DE60035509T2

DE60035509T2 - Regulierung der verzweigung von pflanzen

Info

Publication number: DE60035509T2
Application number: DE60035509T
Authority: DE
Inventors: Mineo Ueda-shi KOJIMA; Takuji Tsukuba-shi SASAKI; Masayuki Chiisagata-gun NOZUE; Hidenari Ueda-shi SHIOIRI
Original assignee: Kojima Mineo Ueda; Kumiai Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kojima Mineo Ueda; Kumiai Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1999-08-19
Filing date: 2000-08-18
Publication date: 2008-03-20
Anticipated expiration: 2020-08-19
Also published as: CN1375005A; KR100765292B1; CA2382290A1; US6995302B1; CA2382290C; BR0013337A; EP1209232A1; NZ517583A; DE60035509D1; WO2001014559A1; PT1209232E; CN100540665C; JP4567933B2; KR20020029104A; ATE366817T1; EP1209232A4; AU780310B2; EP1209232B1; AU6595400A

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Regulieren der Pflanzenverzweigung und eine transgene Pflanze die durch besagtes Verfahren erhalten wird.
Hintergrund der Erfindung
Das Fördern der Verzweigung in Zierpflanzen oder landwirtschaftlichen Nutzpflanzen ist günstig da der Wert der Zierpflanzen und die Ausbeute der landwirtschaftlichen Nutzpflanzen gesteigert werden kann. Daher war eine Technik zum Regulieren der Verzweigungen in verschiedenen Pflanzen erwünscht.
Das Maisgen tbl war bekannt als ein Gen das die Verzweigung reguliert (J. Doebley et al., "Nature" 386, 485–488 (1997)). Das Gen ist ein Gen das die Verzweigung unterdrückt. Auf der anderen Seite ist nur das Zinkfingergen als ein Gen beschrieben worden, das die Verzweigung fördert (H. Takatsuji, "Plant Mol. Biol. (Übersicht)", 39, 1073–1078 (1999) und Hiroshi Takatsuji, "Kagaku to Seibutsu", Bd. 37, pp. 287–289 (1999)).
Wie oben beschrieben dient das Fördern der Verzweigung dazu den Wert von Zierpflanzen oder landwirtschaftlichen Nutzpflanzen zu erhöhen sodass diese Techniken wichtige Techniken im Bereich der Landwirtschaft und der Kultur von Zierpflanzen sind. Es kann jedoch nicht gesagt werden, dass diese Techniken auf alle Pflanzen mit einem überragenden Ergebnis anwendbar sind. Daher wird eine neue Technik zum Fördern der Verzweigung sehr erwünscht.
Des Weiteren ist häufig die Unterdrückung des Pflanzenwachstums aufgetreten wodurch eine Zwergpflanze mit geringer Länge entstanden ist. Daher war es erwünscht eine Technik zur Verfügung zu stellen die Unterdrückung in einfacher Weise unter Verwendung von Genmanipulation durchzuführen.
Gegenwärtig ist nur eine Anzahl von Genen, umfassend ein Gen, isoliert aus der chromosomalen DNA von Arabidopsis thaliana bekannt als solche die Pflanzen Zwergwuchs kontrollieren ( Japanisches offen gelegtes Patent Nr. 56382/1997 ).
WO 96/11566 offenbart das Reis-MADS-Box-Gen OsMADS1, welches zu einem modifizierten Verzweigungsphänotyp führt wenn es in transgenen Pflanzen überexprimiert wird.
Die Nukleinsäuresequenz sowie die abgeleitete Aminosäuresequenz eines Reis-MADS-Box-Gens wird von Sasaki T. in der EBI-Datenbank unter Accession Nr. AB003325 gezeigt.
Die Erfindung wurde erreicht in Bezug auf den oben beschriebenen Stand der Technik. Es ist ein Ziel der Erfindung eine Technik zur Verfügung zu stellen, die die Verzweigung von Pflanzen wie Zierpflanzen und landwirtschaftliche Nutzpflanzen reguliert.
Offenbarung der Erfindung
Die Erfinder haben eine große Zahl von Genen gescreent um Gene zu finden, die die Pflanzenverzweigung kontrollieren. Die Erfinder haben schließlich das Reis-MADS-Box-Gen gefunden, das die Funktion hat Pflanzenverzweigung zu kontrollieren.
Die Erfinder haben auch gefunden, dass in Pflanzen, die über einen geeigneten Wirtsmikroorganismus durch einen Vektor mit einem Gen transformiert sind, das Verzweigen oder der Zwergwuchs gefördert werden, in Abhängigkeit von der Genrichtung. Dadurch wurde die Erfindung erreicht.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Regulieren von Pflanzenverzweigung zur Verfügung, wobei das Verfahren charakterisiert wird durch Integrieren des Reis-MADS-Box-Gens oder eines homologen Gens in einen Vektor und Transferieren des Vektors über einen Wirtsmikroorganismus in eine Pflanze und eine transgene Pflanze erhalten durch besagtes Verfahren.
Gemäß der Erfindung wird ein Gen des Standes der Technik, welches Pflanzenverzweigung reguliert, verwendet in dem Verfahren der Erfindung, worin das Gen charakterisiert ist dadurch dass es das Reis-MADS-Box-Gen oder ein mit diesem Gen homologes Gen enthält.
