CN104844699B - 大豆GmNEK1蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大豆GmNEK1蛋白及其编码基因与应用。本发明提供如下1）‑3）中任一种物质在调控植物耐逆性、调控植物生物量和/或调控植物产量中的应用：1）蛋白GmNEK1；2）编码蛋白GmNEK1的DNA分子；3）含有编码蛋白GmNEK1的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；所述蛋白GmNEK1的氨基酸序列为序列表中的序列2。本发明的实验证明，所述蛋白及其编码基因对培育耐逆且籽粒和生物量高产植物品种具有重要意义。

Description

大豆GmNEK1蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及大豆GmNEK1蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

环境中物理、化学因素的变化，例如干旱、盐碱、冷害、冻害、水涝等胁迫因素以及生物因素，例如病虫害对植物的生长发育具有重要的影响，严重时会造成农作物大规模减产，培育耐逆性作物是种植业的主要目标之一。提高作物的耐逆性，除了利用传统的育种方法，目前，分子遗传育种已经成为科技工作者所关注的领域之一。在非生物和生物逆境的胁迫下，高等植物细胞有多种途径感受和应答外界环境中物化参数的变化，将胞外的信号变为胞内信号，经过一系列磷酸化级联反应将信号传递到细胞核，经转录因子调控相关的功能基因，启动逆境应答基因的表达，提高植物的耐逆性。

发明内容

本发明的一个目的是提供大豆GmNEK1蛋白及其编码基因。

本发明提供的蛋白，是如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。

上述蛋白中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

编码上述蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围。

上述DNA分子是如下（1）-（4）中任一种的DNA分子：

（1）编码区为序列表中的序列1所示的DNA分子；

（2）编码区为序列表中序列1自5’末端第1-1827位核苷酸所示的DNA分子；

（3）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA序列杂交且具有相同功能的蛋白的DNA分子；

（4）与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。

上述严格条件为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

上述重组载体为将上述DNA分子插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。

在本发明的实施例中，表达载体为pBIN438，重组载体为将序列表序列1自5’末端第1-1827位核苷酸插入pBIN438植物表达载体的BamHI和KpnI酶切位点之间得到的重组载体。

扩增上述DNA分子全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围，具体如下：

NEK1-F 5' CGCGGATCCATGGAGCAGTACGAAATTCTAGAAC 3'

NEK1-R 5' CGGGGTACCGGCCACAGTTTCCTTGAAGCTCT 3'

上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控植物耐逆性、调控植物生物量和/或调控植物籽粒产量中的应用也是本发明保护的范围；

所述调控植物耐逆性为提高植物耐逆性；

所述调控植物生物量为提高植物生物量；

所述调控植物籽粒产量为提高植物籽粒产量。

所述耐逆性具体为耐盐性、耐旱性和/或耐低温；

所述生物量具体通过叶宽和/或叶长体现。

所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为将编码上述蛋白的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物具有如下1）-3）中至少一种特征：

1）所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物；

2）所述转基因植物的生物量高于所述目的植物；

3）所述转基因植物的籽粒产量高于所述目的植物。

上述方法中，所述耐逆性为耐盐性、耐旱性和/或耐低温；

所述生物量通过叶宽和/或叶长体现；

所述编码上述蛋白的DNA分子通过上述的重组载体导入目的植物。

上述方法中，所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。

上述低温为-6℃，上述生物量为单株生物量，上述籽粒产量通过9株籽粒重体现。

可用现有的植物表达载体构建含有GmNEK1基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用GmNEK1构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin），它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

本发明基因可通过如下方式导入宿主中：将本发明基因插入表达盒中，再将表达盒通过植物表达载体、非致病自我复制的病毒或弄杆菌导入宿主。携带本发明基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织。

本发明的实验证明，本发明发现了大豆GmNEK1蛋白及其编码基因，并通过转基因实验，验证该蛋白及其基因具有提高植物生物量、籽粒产量及耐逆性功能，转入本发明基因的植物的生物量、籽粒产量和耐逆性明显高于野生型受体植物，如转基因拟南芥，经过盐、干旱或低温处理后，转基因植物的恢复情况明显好于野生型拟南芥，且存活率、抽薹率等都较对照组有显著提高。同时，转入本发明基因的转基因植物的每株生物量和籽粒总产量也明显高于对照，过量表达本发明所述基因的各转基因株系其耐旱、耐盐和耐低温性及单株生物量和籽粒产量均与转基因植株中本发明所述基因的表达量呈正相关，进一步表明本发明所述蛋白及其编码基因对培育耐逆且高产植物品种，特别是培育耐非生物胁迫如耐干旱和/或耐盐和/或耐低温且高产植物品种，从而提高农作物产量具有重要意义。因此，本发明蛋白及其编码基因有广阔的应用前景。

