CN102010864B - 玉米花粉组织特异性启动子及其表达载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种玉米花粉组织特异性启动子及其表达载体，该启动子长2222bp，具有序列表中<400>1项下的序列，将其取代植物表达载体pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，构建成为一个新的植物表达载体，命名为p-ZMP5。本发明所提供的启动子的获得，为利用基因工程获得植物雄性不育系和恢复系创造了条件，为基因工程研究提供了依据，为外源基因在花粉中特异性表达提供了基础，外源基因可以是编码杀昆虫毒素（靶向以花粉为食的昆虫）的基因、可增强或修饰花粉的营养价值的基因等。此外，通过RNAi干扰PAB5基因，防止花粉的产生可以应用到行道树，对花粉过敏症有一定的缓解作用等，具有重要的理论和实践意义。

Description

玉米花粉组织特异性启动子及其表达载体

技术领域

本发明属于植物分子生物学和基因工程领域，具体的说，涉及一个玉米poly(A)结合蛋白PAB5基因启动子的获得和植物表达载体的构建，尤其涉及诱导外源基因在花粉特异性表达和获得植物雄性不育系和恢复系。 

背景技术

玉米属禾本科玉米属。全世界玉米播种面积仅次于小麦、水稻而居第三位。玉米用作饲料、食物和工业原料，在许多地区作为主要食物。除食用外，玉米也是工业酒精和烧酒的主要原料。故对玉米的研究具有重要意义。 

花药是花粉发育的场所，植物雄性不育系是作物杂种优势利用的重要途径，因此对花药及花粉发育的研究具有重要的应用价值。杂交繁育是传统的将两种植物的所需遗传性状导入一种植物的传统方法。为了可靠的获得性状一致的杂种，应确保亲本系之一为雄性不育。产生雄性不育目前有多种技术，一种是人工地或机械化地除去雌性亲本植物的花药或穗狀雄花，但该方法费力而且不完全可靠。另一种是利用基因工程来获得住屋雄性不育系和恢复系。 

外源基因能够在植物组织中特异高效的表达，必须要构建一个可以特异高效表达的植物表达载体，其中启动子的选择是重要的条件之一。以人为地可控制的方式在花粉中表达对花粉产生有影响的基因对雄性不育系统将是有用的，必要时可以恢复能育性。因此，对于花粉特异性表达启动子的研究具有很大的应用价值。 

发明内容

为了研究玉米花粉的发育机制以及转基因植物中标记的删除，同时为在花粉中特异性的表达外源基因，从而得到在花粉中特异表达的转基因植物，培育具有较高商业价值及保健价值的新品种。本发明提供一种在玉米花粉组织中特异性表达的启动子及其植物表达载体。 

本发明所提供的玉米花粉组织特异性启动子，名称为ZMP5 (poly(A) binding 

protein PAB5 gene promoter)，来源于玉米属玉米（Zea mays L.）。

本发明所涉及的设计方案为，一种玉米花粉组织特异性启动子，通过生物信息学的方法筛选确定启动启动子序列，在玉米B73自交系中获得，通过在水稻中验证在花粉中特异性表达的启动子，具有序列表中<400>1下的序列。通过玉米B73提取总DNA克隆获得的PAB5基因启动子，经测序其长度为2222bp。通过软件分析，该启动子具有高等植物启动子应具有的调控元件。 

一种玉米花粉特异性表达载体，转入了上述的玉米花粉组织特异性启动子。 

本发明提供的一种玉米花粉组织特异性表达载体，转入了前述的玉米花粉组织特异性表达的启动子，并在水稻中进行验证。利用前述的玉米特异性启动子置换植物表达载体pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，构建成在启动子的下游含有GUS报告基因的花粉特异性表达载体，命名为p-ZMP5。并形成愈伤组织；利用潮霉素筛选，得到转基因水稻。PCR结果表明玉米特异性启动子转入到水稻种；GUS组织化学染色鉴定证实PAB5基因的启动子为花粉特异性表达启动子，p-ZMP5为一种花粉特异性表达的载体。 

本发明的玉米花粉特异性启动子，通过驱动能干扰花粉产生或生存能力的基因而导致雄性不育，或在花粉粒中特异性表达目的基因。所述基因可以是对花粉或花粉生成有影响的基因，可以是参与控制雄性能育性的基因，编码杀昆虫毒素的基因，或可增强或修饰花粉的营养价值的基因。本发明的表达系统还可含有选择标记，如除草剂抗性基因或抗生素抗性基因，以根据种如玉米、水稻、小麦鉴定稳定的转化株，除草剂抗性基因的存在也可选择分离群体中的雄性不育子代。 

