CN104087600A - 小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrA4.1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦山融3号甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrA4.1。本发明还公开了所述基因TaMsrA4.1在拟南芥和小麦植株中提高其抗盐性的应用。实验结果表明，本发明所述转基因植株比非转基因植株的抗盐能力得到了很大程度的提高，为通过基因工程手段提高作物抗盐性提供了理论依据和实践基础。

Description

小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrA4.1及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrA4.1及其应用。

背景技术

高盐是限制植物生长发育和相关产量的重要因素。因此，发掘和鉴定抗盐相关基因用于农作物改良是育种科学家考虑的关键问题之一。甲硫氨酸亚砜还原酶(MethionineSulfoxide reductase，Msr)家族基因能被多种非生物胁迫诱导表达。在植物体内，Msr不但可以清除机体内过量的活性氧(Reactive oxygen radical species，ROS)，而且可以体外催化因ROS氧化的R和S型的MetSO还原为Met，这些证据表明Msr在植物胁迫应答中可能发挥重要作用。

小麦是世界上最为重要的甜土粮食作物之一，不耐盐碱。不过近年来世界范围内的土壤盐渍化加剧，严重限制了作物生长发育和产量。因此加强小麦应对耐盐的能力是扩大小麦种植范围和提高小麦产量最为有效的途径之一。本实验室前期将小麦近缘禾草中耐逆性极强的长穗偃麦草的染色质渐渗入小麦济南177的基因组，创制了一批抗逆新种质资源并从中选育出高产/耐盐小麦新品种山融3号(SR3)。前期的盐旱处理SR3幼苗构建的cDNA芯片显示其中的TaMsrA4.1有显著响应。尽管MsrA家族基因在拟南芥、水稻以及一些其他植物中抗胁迫方面的作用已有初步结果，但在主要粮食作物小麦中该家族基因特别是TaMsrA4.1基因的克隆、功能验证尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一个抗盐相关基因--小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrA4.1，以及利用该基因在提高植株抗盐性中的应用。

本发明的技术方案是：从小麦山融3号(SR3)中分离得到小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrA4.1，首先在拟南芥中验证其功能，随后在小麦中证实其提高抗盐性。

本发明所述的小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrA4.1，其特征在于：所述基因cDNA序列如SEQ ID No.1所示。其中，所述小麦是山融3号小麦。

本发明在小麦中克隆的甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrA4.1与其他物种中的类似基因相比同源性在60～79％之间。对其保守区分析发现，小麦中甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrA4.1推导的氨基酸序列含有类似“GCFWG”的保守序列和位于C端的“KGCNDPIRCYG”保守序列，这其中的三个Cys是酶的热稳定性和催化活性所必须。和其它同类基因相比，也存在N-和C-端的较高的变异性，这暗示在小麦中该基因存在功能上的分化。

本发明所述小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrA4.1在提高植株抗盐性中的应用。

实验证实：在盐处理下，转入本发明所述基因TaMsrA4.1的植株过表达系生长状况和根长比野生型生长更好，说明该基因的转化的确增强了植株(拟南芥和小麦)抗盐的能力。

本发明的有益效果：利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了小麦SR3甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrA4.1并进行了功能验证。实验发现该基因与抗盐性密切相关。故对于该基因TaMsrA4.1的研究具有重要理论意义和应用前景。

附图说明

图1：TaMsrA4.1基因的cDNA电泳图，其中：M为DNA Marker，泳道1-2为TaMsrA4.1的cDNA，泳道NC为阴性对照，水为模版。

图2：转TaMsrA4.1基因的拟南芥转基因植株筛选，绿苗为转基因植株。

图3：甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrA4.1在转基因拟南芥中RealTime-PCR表达分析，Clo-0为野生型拟南芥，OE1和OE2为不同转基因纯系，Actin为内标对照。

