CN101024826B

CN101024826B - 新的甘露聚糖酶

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Publication number: CN101024826B
Application number: CN200610106884.4A
Authority: CN
Inventors: M·S·考皮南; M·斯楚雷恩; K·斯啻诺; L·N·安德尔森; M·E·比卓恩威德
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1998-06-10
Filing date: 1999-06-10
Publication date: 2014-09-03
Anticipated expiration: 2019-06-10
Also published as: JP2005160476A; EP2287318B1; EP2287318A1; WO1999064619A2; US7183093B2; JP4047545B2; US6566114B1; EP2284272A1; JP2004500004A; CN100497614C; JP4047853B2; MXPA00012241A; WO1999064619A3; CN101024826A; ATE528394T1; EP1086211B1; AU4257399A; AU755850B2; BR9911086A; BRPI9911086B1

Abstract

包含例如SEQ ID NO：2的第31-330位所示氨基酸序列的新的甘露聚糖酶或它们的同源物，可以由例如芽孢杆菌I633得到，或者可以由下列多核苷酸分子编码：包含SEQ ID NO：1的第91-990位所示核苷酸序列的多核苷酸分子、编码与SEQ ID NO：2的第31-330位所示氨基酸序列至少65％相同的多肽的多核苷酸分子、或它们的简并核苷酸序列。该甘露聚糖酶是碱性的，而且非常有用，如，在清洁组合物中使用，在压裂液中用来裂解地下结构，用于修饰植物材料，和用于处理纤维素质纤维。

Description

新的甘露聚糖酶

本发明涉及微生物甘露聚糖酶，尤其是在中性和碱性pH范围内具有甘露聚糖酶活性作为其主要酶活性的微生物酶；生产这些酶的方法；和在纸张和纸浆、纺织品、石油钻探、清洁、洗涤衣物、洗涤剂和纤维素纤维加工业中，使用这些酶的方法。

发明背景

含有甘露聚糖的多糖是木材、许多豆科种子胚乳、和一些非豆科植物成熟种子中，半纤维素部分的主要成分。基本上未取代的线性β-1，4-甘露聚糖在一些非豆科植物中发现存在。例如，象牙棕榈果实中存在的未取代β-1，4-甘露聚糖在单个多糖链的构象方面与纤维素相似，而且不溶于水。在豆科种子中，水溶性半乳甘露聚糖是主要贮藏糖类，占总干重的多至20％。半乳甘露聚糖的线性β-1，4-甘露聚糖主链有单个α-1，6-半乳糖取代，任选有乙酰基取代。甘露聚糖还在多种单子叶植物中发现，而且是棕榈仁粉细胞壁物质中含量最丰富的多糖。葡甘露聚糖是具有β-1，4连接(以或多或少的规则方式交替出现)的甘露糖和葡萄糖主链的线性多糖，主链任选有半乳糖和/或乙酰基取代。甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖(即具有分支半乳糖的葡甘露聚糖主链)占软木半纤维素的50％以上。此外，许多红藻的纤维素中含有大量的甘露糖。

已经在多种芽孢杆菌生物体中鉴定了甘露聚糖酶。例如，Talbot等人(应用环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)，56(11)：3505-3510(1990))描述了由嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)得到的β-甘露聚糖酶，其二聚体形式具有分子量162kDa，最适pH 5.5-7.5。Mendoza等人(世界微生物学和生物技术杂志(World J.Microbiol.Biotech.)，10(5)：551-555(1994))描述了由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)得到的β-甘露聚糖酶，具有分子量38kDa，在pH5.0和55℃具有最大活性，pI4.8。JP-A-03047076公开了由一种芽孢杆菌得到的β-甘露聚糖酶，具有分子量37±3kDa(通过凝胶过滤测量)，最适pH 8-10，pI5.3-5.4。JP-A-63056289描述了碱性、热稳定的β-甘露聚糖酶的生产，该酶水解例如甘露聚糖的β-1，4-D-吡喃甘露糖苷键，并产生甘露寡糖。JP-A-63036775涉及在碱性pH产生β-甘露聚糖酶和β-甘露糖苷酶的芽孢杆菌微生物FERM P-8856.JP-A-08051975公开了来自嗜碱性芽孢杆菌AM-001的几种碱性β-甘露聚糖酶，其具有分子量43±3kDa和57±3kDa，最适pH 8-10。WO97/11164中公开了一种可用于漂白纸浆和纸张，来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的纯化甘露聚糖酶及其制备方法.WO91/18974描述了在极端pH和温度下有活性的半纤维素酶，诸如葡聚糖酶、木聚糖酶或甘露聚糖酶.WO94/25576公开了来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)CBS101.43的酶，其具有甘露聚糖酶活性，可用于降解或修饰植物或藻类细胞壁物质。WO93/24622公开了由Trichoderma reseei分离得到的甘露聚糖酶，其可用于漂白木质纤维素(Lignocellulosic)纸浆.

WO95/35362公开了含有植物细胞壁降解酶(具有果胶酶和/或半纤维素酶以及任选有纤维素酶活性)、用于除去植物来源的污渍的清洁组合物，还公开了来自菌株C11SB.G17的碱性甘露聚糖酶。

本发明的一个目的是提供新的和有效的、在碱性pH范围内(例如应用于清洁组合物或不同的工业加工中)仍具有甘露聚糖酶活性的酶。

发明概述

发明人现在已经发现了具有实质性甘露聚糖酶活性的新酶，即可以由芽孢杆菌属的细菌菌株得到、具有甘露聚糖酶活性的酶，而且已经成功的鉴定了编码这些酶的DNA序列。DNA序列在序列表中列出，分别为SEQ ID NO：1，5，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29和31；而且推导的氨基酸序列也在序列表中列出，分别为SEQ ID NO：2，6，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30和32。相信新酶根据酶命名法将归类为酶类EC 3.2.1.78。

在第一个方面，本发明涉及甘露聚糖酶，它是i)由芽孢杆菌I633产生的多肽，ii)包含SEQID NO：2的第31-330位所示氨基酸序列的多肽，或iii)与i)或ii)定义的多肽至少65％同源，由该多肤通过取代、删除或加入一个或几个氨基酸衍生得到，或与针对该多肽(经纯化的形式)制备的多克隆抗体可发生免疫学反应的所述多肽类似物。

在一个方面中，本发明提供了选自下组的分离多核苷酸分子：(a)编码具有甘露聚糖酶活性的多肽、并包含SEQ ID NO：1的第91-990位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的物种同源物；(c)编码具有甘露聚糖酶活性、与SEQ ID NO：2的第31-330位氨基酸残基所示氨基酸序列至少65％相同的多肽的多核苷酸分子；(d)与(a)、(b)或(c)互补的分子；和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的简并核苷酸序列。

已经将质粒pBXM3转化到大肠杆菌菌株中(质粒pBXM3包含编码本发明甘露聚糖酶的多核苷酸分子(DNA序列))，依照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，发明人于1998年5月29日将此菌株保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德国，保藏号DSM 12197。

在本发明的另一个方面中，提供了包含下列可操作连接在一起的元件的表达载体：转录启动子；选自下组的DNA片段：(a)编码具有甘露聚糖酶活性的多肽、并包含SEQ ID NO：1的第91-990位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的物种同源物；(c)编码具有甘露聚糖酶活性、与SEQ ID NO：2的第31-330位氨基酸残基所示氨基酸序列至少65％相同的多肽的多核苷酸分子；和(d)(a)、(b)或(c)的简并核苷酸序列；和转录终止子。

在本发明的还有一个方面中，提供了已经导入了上述表达载体的培养细胞，其中该细胞表达该DNA片段编码的多肽。

本发明的其它方面提供了具有甘露聚糖酶活性的分离多肽，其选自：(a)包含SEQ ID NO：2的第31-330位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽分子；(b)(a)的物种同源物；和具有甘露聚糖酶活性的融合蛋白，其包含的第一多肽部分具有甘露聚糖酶活性，而第二多肽部分具有纤维素结合功能，第二多肽优选是纤维素结合结构域(cellulose binding domain，CBD)，诸如SEQ ID NO：4描绘的融合蛋白。

