ES2250969T3 - Amilasa alcalina de bacilo. - Google Patents

Abstract

UNA AL -AMILASA CARACTERIZADA POR TENER UNA ACTIVIDAD ESPECIFICA AL MENOS 25% SUPERIOR A LA ACTIVIDAD ESPECIFICA DE TERMAMYL (R) A UNA TEMPERATURA EN EL RANGO DE 25 C A 55 C Y A UN VALOR DE PH EN EL RANGO DE PH 8 A PH 10.

Description

Amilasa alcalina de bacilo.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a las amilasas que tienen una rendimiento mejorado para lavar vajillas y/o lavar.

Antecedentes de la invención

Durante varios años se han empleado las enzimas \alpha-amilasa para una variedad de objetivos diferentes, los más importantes de los cuales son la licuefacción de almidón, el desencolado textil, la modificación del almidón en la industria de la pasta y el papel, y en la fabricación de cerveza y la cocción. Otro uso de las \alpha-amilasas, que se hace cada vez mas importante, es la eliminación de manchas amiláceas durante el lavado y el lavado de vajillas.

El Termamyl®, BAN® y el Fungamyl® son ejemplos de productos de \alpha-amilasa, todos disponibles de Novo Nordisk NS, Dinamarca. Estos productos y otros similares de otras fuentes comerciales tienen un nivel óptimo de pH de neutro a ácido, normalmente dentro de la gama de pH 5 a pH 7.5, lo cual significa que no demuestran una actividad óptima en las soluciones detergentes debido al carácter alcalino de los detergentes.

La presente invención tiene como objetivo proporcionar nuevas \alpha-amilasas con un rendimiento mejorado en las soluciones alcalinas, en particular en las soluciones de detergente alcalinas.

Resumen de la invención

La presente invención provee \alpha-amilasas con una actividad específica muy elevada a pH 8-10 y a temperaturas de 30ºC a aproximadamente 60ºC, con condiciones normales en soluciones detergentes.

En consecuencia, la presente invención se refiere a una \alpha-amilasa que tiene una actividad específica que es al menos un 25% superior a la actividad específica de la Termamyl® a una temperatura dentro de la gama de 25ºC a 55ºC y a pH 10, determinada diluyendo dicha \alpha-amilasa en 50 mM de tampón Britton-Robinson, añadiendo 1 ml de esta solución de \alpha-amilasa a 5 ml 50 mM de tampón Britton-Robinson conteniendo un comprimido de Phadebas® suspendido en éste y midiendo la absorbencia a 620 nm, y la secuencia de aminoácidos mostrada en ID SEC NO. 2 o siendo al menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos 5 mostrada en ID SEC. NO.2.

Breve descripción de los dibujos

Se ilustra la presente invención con más detalle haciendo referencia a los dibujos anexos, en los que

La fig. 1 muestra la relación entre el pH y la actividad de una \alpha-amilasa de una nueva amilasa (obtenida de la cepa de Bacilo NCIB 12289), determinada de la misma forma que se describe en el ejemplo 2.

La fig. 2 muestra el perfil del pH de una \alpha-amilasa obtenida de la cepa de Bacilo NCIB 12512 (I), de una \alpha-amilasa obtenida de la cepa de bacilo 12513 (II) y del Termamyl® (III) determinado a 55ºC dentro del intervalo de pH de 4 a 10.5, la prueba siendo realizada de la misma manera descrita en el ejemplo 3.

La fig. 3 muestra el perfil de la temperatura de una \alpha-amilasa obtenida de la cepa de Bacilo NCIB 12512 (I), de una \alpha-amilasa obtenida de la cepa de Bacilo NCIB 12513 (II) y del Termamyl® (III) determinada a pH 10.0 dentro del intervalo de temperatura de 25ºC a 95ºC, la prueba siendo realizada de la misma forma descrita en el ejemplo 3.

La fig. 4 muestra la valoración EPA - eliminación de la película de almidón de la vajilla y la cristalería, en función de la dosificación de una nueva \alpha-amilasa (obtenida de la cepa Bacilo NCIB 12289) a 55ºC, la prueba siendo realizada de la misma forma descrita en el ejemplo 4.

La fig. 5 muestra la valoración EPA - eliminación de la película de almidón de la vajilla y la cristalería, en función de la dosificación de una nueva \alpha-amilasa (obtenida de la cepa de Bacilo NCIB 12512) a 45ºC (\bullet), a 55ºC (*) y a 65ºC (x), la prueba siendo realizada de la misma forma descrita en el ejemplo 4.

Descripción detallada de la invención Las \alpha-amilasas de la invención

Una forma de realización de la presente invención provee una \alpha-amilasa que tiene una actividad específica de al menos un 25% más alta o al menos un 35% más alta o al menos un 45% más alta o al menos un 55% más alta o al menos un 65% más alta o al menos un 75% o al menos un 25-75% superior a la actividad específica del Termamyl® a una temperatura dentro del intervalo de 25ºC a 55ºC o a una temperatura dentro del intervalo de 25ºC a 35ºC o a una temperatura dentro del intervalo de 35ºC a 45ºC o a una temperatura dentro del intervalo de 45ºC a 55ºC y con un valor de pH dentro del intervalo de pH 8 al pH 10 o a un valor de pH dentro del intervalo de pH 8 a 8.5 o a un valor de pH dentro del intervalo de pH 8.5 a 9.0 o a un valor de pH dentro del intervalo de pH 9.0 a 9.5 o a un valor de pH dentro del intervalo de pH 9.5 a 10.0, medido por la prueba de actividad de la \alpha-amilasa como se describe aquí.

Sorprendentemente, se ha descubierto que las nuevas \alpha-amilasas preferidas de la invención pueden estar caracterizadas por el hecho de que tienen una actividad específica de al menos un 25% superior a la actividad específica del Termamyl® a cualquier temperatura dentro del intervalo de 25ºC a 55ºC y a cualquier valor de pH dentro del intervalo de pH 8 a pH 10, medido por la prueba de actividad de la nuevas \alpha-amilasa como se describe aquí.

En comparación con las \alpha-amilasas conocidas, se destaca el rendimiento notable a pH 10 de las \alpha-amilasas de la invención; en consecuencia en una forma de realización preferida la \alpha-amilasa está caracterizada por el hecho de que tiene una actividad específica de al menos un 25% superior a la actividad específica del Termamyl® a cualquier temperatura dentro del intervalo de 25ºC a 55ºC y a pH 10, empleando la prueba de actividad de \alpha-amilasa como se describe aquí.

Se considera que un polipéptido es X% homólogo a la \alpha-amilasa madre si una comparación de las secuencias de aminoácidos respectivas, realizadas por medio de algoritmos conocidos, como aquel descrito por Lipman y Pearson en Science 227, 1985, p. 1435, revela una identidad de X%.

Otro aspecto de la invención se refiere a una \alpha-amilasa que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en ID SEC No. 2 o una \alpha-amilasa que es al menos un 90% homóloga a la ID SEC No.2.

Se pueden obtener las \alpha-amilasas preferidas de la invención de una especie de Bacilo alcalinófilo, en particular de una de las cepas de Bacilo NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 y DSM 9375. En el contexto de la presente invención, el término "obtenible de" no sólo indica una \alpha-amilasa producida por una cepa de Bacilo sino una \alpha-amilasa codificada por una secuencia de ADN aislada de este tipo de cepa de Bacilo y producida en un organismo huésped que ha sido transformado con dicha secuencia de ADN.

La cepa NCIB 12289 se describe en detalle en EP 0277 216. La cepa NCIB 12289 ha sido depositada según el tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional de depósito de microorganismos para el procedimiento de patentes, el 8 de julio de 1986 en la colección nacional de bacterias industriales (NCIB) bajo el número de acceso NCIB 12289.

La cepa NCIB 12512 se describe en detalle en EP 0277 216 La cepa NCIB 12512 ha sido depositada según el tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional de depósito de microorganismos para el procedimiento de patentes, el 5 de agosto de 1986 en la colección nacional de bacterias industriales (NCIB) bajo el número de acceso NCIB 12512.

La cepa NCIB 12513 se describe en detalle en EP 0 277 216. La cepa NCIB 12513 ha sido depositada según el tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional de depósito de microorganismos para el procedimiento de patentes, el 5 de agosto de 1987 en la colección nacional de bacterias industriales (NCIB) bajo el número de acceso NCIB 12513.

La cepa DSM 9375 ha sido depositada según el tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional de depósito de microorganismos para el procedimiento de patentes, el 16 de agosto de 1994 en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) bajo el número de acceso DSM.

Clonaje de una secuencia de ADN que codifica un \alpha-amilasa

La secuencia de ADN que codifica una \alpha-amilasa de la invención puede ser aislada de cualquier célula o microorganismo que produzca la \alpha-amilasa en cuestión, usando distintos métodos bien conocidos en la técnica. En primer lugar, se debería construir una biblioteca de ADN genómica y/o de ADNc por la cual se utilice el ADN cromosómico o el ARN mensajero del organismo que produce la \alpha-amilasa que debe ser estudiada. Luego, en el caso de que se conozca la secuencia de aminoácidos de la \alpha-amilasa, se pueden sintetizar sondas de oligonucleótidos homólogos marcados y utilizarlos para identificar los clones que codifican las \alpha-amilasas de una genoteca preparada a partir del organismo en cuestión. De forma alternativa, una sonda de oligonucleótidos marcados conteniendo las secuencias que son homólogas a un gen de \alpha-amilasa conocido podría ser empleada como sonda para identificar los clones que codifican la \alpha-amilasa, mediante el uso de la hibridación y las condiciones de lavado menos rigorosas. Según la presente invención, las sondas preferidas pueden ser construidas a base de la SEC ID Nº. 1 o a base de la SEC ID Nº. 2 o a base de la SEC ID Nº. 4 o a base de la SEC ID no. 5.

Otro método para identificar los clones que codifican una \alpha-amilasa consistiría en introducir fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, como un plásmido, para transformar la bacteria negativa de la \alpha-amilasa con la biblioteca de ADN genómico resultante, y entonces colocar en placas las bacterias transformadas sobre agar conteniendo un sustrato para la \alpha-amilasa, permitiendo de ese modo la identificación de los clones que expresan la \alpha-amilasa.

De forma alternativa, se puede preparar sintéticamente la secuencia de ADN que codifica la enzima mediante métodos estándares establecidos, p. ej. el método de fosfoamidita descrito por S.L. Beaucage y M.H. Caruters en Tetrahedron Letters 22, 1981, pgs. 1859-1869 o el método descrito por Mattes et al. en The EMBO J. 3, 1984, pgs. 801-805. En el método de fosfoamidita, se sintetizan los oligonucleótidos, p. ej. en un sintetizador de ADN automático, y luego son purificados, recocidos, ligados y clonados en los vectores apropiados.