图4：转基因的拟南芥中NaCl处理分析，WT为野生型，OE1和OE2为过表达系。

图5：转基因小麦PCR筛选电泳结果，NC为阴性对照，M为DNA Marker，其余为检测的转基因小麦。

具体实施方式

实施例1、TaMsrA4.1cDNA的克隆

1.1SR3小麦总RNA的提取

(1)将生长到2叶一心期小麦剪碎放入研钵中，加入液氮覆盖材料后将其研磨成粉；

(2)一旦液氮挥发后，立即取约200mg粉末转入1.5ml离心管中，加入1ml TrizolRNA提取液，涡旋震荡充分混匀于室温静置5min；

(3)4℃，12000rpm条件下离心10min，取0.9ml上清液移入另一个1.5ml离心管中，加入0.2ml氯仿剧烈振荡15sec混匀后于室温静置5min；

(4)在4℃，12000rpm条件下离心10min，取0.4ml上清液移入新的1.5ml离心管中，取0.4ml异丙醇加入后混匀于室温静置15mim；

(5)4℃，12000rpm条件下离心10min，弃上清后用1ml75％的乙醇连续洗涤两次，4℃，8000rpm条件下离心5min；

(6)弃上清，在超净工作台中干燥RNA5min，加入40μl RNase-Free水，在60℃中溶解RNA10min；

(7)用紫外分光光度计测RNA样品的浓度和质量，A₂₆₀/A₂₈₀达到1.7-2.0为好；再利用1.2％的琼脂糖凝胶标准电泳检测提取RNA的质量。

1.2合成TaMsrA4.1cDNA第一链

(1)向离心管中依次加入下列物质(40μl体系)：

(2)轻混后于65℃下变性5min，立即冰浴1min；

(3)之后立即向离心管中依次加入下列试剂：

(4)轻混后于42℃恒温水浴1h，之后65℃下变性10min，于-20℃下储存备用。

1.3PCR反应合成TaMsrA4.1的cDNA

TaMsrA4.1-F：5'GGACTGACTGAGCCGACGAAGCATC  3'

TaMsrA4.1-R：5'GGTCAGGTCACCAGGCTCGTTCATC  3'

(1)PCR反应体系(20μl)：

PCR反应条件如下：

反应结束后，PCR产物于0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，获得了预期大小的电泳条带，结果如图1所示。

(2)克隆基因片段的纯化回收(使用DP209试剂盒以及标准程序)

将切下带有目的片段的凝胶放入1.5ml离心管并称重，加入3倍体积的溶胶液于60℃温育10min，期间不断轻摇；凝胶完全融化后，全部吸取到回收柱中，放置片刻；室温，12000rpm，离心30sec，弃溶液；在柱中加入700μl漂洗液，12000rpm下离心1min，弃漂洗液；在柱中加入500μl的漂洗液，于12000rpm离心1min，弃漂洗液；空柱，12000rpm，离心2min；回收柱开盖晾干1-2min，放入新的干净的1.5ml离心管，加入60℃预热的40μl灭菌水或者EB缓冲液，放置2min；12000rpm离心1min，所得溶液中含有回收的目的片段。

1.4目的片段的连接和转化E.coli DH10B

(1)连接：上述回收的目的片段与pEasy-T1simple载体连接。连接体系需要1μlpEasy-T1simple载体，4μl PCR回收产物(含目的片段100～200ng)的比例，混匀后短暂离心，于25-30℃连接20min。得到重组质粒用于后面的反应。

(2)转化：重组体转化使用热击法转化E.coli DH10B(试剂购自鼎国生物技术有限公司，北京)。在无菌条件下吸取100μl感受态细胞加入预冷灭菌的1.5ml Eppendorf管中，加入10μl连接产物(1.4中的重组质粒)，轻轻混匀，立即置于冰上30min；在42℃恒温水浴中热激90sec；冰浴5min；加入800μl不含抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃振荡复苏培养60min；短暂离心收集菌体，用150μl LB液体培养基重悬菌体，转至含抗生素Amp、X-gal、IPTG的LB固体平板上，用无菌涂布棒涂布；将平板于37℃正向放置30min至液体被吸收，倒置平板，于37℃培养16h，观察平板会有蓝白菌斑发生。白斑用于后面的阳性重组子的鉴定工作。