附图说明

附图1为转基因植株的GUS染色结果（在划分中呈现蓝色）。 

A为茎；B为根；C为叶；D为花粉；E为子房；F为颖壳；G为未成熟的种子； 

H为成熟的种子。

染色结果显示GUS基因在花粉中特异性表达，其他部位均不表达，D图中的蓝色斑点即为花粉。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。 

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，测序由Invitrogen公司进行，PCR试剂盒、连接试剂盒和载体构建过程中的核酸内切酶均购自于自宝生物工程有限公司，质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购于全式金生物技术有限公司，方法均参照试剂盒说明书进行。 

实施方式 

一、玉米花粉组织特异性表达的基因PAB5的获得

首先在NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中以关键词“PAB5”搜索基因,获得拟南芥PAB5基因的蛋白序列。建立玉米蛋白本地数据库，使用“DNATOOLS 6.0”软件对获得的拟南芥PAB5基因的蛋白序列进行BlastP（E-value=0.001）序列比对，筛选出同源性最高的玉米候选蛋白序列。接着使用“DNATOOLS 6.0”软件对获得的玉米全基因组DNA序列数据建立本地数据库，以获得的玉米蛋白序列进行BlastN（E-value=0.001）序列比对，筛选出同源性最高的候选基因。

对转基因植株进行GUS组织染色，但在拟南芥的花器官、未成熟的种子中检测到GUS的表达，推测GUS可能在水稻的花器官中、未成熟的种子中表达。 

二、玉米花粉组织特异性启动子ZMP5的克隆 

将启动pab5表达的启动子命名为ZMP5(poly(A)binding protein PAB5 genepromoter)，根据pab5上游长度为2222bp的核苷酸序列设计PCR扩增该片段的引物，上游加pst I(CTGCAG)酶切位点，下游加Bgl II(AGATCT)酶切位点 

引物序列如下： 

引物1(上游引物)：5’-TTACTGCAGGTTTGTTAGCCCCGCTCCCGGAAGA-3’ 

引物2(下游引物)：5’-CGCAGATCTCATGGCTCCTTGGCTCGTCCCTATAC-3’ 

提取水稻基因组DNA并以此为模板，在引物1和引物2的引导下，进行PCR扩增，PCR反应体系为： 

ddH₂O：                39.6μL 

10X PCR Buffer：       5μL； 

10mM dNTP：            1μL； 

10uM引物1：            1μL； 

10uM引物2：            1μL； 

玉米B73基因组DNA：     10pg； 

DNA Polymerase(2U/ul)：0.4μL； 

PCR反应条件为： 

反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化2222bp的目的片段，将其克隆到载体pMD18-T Vector（宝生物公司），再转化到Trans5α化学感受态细胞(全式金生物技术有限公司)中,PCR筛选阳性克隆，进行测序，测序结果表明ZMP5具有序列表中<400>1的DNA序列，序列表中的<400>1由2222个碱基组成，将含有ZMP5 DNA序列的重组质粒载体命名为PMD18-ZMP5。 

三、PAB5基因启动子ZMP5表达载体的建立 

将用PCR扩增得到并克隆于PMD18-T载体上的PAB5片段用pstⅠ和BglⅡ酶切下来，与用相同酶切pCAMBIA1301的载体连接，构建载体p-ZMP5。其载体构建图具体是：hpt：潮霉素抗性基因，在该基因上游有—nos启动子；ZMP5 ：启动子pab5P；gus：glucoronidase基因，即GUS报告基因；nos：终止子，在其下游是GUS报告基因。

取纯化后1 μg的过量表达载体质粒DNA加入到200 μL EH105感受态细胞中，混匀；冰浴5 分钟后转入液氮中速冻1分钟，接着移至37℃水浴5分钟，加入1 mL YEP液体培养基，28℃，250 rpm预表达4-5小时；10000 rpm离心30秒，弃上清，加入0.1mL YEP液体培养基，重新悬浮细胞；涂布于含100 μg/mL Kan和50 μg/mL利福平的YEP固体平板上，28℃培养约48小时。挑取平板上长出的单菌落，接种于含100μg/mL Kan和50μg/mL利福平的YEP液体培养基中，最后提取质粒 。先用PCR方法初步鉴定（引物为引物1和引物2）；接着用pstⅠ和BglⅡ酶切验证。 

四、农杆菌介导水稻转化 

    通过农杆菌感受态的方法将含目的基因的ZMP5表达载体p-ZMP5质粒导入农杆菌菌株EH105中，经PCR筛选出阳性克隆，然后用共培养法将含有目的基因的农杆菌导入植物受体材料转化水稻。