Finalmente, la secuencia de ADN puede ser de origen genómico y sintético mixto, de origen sintético y ADNc mixto o de origen genómico y ADNc mixto, y es preparada ligando fragmentos de origen sintético, genómico o de ADNc (según sea apropiado, los fragmentos correspondiendo a varias partes de la secuencia entera de ADN), según las técnicas estándares. También, se puede emplear la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para preparar la secuencia de ADN utilizando cebadores específicos, por ejemplo como se describe en US 4,683,202 o R.K. Saiki et al. en Science 239, 1988, pgs. 487-491.

Expresión de \alpha-amilasa

Según la invención, una secuencia de ADN que codifica la \alpha-amilasa producida mediante los métodos descritos anteriormente, o mediante cualquier método alternativo conocido en la técnica, se puede expresar en forma de enzima, empleando un vector de expresión el cual normalmente incluye las secuencias de control que codifican un promotor, un operador, un lugar de enlace del ribosoma, una señal de iniciación de translación, y opcionalmente, un gen represor o varios genes activadores.

El vector de expresión recombinante que lleva la secuencia de ADN que codifica una \alpha-amilasa de la invención puede ser cualquier vector que se pueda someter convenientemente a los procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector a menudo depende de la célula huésped en la que se introducirá dicho vector. Por lo tanto, el vector puede ser un vector replicador autónomo, es decir un vector que existe en calidad de una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej., un plásmido, un bacteriófago o un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. De forma alternativa, el vector puede ser del tipo que, una vez introducido en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se replica junto con el/los cromosoma(s) en los cuales ha sido integrado.

En el vector, la secuencia de ADN debería ser conectada operativamente a una secuencia promotora adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre la actividad transcripcional en la célula huésped elegida y pueda ser derivada de los genes que codifican las proteínas que son u homólogas o heterólogas a la célula huésped. Unos ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia del ADN que codifica una \alpha-amilasa de la invención, en particular en un huésped bacteriano, comprenden el promotor del operón lac de E.coli, los promotores del gen agarasa dagA de Streptomyces coelicolor, los promotores del gen de \alpha-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), los promotores del gen de amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM), los promotores de la \alpha-amilasa de Bacillus Amiloliquefaciens (amyQ), los promotores de los genes de Bacillus subtilis xylA y xylB etc. Para la transcripción en un huésped fúngico, unos ejemplos de promotores útiles son los que se derivan del gen que codifica la amilasa de A.oryzae TAKA, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, \alpha-amilasa de A. Níger neutra, \alpha-amilasa estable al ácido de A. niger, glucoamilasa de A. niger, lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de A. oryzae, triosa fosfato isomerasa de A. oryzae o. acetamidasa de A. nidulans.

El vector de expresión de la invención también puede comprender un terminador de transcripción adecuado y, en las células eucariotas, puede comprender las secuencias de poliadenilación operativamente conectadas a la secuencia de ADN que codifica la \alpha-amilasa de la invención. Las secuencias de terminación y de poliadenilación idealmente se derivan de las mismas fuentes que el promotor.

Además, el vector puede comprender una secuencia de ADN que permita al vector replicarse en la célula huésped en cuestión. Unos ejemplos de tales secuencias son los orígenes de replicación de los plásmidos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 y pIJ702.

Además, el vector puede comprender un marcador genético, p. ej., un gen cuyo producto complemente un defecto en la célula huésped, como los genes dal de B. subtilis o B. licheniformis, o un gen que confiera la resistencia antibiótica como ampicilina, canamicina, cloranfenicol o la resistencia de tetraciclina. Además, el vector puede comprender marcadores genéticos de Aspergillus como amdS, argB, niaD y sC, un marcador que proporciona la resistencia a la higromicina, o se puede realizar la selección mediante la cotransformación, p. ej., como se describe en WO 91/17243.

Aunque la expresión intracelular puede resultar ventajosa en ciertos aspectos, p. ej., cuando se usan las bacterias determinadas como células huéspedes, en general se prefiere que la expresión sea extracelular.

Los procedimientos adecuados para construir los vectores de la invención que codifican una \alpha-amilasa y contienen el promotor, el terminador y otros elementos respectivamente, son muy conocidos para los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al. en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. Ed., Cold Spring Harbor, 1989).

La célula de la invención que comprende o bien un constructo de ADN o bien un vector de expresión de la invención tal como se ha definido anteriormente, se utiliza ventajosamente como una célula huésped en la producción recombinante de una \alpha-amilasa de la invención. Se puede transformar la célula con el constructo de ADN de la invención si se codifica la \alpha-amilasa de forma conveniente mediante la integración del constructo de ADN (en una o más copias) en el cromosoma de huésped. En general, se considera esta integración una ventaja dado que es más probable que la secuencia de ADN se mantenga estable en la célula. La integración de los constructos de ADN en el cromosoma huésped se puede realizar según los métodos convencionales, p. ej., mediante la recombinación homóloga o heteróloga. De forma alternativa, la célula puede ser transformada mediante un vector de expresión del mismo modo descrito anteriormente en relación con los diferentes tipos de células huéspedes.

La célula de la invención puede ser una célula proveniente de un organismo superior como un mamífero o un insecto, pero preferiblemente es una célula microbiana, p. ej., una célula bacteriana o fúngica (incluyendo la levadura).

Unos ejemplos de bacterias adecuadas incluyen las bacterias gram-positivas como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis,Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus,Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus meqaterium, Bacillus thuringiensis, o Streptomyces lividans o Streptomices murinus, o bacterias gram-negativas como E.coli.

Por ejemplo, la transformación de las bacterias puede ser realizada por la transformación del protoplasto o mediante el uso de células competentes de modo conocido per se.

Se puede seleccionar favorablemente el organismo de levadura de una especie de Saccharomvces o de Schizosaccharomyces, p.ej., Saccharomvces cerevisiae. Ventajosamente, el hongo filamentoso puede pertenecer a una especie de Aspergillus, p. ej., Aspergillus orvzae o Aspergillus niger. Se pueden transformar las células fúngicas mediante un proceso que implica la formación del protoplasto y la transformación de los protoplastos seguido por la regeneración de la membrana celular de modo conocido per se. Se describe un procedimiento adecuado para la transformación de células huéspedes de Aspergillus en EP 238 023.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir una \alpha-amilasa de la invención, este método consiste en cultivar una célula huésped del mismo modo descrito anteriormente bajo unas condiciones propicias a la producción de la \alpha-amilasa y en recuperar la \alpha-amilasa de las células y/o medio de cultivo.

El medio empleado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para cultivar la célula huésped en cuestión y para obtener la expresión de la \alpha-amilasa de la invención. Los medios adecuados están disponibles por los proveedores comerciales o pueden ser preparados según las recetas publicadas (p. ej., como se describe en los catálogos de la American Type Culture Collection).

Se puede recuperar la \alpha-amilasa secretada de las células huéspedes de forma conveniente del medio de cultivo mediante procedimientos bien conocidos, los cuales incluyen separar las células del medio por centrifugado o filtración y precipitar los componentes proteínicos del medio mediante una sal como sulfato amónico, seguido del uso de procedimientos cromatográficos como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o similares.

Ensayo sobre la actividad de la \alpha-amilasa

La actividad de \alpha-amilasa fue determinada por un método que utiliza comprimidos de Phadebas® como sustrato. Los comprimidos de Phadebas (prueba de amilasa de Phadebas®, suministrada por Pharmacia Diagnostic) contienen un polímero de almidón reticulado e insoluble de color azul el cual ha sido mezclado con sueroalbúmina bovino y una sustancia de tampón y que ha sido formado en comprimidos.

Para cada medición se suspende un comprimido en un tubo conteniendo 5 ml 50 mM de tampón de Britton-Robinson (50 mM de ácido acético, 50 mM de ácido fosfórico, 50 mM de ácido bórico, 0.1 mM de CaCl_{2}, pH ajustado al valor de interés con NaOH). Se realiza el ensayo en un baño de agua a la temperatura de interés. Se diluye la \alpha-amilasa que debe ser evaluada en x ml de 50 mM tampón de Britton-Robinson. Se añade 1 ml de esta solución de \alpha-amilasa a 5 ml 50 mM de tampón de Britton-Robinson. El almidón es hidrolizado por la \alpha-amilasa que produce fragmentos solubles de color azul. La absorbencia de la solución azul resultante, medida espectrofotométricamente a 620 nm, es una función de la actividad de la \alpha-amilasa.

Es importante que la absorbencia medida de 620 nm después de 10 o 15 minutos de incubación (tiempo de prueba) se encuentre dentro del intervalo de 0.2 a 2.0 unidades de absorbencia a 620 nm. Dentro de este intervalo de absorbencia existe una linealidad entre la actividad y la absorbencia (ley de Lambert-Beer). Por tanto, se debe ajustar la dilución con el fin de corresponder a este criterio.

Bajo una serie de condiciones especificas (temp., pH, tiempo de reacción, condiciones del tampón) 1 mg de una determinada \alpha-amilasa hidroliza una cantidad determinada de sustrato y se produce un color azul. La intensidad de color es medida a 620 nm. La absorbencia medida resulta directamente proporcional a la actividad específica (actividad/Mg de \alpha-amilasa proteínica pura) de la \alpha-amilasa en cuestión bajo la serie de condiciones determinada. Por tanto, si se realiza ensayos sobre \alpha-amilasas de interés diferentes (incluyendo Termamyl®, la \alpha-amilasa usada como referencia) bajo unas condiciones idénticas, se puede comparar directamente la actividad específica de cada una de las \alpha-amilasas a un temperatura determinada y a un pH determinado, y además se puede determinar la proporción de la actividad específica de cada una de las \alpha-amilasas de interés en relación a la actividad específica del Termamyl®.

Aplicaciones industriales

Debido a su actividad a valores de pH alcalino, las \alpha-amilasas de la invención se adaptan bien al uso en una variedad de procesos industriales, en particular la enzima tiene aplicaciones potenciales como componente en el lavado, el lavado de la vajilla y en las composiciones detergentes de limpieza de superficies duras, no obstante, también puede resultar útil en la fabricación de endulzadores y etanol de almidón. Se describen las condiciones para los procesos convencionales de transformación de almidón y los procesos de licuefacción y/o de sacarificación en, por ejemplo, la patente estadounidense no. 3,912,590 y en las publicaciones de patentes EP números. 252,730 y 63,909.

En vista de que las \alpha-amilasas de la invención son alcalinas, también poseen propiedades valiosas para la producción de materiales lignocelulósicos, como la pasta, el papel y el cartón, a partir de papel usado reforzado con almidón y cartón, especialmente en el caso de que la reproducción de la pasta papelera se realice a un pH superior a 7 y cuando las amilasas puedan facilitar la desintegración de los residuos mediante la degradación del almidón de refuerzo. Las \alpha-amilasas de la invención resultan especialmente útiles en los procesos de extracción de tinta/reciclaje en la fabricación de papel a partir del papel impreso usado con un revestimiento de almidón o conteniendo almidón. Normalmente, es deseable eliminar la tinta de impresión para producir papel nuevo de alta luminosidad; se describen unos ejemplos que explican cómo las \alpha-amilasas de la invención pueden ser empleadas de esta manera en PCT/DK 94/00437.

