DE19619918A1 - Nucleinsäuremoleküle codierend lösliche Stärkesynthasen aus Mais - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäuremoleküle, die eine Form der löslichen Stärkesynthase aus Mais codieren.

Weiterhin betrifft diese Erfindung Vektoren, Bakterien, sowie mit den beschriebenen Nucleinsäuremolekülen transformierte Pflanzenzellen und aus diesen regenerierbare Pflanzen.

Ferner werden Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen beschrieben, die aufgrund der Einführung von DNA-Molekülen, die eine lösliche Stärkesynthase aus Mais codieren, eine in ihren Eigenschaften veränderte Stärke synthetisieren.

Im Hinblick auf die zunehmende Bedeutung, die pflanzlichen In­ haltsstoffen als erneuerbaren Rohstoffquellen in letzter Zeit beigemessen wird, ist es eine der Aufgaben der biotechnologi­ schen Forschung, sich um eine Anpassung dieser pflanzlichen Rohstoffe an die Anforderungen der verarbeitenden Industrie zu bemühen. Um eine Anwendung von nachwachsenden Rohstoffen in möglichst vielen Einsatzgebieten zu ermöglichen, ist es dar­ über hinaus erforderlich, eine große Stoffvielfalt zu errei­ chen.

Neben Ölen, Fetten und Proteinen stellen Polysaccharide die wesentlichen nachwachsenden Rohstoffe aus Pflanzen dar. Eine zentrale Stellung bei den Polysacchariden nimmt neben Cellu­ lose die Stärke ein, die einer der wichtigsten Speicherstoffe in höheren Pflanzen ist. Hierbei ist Mais eine der interessan­ testen Pflanzen, da sie die weltweit für die Stärkeproduktion wichtigste Kulturpflanze ist.

Das Polysaccharid Stärke ist ein Polymer aus chemisch einheit­ lichen Grundbausteinen, den Glucosemolekülen. Es handelt sich dabei jedoch um ein sehr komplexes Gemisch aus unterschiedli­ chen Molekülformen, die sich hinsichtlich ihres Polymerisa­ tionsgrades und des Auftretens von Verzweigungen der Glucose­ ketten unterscheiden. Daher stellt Stärke keinen einheitlichen Rohstoff dar. Man unterscheidet insbesondere die Amylose-Stärke, ein im wesentlichen unverzweigtes Polymer aus α-1,4- glycosidisch verknüpften Glucosemolekülen, von der Amylopek­ tin-Stärke, die ihrerseits ein komplexes Gemisch aus unter­ schiedlich verzweigten Glucoseketten darstellt. Die Verzwei­ gungen kommen dabei durch das Auftreten von zusätzlichen α-1,6-glycosidischen Verknüpfungen zustande. In typischen für die Stärkeproduktion verwendeten Pflanzen, wie z. B. Mais oder Kartoffel, besteht die synthetisierte Stärke zu ca. 25% aus Amylose-Stärke und zu ca. 75% aus Amylopektin-Stärke.

Um eine möglichst breite Anwendung von Stärke zu ermöglichen, erscheint es wünschenswert, Pflanzen zur Verfügung zu stellen, die in der Lage sind, modifizierte Stärke zu synthetisieren, die sich für verschiedene Verwendungszwecke besonders eignet. Eine Möglichkeit, derartige Pflanzen bereitzustellen, besteht - neben züchterischen Maßnahmen - in der gezielten genetischen Veränderung des Stärkemetabolismus stärkeproduzierender Pflan­ zen durch gentechnologische Methoden. Voraussetzung hierfür ist jedoch die Identifizierung und Charakterisierung der an der Stärkesynthese und/oder -modifikation beteiligten Enzyme sowie die Isolierung der entsprechenden, diese Enzyme codie­ rende DNA-Moleküle.

Die biochemischen Synthesewege, die zum Aufbau von Stärke füh­ ren, sind im wesentlichen bekannt. Die Stärkesynthese in pflanzlichen Zellen findet in den Plastiden statt. In photo­ synthetisch aktiven Geweben sind dies die Chloroplasten, in photosynthetisch inaktiven, stärkespeichernden Geweben die Amyloplasten.

Die wichtigsten an der Stärkesynthese beteiligten Enzyme sind die Stärkesynthasen sowie die Verzweigungsenzyme. Bei den Stärkesynthasen sind verschiedene Isoformen beschrieben, die alle eine Polymerisierungsreaktion durch Übertragung eines Glucosylrestes von ADP-Glucose auf α-1,4-Glucane katalysieren. Verzweigungsenzyme katalysieren die Einführung von α-1,6-Ver­ zweigungen in lineare α-1,4-Glucane.

Stärkesynthasen können in zwei Klassen eingeteilt werden: die Stärkekorn-gebundenen Stärkesynthasen ("granule-bound starch synthases"; GBSS) und die löslichen Stärkesynthasen ("soluble starch synthases"; SSS). Diese Unterscheidung ist nicht in je­ dem Fall eindeutig zu treffen, da einige der Stärkesynthasen sowohl stärkekorngebunden als auch in löslicher Form vorliegen (Denyer et al., Plant J. 4 (1993), 191-198; Mu et al., Plant J. 6 (1994), 151-159). Für verschiedene Pflanzenspezies werden innerhalb dieser Klassen wiederum verschiedene Isoformen be­ schrieben, die sich hinsichtlich ihrer Abhängigkeit von Star­ termolekülen unterscheiden (sogenannte "primer dependent" (Typ II) und "primer independent" (Typ I) starch synthases).

Lediglich für die Isoform GBSS I gelang es bisher, die genaue Funktion bei der Stärkesynthese zu ermitteln. Pflanzen, in de­ nen diese Enzymaktivität stark oder vollkommen reduziert ist, synthetisieren eine amylosefreie (sogenannte "waxy") Stärke (Shure et al., Cell 35 (1983), 225-233; Visser et al., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 289-296; WO 92/11376), so daß diesem Enzym eine entscheidende Rolle bei der Synthese der Amylose- Stärke zugesprochen wird. Dieses Phänomen wird ebenfalls in Zellen der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii beobachtet (Delrue et al., J. Bacteriol. 174 (1992), 3612-3620). Bei Chlamydomonas konnte darüber hinaus gezeigt werden, daß GBSS I nicht nur an der Synthese der Amylose beteiligt ist, sondern auch einen Einfluß auf die Amylopektinsynthese besitzt. In Mu­ tanten, die keine GBSS I-Aktivität aufweisen, fehlt eine be­ stimmte Fraktion des normalerweise synthetisierten Amylopek­ tins, die längerkettige Glucane aufweist.

Die Funktionen der anderen Isoformen der Stärkekorn-gebundenen Stärkesynthasen, insbesondere der GBSS II, und der löslichen Stärkesynthasen sind bisher unklar. Es wird angenommen, daß die löslichen Stärkesynthasen zusammen mit Verzweigungsenzymen an der Synthese des Amylopektins beteiligt sind (siehe z. B. Ponstein et al., Plant Physiol. 92 (1990), 234-241) und daß sie eine wichtige Funktion bei der Regulation der Stärkesyn­ theserate spielen.

Bei Mais wurden zwei Isoformen der Stärkekorn-gebundenen, so­ wie zwei bzw. drei Isoformen der löslichen Stärkesynthasen identifiziert (Hawker et al., Arch. Biochem. Biophys. 160 (1974), 530-551; Pollock und Preiss, Arch. Biochem. Biophys. 204 (1980), 578-588; MacDonald und Preiss, Plant Physiol. 78 (1985), 849-852; Mu et al., Plant J. 6 (1994) , 151-159).

Eine GBSS I aus Mais codierende cDNA sowie eine genomische DNA sind bereits beschrieben (Shure et al., Cell 35 (1983), 225-233; Kloesgen et al., Mol. Gen. Genet. 203 (1986), 237-244). Weiterhin ist ein sogenannter "Expressed Sequence Tag (EST) beschrieben worden (Shen et al., 1994, GenBank Nr.: T14684), dessen abgeleitete Aminosäuresequenz eine starke Ähnlichkeit zur abgeleiteten Aminosäuresequenz der GBSS II aus Erbse (Dry et al., Plant J. 2 (1992), 193-202) und Kartoffel (Edwards et al., Plant J. 8 (1995), 283-294) aufweist. Nucleinsäuresequen­ zen, die weitere Stärkesynthase-Isoformen aus Mais codieren, lagen jedoch bisher noch nicht vor. cDNA-Sequenzen, die für andere Stärkesynthasen als für die GBSS I codieren, wurden bisher lediglich für Erbse (Dry et al., Plant J. 2 (1992), 193-202), Reis (Baba et al., Plant Physiol. 103 (1993), 565-573) und Kartoffel (Edwards et al., Plant J. 8 (1995), 283-294) beschrieben.

Außer beim Mais wurden lösliche Stärkesynthasen auch in einer Reihe weiterer Pflanzenarten identifiziert. Lösliche Stärke­ synthasen sind beispielsweise bis zur Homogenität aus Erbse (Denyer und Smith, Planta 186 (1992), 609-617) und Kartoffel (Edwards et al., Plant J. 8 (1995), 283-294) isoliert worden. In diesen Fällen stellte sich heraus, daß die als SSS II iden­ tifizierte Isoform der löslichen Stärkesynthase identisch ist mit der Stärkekorn-gebundenen Stärkesynthase GBSS II (Denyer et al., Plant J. 4 (1993), 191-198; Edwards et al., Plant J. 8 (1995), 283-294). Für einige weitere Pflanzenspezies wurde das Vorhandensein mehrerer SSS-Isoformen mit Hilfe chromatographi­ scher Methoden beschrieben, beispielsweise bei Gerste (Tyynelä und Schulman, Physiologia Plantarum 89 (1993) 835-841; Kreis, Planta 148 (1980), 412-416) und Weizen (Rÿven, Plant Physiol. 81 (1986), 448-453). DNA-Sequenzen, die diese Proteine codie­ ren, wurden jedoch bisher nicht beschrieben.