Zusätzlich verwendet die Erfindung einen Vektor mit besagtem Gen darin integriert und einem mit dem Vektor transformierten Mikroorganismus.
Kurzbeschreibung der Abbildungen
1 zeigt die erste Hälfte des Verfahrens zum Konstruieren des Sense-Vektors gemäß der Erfindung.
2 zeigt die zweite Hälfte des Verfahrens zum Konstruieren des Sense-Vektors gemäß der Erfindung.
3 zeigt die erste Hälfte des Verfahrens zur Konstruktion des Antisense-Vektors gemäß der Erfindung.
4 zeigt die zweite Hälfte des Verfahrens zur Konstruktion des Antisense-Vektors gemäß der Erfindung.
5 zeigt Fotografien, die das Erscheinungsbild von Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 zeigen, worin das Gen, das Pflanzenverzweigung reguliert, eingefügt ist in Sense und Antisense-Richtung.
6 zeigt Fotografien, die den Vergleich des Erscheinungsbildes von Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 Individuen zeigt, in denen das Gen, das Pflanzenverzweigungen reguliert, eingefügt wird in der Sense- oder Antisense- Richtung und Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 ohne Behandlung.
7 ist ein Bild das die Ergebnisse des genomischen Southern Hybridisierens von Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 (T1) zeigt, worin das Gen, das Pflanzenverzweigung reguliert, eingeführt wird in der Sense-Richtung.
8 ist ein Bild das die Ergebnisse des genomischen Southern Hybridisierens von Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 (T1) zeigt, worin das Gen, das Pflanzenverzweigung reguliert, in der Antisense-Richtung eingeführt wurde.
9 ist ein Bild das die Ergebnisse der Elektrophorese zeigt, durch welche die Integration des Gens, das Pflanzenverzweigung reguliert, im Genom bestätigt werden kann.
10 zeigt Diagramme, die schematisch das MADS Gen zeigen, das in der Sense- oder Antisense-Richtung integriert ist.
11 ist eine Abbildung, die die Ergebnisse der Southern Hybridisierungs-Analyse zeigen zur Bestätigung der Richtung der cDNA-Integration in das Genom.
12 zeigt Fotografien, die den Vergleich des Erscheinungsbildes zeigen zwischen Kalanchoe daigremontiana, in der das Gen, welches Pflanzenverzweigung reguliert in der Sense-Richtung eingeführt wurde, Kalanchoe daigremontiana in der das GUS Gen eingeführt wurde und Kalanchoe daigremontiana ohne Behandlung.
Beste Art die Erfindung auszuführen
Das Gen das als ein Gen welches Pflanzenverzweigung reguliert gemäß der Erfindung zu verwenden ist umfasst das Reis-MADS-Box-Gen oder ein zu diesem Gen homologes Gen. Das Reis-MADS-Box-Gen hat die folgende Nukleotidsequenz.
Des weiteren umfasst die Bezeichnung "Gen das homolog ist mit dem Gen" eine Bandbreite von Genen welche nicht identisch sind mit dem letzteren an sich infolge des Vorhandenseins von Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder dergleichen in einem Teil der Nukleotidsequenzen jedoch in Bezug auf die von den Genen ausgeübten Funktionen als identisch angenommen werden können.
Unter den durch das Gen kodierten Aminosäuren ist auch geklärt worden dass ein Peptidteil der durch die folgende Sequenz dargestellt wird das Verzweigen als ein Transkriptionsfaktor reguliert.
Dementsprechend ist der Begriff "MADS" des MADS Gens das Akronym von "M" von Hefe MCM1, "A" der Pflanze AGAMOUS, "D" der Pflanze DEFICIENS, und "S" des menschlichen Serum Response Faktors SRF. So wurde gefunden, dass MADS-Box-Gene eine gemeinsame Nukleotidsequenz aufweisen, unabhängig von der Art. Diese Gene sind Transkriptionsfaktoren (Gene die DNA regulieren, sodass DNA in mRNA transkribiert werden kann), wie ein Gen, das involviert ist in biologischer Morphologie, nämlich ein homeotisches Gen.
Des weiteren sind die meisten MADS Gene von Pflanzen abgesehen von Reis involviert in Blütenmorphologie, jedoch ist keines von diesen dafür bekannt in der Regulation von Pflanzenverzweigung involviert zu sein.
Gemäß der Erfindung wird das Gen das Pflanzenverzweigung reguliert, in einen Vektor integriert, welcher dann über einen geeigneten Wirtsmikroorganismus in eine Pflanze eingeführt wird, um Pflanzenverzweigung zu regulieren. Genauer gesagt wird eine Pflanzenzelle transformiert durch Konjugieren eines Promoters der in der Lage ist in einer Pflanzenzelle zu funktionieren, des Gens das Pflanzenverzweigung reguliert und eines Terminators der in der Lage ist in einer Pflanzenzelle zu funktionieren, in einer solchen Weise, dass das resultierende Konjugat funktionieren kann ein Expressionsplasmid zu konstruieren und dann einführen des Expressionsplasmids in die Pflanzenzelle.