附图说明

图1为盐处理大豆幼苗时GmNEK1基因的表达

图2为GmNEK1过表达载体示意图

图3为GmNEK1过表达转基因株系分子鉴定

图4为GmNEK1过表达拟南芥在正常条件下的表型

图5为GmNEK1过表达植株的生物量和籽粒产量比较

图6为GmNEK1过表达株系和对照在不同盐浓度下的表型

图7为GmNEK1过表达株系和对照在土壤含水量为30%时的表型

图8为GmNEK1过表达株系和对照低温处理24h的表型

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

农杆菌GV3101菌株记载在Clough-SJ,Bent-AF.Floral dip:a simplifiedmethod for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.Plant-Journal.1998,16:6,735-743中，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

哥伦比亚生态型拟南芥(col-0)：种子购自Arabidopsis Biological ResourceCenter(ABRC)，以下简称野生型拟南芥。

pBIN438载体（双元表达载体）由方荣祥院士惠赐。记载于李太元,田颖川,秦晓峰,等.高效抗虫转基因烟草的研究[J].中国科学(B辑),1994,24(3):276-282.)，公众经方荣祥院士同意后可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

实施例中的大豆为大豆科丰1号（Glycine max L.Merr.Kefeng 1）记载在W.K.Zhang,Y.J.Wang,G.Z.Luo,J.S.Zhang,C.Y.He,X.L.Wu,J.Y.Gai,S.Y.Chen,QTLmapping of ten agronomic traits on the soybean(Glycine max L.Merr.)geneticmap and their association with EST markers,Theor.Appl.Genet,2004,108:1131-1139中，公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

实施例1、大豆GmNEK1基因的克隆

1、GmNEK1基因的克隆

采用异硫氰酸胍-酚-氯仿的方法进行提取大豆科丰1号（Glycine maxL.Merr.Kefeng 1）总RNA（Zhang et al.2001 A two-component gene(NTHK1)encoding aputative ethylene-receptor homolog is both developmentally and stress-regulated in tobacco.Theor Appl Genet 102:815-824)，使用Promega试剂盒（购自Promega公司）PolyAT tract mRNA isolation system Ⅳ进行mRNA分离纯化，分离得到的mRNA用紫外分光光度计进行定量，然后反转录得到cDNA。根据已经公布的大豆基因组序列中相应基因序列，设计引物：

NEK1-F 5' CGCGGATCCATGGAGCAGTACGAAATTCTAGAAC 3'

NEK1-R 5' CGGGGTACCGGCCACAGTTTCCTTGAAGCTCT 3'

以反转录得到的cDNA为模板，以上述引物进行PCR扩增。对PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，PCR扩增产物的大小约为1.8kb,与预期结果相符。

用琼脂糖凝胶回收试剂盒（TIANGEN）回收该片段。将该回收片段与pGEM-T Easy（Promega）连接，参照Cohen等的方法，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明该PCR产物具有序列表中的序列1的核苷酸序列，该PCR产物的基因命名为GmNEK1，其ORF为序列1的自5’末端第1-1830位核苷酸。该基因编码的蛋白命名为GmNEK1，该蛋白的氨基酸序列为序列表的序列2，序列表中的序列2由609个氨基酸组成。

2、GmNEK1基因的在盐胁迫下的表达模式

将2周龄的大豆幼苗的根系置于200mM NaCl水溶液中，分别在光照培养0小时、3小时、6小时和12小时后取样。制备每个样本的总RNA，每泳道上样量为15μg，以GmNEK1为探针，进行Real-time PCR分析。

结果如图1所示，可以看出，200mM NaCl处理3小时时，GmNEK1基因的表达即明显升高，并在6小时表达量达到最高，之后12小时时下降，但仍高于未处理时。因此GmNEK1是盐响应基因。

实施例2、GmNEK1在调控拟南芥耐逆性中的应用

一、过表达GmNEK1拟南芥株系的获得

1、重组载体的构建

以大豆科丰1的cDNA为模板，以引物NEK1-F和NEK1-R进行PCR扩增，得到1.8kb的PCR产物，即为GmNEK1全长cDNA。

用BamHI和KpnI双酶切上述PCR产物，回收酶切产物，将酶切产物与经过同样酶切的植物表达载体pBIN438连接，得到重组载体pBin438-GmNEK1（结构示意图如图2）。

