CN106554399A

CN106554399A - 大豆GmABC蛋白及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN106554399A
Application number: CN201710033870.2A
Authority: CN
Inventors: 宋雯雯; 段方猛
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2017-01-16
Filing date: 2017-01-16
Publication date: 2017-04-05

Abstract

本发明提供了一种大豆GmABC蛋白及其编码基因和应用，属于基因工程领域。本发明提供如下1)‑3)中任一种物质在提高植物抵抗非生物胁迫的能力中的应用：1)蛋白GmABC；2)编码蛋白GmABC的DNA分子；3)含有编码蛋白GmABC的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；所述蛋白GmABC氨基酸序列为序列表中的序列2。本发明的实验证明，所述蛋白及其编码基因对培育耐逆高产植物品种具有重要意义。

Description

大豆GmABC蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种大豆GmABC蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

ABC(ATP-Binding Cassette)转运蛋白是目前已知最大、功能最广泛的蛋白家族，大多数ABC转运蛋白都能利用水解ATP释放的能量直接转运底物，其中包括肽、糖、脂、重金属螯合物、多糖、生物碱、类固醇、无机离子和谷胱苷肽结合物等多种化合物。ABC转运蛋白在原核和真核生物中与一些重要的生理过程如细菌的耐药性、囊性纤维性变和肿瘤细胞的抗药性等密切相关从而引起了人们的广泛关注。

1992年国际上报道了第一个植物ABC转运蛋白，即从拟南芥(Arabidopsisthaliana)中克隆的AtPGP1(又称为AtMDR1)。此后，研究人员对植物ABC转运蛋白进行了多方面的研究，发现植物ABC转运蛋白在植物生长素的极性转运、脂质的降解、外源毒素的解毒、植物抗病和气孔的功能调节等一系列过程中都发挥作用，因此植物ABC转运蛋白已经成为一类重要的、引起人们重视的蛋白家族。目前拟南芥和水稻(Oryza sativa)全基因组测序工作已经完成，序列分析显示拟南芥和水稻基因组中分别有129个和128个ABC转运蛋白基因，在目前完成全基因组测序的生物中数量远远超过其他生物，高居前两位。然而，关于大豆ABC蛋白的生物学信息知之甚少。ABC转运蛋白在植物次生代谢产物跨膜转运中的作用研究已经成为一个新兴的研究领域,与其他生物ABC转运蛋白的研究相比，植物ABC转运蛋白的研究相对滞后。目前大豆ABC蛋白的功能相关研究也十分少见，研究相对片面。

发明内容

本发明的目的一方面在于提供一种大豆GmABC蛋白，另一方面首次克隆了大豆GmABC蛋白编码基因，还研究了大豆GmABC蛋白抵抗非生物胁迫的功能，本发明的大豆GmABC蛋白能够显著提高植物的耐逆性。

本发明提供了一种蛋白，如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。

上述蛋白中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

另一方面，编码上述蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围。

上述DNA分子是如下(1)-(4)中任一种的DNA分子：

(1)序列表中序列1自5’末端第1-3078位核苷酸所示的DNA分子；

(2)编码区为序列表中序列1自5’末端第76-2781位核苷酸所示的DNA分子；

(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的蛋白的DNA分子；

(4)与(1)或(2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有相同功能的DNA分子。

上述严格条件为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

上述重组载体为将上述DNA分子插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。

上述的表达载体为pCAMBIA3301，重组载体为将序列表序列1自5’末端第76-2781位核苷酸所示的DNA分子插入pCAMBIA3301植物表达载体的NcoI和BglII酶切位点之间得到的重组载体。

扩增上述DNA分子编码区或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围，具体如下：

ORF-F 5’-3’：TCAAGCATGTTGTGAAGGCT，

ORF-R 5’-3’：TGCTGGCCTCTCCAATTTGT。

上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在提高植物抵抗非生物胁迫的能力中的应用也是本发明保护的范围；

所述提高植物抵抗非生物胁迫的能力为提高植物抵抗低温和/或高盐和/或干旱和/或脱落酸胁迫的能力。

所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为将编码上述蛋白的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物至少具有如下特征：所述转基因植物的抵抗非生物胁迫的能力高于所述目的植物。

上述方法中，所述抵抗非生物胁迫的能力为提高植物抵抗低温和/或高盐和/或干旱和/或脱落酸胁迫的能力；

所述编码上述蛋白的DNA分子通过上述的重组载体导入目的植物。

上述方法中，所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。

上述低温胁迫为4℃，上述高盐胁迫为250mmol/L NaCl胁迫，上述干旱胁迫为脱水胁迫0、2、4、6d，上述脱落酸胁迫为100mmol/L脱落酸胁迫处理。

使用GmABC基因重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因、抗草甘膦基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