1.5阳性重组子的鉴定

(1)首先用碱裂解法提取含有重组子的白色菌落

挑取白色单菌落，接入含抗生素Amp(50mg/L)的3ml LB液体培养基中，37℃震荡培养12-16h；之后在12000rpm下离心30sec，弃上清；加入100μl冰预冷的溶液I，在涡旋器上使菌体充分重悬；加入200μl溶液II，立即将离心管缓缓颠倒数次，冰浴10min；加入150μl冰预冷的溶液Ⅲ，缓缓颠倒离心管数次直至白色沉淀充分形成，冰浴10min；12000rpm离心3min，取上清转入新离心管中，加入2倍体积95％乙醇，混匀后，室温静置3min；12000rpm离心3min，使质粒DNA沉淀；弃上清，取200μl TE溶液溶解沉淀；加入等体积冰预冷的5mol/L LiCl溶液，冰浴5min，沉淀大量RNA；12000rpm，离心3min；转移上清到另一离心管中，加入2倍体积的95％乙醇，混匀后于室温静置3min，12000rpm离心3min使质粒沉淀；弃上清后用1ml70％乙醇洗涤沉淀，弃尽液体；室温干燥后，取20μl含RNaseA(20μg/ml)的TE溶液溶解沉淀，37℃水浴60min消化残存的RNA；TE溶液将总体积补充至200μl，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇，充分振荡10min，12000rpm离心5min；取上清，加入等体积的氯仿-异戊醇，重复以上操作；取上清，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5.3)和2倍体积的无水乙醇,混匀后-20℃放置15min后,12000rpm离心3min使质粒沉淀；弃上清用1ml70％乙醇洗涤沉淀，弃液体,用40μl无菌水溶解沉淀。所提取质粒用于后面的酶切反应。

(2)酶切验证重组质粒

酶切反应体系如下：

重组质粒                16μl

EcoRI                   2μl

10×Buffer              2μl

将上述反应体系混匀并5000rpm离心1min，37℃水浴反应过夜，然后进行1％的TAE琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现所提取质粒大小符合所克隆基因的预期长度。

1.6cDNA测序和基因命名

将酶切验证正确的阳性单菌落用含有Amp(50mg/L)的液体LB摇过夜，然后送上海博亚生物技术有限公司测序，得到全长基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。

经过NCBI blast分析，与拟南芥和水稻来源的甲硫氨酸亚砜还原酶基因MsrA4存在保守序列的相似性，初步命名为小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrA4.1。

实施例2、在拟南芥中对TaMsrA4.1进行功能验证

2.1植物过表达载体的构建

(1)设计引物：pSTART载体是常见的双元载体，其含有的T-DNA序列经过农杆菌转化，可以整合到拟南芥的染色体组上，并大量表达。根据其物理图谱及限制性内切酶位点，正向引物增加Xba I，反向引物增加BamH I，设计引物进行扩增：

TaMsrA4.1-F-PSTART：5'TCTAGAATGCCTCCCCTCCTCACCTCAC  3'

TaMsrA4.1-R-PSTART：5'GGATCCTCCATAGCAGCGGATGGGG  3'

(2)PCR反应与连接和转化：除反应模版为含有TaMsrA4.1的重组质粒外，反应体系和条件同1.3(1)；电泳回收目的片段的方法同1.3(2)；回收片段与pEasy-T1连接后转化大肠杆菌，阳性重组子鉴定并提取质粒。连接和转化方法同1.4，阳性重组子鉴定和质粒提取方法同1.5；

(3)克隆质粒和pSTART空载体质粒用相应合适的内切酶进行酶切(引物上引入的)，电泳后回收载体线性片段和目的片段；酶切方法同1.5，片段的回收同1.3(2)。

(4)使用T4DNA ligase把目的基因连入切好的pSTART空载体；连接方法同1.4。

(5)连接产物热激法转化E.Coli DH10B感受态细胞；转化方法同1.4。

(6)阳性重组子的酶切验证方法同1.5。

构建好的双子叶植物表达载体命名为pSTART-TaMsrA4.1。

2.2植物表达载体转化农杆菌

(1)无菌操作制备农杆菌感受态：取保存的农杆菌GV3101接种于10ml YEP液体培养基中，28℃摇床过夜；之后按1︰50接种于50ml YEP液体培养基中，28℃振荡培养3-4小时，至OD₆₀₀值为0.4-0.6；4℃，4200rpm，离心10min，收集菌体；弃上清，加入10ml预冷的0.15M的NaCl悬浮菌体；4℃，4200rpm，离心10min，收集菌体；弃上清，加入2ml预冷的20mM的CaCl₂悬浮菌体，分装于1.5ml离心管中，现用或加入终体积7％DMSO经液氮速冻后-80℃保存备用。