Um weitere Möglichkeiten bereitzustellen, beliebige stärke­ speichernde Pflanzen dahingehend zu verändern, daß sie eine mo­ difizierte Stärke synthetisieren, ist es erforderlich, jeweils DNA-Sequenzen zu identifizieren, die weitere Isoformen der Stärkesynthasen codieren.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Nucleinsäuremoleküle zur Verfügung zu stellen, die an der Stärkebiosynthese beteiligte Enzyme codieren und mit deren Hilfe es möglich ist, gentechnisch veränderte Pflanzen herzu­ stellen, die eine erhöhte oder erniedrigte Aktivität dieser Enzyme aufweisen, wodurch es zu einer Veränderung der chemi­ schen und/oder physikalischen Eigenschaften der in diesen Pflanzen synthetisierten Stärke kommt.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patent­ ansprüchen bezeichneten Ausführungsformen gelöst.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher Nucleinsäuremoleküle, die Proteine mit der biologischen Aktivität einer löslichen Stärkesynthase des Typs I aus Mais codieren, wobei derartige Moleküle vorzugsweise Proteine codieren, die die unter Seq ID No. 2 angegebenen Aminosäuresequenz umfassen. Insbesondere betrifft die Erfindung Nucleinsäuremoleküle, die die unter Seq ID No. 1 angegebene Nucleotidsequenz oder einen Teil davon enthalten, bevorzugt Moleküle, die die in Seq ID No. 1 angege­ bene codierende Region umfassen bzw. entsprechende Ribo­ nucleotidsequenzen.

Die Erfindung betrifft auch Nucleinsäuremoleküle, die eine Se­ quenz aufweisen, die zu der gesamten oder einem Teil der unter Seq ID No. 1 dargestellten Sequenz komplementär ist.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremole­ küle, die eine lösliche Stärkesynthase aus Mais codieren und deren einer Strang mit einem der oben beschriebenen Moleküle hybridisiert.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Nucleinsäuremoleküle, die eine lösliche Stärkesynthase des Typs I aus Mais codieren und deren Sequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von den Nucleotidsequenzen der oben beschriebenen Mole­ küle abweicht.

Bei den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen kann es sich sowohl um DNA- als auch RNA-Moleküle handeln. Entsprechende DNA-Moleküle sind beispielsweise genomische oder cDNA-Mole­ küle.

Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet im Rahmen dieser Erfin­ dung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisie­ rungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrock et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (1989) Cold Spring Harbor Labo­ ratory Press, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben sind. Nucleinsäuremoleküle, die mit den erfindungsgemäßen Nuclein­ säuremolekülen hybridisieren, können prinzipiell aus jeder be­ liebigen Maispflanze stammen, die derartige Moleküle besitzt.

Nucleinsäuremoleküle, die mit den erfindungsgemäßen Molekülen hybridisieren, können z. B. aus genomischen oder aus cDNA-Bi­ bliotheken von Maispflanzen oder Maispflanzengewebe isoliert werden. Alternativ können sie durch gentechnische Methoden oder durch chemische Synthese hergestellt sein.

Die Identifizierung und Isolierung derartiger Nucleinsäuremo­ leküle kann dabei unter Verwendung der erfindungsgemäßen Mole­ küle oder Teile dieser Moleküle bzw. der reversen Komplemente dieser Moleküle erfolgen, z. B. mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor La­ boratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Als Hybridisierungsprobe können z . B. Nucleinsäuremoleküle ver­ wendet werden, die exakt die oder im wesentlichen die unter Seq ID No. 1 angegebene Nucleotidsequenz oder Teile dieser Se­ quenz aufweisen. Bei den als Hybridisierungsprobe verwendeten Fragmenten kann es sich auch um synthetische Fragmente han­ deln, die mit Hilfe der gängigen Synthesetechniken hergestellt wurden und deren Sequenz im wesentlichen mit der eines erfin­ dungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls übereinstimmt. Hat man Gene identifiziert und isoliert, die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen hybridisieren, ist eine Bestimmung der Sequenz und eine Analyse der Eigenschaften der von dieser Se­ quenz codierten Proteine erforderlich.

Die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridi­ sierenden Moleküle umfassen auch Fragmente, Derivate und alle­ lische Varianten der oben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle, die eine erfindungsgemäße lösliche Stärkesynthase aus Mais co­ dieren. Unter Fragmenten werden dabei Teile der Nucleinsäure­ moleküle verstanden, die lang genug sind, um eines der be­ schriebenen Proteine zu codieren. Der Ausdruck Derivat bedeu­ tet in diesem Zusammenhang, daß die Sequenzen dieser Moleküle sich von den Sequenzen der oben beschriebenen Nucleinsäuremo­ leküle an einer oder mehreren Positionen unterscheiden und einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität von mindestens 40%, insbesondere eine Identität von mindestens 60%, vor­ zugsweise über 80% und besonders bevorzugt über 90%. Die Ab­ weichungen zu den oben beschriebenen Nucleinsäuremolekülen können dabei durch Deletion, Substitution, Insertion oder Re­ kombination entstanden sein.

Homologie bedeutet ferner, daß funktionelle und/oder struktu­ relle Äquivalenz zwischen den betreffenden Nucleinsäuremolekü­ len oder den durch sie codierten Proteinen, besteht. Bei den Nucleinsäuremolekülen, die homolog zu den oben beschriebenen Molekülen sind und Derivate dieser Moleküle darstellen, han­ delt es sich in der Regel um Variationen dieser Moleküle, die Modifikationen darstellen, die dieselbe biologische Funktion ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftre­ tende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus an­ deren Maissorten, oder um Mutationen, wobei diese Mutationen auf natürliche Weise aufgetreten sein können oder durch ge­ zielte Mutagenese eingeführt wurden. Ferner kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende Varianten handeln, als auch um synthetisch herge­ stellte oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugte Varian­ ten.

Die von den verschiedenen Varianten der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codierten Proteine weisen bestimmte ge­ meinsame Charakteristika auf. Dazu können z. B. Enzymaktivität, Molekulargewicht, immunologische Reaktivität, Konformation etc. gehören, sowie physikalische Eigenschaften wie z. B. das Laufverhalten in Gelelektrophoresen, chromatographisches Ver­ halten, Sedimentationskoeffizienten, Löslichkeit, spektrosko­ pische Eigenschaften, Stabilität; pH-Optimum, Temperatur-Opti­ mum etc.

Wichtige Charakteristika einer Stärkesynthase sind: i) ihre Lokalisation im Stroma der Plastiden pflanzlicher Zellen; ii) ihre Fähigkeit zur Synthese linearer α-1,4-verknüpfter Poly­ glucane unter Verwendung von ADP-Glucose als Substrat. Diese Aktivität kann wie in Denyer und Smith (Planta 186 (1992), 606-617) oder wie in den Beispielen beschrieben bestimmt wer­ den.

Bei den durch die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen co­ dierten Proteine handelt es sich um eine bisher nicht identi­ fizierte und charakterisierte Form einer löslichen Stärke­ synthase aus Mais, die dem Typ I ("primer independent") zuge­ ordnet werden kann. Derartige Stärkesynthasen bzw. Nucleinsäu­ remoleküle, die derartige Proteine codieren, sind bisher aus Mais nicht beschrieben. Das codierte Protein weist eine ge­ wisse Homologie zu einer löslichen Stärkesynthase aus Reis auf (Baba et al., Plant Physiol. 103 (1993), 565-573).

Gegenstand der Erfindung sind auch Oligonucleotide, die spezi­ fisch mit einem erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül hybridi­ sieren. Derartige Oligonucleotide haben vorzugsweise eine Länge von mindestens 10, insbesondere von mindestens 15 und besonders bevorzugt von mindestens 50 Nucleotiden. Sie sind dadurch gekennzeichnet, daß sie spezifisch mit erfindungsge­ mäßen Nucleinsäuremolekülen hybridisieren, d. h. nicht oder nur in sehr geringem Ausmaß mit Nucleinsäuresequenzen, die andere Proteine, insbesondere andere Stärkesynthasen codieren. Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide können beispielsweise als Primer für eine PCR-Reaktion verwendet werden. Ebenso können sie Bestandteile von antisense-Konstrukten sein oder von DNA-Molekülen, die für geeignete Ribozyme codieren.

Ferner betrifft die Erfindung Vektoren, insbesondere Plasmide, Cosmide, Viren, Bacteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren, die die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle enthalten.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in den Vektoren enthaltenen Nucleinsäuremoleküle verknüpft mit regulatorischen Elementen, die die Transkription und Synthese einer transla­ tierbaren RNA in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen gewährleisten.

Die Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in prokaryontischen Zellen, beispielsweise in Escherichia coli, ist insofern interessant, als daß auf diese Weise eine ge­ nauere Charakterisierung der enzymatischen Aktivitäten der En­ zyme, für die diese Moleküle codieren, ermöglicht wird. Es ist insbesondere möglich, das Produkt, das von den entsprechenden Enzymen in Abwesenheit anderer, in der pflanzlichen Zelle an der Stärkesynthese beteiligter Enzyme synthetisiert wird, zu charakterisieren. Dies läßt Rückschlüsse zu auf die Funktion, die das entsprechende Protein bei der Stärkesynthese in der Pflanzenzelle ausübt.

Darüber hinaus ist es möglich, mittels gängiger molekularbio­ logischer Techniken (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecu­ lar Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) verschiedenartige Mutationen in die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle ein­ zuführen, wodurch es zur Synthese von Proteinen mit eventuell veränderten biologischen Eigenschaften kommt. Hierbei ist zum einen die Erzeugung von Deletionsmutanten möglich, bei denen durch fortschreitende Deletionen vom 5′- oder vom 3′- Ende der codierenden DNA-Sequenz Nucleinsäuremoleküle erzeugt werden, die zur Synthese entsprechend verkürzter Proteine führen. Durch derartige Deletionen am 5′-Ende der Nucleotidsequenz ist es beispielsweise möglich, Aminosäuresequenzen zu identifizie­ ren, die für die Translokation des Enzyms in die Plastiden verantwortlich sind (Transitpeptide). Dies erlaubt es, gezielt Enzyme herzustellen, die durch Entfernen der entsprechenden Sequenzen nicht mehr in den Plastiden, sondern im Cytosol lo­ kalisiert sind, oder aufgrund der Addition von anderen Si­ gnalsequenzen in anderen Kompartimenten lokalisiert sind.