本发明基因可通过如下方式导入宿主中：将本发明基因插入植物表达载体中，通过农杆菌导入宿主。携带本发明基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织。

本发明的有益效果在于，本发明发现了大豆GmABC蛋白及其编码基因，并通过转基因实验，验证该蛋白及其基因具有提高植物抵抗低温和/或高盐和/或干旱和/或脱落酸等逆境胁迫的能力，转入本发明基因的植物的耐低温、耐高盐、耐干旱和耐脱落酸的能力明显高于野生型受体植物。转基因大豆经过干旱处理后，生长情况明显好于野生型，且都较对照组有显著提高。而本发明的大豆超量表达GmABC基因的植株，能够有效提高转基因植株抵抗干旱的能力进一步表明本发明所述蛋白及其编码基因对培育耐逆的稳产增产植物品种具有广泛应用，对培育耐非生物胁迫如耐干旱和/或耐盐和/或耐低温且高产植物品种，从而提高农作物产量具有重要意义。因此，本发明蛋白及其编码基因有广阔的应用前景，特别是对推动和缩短我国大豆抗旱育种进程，同时对保护我国自主知识产权的大豆基因资源具有重要的意义。

附图说明

图1为GmABC基因的ORF扩增片段电泳图；

图2为利用Real-time PCR方法检测GmABC基因在逆境下的表达模式；

图3为：利用RT-PCR方法检测超表达GmABC基因的转基因植株叶片中GmABC基因的表达情况；

图4为干旱胁迫6d后，野生型和转基因大豆植株的丙二醛、脯氨酸含量和超氧化物歧化酶的比活力；

图5为250mMNaCl溶液浇灌6天后，野生型和转基因大豆植株的丙二醛、脯氨酸含量和超氧化物歧化酶的比活力；

图6为低温胁迫12小时后，野生型和转基因大豆植株的丙二醛、脯氨酸含量和超氧化物歧化酶的比活力；

图7为100mM ABA溶液喷洒3小时后，野生型和转基因大豆植株的丙二醛、脯氨酸含量和超氧化物歧化酶的比活力；

图8为GmABC基因过表达大豆植株干旱处理表型对比。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从常规途径得到。

农杆菌LBA4404，购自英竣公司，产品编号：18313015；

pCAMBIA3301，购自优宝公司，产品编号：VT1386；

实施例中的大豆(Glycine max(L.)Merrill.)为强抗旱品种晋豆23，由山西省农科院经济作物研究所马俊奎惠赠；

可用现有的植物表达载体构建含有GmABC基因的重组表达载体。

实施例1、大豆GmABC基因的克隆

1、GmABC基因的克隆

结合大豆基因芯片数据，筛选出干旱胁迫下表达差异显著的EST，利用其对应的探针GmaAffx.83637.1.S1_at的核苷酸序列搜索大豆基因组数据库,网址为http://www.phytozome.net/soybean。将匹配的基因组序列利用FGENESH程序预测开放阅读框。以预测序列为探针，搜索大豆dbEST数据库，下载匹配序列,BLASTN:score>200；E-value<e-10。将下载的ESTs序列用DNASTAR软件进行第一次拼接和校对，得到重叠群序列contigs。将contigs为目标序列在NCBI数据库上重新搜索匹配序列，并下载匹配序列。再将匹配序列进行拼接。重复以上步骤，直到不能再延伸为止。将最后得到的contig作为目标序列在NCBI上进行BLASTx比对,分析该序列可能为ABC转运蛋白的家族成员。