(2)无菌操作下进行农杆菌转化：将10μl植物表达载体质粒DNA加入50μl的感受态细胞中，轻弹离心管混匀，冰浴30min；液氮速冻1min；然后37℃水浴5min，立即冰浴2-3min；加入1ml YEP培养基，28℃培养2-4h；室温，4000rpm，离心3min，收集菌体；将菌涂布于含有相应抗生素的YEP培养平板上，28℃倒置培养48h。

(3)阳性菌落的PCR验证：用菌落PCR技术，反应体系如下(20μl)：

扩增条件：

反应结束后，PCR产物在0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明PCR产物长度与所插入基因TaMsrA4.1长度一致。

2.3浸花法转化拟南芥

首先将待灭菌Col-0拟南芥种子放入1.5ml离心管中，加入1ml75％的乙醇震荡灭菌1min，接着70％的乙醇灭菌两次各1min，之后用吸头将种子吸到无菌滤纸上晾干，之后用灭菌牙签将其点入1/2MS培养基中；至抽苔1cm时将顶端减掉以诱导侧生花序的生成；在转化前一天，取1ml活化过的含有表达载体质粒的农杆菌加到含相应抗生素及50μg/ml利福平的40ml YEP培养基中，28℃震荡培养至OD₆₀₀约为1.0-1.2；室温，4200rpm,离心10min，收集菌体，用浸染液(5％蔗糖，0.05％Silwet L-77)重悬菌体，使OD₆₀₀约为0.8；用移液器将含有重组质粒的农杆菌滴到花序上，侵染后立即将拟南芥放入真空干燥器中抽真空1min；用保鲜袋覆盖花序，于20-22℃避光培养一天剪开顶部露出花序，再培养一天后揭去保鲜袋，培养至种子成熟。

2.4转基因纯系的获得

对收获的T₀代种子进行表面灭菌，然后均匀涂布于1/2MS平板上(含相应的抗生素卡那霉素)。春化处理3天后移入人工气候室生长。萌发约10天，子叶仍为绿色的植株为转基因植株，未转基因的枯黄甚至死亡(图2)。将转基因植株转入土中栽培生长至收获单株T₁代种子，每株收取的种子继续筛选，将后代分离比为3∶1(阳性∶阴性)的阳性植株移栽后生长至收获T₂代种子，单株收种后，每株收取的种子经筛选可以得到纯系。2.5转基因植株的RT-PCR检测

植株总RNA的提取和cDNA第一链的合成方法参照1.1和1.2。TaMsrA4.1基因的RT-PCR引物序列如下：

TaMsrA4.1-RT-F：5'CCACCCCCTCCTCCTCGTC  3'

TaMsrA4.1-RT-R：5'TGGCGATTGGGCGTGGTC  3'

将逆转录得到的cDNA第一链进行适当稀释并作为模板进行正常PCR扩增，用单拷贝组成型表达的基因TaActin作为内参，在200μl离心管中加入如下物质：

混匀体系并离心，放入PCR仪中进行PCR反应。

PCR反应程序：

之后利用1％琼脂糖电泳分析PCR结果，检测结果如图(3)所示，表明成功获得了转基因株系。

2.6不同盐浓度处理过表达拟南芥

将灭菌后的拟南芥野生型(WT)及转TaMsrA4.1过表达系(OE)的种子分别点到1/2MS固体培养基上，4℃下无光培养3-4d，后转移至到光照培养箱22℃竖直培养3d；制备加有不同浓度的NaCl(0,80mM,130mM)的1/2MS固体培养基；将根长0.8～1cm且生长一致的幼苗移入不同盐浓度1/2MS固体培养基中竖直培养，要求每个培养皿中包括对照野生型和两个独立的过表达系幼苗，培养10d后拍照并统计根长，实验重复3次。