在本发明的另一个方面中，提供了包含本发明的纯化多肽与其它多肽的组合物。

在本发明的另一个方面中，提供了生产本发明多肽的方法，包括培养已经导入了上述表达载体的细胞(从而该细胞表达该DNA片段编码的多肽)和回收多肽。

本发明的新酶可以用于处理纤维素物质，尤其是含纤维素的纤维、纱线、机织或非机织织物，处理机械造纸纸浆、牛皮纸纸浆或再生废纸，和浸解纤维。可以在从纤维素材料加工成可用于制造纸张、衣物或织物的材料的过程中进行该处理，后者例如退浆或精炼步骤；或者在工业或家庭清洗这类织物或衣物过程中进行。

相应的，在另一个方面中，本发明涉及包含本发明酶的清洁或洗涤剂组合物；和将本发明的酶用于处理(如清洗)含纤维素的纤维、纱线、机织或非机织织物，以及合成或部分合成织物的用途。

预计本发明的酶可用于纤维素材料制备过程中的酶精炼处理和/或退浆(除去甘露聚糖浆)步骤，以便例如在随后的染色操作中有正确反应。该酶还可用于除去含甘露聚糖的印花浆。此外，包含新酶的洗涤剂组合物能够除去或漂白某些衣物上的污渍，尤其是含甘露聚糖的食物、植物、等等产生的污渍。此外，用包含新酶的清洁或洗涤剂组合物进行处理，可以提高洁白程度，以及防止某些污物结合到纤维素材料上。

相应的，本发明还涉及包含本发明甘露聚糖酶的清洁组合物，包括清洗衣物、洗碗盘、硬表面清洁剂、个人清洁和口腔/牙齿清洁组合物。此外，本发明涉及包含甘露聚糖酶和选自下组的酶的清洁组合物：纤维素酶、蛋白酶、脂酶、淀粉酶、果胶降解酶和木葡聚糖酶(xyloglucanase)，这些组合物可提供上佳的清洁性能，即有效消除污渍、清洁黑斑或维持洁白。

定义

在进一步详细讨论本发明之前，首先定义下列术语。

术语“直向同源物(ortholog)(或“物种同源物(specieshomolog”)指由一个物种得到的、与来自不同物种的类似多肽或蛋白质具有同源性的多肽或蛋白质。

术语“共生同源物(paralog)指由给定的物种得到的、与来自相同物种的不同多肽或蛋白质具有同源性的多肽或蛋白质。

术语“表达载体”指线性或环状DNA分子，其包含编码感兴趣的多肽、并与可提供其转录的附加片段可操纵连接的片段。这些附加片段可以包括启动子和终止子序列，而且任选可以包括一个或几个复制起点、一种或几种选择标记、增强子、多腺苷酸化信号、等等。表达载体通常是由质粒或病毒DNA衍生得到的DNA，或可以同时含有二者的元件。本发明的表达载体可以是任何方便进行重组DNA操作的表达载体，而且载体的选择通常取决于载体将要导入的宿主细胞。由此，载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在，其复制独立于染色体复制的载体，例如质粒。或者，载体可以是在导入宿主细胞后整合到宿主细胞基因组中，并随其整合的染色体一起复制的载体。

此处与多肽或蛋白质的表达一起使用的术语“重组表达的”是根据本领域的常规定义定义的。蛋白质的重组表达通常通过利用上述的表达载体进行。

术语“分离的”，当用于多核苷酸分子时，指已经与其天然遗传环境分开，并因此不含其它外来或不需要的编码序列，以适用于基因工程蛋白质生产系统的形式存在的多核苷酸。这些分离分子与它们的天然环境是分开的，包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离DNA分子不含通常与它们有关的其它基因，但可以包括天然的5’和3’非翻译区，诸如启动子和终止子。相关区域的鉴定对本领域的普通技术人员将是明显的(见，例如，Dynan和Tijan，自然316：774-778，1985)。术语“分离的多核苷酸”或者可以称作“克隆的多核苷酸”。

当用于蛋白质/多肽时，术语“分离的”指蛋白质存在的状况与它的天然环境不同。作为优选的形式，分离的蛋白质基本上不含其它蛋白质，特别是其它同源蛋白质(即“同源杂质”(见下文))。优选以超过40％纯度形式提供蛋白质，更优选超过60％纯度形式。甚至更优选的，优选以更高纯度形式提供蛋白质，即超过80％纯度，更优选超过95％纯度甚至更优选超过99％纯度(纯度通过SDS-PAGE测定)。术语“分离的蛋白质/多肽”或者可以称作“纯化的蛋白质/多肽”。

术语“同源杂质”指来源于最初得到本发明多肽的同源细胞的任何杂质，例如除了本发明多肽外的其它多肽。

此处与特异微生物来源一起使用的术语“由...得到”，指多核苷酸和/或多肽是由该特异来源(同源表达)或插入了来自该来源的基因的细胞(异源表达)产生的。

术语“可操作连接”，当提及DNA片段时，指各片段的排列方式，使之以预期目的协同行使功能，例如，转录在启动子起始，并进而通过编码区，直到终止子。

术语“多核苷酸”指单链或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基聚合体，从5’端读向3’端。多核苷酸包括RNA和DNA，而且可以由天然来源分离，体外合成，或由天然和合成分子的组合制备。

术语“多核苷酸分子的互补物”指具有互补碱基序列、且与参考序列相比方向相反的多核苷酸分子。例如，序列5’ATGCACGGG 3’与5’CCCGTGCAT 3’互补。

术语“简并核苷酸序列”指包括一个或几个简并密码子(与编码多肽的参考多核苷酸分子相比)的核苷酸序列。简并密码子包含不同的三联体核苷酸，但是编码相同的氨基酸残基，如GAU和GAC三联体都编码Asp。

术语“启动子”指含有可提供RNA聚合酶结合和转录起始的DNA序列的基因部分。启动子序列通常是，但不总是存在于基因的5’非编码区。

术语“分泌信号序列”指编码作为较大多肽的成分、指导较大多肽通过合成该多肽之细胞的分泌途径的多肽的DNA序列。在较大多肽通过分泌途径的过程中通常被切割除去分泌肽。

术语“酶核心”指已经或未被修饰或改变，但保留了其最初活性的单结构域酶；催化结构域，如本领域所知，保持完整和有功能。

术语“接头”或“间隔物”指包含至少两个氨基酸的多肽，其可以存在于多结构域蛋白质，例如包含酶核心和结合结构域(诸如纤维素结合结构域(CBD))的酶或任何其它酶杂合体的各结构域之间，或者可以存在于以融合多肽形式表达的两种蛋白质或多肽之间，例如包含两种核心酶的融合蛋白。例如，向一个开放阅读框架中，依次融合编码酶核心的DNA序列、编码接头的DNA序列和编码CBD的DNA序列，并表达此构建物，可提供具有CBD和酶核心的融合蛋白。

术语“甘露聚糖酶”(mannanase)或“半乳甘露聚糖酶”(galactomannanase)指根据本领域定义、正式命名为甘露聚糖内切-1，4-β-甘露糖苷酶，或者叫做β-甘露聚糖酶和内切-1，4-甘露聚糖酶的甘露聚糖酶，其催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、和半乳葡甘露聚糖中1，4-β-D-甘露糖苷键的水解，此酶根据酶命名法归类为EC 3.2.1.78(http://www.expasy.ch/enzyme)。

发明的详细描述

如何使用本发明的序列以得到其它相关序列：可以使用此处公开的、涉及编码本发明甘露聚糖酶的多核苷酸序列的序列信息作为工具，来鉴定其它同源甘露聚糖酶。例如，可以使用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)由多种微生物来源，特别是不同的芽孢杆菌物种，扩增编码其它同源甘露聚糖酶的序列。

活性测试实验

可以根据本领域已知的常规测试步骤，测试具有甘露聚糖酶活性的本发明多肽，诸如在含0.2％AZCL-半乳甘露聚糖(豆角)(即内切-1，4-β-D-甘露聚糖酶的检验底物，可以由Megazyme公司购买，目录号I-AZGMA，Megazyme的因特网地址：http://www.megazyme.com/Purchase/index.html)的琼脂平板上打4mm直径孔，然后加入要测试的溶液进行测试。