1)RNA的提取及cDNA的合成

采用TRIZOL法提取大豆晋23叶片总RNA，参照Thermo反转录试剂盒(Cat:K1621)合成cDNA，反应条件为42℃60min，70℃5min。

2)采用RACE方法(具体操作详见Clontech SMART 5’RACE和3’RACE试剂盒说明书)分别获得该基因5’端和3’端的序列，所用引物序列分别为：

5’RACE-GSP1：TTTCTTACGGAAGGTGACC

5’RACE-GSP2：TCTTACGGAAGGTGACCATAC

3’RACE-GSP1：ATGAGCAGCTTGGCTTATT

3’RACE-GSP2：TGTTGTGCTGCTTTGTCTTG

将5’端和3’端的序列拼接后，得到GmABC基因的全长序列，参见序列表1。根据上述序列设计ORF引物，上下游引物分别为：

ORF-F(5’-3’)：TCAAGCATGTTGTGAAGGCT

ORF-R(5’-3’)：TGCTGGCCTCTCCAATTTGT

以反转录的第一链为模板，PCR扩增GmABC基因的ORF。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃复性30s，72℃延伸3min，35个循环；72℃延伸5min；4℃终止反应。电泳结果参见图1，具体电泳片段为2820bp。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收该片段。将该回收片段与pMD18T载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆pMD18T-GmABC并测序。通过DNAMAN对测序得到的序列进行分析，确定包含一个完整的ORF；测序结果表明该PCR产物具有序列表中的序列1的核苷酸序列，该PCR产物的基因命名为GmABC，其ORF为序列1的自5’末端第76-2781位核苷酸。该基因编码的蛋白命名为GmABC，该蛋白的氨基酸序列为序列表的序列2，序列表中的序列2由902个氨基酸组成。

2、GmABC基因在非生物逆境胁迫下的表达模式

对3周苗龄的野生大豆幼苗分别进行低温(4℃)、干旱(脱水胁迫0、2、4、6d)、高盐(250mmol/L NaCl)和脱落酸(100mmol/L ABA)胁迫处理，在处理之前(0h)及处理后1、3、6、12和24h，分别提取幼苗的根系及第一片三出复叶的总RNA，进行实时荧光定量RT-PCR，以野生大豆Actin基因作为内参基因，分析基因在低温、干旱、高盐和脱落酸胁迫处理下的表达模式。所用引物：

qRT-PCR-F(5’-3’)：ATCAGGGAGTGTGGCTCATAAC

qRT-PCR-R(5’-3’)：CGGGCAATTACACCCATAAGA

ACTIN-F(5’-3’)：AACCCCTTGTTTGCGACAATG

ACTIN-R(5’-3’)：TCGAGGTCGGCCAACAATACT

荧光定量PCR仪型号Bio-rad Chromo4，反转录和SYBR定量PCR试剂均购自Takara公司。反应体系(总体积10uL)为：5uL SYBR Premix Ex Taq II，1uL 10uM引物，1uL cDNA，2uL ddH2O。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，68℃复性30s，72℃延伸30s，40个循环。

结果表明：参见图2，低温胁迫下，根系GmABC基因的表达随时间变化幅度小，而叶片中该基因在6h表达量最大，随后逐渐降低；高盐胁迫下该基因在根系和叶片中随时间表达变化差异显著，在3h达到最高，然后逐渐减少，在24h时又升高；该基因在ABA处理下迅速做出应激反应，在1h上调表达显著，叶片中上调近14倍，随时间延长表达量逐渐降低，而根中只在1h时上调表达，3h到24h均显著下调表达；在干旱胁迫下，GmABC基因在叶片和根系中均表现上调表达趋势，且都在胁迫6d时的表达量达到最高，显著上调表达8-9倍。通过该结果可以看出，GmABC蛋白及其基因具有提高植物抵抗低温和/或高盐和/或干旱和/或脱落酸胁迫的能力。

实施例2、GmABC在调控大豆耐逆性中的应用

一、过表达GmABC大豆株系的获得

1、GmABC基因植物超量表达载体的构建

根据序列表1的序列和表达载体的酶切位点，设计引物用于构建重组载体。引物序列分别为

ORF-F(5’-3’)：GAAGATCTTCAAGCATGTTGTGAAGGCT

ORF-R(5’-3’)：CATGCCATGGTGCTGGCCTCTCCAATTTGT

以pMD18T-GmABC重组质粒为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃复性30s，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸5min。利用QIA-quick GelExtraction Kit(购自QIAGEN公司，德国)进行PCR产物的胶回收。回收产物和植物表达载体pCAMBIA3301进行NcoI和Bgl II的双酶切。酶切反应体系总体积为20uL，其中质粒10uL，NcoI和Bgl II各1uL，1××K+BSA 2uL，ddH₂O 6uL。反应条件为37℃孵育3h。酶切后进行凝胶电泳，对目的基因和载体的大片段进行胶回收，然后用T4DNA连接酶(购自NEB公司，美国)对二者进行连接。连接反应体系总体积为5uL，其中目的基因片段1.5uL，载体大片段0.5uL，Reaction buffer 2.5uL，T4DNA连接酶0.5uL。连接条件为4℃孵育16h。获得含有目的基因的重组载体pCAMB IA3301-GmABC，并采用热激法将其转入大肠杆菌感受态细胞中。利用GmABC基因的ORF引物进行PCR鉴定，阳性克隆用于转化农杆菌。

2、过表达GmABC大豆株系的获得

(1)农杆菌感受态细胞的制备:

挑取单菌落接种于5mL YEP液体培养基中(25mg/mL利福平Rif 5uL)，28度，220rpm，振荡过夜培养；

取2mL菌液转入50mL YEP液体培养基中，继续培养使菌液浓度达到OD600＝0.5左右；

转入无菌离心管中，冰浴30min，4度，5000rpm离心5min，弃上清；

加入10mL冰预冷的50mmol/L CaCl₂重悬菌体，冰浴30min；

4℃，5000rpm，离心5min，弃上清；

加入2mL冰预冷的50mmol/L CaCl₂重悬菌体；

用冷却的无菌吸头从感受态细胞悬液中各取200uL分装于无菌离心管中，4度保存。

(2)转化：

将5uL提取的重组质粒加入200uL农杆菌感受态细胞中，混匀；冰浴30min，立即转入液氮速冻5-10min，迅速置于37度水浴5min，立即取出后再冰浴3min；加入800uL YEP液体培养基中，28度，130rpm，4-5小时；将菌液移至YEP固体培养基中(加入1mLkan终浓度50mg/L和0.5mL利福平终浓度25mg/L)均匀涂布整个平板，28度培养36-48小时；挑取单菌落进行液体培养(加入1mLkan终浓度50mg/L和0.5mL利福平终浓度25mg/L)，PCR鉴定阳性克隆。

(3)无菌苗的获得

以东引小粒豆为试验材料，选取健康无病害、无霉菌的成熟大豆种子，将种子放于通风厨内的密闭干燥器中，将96mL次氯酸钠和4mL浓盐酸加入到反应液容器中，消毒12h。

培养基成分如下

萌发培养基为B5盐+MS-C+B5-D+1.0mg/L 6-BA+3％蔗糖+0.8％琼脂粉，pH5.6；

共培养培养基为1/10(B5盐+MS-C)+B5-D+1.67mg/L 6-BA+200uM AS+3％蔗糖+0.8％琼脂粉，pH 5.6；

芽诱导导培养基为B5盐+MS-C+B5-D+1.67mg/L 6-BA+3％蔗糖+0.8％琼脂粉，pH5.6；

芽伸长培养基为B5盐+MS-C+B5-D+1mg/L ZR+1mg/L Asp+0.1mg/L IAA1mg/L+3％蔗糖+0.8％琼脂粉，pH 5.6；

生根培养基为1/2B5盐+MS-C+1.0mg/L IBA+3％蔗糖+0.8％琼脂粉，pH 5.8。

(4)菌液的制备

挑取含有目的基因的农杆菌单菌落，涂在含相应抗生素的固体YEP平板上，28℃暗培养2～3d；

挑取单菌落接种于10m L含有抗生素的YEP液体培养基中，28℃，220rpm培养过夜；

取出菌液以1:100的接种量进行二次活化；

当菌液浓度达到OD₆₀₀＝0.6时，以4000rpm离心10min，弃上清；

用液体共培养培养基重悬菌体至OD₆₀₀＝0.6，作为转化用菌液。

(5)转化程序

外植体准备：取出无菌苗，去掉种皮，保留2～3mm下胚轴，去掉顶芽和腋芽，在子叶节处纵向划7～10刀制造伤口；

浸染：将子叶节放入活化的菌液中浸泡30min；

共培养：取出浸泡的子叶节，用无菌滤纸吸掉多余的菌液。然后将外植体按近轴面朝下接种在共培养培养基中，暗培养3d。共培养培养基中附加200μmol/L AS(Acetosyringone)；

除菌：将共培养后的子叶节转入液体除菌培养基中，25℃，200rpm，摇10min，更换新鲜液体除菌培养基3次，用无菌滤纸吸干残留菌液，将其接种在添加除菌剂的芽诱导培养基上；

筛选：在丛生芽诱导阶段培养基中不添加选择压力，培养7d后，转接到含有Km浓度为75mg/L的丛生芽诱导培养基中进行筛选；

抗性芽生根：当芽长到3cm左右时，将其从底部切下转入生根培养基中(1/2MSB培养基附加1.0mg/L IBA、20mg/L塞孢霉素钠盐和50mg/L卡那霉素)，7d继代一次，两周后可见根的生成。

3、过表达GmABC大豆植株分子鉴定

(1)转基因植株的PCR检测

模板为待测样品DNA，阳性对照为pCAMBIA3301-GmABC质粒DNA，阴性对照为未转化的同一基因型植株DNA；用抗草甘膦基因Bar基因序列设计引物进行PCR扩增。

