CN104558132B

CN104558132B - 花生della基因家族及其编码基因与应用

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Publication number: CN104558132B
Application number: CN201510018648.6A
Authority: CN
Inventors: 侯蕾; 王兴军; 赵传志; 夏晗; 赵术珍; 李长生; 李膨呈; 李爱芹; 薛月寒
Original assignee: Biotechnology Research Center of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Biotechnology Research Center of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-01-14
Filing date: 2015-01-14
Publication date: 2018-06-19
Anticipated expiration: 2035-01-14
Also published as: CN104558132A

Abstract

本发明涉及花生DELLA基因家族及其编码基因与应用。本发明公开了一种花生AhDELLA3蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；花生AhDELLA4蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；本发明首次发现了花生DELLA蛋白基因家族AhDELLA3和AhDELLA4及其编码基因，通过分析AhDELLA3和AhDELLA4基因在花生不同组织中的表达变化，发现AhDELLA3和AhDELLA4基因在花生荚果发育过程中起到重要的作用；为阐明DELLA基因家族调控花生生长发育的分子机理提供了重要的理论依据，并且在花生新品种培育方面具有重要指导意义，为利用转基因技术创新作物新种质奠定了基础。

Description

花生DELLA基因家族及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及花生DELLA基因家族及其编码基因与应用，特别涉及花生DELLA基因家族的克隆、表达分析、功能鉴定及其应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

赤霉素(gibberellins，简称GAs)作为一种植物激素，在植物的整个生长发育过程中起着非常重要的调控作用。例如：促进种子萌发、促进茎的伸长和叶的生长、诱导开花及种子和果实生长等多种生理功能。

DELLA蛋白是赤霉素信号通路中的抑制因子(参见Fleet et al.Current Opinionin Plant Biology,877-85,2005)。赤霉素信号传递途径主要是通过解除DELLA蛋白的抑制作用来实现的。受体GID1接收到GA信号后与DELLA蛋白形成GA-GID1-DELLA复合体，随后被SCF蛋白复合体中的SLY1识别并通过泛素蛋白酶途径降解，DELLA蛋白对植物生长的抑制作用随即解除，从而调节下游基因的表达(参见Riehards et al.Plant Mol Biol,5267-88,2001；Nakajima et al.Plant Journal,46880-889,2006；Willige et al.The PlantCell,191209-1220,2007)。

DELLA蛋白属于植物GRAS蛋白家族。拟南芥的GAI(GA Insensitive)、RGA(Repressor of ga1-3)和RGL(RGA like)、水稻的SLR1(Slender Rice 1)、小麦的RhtB1/RhtD1(Reduced height)、大麦的SLN1(Slender 1)等都是DELLA蛋白，它们在序列上高度保守(参见Vandenbussche et al.BMC Plant Biol,765,2007)。DELLA蛋白的N端具有保守的DELLA结构域(包括DELLA和VHYNP两个酸性基序)，是与受体GID1蛋白的结合结构域，对响应GA信号的DELLA蛋白降解具有重要作用。C端具有保守的GRAS结构域，是DELLA蛋白的功能结构域，在调控DELLA蛋白活性方面起作用。DELLA结构域的缺失将使DELLA蛋白不能被降解，而使植物表现出类似于GA缺陷型突变体gal-3的表型，而它们在GRAS功能结构域中的缺失突变会造成植株徒长的表型(参见Dill et al.PNAS,98(24)14162-14167,2001；Chandleret al.Plant Physiology,129181-190,2002；Wen et al.The Plant Cell,1487-100,2002)。

水稻和大麦中只有一个DELLA蛋白，能够抑制几乎所有GA控制的生长发育过程。而拟南芥中有五个DELLA蛋白，包括GAI、RGA、RGL1、RGL2和RGL3，它们的功能既相互重叠又各有不同(参见Cheng et al.Development,1311055-1064,2004)。例如RGA、GAI和RGL1都具有抑制茎伸长的作用(参见Dill et al.Genetics,159777-785,2001；Wen et al.PlantCell,1487-100,2002)；RGA、RGL1和RGL2都具有抑制成花和种子形成的作用(参见Ueguchi-Tanaka et al.Annu Rev Plant Biol,58183-198,2007)；RGA、GAI、RGL2和RGL3在种子萌发中具有抑制作用(参见Peng et al.Curr Opin Plant Biol,5376～381,2002；Cao etal.Planta,223:105～113,2005；Ariizumi et al.Plant Cell,19:791～804,2007)。