多核苷酸

在本发明优选的实施方案中，本发明的多核苷酸与SEQ ID NO：1的相似大小区域，或它们的互补序列在至少中等严谨条件下可杂交。

特别的，本发明的多核苷酸与包含SEQ ID NO：1所示全序列或包含SEQ ID NO：1的第91-990位所示片段(此片段编码本发明甘露聚糖酶的催化活性结构域或酶核心)的部分序列的变性双链DNA探针，或包含SEQ ID NO：1的第91-990位所示亚序列(此亚序列长度至少为大约100碱基对)的任何探针在至少中等严谨条件下，但是优选如下文详述的高度严谨条件下可杂交。用于测定在中等或高度严谨条件下核苷酸探针和同源DNA或RNA序列的杂交的合适实验条件，涉及将含待杂交DNA片段或RNA的滤膜在5xSSC(NaCl/柠檬酸钠，Sambrook等人，1989)中预先浸泡10分钟，并将滤膜在5xSSC、5xDenhardt氏溶液(Sambrook等人，1989)、0.5％SDS和100μg/ml变性超声波破碎鲑鱼精DNA(Sambrook等人，1989)中预杂交，随后在含浓度为10ng/ml随机引发的(A.P.Feinberg和B.Vogelstein(1983)分析生物化学(Anal.Biochem.)132：6-13)³²P-dCTP标记的(比活性高于1×10⁹cpm/μg)探针的相同溶液中于约45℃杂交12小时。然后将滤膜在2xSSC、0.5％SDS中于至少60℃(中等严谨条件)，更优选至少65℃(中等/高度严谨条件)，甚至更优选至少70℃(高度严谨条件)，而且甚至更优选至少75℃(很高严谨条件)清洗两次30分钟。

使用X光胶片检测在这些条件下与寡核苷酸探针杂交的分子。

其它有用的分离多核苷酸是可分别与SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：31或者它们的互补序列的相似大小区域在至少中等严谨条件下杂交的多核苷酸。

特别有用的是可与包含SEQ ID NO：5所示全序列或包含SEQ ID NO：5的第94-1032位所示片段(此片段编码本发明甘露聚糖酶的催化活性结构域或酶核心)的部分序列的变性双链DNA探针，或包含SEQ IDNO：5的第94-1032位所示亚序列(此亚序列长度至少为大约100碱基对)的任何探针在至少中等严谨条件下，但是优选如下文详述的在高度严谨条件下可杂交的多核苷酸；以及可与包含SEQ ID NO：9所示全序列或包含SEQ ID NO：9的第94-1086位所示片段(此片段编码本发明甘露聚糖酶的催化活性结构域或酶核心)的部分序列的变性双链DNA探针，或包含SEQ ID NO：9的第94-1086位所示亚序列(此亚序列长度至少为大约100碱基对)的任何探针在至少中等严谨条件下，但是优选如下文详述的在高度严谨条件下杂交的多核苷酸；以及可与包含SEQ ID NO：11所示全序列或包含SEQ ID NO：11的第97-993位所示片段(此片段编码本发明甘露聚糖酶的催化活性结构域或酶核心)的部分序列的变性双链DNA探针，或包含SEQ ID NO：11的第97-993位所示亚序列(此亚序列长度至少为大约100碱基对)的任何探针在至少中等严谨条件下，但是优选如下文详述的在高度严谨条件下杂交的多核苷酸；以及可与包含SEQ ID NO：13所示全序列或包含SEQ ID NO：13的第498-1464位所示片段(此片段编码本发明甘露聚糖酶的催化活性结构域或酶核心)的部分序列的变性双链DNA探针，或包含SEQ ID NO：13的第498-1464位所示亚序列(此亚序列长度至少为大约100碱基对)的任何探针在至少中等严谨条件下，但是优选如下文详述的在高度严谨条件下杂交的多核苷酸；以及可与包含SEQ ID NO：15所示全序列或包含SEQ ID NO：15的第204-1107位所示片段(此片段编码本发明甘露聚糖酶的催化活性结构域或酶核心)的部分序列的变性双链DNA探针，或包含SEQ ID NO：15的第204-1107位所示亚序列(此亚序列长度至少为大约100碱基对)的任何探针在至少中等严谨条件下，但是优选如下文详述的在高度严谨条件下杂交的多核苷酸；以及可与包含SEQ ID NO：17所示序列或包含SEQID NO：17的亚序列(此亚序列长度至少为大约100碱基对)的任何探针的变性双链DNA探针在至少中等严谨条件下，但是优选如下文详述的在高度严谨条件下杂交的多核苷酸；以及可与包含SEQ ID NO：19所示序列或包含SEQ ID NO：19的亚序列(此亚序列长度至少为大约100碱基对)的任何探针的变性双链DNA探针在至少中等严谨条件下，但是优选如下文详述的在高度严谨条件下杂交的多核苷酸；以及可与包含SEQ ID NO：21所示全序列或包含SEQ ID NO：21的第88-960位所示片段(此片段编码本发明甘露聚糖酶的催化活性结构域或酶核心)的部分序列的变性双链DNA探针，或包含SEQ ID NO：21的第88-960位所示亚序列(此亚序列长度至少为大约100碱基对)的任何探针在至少中等严谨条件下，但是优选如下文详述的在高度严谨条件下杂交的多核苷酸；以及可与包含SEQ ID NO：23所示全序列或包含SEQ ID NO：23的亚序列(此亚序列长度至少为大约100碱基对)的任何探针的变性双链DNA探针在至少中等严谨条件下，但是优选如下文详述的在高度严谨条件下杂交的多核苷酸；以及可与包含SEQ IDNO：25所示全序列或包含SEQ ID NO：25的第904-1874位所示片段(此片段编码本发明甘露聚糖酶的催化活性结构域或酶核心)的部分序列的变性双链DNA探针，或包含SEQ ID NO：25的第904-1874位所示亚序列(此亚序列长度至少为大约100碱基对)的任何探针在至少中等严谨条件下，但是优选如下文详述的在高度严谨条件下杂交的多核苷酸；以及可与包含SEQ ID NO：27所示全序列或包含SEQ ID NO：27的第498-1488位所示片段(此片段编码本发明甘露聚糖酶的催化活性结构域或酶核心)的部分序列的变性双链DNA探针，或包含SEQ IDNO：27的第498-1488位所示亚序列(此亚序列长度至少为大约100碱基对)的任何探针在至少中等严谨条件下，但是优选如下文详述的在高度严谨条件下杂交的多核苷酸；以及可与包含SEQ ID NO：29所示全序列或包含SEQ ID NO：29的第79-1083位所示片段(此片段编码本发明甘露聚糖酶的催化活性结构域或酶核心)的部分序列的变性双链DNA探针，或包含SEQ ID NO：29的第79-1083位所示亚序列(此亚序列长度至少为大约100碱基对)的任何探针在至少中等严谨条件下，但是优选如下文详述的在高度严谨条件下杂交的多核苷酸；以及可与包含SEQ ID NO：31所示全序列或包含SEQ ID NO：31的第1779-2709位所示片段(此片段编码本发明甘露聚糖酶的催化活性结构域或酶核心)的部分序列的变性双链DNA探针，或包含SEQ ID NO：31的第1779-2709位所示亚序列(此亚序列长度至少为大约100碱基对)的任何探针在至少中等严谨条件下，但是优选如下文详述的在高度严谨条件下杂交的多核苷酸。

正如先前注明的，本发明的分离多核苷酸包括DNA和RNA。分离DNA和RNA的方法在本领域是众所周知的。通过本领域已知的方法，可以将编码感兴趣的基因的DNA和RNA从Gene Banks或DNA文库中克隆到。

然后，通过，例如杂交或PCR，对编码具有本发明甘露聚糖酶活性的多肽的多核苷酸进行鉴定和分离。

本发明还提供了来自不同细菌菌株的类似多肽和多核苷酸(直向同源物或共生同源物)。特别感兴趣的是，来自革兰氏阳性嗜碱菌株，包括芽孢杆菌物种诸如芽孢杆菌属之种(Bacillus sp.)、Bacillusagaradhaerens、耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、Bacillusclausii和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的甘露聚糖酶多肽；和来自热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter)组的甘露聚糖酶多肽，包括热解纤维素菌属(Caldicellulosiruptor)的种。来自真菌腐质霉属或柱霉属(Scytalidium)，特别是Humicola insolens或Scytalidium thermophilum的甘露聚糖酶多肽也是感兴趣的。