Las \alpha-amilasas de la invención también pueden resultar muy útiles en la modificación del almidón cuando se usa el almidón modificado enzimáticamente en la fabricación de papel junto con los rellenos alcalinos como el carbonato cálcico, caolín y arcillas. Las \alpha-amilasas alcalinas de la invención hacen posible modificar el almidón en presencia del relleno y de este modo permiten un proceso integrado más simple.

Las \alpha-amilasas de la invención también pueden resultar muy útiles en el desencolado textil. En la industria de acabado de textiles, tradicionalmente se emplean las \alpha-amilasas como auxiliares en el proceso de desencolado para facilitar la eliminación de la parte que contiene almidón la cual ha servido de revestimiento protector en los hilos de trama durante el tejido.

La eliminación completa del revestimiento de encolado después del tejido es importante para asegurar los resultados óptimos en los procesos posteriores, en los que el tejido es lavado a fondo, blanqueado y teñido. Se prefiere la disgregación enzimática del almidón ya que no implica ningún efecto nocivo en la fibra del material.

Con el objetivo de reducir los costes de los procesos de acabado y aumentar la producción de la fábrica, a veces se combinan el proceso de desencolado con los procesos de lavado a fondo y de blanqueamiento. En tales casos, los auxiliares no enzimáticos como el álcali o los agentes oxidantes normalmente se emplean para disgregar el almidón, dado que las \alpha-amilasas tradicionales no son muy compatibles con altos niveles de pH y los agentes blanqueadores. La descomposición no enzimática del desencolado de almidón produce algunos daños en la fibra debido a los productos químicos agresivos que se emplean en el proceso.

En consecuencia, sería deseable usar las \alpha-amilasas de la invención ya que tienen un rendimiento mejorado en las soluciones alcalinas. Se pueden utilizar las \alpha-amilasas solas o en combinación con una celulasa cuando se desencola la fibra o textil conteniendo celulosa.

Las \alpha-amilasas de la invención también pueden resultar muy útiles en el proceso de la fabricación de cerveza; normalmente se añaden las \alpha-amilasas durante el proceso de maceración.

Composiciones detergentes

Según la invención, normalmente las \alpha-amilasas pueden ser un componente de una composición de detergente, p. ej., una composición de detergente de lavado o una composición de detergente de lavavajillas. Por lo tanto, se puede incluir en la composición de detergente en forma de un granulado no pulverulentos, un líquido estabilizado, o una enzima protegida. Los granulados no espolvoreados pueden ser producidos, p. ej., como se describe en US 4,106,991 y 4,661,452 (ambos de Novo Industri A/S) y opcionalmente pueden ser revestidos mediante los métodos conocidos en la técnica. Unos ejemplos de materiales de revestimiento encerado son los productos de poli(óxido de etileno) (polietilenoglicol, PEG) con pesos moleculares medios de 1000 a 20000; nonilfenoles etoxilados que tienen de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados en los que el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en el cual se encuentran 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono- y di y triglicéridos de ácidos grasos. Se dan unos ejemplos de materiales de revestimiento que forman una película adecuada que pueden ser aplicados por técnicas de lecho fluidificado en la patente GB 1483591. Se pueden estabilizar las preparaciones enzimáticas líquidas, por ejemplo, añadiendo un poliol como propilenoglicol, un azúcar o un alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico según los métodos establecidos. Otros estabilizadores enzimáticos son bien conocidos en la técnica. Se pueden preparar las enzimas protegidas según el método descrito en EP 238,216.

La composición de detergente de la invención puede tener cualquier forma conveniente, p. ej. como polvo, gránulos, pasta o líquido.

La composición de detergente comprende uno o más agentes tensioactivos, cada uno de los cuales puede ser aniónico, no iónico, catiónico, o anfotérico (ion bipolar). Normalmente, el detergente contiene un 0-50% de agente tensioactivo aniónico como alquilobencenosulfonato lineal (LAS), alfa-olefinsulfonato (AOS), sulfato de alquilo (sulfato de alcohol graso) (AS), etoxisulfato de alcohol (AEOS o AES), alcanosulfonatos secundarios (SAS), alfa-sulfometilésteres de ácidos grasos, alquilo o ácido alquenilsuccínico, o jabón. También, puede contener un 0-40% de agente tensioactivo no iónico como etoxilato de alcohol (AEO o AE), alcohol propoxilato, etoxilatos de alcohol carboxilado, nonilfenol etoxilato, alquilpoliglicósido, óxido de aiquildimetilamino, monoetanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de ácido graso, o amida de ácido graso de alquilo de polihidroxi (p. ej. como se describe en WO 92/06154).

La composición de detergente además puede comprender una o más de otras enzimas, como pululanasa, esterasa, lipasa, cutinasa, proteasa, celulasa, peroxidasa, u oxidasa, p. ej., lacasa.

Normalmente el detergente contiene 1-65% de un constructor de detergente, pero ciertos detergentes de lavado de vajilla pueden contener hasta un 90% de un constructor de detergente, o agente de complejación como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, citrato, ácido nitrilotriacético (NTA), ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), ácido dietilenotriaminopentaacético (DTMPA), alquilo o ácido aiquenilsuccínico, silicatos solubles o silicatos estratificados (p. ej. SKS-6 de Hoechst).

Se pueden subdividir los adyuvantes de detergente en los tipos que contienen fósforo y los que no contienen fósforo. Unos ejemplos de adyuvantes de detergente alcalinos inorgánicos que contienen fósforo incluyen las sales hidrosolubles, especialmente los pirofosfatos de metal alcalino, ortofosfatos, polifosfatos y fosfonatos. Unos ejemplos de adyuvantes inorgánicos que no contienen fósforo incluyen los carbonatos de metal alcalino hidrosolubles, los boratos y silicatos así como los disilicatos estratificados y los distintos tipos de silicatos de aluminio amorfo cristalino insoluble en agua de los cuales la zeolita es la representante más conocida.

Unos ejemplos de adyuvantes orgánicos adecuados incluyen el metal alcalino, el amonio o las sales amónicas sustituidas de succinatos, malonatos, malonatos de ácido graso, sulfonatos de ácido graso, carboximetoxisuccinatos, poliacetatos, carboxilatos, policarboxilatos, aminopolicarboxilatos y poliacetilcarboxilatos.

El detergente también puede ser no adyuvado, es decir esencialmente sin adyuvante de detergente.

El detergente puede comprender uno o más polímeros. Unos ejemplos son carboximetilcelulosa (CMC), poli(vinilpirrolidona) (PVP), polietilenoglicol (PEG), alcohol polivinílico, policarboxilatos como poliacrilatos, polimaleatos, copolímeros de ácido maléico/acrílico y copolímeros de laurilmetacrilato/ácido acrílico.

La composición de detergente puede contener blanqueadores del tipo con cloro/bromo o del tipo con oxígeno. Los blanqueadores pueden ser revestidos o encapsulados. Unos ejemplos de blanqueadores inorgánicos del tipo cloro/bromo son litio, sodio o hipoclorito de calcio o hipobromo así como fosfato de trisodio clorurado. El sistema blanqueador también puede comprender una fuente de H_{2}O_{2} como perborato o percarbonato que se puede combinar con un activador de blanqueador formando perácido como tetraacetiletilenodiamina (TAED) o nonanoiloxibencenosulfonato (NOBS).

Unos ejemplos de blanqeadores orgánicos del tipo cloro/bromo son imidas de N-bromo y N-cloro heterocíclicas como ácidos tricloroisocianúricos, tribromoisocianúricos, dibromoisocianúricos y dicloroisocianúricos, y sales derivadas con cationes solubilizantes en agua como potasio y sodio. Los compuestos de hidantoina también resultan adecuados. El sistema blanqueador también puede comprender peroxiácidos del tipo, p. ej., amida, imida, o sulfona.

En los detergentes lavavajillas se prefieren los blanqueadores de oxígeno, por ejemplo en forma de un persal inorgánico, preferiblemente con un precursor blanqueador o como un compuesto de ácido peróxido. Unos ejemplos típicos de compuestos blanqueadores de peróxido adecuados son los perboratos de metal alcalino, tanto los tetrahidratos como los monohidratos, percarbonatos de metal alcalino, persilicatos y perfosfatos. El TAED o NOBS son los materiales activadores preferidos.

Se pueden estabilizar las enzimas de la composición de detergente de la invención mediante los agentes estabilizantes convencionales, p. ej. un poliol como propilenoglicol o glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico como, p. ej., un éster de borato aromático, y se puede formular la composición como se describe en, p. ej., WO 92/19709 y WO 92/19708. También, se pueden estabilizar las enzimas de la invención añadiendo inhibidores de enzima reversibles, p. ej., del tipo proteínico como se describe en EP 0 544 777 B1.

El detergente también puede contener otros ingredientes de detergente convencionales como, p. ej., suavizantes incluyendo la arcilla, material desfloculante, reforzantes de espuma/depresores de espuma (depresores de espuma en detergentes lavavajillas), supresores de agua jabonosa, agentes anticorrosivos, agentes de supensión de suciedad, agentes antisedimentos, colorantes, agentes deshidratantes, bactericidas, blanqueadores ópticos, o perfume.

El pH (medido en una solución acuosa en concentración de uso) normalmente es neutro o alcalino, p. ej. dentro del intervalo de 7-11.