Andererseits ist auch die Einführung von Punktmutationen denk­ bar an Positionen, bei denen eine Veränderung der Aminosäure­ sequenz einen Einfluß beispielweise auf die Enzymaktivität oder die Regulierung des Enzyms hat. Auf diese Weise können z. B. Mutanten hergestellt werden, die einen veränderten K_m- Wert besitzen oder nicht mehr den normalerweise in der Zelle vorliegenden Regulationsmechanismen über allosterische Regula­ tion oder kovalente Modifizierung unterliegen.

Des weiteren können Mutanten hergestellt werden, die eine ver­ änderte Substrat- oder Produktspezifität aufweisen, wie z. B. Mutanten, die als Substrat ADP-Glucose-6-Phosphat anstatt ADP-Glucose verwenden. Weiterhin können Mutanten hergestellt wer­ den, die ein verändertes Aktivitäts-Temperatur-Profil aufwei­ sen.

Für die gentechnische Manipulation in prokaryontischen Zellen können die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder Teile dieser Moleküle in Plasmide eingebracht werden, die eine Muta­ genese oder eine Sequenzveränderung durch Rekombination von DNA-Sequenzen erlauben. Mit Hilfe von Standardverfahren (vgl. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) können Basenaustausche vorgenommen oder natürliche oder synthetische Sequenzen hinzugefügt werden. Für die Verbindung der DNA-Frag­ mente untereinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden. Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen zur Verfügung stellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfer­ nen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Sub­ stitutionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primer repair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Als Analysemethode werden im allgemeinen eine Sequenzanalyse, eine Restriktionsanalyse und weitere biochemisch-molekularbio­ logische Methoden durchgeführt.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Wirtszellen, insbesondere prokaryontische oder eukaryontische Zellen, die mit einem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül oder einem erfindungsgemäßen Vektor trans­ formiert sind, sowie Zellen, die von derart transformierten Zellen abstammen und ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül oder einen Vektor enthalten. Dabei handelt es sich vorzugs­ weise um bakterielle Zellen oder pflanzliche Zellen.

Gegenstand der Erfindung sind ferner die Proteine, die durch die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codiert werden, so­ wie Verfahren zu deren Herstellung, wobei eine erfindungsge­ mäße Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert wird, die die Synthese des Proteins erlauben, und anschließend das Protein aus den kultivierten Zellen und/oder dem Kulturmedium isoliert wird.

Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremo­ leküle ist es nun möglich, mit Hilfe gentechnischer Methoden in den Stärkemetabolismus von Pflanzen einzugreifen, wie es bisher nicht möglich war, und ihn dahingehend zu verändern, daß es zur Synthese einer modifizierten Stärke kommt, die bei­ spielsweise in ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften, insbesondere dem Amylose/Amylopektin-Verhältnis, dem Verzwei­ gungsgrad, der durchschnittlichen Kettenlänge, dem Phosphatge­ halt, dem Verkleisterungsverhalten, der Stärkekorngröße und/oder der Stärkekornform im Vergleich zu in Wildtyp-Pflan­ zen synthetisierter Stärke verändert ist. Durch eine Erhöhung der Aktivität der erfindungsgemäßen Proteine, beispielsweise durch Überexpression entsprechender Nucleinsäuremoleküle, oder durch die Bereitstellung von Mutanten, die nicht mehr den zelleigenen Regulationsmechanismen unterliegen und/oder unter­ schiedliche Temperaturabhängigkeiten in bezug auf ihre Aktivi­ tät besitzen, besteht die Möglichkeit der Ertragssteigerung in entsprechend gentechnisch veränderten Pflanzen. Die wirt­ schaftliche Bedeutung der Möglichkeit des Eingriffs in die Stärkesynthese allein bei Mais ist offensichtlich: Mais ist weltweit die wichtigste Pflanze zur Stärkegewinnung. Ca. 80% der weltweit jährlich produzierten Stärke wird aus Mais gewon­ nen.

Möglich ist somit die Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in pflanzlichen Zellen, um die Aktivität der entsprechenden löslichen Stärkesynthase zu erhöhen. Ferner ist es möglich, die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle nach dem Fachmann bekannten Methoden zu modifizieren, um er­ findungsgemäß Stärkesynthasen zu erhalten, die nicht mehr den zelleigenen Regulationsmechanismen unterliegen, bzw. verän­ derte Temperaturabhängigkeiten oder Substrat- bzw. Pro­ duktspezifitäten aufweisen.

Bei der Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in Pflanzen besteht grundsätzlich die Möglichkeit, daß das synthetisierte Protein in jedem beliebigen Kompartiment der pflanzlichen Zelle lokalisiert sein kann. Um die Lokalisation in einem bestimmten Kompartiment zu erreichen, muß die die Lo­ kalisation in Plastiden gewährleistende Sequenz deletiert wer­ den und die verbleibende codierende Region gegebenenfalls mit DNA-Sequenzen verknüpft werden, die die Lokalisierung in dem jeweiligen Kompartiment gewährleisten. Derartige Sequenzen sind bekannt (siehe beispielsweise Braun et al., EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald et al., Plant J. 1 (1991), 95-106).

Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch transgene Pflan­ zenzellen, die mit einem erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül transformiert wurden, sowie transgene Pflanzenzellen, die von derartig transformierten Zellen abstammen. Derartige Zellen enthalten ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül, wobei dieses vorzugsweise mit regulatorischen DNA-Elementen ver­ knüpft ist, die die Transkription in pflanzlichen Zellen ge­ währleisten, insbesondere mit einem Promotor. Derartige Zellen lassen sich von natürlicherweise vorkommenden Pflanzenzellen dadurch unterscheiden, daß sie ein erfindungsgemäßes Nuclein­ säuremolekül enthalten, das natürlicherweise in diesen Zellen nicht vorkommt oder dadurch, daß ein solches Molekül an einem Ort im Genom der Zelle integriert vorliegt, an dem es sonst nicht vorkommt, d. h. in einer anderen genomischen Umgebung.

Die transgenen Pflanzenzellen können nach dem Fachmann bekann­ ten Techniken zu ganzen Pflanzen regeneriert werden. Die durch Regeneration der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen erhältlichen Pflanzen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegen­ den Erfindung. Ferner sind Gegenstand der Erfindung Pflanzen, die die obenbeschriebenen transgenen Pflanzenzellen enthalten. Bei den transgenen Pflanzen kann es sich prinzipiell um Pflan­ zen jeder beliebigen Pflanzenspezies handeln, d. h. sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen. Bevorzugt handelt es sich um Nutzpflanzen, insbesondere um stärkesynthetisierende bzw. stärkespeichernde Pflanzen, wie z. B. Getreidearten (Roggen, Gerste Hafer, Weizen etc.), Reis, Mais, Erbse, Maniok oder Kartoffel.

Die Erfindung betrifft ebenfalls Vermehrungsmaterial der er­ findungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Früchte, Samen, Knol­ len, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge etc.

Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen synthetisieren aufgrund der Expression bzw. zusätzlichen Ex­ pression eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls eine Stärke, die beispielsweise in ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften, insbesondere dem Amylose/Amylopektin-Verhält­ nis, dem Verzweigungsgrad, der durchschnittlichen Kettenlänge, dem Phosphatgehalt, dem Verkleisterungsverhalten, der Stärke­ korngröße und/oder der Stärkekornform im Vergleich zu in Wild­ typ-Pflanzen synthetisierter Stärke verändert ist. Insbeson­ dere kann eine solche Stärke im Hinblick auf die Viskosität und/oder die Gelbildungseigenschaften von Kleistern dieser Stärke im Vergleich zu Wildtypstärke verändert sein.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch die aus den erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen, Pflanzen so­ wie Vermehrungsmaterial erhältliche Stärke.

Ferner ist es möglich, mit Hilfe der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle Maispflanzenzellen und Maispflanzen zu erzeugen, bei denen die Aktivität eines erfindungsgemäßen Pro­ teins verringert ist. Dies führt ebenfalls zur Synthese einer Stärke mit veränderten chemischen und/oder physikalischen Eigenschaften verglichen mit Stärke aus Wildtyp-Pflanzenzel­ len.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind somit auch trans­ gene Maispflanzenzellen, in denen die Aktivität eines erfin­ dungsgemäßen Proteins verringert ist im Vergleich zu nicht­ transformierten Zellen.

Die Herstellung von Maispflanzenzellen mit einer verringerten Aktivität eines erfindungsgemäßen Proteins kann beispielsweise erzielt werden durch die Expression einer entsprechenden anti­ sense-RNA, einer sense-RNA zur Erzielung eines Cosuppressions­ effektes oder die Expression eines entsprechend konstruierten Ribozyms, das spezifisch Transkripte spaltet, die eines der erfindungsgemäßen Proteine codieren, unter Verwendung der er­ findungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle.

Vorzugsweise wird zur Reduzierung der Aktivität eines erfin­ dungsgemäßen Proteins in pflanzlichen Zellen eine antisense- RNA exprimiert.