使用本发明提供的信息和组合物，与常规的克隆技术结合，可以克隆具有本发明甘露聚糖酶活性的多肽的物种同源物。例如，使用由表达该蛋白质的细胞类型得到的染色体DNA，可以克隆本发明的DNA序列。可以用根据此处公开的序列设计的探针，探测Northern或Southern印迹，鉴定合适的DNA来源。然后，由阳性细胞系的染色体DNA制备DNA文库。然后通过多种方法，诸如用根据此详述和权利要求公开的序列设计的探针，或一组或几组基于公开序列的简并探针进行探测，可以分离编码具有甘露聚糖酶活性的多肽的本发明DNA序列。通过聚合酶链式反应或PCR(Mullis，美国专利号4,683,202)，用根据此处公开序列设计的引物，也可以克隆本发明的DNA序列。在其它方法中，可以用DNA文库转化或转染宿主细胞，并用针对由芽孢杆菌属之种克隆的甘露聚糖酶制备的、如材料与方法和实施例1中所述表达和纯化的抗体(单克隆或多克隆)，或通过涉及具有甘露聚糖酶活性的多肽的活性测试，检测感兴趣的DNA的表达。

可以由细菌芽孢杆菌属I633菌株，或此处描述的另一种或有关生物体，克隆甘露聚糖酶编码部分的DNA序列(SEQ ID NO：1)(克隆到大肠杆菌DSM 12197中存在的质粒pBXM3中的DNA序列)和/或本发明的类似DNA序列。

将多核苷酸分子的甘露聚糖酶编码部分(SEQ ID NO：5的DNA序列)转化到大肠杆菌菌株中，依照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，发明人于1998年5月18日将此菌株保藏于DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，MascheroderWeg 1b，D-38124 Braunschweig，德国，保藏号DSM 12180；可以由细菌Bacillus agaradhaerens的菌株，例如由菌株DSM 8721，或此处描述的另一种或有关生物体，克隆多核苷酸分子的此甘露聚糖酶编码部分(SEQ ID NO：5的DNA序列)和/或它们的类似DNA序列。

将多核苷酸分子的甘露聚糖酶编码部分(SEQ ID NO：9的DNA序列)转化到大肠杆菌菌株中，依照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，发明人于1998年10月7日将此菌株保藏于DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，MascheroderWeg 1b，D-38124 Braunschweig，德国，保藏号DSM 12433；可以由细菌芽孢杆菌属之种(Bacillus sp.)AAI12的菌株或此处描述的另一种或有关生物体，克隆多核苷酸分子的此甘露聚糖酶编码部分(SEQID NO：9的DNA序列)和/或它们的类似DNA序列。

将多核苷酸分子的甘露聚糖酶编码部分(SEQ ID NO：11的DNA序列)转化到大肠杆菌菌株中，依照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，发明人于1998年10月9日将此菌株保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德国，保藏号DSM 12441；可以由细菌耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)菌株或者此处描述的另一种或有关生物体，克隆多核苷酸分子的此甘露聚糖酶编码部分(SEQ ID NO：11的DNA序列)和/或它们的类似DNA序列。

将多核苷酸分子的甘露聚糖酶编码部分(SEQ ID NO：13的DNA序列)转化到大肠杆菌菌株中，依照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，发明人于1995年5月11日将此菌株保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，联邦德国，保藏号DSM9984；可以由真菌Humicola insolens的菌株或者此处描述的另一种或有关生物体，克隆多核苷酸分子的此甘露聚糖酶编码部分(SEQ IDNO：13的DNA序列)和/或它们的类似DNA序列。

将多核苷酸分子的甘露聚糖酶编码部分(SEQ ID NO：15的DNA序列)转化到大肠杆菌菌株中，依照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，发明人于1998年10月5日将此菌株保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德国，保藏号DSM 12432；可以由细菌物种芽孢杆菌属之种(Bacillus sp.)AA349的菌株或者此处描述的另一种或有关生物体，克隆多核苷酸分子的此甘露聚糖酶编码部分(SEQ ID NO：15的DNA序列)和/或它们的类似DNA序列。

将多核苷酸分子的甘露聚糖酶编码部分(SEQ ID NO：17的DNA序列)转化到大肠杆菌菌株中，依照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，发明人于1999年6月4日将此菌株保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德国，保藏号DSM 12847；可以由细菌物种芽孢杆菌属之种(Bacillus sp.)的菌株或者此处描述的另一种或有关生物体，克隆多核苷酸分子的此甘露聚糖酶编码部分(SEQ ID NO：17的DNA序列)和/或它们的类似DNA序列。

将多核苷酸分子的甘露聚糖酶编码部分(SEQ ID NO：19的DNA序列)转化到大肠杆菌菌株中，依照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，发明人于1999年6月4日将此菌株保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德国，保藏号DSM 12848；可以由细菌物种芽孢杆菌属之种(Bacillus sp.)的菌株或者此处描述的另一种或有关生物体，克隆多核苷酸分子的此甘露聚糖酶编码部分(SEQ ID NO：19的DNA序列)和/或它们的类似DNA序列。

将多核苷酸分子的甘露聚糖酶编码部分(SEQ ID NO：21的DNA序列)转化到大肠杆菌菌株中，依照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，发明人于1999年6月4日将此菌株保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德国，保藏号DSM 12849；可以由细菌物种Bacillus clausii的菌株或者此处描述的另一种或有关生物体，克隆多核苷酸分子的此甘露聚糖酶编码部分(SEQ ID NO：21的DNA序列)和/或它们的类似DNA序列。

将多核苷酸分子的甘露聚糖酶编码部分(SEQ ID NO：23的DNA序列)转化到大肠杆菌菌株中，依照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，发明人于1999年6月4日将此菌株保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德国，保藏号DSM 12850；可以由细菌物种芽孢杆菌属之种(Bacillus sp.)的菌株或者此处描述的另一种或有关生物体，克隆多核苷酸分子的此甘露聚糖酶编码部分(SEQ ID NO：23的DNA序列)和/或它们的类似DNA序列。

将多核苷酸分子的甘露聚糖酶编码部分(SEQ ID NO：25的DNA序列)转化到大肠杆菌菌株中，依照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，发明人于1999年6月4日将此菌株保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德国，保藏号DSM 12846；可以由细菌物种芽孢杆菌属之种(Bacillus sp.)的菌株或者此处描述的另一种或有关生物体，克隆多核苷酸分子的此甘露聚糖酶编码部分(SEQ ID NO：25的DNA序列)和/或它们的类似DNA序列。

将多核苷酸分子的甘露聚糖酶编码部分(SEQ ID NO：27的DNA序列)转化到大肠杆菌菌株中，依照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，发明人于1999年6月4日将此菌株保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德国，保藏号DSM 12851；可以由细菌物种芽孢杆菌属之种(Bacillus sp.)的菌株或者此处描述的另一种或有关生物体，克隆多核苷酸分子的此甘露聚糖酶编码部分(SEQ ID NO：27的DNA序列)和/或它们的类似DNA序列。

将多核苷酸分子的甘露聚糖酶编码部分(SEQ ID NO：29的DNA序列)转化到大肠杆菌菌株中，依照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，发明人于1999年6月4日将此菌株保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德国，保藏号DSM 12852；可以由细菌物种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的菌株或者此处描述的另一种或有关生物体，克隆多核苷酸分子的此甘露聚糖酶编码部分(SEQ ID NO：29的DNA序列)和/或它们的类似DNA序列。将多核苷酸分子的甘露聚糖酶编码部分(SEQ ID NO：31的DNA序列)转化到大肠杆菌菌株中，依照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，发明人于1998年10月5日将此菌株保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德国，保藏号DSM 12436；可以由细菌热解纤维素菌属之种(Caldicellulosiruptor sp.)的菌株或者此处描述的另一种或有关生物体，克隆多核苷酸分子的此甘露聚糖酶编码部分(SEQ ID NO：31的DNA序列)和/或它们的类似DNA序列。