Las formas particulares de las composiciones de detergente de lavado dentro del campo de la invención incluyen:

1) Una composición de detergente formulada como un granulado teniendo una densidad aparente de al menos 600 g/l comprendiendo

Alquilobencenosulfonato lineal (calculado como ácido)	7 - 12%
Etoxisulfato de alcohol (p. ej. alcohol C_{12-18}, 1-2 EO) o sulfato de alquilo (p. ej. C_{14-15})	1 - 4%
Etoxilato de alcohol (p. ej. alcohol C_{14-15}, 7 EO)	5 - 9%
Carbonato sódico (como Na_{2}CO_{3})	14 - 20%
Silicato soluble (como Na_{2}O, 2SiO_{2})	2 - 6%
Zeolita (como NaAlSiO_{4})	15 - 22%
Sulfato sódico (como Na_{2}SO_{4})	0 - 6%
Citrato sódico/ácido cítrico (como C_{6}H_{5}Na_{3}O_{7}/C_{6}H_{8}O_{7})	0 - 15%
Perborato sódico (como NaBO_{3} \cdot H_{2}O)	11 - 18%
TAED	2 - 6%
Carboximetilcelulosa	0 - 2%
Polímeros (p. ej. copolímero de ácido maléico/acrílico, PVP, PEG)	0 - 3%
Enzimas (calculadas como proteína enzímica pura)	0.0001 - 0.1%
\begin{minipage}[t]{128mm}Ingredientes menores (p. ej. supresores de espuma, perfume, blanqueador óptico, fotoblanqueador)\end{minipage}	0 - 5%

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2) Una composición de detergente formulada como un granulado teniendo una densidad aparente de al menos 600 g/l comprendiendo

Alquilobencenosulfonato lineal (calculado como ácido)	6 - 11%
Etoxisulfato de alcohol (p. ej. alcohol C_{12-15}, 1-2 EO o sulfato de alquilo (p. ej. C_{16-18})	1 - 3%
Etoxilato de alcohol (p. ej. alcohol C_{14-15}, 7 EO)	5 - 9%
Carbonato sódico (como Na_{2}CO_{3})	15 - 21%
Silicato soluble (como Na_{2}O, 2SiO_{2})	1 - 4%
Zeolita (como NaAlSiO_{4})	24 - 34%
Sulfato sódico (como Na_{2}SO_{4})	4 - 10%
Citrato sódico/ácido cítrico (como C_{6}H_{5}Na_{3}O_{7}/C_{6}H_{8}O_{7})	0 - 15%
Carboximetilcelulosa	0 - 2%
Polímeros (p. ej. copolímero de ácido maléico/acrílico, PVP, PEG)	1 - 6%
Enzimas (calculadas como proteína enzímica pura)	0.0001 - 0.1%
Ingredientes menores (p. ej. supresores de espuma, perfume)	0 - 5%

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3) Una composición de detergente formulada como un granulado teniendo una densidad aparente de al menos 600 g/l comprendiendo

Alquilobencenosulfonato lineal (calculado como ácido)	5 - 9%
Etoxilato de alcohol (p. ej alcohol C_{12-15}, 7 EO)	7 - 14%
Jabón como ácido graso (p.ej. ácido graso C_{16-22})	1 - 3%
Carbonato sódico (como Na_{2}CO_{3})	10 - 17%
Silicato soluble (como Na_{2}O, 2SiO_{2})	3 - 9%
Zeolita (como NaAlSiO_{4})	23 - 33%
Sulfato sódico (como Na_{2}SO_{4})	0 - 4%
Perborato sódico (como NaBO_{3} \cdot H_{2}O)	8 - 16%
TAED	2 - 8%
Fosfonato (p. ej. EDTMPA)	0 - 1%
Carboximetilcelulosa	0 - 2%
Polímeros (p. ej. copolímero de ácido maléico/acrílico, PVP, PEG)	0 - 3%
Enzimas (calculada como proteína enzímica pura)	0.0001 - 0.1%
Ingredientes menores p. ej. supresores de espuma, perfume, blanqueador óptico)	0 - 5%

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4) Una composición de detergente formulada como un granulado teniendo una densidad aparente de al menos 600 g/l comprendiendo

Alquilobencenosulfonato lineal (calculado como ácido)	8 - 12%
Etoxilato de alcohol (p. ej. alcohol C_{12-15}, 7 EO)	10 - 25%
Carbonato sódico (como Na_{2}CO_{3})	14 - 22%
Silicato soluble (como Na_{2}O, 2SiO_{2})	1 - 5%
Zeolita (como NaAlSiO_{4})	25 - 35%
Sulfato sódico (como Na_{2}SO_{4})	0 - 10%
Carboximetilcelulosa	0 - 2%
Polímeros (p. ej. copolímero de ácido maléico/acrílico, PVP, PEG)	1 - 3%
Enzimas (calculada como proteína enzímica pura)	0.0001 - 0.1%
Ingredientes menores (p. ej. supresores de espuma, perfume)	0 - 5%

5) Una composición de detergente líquido acuoso comprendiendo

Alquilobencenosulfonato lineal (calculado como ácido)	15 - 21%
Etoxilato de alcohol (p. ej. alcohol C_{12-15}, 7 EO o alcohol C_{12-15}, 5 EO)	12 - 18%
Jabón como ácido graso (p. ej. ácido oleico)	3 - 13%
Ácido alquenilsuccínico (C_{12-14})	0 - 13%
Aminoetanol	8 - 18%
Ácido cítrico	2 - 8%
Fosfonato	0 - 3%
Polímeros (p. ej. PVP, PEG)	0 - 3%
Borato (como B_{4}O_{7})	0 - 2%
Etanol	0 - 3%
Propilenoglicol	8 - 14%
Enzimas (calculada como proteína enzímica pura)	0.0001 - 0.1%
\begin{minipage}[t]{128mm}Ingredientes menores (p. ej. agentes de dispersión, supresores de espuma, perfume, blanqueador óptico)\end{minipage}	0 - 5%

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6) Una composición de detergente líquida estructurada acuosa comprendiendo

Alquilobencenosulfonato lineal (calculado como ácido)	15 - 21%
Etoxilato de alcohol (p. ej. alcohol C_{12-15}, 7 EO, o alcohol C_{12-15}, 5 EO)	3 - 9%
Jabón como ácido graso (p. ej. ácido oleico)	3 - 10%
Zeolita (como NaAlSiO_{4})	14 - 22%
Citrato potásico	9 - 18%
Borato (como B_{4}O_{7})	0 - 2%
Carboximetilcelulosa	0 - 2%
Polímeros (p. ej. PEG, PVP)	0 - 3%
\begin{minipage}[t]{128mm}Polímeros de fijación como, p. ej., laurilmetacrilato/copolímero de ácido acrílico; fracción molar 25:1; Peso Mol. 3800\end{minipage}	0 - 3%
Glicerol	0 - 5%
Enzimas (calculada como proteína enzímica pura)	0.0001 - 0.1%
\begin{minipage}[t]{128mm}Ingredientes menores (p. ej. agentes de dispersión, supresores de espuma, perfume, blanqueadores ópticos)\end{minipage}	0 - 5%

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7) Una composición de detergente formulada como un granulado teniendo densidad aparente de al menos 600 g/l comprendiendo

Sulfato de alcohol graso	5 - 10%
Ácido graso etoxilado de monoetanol-amida	3 - 9%
Jabón como ácido graso	0 - 3%
Carbonato sódico (como Na_{2}CO_{3})	5 - 10%
Silicato soluble (como Na_{2}O, 2SiO_{2})	1 - 4%
Zeolita (como NaAlSiO_{4})	20 - 40%
Sulfato sódico (como Na_{2}SO_{4})	2 - 8%
Perborato sódico (como NaBO_{3} \cdot H_{2}O)	12 - 18%
TAED	2 - 7%
Polímeros (p. ej. copolímero de ácido maléico/acrílico, PEG)	1 - 5%
Enzimas (calculada como proteína enzímica pura)	0.0001 - 0.1%
Ingredientes menores (p. ej. blanqueador óptico, supresores de espuma, perfume)	0 - 5%

8) Una composición de detergente formulada como un granulado comprendiendo

Alquilobencenosulfonato lineal (calculado como ácido)	8 - 14%
Ácido graso etoxilado monoetanol-amida	5 - 11%
Jabón como ácido graso	0 - 3%
Carbonato sódico (como Na_{2}CO_{3})	4 - 10%
Silicato soluble (como Na_{2}O, 2SiO_{2})	1 - 4%
Zeolita (como NaAlSiO_{4})	30 - 50%
Sulfato sódico (como Na_{2}SO_{4})	3 - 11%
Citrato sódico (como C_{6}H_{5}Na_{3}O_{7})	5 - 12%
Polímeros (p. ej. PVP, copolímero de ácido maléico/acrílico, PEG)	1 - 5%
Enzimas (calculada como proteína enzímica pura)	0.0001 - 0.1%
Ingredientes menores (p. ej. supresores de espuma, perfume)	0 - 5%

9) Una composición de detergente formulada como un granulado comprendiendo

Alquilobencenosulfonato lineal (calculado como ácido)	6 - 12%
Agente tensioactivo no iónico	1 - 4%
Jabón como ácido graso	2 - 6%
Carbonato sódico (como Na_{2}CO_{3})	14 - 22%
Zeolita (como NaAlSiO_{4})	18 - 32%

(Continuación)

Sulfato sódico (como Na_{2}SO_{4})	5 - 20%
Citrato sódico (como C_{6}H_{5}Na_{3}O_{7})	3 - 8%
Perborato sódico (como NaBO_{3} \cdot H_{2}O)	4 - 9%
Activador blaqueante (p. ej. NOBS o TAED)	1 - 5%
Carboximetilcelulosa	0 - 2%
Polímeros (p. ej. policarboxilato o PEG PEG)	1 - 5%
Enzimas (calculada como proteína enzímica pura)	0.0001 - 0.1%
Ingredientes menores (p. ej. blanqueador óptico, perfume)	0 - 5%

10) Una composición de detergente líquida acuosa comprendiendo

Alquilobencenosulfonato lineal (calculado como ácido)	15 - 23%
Etoxisulfato de alcohol (p. ej. alcohol C_{12-15}, 2-3 EO)	8 - 15%
Etoxilato de alcohol (p. ej. alcohol C_{12-15}, 7 EO, o alcohol C_{12-15}, 5 EO)	3 - 9%
Jabón como ácido graso (p. ej. ácido láurico)	0 - 3%
Aminoetanol	1 - 5%
Citrato sódico	5 - 10%
Hidrotropo (p. ej. toluenosulfonato sódico)	2 - 6%
Borato (como B_{4}O_{7})	0 - 2%
Carboximetilcelulosa	0 - 1%
Etanol	1 - 3%
Propilenoglicol	2 - 5%
Enzimas (calculada como proteína enzímica pura)	0.0001 - 0.1%
Ingredientes menores (p. ej. polímeros, dispersantes, perfume, blanqueadores ópticos)	0 - 5%

11) Una composición de detergente líquida acuosa comprendiendo

Alquilobencenosulfonato lineal (calculado como ácido)	20 - 32%
Etoxilato de alcohol (p. ej. alcohol C_{12-15}, 7 EO, o alcohol C_{12-15}, 5 EO)	6 - 12%
Aminoetanol	2 - 6%
Ácido cítrico	8 - 14%
Borato (como B_{4}O_{7})	1 - 3%
\begin{minipage}[t]{128mm}Polímero (p. ej. copolímero de ácido maléico/acrílico, polímero de fijación como, p. ej., laurilmetacrilato/copolímero de ácido acrílico)\end{minipage}	0 - 3%
Glicerol	3 - 8%

(Continuación)

Enzimas (calculada como proteína enzímica pura)	0.0001 - 0.1%
\begin{minipage}[t]{128mm}Ingredientes menores (p. ej. hidrotropos, agentes de dispersión, perfume, blanqueadores ópticos)\end{minipage}	0 - 5%

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12) Una composición de detergente formulada como un granulado teniendo una densidad aparente de al menos 600 g/l comprendiendo

\begin{minipage}[t]{128mm}Agente tensioactivo aniónico (alquilobencenosulfonato lineal, sulfato de alquilo, alfa-olefinsulfonato, alfa-sulfometilésteres de ácidos grasos, alcanosulfonatos, jabón)\end{minipage}	25 - 40%
Agente tensioactivo no iónico (p. ej. etoxilato de alcohol)	1 - 10%
Carbonato sódico (como Na_{2}CO_{3})	8 - 25%
Silicatos solubles (como Na_{2}O, 2SiO_{2})	5 - 15%
Sulfato sódico (como Na_{2}SO_{4})	0 - 5%
Zeolita (como NaAlSiO_{4})	15 - 28%
Perborato sódico (como NaBO_{3} \cdot 4H_{2}O)	0 - 20%
Activador blanqueante (TAED o NOBS)	0 - 5%
Enzimas (calculada como proteína enzímica pura)	0.0001 - 0.1%
Ingredientes menores (p. ej. perfume, blanqueadores ópticos)	0 - 3%

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13) Formulaciones de detergente como se describe en 1) - 12) donde todo o parte del alquilobencenosulfonato lineal es sustitudo por sulfato de alquilo (C_{12-18}).