Hierzu kann zum einen ein DNA-Molekül verwendet werden, das die gesamte für ein erfindungsgemäßes Protein codierende Se­ quenz einschließlich eventuell vorhandener flankierender Se­ quenzen umfaßt, als auch DNA-Moleküle, die nur Teile der co­ dierenden Sequenz umfassen, wobei diese Teile lang genug sein müssen, um in den Zellen einen antisense-Effekt zu bewirken. Es können im allgemeinen Sequenzen bis zu einer Mindestlänge von 15 bp, vorzugsweise einer Länge von 100-500 bp, für eine effiziente antisense-Inhibition insbesondere Sequenzen mit einer Länge über 500 bp verwendet werden. In der Regel werden DNA-Moleküle verwendet, die kürzer als 5000 bp, vorzugsweise Sequenzen, die kürzer als 2500 bp sind.

Möglich ist auch die Verwendung von DNA-Sequenzen, die einen hohen Grad an Homologie zu den Sequenzen der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle aufweisen, aber nicht vollkommen identisch sind. Die minimale Homologie sollte größer als ca. 65% sein. Die Verwendung von Sequenzen mit Homologien zwischen 95 und 100% ist zu bevorzugen.

Gegenstand der Erfindung sind auch Maispflanzen, die erfin­ dungsgemäße transgene Maispflanzenzellen enthalten. Die Er­ findung betrifft ebenfalls Vermehrungsmaterial der erfin­ dungsgemäßen Pflanzen, insbesondere Samen.

Die erfindungsgemäßen transgenen Maispflanzenzellen und Mais­ pflanzen synthetisieren aufgrund der Verringerung der Aktivi­ tät eines der erfindungsgemäßen Proteine eine Stärke, die bei­ spielsweise in ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften, insbesondere dem Amylose/Amylopektin-Verhältnis, dem Verzwei­ gungsgrad, der durchschnittlichen Kettenlänge, dem Phosphatge­ halt, dem Verkleisterungsverhalten, der Stärkekorngröße und/oder der Stärkekornform im Vergleich zu in Wildtyp-Pflan­ zen synthetisierter Stärke verändert ist. Diese Stärke kann beispielsweise veränderte Viskositäten und/oder Gelbil­ dungseigenschaften ihrer Kleister zeigen im Vergleich zu Stärke aus Wildtyp-Pflanzen.

Gegenstand der Erfindung ist somit auch die aus den vorgehend beschriebenen transgenen Maispflanzenzellen, Maispflanzen so­ wie Vermehrungsmaterial erhältliche Stärke.

Die erfindungsgemäßen Stärken können nach dem Fachmann bekann­ ten Verfahren modifiziert werden und eignen sich in unmodifi­ zierter oder modifizierter Form für verschiedene Verwendungen im Nahrungsmittel- oder Nicht-Nahrungsmittelbereich.

Grundsätzlich läßt sich die Einsatzmöglichkeit der Stärke in zwei große Bereiche unterteilen. Der eine Bereich umfaßt die Hydrolyseprodukte der Stärke, hauptsächlich Glucose und Glucanbausteine, die über enzymatische oder chemische Verfah­ ren erhalten werden. Sie dienen als Ausgangsstoff für weitere chemische Modifikationen und Prozesse, wie Fermentation. Für eine Reduktion der Kosten kann hierbei die Einfachheit und ko­ stengünstige Ausführung eines Hydrolyseverfahrens von Bedeu­ tung sein. Gegenwärtig verläuft es im wesentlichen enzymatisch unter Verwendung von Amyloglucosidase. Vorstellbar wäre eine Kosteneinsparung durch einen geringeren Einsatz von Enzymen. Eine Strukturveränderung der Stärke, z. B. Oberflächenvergröße­ rung des Korns, leichtere Verdaulichkeit durch geringeren Ver­ zweigungsgrad oder eine sterische Struktur, die die Zugäng­ lichkeit für die eingesetzten Enzyme begrenzt, könnte dies be­ wirken.

Der andere Bereich, in dem die Stärke wegen ihrer polymeren Struktur als sogenannte native Stärke verwendet wird, gliedert sich in zwei weitere Einsatzgebiete:

1. Nahrungsmittelindustrie

Stärke ist ein klassischer Zusatzstoff für viele Nah­ rungsmittel, bei denen sie im wesentlichen die Funktion des Bindens von wäßrigen Zusatzstoffen übernimmt bzw. eine Erhöhung der Viskosität oder aber eine erhöhte Gel­ bildung hervorruft. Wichtige Eigenschaftsmerkmale sind das Fließ- und Sorptionsverhalten, die Quell- und Ver­ kleisterungstemperatur, die Viskosität und Dickungslei­ stung, die Löslichkeit der Stärke, die Transparenz und Kleisterstruktur, die Hitze-, Scher- und Säurestabilität, die Neigung zur Retrogradation, die Fähigkeit zur Film­ bildung, die Gefrier/Taustabilität, die Verdaulichkeit sowie die Fähigkeit zur Komplexbildung mit z. B. anorgani­ schen oder organischen Ionen.

2. Nicht-Nahrungsmittelindustrie

In diesem großen Bereich kann die Stärke als Hilfsstoff für unterschiedliche Herstellungsprozesse bzw. als Zu­ satzstoff in technischen Produkten eingesetzt. Bei der Verwendung der Stärke als Hilfsstoffist hier insbeson­ dere die Papier- und Pappeindustrie zu nennen. Die Stärke dient dabei in erster Linie zur Retardation (Zurückhaltung von Feststoffen), der Abbindung von Füll­ stoff- und Feinstoffteilchen, als Festigungsstoff und zur Entwässerung. Darüber hinaus werden die günstigen Eigen­ schaften der Stärke in bezug auf die Steifigkeit, die Härte, den Klang, den Griff, den Glanz, die Glätte, die Spaltfestigkeit sowie die Oberflächen ausgenutzt.

2.1 Papier- und Pappeindustrie

Innerhalb des Papierherstellungsprozesses sind vier An­ wendungsbereiche, nämlich Oberfläche, Strich, Masse und Sprühen, zu unterscheiden.

Die Anforderungen an die Stärke in bezug auf die Oberflä­ chenbehandlung sind im wesentlichen ein hoher Weißegrad, eine angepaßte Viskosität, eine hohe Viskositätsstabili­ tät, eine gute Filmbildung sowie eine geringe Staubbil­ dung. Bei der Verwendung im Strich spielt der Feststoff­ gehalt, eine angepaßte Viskosität, ein hohes Bindevermö­ gen sowie eine hohe Pigmentaffinität eine wichtige Rolle. Als Zusatz zur Masse ist eine rasche, gleichmäßige, ver­ lustfreie Verteilung, eine hohe mechanische Stabilität und eine vollständige Zurückhaltung im Papierfließ von Bedeutung. Beim Einsatz der Stärke im Sprühbereich sind ebenfalls ein angepaßter Feststoffgehalt, hohe Viskosität sowie ein hohes Bindevermögen von Bedeutung.

2.2 Klebstoffindustrie

Ein großer Einsatzbereich der Stärken besteht in der Klebstoffindustrie, wo man die Einsatzmöglichkeiten in vier Teilbereiche gliedert: die Verwendung als reinem Stärkeleim, die Verwendung bei mit speziellen Chemikalien aufbereiteten Stärkeleimen, die Verwendung von Stärke als Zusatz zu synthetischen Harzen und Polymerdispersionen sowie die Verwendung von Stärken als Streckmittel für synthetische Klebstoffe. 90% der Klebstoffe auf Stärke­ basis werden in den Bereichen Wellpappenherstellung, Her­ stellung von Papiersäcken, Beuteln und Tüten, Herstellung von Verbundmaterialien für Papier und Aluminium, Herstel­ lung von Kartonagen und Wiederbefeuchtungsleim für Brief­ umschläge, Briefmarken usw. eingesetzt.

2.3 Textil- und Textilpflegemittelindustrie

Ein großes Einsatzfeld für die Stärken als Hilfmittel und Zusatzstoff ist der Bereich Herstellung von Textilien und Textilpflegemitteln. Innerhalb der Textilindustrie sind die folgenden vier Einsatzbereiche zu unterscheiden: Der Einsatz der Stärke als Schlichtmittel, d. h. als Hilfs­ stoff zur Glättung und Stärkung des Klettverhaltens zum Schutz gegen die beim Weben angreifenden Zugkräfte sowie zur Erhöhung der Abriebfestigkeit beim Weben, Stärke als Mittel zur Textilaufrüstung vor allem nach qualitätsver­ schlechternden Vorbehandlungen, wie Bleichen, Färben usw., Stärke als Verdickungsmittel bei der Herstellung von Farbpasten zur Verhinderung von Farbstoffdiffusionen sowie Stärke als Zusatz zu Kettungsmitteln für Nähgarne.

2.4 Baustoffindustrie

Der vierte Einsatzbereich ist die Verwendung der Stärken als Zusatz bei Baustoffen. Ein Beispiel ist die Herstel­ lung von Gipskartonplatten, bei der die im Gipsbrei ver­ mischte Stärke mit dem Wasser verkleistert, an die Ober­ fläche der Gipsplatte diffundiert und dort den Karton an die Platte bindet. Weitere Einsatzbereiche sind die Bei­ mischung zu Putz- und Mineralfasern. Bei Transportbeton werden Stärkeprodukte zur Verzögerung der Abbindung ein­ gesetzt.

2.5 Bodenstabilisation

Ein weiterer Markt für die Stärke bietet sich bei der Herstellung von Mitteln zur Bodenstabilisation an, die bei künstlichen Erdbewegungen zum temporären Schutz der Bodenpartikel gegenüber Wasser eingesetzt werden. Kombi­ nationsprodukte aus der Stärke und Polymeremulsionen sind nach heutiger Kenntnis in ihrer Erosions- und ver­ krustungsmindernden Wirkung den bisher eingesetzten Pro­ dukten gleichzusetzen, liegen preislich aber deutlich un­ ter diesen.