Bar-F(5’-3’)：ATATCCGAGCGCCTCGTGCAT

Bar-R(5’-3’)：GGTCTGCACCATCGTCAACCACT

PCR反应体系如下：

PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸2min；4℃终止反应。

(2)转基因植株的半定量RT-PCR检测

Trizol法分别提取野生型和转基因幼苗的根系及第一片三出复叶的总RNA，进行实时RT-PCR，以野生大豆Actin基因作为内参基因，分析基因在野生型和转基因植株体内的表达量。所用引物：

qRT-PCR-F(5’-3’)：ATCAGGGAGTGTGGCTCATAAC

qRT-PCR-R(5’-3’)：CGGGCAATTACACCCATAAGA

ACTIN-F(5’-3’)：AACCCCTTGTTTGCGACAATG

ACTIN-R(5’-3’)：TCGAGGTCGGCCAACAATACT

荧光定量PCR仪型号Bio-rad Chromo4，反转录和SYBR定量PCR试剂均购自Takara公司。反应体系(总体积10uL)为：5uL SYBR Premix Ex Taq II，1uL 10uM引物，1uL cDNA，2uL ddH2O。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，68℃复性30s，72℃延伸30s，40个循环。结果表明：参见图3，1：对照植株叶片RNA；2：转GmABC基因植株叶片RNA；3：对照植株根系RNA；4：转GmABC基因植株的根系RNA。在β-actin表达量相同的情况下，GmABC基因在其转基因植株的叶片和根系中的表达量均比对照有所上升，进一步说明已获得过量表达的T₀代转GmABC大豆植株,T₀代转GmABC大豆植株自交三代得到T₃代转GmABC大豆植株。

三、过表达GmABC大豆植株的耐逆鉴定

1、转基因植株的生理检测

将未转基因对照种子和T₃代PCR检测为阳性的转基因大豆在25℃恒温培养箱中培养，对4周苗龄的大豆幼苗分别进行干旱胁迫(6天)、250mM盐溶液浇灌(6天)、低温胁迫(12小时)和100Mm ABA喷洒(3小时)，在处理之前及处理后，分别取样测生理指标，设3次重复，平行测定后取平均值。脯氨酸，丙二醛和超氧化物歧化酶测定方法见“植物生理实验，郝再彬、苍晶、徐仲，哈尔滨工业大学出版社，2006年2月第2版”，该书中记载了脯氨酸含量、超氧化物岐化酶活力和丙二醛含量的详细检测方法。

结果表明：参见图4-图7，WT为野生型大豆对照，L1，L9为转基因大豆植株，在干旱、高盐、低温和脱落酸胁迫前，野生型和两个转基因大豆株系的脯氨酸(Proline)、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力差异不大，而在胁迫后，脯氨酸含量均增加，并且转基因大豆的脯氨酸含量明显高于野生型；SOD在上述四种胁迫下的活力均降低，但转基因大豆的SOD活力显著高于野生型。干旱、高盐和低温胁迫促使了野生型和转基因大豆的丙二醛含量增加，但转基因大豆的丙二醛含量明显低于野生型；脱落酸胁迫下，野生型植株的丙二醛含量增加，而转基因大豆的丙二醛含量显著降低。

2、转基因植株的抗旱性表型鉴定

参见图8，将未转基因对照种子和T3代PCR检测为阳性的转基因大豆置于25℃恒温培养箱中培养，对4周苗龄的大豆幼苗进行干旱胁迫处理，在处理之前及处理后15d观察植株的表型。处理后15d，对照植株叶片几乎全部枯黄凋谢，而转基因植株只出现了轻度的萎蔫，说明过量表达GmABC基因的大豆植株的抗旱性提高。

综上所述，GmABC基因的过量表达，提高了转基因植株的耐旱性状，而且与耐盐、耐低温和耐脱落酸的应激反应密切相关，且上述性状与GmABC基因的表达量呈正相关。因此，在受体植物中过表达GmABC基因，有望提高受体植物产量和耐逆性。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛农业大学