DELLA蛋白除了对植物生长发育具有抑制作用外，还有其他重要功能。DELLA蛋白在调控果实发育方面有重要作用。例如番茄中SlDELLA基因的沉默导致未受精的情况下发生单性结实，推测DELLA的表达很可能是受精前子房发育暂停的原因(参见Cristina etal.The Plant Journal,52865–876,2007)。DELLA蛋白在多种植物激素信号和环境信号的传递途径中也具有调节作用(参见Achard et al.Science,311:91～94,2006)。例如，光通过降低GA的生物合成水平促进DELLA蛋白的积累，抑制PIF3转录因子与它的靶基因启动子结合，使拟南芥下胚轴伸长受到抑制。而黑暗下相反，DELLA蛋白的降解促进下胚轴伸长(参见Feng et al.Nature,451475-478,2008；Achard et al.Plant Physiology,1431163-1172,2007)。DELLA蛋白还在植物耐逆境胁迫方面起作用。通过研究拟南芥在植物激素处理条件下和逆境胁迫下的DELLA蛋白变化，结果表明DELLA蛋白对植物生长的抑制是有益的，它能够依据外界的变化，实时地调控植物生长，从而提高植物的抗逆性(Achard etal.Plant Physiol,1431163-1172,2007)。由此可见，DELLA蛋白在植物整个的生长发育过程中发挥着至关重要的作用。

花生是我国重要的油料作物之一，我国花生总产占全国油料作物总产量的1/2。然而，我国花生产业仍面临着十分严峻的问题，花生产量和胁迫抗性的进一步提高仍然是我国花生品种培育的最重要课题。加大生物技术在种质创新和品种培育中的力度是实现我国花生品种改良新飞跃的关键。然而，由于对花生重要农艺性状形成的分子机理知之甚少，花生的分子生物学研究也远落后于其他农作物。鉴定花生中的DELLA基因家族，研究不同DELLA蛋白在花生生长发育和抵御胁迫中的作用机理，对阐明决定花生高产、抗逆性状的分子基础具有重要意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供花生DELLA蛋白基因家族及其编码基因与应用。

一种花生AhDELLA3蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

编码花生AhDELLA3蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

一种重组载体，插入了核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的编码花生AhDELLA3蛋白的基因。该重组载体可通过购买市售的载体，经过常规手段，将目的基因SEQ ID NO.6导入载体，即可获得含有SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重组载体。

一种重组细胞，含有上述编码花生AhDELLA3蛋白的基因或者上述重组载体。

上述编码花生AhDELLA3蛋白的基因、重组载体和/或重组细胞在改良花生或其他经济作物抗逆中的应用。

一种花生AhDELLA4蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

编码花生AhDELLA4蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

一种重组载体，插入了核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的编码花生AhDELLA4蛋白的基因。该重组载体可通过购买市售的载体，经过常规手段，将目的基因SEQ ID NO.8导入载体，即可获得含有SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的重组载体。

一种重组细胞，含有上述编码花生AhDELLA4蛋白的基因或者上述重组载体。

上述编码花生AhDELLA4蛋白的基因、重组载体和/或重组细胞在改良花生或其他经济作物抗逆中的应用。

有益效果

本发明首次发现了花生DELLA蛋白基因家族AhDELLA3和AhDELLA4及其编码基因。通过分析AhDELLA3和AhDELLA4基因在花生不同组织中的表达变化，发现AhDELLA3和AhDELLA4基因在花生荚果发育过程中起到重要的作用；为阐明DELLA基因家族调控花生生长发育的分子机理提供了重要的理论依据，并且在花生新品种培育方面具有重要指导意义，为利用转基因技术创新作物新种质奠定了基础。

附图说明

图1、AhDELLA基因家族蛋白与几种不同物种来源的DELLA蛋白的同源性比较；

其中：At:拟南芥；Ta:小麦；Gm:大豆；Hv:大麦；Os:水稻；Rc:蓖麻；Ps:豌豆；Ah:花生；

所选择蛋白登录号：AtGAI:NM_101361.2；AtRGL1:NM_105306.3；AtRGA:NM_126218.2；AtRGL2:NM_111216.2；AtRGL3:NM_121755.2；TaRht-A1:GQ451333.1；TaRHT-D1:GQ451334.1；TaRht-B1:KC434135.1；GmGAI1:NM_001254019.1；GmGAI1-l:XM_003552932.1；GmGAI2:XM_003538347.1；GmRGA2-l1:XM_003535403.1；GmRGA2-l2:XM_003531105.1；HvSLN1:AF460219.1；OsSLR1:AB262980.1；RcGAIP-B:XP_002527794.1；PsDELLA:DQ848351.1；

图2、荧光定量PCR分析AhDELLA基因家族在花生不同组织中的表达量的柱状图；

其中：a、AhDELLA1；b、AhDELLA2；c、AhDELLA3；d、AhDELLA4；

JS幼年茎(15天)，AS成年茎(40天)，JL幼年叶片(15天)，AL成年叶片(40天)，JR根，F花，G1未入土的果针，G2入土3天的果针，G3入土9天的果针，S未成熟种子。

图3、荧光定量PCR分析AhDELLA基因家族在模拟干旱胁迫下的表达变化的柱状图；

其中：a、AhDELLA1；b、AhDELLA2；c、AhDELLA3；d、AhDELLA4；

图4、荧光定量PCR分析AhDELLA基因家族在高盐胁迫下的表达变化的柱状图；

其中：a、AhDELLA1；b、AhDELLA2；c、AhDELLA3；d、AhDELLA4；

图5、植物表达载体pCAMBIA2300-AhDELLA1的构建过程示意图；

图6、通过PCR分子检测法，对AhDELLA1转基因烟草的鉴定；

其中：1-8、AhDELLA1转基因烟草植株，经PCR显示为阳性，为转基因植株；9、质粒阳性对照；10、野生型烟草阴性对照；M、Marker DL5000(购自TaKaRa公司)；