或者，可以在能由下列质粒得到的DNA序列的基础之上，构建类似序列，如它们的亚序列：大肠杆菌DSM 12197中存在的质粒(相信与所附SEQ ID NO：1相同)、大肠杆菌DSM 12180中存在的质粒(相信与所附SEQ ID NO：5相同)、大肠杆菌DSM 12433中存在的质粒(相信与所附SEQ ID NO：9相同)、大肠杆菌DSM 12441中存在的质粒(相信与所附SEQ ID NO：11相同)、大肠杆菌DSM 9984中存在的质粒(相信与所附SEQ ID NO：13相同)、大肠杆菌DSM 12432中存在的质粒(相信与所附SEQ ID NO：15相同)、大肠杆菌DSM 12847中存在的质粒(相信与所附SEQ ID NO：17相同)、大肠杆菌DSM 12848中存在的质粒(相信与所附SEQ ID NO：19相同)、大肠杆菌DSM 12849中存在的质粒(相信与所附SEQ ID NO：21相同)、大肠杆菌DSM 12850中存在的质粒(相信与所附SEQ ID NO：23相同)、大肠杆菌DSM 12846中存在的质粒(相信与所附SEQ ID NO：25相同)、大肠杆菌DSM 12851中存在的质粒(相信与所附SEQ ID NO：27相同)、大肠杆菌DSM 12852中存在的质粒(相信与所附SEQ ID NO：29相同)或大肠杆菌DSM 12436中存在的质粒(相信与所附SEQ ID NO：31相同)，和/或通过引入核苷酸取代，这样的核苷酸取代并不引起由该DNA序列编码的甘露聚糖酶氨基酸序列不同，但是符合意欲用于生产该酶的宿主生物体的密码子用法，或通过引入会产生不同的氨基酸序列(即本发明甘露聚糖降解酶的变体)的核苷酸取代进行构建。

多肽

SEQ ID NO：2的第31-490位所示氨基酸序列是成熟甘露聚糖酶序列。SEQ ID NO：2的第1-30位所示氨基酸序列是信号肽。相信SEQID NO：2的第31-330位所示氨基酸亚序列是甘露聚糖酶的催化结构域，而且成熟酶还包含第331-342位的接头和第343-490位的至少一个未知功能的C端结构域。既然本发明的目的是得到具有甘露聚糖酶活性的多肽，故本发明涉及包含SEQ ID NO：2的第31-330位所示氨基酸序列(即催化结构域)，任选在N端或C端与一个或两个或两个以上具有不同功能的结构域可操作连接的任何甘露聚糖酶。具有SEQID NO：2的第343-490位所示氨基酸亚序列的结构域，是未知功能的甘露聚糖酶的结构域，此结构域与已知甘露聚糖酶的相似结构域高度同源，参阅实施例1。

SEQ ID NO：6的第32-494位所示氨基酸序列是成熟甘露聚糖酶序列。SEQ ID NO：6的第1-31位所示氨基酸序列是信号肽。相信SEQID NO：6的第32-344位所示氨基酸亚序列是甘露聚糖酶的催化结构域，而且成熟酶还包含第345-494位的至少一个未知功能的C端结构域。既然本发明的目的是得到具有甘露聚糖酶活性的多肽，故本发明涉及包含SEQ ID NO：6的第32-344位所示氨基酸序列(即催化结构域)，任选在N端或C端与一个或两个或两个以上具有不同功能的结构域可操作连接的任何甘露聚糖酶。

SEQ ID NO：10的第32-586位所示氨基酸序列是成熟甘露聚糖酶序列。SEQ ID NO：10的第1-31位所示氨基酸序列是信号肽。相信SEQ ID NO：10的第32-362位所示氨基酸亚序列是甘露聚糖酶的催化结构域，而且成熟酶还包含第363-586位的至少一个未知功能的C端结构域。既然本发明的目的是得到具有甘露聚糖酶活性的多肽，故本发明涉及包含SEQ ID NO：10的第32-362位所示氨基酸序列(即催化结构域)，任选在N端或C端与一个或两个或两个以上具有不同功能的结构域可操作连接的任何甘露聚糖酶。

SEQ ID NO：12的第33-331位所示氨基酸序列是成熟甘露聚糖酶序列。SEQ ID NO：12的第1-32位所示氨基酸序列是信号肽。相信SEQ ID NO：10的第33-331位所示氨基酸亚序列是甘露聚糖酶的催化结构域。此甘露聚糖酶的酶核心包含SEQ ID NO：12的第33-331位所示氨基酸序列，即催化结构域，其可以在N端或C端与或不与一个或两个或两个以上具有不同功能的结构域可操作连接，即是融合蛋白的一部分。

SEQ ID NO：14的第22-488位所示氨基酸序列是成熟甘露聚糖酶序列。SEQ ID NO：14的第1-21位所示氨基酸序列是信号肽。相信SEQ ID NO：14的第166-488位所示氨基酸亚序列是甘露聚糖酶的催化结构域，而且成熟酶还包含第22-164位的至少一个未知功能的N端结构域。既然本发明的目的是得到具有甘露聚糖酶活性的多肽，故本发明涉及包含SEQ ID NO：14的第166-488位所示氨基酸序列(即催化结构域)，任选在N端或C端与一个或两个或两个以上具有不同功能的结构域可操作连接的任何甘露聚糖酶。

SEQ ID NO：16的第26-369位所示氨基酸序列是成熟甘露聚糖酶序列。SEQ ID NO：16的第1-25位所示氨基酸序列是信号肽。相信SEQ ID NO：16的第68-369位所示氨基酸亚序列是甘露聚糖酶的催化结构域，而且成熟酶还包含第26-67位的至少一个未知功能的N端结构域。既然本发明的目的是得到具有甘露聚糖酶活性的多肽，故本发明涉及包含SEQ ID NO：16的第68-369位所示氨基酸序列(即催化结构域)，任选在N端或C端与一个或两个或两个以上具有不同功能的结构域可操作连接的任何甘露聚糖酶。

SEQ ID NO：18的氨基酸序列是构成成熟甘露聚糖酶一部分的部分序列。本发明涉及包含SEQ ID NO：18的第1-305位所示氨基酸序列的任何甘露聚糖酶。

SEQ ID NO：20的氨基酸序列是构成成熟甘露聚糖酶一部分的部分序列。本发明涉及包含SEQ ID NO：20的第1-132位所示氨基酸序列的任何甘露聚糖酶。

SEQ ID NO：22的第29-320位的氨基酸序列是成熟甘露聚糖酶序列。SEQ ID NO：22的第1-28位所示氨基酸序列是信号肽。相信SEQ ID NO：22的第29-320位所示氨基酸亚序列是甘露聚糖酶的催化结构域。包含SEQ ID NO：22的第29-320位所示氨基酸序列，即催化结构域的此甘露聚糖酶酶核心，可以在N端或C端与或不与一个或两个或两个以上具有不同功能的结构域可操作连接，即是融合蛋白的一部分。

SEQ ID NO：24的氨基酸序列是构成成熟甘露聚糖酶一部分的部分序列。本发明涉及包含SEQ ID NO：24的第29-188位所示氨基酸序列的任何甘露聚糖酶。

SEQ ID NO：26的第30-815位所示氨基酸序列是成熟甘露聚糖酶序列。SEQ ID NO：26的第1-29位所示氨基酸序列是信号肽。相信SEQ ID NO：26的第301-625位所示氨基酸亚序列是甘露聚糖酶的催化结构域，而且成熟酶还分别包含第44-166位和第195-300位的两个未知功能的N端结构域，和第626-815位的未知功能的C端结构域。既然本发明的目的是得到具有甘露聚糖酶活性的多肽，故本发明涉及包含SEQ ID NO：26的第301-625位所示氨基酸序列(即催化结构域)，任选在N端或C端与一个或两个或两个以上具有不同功能的结构域可操作连接的任何甘露聚糖酶。

SEQ ID NO：28的第38-496位所示氨基酸序列是成熟甘露聚糖酶序列.SEQ ID NO：28的第1-37位所示氨基酸序列是信号肽。相信SEQ ID NO：28的第166-496位所示氨基酸亚序列是甘露聚糖酶的催化结构域，而且成熟酶还包含第38-165位的至少一个未知功能的N端结构域。既然本发明的目的是得到具有甘露聚糖酶活性的多肽，故本发明涉及包含SEQ ID NO：28的第166-496位所示氨基酸序列(即催化结构域)，任选在N端或C端与一个或两个或两个以上具有不同功能的结构域可操作连接的任何甘露聚糖酶。

SEQ ID NO：30的第26-361位所示氨基酸序列是成熟甘露聚糖酶序列。SEQ ID NO：30的第1-25位所示氨基酸序列是信号肽。相信SEQ ID NO：30的第26-361位所示氨基酸亚序列是甘露聚糖酶的催化结构域。包含SEQ ID NO：30的第26-361位所示氨基酸序列，即催化结构域的此甘露聚糖酶酶核心，可以在N端或C端与或不与一个或两个或两个以上具有不同功能的结构域可操作连接。