<120> 大豆GmABC蛋白及其编码基因和应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3078

<212> DNA

<213> 大豆（Glycine max (L.) Merrill.）

<400> 1

ctcaaaggag atacctgcaa gaacttcgaa ttgtcaagca tgttgtgaag gcttcctttg 60

tcctcatggg aaaacatgca tgatacatat ctttatcagc tgcctccaat gcagccaaac 120

catacctgtg gtggagcaaa tgtttgggct gatgttagta gcagtagtga gatattttgc 180

tcagctggat catactgccc aacaacaaca aaaagaattc cttgcagtag tgcccattat 240

tgcaggatgg gctccacatc tgagaaaaga tgcttcaagt tgagttcatg taattcaaac 300

acagcaaccc agaatatgca tgcatatgga attatgctca ttgctgcttt gagtactttg 360

ctactcatta tttacaattg ttctgaccaa gttctaacta ctagggaaag aagagtggcc 420

aaatctagac ccgcagcagc tagaagtgca aggaagactg caaatgcacg ccaaagatgg 480

caatttgcaa aagatgccac taagaagggt gcaatggggc tgcaagctca gctatcacgc 540

accttcaaga aggatgtggc aaatctggaa aaagttaaaa ttttgaatca agcaacttct 600

gaagcagata ttgaattgtt gtcacattca ggacctacaa cttcaagcat ggttccaagt 660

tcatctctgg cgccaaagga aaagggaaaa gaacctaatg gtcttatgca gataatacat 720

gaaattgaaa atgatccaga tattaatgac caccttcata cagaaacaga aaccagagat 780

acaggtgtta gagcacatgc gccaaaggga aaacaaccac atactcatag ccaaattttt 840

aagtatgcat attctcaact tgaaaaagag aaggctgagc aacaagaaaa caagaagctt 900

accttctcgg gggtaattaa aatggctaca aacactgaaa aaaggaaaag gcctttaatg 960

gagatttctt tcaaggatct gactcttaca ttgaaagctc aaaacaaaca catattgaga 1020

tatgttactg ggaaaattaa acctggccgc atcactgctg tcatgggtcc atcaggggct 1080

ggcaagacaa catttctttc agctctagcc ggaaaggcat tgggatgcgg agtcactggt 1140

tcaattttta taaatggaaa gaatgaatca atccactcct ttaagaaaat tactggcttt 1200

gtgccacaag atgatgtagt tcatggaaac ctaacagtgg aagagaatct ctggttcagt 1260

gcacagtgca ggctatctgc tgacttgtca aaaccagaaa aagttctggt tgttgaaaga 1320

gttatagaat tcttggggct tctatctgtg cgcaatgcct tggttggaac tgtggaaaaa 1380

agagggatct ctggaggcca aaggaagcgt gtaaatgttg gattggaaat ggttatggaa 1440

ccttcgctct tgatcttgga tgaacccaca tctggcttgg acagggcatc atctcagctc 1500

cttctaagag cactaagacg cgaagctctt gagggagtga acatttgcat ggtggttcac 1560

caacccagct atgctttgtt caagatgttt gatgacctga tacttctggg aaaaggtggt 1620

cttactgtct atcatggatc tgccaagaaa gttgaagaat acttttcagg tctggggatc 1680

aatattccgg agcggattaa tcctcctgat tacttcattg acattttgga gggcataaca 1740

acacctggtg gaagctcagg actcagttat aaagagctgc cagttagatg gatgcttcat 1800

aatggatatc caattcctct tgatatgagg cagaatgcag ttcaatttga tatgtcccag 1860

agtgtaaatt cagctaatga aatagatccc agtggatctg gtcatgccgg taaaaccttt 1920

gccggagagt tatggcaaga tatgagaaac aatgcggaac tgaagaggga gaagataaga 1980

ctcaattttt ttaaatccaa ggatttatct aaccggaaaa ctcctggtgt tttcaagcaa 2040

tataagtact ttcttatacg ggttgggaag cagcgactac gagaagctag gatccaagcc 2100

attgattatc ttattttgtt acttgctgga gcctgcttag gatcacttac caaatcaggt 2160

gaccaaacat ttggtgcagc tgggtacacc tatacggtga ttgctgtatc tcttctgtgc 2220

aagatagcgg ccttgagatc attttctctg gataaattac actactggag ggattctggc 2280

atgagcagct tggcttattt cctctctaaa gacacaattg atcattttaa tacactgatc 2340

aagcctgtgg tgtatctttc tatgttctat ttcttcacca atccgagatc aacttttgca 2400

gataattatg ttgtgctgct ttgtcttgta tactgtgtca ctggcatagc ctatgcattg 2460

tccatatttt ttgaacctgg cgcagcccag ctgtggtcag tacttctgcc agttgttttg 2520

actctcattg caacacaacc aaaagatagt aaagtgttga agaatatagc taatttatgc 2580

tactctaagt gggctttaca agcattagtt gttgcaaatg ctgaaaggta tcagggagtg 2640

tggctcataa ctcgttgtgg ttcacttttg aaaagtggct acaatcttca tgattggagt 2700

ttgtgcatat ccatactcat tcttatgggt gtaattgccc gggctatagc atttttctgt 2760

atggtcacct tccgtaagaa ataacggcca aacttcaggc taccaaattt tacgtctaac 2820

aaatctgagt tgtacaaatt ggagaggcca gcatgaccaa aactgaatag aaattacatt 2880

aggattctca tgatttgata aatgtctgat agtttttttt ggggctgata ttggttattg 2940

gcttttatgc atgtgattaa ttagtcatgt cattgttgca tggccatatt tagtggttgt 3000

gactctagta agtttaattt gcattgctat taattttagt acttagttga cgagtagaag 3060

tgtagaacca aaaaaaaa 3078

<210> 2

<211> 902

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine max (L.) Merrill.)