14) Una composición de detergente formulada como un granulado teniendo una densidad aparente de al menos 600 g/l comprendiendo

\vskip1.000000\baselineskip

Sulfato de alquilo (C_{12} - C_{18})	9 - 15%
Etoxilato de alcohol	3 - 6%
Polihidroxialquilo-amida de ácido graso	1 - 5%
Zeolita (como NaAlSiO_{4})	10 - 20%
Disilicato estratificado (p. ej. SK56 de Hoechst)	10 - 20%
Carbonato sódico (como Na_{2}CO_{3})	3 - 12%
Silicato soluble (como Na_{2}O, 2SiO_{2})	0 - 6%
Citrato sódico	4 - 8%
Percarbonato sódico	13 - 22%
TAED	3 - 8%
Polímeros (p. ej. policarboxilatos y PVP)	0 - 5%

(Continuación)

Enzimas (calculada como proteína enzímica pura)	0.0001 - 0.1%
\begin{minipage}[t]{128mm}Ingredientes menores (p. ej. blanqueador óptico, fotoblanqueador, perfume, supresores de espuma)\end{minipage}	0 - 5%

15) Una composición de detergente formulada como un granulado teniendo una densidad aparente de al menos 600 g/l comprendiendo

Sulfato de alquilo (C_{12} - C_{18})	4 - 8%
Etoxilato de alcohol	11 - 15%
Jabón	1 - 4%
Zeolita MAP o zeolita A	35 - 45%
Carbonato sódico (como Na_{2}CO_{3})	2 - 8%
Silicato soluble (como Na_{2}O, 2SiO_{2})	0 - 4%
Percarbonato sódico	13 - 22%
TAED	1 - 8%
Carboximetilcelulosa	0 - 3%
Polímeros (p. ej. policarboxilatos y PVP)	0 - 3%
Enzimas (calculada como proteína enzímica pura)	0.0001 - 0.1%
Ingredientes menores (p. ej. blanqueador óptico, fosfonato, perfume)	0 - 3%

16) Formulaciones de detergente como se describe en 1) - 15) las cuales contienen un perácido estabilizado o encapsulado, o bien como un componente adicional o bien como un substituto para los sistemas blanqueantes ya especificados.

17) Composiciones de detergente como se describe en 1), 3), 7), 9) y 12) donde el perborato es sustituido por percarbonato.

18) Las composiciones de detergente como se describen en 1), 3), 7), 9), 12), 14) y 15) conteniendo también un catalizador de manganeso. El catalizador de manganeso puede ser, p. ej., uno de los compuestos descrito en "Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching", Nature 369, 1994, pp. 637-639.

19) Una composición de detergente formulada como un detergente líquido no acuoso comprendiendo un agente tensioactivo líquido no iónico como, p. ej., alcohol primario alcoxilado lineal, un sistema adyuvante (p. ej. fosfato), enzima y álcali. El detergente también puede comprender un agente tensioactivo aniónico y/o un sistema blanqueante.

Las formas particulares de composiciones de detergente de lavavajillas dentro del campo de la invención incluyen:

1) Composición de lavavajillas para lavado automático en polvo

Agente tensioactivo no iónico	0.4 - 2.5%
Metasilicato sódico	0 - 20%
Disilicato sódico	3 - 20%
Trifosfato sódico	20 - 40%
Carbonato sódico	0 - 20%

(Continuación)

Perborato sódico	2 - 9%
Tetraacetiletilenodiamina (TAED)	1 - 4%
Sulfato sódico	5 - 33%
Enzimas	0.0001 - 0.1%

2) Composición de lavavajillas para lavado automático en polvo

Agente tensioactivo no iónico (p. ej. etoxilato de alcohol)	1 - 2%
Disilicato sódico	2 - 30%
Carbonato sódico	10 - 50%
Fosfonato sódico	0 - 5%
Dihidrato de citrato trisódico	9 - 30%
Acetato nitrilotrisódico (NTA)	0 - 20%
Monohidrato de perborato sódico	5 - 10%
Tetraacetiletilenodiamina (TAED)	1 - 2%
Polímero de poliacrilato (p. ej. copolímero de ácido maléico/ácido acrílico)	6 - 25%
Enzimas	0.0001 - 0.1%
Perfume	0.1 - 0.5%
Agua	5 - 10

3) Composición de lavavajillas para lavado automático en polvo

Agente tensioactivo no iónico	0.5 - 2.0%
Disilicato sódico	25 - 40%
Citrato sódico	30 - 55%
Carbonato sódico	0 - 29%
Bicarbonato sódico	0 - 20%
Monohidrato de perborato sódico	0 - 15%
Tetraacetiletilenodiamina (TAED)	0 - 6%
Copolímero de ácido maléico/ácido acrílico	0 - 5%
Arcilla	1 - 3%
Poli(amino ácidos)	0 - 20%
Poliacrilato sódico	0 - 8%
Enzimas	0.0001 - 0.1%

4) Composición de lavavajillas para lavado automático en polvo

Agente tensioactivo no iónico	1 - 2%
Zeolita MAP	15 - 42%
Disilicato sódico	30 - 34%
Citrato sódico	0 - 12%
Carbonato sódico	0 - 20%
Monohidrato de perborato sódico	7 - 15%
Tetraacetiletilenodiamina (TAED)	0 - 3%
Polímero	0 - 4%
Copolímero de ácido maléico/ácido acrílico	0 - 5%
Fosfonato orgánico	0 - 4%
Arcilla	1 - 2%
Enzimas	0.0001 - 0.1%
Sulfato sódico	Compensación

5) Composición de lavavajillas para lavado automático en polvo

Agente tensioactivo no iónico	1 - 7%
Disilicato sódico	18 - 30%
Citrato Trisódico	10 - 24%
Carbonato sódico	12 - 20%
Monopersulfato (2KHSO_{5} \cdot KHSO_{4} \cdot K_{2}SO_{4})	15 - 21%
Estabilizador del blanqueador	0.1 - 2%
Copolímero de ácido maléico/ácido acrílico	0 - 6%
Dietilenotriaminopentaacetato, sal pentasódica	0 - 2.5%
Enzimas	0.0001 - 0.1%
Sulfato sódico, agua	Compensación

6) Composición de lavavajillas en polvo y líquida con sistema de limpieza por agente tensioactivo

Agente tensioactivo no iónico	0 - 1.5%
Dihidrato de N-oxido de dimetilamina de octadecilo	0 - 5%
\begin{minipage}[t]{128mm} Mezcla C18/C16 80:20 peso de dihidrato de N-óxido de dimetilamina de octadecilo y dihidrato de N-óxido de hexadecildimetilamina\end{minipage}	0 - 4%
\begin{minipage}[t]{128mm} Mezcla C18/C16 70:30 peso de anhídrido de N-óxido de bis(hidroxietil)amina de octadecilo y anhídrido de N-óxido de bis(hidroxietil)amina de hexadecilo\end{minipage}	0 - 5%
Etoxisulfato de alquilo C_{13} - C_{15} con un grado medio de etoxilación de 3	0 - 10%

(Continuación)

Etoxisulfato de alquilo C_{13} - C_{15} con un grado medio de etoxilación de 3	0 - 5%
Alcohol etoxilado C_{13} - C_{15} con un grado medio de etoxilación de 12	0 - 5%
Mezcla de alcoholes etoxilados C_{12} - C_{15} con un grado medio de etoxilación de 9	0 - 6.5%
Mezcla de alcoholes etoxilados C_{13} - C_{15} con un grado medio de etoxilación de 30	0 - 4%
Disilicato sódico	0 - 33%
Tripolifosfato sódico	0 - 46%
Citrato sódico	0 - 28%
Ácido cítrico	0 - 29%
Carbonato sódico	0 - 20%
Monohidrato de perborato sódico	0 - 11.5%
Tetraacetiletilenodiamina (TAED)	0 - 4%
Copolímero de ácido maléico/ácido acrílico	0 - 7.5%
Sulfato sódico	0 - 12.5%
Enzimas	0.0001 - 0.1%

7) Composición de lavavajillas para lavado automático líquida no acuosa

Agente tensioactivo no iónico líquido (p. ej. etoxilados de alcohol)	2.0 - 10.0%
Silicato de metal alcalino	3.0 - 15.0%
Fosfato de metal alcalino	20.0 - 40.0%
\begin{minipage}[t]{128mm}Soporte líquido seleccionado de glicoles superiores, poliglicoles, polióxidos, glicoléteres\end{minipage}	25.0 - 45.0%
Estabilizante (p. ej. un éster parcial de ácido fosfórico y un alcanol C_{16} - C_{18})	0.5 - 7.0%
Supresor de espuma (p. ej. silicona)	0 - 1.5%
Enzimas	0.0001 - 0.1%

8) Composición de lavavajillas líquida no acuosa

Agente tensioactivo no iónico líquido (p. ej. etoxilatos de alcohol)	2.0 - 10.0%
Silicato sódico	3.0 - 15.0%
Carbonato de metal alcalino	7.0 - 20.0%
Citrato sódico	0.0 - 1.5%
\begin{minipage}[t]{128mm}Sistema estabilizante (p. ej. mezclas de silicona finamente dividida y poliglicoléteres dialquílicos de bajo peso molecular)\end{minipage}	0.5 - 7.0%
Polímero de poliacrilato de bajo peso de molecular	5.0 - 15.0%
Gel de arcilla espesante (p. ej. bentonita)	0.0 - 10.0%

(Continuación)

Polímero de celulosa de hidroxipropilo	0.0 - 0.6%
Enzimas	0.0001 - 0.1%
\begin{minipage}[t]{128mm}Soporte líquido seleccionado de licoles superiores, poliglicoles, polióxidos y glicoléteres\end{minipage}	Compensación