结果表明，过表达系和野生型相比，在80mM和130mM浓度NaCl下显著增强了对盐胁迫的抗性(图4)。

实施例3、在小麦济南17中过表达甲硫氨酸亚砜还原酶TaMsrA4.1

3.1种子灭菌：取济南17种子，在超净工作台上以75％乙醇浸泡1min，无菌水洗3～4次，接着用0.1％的升汞浸泡10min，无菌水洗3～4次。

3.2春化处理：灭菌后的种子置于含有适量无菌水的100mL无菌三角瓶中，在28℃100rpm摇床过夜，将露白的种子置于培养皿底用超纯水饱和的滤纸上；之后放入4℃冰箱暗培养四周，待胚芽鞘长到1～3cm即可切苗侵染。

3.3表达载体的构建和转化农杆菌：利用pSTART构建载体，方法同2.1，只是用ubiquitin启动子替换了35S启动子。转化农杆菌及阳性菌的鉴定同2.2。

3.4转化小麦：含有植物表达载体的农杆菌活化：切苗前3～4天活化菌种(培养基：10mLYEP+5μL Kan+50μL利福平)：第一次活化用20mL培养基+50～100μL菌液→保菌(浓白)；第二次活化在切苗前一天晚上，用100mL三角瓶将第一次活化后菌液450μL+40～60mL培养基过夜摇至OD略大于1.0。取1ml活化至OD_6oo达1.0的农杆菌菌液,10000rpm离心30s,弃上清后加入乙酰丁香酮使其终浓度达到200μM,加入无菌水10ml,置于冰上备用。切苗和农杆菌转化:首先将胚芽鞘长至1～3cm的幼苗从根部开始下刀,斜切暴露幼苗茎端生长点；接着用微量注射器吸取4μL菌液,滴于暴露的生长点；将处理后的幼苗置于己灭菌的培养皿中，室温培养至小麦健壮后移栽于土壤中，在植株开花前将每株麦穗进行套袋隔离。

3.5转基因小麦阳性株系的确定：(1)待测植株基因组DNA的提取(CTAB法)：T₁～T₂代转化小麦长至3～4叶时,剪取3-5cm叶片,剪碎叶片后用液氮研磨成粉末，立即转移至1.5ml离心管中，然后加入700μl65℃的CTAB提取缓冲液，置于65℃水浴保温2h，不时颠倒混匀。之后加入等体积的酚∶氛仿∶异戊醇(25∶24∶1)，4℃下10000g离心10min。将液相转移至一干净离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，4℃下10000g离心10min。将上清转移至一干净离心管中，加入两倍体积无水乙醇，温和混匀，-20℃放置30min沉淀DNA。4℃下10000g离心10min，弃去液体，并用70％乙醇洗涤两次，室温干燥DNA后，加入100μl RNA酶液，37℃水浴30min。加入200μl无水乙醇，温和混匀，-20℃放置30min沉淀DNA。4℃10000rpm离心10min，弃去液体，并用70％乙醇洗涤两次，室温干燥DNA后，加入40μl无菌水溶解DNA，4℃保存待用。(2)PCR法检测阳性转基因植株，釆用GUS引物进行筛选:

GUSr:GACAGCAGCAGTTTCATCAATC

GUSf:ATCCCACTATCCTTCGCAAG

PCR反应体系(20μl)：

PCR扩增条件：

反应结束后，反应液于1％TAE琼脂糖凝胶电泳检测(图5)，依据电泳结果进行了相关遗传分析，获得了阳性小麦纯系。

3.6过表达小麦耐盐性分析：用1/2Hoagland液体培养基(配方见表1)培养JN17(对照)，和两个不同的转基因过表达系OE1和OE2，22℃长日照(光照16h/黑暗18h)条件下培养，待材料长至两叶一心时选择生长一致的进行不同浓度NaCl(0，100mM，150mM)处理2周后看生长状况以及统计根长，根长实验重复三次。结果如表2，可以看出在没有盐胁迫的条件下，对照和两个过表达系都生长良好且根长没有显著差异；在不同浓度盐处理的条件下，过表达系的生长显著好于对照，过表达系的根长相比于野生型差异明显，实验结果说明该基因在小麦中的过表增强了小麦抗盐的能力。

表1：1/2Hogland液体培养基配方如下：

表2：过表达小麦在盐处理下根长分析

Claims (4)

1.一种小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrA4.1，其特征在于：所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.如权利要求1所述小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrA4.1，其特征在于：所述小麦是山融3号小麦。

3.权利要求1所述小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrA4.1在提高植株抗盐性中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述植株是小麦或拟南芥。