Als der für diesen Zweck verwendete Promoter kann z.B. ein CaMV35S Promoter und ein Promoter für Nopaline Synthase verwendet werden, ohne spezifische Limitierungen. Zusätzlich kann ein Enhancer verwendet werden für hohe Expression des Genprodukts. Als ein solcher Enhancer kann z.B. der Enhancer der enthalten ist in der Sequenz in einem Upstream-Bereich der Nukleotidsequenz des CaMV35S Promoters verwendet werden. Eine Vielzahl von solchen Enhancern können verwendet werden. Alternativ kann der Terminator einen CaMV35S Terminator und einen Terminator für Nopaline Synthase umfassen, ist jedoch nicht darauf limitiert.
Gemäß der Erfindung kann ein Selektionsmarker-Gen verwendet werden zum Screenen der resultierenden transformierten Mikroorganismen und transformierten Pflanzen.
Selektionsmarker können verwendet werden umfassend z.B. das Neomycin Phosphortransferase 2 (MPT2) Gen und Hygromycin Phosphortransferase (HPT) Gen.
Als Vektor zur Verwendung in der Integration des Gens das Pflanzenverzweigung reguliert gemäß dem Verfahren der Erfindung könne Vektoren der pBI-Serie und pUC-Serie vorzugsweise verwendet werden. Die Vektoren der pBI-Serie umfassen z.B. pBI121, pBI101, pBI101.2 und pBI101.3, wohingegen die Vektoren der pUC-Serie z.B. pUC18, pUC19 und pUC9 umfassen.
Des weiteren können Vektoren wie pTOK162, entwickelt für die Transformation von monocotyledonen Pflanzen auch verwendet werden.
Als Verfahren zum Transformieren von Pflanzen mit dem Vektor in dem Gen das Pflanzenverzweigung reguliert, integriert ist, kann das Agrobakterium-Verfahren, das Polyethylenglycol-Verfahren, das Elektroporationsverfahren und die Teilchenbeschuss-Methode und dergleichen verwendet werden.
Unter dem Transformationsverfahren ist das Agrobakterium-Verfahren ein Verfahren zum Einführen eines Gens in eine Pflanzenzelle durch kultivieren von Agrobakterium, das einen Vektor enthält, der das rekombinante Gen trägt, in der gleichzeitigen Gegenwart einer Pflanzenkulturzelle. Als einfacheres Verfahren kann auch ein Verfahren zum Aufsprühen oder Aufbringen oder injizieren einer Lösung, die das Agrobakterium enthält, in der Nähe des Pflanzenwachstumspunktes verwendet werden. Dann wird vorzugsweise der Pflanzenkörper angeritzt.
Die Regulation der Verzweigung durch das Verfahren der Erfindung ist anwendbar auf jede Pflanze mit Zellen, Geweben oder Organen in welche die Gene eingeführt werden können und für welche Redifferenzierungsverfahren etabliert worden sind, oder eine beliebige Pflanze in der das Gen direkt in den Pflanzenkörper eingeführt werden kann.
Spezifisch können transformierte Pflanzen von Zierpflanzen wie die Chrysantheme, Lilie, Nelke, Tulpe, Rose und Orchideen und landwirtschaftliche Nutzpflanzen wie Sojabohne, Baumwolle, Reis, Mais, Weizen und Gerste erhalten werden durch Behandeln der Calli- oder Wachstumspunkte davon mit einer Suspension von Agrobakterium welches einen Vektor mit dem Gen das Pflanzenverzweigung reguliert darin integriert trägt, oder durch das direkte Injizieren eines Vektors mit dem Gen darin integriert in die Zellen oder Gewebe davon und Screenen und wachsen lassen einer Transformante.
Das Ergebnis der Erfindung wie es in den folgenden Beispielen beschrieben ist, ist unterschiedlich, in Abhängigkeit davon ob das Gen das Pflanzenverzweigung reguliert in Pflanzen in der Sense-Richtung oder in der Antisense-Richtung integriert ist. Mit anderen Worten wird Pflanzenverzweigung gefördert wenn das Gen in der Sense-Richtung integriert ist, während Pflanzenwachstum zu Zwergwuchs suprimiert wird wenn das Gen in der Antisense-Richtung integriert wird.
Industrielle Anwendbarkeit
Das Gen das Pflanzenverzweigung reguliert kann Pflanzenverzweigung oder Zwergwuchs fördern, wenn das Gen in Pflanzen eingebracht wird. Zusätzlich kann die resultierende Eigenschaft an die Nachkommen vererbt werden. So stellt die Erfindung eine Technik zum Herstellen einer Pflanze mit einem solchen neuen Erscheinungsbild zur Verfügung, insbesondere ist die Erfindung effektiv für das Steigern der Verzweigung in Pflanzen wie Zierpflanzen und landwirtschaftlichen Nutzpflanzen um den Wert der Zierpflanzen oder den Ertrag der landwirtschaftlichen Nutzpflanzen zu steigern.
Beispiele
Die Erfindung wird nun nachfolgend in größerem Detail in den Beispielen beschrieben. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele limitiert.