图7、转AhDELLA基因烟草与野生型烟草成苗期表型对比；

其中WT：野生型烟草。

图8、转AhDELLA基因烟草与野生型烟草衰老期表型对比；

其中WT：野生型烟草。

具体实施方案

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

生物材料来源：

烟草品种SR1购自山东鲁生生物科技有限公司；

鲁花14号、仲恺1号花生种子购自山东种业集团有限公司；

农杆菌GV3101、农杆菌EHA105、pSPYNE质粒、pSPYCE质粒购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心；

E.coil DH5α菌株购自天根生化科技有限公司；

pGADT7质粒、pGBKT7质粒、Y2H Gold酵母菌株购自Clontech公司。

花生品种的种植：

选取种仁饱满、没有病虫害及霉变的花生籽粒作为种子。首先温水浸种2～4h，然后种植于直径15cm，深10cm的花盆中。将花盆置于光照培养箱中，白天光照时间为16h，温度(25±0.3)℃，湿度为80％；夜晚黑暗时间8h，温度(20±0.3)℃，湿度为80％。一周左右子叶即可出土，在相应时间段进行样品采集；

以下实验步骤及涉及的培养基均为本领域常规技术，试剂均为市售产品。

实施例1：花生AhDELLA基因家族基因及赤霉素受体AhGID1基因全长的克隆

用与花生同源性较高的大豆DELLA蛋白核苷酸序列，利用同源比对搜索花生果针和荚果发育早期转录组数据库，共查找到DELLA相关的四组Unigene，每组来自一个基因。其中来自于AhDELLA2的Unigene包含起始密码子，3'端缺失；AhDELLA1、AhDELLA3、AhDELLA4的Unigene均在5'端、3'端缺失。同样的方法搜索花生果针和荚果发育早期转录组数据库，通过短片段的拼接，得到AhGID1基因的全长序列。

通过5'RACE和3'RACE进行巢式PCR扩增，最终得到DELLA基因家族AhDELLA1、AhDELLA2、AhDELLA3和AhDELLA44个基因的全长开放读码框。利用这4个基因同源比对花生果针和荚果发育早期转录组数据库及NCBI花生EST数据库，得到的序列均属于上述4个基因，因此，认为该四个基因为花生DELLA基因家族全部基因。

5'RACE、3'RACE反应分别使用的是TaKaRa公司的5'-Full RACE Kit(TaKaRaCode:D315)、3'-Full RACE Core Set Ver.2.0(TaKaRa Code:D314)试剂盒。

具体步骤如下：

1.1花生RNA的提取：

(1)参照CTAB-LiCl法，称取0.2g新鲜花生组织(鲁花14)，在液氮中充分研磨至粉末状，研磨中不断缓慢加入液氮，防止材料解冻；

(2)将研好的组织迅速转移至预热(65℃)的含有600μl CTAB提取液的Ep管中，立即剧烈涡旋振荡30s，使其混匀；

(3)65℃水浴2-5min，期间剧烈涡旋振荡3-5次；

(4)冷却后加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24:1)混合溶液，涡旋振荡1min，混匀，4℃，12000rpm离心15min；

(5)将上清转移到另一新的Ep管中，加入2μl的DNase I，37℃水浴15min；

(6)再加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24:1)混合溶液，涡旋振荡1min，混匀，4℃，12,000rpm离心15min；

(7)将上清转移到另一新的Ep管中，加入1/3体积的8M LiCl溶液，使其终浓度为2M，4℃过夜沉淀；

(8)4℃，12,000rpm离心20min，弃上清；

(9)分别用体积浓度为70％的乙醇、无水乙醇洗沉淀，晾干，加30-50μl DEPC-H2O，溶解沉淀。

1.25'RACE获得基因5'端：

步骤参照5'-Full RACE Kit(TaKaRa Code:D315)试剂盒说明书。通过已知片段序列，利用olige6.0软件在此片段上设计与5'RACE试剂盒中的outer引物和inner引物配对的基因特异性引物：

Della1-5'race-outer:5'-GACTCCGTGAACCTGTCAAGAAAACCC-3'(SEQ ID NO.11)；

Della1-5'race-inner:5'-CGTGGATCGTTTCGGCTAATTGA-3'(SEQ ID NO.12)；

Della3-5'race-outer:5'-GTTCACGAGCACGTCAGCGAGGTCAAGC-3'(SEQ ID NO.13)；

Della3-5'race-inner:5'-TGGCACGTGAGGTCTGAGTGTG-3'(SEQ ID NO.14)；

Della4-5'race-outer:5'-GTTCACGAGCACGTCAGCGAGGTCAAGC-3'(SEQ ID NO.15)；

Della4-5'race-inner:5'-GTAACCGCTGTAAGATCGTTGTCC-3'(SEQ ID NO.16)。

使用TaKaRa LA Taq(TaKaRa Code:DRR02)进行巢式PCR反应。PCR反应结束后，取10μl的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认5'RACE PCR扩增产物，AhDELLA1、AhDELLA3和AhDELLA4的5'端得到大约1200bp、200bp、200bp左右的条带，分别记作AhDELLA1-5'、AhDELLA3-5'、AhDELLA4-5'。