<400> 2

Met His Asp Thr Tyr Leu Tyr Gln Leu Pro Pro Met Gln Pro Asn His

1 5 10 15

Thr Cys Gly Gly Ala Asn Val Trp Ala Asp Val Ser Ser Ser Ser Glu

20 25 30

Ile Phe Cys Ser Ala Gly Ser Tyr Cys Pro Thr Thr Thr Lys Arg Ile

35 40 45

Pro Cys Ser Ser Ala His Tyr Cys Arg Met Gly Ser Thr Ser Glu Lys

50 55 60

Arg Cys Phe Lys Leu Ser Ser Cys Asn Ser Asn Thr Ala Thr Gln Asn

65 70 75 80

Met His Ala Tyr Gly Ile Met Leu Ile Ala Ala Leu Ser Thr Leu Leu

85 90 95

Leu Ile Ile Tyr Asn Cys Ser Asp Gln Val Leu Thr Thr Arg Glu Arg

100 105 110

Arg Val Ala Lys Ser Arg Pro Ala Ala Ala Arg Ser Ala Arg Lys Thr

115 120 125

Ala Asn Ala Arg Gln Arg Trp Gln Phe Ala Lys Asp Ala Thr Lys Lys

130 135 140

Gly Ala Met Gly Leu Gln Ala Gln Leu Ser Arg Thr Phe Lys Lys Asp

145 150 155 160

Val Ala Asn Leu Glu Lys Val Lys Ile Leu Asn Gln Ala Thr Ser Glu

165 170 175

Ala Asp Ile Glu Leu Leu Ser His Ser Gly Pro Thr Thr Ser Ser Met

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Ala Pro Lys Glu Lys Gly Lys Glu Pro Asn

195 200 205

Gly Leu Met Gln Ile Ile His Glu Ile Glu Asn Asp Pro Asp Ile Asn

210 215 220

Asp His Leu His Thr Glu Thr Glu Thr Arg Asp Thr Gly Val Arg Ala

225 230 235 240

His Ala Pro Lys Gly Lys Gln Pro His Thr His Ser Gln Ile Phe Lys

245 250 255

Tyr Ala Tyr Ser Gln Leu Glu Lys Glu Lys Ala Glu Gln Gln Glu Asn

260 265 270

Lys Lys Leu Thr Phe Ser Gly Val Ile Lys Met Ala Thr Asn Thr Glu

275 280 285

Lys Arg Lys Arg Pro Leu Met Glu Ile Ser Phe Lys Asp Leu Thr Leu

290 295 300

Thr Leu Lys Ala Gln Asn Lys His Ile Leu Arg Tyr Val Thr Gly Lys

305 310 315 320

Ile Lys Pro Gly Arg Ile Thr Ala Val Met Gly Pro Ser Gly Ala Gly

325 330 335

Lys Thr Thr Phe Leu Ser Ala Leu Ala Gly Lys Ala Leu Gly Cys Gly

340 345 350

Val Thr Gly Ser Ile Phe Ile Asn Gly Lys Asn Glu Ser Ile His Ser

355 360 365

Phe Lys Lys Ile Thr Gly Phe Val Pro Gln Asp Asp Val Val His Gly

370 375 380

Asn Leu Thr Val Glu Glu Asn Leu Trp Phe Ser Ala Gln Cys Arg Leu

385 390 395 400

Ser Ala Asp Leu Ser Lys Pro Glu Lys Val Leu Val Val Glu Arg Val

405 410 415

Ile Glu Phe Leu Gly Leu Leu Ser Val Arg Asn Ala Leu Val Gly Thr

420 425 430

Val Glu Lys Arg Gly Ile Ser Gly Gly Gln Arg Lys Arg Val Asn Val

435 440 445

Gly Leu Glu Met Val Met Glu Pro Ser Leu Leu Ile Leu Asp Glu Pro

450 455 460

Thr Ser Gly Leu Asp Arg Ala Ser Ser Gln Leu Leu Leu Arg Ala Leu

465 470 475 480

Arg Arg Glu Ala Leu Glu Gly Val Asn Ile Cys Met Val Val His Gln

485 490 495

Pro Ser Tyr Ala Leu Phe Lys Met Phe Asp Asp Leu Ile Leu Leu Gly

500 505 510

Lys Gly Gly Leu Thr Val Tyr His Gly Ser Ala Lys Lys Val Glu Glu

515 520 525

Tyr Phe Ser Gly Leu Gly Ile Asn Ile Pro Glu Arg Ile Asn Pro Pro

530 535 540

Asp Tyr Phe Ile Asp Ile Leu Glu Gly Ile Thr Thr Pro Gly Gly Ser

545 550 555 560

Ser Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Leu Pro Val Arg Trp Met Leu His Asn