Beispiel 1
(1) Konstruktion eines Vektors mit dem Reis-MADS-Box-Gen integriert in der Sense-Richtung (1 und 2)
Der Vektor mit dem Reis-MADS-Box-Gen integriert in der Sense-Richtung wurde konstruiert durch Ersetzen des β-Glucuronidase Gens (GUS) in einem binären Vektor (pBI121) käuflich erworben von Toyobo Co., Ltd., mit der cDNA (1,3 kb) des Reis-MADS-Box-Gens (DDBJ Accession Nr. AB003325) in Sense-Richtung gemäß der folgenden Methode.
Das BluescriptSK⁺M Plasmid (erhältlich von der DNA-Bank des National Institute of Agrobiological Sciences, the Ministry of Agriculture, Forestry and Fishery) in dem das MADS-Box-Gen inseriert worden war an der Restriktionsschnittstelle SalI und der Restriktionsschnittstelle Not' in der 5' → 3' Richtung wurde mit SalI verdaut und stumpfe Enden hergestellt ("bluntended"), welches weiter mit SacI verdaut wurde. Das resultierende Produkt wurde der Elektrophorese unterworfen um ein 1,3 kb DNA Fragment zu erhalten.
Auf der anderen Seite wurde das pUC18 Plasmid (hergestellt von Nipon Gene/korrespondierend zu pBI221 hergestellt von Toyobo, Co., Ltd.), worin ein pBI121 abgeleitetes 3,1 kb DNA Fragment (enthaltend den CaMV35S Promoter und das GUS Gen und den Nos Terminator) inseriert war an den Restriktionsschnittstellen HindIII und EcoRI, mit SmaI und SacI verdaut. Das resultierende Produkt wurde der Agarose Elektrophorese unterworfen um ein 4,0 kb DNA Fragment zu erhalten.
p3I221-M Plasmid wurde hergestellt durch Ligieren des 1,3 kb Fragments und des resultierenden 4,0 kb Fragments, welches dann in Escherichia coli (JM109) eingeführt wurde. Aus den positiven Kolonien von Escherichia coli wurde das p3I221-M Plasmid isoliert und mit BamHI und SacI verdaut, um die 1,3 kb cDNA zu erhalten. Die in einer solchen Weise erhaltene cDNA mit den BamHI und SacI Schnittstellen wurde konjugiert mit einem pBI121 Plasmid das zuvor mit BamHI und SacI verdaut worden war um das GUS Gen zu eliminieren, um einen pBI121-MS Vektor zu erhalten worin das Reis-MADS-Box-Gen in der Sense-Richtung integriert war (nachstehend bezeichnet als "Sense-Vektor").
(2) Konstruktion eines Vektors mit dem Reis-MADS-Box-Gen integriert in der Antisense-Richtung (3 und 4)
Ein pBI121-MA Vektor worin das GUS Gen durch die cDNA in der Antisense-Richtung ersetzt worden war wurde durch das folgende Verfahren hergestellt. Zunächst wurde ein pBluescriptSK⁺-M Plasmid in dem die cDNA an den Restriktionsschnittstellen SalI und NotI in der 5' → 3' Richtung inseriert war, verdaut mit NotI und stumpfen Enden hergestellt, gefolgt vom Verdauen mit KpnI. Das resultierende Produkt wurde der Gel-Elektrophorese unterworfen um ein 1,3 kb DNA Fragment zu erhalten.
Auf der anderen Seite wurde das pUC18 Plasmid verdaut mit BamHI und stumpfe Enden hergestellt, gefolgt vom weiteren Verdauen mit KpnI. Das Produkt wurde der Gel-Elektrophorese unterworfen um ein 2,6 kb DNA Fragment zu erhalten. Das Fragment wurde mit dem 1,3 kb Fragment konjugiert um ein pUC18-M Plasmid herzustellen, welches dann in Escherichia coli (HB101) eingeführt wurde. Aus den positiven Kolonien von Escherichia coli wurde das pUC18-M Plasmid isoliert und verdaut mit SacI und XbaI, um eine 1,3 kb cDNA mit SacI und XbaI Schnittstellen zu erhalten. Die cDNA wurde mit einem pBI121 Vektor der zuvor mit SacI und XbaI verdaut worden war, konjugiert, um einen pBI121-MA Vektor zu erhalten in dem das Reis-MAOS-Box-Gen in der Antisense-Richtung integriert war (nachstehend als "Antisense-Vektor" bezeichnet).
(3) Vektor-Einbringung in Wirtsmikroorganismus
Als Wirtmikroorganismus wurde Agrobakterium tumefaciens (A. tumefaciens) LBA 4404 erhältlich von Toyobo Co., Ltd. verwendet. Das Einführen des oben in (1) oder (2) erhaltenen Vektors in den Mikroorganismus wurde durchgeführt durch eine zuvor beschriebene Methode (M. Holster et al., "Mol. Gen. Gene", 163, 181–187 (1978)). Nach dem Einführen wurde der Mikroorganismus in LB Kulturmedium, supplementiert mit 50 μg/ml Kanamycin, und 10 μg/ml Rifampicin und 50 μg/ml Streptomycin bei 28°C für 18 Stunden kultiviert. Nach Beendigung der Kultur wurden die Zellen durch Zentrifugation gewonnen und wurden in Wasser gespült und suspendiert in Wasser (1,0 × 10⁸ Zellen/ml), zur Verwendung bei der Inokulation in Pflanzen.