1.33’RACE获得基因3'端：

步骤参照3'-Full RACE Core Set Ver.2.0(TaKaRa Code:D314)试剂盒说明书。通过已知片段序列，利用olige6.0软件在此片段上设计与3'RACE试剂盒中的outer引物和inner引物配对的基因特异性引物：

Della1-3'race-outer：5'-CGAGAGGCACGAGACACTGGG-3'(SEQ ID NO.17)

Della1-3'race-inner：5'-ACTTGGGTTCAAATGCCT-3'(SEQ ID NO.18)

Della2-3'race-outer：5'-CAACCCATTTTCTTCTCTTCTCTCACG-3'(SEQ ID NO.19)

Della2-3'race-inner：5'-TCCATTCTCCCACTGCTATGTG-3'(SEQ ID NO.20)

Della3-3'race-outer：5'-TTCGCGGGTTCTTCATCCTATGAACC-3'(SEQ ID NO.21)

Della3-3'race-inner：5'-AGCCACACTCAGACCTCACGTGC-3'(SEQ ID NO.22)

Della4-3'race-outer：5'-TTCGCGGGTTCTTCATCCTATGAACC-3'(SEQ ID NO.23)

Della4-3'race-inner：5'-CTCAGCCAAGGACAACGATCTTAC-3'(SEQ ID NO.24)

使用TaKaRa LA Taq(TaKaRa Code:DRR02)进行PCR反应。PCR反应结束后，取10μl的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认3'RACE PCR扩增产物，AhDELLA1、AhDELLA2、AhDELLA3和AhDELLA4的3'端分别得到大约220bp、2500bp、3000bp、3000bp的条带，记作AhDELLA1-3'、AhDELLA2-3'、AhDELLA3-3'和AhDELLA4-3'。

1.4RACE扩增产物的切胶回收：

电泳后切胶回收使用的是TaKaRa公司的TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNAExtraction Kit Ver.3.0(TaKaRa Code:9762)试剂盒，步骤参照说明书，制得回收的DNA片段：AhDELLA1-5'、AhDELLA3-5'、AhDELLA4-5'、AhDELLA1-3'、AhDELLA2-3'、AhDELLA3-3'和AhDELLA4-3'。

1.5将回收的DNA片段分别连接pMD^TM 18-T Vector(购自TaKaRa Code:6011)载体。

连接体系如下：

将上述a、b、c反应物混匀，16℃反应过夜，用于转化大肠杆菌DH5α。

1.6大肠杆菌感受态细胞的制备：

(1)挑取E.coil DH5α单菌落接种到约5ml的LB液体培养基，于37℃，250rpm震荡培养过夜；

(2)次日将此菌液以1wt％的接种量转移至100ml的LB液体培养基中，继续培养至吸光度OD₆₀₀＝0.4左右；

(3)将此菌液冰浴10min，在无菌条件下转移至预先冰冷的50ml离心管中，4℃、5000rpm离心10min，收集菌体；

(4)重悬于10ml预冷的0.1mol/L的CaCl₂中，冰浴10min，4℃、5000rpm离心10min，收集菌体；

(5)重悬于2ml(含15wt％甘油)的预冷的0.1mol/L的CaCl2中，分装成100μl/管，-70℃保存备用。

1.7转化大肠杆菌：

(1)从-70℃冰箱取出大肠杆菌感受态细胞置于冰上溶解；

(2)将10μl连接体系加至感受态细胞中，充分混匀，冰上放置30min；

(3)42℃热激90s，在此过程中不要晃动离心管；

(4)热激完毕后立即取出放于冰上2min；

(5)加入600μl的LB液体培养基，37℃，200rpm孵育1h；

(6)将菌液涂布在氨苄霉素(Amp，50mg/L)抗性的LB固体平板上，37℃培养12h；

(7)将平板放入4℃保存。

1.8质粒的提取：

(1)用灭菌的牙签挑取单克隆菌斑，放入添加氨苄霉素(Amp，50mg/L)的LB液体培养基中，于37℃，250rpm震荡培养过夜；

(2)将菌液转移到离心管中，室温8000rpm离心2min，收集菌体；

(3)倒去上清液，将离心管倒扣在吸水纸上，使残余的液体流出；

(4)加入100μl预冷的溶液Ⅰ，在涡旋振荡器上剧烈震荡重悬菌体，其中所述溶液Ⅰ配方为：50mmol/L葡萄糖、25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、10mmol/L EDTA(pH8.0)；

(5)加入200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，轻柔颠倒混匀10次，冰浴5min，其中所述溶液Ⅱ配方为：0.2mol/L NaOH、1wt％十二烷基硫酸钠(SDS)；