2.6 Einsatz bei Pflanzenschutz- und Düngemitteln

Ein Einsatzbereich liegt bei der Verwendung der Stärke in Pflanzenschutzmitteln zur Veränderung der spezifischen Eigenschaften der Präparate. So kann die Stärke zur Ver­ besserung der Benetzung von Pflanzenschutz- und Düngemit­ teln, zur dosierten Freigabe der Wirkstoffe, zur Umwand­ lung flüssiger, flüchtiger und/oder übelriechender Wirk­ stoffe in mikrokristalline, stabile, formbare Substanzen, zur Mischung inkompatibler Verbindungen und zur Verlänge­ rung der Wirkdauer durch Verminderung der Zersetzung ein­ gesetzt werden.

2.7 Pharmaka, Medizin und Kosmetikindustrie

Ein weiteres Einsatzgebiet besteht im Bereich der Phar­ maka, Medizin und Kosmetikindustrie. In der pharmazeuti­ schen Industrie kann die Stärke als Bindemittel für Ta­ bletten oder zur Bindemittelverdünnung in Kapseln einge­ setzt werden. Weiterhin kann die Stärke als Tabletten­ sprengmittel dienen, da sie nach dem Schlucken Flüssig­ keit absorbieren und nach kurzer Zeit soweit quellen, daß der Wirkstoff freigesetzt wird. Medizinische Gleit- und Wundpuder basieren aus qualitativen Gründen auf Stärke. Im Bereich der Kosmetik werden Stärken beispielsweise als Träger von Puderzusatzstoffen, wie Düften und Salicyl­ säure eingesetzt. Ein relativ großer Anwendungsbereich für die Stärke liegt bei Zahnpasta.

2.8 Stärkezusatz zu Kohlen und Briketts

Einen Einsatzbereich bietet die Stärke als Zusatzstoff zu Kohle und Brikett. Kohle kann mit einem Stärkezusatz quantitativ hochwertig agglomeriert bzw. brikettiert wer­ den, wodurch ein frühzeitiges Zerfallen der Briketts ver­ hindert wird. Der Stärkezusatz liegt bei Grillkohle zwi­ schen 4 und 6%, bei kalorierter Kohle zwischen 0,1 und 0,5%. Des weiteren gewinnen Stärken als Bindemittel an Bedeutung, da durch ihren Zusatz zu Kohle und Brikett der Ausstoß schädlicher Stoffe deutlich vermindert werden kann.

2.9 Erz- und Kohleschlammaufbereitung

Die Stärke kann ferner bei der Erz- und Kohleschlammauf­ bereitung als Flockungsmittel eingesetzt werden.

2.10 Gießereihilfsstoff

Ein weiterer Einsatzbereich besteht als Zusatz zu Gieße­ reihilfsstoffen. Bei verschiedenen Gußverfahren werden Kerne benötigt, die aus Bindemittel-versetzten Sänden hergestellt werden. Als Bindemittel wird heute überwie­ gend Bentonit eingesetzt, das mit modifizierten Stärken, meist Quellstärken, versetzt ist.

Zweck des Stärkezusatzes ist die Erhöhung der Fließfe­ stigkeit sowie die Verbesserung der Bindefestigkeit. Dar­ über hinaus können die Quellstärken weitere produk­ tionstechnische Anforderungen, wie im kalten Wasser dis­ pergierbar, rehydratisierbar, gut in Sand mischbar und hohes Wasserbindungsvermögen, aufweisen.

2.11 Einsatz in der Kautschukindustrie

In der Kautschukindustrie kann die Stärke zur Verbesse­ rung der technischen und optischen Qualität eingesetzt werden. Gründe sind dabei die Verbesserung des Oberflä­ chenglanzes, die Verbesserung des Griffs und des Ausse­ hens, dafür wird Stärke vor der Kaltvulkanisation auf die klebrigen gummierten Flächen von Kautschukstoffen ge­ streut, sowie die Verbesserung der Bedruckbarkeit des Kautschuks.

2.12 Herstellung von Lederersatzstoffen

Eine weitere Absatzmöglichkeit der modifizierten Stärken besteht bei der Herstellung von Lederersatzstoffen.

2.13 Stärke in synthetischen Polymeren

Auf dem Kunststoffsektor zeichnen sich folgende Einsatz­ gebiete ab: die Einbindung von Stärkefolgeprodukten in den Verarbeitungsprozeß (Stärke ist nur Füllstoff, es besteht keine direkte Bindung zwischen synthetischem Po­ lymer und Stärke) oder alternativ die Einbindung von Stärkefolgeprodukten in die Herstellung von Polymeren (Stärke und Polymer gehen eine feste Bindung ein).

Die Verwendung der Stärke als reinem Füllstoff ist verglichen mit den anderen Stoffen wie Talkum nicht wettbewerbsfähig. An­ ders sieht es aus, wenn die spezifischen Stärkeeigenschaften zum Tragen kommen und hierdurch das Eigenschaftsprofil der Endprodukte deutlich verändert wird. Ein Beispiel hierfür ist die Anwendung von Stärkeprodukten bei der Verarbeitung von Thermoplasten, wie Polyäthylen. Hierbei werden die Stärke und das synthetische Polymer durch Koexpression im Verhältnis von 1 : 1 zu einem ′master batch′ kombiniert, aus dem mit granu­ liertem Polyäthylen unter Anwendung herkömmlicher Verfah­ renstechniken diverse Produkte hergestellt werden. Durch die Einbindung von Stärke in Polyäthylenfolien kann eine erhöhte Stoffdurchlässigkeit bei Hohlkörpern, eine verbesserte Wasser­ dampfdurchlässigkeit, ein verbessertes Antistatikverhalten, ein verbessertes Antiblockverhalten sowie eine verbesserte Be­ druckbarkeit mit wäßrigen Farben erreicht werden.

Eine andere Möglichkeit ist die Anwendung der Stärke in Po­ lyurethanschäumen. Mit der Adaption der Stärkederivate sowie durch die verfahrenstechnische Optimierung ist es möglich, die Reaktion zwischen synthetischen Polymeren und den Hydroxygrup­ pen der Stärken gezielt zu steuern. Das Ergebnis sind Poly­ urethanfolien, die durch die Anwendung von Stärke folgende Eigenschaftsprofile erhalten: eine Verringerung des Wärmeaus­ dehnungskoeffizienten, Verringerung des Schrumpfverhaltens, Verbesserung des Druck/Spannungsverhaltens, Zunahme der Was­ serdampfdurchlässigkeit ohne Veränderung der Wasseraufnahme, Verringerung der Entflammbarkeit und der Aufrißdichte, kein Abtropfen brennbarer Teile, Halogenfreiheit und verminderte Alterung. Nachteile, die gegenwärtig noch vorhanden sind, sind verringerte Druckfestigkeit sowie eine verringerte Schlagfe­ stigkeit.

Die Produktentwicklung beschränkt sich inzwischen nicht mehr nur auf Folien. Auch feste Kunststoffprodukte, wie Töpfe, Platten und Schalen, sind mit einem Stärkegehalt von über 50% herzustellen. Des weiteren sind Stärke/ Polymermischungen gün­ stig zu beurteilen, da sie eine sehr viel höhere biologische Abbaubarkeit aufweisen.

Außerordentliche Bedeutung haben weiterhin auf Grund ihres ex­ tremen Wasserbindungsvermögen Stärkepfropfpolymerisate gewon­ nen. Dies sind Produkte mit einem Rückgrat aus Stärke und einer nach dem Prinzip des Radikalkettenmechanismus aufge­ pfropften Seitengitters eines synthetischen Monomers. Die heute verfügbaren Stärkepfropfpolymerisate zeichnen sich durch ein besseres Binde- und Rückhaltevermögen von bis zu 1000 g Wasser pro g Stärke bei hoher Viskosität aus. Die Anwendungs­ bereiche für diese Superabsorber haben sich in den letzten Jahren stark ausgeweitet und liegen im Hygienebereich mit Pro­ dukten wie Windeln und Unterlagen sowie im landwirtschaftlichen Sektor, z. B. bei Saatgutpillierungen.

Entscheidend für den Einsatz der neuen, gentechnisch veränder­ ten Stärken sind zum einen die Struktur, Wassergehalt, Pro­ teingehalt, Lipidgehalt, Fasergehalt, Asche/Phosphatgehalt, Amylose/Amylopektinverhältnis, Molmassenverteilung, Verzwei­ gungsgrad, Korngröße und -form sowie Kristallinität, zum ande­ ren auch die Eigenschaften, die in folgende Merkmale münden: Fließ- und Sorptionsverhalten, Verkleisterungstemperatur, Vis­ kosität, Dickungsleistung, Löslichkeit, Kleisterstruktur und -transparenz, Hitze-, Scher- und Säurestabilität, Retrograda­ tionsneigung, Gelbildung, Gefrier/Taustabilität, Komplexbil­ dung, Jodbindung, Filmbildung, Klebekraft, Enzymstabilität, Verdaulichkeit und Reaktivität.

Die Erzeugung modifizierter Stärken mittels gentechnischer Eingriffe in einer transgenen Pflanze kann zum einen die Eigenschaften der aus der Pflanze gewonnenen Stärke dahinge­ hend verändern, daß weitere Modifikationen mittels chemischer oder physikalischer Verfahren nicht mehr notwendig erscheinen. Zum anderen können die durch gentechnische Verfahren verän­ derte Stärken weiteren chemischen Modifikationen unterworfen werden, was zu weiteren Verbesserungen der Qualität für be­ stimmte der oben beschriebenen Einsatzgebiete führt. Diese chemischen Modifikationen sind grundsätzlich bekannt. Insbe­ sondere handelt es sich dabei um Modifikationen durch

• - Hitzebehandlung,
• - Säurebehandlung,
• - Oxidation und
• - Veresterungen,

welche zur Entstehung von Phosphat-, Nitrat-, Sulfat-, Xanthat-, Acetat- und Citratstärken führen. Weitere organische Säuren können ebenfalls zur Veresterung eingesetzt werden:

• - Erzeugung von Stärkeethern Stärke-Alkylether, O-Allylether, Hydroxylalkylether, O-Carboxylmethylether, N-haltige Stärkeether, P-haltige Stärkeether, S-haltige Stärkeether
• - Erzeugung von vernetzten Stärken
• - Erzeugung von Stärke-Pfropf-Polymerisaten.