(1) 水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养与继代培养 

去壳的水稻成熟种子先用ddH₂0洗4-5次，再用70%乙醇浸泡1-2分钟，然后用含有1/1000吐温的20%次氯酸钠浸泡30分钟，期间不停的摇晃，从而进行表面灭菌，之后用无菌水冲洗3-4次，再将成熟种子放在无菌滤纸上吸干水分后，放在愈伤诱导培养基上，28℃弱光培养。约10-15天后，将愈伤组织转入继代培养基上，在相同条件下继代培养。每两周继代培养一次，继代两次后挑选继代培养5-7天，将色泽淡黄的愈伤组织用于共培养。

(2) 用于转化水稻的农杆菌菌液的准备 

将含有植物表达载体的农杆菌接种于YEP液体培养基（含有100μg/mL Kan和50μg/mL利福平）中，28℃振荡培养至OD₆₀₀=0.6-1.0；室温下5000 rpm离心5分钟收集菌体，随后将其悬浮于液体共培养基中，调整菌体浓度至OD₆₀₀=0.4，即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。

(3) 农杆菌侵染水稻愈伤组织 

挑选状态较好（继代培养5-7天、色泽淡黄）的愈伤组织放入25 mL无菌三角瓶中，加入适量农杆菌悬浮液以保证有足够的菌液与材料接触，28℃ 150 rpm摇床上培养20-30分钟。之后倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，22℃暗培养2-3天。

(4) 抑菌处理 

用ddH₂O清洗愈伤3-4次至清洗液清亮，弃去清洗液，用无菌滤纸吸干，转入含有头孢霉素（500mg/L）和羧苄青霉素（200mg/L）的溶液中振荡灭菌半个小时以上，用无菌滤纸吸干，转至铺两层无菌滤纸的培养皿中干燥处理24-72小时；将愈伤转移至加有头孢霉素（500mg/L）和潮霉素（50mg/L）筛选培养基上，28℃光照培养约30天。

(5) 抗性愈伤组织的分化 

从筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的潮霉素抗性愈伤转至含有50mg/L潮霉素（或20mg/L PPT）的分化培养基上，先28℃暗培养3天，然后转至30℃全光照条件下培养，一般经过15-20天左右，有绿点出现。30-40d后进一步分化出小苗。

(6) 生根、壮苗和移栽 

抗性愈伤组织分化出的小苗高度大于3cm时，移到生根培养基上，培养2-3周。选择高15cm以上、根系发达的小苗，用温水洗去培养基，在温室内移栽入土。水面以不淹没小苗为度，晴天需要遮荫到小苗成活（以吐水为准）。待转基因小苗生长健壮后移入田中生长。

五、转基因水稻的的鉴定 

为了检测转基因水稻，一般以提取的转基因水稻总DNA为模板，用中间载体抗性筛选基因潮霉素的上游引物和下游引物配对扩增相应基因，初步鉴定转基因植株。

用于检测潮霉素抗性基因的引物序列： 

引物3（上游引物）：5’-ACTCACCGCGACGTCTGT-3’  

引物4（下游引物）：5’-TTTCTTTGCCCTCGGACG-3’；

初步鉴定为转基因植株后，接着对转基因植株进行GUS组织染色。取转基因水稻的茎、根、叶、花粉、颖壳，未成熟的种子以及成熟的种子待检测的植物组织与小离心管中，加入GUS缓冲液浸没组织块，再加入5%（v/v）用量的GUS染色液，混匀后37℃下保存16-24小时。叶片等绿色材料转入70%乙醇溶液中脱色2-3次，直至阴性对照材料呈白色。肉眼或显微镜下观察，白色背景下的蓝色小点即为GUS表达载体如图所示（A为茎；B为根；C为叶；D为花粉；E为子房；F为颖壳；G为未成熟的种子；H为成熟的种子）。在转基因植株的正常器官中都没有检测到GUS基因的表达，而只在花粉中检测到GUS基因的表达，从而证明ZMP5仅在水稻花粉组织中特异性表达。

Claims (3)

1.一种玉米花粉组织特异性启动子，其特征在于：通过生物信息学的方法初步确定、在玉米B73自交系中获得、通过在水稻中验证在花粉中特异性表达的启动子，其DNA序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种玉米花粉特异性表达载体，其特征在于：转入了权利要求1所述的玉米花粉组织特异性启动子。

3.根据权利要求2所述的玉米花粉特异性表达载体，其特征在于：用权利要求1所述的玉米花粉组织特异性启动子置换植物表达载体pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，构建成在启动子的下游含有GUS报告基因的花粉特异性表达载体，并利用所述植物表达载体对受体水稻的外植体进行转化，并形成愈伤组织；利用潮霉素筛选，得到转基因水稻。

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