(4) Inokulation in Pflanzen
Die Samen von Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 wurden sterilisiert mit Natriumhypochlorid und wurden dann in einem Pflanztopf in Erde gepflanzt. Der Topf wurde bei Bedingungen von einer Temperatur von 25°C für 8 Stunden im Hellen und 16 Stunden im Dunklen aufgestellt. Vier bis fünf Tage nach dem Säen waren zwei Blätter der Pflanze geöffnet. Wenn die Pflanze gerade eine Höhe von 7 bis 8 cm erreichte, wurde mit einer Nadel ein kleines Loch in das Triebmeristem der Stammspitze gestochen, wo die wässrige Lösung (etwa 1,0 × 10⁸ Zellen/ml) von A. tumefaciens, den Vektor enthaltend, inokuliert wurde.
Die Inokulation wurde an 50 Sämlingen von Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 durchgeführt, welche bei Bedingungen einer Temperatur von 22°C für 3 Tage in absoluter Dunkelheit aufgestellt wurden. Anschließend wurden die einzelnen Pflanzen bei 30°C bei einer Beleuchtung von etwa 4000 lux in einer Wachstumskammer für 8 Stunden wachsen gelassen. In Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 blühen zwei verschieden Arten von Blüten mit unterschiedlichen Grifflängen nämlich etwa 1,8 mm und etwa 0,6 mm (Heterostylismus; das Auftreten unterschiedlicher Griffe). Die Bestäubung zwischen den unterschiedlichen Arten von Blüten kann zur Befruchtung führen. Um einen Samen (T1 Pflanze) zu erhalten wurde so Bestäubung durchgeführt zwischen den Blüten der transformierten Pflanze (T0) und einer anderen Art von einer Blüte auf einer Pflanze ohne Transformation.
Unter den 50 Pflanzen die mit A. tumefaciens, den Sense-Vektor enthaltend, inokuliert wurden, wurde die Verzweigung in 33 Individuen der Pflanzen gefördert, so dass viele Zweige gebildet wurden. Das Expressionsniveau des Phänotyps der Transformanden variierte jedoch zwischen den Pflanzen. Keine Veränderung wurde beobachtet in der Differenzierung und Struktur der Blüte.
Unter den 50 mit A. tumefaciens, enthaltend den Antisense-Vektor, inokulierten Pflanzen war die Verzweigung und das Wachstum in 30 Individuen der Pflanzen unterdrückt. Das Expressionsniveau des Phänotyps unterschied sich zwischen den Pflanzen, wie in den oben beschriebenen Pflanzen. Keine offensichtliche Veränderung wurde in Bezug auf die Blütenentwicklung und Struktur der Blüten dieser Pflanzen beobachtet.
5 (Fotografien) zeigen das Erscheinungsbild von Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 mit dem Gen das Pflanzenverzweigung reguliert, eingeführt in der Sense- und Antisense-Richtung. In 5(A) bedeutet die Bezeichnung "1" Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 ohne Behandlung, die Bezeichnung "2" Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 behandelt mit A. tumefaciens, enthaltend den pBI121 Vektor (GUS Gen); das Zeichen "3" Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 behandelt mit A. tumefaciens, enthaltend den Sense-Vektor; und das Zeichen "4" Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 behandelt mit A. tumefaciens enthaltend den Antisense-Vektor. Diese Fotografien wurden 1 Monat nach der Behandlung aufgenommen. Des weiteren zeigt der Balken in den Fotografien eine Skala von 30 cm Länge.
Die Ergebnisse zeigen dass, die Verzweigung in Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 in welches das Gen, das Pflanzenverzweigung reguliert, in der Sense-Richtung eingeführt worden war (3 in 5(A)) verstärkt war, während die Verzweigung unterdrückt war in Fagopyrum esculentum var. Shinano Ichigo in das das Gen in der Antisense-Richtung eingeführt worden war (4 in 5(A)).
Des weiteren zeigt 5(B) Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 in das das Gen das Pflanzenverzweigung reguliert in der Sense-Richtung eingeführt worden war mit der höchsten Expression des transformierten Phänotyps (Verzweigungsniveau) unter solchen Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 Individuen in die das Gen in der Sense-Richtung eingeführt worden war. Die Fotografie war aufgenommen worden nachdem die Pflanze ihr Wachstum beendet hatte und welkte, 6 Monate nach der Behandlung.
(5) In dem oben beschriebenen Test wurde A. tumefaciens zur Transformation inokuliert in das Sprossmeristem an den Triebspitzen der Sämlinge, ohne anschließende
Eliminierungsprozedur zum Entfernen des Agrobakteriums aus dem Sämling. Daher wurden die T0 Pflanzen und die T1 Pflanzen durch das folgende Verfahren untersucht ob inokuliertes Agrobakterium verblieb, nämlich ob die morphologischen Veränderungen der transformierten Pflanzen durch die Effekte von A. tumefaciens verursacht wurden.
Die gesamten Pflanzen (T0 Pflanzen) wurden nach der Inokulation mit sterilem Wasser in einem Mörser zerrieben. Die Lösung aus zerriebenen Pflanzen wurde auf LB Kulturplatten verteilt die ein Antibiotikum enthielten in welchem die zur Transformation verwendeten A. tumefaciens wachsen konnten, zur Inkubation bei 28°C. Die Anzahl von Kolonien die auf den Platten auftrat war vermindert je mehr Zeit nach der Inokulation verstrich. Am Tag 14 nach der Inokulation traten nur einige Kolonien auf. Vermutlich wurde eine große Zahl der Agrobakterien eliminiert über die Resistenzreaktion der Pflanze Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1.