SEQ ID NO：32的第23-903位所示氨基酸序列是成熟甘露聚糖酶序列。SEQ ID NO：32的第1-22位所示氨基酸序列是信号肽.相信SEQ ID NO：32的第593-903位所示氨基酸亚序列是甘露聚糖酶的催化结构域，而且成熟酶还包含分别位于第23-214位、第224-424位和第434-592位的至少三个未知功能的N端结构域。既然本发明的目的是得到具有甘露聚糖酶活性的多肽，故本发明涉及包含SEQ ID NO：32的第593-903位所示氨基酸序列(即催化结构域)，任选在N端或C端与一个或两个或两个以上具有不同功能的结构域可操作连接的任何甘露聚糖酶。

本发明还提供了分别与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32的多肽基本同源的甘露聚糖酶多肽，和它们的物种同源物(共生同源物或直向同源物)。此处使用术语“基本同源”，指与SEQ ID NO：2的第33-340位或第33-490位氨基酸所示序列或者它们的直向同源物或共生同源物；或与SEQ ID NO：6的第32-344位或第32-494位氨基酸所示序列或者它们的直向同源物或共生同源物；或与SEQ ID NO：10的第32-362位或第32-586位氨基酸所示序列或者它们的直向同源物或共生同源物；或与SEQ ID NO：12的第33-331位氨基酸所示序列或者它的直向同源物或共生同源物；或与SEQ ID NO：14的第166-488位或第22-488位氨基酸所示序列或者它的直向同源物或共生同源物；或与SEQ ID NO：16的第68-369位或第32-369位氨基酸所示序列或者它的直向同源物或共生同源物；或与SEQ ID NO：18的第1-305位氨基酸所示序列或者它的直向同源物或共生同源物；或与SEQ ID NO：20的第1-132位氨基酸所示序列或者它的直向同源物或共生同源物；或与SEQ ID NO：22的第29-320位氨基酸所示序列或者它的直向同源物或共生同源物；或与SEQ ID NO：24的第29-188位氨基酸所示序列或者它的直向同源物或共生同源物；或与SEQ ID NO：26的第301-625位或第30-625位氨基酸所示序列或者它的直向同源物或共生同源物；或与SEQ ID NO：28的第166-496位或第38-496位氨基酸所示序列或者它的直向同源物或共生同源物；或与SEQ ID NO：30的第26-361位氨基酸所示序列或者它的直向同源物或共生同源物；或与SEQ ID NO：32的第593-903位或第23-903位氨基酸所示序列或者它的直向同源物或共生同源物，具有65％，优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％序列同一性的多肽。

这些多肽更优选与SEQ ID NO：2的第31-330位或第31-490位氨基酸所示序列或者它们的直向同源物或共生同源物；或与SEQ ID NO：6的第32-344位或第32-494位氨基酸所示序列或者它们的直向同源物或共生同源物；或与SEQ ID NO：10的第32-362位或第32-586位氨基酸所示序列或者它们的直向同源物或共生同源物；或与SEQ IDNO：12的第33-331位氨基酸所示序列或者它的直向同源物或共生同源物；或与SEQ ID NO：14的第166-488位或第22-488位氨基酸所示序列或者它们的直向同源物或共生同源物；或与SEQ ID NO：16的第68-369位或第32-369位氨基酸所示序列或者它们的直向同源物或共生同源物；或与SEQ ID NO：18的第1-305位氨基酸所示序列或者它的直向同源物或共生同源物；或与SEQ ID NO：20的第1-132位氨基酸所示序列或者它的直向同源物或共生同源物；或与SEQ ID NO：22的第29-320位氨基酸所示序列或者它的直向同源物或共生同源物；或与SEQ ID NO：24的第29-188位氨基酸所示序列或者它的直向同源物或共生同源物；或与SEQ ID NO：26的第301-625位或第30-625位氨基酸所示序列或者它们的直向同源物或共生同源物；或与SEQ ID NO：28的第166-496位或第38-496位氨基酸所示序列或者它的直向同源物或共生同源物；或与SEQ ID NO：30的第26-361位氨基酸所示序列或者它的直向同源物或共生同源物；或与SEQ ID NO：32的第593-903位或第23-903位氨基酸所示序列或者它们的直向同源物或共生同源物，至少95％相同，而且最优选98％或更多相同.

通过常规方法，使用本领域已知的电脑程序，诸如GCG程序包(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，1994年8月，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)中提供的GAP，如S.B.Needleman和C.D.Wunsch(1970)，分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)，48：443-453(此处完整引用作为参考)中公开的，测定了序列同一性百分比。对于多肽序列比较以下述设置使用GAP程序：缺口产生罚分3.0，缺口延伸罚分0.1。

通过类似的方法，以下列用于DNA序列比较的设置使用GAP程序，测定了多核苷酸分子的序列同一性：缺口产生罚分5.0，缺口延伸罚分0.3。

本发明的酶制剂优选来自微生物，优选来自细菌、古细菌(archea)或真菌，尤其是来自细菌诸如芽孢杆菌属的细菌，优选属于选自芽孢杆菌属之种以及与芽孢杆菌I633、耐盐芽孢杆菌或芽孢杆菌AAI12在16S rDNA序列排列方面至少95％，甚至更优选至少98％同源之高度相关芽孢杆菌属的种的芽孢杆菌菌株。

根据RDP(Ribosomal Database Project，)(Bonne L.Maidak，Neils Larson，Michael J.McCaughey，Ross Overbeek，Gary J.Olsen，Karl Fogel，James Blandy，和Carl R.Woese，核酸研究(NucleicAcid Research)，1994，22(17)：3485-3487，The Ribosomal DatabaseProject)的16S rDNA序列排列鉴定的系统发生相互关系，要求这些物种(的专利权)。排序是根据二级结构进行的。使用ARB程序包(Oliver Strunk和Wolfgang Ludwig，Technical University ofMunich，德国)中的“全矩阵计算(Full matrix calculation)”程序，以相邻连接方法(neighbor joining method)的系统设置，建立了序列相似性的计算法。

由表II得到的信息是要求保护来自高度相关芽孢杆菌物种的所有家族5的甘露聚糖酶的基础，其中要求保护与芽孢杆菌I633超过93％同源的所有物种。这些物种包括：产孢耐热芽孢杆菌(Bacillussporothermodurans)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)、假嗜碱芽孢杆菌(Bacillus pseudoalcalophilus)和Bacillusclausii。见图1：由ARP程序产生的系统发生树，列出了与芽孢杆菌I633关系最近的物种。16SRNA显示于SEQ ID NO：33.

表II：选定的芽孢杆菌物种的16S核糖体RNA同源指数

其它有用的家族5的甘露聚糖酶是由高度相关芽孢杆菌物种得到的甘露聚糖酶，其中所有物种基于排列的16S序列，显示与耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)超过93％同源。这些芽孢杆菌物种包括：左旋乳酸芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus laevis)、Bacillusagaradhaerens和嗜盐海球菌(Marinococcus halophilus)。见图2：由ARP程序产生的系统发生树，列出了与耐盐芽孢杆菌(Bacillushalodurans)关系最近的物种。

表III：选定的芽孢杆菌物种的16S核糖体RNA同源指数

其它有用的家族5的甘露聚糖酶是由Bacillus agaradhaerens和高度相关芽孢杆菌物种的菌株得到的甘露聚糖酶，其中所有物种优选与Bacillus agaradhaerens DSM 8721至少95％，甚至更优选至少98％同源(基于排列的16SrDNA序列)。

有用的家族26的甘露聚糖酶是例如由高度相关芽孢杆菌物种得到的甘露聚糖酶，其中要求保护与芽孢杆菌AAI12超过93％同源的所有物种。这些物种包括：产孢耐热芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalcalophilus)、假嗜碱芽孢杆菌(Bacillus pseudoalcalophilus)和Bacillus clausii。见图3：由ARP程序产生的系统发生树，列出了与芽孢杆菌AAI12关系最近的物种。16S RNA显示于SEQ ID NO：34。

表IV：选定的芽孢杆菌物种的16S核糖体RNA同源指数

其它有用的家族26的甘露聚糖酶是由地衣芽孢杆菌和高度相关芽孢杆菌物种的菌株得到的甘露聚糖酶，其中所有物种优选与地衣芽孢杆菌至少95％，甚至更优选至少98％同源(基于排列的16S rDNA序列)。