(6)加入150μl预冷的溶液Ⅲ，轻柔地颠倒10次，冰浴5min，4℃12000rpm离心10min，其中所述溶液Ⅲ配方为：5mol/L乙酸钾60ml、3mol/L冰乙酸11.5ml、H₂O 28.5ml、pH5.2；

(7)将上清转移到另一干净的离心管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(体积比为25:24:1)，反复混匀，4℃12000rpm离心10min；

(8)将上清转移到另一干净的离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(体积比为24:1)，反复混匀，4℃12000rpm离心10min；

(9)将上清转移到干净的离心管中，加入等体积预冷(-20℃)的异丙醇，混匀后-20℃沉淀1h，4℃12000rpm离心10min；

(10)倒掉上清，加入500μl体积百分比为70％的乙醇洗涤沉淀两次，空气中干燥；

(11)加入TE溶液和2μl RNaseA，37℃消化0.5h，制得质粒：pMD18-T-AhDELLA1-5'、pMD18-T-AhDELLA3-5'、pMD18-T-AhDELLA4-5'、pMD18-T-AhDELLA1-3'、pMD18-T-AhDELLA2-3'、pMD18-T-AhDELLA3-3'和pMD18-T-AhDELLA4-3'。

1.9质粒的酶切检测：

(1)用pMD18-T载体两端的酶切位点Eco RI、Hind III对质粒进行双酶切，

酶切体系：

(2)37℃酶切3h，取10μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果证明pMD18-T-AhDELLA1-5'、pMD18-T-AhDELLA3-5'、pMD18-T-AhDELLA4-5'、pMD18-T-AhDELLA1-3'、pMD18-T-AhDELLA2-3'、pMD18-T-AhDELLA3-3'和pMD18-T-AhDELLA4-3'分别酶切出大小合适的条带。

1.10序列测定：

以上步骤中获得的阳性克隆pMD18-T-AhDELLA1-5'、pMD18-T-AhDELLA3-5'、pMD18-T-AhDELLA4-5'、pMD18-T-AhDELLA1-3'、pMD18-T-AhDELLA2-3'、pMD18-T-AhDELLA3-3'和pMD18-T-AhDELLA4-3'测序后，将序列结果进行NCBI BLAST比对，确认序列正确，并与已知序列进行拼接，得到DELLA基因家族AhDELLA1、AhDELLA2、AhDELLA3和AhDELLA44个基因的全长序列；其中AhDELLA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，转录翻译后的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；AhDELLA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，转录翻译后的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；AhDELLA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，转录翻译后的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；AhDELLA4的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，转录翻译后的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

1.11PCR克隆DELLA基因家族AhDELLA1、AhDELLA2、AhDELLA3、AhDELLA4基因及AhGID1基因的全长序列：

设计克隆全长引物，以花生果针cDNA为模板扩增基因的全长。

DELLA1-F：5'-TCTAGAATGAAGAGGGAGCACCACC-3'(SEQ ID NO.25)；

DELLA1-R：5'-CTGCAGTTAACTCAGTGAGCAACCAC-3'(SEQ ID NO.26)；

DELLA2-F：5'-GGATCCATGAAGAGGGATCACAGTG-3'(SEQ ID NO.27)；

DELLA2-R：5'-GTCGACCTAAGACTCGCCGCCAGAAG-3'(SEQ ID NO.28)；

DELLA3-F：5'-GGATCCATGATAACCGACGATAATATATTCG-3'(SEQ ID NO.29)；

DELLA3-R：5'-GTCGACTCGTTAGTTCGTTCACTCAATGG-3'(SEQ ID NO.30)；

DELLA4-F：5'-GGATCCATGATAACCGACGATAATATATTCG-3'(SEQ ID NO.31)；

DELLA4-R：5'-GTCGACGTTAGCTCGCTCACTCAATGG-3'(SEQ ID NO.32)；

GID1-F：5'-ATGGCTGGAAGTAATGAAGTC-3'(SEQ ID NO.33)；

GID1-R：5'-GGCGGTGGTAGTATATTAACAGTT-3'(SEQ ID NO.34)；

(1)反转录反应：利用花生总RNA为模板，使用PrimeScript^TM 1st Strand cDNASynthesis Kit反转录试剂盒(TaKaRa Code:6110A)，参照说明书，反转录合成花生单链cDNA。

(2)使用Pyrobest^TM DNA Polymerase(TaKaRa Code:R005Q)高保真酶进行PCR扩增：

PCR反应体系如下：

按以下条件进行PCR反应：

置PCR仪上按以下程序进行扩增：94℃预变性3min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃终延伸10min。

PCR反应结束后，使用加A反应液(购自天根生化科技有限公司，货号RT124)将PCR扩增产物3'端加A，实验步骤参照加A反应液说明书。取20μl产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认AhDELLA1、AhDELLA2、AhDELLA3、AhDELLA4和AhGID1基因PCR扩增产物长度约为1817bp、1749bp、1611bp、1611bp、1035bp，与预期结果相符合。