Im Fall der T1 Pflanzen wurden die Samen mit Natriumhypochlorid-Lösung sterilisiert, für das anschließende aseptische Treiben und Wachstum. Die anschließend erhaltenen Sämlinge wurden in sterilem Wasser zerrieben und wurden dann auf einer LB Kulturplatte enthaltend ein Antibiotikum, wie oben beschrieben, kultiviert. Keine einzige Kolonie trat auf und es wurde bestätigt dass jegliches Agrobakterium das zur Transformation verwendet worden war komplett in den T1 Pflanzen fehlte.
Beispiel 2
Bestätigung des Phänotyps der Nachkommenschaft (T1) von transformiertem Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1
Die Blüte von Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 zeigt den Heterostylismus, so dass Bestäubung nur zwischen verschiedenen Arten von Blüten auftritt. Daher wurden die Blüten der transformierten Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 (T0) und die Blüten von Wild-Typ Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 bestäubt. Die anschließend erhaltenen Samen wurden gepflanzt und kultiviert um den Phänotyp der T1 Pflanzen zu untersuchen (6). In sowohl Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 in welches das Gen das Pflanzenverzweigung reguliert in der Sense-Richtung eingebracht worden war und Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 in welches das Gen in der Antisense-Richtung eingeführt worden war hatten etwa die Hälfte der Nachkommen (10 Individuen) individuell Phänotypen der T0 Pflanzen geerbt. Mit anderen Worten war die Verzweigung gefördert in den Nachkommen von Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 in das das Gen in der Sense-Richtung eingebracht worden war (2 in 6(A)). Im Gegensatz war die Verzweigung und das Wachstum in den Nachkommen von Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 in das das Gen in der Antisense-Richtung eingebracht worden war (2 in 6(B)), unterdrückt. Wie oben beschrieben hatten die Phänotypen von Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 transformiert mit dem Gen, eingeführt in den entgegengesetzten Richtungen, zueinander, auch die entgegen gesetzte Beziehung im Bezug auf die daraus hervorgehenden Nachkommen.
Beispiel 3
Bestätigung der Integration des Gens das Pflanzenverzweigung reguliert in das Genom
(1) Isolierung und Reinigung von genomischer DNA der Nachkommen (T1) von transformierten Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1
Unter Verwendung des Nuklear Phytopur DNA Extraktions-Kit (Amersham Pharmacia Biotec), wurde genomische DNA aus den Sämlingen oder reifen Pflanzen die in Beispiel 2 erhalten worden waren extrahiert, gemäß den Anweisungen. Die extrahierte DNA wurde weiter aufgereinigt durch das folgende Verfahren. Spezifisch wurde die DNA in 10 mM Tris-HCl Puffer (pH 8,0) enthaltend 500 μl 1 mM EDTA, aufgelöst, und dann inkubiert mit 2 μl Rnase (Nippon Gene; 10 mg/ml), bei 37°C für 45 Minuten. Anschließend wurden 100 μl einer Lösung enthaltend 60 mM Tris-HCl Puffer (pH 7,8), 60 mM EDTA, 30% SDS und 5 μl Protease K (10 mg/ml) hinzugefügt, zur Inkubation bei 50°C für 3 Stunden. Die Lösung wurde sequenziell extrahiert in Phenol, einer Phenol/Chloroform-Mischungslösung (1:1, v/v) und Phenol. DNA wurde in Ethanol aus der resultierenden DNA Lösung prezipitiert, und wurde in 70%igem Ethanol gespült, um gereinigte genomische DNA zu erhalten.
(2) Genomische Southern Hybridisierung
15 μg der oben in (1) erhaltenen genomischen DNA wurde mit Restriktionsendonukleasen (unter Verwendung von EcoRI, SacI, XhoI und SalI die keine Restriktionsstellen in der cDNA des MADS Gens haben) verdaut, gefolgt von Agarose-Elektrophorese (1%) und anschließendes Blotten auf Hybond N+ Nylon Membran (Amersham Pharmacia Biotec). Eine mit ³²P markierte Sonde wurde hergestellt unter Verwendung der cDNA (1,3 kb) des Reis-MADS-Box-Gens und einem Ramdom Primer Labeling Kit (hergestellt von Takara), welche auf einer Sephadex G-50 Säule gereinigt wurde. Die Nylon Membran auf welche die DNA geblottet war wurde zunächst der Prähybridisierung 5 × SSPE Lösung (Lösung bei pH 7,7 enthaltend 0,18 M NaCl, 10 mM Natriumphosphat, 1 mM EDTA), enthaltend 5 × Denhardt's Lösung, 0,5% SDS und 20 μg/ml Lachsspermien DNA bei 65°C für 1 Stunde unterworfen.