基本同源的蛋白质和多肽的特征是，具有一个或几个氨基酸取代、删除或加入。这些变化优选影响较小的改变，即保守氨基酸取代(见表2)和不显著影响蛋白质或多肽的折叠或活性的其它取代；短肽删除，通常是1-大约30个氨基酸的缺失；和短氨基-或羧基-末端延伸，诸如氨基端甲硫氨酸残基、直至大约20-25个残基的短连接肽、或有助于纯化的短延伸(亲和标签)，诸如聚组氨酸区、蛋白A(Nilsson等人，EMBO J.4：1075，1985；Nilsson等人，Methods Enzymol.198：3，1991。见Ford等人，蛋白质表达和纯化(Protein Expression and Purification)2：95-107，1991，此处引用作为参考)。可以从商业供应商处购得编码亲和标签的DNA(如，Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ；New England Biolabs，Beverly，MA)。

然而，即使上述改变优选影响较小的改变，这些改变仍可以变化较大，诸如直至300个氨基酸或更多的较大多肽作为氨基-或羧基-末端延伸与本发明的甘露聚糖酶多肽的融合体。

表1

保守氨基酸取代

除了20种标准氨基酸，可以用非常见氨基酸(诸如4-羟脯氨酸，6-N-甲基赖氨酸，2-氨基异丁酸，异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)取代本发明多肽的氨基酸残基。可以用有限数目的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸、和非天然氨基酸取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后被修饰，且/或在它们的侧链中具有与标准氨基酸不同的化学结构。非天然氨基酸可以化学合成，或优选商业购买，包括六氢吡啶羧酸、噻唑羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、和3，3-二甲基脯氨酸。

根据本领域已知的方法，诸如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，科学244：1081-1085，1989)，可以鉴定本发明甘露聚糖酶多肽中的重要氨基酸。在后一种技术中，在分子中的每一个残基处引入单个丙氨酸突变，并测试产生的突变分子的生物学活性(即甘露聚糖酶活性)，从而鉴定分子活性的关键氨基酸残基。见，Hilton等人，生物化学杂志271：4699-4708，1996。通过对结构进行物理学分析，如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记技术，与假定接触位点氨基酸的突变结合，还可以测定酶或其它生物学相互作用的活性位点。见，例如，de Vos等人，科学255：306-312，1992；Smith等人，分子生物学杂志224：899-904，1992；Wlodaver等人，FEBS Lett.309：59-64，1992。还可以由与本发明多肽相关的多肽的同源性分析推断重要氨基酸的位置。

使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，以及随后的相应筛选步骤，诸如Reidhaar-Olson和Sauer(科学241：53-57，1988)、Bowie和Sauer(美国国家科学院进展86：2152-2156，1989)、WO95/17413、或WO95/22625公开的那些，可以制得并测试多氨基酸取代。简要的说，这些作者公开了在多肽的两个或多个位置同时进行随机化，或重组/改组不同突变(WO95/17413，WO95/22625)，随后选择功能多肽，然后对突变多肽进行测序以测定各位置可允许取代的范围。其它可以使用的方法包括噬菌体展示(如，Lowman等人，Biochem.30：10832-10837，1991；Ladner等人，美国专利号5,223,409；Huse，WO92/06204)和定区诱变(Derbyshire等人，基因46：145，1986；Ner等人，DNA 7：127，1988)。

诱变/改组方法，如上文公开的，可以与高通量、自动筛选方法结合，来检测克隆的突变多肽在宿主细胞中的活性。可以由宿主细胞回收编码活性多肽的突变DNA分子，并使用现代化设备进行快速测序。用这些方法可以快速确定目的多肽中各氨基酸残基的重要性，并可应用于未知结构的多肽。

使用上文讨论的方法，本领域的普通技术人员可以鉴定和/或制备多种与下述基本同源、并保留野生型蛋白质甘露聚糖酶活性的多肽：SEQ ID NO：2的第33-340位或第33-490位残基；或SEQ ID NO：6的第32-344位或第32-494位残基；或SEQ ID NO：10的第32-362位或第32-586位残基；或SEQ ID NO：12的第33-331位残基；或与SEQ ID NO：14的第166-488位或第22-488位残基；或SEQ ID NO：16的第68-369位或第32-369位残基；或SEQ ID NO：18的第1-305位残基；或SEQ ID NO：20的第1-132位残基；或SEQ ID NO：22的第29-320位残基；或SEQ ID NO：24的第29-188位残基；或SEQ ID NO：26的第301-625位或第30-625位残基；或SEQ ID NO：28的第166-496位或第38-496位残基；或SEQ ID NO：30的第26-361位残基；或SEQ ID NO：32的第593-903位或第23-903位残基。

本发明的甘露聚糖酶，除了包含催化结构域的酶核心外，还可以包含纤维素结合结构域(CBD)，其中纤维素结合结构域与酶的酶核心(催化活性结构域)是可操作连接的。纤维素结合结构域(CBD)可以作为编码的酶的整体部分存在，或可以将来自另一来源的CBD引入甘露聚糖降解酶，由此产生酶杂合体。在本文中，术语“纤维素结合结构域”意欲理解为Peter Tomme等人的定义，“纤维素结合结构域：分类和性质”在“Enzymatic Degradation of InsolubleCarbohydrates”中，John N.Saddler和Michael H.Penner(编)，ACS Symposium Series，No.618,1996。此定义将超过120种纤维素结合结构域分类成10个家族(I-X)，并证明CBD发现于多种酶诸如纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶和几丁质酶。CBD也发现于藻类中，如红藻Porphyra purpurea中，作为非水解的多糖结合蛋白存在，见Tomme等人，前面引文。然而，大多数CBD来自纤维素酶和木聚糖酶，CBD发现于蛋白质的N和C端或内部。酶杂合体在本领域是已知的，见，如WO90/00609和WO95/16782，而且可以如下制备，即用至少包含纤维素结合结构域编码DNA的片段并通过或不通过接头连接了编码甘露聚糖降解酶的DNA序列的DNA构建物转化宿主细胞，并培养细胞以表达融合基因。酶杂合体可以由下面的通式描述：

CBD-MR-X

其中CBD是至少相应于纤维素结合结构域的氨基酸序列N端或C端区域；MR是中间区域(接头)，而且可以是键或短连接基团，优选大约2-大约100个碳原子的基团，更优选2-40个碳原子的基团；或优选大约2-大约100个氨基酸，更优选2-40个氨基酸；而X是本发明甘露聚糖酶的N端或C端区域。SEQ ID NO：4公开了甘露聚糖酶酶核心和CBD的酶杂合体的氨基酸序列。

优选的，本发明的甘露聚糖酶在pH至少7，更优选至少8，更优选至少8.5，更优选至少9，更优选至少9.5，更优选至少10，甚至更优选至少10.5，尤其是至少11具有其最大催化活性；而且优选酶在温度为至少40℃，更优选至少50℃，甚至更优选至少55℃有最大酶活性。

优选的，本发明的清洁组合物可提供pH通常在大约8-大约10.5之间的清洗液，如在机械清洗过程的清洗循环中用于处理织物。通常，这样的清洗液在温度大约20℃-大约95℃之间，优选大约20℃-大约60℃之间，优选大约20℃-大约50℃之间使用。

蛋白质生产

本发明的蛋白质和多肽，包括全长蛋白质、它们的片段和融合蛋白，可根据常规技术在基因工程化宿主细胞中生产。合适的宿主细胞是可以用外源DNA转化或转染、并在培养基中培养的那些细胞类型，并且包括细菌、真菌细胞、和培养的高等真核细胞。优选细菌细胞，特别是革兰氏阳性生物体的培养细胞。尤其优选芽孢杆菌属的革兰氏阳性细胞，诸如：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、Bacillus clausii、Bacillus agaradhaerens、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermopilus)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、和芽孢杆菌属之种，特别是芽孢杆菌I633、芽孢杆菌AAI12、Bacillusclausii、Bacillus agaradhaerens和地衣芽孢杆菌。

在另一个优选的实施方案中，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”，如此处使用的，包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、和接合菌门(Zygomycota)(如Hawksworth等人定义的，Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi，第8版，1995，CAB International，University Press，剑桥，英国)，以及卵菌门(Oomycota)(见Hawksworth等人引用的，1995，见上文，第171页)和所有有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995，见上文)。子囊菌门的代表类型包括，如脉孢菌属(Neurospora)、正青霉属(Eupenicillium)＝青霉属(Penicillium)、裸孢壳属(Emericella＝曲霉属Aspergillus)、散囊菌属(Eurotium＝曲霉属Aspergillus)、和上文列出的真酵母。担子菌门的实例包括蘑菇(mushroom)、锈菌(rust)、和黑粉菌(smut)。壶菌门的代表类型包括，如异水霉属(Allomyces)、小芽枝霉属(Blastocladiella)、雕蚀菌属(Coelomomyces)、和水生真菌。卵菌门的代表类型包括，如腐生的水生真菌(水霉)诸如绵霉属(Achlya)。有丝分裂孢子真菌的实例包括曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、假丝酵母属(Candida)、和链格孢属(Alternaria)。接合菌门的代表类型包括，如根霉属(Rhizopus)和毛霉属(Mucor).