9) Composición de lavavajillas líquida tixotropica

Ácido graso C_{12} - C_{14}	0 - 0.5%
Agente tensioactivo de copolímero bloque	1.5 - 15.0%
Citrato sódico	0 - 12%
Tripolifosfato sódico	0 - 15%
Carbonato sódico	0 - 8%
Tristearato alumínico	0 - 0.1%
Cumeno sulfonato sódico	0 - 1.7%
Espesante a base de poliacrilato	1.32 - 2.5%
Poliacrilato sódico	2.4 - 6.0%
Ácido bórico	0 - 4.0%
Formato sódico	0 - 0.45%
Formato cálcico	0 - 0.2%
Disulfonato de óxido de sodio de N-decidifenilo	0 - 4.0%
Monoetanol amina (MEA)	0 - 1.86%
Hidróxido de sodio (50%)	1.9 - 9.3%
1,2-Propandiol	0 - 9.4%
Enzimas	0.0001 - 0.1%
Supresor de espuma, colorante, perfumes, agua	Compensación

10) Composición de lavavajillas para lavado automático líquida

Etoxilato de alcohol	0 - 20%
Sulfonato de éster de ácido graso	0 - 30%
Sulfato sódico de dodecilo	0 - 20%
Alquil-poliglócosido	0 - 21%
Ácido oléico	0 - 10%
Monohidrato de disilicato sódico	18 - 33%
Dihidrato de citrato sódico	18 - 33%
Estearato sódico	0 - 2.5%

(Continuación)

Monohidrato de perborato sódico	0 - 13%
Tetraacetiletilenodiamina (TAED)	0 - 8%
Copolímero de ácido maléico/ácido acrílico	4 - 8%
Enzimas	0.0001 - 0.1%

\vskip1.000000\baselineskip

11) Composición de lavavajillas para lavado automático líquida conteniendo partículas blanqueantes protegidas

\vskip1.000000\baselineskip

Silicato sódico	5 - 10%
Pirofosfato tetrapotásico	15 - 25%
Trifosfato sódico	0 - 2%
Trifosfato sódico	4 - 8%
Partículas blanqueantes protegidas, p. ej. cloro	5 - 10%
Espesante polimérico	0.7 - 1.5%
Hidróxido de potasio	0 - 2%
Enzimas	0.0001 - 0.1%
Agua	Compensación

\vskip1.000000\baselineskip

11)

Composiciones de lavavajillas para lavado automático como se describen en 5 1), 2), 3), 4), 6) y 10), donde el perborato es sustituido por el percarbonato.

12)

Composiciones de lavavajillas para lavado automático como se describen en 1) - 6) las cuales también contienen un catalizador de manganeso. El catalizador de manganeso puede ser, p. ej., uno de los compuestos descritos en "Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching", Nature 369, 1994, pp. 637-639.

Se pueden incorporar las \alpha-amilasas de la invención en concentraciones empleadas de forma convencional en los detergentes. Actualmente, se considera que, en la composición de detergente de la invención, se puede añadir la \alpha-amilasa en una cantidad correspondiente a 0.00001-1 Mg (calculada como proteína enzímica pura) de \alpha-amilasa por litro de solución de lavado/lavavajillas.

La presente invención es ilustrada con más detalle en los siguientes ejemplos que se consideran ejemplos no limitativos del objeto de la invención como se reivindica.

Ejemplo 1 Preparaciones de \alpha-amilasa de cepas de Bacilo NCIB 12289, NCIB 12513, DSM 9375 y NCIB 12512. Fermentación

Se incubó cada una de las cepas de Bacilo mencionadas anteriormente a 26ºC en una mesa vibratoria rotatoria (300 r.p.m.) en un matraz Erlenmeyer de 500 ml con deflectores conteniendo 100 ml de BP-X medio + 0.1 M de tampón de carbonato con pH 9.0.

\newpage

Medio de BP-X:
Almidón de patata	100 g
Cebada molida	50 g
Harina de soja	20 g
Caseinato sódico	10 g
Na_{2}HPO_{4} X 12H_{2}O	9 g
Termamyl® 60L*	0.1 g
Pluronic®	0.1 g
*) disponible de Novo Nordisk A/S.

Se calentó lentamente el medio de 60ºC a 85ºC durante 30 minutos para licuar el almidón contenido en el medio. A continuación, se aumentó la temperatura del medio rápidamente a 95ºC durante 10 minutos y se enfrió. Finalmente, el medio fue esterilizado calentando a 121ºC durante 40 minutos.

Purificación de \alpha-amilasa de NCIB 12289, DSM 9375 y NCIB 12512

Después de 5 días de incubación el caldo de cultivo fue filtrado y concentrado mediante un módulo de ultrafiltración del tipo Filtron con membranas de 3KD y fue lavado con agua desionizada hasta llegar a una conductividad de 1 mS/cm. Se ajustó el pH a pH 5.9 con un 10% (v/v) de ácido acético. Una columna FF de S-sefarosa fue equilibrada en el tampón EKV, pH 5.9. A no ser que se indique lo contrario, el tampón de purificación consistió de 100 mM de ácido bórico, 10 mM de ácido succínico, 2 mM de CaCl_{2}, (tampón EKV) ajustado al pH indicado con NaOH.

Se aplicó la solución enzimática a la columna, se lavó la columna con el tampón EKV, pH 5.9, y se eluyó la amilasa con un gradiente de naCl lineal (0-> 500 mM NaCl). Las fracciones conteniendo amilasa fueron agrupadas y el pH fue ajustado a pH 7 con un 3% (p/v) de NaOH.

Una columna de agarosa y quelato fue cargada con Cu++ y equilibrada de la manera siguiente: se bombeó 50 mM de CuSO_{4}, pH 5 sobre la columna hasta que toda la columna cambió a azul, luego el exceso de iones Cu++ fue extraído lavando la columna con 500 mM de imidazol, pH 7, y finalmente la columna fue equilibrada con el tampón EKV, pH 7. Se aplicó la agrupación de amilasa de la columna S-sefarosa a la columna de agarosa y quelato cargada de Cu++, se lavó la columna con el tampón EKV, pH 7, y se eluyó la enzima con un gradiente lineal de imidazol (0-> 500 mM imidazol). Se agruparon las fracciones conteniendo la amilasa y se añadió una solución de sulfato amónico saturado para dar como resultado una concentración final de 1M (NH_{4})2SO_{4} en la agrupación.

Se equilibró una columna de fenil-sefarosa en un tampón EKV + 1M de (NH_{4})2 SO_{4}, pH 7. Se aplicó la agrupación de amilasa de la columna Cu++ a la columna de interacción hidrofóbica. Los experimentos de enlace demostraron que la amilasa es una enzima más bien hidrofóbica, y por lo tanto se enlaza estrechamente a la columna de fenilo. La proteína que no se enlazó tan estrechamente a la columna fue eliminada de la columna lavando con tampón EKV, pH 7. Se eluyó la amilasa de forma progresiva de la columna con el tampón EKV + un 25% (v/v) de isopropanol. Se ajustó la agrupación conteniendo amilasa a pH 9.5 con un 3% (p/v) de NaOH y se diluyó 5 veces con agua desionizada.

Una columna HP de Q-sefarosa fue equilibrada en 20 mM de Tris-HCl, pH 9.5. Se aplicó la agrupación de amilasa de la columna de fenil-sefarosa a la columna y se lavó la columna con 20 mM de Tris-HCl, pH 9.5. Se eluyó la amilasa con un gradiente lineal de NaCl (0 - > 250 mM de NaCl).

Se ajustó el valor máximo de la amilasa a pH 7 con un 10% (v/v) de ácido acético.

Se equilibró una columna FF quelante de sefarosa cargada con Cu++ (cargada con Cu++ como se describe para la columna de agarosa y quelato) con el tampón EKV, pH 7. Se aplicó el valor máximo de la amilasa de la columna de Q-sefarosa a la columna, y se lavó a fondo la columna con el tampón EKV, pH 7. Se eluyó la amilasa con un gradiente lineal de imidazol fuerte (0 - > 500 mM de imidazol).

Se controló la pureza de la amilasa purificada mediante electroforesis de SDS-PAGE (sistema de dilución simple en gel de poliacrimida) El gel coloreado de azul Coomassie sólo tenía una banda.

Purificación de \alpha-amilasa de NCIB 12513

Después de 5 días de incubación se filtró el caldo de cultivo y se concentró utilizando un módulo de ultrafiltración Filtron con membranas 3KD. Se filtró la solución concentrada y se saturó a un 20% p/p con sulfato de amonio. A continuación se absorbió por lotes la solución utilizando una matriz AFFI-T^{TM} de Kem-En-Tec A/S. La amilasa fue eluida con un 25% de isopropanol en 20 mM de Tris, pH 7.5 después de haber lavado la matriz con agua desionizada. Se sometió la enzima a diálisis (20 mM de Tris pH 8.5) y se realizó una absorción por lotes progresiva en FF Q-sefarosa para eliminar el color.

Una columna de agarosa y quelato fue cargada con Cu++ y equilibrada de la siguiente manera: se bombeó 50 mM de CuSO_{4}, pH 5 sobre la columna hasta que toda la columna cambió a azul, entonces se lavó la columna con 500 mM de imidazol, pH 7 para extraer el exceso de iones Cu++, y finalmente se equilibró la columna con 50 mM de tampón de borato, pH 7.

A pesar del bajo nivel de pl (5.8) la amilasa no se unió a la FF Q-sefarosa a pH 8.5.

Se aplicó el filtrado de la columna FF Q-sefarosa a la agarosa quelante de Cu y se eluyó con 250 mM de imidazol, 20 mM de Tris pH 7.0 y se dializó la columna contra 50 mM de tampón de borato pH 7.0. Se ajustó el pH a pH 9.5 y se unió la solución dializada sobre una columna HP de Q-sefarosa y se eluyó sobre 10 columnas usando un gradiente lineal de 0-250 mM de NaCl. Se agruparon las fracciones conteniendo amilasa y se añadió una solución de sulfato amónico saturado para dar como resultado una concentración final de un 20% p/p, y se aplicaron las fracciones sobre una columna de fenil-sefarosa. Se lavó la columna con agua desionizada y se eluyó con un 25% de isopropanol en 50 mM de tampón de borato pH 7.0.

Se controló la pureza de la amilasa purificada mediante electroforesis de SDS-PAGE (sistema de dilución simple en gel de poliacrimida). El gel coloreado de azul Coomassie sólo tiene una banda.

Ejemplo 2 Propiedades físico-químicas de las \alpha-amilasas

Se descubrió que la \alpha-amilasa obtenida de la cepa de Bacilo NCIB 12289, fermentada y purificada como se describe en el ejemplo 1, tiene las siguientes propiedades:

Un pl de aproximadamente 8.8-9.0 determinado por isoelectroenfoque en placas de gel de poliacrimida de LKB Ampholine® (3.5-9.5) - lo cual significa que dichas placas resultan útiles en el intervalo de pl de 3.5 a 9.5.

Un peso molecular de aproximadamente 55 kD determinado por SDS-PAGE (sistema de dilución simple sobre gel de poliacrimida).