Zur Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in sense- oder antisense-Orientierung in pflanzlichen Zellen wer­ den diese mit regulatorischen DNA-Elementen verknüpft, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten. Hierzu zählen insbesondere Promotoren. Generell kommt für die Ex­ pression jeder in pflanzlichen Zellen aktive Promotor in Frage.

Der Promotor kann dabei so gewählt sein, daß die Expression konstitutiv erfolgt oder nur in einem bestimmten Gewebe, zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung oder zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt. In Be­ zug auf die Pflanze kann der Promotor homolog oder heterolog sein. Sinnvolle Promotoren sind z. B. der Promotor der 35S RNA des Cauliflower Mosaic Virus und der Ubiquitin-Promotor aus Mais für eine konstitutive Expression, der Patatingen-Promotor B33 (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) für eine knollenspezifische Expression in Kartoffeln oder ein Promotor, der eine Expression lediglich in photosynthetisch aktiven Ge­ weben sicherstellt, z. B. der ST-LS1-Promotor (Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stock­ haus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451) oder für eine en­ dosperm-spezifische Expression der HMG-Promotor aus Weizen, der USP-Promotor, der Phaseolinpromotor oder Promotoren von Zein-Genen aus Mais.

Ferner kann eine Terminationssequenz vorhanden sein, die der korrekten Beendigung der Transkription dient sowie der Addi­ tion eines Poly-A-Schwanzes an das Transkript, dem eine Funk­ tion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (vgl. Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) und sind beliebig aus­ tauschbar.

Die vorliegende Erfindung stellt Nucleinsäuremoleküle zur Ver­ fügung, die eine neue in Mais identifizierte Form einer lösli­ chen Stärkesynthase codieren. Dies erlaubt nun sowohl die Identifizierung der Funktion dieser Stärkesynthase bei der Stärkebiosynthese, als auch die Herstellung gentechnisch ver­ änderter Pflanzen, bei denen die Aktivität dieses Enzyms ver­ ändert ist. Dies ermöglicht die Synthese einer Stärke mit ver­ änderter Struktur und somit veränderten physikalisch-chemi­ schen Eigenschaften in derartig manipulierten Pflanzen.

Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können prinzipiell auch dazu verwendet werden, Pflanzen herzustellen, bei denen die Aktivität der erfindungsgemäßen Stärkesynthase erhöht oder verringert ist und gleichzeitig die Aktivitäten anderer, an der Stärkebiosynthese beteiligter Enzyme verändert sind. Dabei sind alle Kombinationen und Permutationen denkbar. Durch die Veränderung der Aktivitäten einer oder mehrerer Isoformen der Stärkesynthasen in Pflanzen kommt es zur Synthese einer in ih­ rer Struktur veränderten Stärke. Durch die Steigerung der Ak­ tivität einer oder mehrerer Isoformen der Stärkesynthasen in den Zellen der stärkespeichernden Gewebe transformierter Pflanzen wie z. B. in dem Endosperm von Mais oder Weizen oder in der Knolle bei der Kartoffel kann es darüber hinaus zu einer Ertragssteigerung kommen. Beispielsweise können Nuclein­ säuremoleküle, die für ein erfindungsgemäßes Protein codieren oder entsprechende antisense-Konstrukte, in Pflanzenzellen eingebracht werden, bei denen bereits die Synthese endogener GBSS I-, SSS- oder GBSS II-Proteine aufgrund eines antisense-Effektes oder einer Mutation inhibiert ist oder die Synthese des Verzweigungsenzyms inhibiert ist (wie z. B. beschrieben in WO92/14827 oder der ae-Mutante (Shannon und Garwood, 1984, in Whistler, BeMiller und Paschall, Starch:Chemistry and Techno­ logy, Academic Press, London, 2nd Edition: 25-86)).

Soll die Inhibierung der Synthese mehrerer Stärke-Synthasen in transformierten Pflanzen erreicht werden, so können DNA-Mole­ küle zur Transformation verwendet werden, die gleichzeitig mehrere, die entsprechenden Stärkesynthasen codierenden Regio­ nen in antisense-Orientierung unter der Kontrolle eines geeig­ neten Promotors enthalten. Hierbei kann alternativ jede Se­ quenz unter der Kontrolle eines eigenen Promotors stehen, oder die Sequenzen können als Fusion von einem gemeinsamen Promotor transkribiert werden. Letztere Alternative wird in der Regel vorzuziehen sein, da in diesem Fall die Synthese der entspre­ chenden Proteine in etwa gleichem Maße inhibiert werden sollte.

Weiterhin ist die Konstruktion von DNA-Molekülen möglich, bei denen neben DNA-Sequenzen, die Stärkesynthasen codieren, wei­ tere DNA-Sequenzen, die andere Proteine, die an der Stärkesyn­ these oder -modifikation beteiligt sind, in antisense-Orien­ tierung an einen geeigneten Promotor gekoppelt sind. Die Se­ quenzen können hierbei wiederum hintereinandergeschaltet sein und von einem gemeinsamen Promotor transkribiert werden. Für die Länge der einzelnen codierenden Regionen, die in einem derartigen Konstrukt verwendet werden, gilt das, was oben be­ reits für die Herstellung von antisense-Konstrukten ausgeführt wurde. Eine obere Grenze für die Anzahl der in einem derarti­ gen DNA-Molekül von einem Promotor aus transkribierten anti­ sense-Fragmente gibt es nicht. Das entstehende Transkript sollte aber in der Regel eine Länge von 10 kb, vorzugsweise von 5 kb nicht überschreiten.

Codierende Regionen, die in derartigen DNA-Molekülen in Kombi­ nation mit anderen codierenden Regionen in antisense-Orientie­ rung hinter einem geeigneten Promotor lokalisiert sind, können aus DNA-Sequenzen stammen, die für folgende Proteine codieren: Stärkekorn-gebundene (GBSS I und II) und lösliche Stärke­ synthasen (SSS I und II), Verzweigungsenzyme, "Debranching"- Enzyme, Disproportionierungsenzyme und Stärkephosphorylasen. Dies ist nur eine beispielhafte Aufzählung. Auch die Verwen­ dung anderer DNA-Sequenzen im Rahmen einer derartigen Kombina­ tion ist denkbar.

Mit Hilfe derartiger Konstrukte ist es möglich, in Pflanzen­ zellen, die mit diesen transformiert wurden, die Synthese meh­ rerer Enzyme gleichzeitig zu inhibieren.

Weiterhin können die Konstrukte in klassische Mutanten einge­ bracht werden, die für ein oder mehrere Gene der Stärkebiosyn­ these defekt sind (Shannon und Garwood, 1984, in Whistler, BeMiller und Paschall, Starch:Chemistry and Technology, Aca­ demic Press, London, 2nd Edition: 25-86). Diese Defekte können sich auf folgende Proteine beziehen: Stärkekorn-gebundene (GBSS I und II) und lösliche Stärkesynthasen (SSS I und II), Verzweigungsenzyme (BE I und II), "Debranching"-Enzyme (R-En­ zyme), Disproportionierungsenzyme und Stärkephosphorylasen. Dies ist nur eine beispielhafte Aufzählung.

Mit Hilfe einer derartigen Vorgehensweise ist es weiterhin möglich, in Pflanzenzellen, die mit diesen transformiert wur­ den, die Synthese mehrerer Enzyme gleichzeitig zu inhibieren.

Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflan­ zen stehen eine große Anzahl von Clonierungsvektoren zur Ver­ fügung, die ein Replikationssignal für E.coli und ein Marker­ gen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor einge­ führt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transforma­ tion von E.coli-Zellen verwendet. Transformierte E.coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet, anschließend ge­ erntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Ana­ lysemethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden einge­ setzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen ver­ knüpft werden. Jede Plasmid-DNA-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden cloniert werden.

Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle ste­ hen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA un­ ter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacte­ rium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Pro­ toplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten.

Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzel­ len werden an sich keine speziellen Anforderungen an die ver­ wendeten Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z. B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig.

Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzen­ zelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri- Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der Ti- und Ri- Plasmid T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden.

Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Plasmide cloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen bi­ nären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobak­ terien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vekto­ ren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzre­ gion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al. Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.

Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzen­ zellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerÿ Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46 und An et al. EMBO J. 4 (1985), 277-287 beschrieben worden.

Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen- Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmen­ te, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kulti­ vierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert wer­ den. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden. Andere Möglichkeiten der Einführung fremder DNA unter Verwendung des biolistischen Verfahrens oder durch Protoplastentransformation sind bekannt (vgl. z. B. Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Bio­ technology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge).

Während die Transformation dikotyler Pflanzen über Ti-Plasmid- Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens wohl etabliert ist, weisen neuere Arbeiten darauf hin, daß auch monokotyle Pflanzen der Transformation mittels Agrobacterium basierender Vektoren sehr wohl zugänglich sind (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6 (1994), 271-282).

Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflan­ zen sind die Transformation mittels des biolistischen An­ satzes, die Protoplastentransformation, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen, die Einbringung von DNA mittels Glasfasern.

Spezifisch die Transformation von Mais wird in der Literatur verschiedentlich beschrieben (vgl. z. B. WO 95/06128, EP 0 513 849; EP 0 465 875) . In EP 292 435 wird ein Verfahren be­ schrieben, mit Hilfe dessen, ausgehend von einem schleimlosen, weichen (friable) granulösen Mais-Kallus, fertile Pflanzen er­ halten werden können. Shillito et al. (Bio/Technology 7 (1989), 581) haben in diesem Zusammenhang beobachtet, daß es ferner für die Regenerierbarkeit zu fertilen Pflanzen notwen­ dig ist, von Kallus-Suspensionskulturen auszugehen, aus denen eine sich teilende Protoplastenkultur, mit der Fähigkeit zu Pflanzen zu regenerieren, herstellbar ist. Nach einer in vitro Kultivierungszeit von 7 bis 8 Monaten erhalten Shillito et al. Pflanzen mit lebensfähigen Nachkommen, die jedoch Abnormalitä­ ten in der Morphologie und der Reproduktivität aufweisen.