经过测序，该重组载体为将序列表序列1自5’末端第1-1827位核苷酸插入pBIN438植物表达载体的BamHI和KpnI酶切位点之间得到的重组载体，且插入方向为GmNEK1正向插入。

2、过表达GmNEK1拟南芥株系的获得

将重组载体pBin438-GmNEK1用电击转化法导入农杆菌GV3101菌株（Clough-SJ,Bent-AF.Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediatedtransformation of Arabidopsis thaliana.Plant-Journal.1998,16:6,735-743；公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。），得到重组菌GV3101/pBin438-GmNEK1。

将重组菌进行菌液PCR鉴定，引物为:

RNEK1-F:5’-AATCATCCGCATCTTCAACCTT

RNEK1-R:5’-TTGCTGAATGAGAATCGTTTGC

得到约1.8kb片段的重组菌提取质粒测序，结果为该质粒为pBin438-GmNEK1，将含有质粒的重组菌命名为GV3101/pBin438-GmNEK1。

挑取GV3101/pBin438-GmNEK1的单菌落在5mlLB中，于28℃培养8-12小时，再转接到200mlLB中继续培养3-6小时，收菌后重悬于LB培养基中得到转化液。将野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana）Col-0的花浸泡于转化液中10s，取出后放入MS培养基中避光培养8-12小时，获得T0代转化种子，将其播于含卡那霉素（50mg/L）的MS培养基上，获得31株T0代转GmNEK1拟南芥。

3、过表达GmNEK1拟南芥株系分子鉴定

提取上述31株T0代转GmNEK1拟南芥植株的RNA，并反转录获得cDNA，分别进行RT－PCR鉴定，引物同上。

部分结果示于图3，为GmNEK1在过表达植株中的表达量与对照Col0中的表达量比值，可以看出，GmNEK1在对照野生型拟南芥中的表达量几乎为0。在所鉴定的5个转基因株系中，1-26中GmNEK1的相对表达量最高，1-27中次之，1-25中第三，1-22中第四，而1-18中GmNEK1的的表达量虽高于对照，但与其它植株相比较低。

因此，T0代转GmNEK1拟南芥均为过表达GmNEK1拟南芥株系。

上述T0代转GmNEK1拟南芥株系1-25、1-26、1-27、1-18和1-22经过3代连续筛选，分别获得T3代转GmNEK1拟南芥纯系1-25、1-26、1-27、1-18和1-22。

采用同样的方法，将空载体pBIN438载体转入野生型拟南芥（Arabidopsisthaliana）Col-0中，得到T0代转空载体拟南芥，按照上述方法检测，没有目的基因的表达，自交，直到得到T3代转空载体拟南芥。

二、过表达GmNEK1拟南芥株系表型分析

将T3代转GmNEK1拟南芥纯系1-25、1-26、1-27、1-18和1-22、T3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥Col-0种于蛭石中，观察各植株表型。实验重复3次，结果取平均值。

结果如图4所示，为野生型拟南芥Col-0和转基因株系苗期、抽穗期和成熟期的表型，由图可见，在所有三个时期中，T3代转GmNEK1拟南芥纯系株系长势均明显优于野生型拟南芥Col-0。

图5统计了野生型拟南芥Col-0和T3代转GmNEK1拟南芥纯系各株系叶宽、叶长和每9株籽粒重（由于拟南芥的种子很小，为方便称量，以9株为单位），结果如下：

Col-0、1-18、1-22、1-25、1-26和1-27的叶宽分别约为：5.7、7.2、6.7、8.4、8.6和8.5毫米，叶长分别约为：19.0、27.0、22.5、30.5、30.0和31.0毫米；Col-0、1-22、1-25和1-26的每9株籽粒重分别约为：0.98、0.97、1.20和1.19克。

上述结果表明，在正常条件下，所有转基因株系的叶宽均极显著大于Col-0，1-18、1-25、1-26和1-27的叶长极显著大于Col-0而1-22则显著大于Col-0。籽粒重平均数表明，1-25和1-26显著重于Col-0，而1-22与Col-0没有明显差异。1-22株系中外源基因GmNEK1的表达量明显低于其它转基因株系，叶宽、叶长所表示的生物量及籽粒重统计数均表明其与Col-0的差异低于其它转基因株系。