565 570 575

Gly Tyr Pro Ile Pro Leu Asp Met Arg Gln Asn Ala Val Gln Phe Asp

580 585 590

Met Ser Gln Ser Val Asn Ser Ala Asn Glu Ile Asp Pro Ser Gly Ser

595 600 605

Gly His Ala Gly Lys Thr Phe Ala Gly Glu Leu Trp Gln Asp Met Arg

610 615 620

Asn Asn Ala Glu Leu Lys Arg Glu Lys Ile Arg Leu Asn Phe Phe Lys

625 630 635 640

Ser Lys Asp Leu Ser Asn Arg Lys Thr Pro Gly Val Phe Lys Gln Tyr

645 650 655

Lys Tyr Phe Leu Ile Arg Val Gly Lys Gln Arg Leu Arg Glu Ala Arg

660 665 670

Ile Gln Ala Ile Asp Tyr Leu Ile Leu Leu Leu Ala Gly Ala Cys Leu

675 680 685

Gly Ser Leu Thr Lys Ser Gly Asp Gln Thr Phe Gly Ala Ala Gly Tyr

690 695 700

Thr Tyr Thr Val Ile Ala Val Ser Leu Leu Cys Lys Ile Ala Ala Leu

705 710 715 720

Arg Ser Phe Ser Leu Asp Lys Leu His Tyr Trp Arg Asp Ser Gly Met

725 730 735

Ser Ser Leu Ala Tyr Phe Leu Ser Lys Asp Thr Ile Asp His Phe Asn

740 745 750

Thr Leu Ile Lys Pro Val Val Tyr Leu Ser Met Phe Tyr Phe Phe Thr

755 760 765

Asn Pro Arg Ser Thr Phe Ala Asp Asn Tyr Val Val Leu Leu Cys Leu

770 775 780

Val Tyr Cys Val Thr Gly Ile Ala Tyr Ala Leu Ser Ile Phe Phe Glu

785 790 795 800

Pro Gly Ala Ala Gln Leu Trp Ser Val Leu Leu Pro Val Val Leu Thr

805 810 815

Leu Ile Ala Thr Gln Pro Lys Asp Ser Lys Val Leu Lys Asn Ile Ala

820 825 830

Asn Leu Cys Tyr Ser Lys Trp Ala Leu Gln Ala Leu Val Val Ala Asn

835 840 845

Ala Glu Arg Tyr Gln Gly Val Trp Leu Ile Thr Arg Cys Gly Ser Leu

850 855 860

Leu Lys Ser Gly Tyr Asn Leu His Asp Trp Ser Leu Cys Ile Ser Ile

865 870 875 880

Leu Ile Leu Met Gly Val Ile Ala Arg Ala Ile Ala Phe Phe Cys Met

885 890 895

Val Thr Phe Arg Lys Lys

900

Claims

1.一种蛋白，其特征在于，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

3.编码权利要求1所述蛋白的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子是如下(1)-(4)中任一种的DNA分子：

(1)序列表中序列1自5’末端第1-3078位核苷酸所示的DNA分子；

4.含有权利要求3所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于：

所述重组载体为将权利要求3所述DNA分子插入表达载体中，得到表达权利要求1所述蛋白的重组载体。

6.扩增权利要求3所述DNA分子全长或其任意片段的引物对。

7.权利要求1所述蛋白、权利要求3所述DNA分子或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在提高植物抵抗非生物胁迫的能力中的应用，其特征在于，所述提高植物抵抗非生物胁迫的能力为提高植物抵抗低温和/或高盐和/或干旱和/或脱落酸胁迫的能力。

8.一种培育转基因植物的方法，其特征在于，将编码权利要求1所述蛋白的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物至少具有如下特征：所述转基因植物的抵抗非生物胁迫的能力高于所述目的植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：上述方法中，所述抵抗非生物胁迫的能力为提高植物抵抗低温和/或高盐和/或干旱和/或脱落酸胁迫的能力；所述编码权利要求1所述蛋白的DNA分子通过权利要求4或5所述的重组载体导入目的植物。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。