Un perfil de pH como el ilustrado en la fig. 1, el cual se determinó a 37ºC en el intervalo de pH de 4 a 10.5. Se utilizó el ensayo de actividad de la \alpha-amilasa descrita anteriormente, empleando el tampón Britton-Robinson ajustado a valores de pH predeterminados. Se entiende de la fig. 1 que la enzima posee una actividad \alpha-amilasa en todos los valores de pH de 4 a 10.5, teniendo el óptimo a pH 7.5-8.5, y al menos un 60% de la actividad máxima a pH 9.5.

Se utilizaron los métodos estándares para obtener y realizar la secuenciación de los péptidos para determinar la secuencia de aminoácidos de la \alpha-amilasa, para referencia véase Findlay & Geisow (Eds.), Protein Sequencinq - a Practical Approach, 1989, IRL Press.

La secuencia de aminoácidos N-terminal resultó ser: His-His-Asn-Gly-Thr-Asn-Gly-Thr-Met-Met-Gln-Tyr-Phe-Glu-Trp-Tyr-Leu-Pro-Asn-Asp (ID SEC Nº. 3).

Se descubrió que las \alpha-amilasas obtenidas de las cepas de Bacilo NCIB 12512 y DSM 9375, fermentadas y purificadas como se describe en el ejemplo 1, poseen el mismo pl (8.8-9.0), el mismo peso molecular (55 kD), y la misma secuencia N-terminal (ID SEC No. 3) que la \alpha-amilasa obtenida de NCIB 12289; por lo tanto se puede concluir que las \alpha-amilasas obtenidas de NCIB 12289, NCIB 12512 y DSM 9375 tienen las siguientes características comunes:

(a)

un pl de aproximadamente 8.6-9.3 determinado por isoelectroenfoque sobre placas de gel de poliacrimida de Ampholine® LKB;

b)

un peso molecular de aproximadamente 55 kD determinado por SDS-PAGE (sistema de dilución simple sobre gel de poliacrimida);

c)

un aminoácido N-terminal con la secuencia de aminoácidos como se muestra en ID Nº. 3.

La secuencia completa de aminoácidos de la \alpha-amilasa de la cepa de Bacilo NCIB 12512 se describe en la ID SEC No.1 de la presente invención. La secuencia completa de ADN de la \alpha-amilasa de la cepa de Bacilo NCIB 12512 se describe en la ID SEC No. 4 de la presente invención.

Se descubrió que la \alpha-amilasa obtenida de la cepa de Bacilo NCIB 12513, fermentada y purificada como se describe en el ejemplo 1, posee un pl de aproximadamente 5.8 y un peso molecular de aproximadamente 55 kD.

La secuencia de aminoácidos completa de la \alpha-amilasa de la cepa de Bacilo NCIB 12513 está indicada en la ID SEC No. 2 de la presente invención. La secuencia de ADN completa de la \alpha-amilasa de la cepa de Bacilo NCIB 12513 está indicada en la ID SEC No. 5 de la presente invención.

Ejemplo 3 Perfiles de pH y de temperaturas de las \alpha-amilasas según la invención comparados con el Termamyl®

Se determinó el perfil de pH de una \alpha-amilasa obtenida de la cepa de Bacilo NCIB 12512 (I), de una \alpha-amilasa obtenida de la cepa de Bacilo NCIB 12513 (II) y del Termamyl® (iii) a 55ºC en el intervalo de pH de 4 a 10.5. Se fermentaron y se purificaron las \alpha-amilasas de la invención como se describe en el ejemplo 1 y se obtuvo el Termamyl® de Novo Nordisk A/S. Se utilizó el ensayo de actividad \alpha-amilasa descrita anteriormente utilizando 50 mM de tampón Britton-Robinson ajustado a valores de pH predeterminados y un tiempo de reacción de 15 minutos. Se presentan los resultados en la fig. 2. Se entiende de la fig. 2 que las \alpha-amilasas de la invención poseen una actividad \alpha-amilasa en todos los valores de pH dentro del intervalo de pH 4 a pH 10.5, y tiene un valor óptimo de pH 7.5-8.5.

Se determinó un perfil de temperatura de una \alpha-amilasa obtenida de la cepa de Bacilo NCIB 12512 (I), de una \alpha-amilasa obtenida de la cepa de Bacilo NCIB 12513 (II) y del Termamyl® (iii) a pH 10.0 en el intervalo de temperatura de 25ºC a 95ºC. Se fermentaron y se purificaron las \alpha-amilasas de la invención como se describe en el ejemplo 1 y se obtuvo el Termamyl® de Novo Nordisk A/S. Se utilizó el ensayo de actividad \alpha-amilasa descrito anteriormente, utilizando 50 mM de tampón Britton-Robinson ajustado a pH 10.0 y un tiempo de reacción de 10 minutos. Se presentan los resultados en la fig. 3. Se entiende de la fig. 3 que las \alpha-amilasas de la invención poseen una actividad \alpha-amilasa en todos los valores de temperatura de 25ºC a 85ºC, y que tienen un óptimo a 45ºC-55ºC, y que la actividad específica de la \alpha-amilasa de la invención es un 25% superior a la actividad específica del Termamyl® a cualquier temperatura dentro del intervalo de temperatura de 25ºC a 55ºC.

Ejemplo 4 Rendimiento del lavavajillas de \alpha-amilasas nuevas

Se probaron las \alpha-amilasas de la invención obtenidas de la cepa de Bacilo NCIB 12289 y de la cepa de Bacilo 12512 como se describe en el ejemplo 1, utilizando la siguiente prueba para las amilasas de detergentes para lavavajillas para lavado automático:

Se sumergieron los platos en almidón de maíz caliente y para manchar los vasos se vertió almidón de maíz de un vaso a otro. Se dejaron secar los platos y vasos durante toda la noche y entonces se lavaron en una lavavajillas bajo las siguientes condiciones:

Dosificación de amilasa	0-0.50 mg de proteína enzimática por litro de solución de lavado
Detergente	Commercial European
Dosificación de detergente	4.0 g por litro de solución de lavado
Lavavajillas	Programa de 45ºC, 55ºC o 65ºC, Cylinda
pH	10.1 durante el lavado de la vajilla.

Sistema de evaluación/valoración

Se evaluó la eliminación de la película de almidón (EPA) de los platos y vasos después de haber coloreado dichos platos y vasos con yodo (el yodo pone azul al almidón). Se utilizó la siguiente escala de valoración:

Valoración	Vajilla	Cristalería
6	limpio	limpio
5	manchas	fino
4	fino	moderado
3	moderado	espeso
2	espeso	muy espeso
1	muy espeso	extremadamente espeso
0	opaco*	opaco
*) sin lavar

Después de haber evaluado cada artículo según el sistema de valoración mencionado anteriormente, el valor total de las valoraciones obtenidas fue dividido por el número total de artículos. A continuación, se trazó el valor resultante de EPA con respecto mg de \alpha-amilasa proteínica empleada por litro de solución de lavado.

Resultados

\alpha-amilasa de la cepa de Bacillus NCIB 12289: Se evaluó esta \alpha-amilasa a 55ºC y se indican los resultados en la fig. 4. Se observa de la fig. 4 que se obtiene un valor de EPA de entre 3 y 4 con una dosificación de enzima de 0.1 mg de \alpha-amilasa proteínica por litro de solución de lavado.

\alpha-amilasa de la cepa de Bacillus NCIB 12512: Se evaluó esta \alpha-amilasa a 45ºC (\bullet), a 55ºC (*) y a 65ºC (X), y se indican los resultados en la fig. 5. Se observa de la fig. 5 que se obtiene un valor de EPA de entre 3 y 4.5 con una dosificación de enzima de 0.1 mg de \alpha-amilasa proteínica por litro de solución de lavado (el valor EPA aumenta cuando se aumenta la temperatura).

Ejemplo 5 Rendimiento del lavavajillas de nuevas \alpha-amilasas a pequeña escala

Se utilizó la siguiente prueba a pequeña escala del lavavajillas: Se hirvió y se enfrió a 20ºC una suspensión de material amidáceo. La suspensión enfriada de almidón fue aplicada a platos de cristal pequeños, identificados individualmente (de aprox. 2 x 2 cm) y fue secada a una temperatura dentro del intervalo de 60-140ºC en una secadora. A continuación, se pesaron los platos individuales. A los efectos de la prueba, se preparó una solución de detergente de lavavajillas para lavado automático (5 g/l) del tipo europeo estándar con una temperatura de 55ºC. Se dejó el detergente durante un periodo de disolución de 1 minuto, después del cual se añadió la amilasa en cuestión a la solución de detergente (contenida en un vaso de precipitados dotado de agitación magnética) para dar como resultado una concentración de enzima de 0.5 mg/l. Al mismo tiempo, los platos de cristal que habían sido pesados, sujetados por pequeñas pinzas de compresión, se sumergieron en una posición sustancialmente vertical en la solución de amilasa/detergente, entonces se agitó durante 15 minutos a 55ºC. Luego, se extrajeron los platos de cristal de la solución de amilasa/detergente, se aclararon con agua destilada, se secaron a 60ºC en una secadora y se volvieron a pesar. A continuación, se determinó el rendimiento de la amilasa en cuestión [expresado como un índice con respecto al Termamyl® (índice 100)] a partir de la diferencia del peso de los platos de cristal antes y después del tratamiento, como sigue:

Indice = \frac{pérdida \ de \ peso \ para \ un \ plato \ tratado \ con \ \alpha -amilasa}{\text{pérdida de peso para un plato tratado con Termamyl}} \cdot 100

Resultados

Se realizó la prueba a pequeña escala del lavavajillas descrita anteriormente a pH 10.0 con Termamyl®, la nueva \alpha-amilasa de NCIB 12513 y la nueva \alpha-amilasa de NCIB 12512 (las nuevas \alpha-amilasas obtenidas del mismo modo descrito en el ejemplo 1). Las pruebas dieron los siguientes resultados:

Termamyl®	Indice: 100
\alpha-amilasa (NCIB 12512)	Indice: 163
\alpha-amilasa (NCIB 12513)	Indice: 175

Sorprendentemente, el rendimiento en la prueba a pequeña escala del lavavajillas es proporcional a la actividad específica a pH 10.0, 55ºC como se puede observar de la fig. 3:

Termamyl®	Actividad especifica: 2200 U/mg
\alpha-amilasa (NCIB 12512)	Actividad específica: 4400 U/mg
\alpha-amilasa (NCIB 12513)	Actividad específica: 5200 U/mg.

Ejemplo 6 Lavado de ropa

Detergente	Detergente comercial estadounidense en granulado de alta exigencia (HDG)
Dosificación de detergente	2 g/l
Dosificación de \alpha-amilasa	0.2 mg enzima proteínica/l
Suciedad	Almidón de patata coloreado con azul de Cibacron 3GA en algodón
Dureza del agua	9ºdH
Tiempo	15 minutos
Temperatura	40ºC

Evaluación

Reflectancia a 660 nm. Se calculó la reflectancia delta a partir de la reflectancia obtenida de una muestra que se había lavado con la enzima relevante y la reflectancia obtenida para una muestra lavada sin enzima. Más específicamente, la reflectancia delta es la reflectancia obtenida con la enzima menos la reflectancia obtenida sin la enzima.