T3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥Col-0结果如显著差异。

因此，转GmNEK1拟南芥的表型变化与GmNEK1的表达水平相关，转基因株系的生物量和籽粒重与GmNEK1的表达量呈正相关。

三、过表达GmNEK1拟南芥株系的耐盐、耐旱和耐低温鉴定

1、耐盐性鉴定

将T3代转GmNEK1拟南芥纯系1-25、1-26、1-27、1-18和1-22、T3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥Col-0在MS培养基上生长5天且生长一致的苗移至分别含有125mM和150mMNaCl的MS培养基上继续生长9和7天。各类株系各15株，实验重复三次，结果取平均值。

存活率统计如图6所示，A为在125mM NaCl处理下表型观察（左图）和数值统计结果（右图），B为在150mM NaCl处理下表型观察（左图）和数值统计结果（右图）；

可以看出，Col-0和1-18、1-22、1-25、1-26和1-27在125mM NaCl处理时，存活率分别约为：55%、72%、62%、94%、96%和94%；150mM NaCl处理时，存活率分别约为：29%、50%、40%、66%、85%和63%。

在转基因植株中，GmNEK1的表达量在1-22中最低，1-18中次之，之后是1-26和1-27，1-26中表达量最高。

T3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥Col-0结果如显著差异。

图6的结果表明，在两个盐浓度胁迫下，1-25、1-26和1-27的存活率均极显著高于对照，1-18的存活率显著高于对照，而1-22的存活率高于对照，但是不显著。所有转基因株系中，1-26的存活率为最高，此结果与转基因株系中GmNEK1的表达量呈正相关。因此转基因株系的耐盐性是由于GmNEK1的过表达所致。

2、耐旱性鉴定

将T3代转GmNEK1拟南芥纯系1-25、1-26、1-27、1-18和1-22、T3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥Col-0在MS培养基上生长至有2片真叶后，生长一致的苗移栽至蛭石中恢复3天，使蛭石中含水量保持于30%，14天后，取地上部分，单株烘干，称重。实验中各株系均取15株，实验重复三次，结果取平均值。

结果如图7所示，Col-0、1-18、1-22、1-25、1-26和1-27单株干重分别约为：0.0180、0.0220、0.0205、0.0240、0.0265和0.0270，其中，1-26和1-27与对照相比有极显著差异，1-25和1-18的干重显著高于对照，而1-18的干重高于对照。上述结果与GmNEK1在转基因株系中的表达基本相符。

T3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥Col-0结果如显著差异。

因此GmNEK1基因的过表达可以提高植物的耐旱性。

3、耐低温鉴定

将T3代转GmNEK1拟南芥纯系1-25、1-26、1-27、1-18和1-22、T3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥Col-0在MS培养基上生长至7天后，生长一致的苗移栽至蛭石中恢复3天，分别在-4℃和-6℃处理24小时，在常温下恢复4天。

观察表型如图8所示，可以看出，在-4℃处理后，T3代转GmNEK1拟南芥和野生型拟南芥Col-0相比，-4℃处理处理24小时GmNEK1过表达株系和对照未见明显差异；在-6℃处理后，T3代转GmNEK1拟南芥和野生型拟南芥Col-0相比，生长状态优于野生型拟南芥Col-0。

统计了-6℃低温处理24h的存活率，如图8中所示，Col-0、1-18、1-22、1-25、1-26和1-27的存活率分别约为：13%、38%、25%、87%、95%和79%，1-22的存活率显著高于对照，其它转基因株系均极显著高于Col-0。

T3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥Col-0结果如显著差异。

该结果与GmNEK1的表达量呈正相关，表明GmNEK1的过量表达提高了转基因植株的耐低温（-6℃）性状。

综上所述，GmNEK1的过量表达，提高了转基因植株的生物量、籽粒产量及耐盐、耐旱和耐低温性状。且上述性状与GmNEK1的表达量呈正相关。因此，在受体植物中过表达GmNEK1基因，有望提高受体植物的产量和耐逆性。

Claims (1)

1.如下任一所述在调控植物耐逆性、调控植物生物量和/或调控植物籽粒产量中的应用；

1）一种蛋白，由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2）编码1）所述蛋白的DNA分子；所述DNA分子是如下（A）或（B）的DNA分子：

（A）编码区为序列表中的序列1所示的DNA分子；

（B）编码区为序列表中序列1自5’末端第1-1827位核苷酸所示的DNA分子；

3）含有2)所述DNA分子的重组载体、表达盒或重组菌； 所述重组载体为将所述DNA分子插入表达载体中，得到表达所述蛋白的重组载体；

所述耐逆性为耐盐性、耐旱性和/或耐低温；

所述生物量通过叶宽和/或叶长体现；

所述植物为拟南芥。