Prioli und Söndahl (Bio/Technology 7 (1989), 589) beschreiben die Regeneration und die Gewinnung fertiler Pflanzen aus Mais- Protoplasten der Cateto Mais-Inzuchtlinie Cat 100-1. Die Auto­ ren vermuten, daß die Protoplasten-Regeneration zu fertilen Pflanzen abhängig ist von einer Anzahl verschiedener Faktoren, wie z. B. von Genotyp, vom physiologischen Zustand der Donor-Zellen und von den Kultivierungsbedingungen.

Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle in­ tegriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle er­ halten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomy­ cin, Hygromycin oder Phosphinotricin u. a. vermittelt. Der in­ dividuelle gewählte Marker sollte daher die Selektion trans­ formierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten.

Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, ge­ kreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen ha­ ben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften. Von den Pflanzenzellen können Samen gewonnen werden.

Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil beibe­ halten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

In den Beispielen verwendete Medien und Lösungen:

20 × SSC:
175,3 g NaCl
88,2 g Natrium-Citrat
ad 1000 ml mit ddH₂O
pH 7,0 mit 10 N NaOH

YT:
8 g Bacto-Yeast extract
5 g Bacto-Tryptone
5 g NaCl
ad 1000 ml mit ddH₂O

Protoplastenisolierungsmedium (100 ml):

Cellulase Onozuka R S (Meÿi Seika, Japan)|800 mg
Pectolyase Y 23	40 mg
KNO₃	200 mg
KH₂PO₄	136 mg
K₂HPO₄	47 mg
CaCl₂ 2H₂O	147 mg
MgSO₄ 7H₂O	250 mg
Rinderserumalbumin (BSA)	20 mg
Glucose	4000 mg
Fructose	4000 mg
Saccharose	1000 mg
pH	5,8
Osmolarität	660 mosm

Protoplastenwaschlösung 1: wie Protoplastenisolierlösung, aber ohne Cellulase, Pectolyase und BSA

Transformationspuffer:

a) Glucose|0,5 M
MES	0,1%
MgCl₂ 6 H₂O	25 mM
pH	5,8
auf 600 mosm. einstellen @	b) PEG 6000-Lösung: @	Glucose	0,5 M
MgCl₂ 6 H₂O	100 mM
Hepes	20 mM
pH	6,5

Dem obigen Puffer unter b) wird PEG 6000 kurz vor Gebrauch der Lösung zugesetzt (40 Gew.-% PEG). Die Lösung wird durch ein 0,45 µm Sterilfilter filtriert.

W5 Lösung:

CaCl₂|125 mM
NaCl	150 mM
KCl	5 mM
Glucose	50 mM

Protoplasten-Kulturmedium (Angaben in mg/l):

KNO₃
3000
(NH₄)₂SO₄	500
MgSO₄ 7 H₂O	350
KH₂PO₄	400
CaCl₂ 2 H₂O	300

Fe-EDTA und Spurenelemente wie im Murashige-Skoog-Medium (Physiol. Plant, 15 (1962), 473).

m-Inosit
100
Thiamin HCl	1,0
Nicotinsäureamid	0,5
Pyridoxin HCl	0,5
Glycin	2,0
Glucuronsäure	750
Galacturonsäure	750
Galactose	500
Maltose	500
Glucose	36 000
Fructose	36 000
Saccharose	30 000
Asparagin	500
Glutamin	100
Prolin	300
Caseinhydrolysat	500
2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D)	0,5
pH	5,8
Osmolarität	600 mosm

In den Beispielen werden die folgenden Methoden verwendet:

1. Clonierungsverfahren

Zur Clonierung in E.coli wurde der Vektor pBluescript II SK (Stratagene) verwendet.

2. Bakterienstämme

Für den Bluescript-Vektor und für die pUSP-Konstrukte wurde der E.coli-Stamm DH5α (Bethesda Research Laborato­ ries, Gaithersburgh, USA) verwendet. Für die in vivo excision wurde der E.coli-Stamm XL1-Blue verwendet.

3. Transformation von Mais (a) Herstellung von Protoplasten der Zellinie DSM 6009 Protoplastenisolierung

2-4 Tage, vorzugsweise 3 Tage nach dem letzten Me­ diumswechsel einer Protoplastensuspensionskultur wird das Flüssigmedium abgesaugt und die zurückbleibenden Zellen mit 50 ml Protoplastenwaschlösung 1 gespült und nochmals trockengesaugt. Zu jeweils 2 g der geernteten Zellmasse wird 10 ml Protoplastenisolierungsmedium ge­ geben. Die resuspendierten Zellen und Zellaggregate werden bei 27 ± 2°C unter leichtem Schütteln (30 bis 40 rpm) 4 bis 6 h im Dunkeln inkubiert.

Protoplastenreinigung

Sobald die Freisetzung von mindestens 1 Mio. Protopla­ sten/ml erfolgt ist (mikroskopische Beobachtung), wird die Suspension durch ein Edelstahl- und Nylonsieb von 200 bzw. 45 µm Maschenwerte gesiebt. Die Kombination eines 100 µm und eines 60 µm Siebs ermöglicht die Ab­ trennung der Zellaggregate genauso gut. Das protopla­ stenhaltige Filtrat wird mikroskopisch beurteilt. Üb­ licherweise enthält es 98-99% Protoplasten. Der Rest sind unverdaute Einzelzellen. Protoplastenpräpa­ rationen mit diesem Reinheitsgrad werden ohne zusätz­ liche Gradientenzentrifugation für Transformationsex­ perimente verwendet. Durch Zentrifugation (100 UpM im Aufschwingrotor (100 × g, 3 min) werden die Protopla­ sten sedimentiert. Der Überstand wird verworfen und die Protoplasten in Waschlösung 1 resuspendiert. Die Zentrifugation wird wiederholt und die Protoplasten danach im Transformationspuffer resuspendiert.

(b) Protoplastentransformation

Die in Transformationspuffer resuspendierten Protopla­ sten werden bei einem Titer von 0,5-1×10⁶ Proto­ plasten/ml in 10 ml Portionen in 50 ml Polyallomer-Röhrchen eingefüllt. Die zur Transformation verwendete DNA wird in Tris-EDTA (TE) Puffer gelöst. Pro ml Pro­ toplastensuspension werden 20 µg Plasmid-DNA zugege­ ben. Als Vektor wird dabei ein Phosphinotricinresi­ stenz vermittelndes Plasmid verwendet (vgl. z. B. EP 0 513 849). Nach der DNA-Zugabe wird die Protopla­ stensuspension vorsichtig geschüttelt, um die DNA ho­ mogen in der Lösung zu verteilen. Sofort danach wird tropfenweise 5 ml PEG-Lösung zugetropft.

Durch vorsichtiges Schwenken der Röhrchen wird die PEG-Lösung homogen verteilt. Danach werden nochmals 5 ml PEG-Lösung zugegeben und das homogene Durchmischen wiederholt. Die Protoplasten verbleiben 20 min der PEG-Lösung bei ± 2°C. Danach werden die Protoplasten durch 3-minütiges Zentrifugieren (100 g; 1000 Upm) se­ dimentiert. Der Überstand wird verworfen. Die Proto­ plasten werden durch vorsichtiges Schütteln in 20 ml W5-Lösung gewaschen und danach erneut zentrifugiert. Danach werden sie in 20 ml Protoplastenkulturmedium resuspendiert, nochmals zentrifugiert und erneut in Kulturmedium resuspendiert. Der Titer wird auf 6 - 8 × 10⁵ Protoplasten/ml eingestellt und die Protoplasten in 3 ml Portionen in Petrischalen (⌀ 60 mm, Höhe 15 mm) kultiviert. Die mit Parafilm versiegelten Petri­ schalen werden bei 25 ± 2°C im Dunkeln aufgestellt.

(c) Protoplastenkultur

Während der ersten 2-3 Wochen nach der Protopla­ stenisolierung und -transformation werden die Proto­ plasten ohne Zugabe von frischem Medium kultiviert. Sobald sich die aus den Protoplasten regenerierten Zellen zu Zellaggregaten mit mehr als 20-50 Zellen entwickelt haben, wird 1 ml frisches Protoplastenkul­ turmedium zugegeben, das als Osmoticum Saccharose (90 g/l) enthält.

(d) Selektion transformierter Maiszellen und Pflanzenrege­ neration

3-10 Tage nach der Zugabe von frischem Medium können die aus Protoplasten entstandenen Zellaggregate auf Agar-Medien mit 100 mg/1 L-Phosphinothricin plattiert werden. N6-Medium mit den Vitaminen des Protoplasten­ kulturmediums, 90 g/l Saccharose und 1,0 mg/l 2,4D ist ebenso geeignet wie ein analoges Medium beispielsweise mit den Makro- und Mikronährsalzen des MS-Mediums (Murashige und Skoog (1962), siehe oben).

Auf dem Selektivmedium können die aus stabil transfor­ mierten Protoplasten hervorgegangenen Kalli ungehin­ dert weiterwachsen. Nach 3-5 Wochen, vorzugsweise 4 Wochen können die transgenen Kalli auffrisches Selek­ tionsmedium transferiert werden, welches ebenfalls 100 mg/l L-Phosphinothricin enthält, das aber kein Auxin mehr enthält. Innerhalb von 3-5 Wochen differenzie­ ren ca. 50% der transgenen Maiskalli, die das L-Phos­ phinothricinacetyltransferase-Gen in ihr Genom inte­ griert haben, auf diesem Medium in Gegenwart von L-Phosphinothricin erste Pflanzen.