(3)DNA片段回收同实施例1步骤1.4。

(4)连接pMD18-T载体同实施例1步骤1.5。

(5)大肠杆菌感受态细胞的制备及转化同实施例1步骤1.6、实施例1步骤1.7。

(6)质粒的提取同实施例1步骤1.8。制得质粒：pMD18-T-AhDELLA1、pMD18-T-AhDELLA2、pMD18-T-AhDELLA3、pMD18-T-AhDELLA4和pMD18-T-AhGID1。

(7)质粒的酶切检测：

用pMD18-T载体上自带的限制性内切酶Bam HI、Sal I双酶切质粒中基因片段两端的酶切位点，酶切体系：

37℃酶切3h，取10μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果证明pMD18-T-AhDELLA1、pMD18-T-AhDELLA2、pMD18-T-AhDELLA3和pMD18-T-AhDELLA4分别酶切出大小合适的条带。

(8)序列测定：

以上步骤中获得的阳性克隆质粒pMD18-T-AhDELLA1、pMD18-T-AhDELLA2、pMD18-T-AhDELLA3、pMD18-T-AhDELLA4和pMD18-T-AhGID1测序后，将序列结果进行NCBI BLAST比对，确认序列正确，得到编码花生DELLA蛋白基因家族的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10所示。

上述LB液体培养基配方如下：

称取10g胰蛋白胨(Typtone)，5g酵母提取物(Yeast extract)，5g NaCl，用1MNaOH调pH值约7.0，加双蒸水定容至1000mL，121℃灭菌15min备用；

LB固体培养基为在每升上述LB液体培养基中加入15g的琼脂制得。

实施例2：花生DELLA蛋白的同源性分析

花生DELLA蛋白基因家族氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7所示。

在NCBI网站查找以下物种的DELLA蛋白：拟南芥、小麦、大豆、大麦、水稻、蓖麻、豌豆，并利用DNAMAN软件进行氨基酸序列同源性比较(图1)。结果显示，AhDELLA1和AhDELLA2分处于两枝，与其他物种的DELLA蛋白的氨基酸序列一致性分别在70％和65％左右；而AhDELLA3和AhDELLA4两蛋白之间同源性很高，达到97％，但与其他物种的同源性较低。说明AhDELLA3和AhDELLA4两蛋白可能功能相似，但与AhDELLA1和AhDELLA2不同的是，AhDELLA3和AhDELLA4两蛋白在花生中可能具有独特的作用。

实施例3：DELLA基因家族在花生不同组织中的表达模式分析

3.1植物中RNA的提取：

同实施例1中的1.1步骤，分别提取花生幼年茎(15天，JS)、成年茎(40天，AS)、幼年叶片(15天，JL)、成年叶片(40天，AL)、根(JR)、花(F)、未入土的果针(G0)，入土3天的果针(G3)，入土9天的果针(G9)以及未成熟种子(S)等不同时期不同组织的总RNA。

3.2花生不同组织cDNA的获得：

同实施例1中的1.11步骤(1)。

3.3利用荧光定量PCR技术分析DELLA基因家族基因的表达模式：

以AhActin为体系内参，引物序列为：

AhActinqF:5'-GTCATCGT CATCCTCTTCTC-3'(SEQ ID NO.35)；

AhActinqR:5'-CATTCCTGTTCCATTGTCAC-3'(SEQ ID NO.36)；

用于DELLA基因家族基因荧光定量的引物为：

DELLA1qF:5'-GGACCCGATTTGGTTCTG-3'(SEQ ID NO.37)；

DELLA1qR:5'-CCGTTATTCTCTTCCACTCTG-3'(SEQ ID NO.38)；

DELLA2qF:5'-AGAAATGCTTGAGATCCGAC-3'(SEQ ID NO.39)；

DELLA2qR:5'-GGCTTGATCTTCTTAACCGT-3'(SEQ ID NO.40)；

DELLA3qF:5'-GAGAACGACGGGTGTCTG-3'(SEQ ID NO.41)；

DELLA3qR:5'-ACCGATTCCGAGAAACCAG-3'(SEQ ID NO.42)；

DELLA4qF:5'-GAGAACGACGGGTGTCTC-3'(SEQ ID NO.43)；

DELLA4qR:5'-GAGTCAGTCAACTCGTTAGC-3'(SEQ ID NO.44)。

荧光定量PCR反应条件为：95℃10min；95℃15s，60℃1min，共进行40个循环。AhDELLA1和AhDELLA2在花生的根、茎、叶、花、果针和种子中均有不同程度的表达。AhDELLA1在幼叶中表达量较低，在花和种子中表达量较高。而在荚果发育初期的不同阶段，AhDELLA1在果针中的表达略微升高(如图2a所示)。AhDELLA2在幼叶和幼根中表达量较低，在花中表达量较高。而在在荚果发育初期的不同阶段，AhDELLA2的表达变化不明显(如图2b所示)。