Anschließend wurde die mit ³²P markierte Sonde zu der Prähybridisierungslösung hinzugefügt, zur Hybridisierung bei 65°C für 18 Stunden. Die Membran wurde zweimal in 2 × SSPE Lösung, enthaltend 0,1% SDS, bei 20°C für 10 Minuten gespült. Anschließend wurde die Membran einmal in 1 × SSPE Lösung enthaltend 0,1% SDS bei 65°C für 15 Minuten gespült. Schließlich wurde die Membran zweimal in 0,1 × SSPE Lösung enthaltend 0,1% SDS bei 65°C für 10 Minuten gespült. Die DNA Bande die mit der Sonde hybridisierte wurde durch einen Image-Analyzer (Molecular Dynamics) abgebildet. Die Ergebnisse sind in 7 und 8 gezeigt.
7 zeigt die Nachkommen von Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 mit dem in der Sense-Richtung eingeführten Gen; und 8 zeigt die Nachkommen von Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 mit dem in der Antisense-Richtung eingeführten Gen. In beiden Figuren zeigt die Spur 1 das Ergebnis von Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 ohne Behandlung, nach Verdau mit EcoRI; die Spur 2 zeigt das Ergebnis der Transformanden, nach Verdau mit EcoRI; die Spur 3 zeigt das Ergebnis der Transformanden nach Verdau mit SacI; die Spur 4 zeigt das Ergebnis der Transformanden nach Verdau mit XhoI; und die Spur 5 zeigt das Ergebnis der Transformanden nach Verdau mit SalI.
Wie aus 7 und 8 ersichtlich wurde keine Bande beobachtet für Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 ohne Behandlung. Jedoch wurde eine einzige Hybridieserungsbande detektiert in all den Spuren für die beiden genomischen DNAs der Nachkommen von Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 in die das Gen in der Sense-Richtung eingeführt worden war (7) und den Nachkommen von Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 in die das Gen in der Antisense-Richtung eingeführt worden war (8). Somit wird gezeigt dass eine Kopie der cDNA in die Genome der analysierten T1 Pflanzen eingeführt worden war.
Beispiel 4
Bestätigung der Integration des Gens das Pflanzenverzweigung reguliert in das Genom.
Zur Amplifikation der cDNA die in das Genom integriert war, wurden zwei Arten von PCR Primern, nämlich P1 und P2, entworfen.
P1:5'-ACAATCCCACTATCCTTCGC-3'
P2:5'-GTCACGACGTTGTAAAACGA-3'
Insbesondere korrespondiert P1 zu der 3' Endsequenz des CaMV35S Promoters der Upstream des GUS Gens in dem ursprünglichen binären pBI121 Vektor positioniert ist; und P2 korrespondiert zu einer Sequenz in der Nähe der rechten Grenze der T-DNA die Downstream des GUS Gens in dem ursprünglichen binären pBI121 Vektors positioniert ist.
Die genomische DNA (1–2 μl, 500 ng), hergestellt in Beispiel 3 (1) wurde zu einem Endvolumen von 50 μl einer Reaktionslösung (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 1,5 mM Magnesiumchlorid, 200 μM von jedem Nukleotid, 0,2 μM der Primer, und 1,25 Einheiten Tagpolymerase (hergestellt von Takara)) hinzugefügt. Die PCR Reaktion wurde ausgeführt mit 30 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 58°C für 45 Sekunden und 72°C für 90 Sekunden und wurde anschließend weitergeführt bei 72°C für 10 Minuten. Die PCR Produkte wurden der Agarose-Elektrophorese (1%) unterworfen. Nach der Amplifikation wurde die Reaktionslösung direkt auf die Elektrophorese aufgetragen und anschließend nach der Elektrophorese mit Ethidiumbromid gefärbt.
Die Ergebnisse werden in 9 gezeigt. In der Figur zeigt Spur 1 die DNA Größenmarker; die Spur 2 zeigt das PCR Produkts des Vektors mit dem in der Sense-Richtung eingeführten Gen; die Spur 3 zeigt das PCR Produkt der genomischen DNA erhalten aus einer Pflanze transformiert mit dem Gen in Sense-Richtung; und Spur 4 zeigt das PCR Produkt der genomischen DNA erhalten aus einer Pflanze transformiert mit dem Gen in Antisense-Richtung.
9 zeigt offensichtlich dass das DNA Fragment der vorhergesagten Größe (1,7 kb) in beiden genomischen DNAs amplifiziert wurde und dass die komplette Sequenz der cDNA in beide T1 Pflanzen integriert war.
Beispiel 5
Bestätigung der Richtung der cDNA Integration in das Genom.
Eine XbaI Restriktionsstelle ist an Position 472bp vom 5' Terminus des Gens das Pflanzenverzweigung reguliert (1,3 kb) vorhanden. Unter Berücksichtigung der XbaI-Stelle der cDNA und der Stelle wo die PCR Primer sich anlagern wird vorhergesagt dass XbaI Verdau des PCR Produkts DNA Fragmente von 1,2 kb und 0,5 kb erzeugt, wenn die Insertion in der Sense-Richtung ist und zwei Fragmente von 850 bp erzeugen wird wenn die Insertion in der Antisense-Richtung ist (10). Die PCR Produkte der genomischen DNAs von beiden T1 Pflanzen und die PCR Produkte von den zwei binären Vektoren die die cDNA enthalten die zur Transformation verwendet worden waren wurden mit XbaI verdaut und anschließend der Southern Hybridisierungsanalyse unter Verwendung der ³²P markierten cDNA-Sonde unterworfen (11).