Resultados

Se realizó la prueba de lavado de ropa descrita anteriormente con Termamyl®, la nueva \alpha-amilasa de NCIB 12513 y la nueva \alpha-amilasa de NCIB 12512 (las nuevas \alpha-amilasas obtenidas del mismo modo descrito en el ejemplo 1).

Las pruebas dieron los siguientes resultados:

Termamyl®	Indice: 100
\alpha-amilasa (NCIB 12512)	Indice: 145
\alpha-amilasa (NCIB 12513)	Indice: 133

De los resultados presentados anteriormente, es evidente que las \alpha-amilasas de la invención tienen una capacidad considerablemente mejorada de eliminar almidón con respecto al Termamyl, es decir que las \alpha-amilasas de la invención tienen un rendimiento de lavado de ropa mejorada en comparación con el del Termamyl.

Ejemplo 7 Eficiencia catalítica de la \alpha-amilasa de la cepa de Bacillus NCIB 12512 y la \alpha-amilasa de la cepa de Bacillus NCIB 12513 en comparación con Termamvl®

Se determinó la cinética de la hidrólisis catalizada por las \alpha-amilasas de la invención y por el Termamyl® a varias concentraciones de sustrato empleando el método Somogyi-Nelson (descrito abajo) con amilosa (Merck 4561) y amilopectina (Sigma A7780) como sustratos.

Se midieron las velocidades de hidrólisis bajo concentraciones de sustrato diferentes (1%, 0.5%, 0.3%, 0.25% y 0.2%).

Se midieron el número de azúcares reductores usando el método Somogyi-Nelson, y se determinó el equivalente de glucosa obtenido/mg de amilasa x h que da la velocidad de hidrólisis. Se trazaron los datos según las ecuaciones de Michaelis-Menten y Lineweaver Burk. A partir de estas ecuaciones se puede calcular fácilmente V_{max}/K_{m} usando la siguiente aproximación:

*V = V_{max} \ x \frac{[S]}{[S] + K_{m}}

Cuando [S] < < K_{m}:

V = V_{max} \ x \frac{[S]}{K_{m}} = \frac{V_{max}}{K_{m}} \ x \ [S]

* A una concentración dada de sustrato, dicha concentración de sustrato siendo inferior a K_{m}, la expresión V_{max}/K_{m} es equivalente a la eficiencia catalítica de una determinada \alpha-amilasa. En la tabla 1 abajo, se calcula V_{max}/K_{m} para tres \alpha-amilasas diferentes.

TABLA 1

Eficiencia catalítica [V_{max}/K_{m}] determinada a 55ºC, pH 7.3 en 50 mM de tampón Britton-Robinson
	\alpha-amilasa (NCIB 12513)	\alpha-amilasa (NCIB 12512)	Termamyl®
Amilopectina	11.9 seg^{-1} x [g/l]^{-1}	11.2 seg^{-1} x [g/l]^{-1}	3.2 seg^{-1} x [g/l]^{-1}
Amilosa	31.3 seg^{-1} x [g/l]^{-1}	30.2 seg^{-1} x [g/l]^{-1}	5.4 seg^{-1} x [g/l]^{-1}

La eficiencia catalítica de \alpha-amilasa (NCIB 12513) y \alpha-amilasa (NCIB 12512) se ha demostrado sorprendentemente alta con respecto tanto a la Amilopectina como al Amilosal, en comparación con Termamyl. Se considera que la eficiencia catalítica particularmente alta de la amilosa tiene una importancia significante para las actividades específicas mejoradas y para el rendimiento del lavado de vajillas/lavado de ropa en comparación con Termamyl.

Las moléculas de amilosa lineales pueden alinearse una al lado de otra y formar uniones intercadena de hidrógeno por medio de los grupos hidróxilo. Esta red de moléculas de amilosa tiene características cristalinas y resulta difícil de solubilizarlas e hidrolizarlas mediante cualquier amilasa conocida.

Método Somogyi para la determinación de azúcares reductores

El método se basa en el principio de que el azúcar reduce los iones cúpricos al cobre óxido el cual reacciona con el reactivo de molibdato de arseniato para producir un color azul que se mide espectrofotométricamente. La solución, que se ha de examinar, debe contener entre 50 y 600 mg de glucosa por litro.

Se mezcla 1 ml de solución de azúcar con 1 ml de reactivo de cobre y se coloca en un baño de agua durante 20 minutos. La mezcla resultante se enfría y se mezcla con 1 ml de reactivo de color Nelson y 10 ml de agua desionizada. Se mide la absorbancia a 520 nm.

En la región de 0-2 la absorbencia es proporcional a la cantidad de azúcar, que por tanto se puede calcular de la siguiente manera:

mg glucosa/l = \frac{100 \ (muestra - en \ blanco)}{(estándar - en \ blanco)}

% glucosa = \frac{100 \ (estándar - en \ blanco)}{(muestra - en \ blanco)}

Reactivos

1. Reactivo de cobre de Somogyi

35.1 g de Na_{2}HPO_{4} \cdot 2H_{2}O, y

40.0 g de tartrato de sodio de potasio (KNaC_{4}H_{4}O_{2} \cdot 4H_{2}O) disuelto en 700 ml de agua desionizada.

Se añade 100 ml de 1 N hidróxido de sodio y

80 ml de un 10% de sulfato cúprico (CuSO_{4} \cdot 5H_{2}O),

Se disuelve 180 g de sulfato de sodio anhídrico en la mezcla, y se añade agua desionizada hasta que el volumen llegue a 1 litro.

2. Reactivo de color Nelson

Se disuelve 50 g de molibdato de amonio en

900 ml de agua desionizada. Luego

se añade 42 ml de ácido sulfúrico concentrado (Merck), seguido

de 6 g de heptahidrato de arseniato de hidrógeno disódico disuelto en 50 ml de agua desionizada, y se añade agua desionizada hasta que el volumen llegue a 1 litro.

La solución debe reposar durante 24-48 horas a 37ºC antes de uso. Se debe almacenar en un sitio oscuro en una botella de vidrio marrón con un tapón de vidrio.

3. Estándar

Se disuelve 100 mg de glucosa (May & Baker, anhídrica) en 1 litro de agua desionizada.

Referencia: J. Biol. Chem. 153, 375 (1944)

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Novo Nordisk A/S

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Novo Alle

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Bagsvaerd

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Dinamarca

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): DK-2880

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELÉFONO: +45 44 44 88 88

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

TELEFAX: +45 44 49 05 55

\vskip0.500000\baselineskip

(I)

TÉLEX: 37173

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE INVENCIÓN: AMILASA ALCALINA DE BACILO

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 5

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMATO PARA ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: DISQUETE

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC COMPATIBLE CON IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS-/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, versión #1.25 (EPO)

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 485 AMINOÁCIDOS

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

DIPSOSICION DE HEBRAS: única

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC No: 1

1

2

3

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 20 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

DISPOSICION DE HEBRAS: simple

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC No: 2

4

5

6

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº:: 3:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 20 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

DISPOSICION DE HEBRAS: simple

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC No: 3

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\sa{His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr}

\sac{Leu Pro Asn Asp}

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 4:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 1455 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucléico

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(C)

DISPOSICION DE HEBRAS: simple

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC No: 4

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATCATAATG GAACAAATCG TACTATGATG CAATATTTGG AATGGTATTT GCCAAATGAC

\hfill

60

7

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 5:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 1455 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucléico

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(C)

DISPOSICION DE HEBRAS: simple

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC No: 5:

8

Claims (23)

1. \alpha-amilasa caracterizada por el hecho de que tiene una actividad específica de al menos un 25% superior a la actividad específica de Termamyl® a cualquier temperatura dentro del intervalo de 25ºC a 55ºC y a pH 10, determinada diluendo dicha \alpha-amilasa en 50 mM de tampón Britton-Robinson, añadiendo 1 ml de esta solución de \alpha-amilasa a 5 ml 50 mM de tampón Britton-Robinson conteniendo un comprimido de Phadebas® suspendido en él y midiendo la absorbencia a 620 nm, y la secuencia de aminoácidos indicada en la ID SEC No. 2 o siendo al menos un 90% idéntico a la secuencia de aminoácidos indicada en la ID SEC Nº. 2.

2. \alpha-amilasa según la reivindicación 1, donde se puede obtener la \alpha-amilasa de una especie de Bacilo alcalinófilo.

3. \alpha-amilasa según la reivindicación 2, que se puede obtener de cualquiera de las cepas NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 y DSM 9375.

4. Composición de detergente que comprende una \alpha-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un agente tensioactivo.

5. Composición de detergente para el lavado de ropa que comprende una \alpha-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un agente tensioactivo.

6. Composición de detergente para lavavajillas que comprende un \alpha-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un agente tensioactivo.

7. Composición de detergente según cualquiera de las reivindicaciones 4-6, que también comprende una o más de otras enzimas, en particular una proteasa, una lipasa, una celulasa, una peroxidasa y/o una oxidasa.

8. Aditivo detergente que comprende una \alpha-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, proporcionado en forma de un granulado no pulverulento, un líquido estabilizado, una pasta, o una enzima protegida.

9. Uso de un detergente según cualquiera de las reivindicaciones 4-7 o un detergente que comprende un aditivo según la reivindicación 8 para el lavado de ropa, lavado de vajilla o limpieza de una superficie dura.

10. Uso de una \alpha-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en un proceso de licuefacción de almidón.

11. Uso de una \alpha-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en la producción de materiales lignocelulósicos, como pasta, papel y cartón, de residuos de papel conteniendo almidón y/o residuos de cartón conteniendo almidón.

12. Uso según la reivindicación 11 para la extracción de tinta de papel reciclado teniendo un revestimiento de almidón o conteniendo almidón.

13. Uso de una \alpha-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para modificar el almidón para la fabricación de papel en una suspensión de relleno de mineral acalino como carbonato cálcico.

14. Uso de una \alpha-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para el desencolado textil.

15. Uso según la reivindicación 14, donde dicha \alpha-amilasa se usa en combinación con una celulasa.

16. Uso de una \alpha-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para un proceso de fabricación de cerveza.

17. Constructo del ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una \alpha-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

18. Vector de expresión recombinante que lleva un constructo del ADN según la reivindicación 17.

19. Célula que es transformada con un constructo del ADN según la reivindicación 17 o un vector según la reivindicación 18.

20. Célula según la reivindicación 19, que es un microorganismo.

21. Célula según la reivindicación 20, que es una bacteria o un hongo.

22. Célula célula según la reivindicación 21, que es una bacteria gram-positiva como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillusalkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus thuringiensis o Streptomyces lividans o Streptomyces murinus, o una bacteria gram-negativa como E. coli.

23. Método para producir una \alpha-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde una célula según cualquiera de las reivindicaciones 19-22 se cultiva bajo condiciones propicias a la producción de la \alpha-amilasa y posteriormente se recupera la \alpha-amilasa del cultivo.