AhDELLA3和AhDELLA4的表达模式较为一致，它们主要在花和种子中表达，在幼叶中也有少量表达，而在其他器官中的表达都极低。在荚果发育初期的不同阶段，在未入土或刚入土3天的果针中表达量极低，而果针入土9天后有明显的升高，均比入土前升高十倍以上，说明AhDELLA3和AhDELLA4两个基因在花生荚果发育过程中很可能起到重要的作用(如图2c、2d所示)。

实施例4：AhDELLA基因家族在逆境胁迫下的表达模式分析

4.1花生逆境胁迫处理方法：

分别用250mM NaCl和20％的PEG 6000溶液处理生长12天的花生幼苗，分别于处理0、3、6、12、24和48小时时，收取叶片材料。

4.2RNA的提取与cDNA的获得：

同实施例3中的3.1和3.2步骤。

4.3利用荧光定量PCR技术分析AhDELLA基因家族在逆境胁迫下的表达模式：

引物序列和反应条件同实施例3中的3.3。

如图3所示，AhDELLA1和AhDELLA2的表达在干旱胁迫6小时时表达量有明显增加，并分别于24小时和12小时时明显下降。AhDELLA3和AhDELLA4的表达在处理6小时明显升高并在12小时时达到最高幅度，分别是处理前的3170倍和4410倍，之后开始下降。AhDELLA3和AhDELLA4的表达变化倍数显著高于AhDELLA1和AhDELLA2的变化倍数。

如图4所示，在250mM NaCl高盐胁迫处理下，AhDELLA1和AhDELLA2的表达没有明显的变化，然而AhDELLA3和AhDELLA4在处理3小时后明显升高，之后持续升高，直到处理48小时时达到最高。结果说明AhDELLA3和AhDELLA4受胁迫诱导显著，可能与花生抗逆相关。

实施例5：AhDELLA转基因植物表达载体的构建(以pCAMBIA2300-AhDELLA1为例，如图5所示)

5.1将测序正确的pMD18-T-AhDELLA1进行Xba I/Pst I双酶切：

37℃酶切4h，体系全部上样进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳后有两条带，切取1817bp片段，切胶回收，回收步骤同实施例1.4。

5.2分别用同样两种酶双酶切pCAMBIA2300载体(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)，双酶切体系：

37℃酶切4h，体系全部上样进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳后有一条9.4Kb左右的条带，切胶回收，回收步骤同实施例1.4，得到双酶切的pCAMBIA2300片段。

5.3将两个回收片段用T4连接酶连接，连接体系如下：

将上述i、ii、iii、iv反应物混匀，16℃反应过夜，用于转化大肠杆菌DH5α。

5.4大肠杆菌感受态细胞的制备同实施例1步骤1.6；转化方法同步骤1.7，筛选标记为卡那霉素(Kan，50mg/L)。

5.5质粒的提取同实施例1步骤1.8，制得植物表达载体pCAMBIA2300-AhDELLA1。

5.6质粒的酶切检测：

(1)双酶切体系同实施例5.1步骤。

(2)37℃酶切2h，取10μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果显示有一条1817bp左右的条带和9.4Kb左右的条带，证明植物正义表达载体pCAMBIA2300-AhDELLA1构建成功。

另外，AhDELLA2、AhDELLA3、AhDELLA4分别均通过Bam HI和Sal I两种限制性内切酶从含有对应基因的pMD18-T载体上酶切出片段，再连接到pCAMBIA2300载体上。

实施例6：表达载体转化农杆菌(以pCAMBIA2300-AhDELLA1为例)

6.1农杆菌感受态细胞的制备：

(1)挑取单菌落(农杆菌EHA105)接种到约3ml的LB液体培养基中，于28℃，220rpm震荡培养至OD600＝0.5；

(2)吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；

(3)5000rpm离心30s，弃去上清液；

(4)沉淀用1.5ml 0.5M NaCl悬浮，冰浴20min；

(5)5000rpm离心30s，弃去上清液；

(6)每管用100μl 20mM CaCl2悬浮，用于转化，-70℃保存备用，制得农杆菌感受态细胞。

6.2转化农杆菌：

(1)在50μl农杆菌感受态细胞中加入植物表达载体pCAMBIA2300-AhDELLA10.1-1μg(5-10μl)，之后冰浴30min；

(2)放入液氮中1.5min，然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；

(3)取出离心管，加入0.5ml LB液体培养基，于28℃，220rpm震荡培养3至5h；

(4)取出菌液于含有50mg/L的卡那霉素和50mg/L的利福平的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养2天，菌落可见，制得转化农杆菌。

6.3重组农杆菌鉴定：

(1)从LB平板上挑取单菌落，接种于含有50mg/L的卡那霉素和50mg/L的利福平的LB液体培养基中，28℃震荡培养过夜；

(2)PCR反应体系：Taq酶缓冲液(含有Mg2+)2.5μl，dNTP(2.5mM)1μl，DELLA1-F引物、DELLA1-R引物(10μM)各1μl，步骤2制得的菌液2μl，Taq酶(购自TaKaRa公司)0.3μl，加灭菌双蒸水至25μl；

(3)PCR反应程序：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1.5min，35循环，72℃10min，4℃保存。取10μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测到1817bp左右的条带，证明农杆菌中转入植物表达载体pCAMBIA2300-AhDELLA1。