In 11 zeigt "1" das PCR Produkt mit dem Vektor in den das Gen das Pflanzenverzweigung reguliert in der Antisense-Richtung eingefügt ist; "2" zeigt das PCR Produkt mit dem Vektor in dem das Gen in der Sense-Richtung eingefügt ist; "3" zeigt das PCR Produkt der genomischen DNA erhalten aus der Pflanze transformiert mit dem Gen in Antisense-Richtung; und "4" zeigt das PCR Produkt der genomischen DNA erhalten von der Pflanze transformiert mit dem Gen in Sense-Richtung.
In 11 wurden Hybridisierungsbanden der vorhergesagten Größen detektiert in den individuellen Proben. Die Ergebnisse zeigen dass cDNA in den vorhergesagten Richtungen in den Genomen der Pflanzen (T1), transformiert in der Sense- und Antisense-Richtung, integriert waren.
Beispiel 6
Einführen des Gens das Pflanzenverzweigung reguliert in Kalanchoe daigremontiana
Ein reifes Blatt mit einer Länge von 10 bis 13 cm wurde vom Stamm einer Kalanchoe daigremontiana abgeschnitten. Unter Verwendung eines Stereomikroskops wurden mehrere Löcher in die epidermalen Zellen und Mesophylzellen rund um die Teilungszellen in der größten Tiefe einer Ausrandung in der Peripherie des Blatts und den epidermalen Zellen gerade oberhalb der Teilungszellen gestochen.
Jeweils ein Tropfen der wässrigen Suspension (1,0 × 10⁸ Zellen/ml) von A. tumefaciens mit dem MADS Gen in der Sense-Richtung darin eingeführt, erhalten in Beispiel 1 (3), wurde in jede Ausrandung inokuliert unter Verwendung einer Pasteur-Pipette. Dann wurde das Blatt zum Trocknen bei Raumtemperatur für etwa 30 Minuten stehen gelassen. Das Blatt wurde auf nasses Vermikulit in einem Plastikgefäß platziert und dann wurde der Deckel zur Inkubation bei 25°C geschlossen (ein Zyklus von 8 Stunden Helligkeit und 16 Stunden Dunkelheit).
Eine frische Knospe und Wurzel traten an dem behandelten Teil des Kalanchoe daigremontiana Blatts auf. Nach dem Wachstum wurden diese 4 Wochen später von dem ursprünglichen Blatt abgeschnitten und fotografiert. Als Kontrolle wurde ein Blatt, behandelt mit einem nicht-transformierten A. tumefaciens, und einem Blatt, behandelt mit A. tumefaciens mit dem GUS Gen (β-Glucuronidase Gen) anstelle des MADS Gens darin eingeführt, verwendet. Die Ergebnisse werden in 12 gezeigt.
Es wurde beobachtet dass sich rund um die Wurzel des Materials, das mit dem MADS-Box-Gen transformiert worden war, Blätter entwickelten. Jedoch wurde kein solches Phänomen beobachtet in den Kontroll-Nicht-Transformanden und dem Material in das das GUS Gen anstelle des MADS-Gens eingefügt worden war. Die Ergebnisse zeigen, dass das MADS-Box-Gen ein Gen ist, das Verzweigung reguliert, wie in den Testergebnissen unter Verwendung von Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1. Da das MADS-Box-Gen Verzweigung nicht nur in Fagopyrum esculentum var. Shinano Nr. 1 sondern auch in Kalanchoe daigremontiana, einer anderen Art, reguliert, wird das Gen vorgeschlagen als ein Gen das in der Lage ist im Allgemeinen in Pflanzen die Verzweigung zu regulieren.
Sequenzliste

Claims

Verfahren zur Regulierung der Pflanzenverzweigung, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass das Reis-MADS-Box-Gen gemäß SEQ. ID. NR. 1 oder ein Gen mit einer Substitution, Deletion oder Insertion in einem Teil der Nukleotidsequenz der SEQ. ID. NR. 1 integriert, aber die Wirkung des Gens, die Pflanzenverzweigung zu regulieren, in einem Vektor beibehalten wird und der Vektor über einen Wirtsmikroorganismus in eine Pflanze eingeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Gen, das die Pflanzenverzweigung reguliert, ein Peptid nach SEQ. ID. NR. 2 oder ein Peptid mit einer Substitution, Deletion oder Insertion der SEQ. ID. NR. 2 kodiert, aber die Wirkung eines Proteins, die Pflanzenverzweigung zu regulieren, beibehalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Gen, das die Pflanzenverzweigung reguliert, durch die SEQ. ID. NR. 1 dargestellt ist.
Transgene Pflanze erhalten durch eines der obigen Verfahren, wobei das Reis-MADS-Box-Gen durch die SEQ. ID. NR. 1 dargestellt wird.
Pflanze nach Anspruch 4, wobei das Reis-MADS-Box-Gen nach SEQ. ID. NR. 1 in der Sinnrichtung eingeführt wird, um die Pflanzenverzweigung zu fördern.
Pflanze nach Anspruch 4, wobei das Reis-MADS-Box-Gen gemäß SEQ. ID. NR. 1 in die Antisinnrichtung eingeführt wird, um das Pflanzenwachstum in Zwergwuchs zu unterdrücken.