(e) Aufzucht transgener Regeneratpflanzen

Das embryogene transformierte Maisgewebe wird auf hor­ monfreiem N6-Medium (Chu C.C. et al., Sci. Sin. 16 (1975) , 659) in Gegenwart von 5×10^-4 M L-Phosphinothri­ cin kultiviert. Auf diesem Medium entwickeln sich Maisembryonen, die das Phsphinothricinacetyltransfe­ rase-Gen (PAT-Gen) hinreichend stark exprimieren, zu Pflanzen. Nicht transformierte Embryonen oder solche mit nur sehr schwacher PAT-Aktivität sterben ab. So­ bald die Blätter der in vitro-Pflanzen eine Länge von 4-6 mm erreicht haben, können diese in Erde transfe­ riert werden. Nach Abwaschen von Agarresten an den Wurzeln werden die Pflanzen in ein Gemisch von Lehm, Sand, Vermiculit und Einheitserde im Verhältnis 3 : 1:1 : 1 gepflanzt und während der ersten 3 Tage nach dem Verpflanzen bei 90-100% relativer Luft feuchte an die Erdkultur adaptiert. Die Anzucht erfolgt in einer Klimakammer mit 14 h Lichtperiode ca. 25000 Lux in Pflanzenhöhe bei einer Tag/Nachttemperatur von 23 ± 1/17 ± 1°C. Die adaptierten Pflanzen werden bei einer Luftfeuchte von 65 ± 5% kultiviert.

4. Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten

Die radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten wurde mit Hilfe eines DNA-Random Primer Labelling Kits der Firma Boehringer (Deutschland) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt.

Beispiel 1 Identifizierung, Isolierung und Charakterisierung einer cDNA, die eine neue Isoform einer Stärkesynthase aus Zea mays co­ diert

Um eine neue lösliche Stärkesynthase aus Mais zu isolieren, wurden polyclonale Antikörper gegen Peptid 1 hergestellt.

Peptid 1: NH₂-GTGGLRDTVENC-COOH (Seq. ID No. 3)

Dieses Peptid wurde an den KLH-Carrier ("keyhole limpet ho­ mocyanin") gekoppelt und anschließend zur Herstellung polyclo­ naler Antikörper in Kaninchen verwendet (Eurogentec, Seraing, Belgien).

Der resultierende Antikörper wurde als anti-SSI bezeichnet. Der Antikörper anti-SSI wurde anschließend verwendet, um eine cDNA-Bibliothek aus Mais nach Sequenzen durchzumustern, die lösliche Stärkesynthasen aus Mais codieren. Hierfür wurde eine cDNA-Bibliothek aus Endosperm-polyA⁺ RNA, angelegt im Vektor λ-ZAP, verwendet. Zur Analyse der Phagenplaques wurden diese auf Nitrozellulosefilter übertragen, die vorher für 30-60 min. in einer 10 mM IPTG-Lösung inkubiert und anschließend auf Filter­ papier getrocknet wurden. Der Transfer erfolgte für 3 h bei 37°C. Anschließend wurden die Filter für 30 min. bei Raumtem­ peratur in Blockreagenz inkubiert und zweimal für 5-10 min. in TBST-Puffer gewaschen. Die Filter wurden mit dem polyclonalen Antikörper anti-SS1 in geeigneter Verdünnung für 1 h bei Raum­ temperatur oder für 16 h bei 4°C geschüttelt. Die Identifizie­ rung von Plaques, die ein Protein exprimierten, das von dem Antikörper anti-SS1 erkannt wurde, erfolgte mit Hilfe des "Blotting detection kit for rabbit antibodies RPN 23" (Amersham UK) nach den Angaben des Herstellers. Phagenclone der cDNA-Bibliothek, die ein Protein exprimierten, das von dem Antikörper anti-SS1 erkannt wurde, wurden unter Anwendung von Standardverfahren weiter gereinigt. Mit Hilfe der in vivo excision-Methode (Stratagene) wurden von positiven Phagenclonen E.coli-Clone gewonnen, die ein doppelsträngiges pBlueskript II SK-Plasmid mit der jeweiligen cDNA-Insertion zwischen der EcoRI- und der Xho I-Schnittstelle des Polylinkers enthalten. Nach Überprüfung der Größe und des Restriktionsmu­ sters der Insertionen wurde ein geeigneter Clon einer Sequenz­ analyse unterzogen.

Beispiel 2 Sequenzanalyse der cDNA-Insertion des Plasmids pSSS1

Aus einem entsprechend Beispiel 1 erhaltenen E. coli-Clon wurde das Plasmid pSSS1 isoliert und seine cDNA-Insertion durch Standardverfahren mittels der Didesoxynucleotidmethode (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467) bestimmt. Die Insertion ist 2383 bp lang und stellt eine partielle cDNA dar. Die Nucleotidsequenz ist unter Seq ID No. 1 angegeben. Die korrespondierende Aminosäuresequenz ist unter Seq ID No. 2 dargestellt.

Eine Sequenzanalyse und ein Sequenzvergleich mit bekannten Se­ quenzen zeigte, daß die unter Seq ID No. 1 dargestellte Se­ quenz neu ist und eine neue lösliche Stärkesynthase des Typs I Aus Mais codiert. Die partielle codierende Region weist Homo­ logie zu Stärkesynthasen aus verschiedenen Organismen auf, insbesondere zu einer Stärksynthase aus Reis. Das durch diese cDNA-Insertion oder durch hybridisierende Sequenzen codierte Protein wird im Rahmen dieser Anmeldung als SSS1Zm bezeichnet. Mit Hilfe dieser partiellen cDNA-Sequenz ist es für eine in der Molekularbiologie erfahrene Person ohne weiteres möglich, die gesamte codierende Region enthaltende Vollängenclone zu isolieren und ihre Sequenzen zu bestimmen. Dazu wird z. B. eine blattspezifische cDNA-Expressionsbank aus Zea mays, Linie B73 (Stratagene GmbH, Heidelberg), nach Standardverfahren mittels Hybridisierung mit einem 5′-Fragment der cDNA-Insertion des Plasmids pSSS1 (200 bp) auf Vollängen-Clone hin durchgemustert. So erhaltene Clone werden sodann sequenziert. Eine andere Möglichkeit zum Erhalt der noch fehlenden 5′-ter­ minal gelegenen Sequenzen besteht in der Anwendung der 5′-Race Methode (Stratagene o. vgl. Hersteller).

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (22)

1. Nucleinsäuremolekül, codierend ein Protein aus Mais mit der biologischen Aktivität einer Stärkesynthase des Typs I, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

• (a) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die unter Seq ID No. 2 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt;
• (b) Nucleinsäuremolekülen, die die unter Seq ID No. 1 dar­ gestellte Nucleotidsequenz umfassen oder eine komple­ mentäre Sequenz oder eine korrespondierende Ribonucleo­ tidsequenz;
• (c) Nucleinsäuremolekülen, deren einer Strang mit den unter (a) oder (b) genannten Nucleinsäuremolekülen hybridi­ siert; und
• (d) Nucleinsäuremolekülen, deren Nucleotidsequenz aufgrund der Degeneration des genetisches Codes von der Sequenz der unter (a), (b) oder (c) genannten Nucleinsäuremole­ küle abweicht.

2. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das ein DNA-Molekül ist.

3. DNA-Molekül nach Anspruch 2, das ein cDNA-Molekül ist.

4. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das ein RNA-Molekül ist.

5. Oligonucleotid, das spezifisch mit einem Nucleinsäuremole­ kül nach einem der Ansprüche 1 bis 4 hybridisiert.

6. Vektor, enthaltend ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3.

7. Vektor nach Anspruch 6, wobei das DNA-Molekül in sense- Orientierung mit regulatorischen Elementen verknüpft ist, die die Transkription und Synthese einer translatierbaren RNA in pro- oder eukaryontischen Zellen gewährleisten.

8. Wirtszelle, die mit einem Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einem Vektor nach Anspruch 6 oder 7 transformiert ist oder von einer solchen Zelle ab­ stammt.

9. Protein oder biologisch aktives Fragment davon, codiert durch ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

10. Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 9 oder eines biologisch aktiven Fragmentes davon, bei dem eine Wirtszelle nach Anspruch 8 unter Bedingungen kulti­ viert wird, die die Synthese des Proteins erlauben, und das Protein aus den kultivierten Zellen und/oder dem Kul­ turmedium isoliert wird.

11. Transgene Pflanzenzelle, die mit einem Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einem Vektor nach Anspruch 6 oder 7 transformiert wurde oder die von einer solchen Zelle abstammt, wobei das Nucleinsäuremolekül, das das Protein mit der biologischen Aktivität einer Stärke­ synthase codiert, unter der Kontrolle regulatorischer Ele­ mente steht, die die Transkription einer translatierbaren mRNA in pflanzlichen Zellen erlauben.

12. Pflanze, enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 11.

13. Pflanze nach Anspruch 12, die eine Nutzpflanze ist.

14. Pflanze nach Anspruch 13, die eine stärkespeichernde Pflanze ist.

15. Pflanze nach Anspruch 14, die eine Maispflanze ist.

16. Vermehrungsmaterial einer Pflanze nach einem der Ansprüche 12 bis 15, enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 11.

17. Stärke, erhältlich aus einer Pflanze nach einem der Ansprüche 12 bis 15 oder aus Vermehrungsmaterial nach Anspruch 16.

18. Transgene Maispflanzenzelle, dadurch gekennzeichnet, daß in dieser Pflanzenzelle die Aktivität eines Proteins nach Anspruch 9 verringert ist.

19. Maispflanzenzelle nach Anspruch 18, wobei die Reduktion der Aktivität in dieser Zelle durch die Expression einer antisense-RNA zu Transkripten eines DNA-Moleküls nach An­ spruch 1 erreicht wird.

20. Maispflanze, enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 18 oder 19.

21. Vermehrungsmaterial einer Maispflanze nach Anspruch 20, enthaltend Zellen nach Anspruch 18 oder 19.

22. Stärke, erhältlich aus Maispflanzen nach Anspruch 20 oder aus Vermehrungsmaterial nach Anspruch 21.