实施例7：AhDELLA转基因烟草的获得(以pCAMBIA2300-AhDELLA1为例)

7.1转基因烟草的获得

取适量SR1烟草种子于1.5ml灭菌EP管中，用体积百分数为75％乙醇消毒1min，无菌水冲洗3-5次。20wt％次氯酸钠对种子消毒5-10min，无菌水冲洗3-5次；

将种子均匀铺洒到1/2MS0基本培养基上，在25℃的培养室中发芽，获得无菌苗；

挑取转化农杆菌接种到含有50μg/mL卡那霉素、50μg/mL利福平的100mlYEP液体培养基中，28℃培养箱，200rpm振荡培养24h至OD600＝0.4-0.6；

5000rpm，离心10min收集菌体，将菌体重悬在等体积的MS0液体培养基中，供侵染使用；

用灭菌的打孔器切取无菌生长的烟草叶片，将叶圆盘浸入菌液中1.5min，取出，无菌滤纸吸干多余菌液，接入不含抗生素的分化培养基(添加6-BA 1mg/L和NAA 0.1mg/L的MS0培养基)中，25℃暗培养2d，制得外植体；

将外植体转入选择培养基(添加6-BA 1mg/L、NAA 0.1mg/L、250mg/L头孢霉素和150mg/L卡那霉素的MS0培养基)上筛选抗性再生苗，约两周更换一次培养基；

待再生苗长至1cm时切下，转入含250mg/L头孢霉素和150mg/L卡那霉素的1/2MS0培养基中，诱导生根；

待转基因烟草长至3-4片叶，根系发育良好后，炼苗1d，移入装有培养基质(购自山东商道生物科技有限公司)的花盆中。

上述YEP液体培养基配方如下：

称取10g胰蛋白胨，10g酵母提取物，5g NaCl，用1M NaOH调pH值约7.0，加双蒸水定容至1000mL，121℃灭菌15min备用。固体培养基加入15g的琼脂。

上述MS₀液体培养基配方如下：

称取4.7g MS干粉(购自北京宜科思源科技有限公司)，20g蔗糖，用1M NaOH调pH值约5.8，加双蒸水定容至1000mL，121℃灭菌15min备用。固体培养基加入0.7wt％的琼脂。

上述1/2MS0培养基配方如下：

称取2.35g MS干粉(购自北京宜科思源科技有限公司)，10g蔗糖，用1M NaOH调pH值约5.8，加双蒸水定容至1000mL，121℃灭菌15min备用。固体培养基加入0.7wt％的琼脂。

7.2转基因烟草基因组DNA的提取：

(1)在液氮中研磨100mg新鲜或-70℃冷冻的样品材料，放入离心管中；

(2)迅速加入600μl 65℃预热的CTAB提取液，充分混匀，65℃水浴30min，每隔5min轻轻摇动离心管；

(3)加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(酚：氯仿：异戊醇体积比为25:24:1)，混匀，室温放置10min，然后12,000rpm室温离心10min。小心将上清转移到新离心管中，加入等体积酚/氯仿(体积比1:1)重复抽提一次；

(4)吸上清到新1.5mlEp管中，加入等体积预冷的异丙醇，充分混匀后，在-20℃放置30min沉淀DNA；

(5)在室温条件下，12,000rpm离心10min，弃上清，用体积百分数为70％乙醇冲洗沉淀两次，再用无水乙醇洗沉淀，在超净台上将乙醇吹干后，用50μl蒸馏水溶解DNA，制得烟草DNA。

7.3转基因烟草PCR检测：

(1)利用AhDELLA1基因的克隆引物SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26进行PCR鉴定。

(2)PCR反应体系：Taq酶缓冲液(含有Mg2+)2.5μl，dNTP(2.5mM)1μl，NPTⅡ-Forward引物、NPTⅡ-Reverse引物(10μM)各1μl，烟草DNA 1μl，Taq酶(购自TaKaRa公司)0.3μl，加灭菌双蒸水至25μl。

(3)PCR反应程序：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，30循环，72℃10min，4℃保存。取10μl进行琼脂糖凝胶电泳检测(图6)，结果PCR扩增得到714bp的片段。

实施例8：

获得的转AhDELLA1～AhDELLA4基因烟草移至土中，温室培养生长2个月，与野生型烟草比较差异明显，主要表现为不同程度的植株矮化，植株下部叶片发黄(图7)，生长约3个月，成熟期植株明显比野生型矮小，叶片黄化(图8)。根据以上结果，可以看出DELLA基因具有抑制植株生长和促进早衰的作用，这种抑制作用在植物抵御逆境胁迫过程中具有正向意义。

Claims

1.编码花生AhDELLA3蛋白的基因在抑制烟草的植株生长和促进早衰的抗逆性状中的应用，所述的编码花生AhDELLA3蛋白的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.编码花生AhDELLA4蛋白的基因在抑制烟草的植株生长和促进早衰的抗逆性状中的应用，所述的编码花生AhDELLA4蛋白的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。