在还有一个实施方案中，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)所有亚门的所有丝状形式(如Hawksworth等人定义的，1995，见上文)。在更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是，但不限于，下列属的种的细胞：顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium属和木霉属(Trichoderma)或它们的有性型或别名。

特别的，细胞可以是属于木霉属的种，优选Trichodermaharzianum或Trichoderma reesei，或曲霉属的物种，最优选米曲霉(Aspergillus oryzae)或黑曲霉(Aspergillus niger)，或镰孢属的种，最优选具有镰孢ATCC 20334的鉴定特征的镰孢，如PCT/US/95/07743中进一步描述的。

可以通过包括原生质体形成、原生质体转化、和细胞壁重建的方法，以基本上已知的方式进行真菌细胞的转化。EP 238 023和Yelton等人，1984，美国国家科学院进展81：1470-1474中描述了转化曲霉属宿主细胞的合适步骤。Malardier等人，1989，基因78：147-156或未审的美国系列号08/269,449描述了转化镰孢属物种的合适方法。可以使用Becker和Guarente，J.N.Abelson和M.I.Simon编，Guide toYeast Genetics and Molecular Biology，酶学方法，第194卷，第182-187页，Academic Press，Inc.，纽约；Ito等人，1983，细菌学杂志153：163；和Hinnen等人，1978，美国国家科学院进展75：1920中描述的步骤转化酵母。可以使用Graham和Van der Eb(1978，病毒学52：546)中的磷酸钙沉淀的方法，通过直接摄取转化哺乳动物细胞。

Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，冷泉港，纽约，1989；Ausubel等人(编)，分子生物学现行方案，John Wiley and Sons，Inc.，纽约，1987；和“枯草芽孢杆菌和其它革兰氏阳性细菌”，Sonensheim等人，1993，American Society for Microbiology，华盛顿特区，公开了用于操作克隆的DNA分子和将外源DNA导入多种宿主细胞的技术，各文献此处引用作为参考。

通常，在表达载体中编码本发明甘露聚糖酶的DNA序列是与表达需要的其它基因元件，包括转录启动子和终止子可操作连接的。载体还通常含有一种或几种选择标记和一种或几种复制起点，虽然那些本领域的技术人员将认识到在某些系统中，可以在分开的载体上提供选择标记，而且可以通过整合到宿主细胞基因组中提供外源DNA的复制。启动子、终止子、选择标记、载体和其它元件的选择，是常规设计的内容，在本领域普通技术人员的水平之内。文献中描述了许多这样的元件，并可以通过商业供应商获得。

为了指导多肽进入宿主细胞的分泌途径，可以在表达载体中提供分泌信号序列(也叫作前导肽、前原序列或前序列)。分泌信号序列可以是多肽本身的，或可以由另一种分泌蛋白得到，或从头合成。本领域知道大量的合适的分泌信号序列，而有关进一步描述用于芽孢杆菌宿主细胞不分泌的合适的分泌信号序列，参考文献有“枯草芽孢杆菌和其它革兰氏阳性细菌”，Sonensheim等人，1993，American Societyfor Microbiology，华盛顿特区；和S.M.Cutting(编)，“MolecularBiological Methods for Bacillus”，John Wiley and Sons，1990。将分泌信号序列以正确的阅读框架与DNA序列连接。分泌信号序列通常位于感兴趣多肽的编码DNA序列的5’端，虽然某些信号序列可以位于感兴趣DNA序列的其它地方(见，如，Welch等人，美国专利号5,037,743；Holland等人，美国专利号5,143,830)。

本发明的表达载体可以是方便进行重组DNA操作的任何表达载体，而载体的选择将通常取决于载体将要导入的宿主细胞。由此，载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒。或者，载体可以是在导入宿主细胞后将整合到宿主细胞基因组，并随其整合的染色体一起复制的类型。

用于丝状真菌宿主细胞的合适的启动子的实例是，如ADH3启动子(McKnight等人，The EMBO J.4(1985)，2093-2099)或tpiA启动子。其它有用的启动子的实例是米曲霉TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(gluA)、米赫根毛霉脂酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶或构巢曲霉乙酰胺酶的编码基因的启动子。

根据常规步骤，在含营养物和所选宿主细胞生长需要的其它成分的培养基中，培养经转化或经转染的宿主细胞。本领域知道多种合适的培养基，包括已知成分培养基和复合培养基，而且通常包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素和矿物质。如果需要，培养基还可以含有诸如生长因子或血清成分。通常，通过例如药物选择，或通过表达载体携带或共转染到宿主细胞中的选择标记可弥补的必需营养物的缺乏，生长培养基将选择含有外来加入的DNA的细胞。

蛋白质分离

当表达的重组多肽分泌时，可以由生长培养基纯化多肽。优选在纯化多肽之前，从培养基中除去表达宿主细胞(如通过离心)。

当表达的重组多肽不从宿主细胞分泌时，优选裂解宿主细胞并将多肽释放到水“提取物”中，这是这种纯化技术的第一步。优选在细胞裂解之前，由培养基收集表达宿主细胞(如通过离心)。

可以通过常规技术诸如通过溶菌酶消化或通过高压处理细胞，进行细胞裂解。有关进一步描述这种细胞裂解技术，见Robert K.Scobes，Protein Purification，第2版，Springer-Verlag.

无论表达的重组多肽(或嵌合多肽)是否分泌，均可以使用分离和/或常规纯化方法和介质进行纯化。

可以使用硫酸铵沉淀和酸或离液剂提取来分离样品。示范性的纯化步骤包括羟磷灰石层析、大小排阻层析、FPLC层析和反相高效液相层析。合适的阴离子交换介质包括衍生化的葡聚糖、琼脂糖、纤维素、聚丙烯酰胺、特效硅土、等等。优选PEI、DEAE、QAE和Q衍生物，特别优选DEAE Fast-Flow Sepharose(Pharmacia，Piscataway)。示范性的层析介质包括用苯基、丁基、或辛基衍生的介质，诸如Phenyl-Sepharose FF(Pharmacia)、Toyopearl butyl 650(Toso Haas，Montgomeryville，PA)、Octyl-Sepharose(Pharmacia)等等；或聚丙烯酸树脂，诸如Amberchrom CG 71(Toso Haas)等等。合适的固体支持物包括玻璃珠、基于硅土的树脂、纤维素树脂、琼脂糖珠、交联琼脂糖珠、聚苯乙烯珠、交联聚丙烯酰胺树脂等等在将要使用的条件下不溶的支持物。这些支持物可以用能允许蛋白质以氨基、羧基、巯基、羟基和/或糖类部分附着的活性基团修饰。偶联化学的实例包括溴化氰活化、N-羟基琥珀酰亚胺活化、环氧化物活化、巯基活化、酰肼活化、和用于碳化二亚胺偶联化学的羧基和氨基衍生物。这些和其它固体介质在本领域广为人知并广泛使用，而且可以由商业供应商获得。

具体方法的选择是常规设计的内容，而且部分由选择的支持物的特性决定。见，例如，Affinity Chromatography：Principles &Methods，Pharmacia LKB Biotechnology，Uppsala，瑞典，1988。

本发明的多肽或它们的片段还可以通过化学合成制备。本发明的多肽可以是单体或多聚体；糖基化的或未糖基化的；PEG化或未PEG化；且可以包括或不包括起始甲硫氨酸氨基酸残基。

根据此处公开的序列信息，可以克隆编码本发明甘露聚糖酶并包含SEQ ID NO：1所示DNA序列(至少第94-990位所示DNA序列或者第94-1470位所示DNA序列)的全长DNA序列。同样的，可以克隆编码本发明的甘露聚糖酶并包含SEQ ID NO：5所示DNA序列(至少第94-1032位所示DNA序列或者第94-1482位所示DNA序列)的全长DNA序列；和编码本发明的甘露聚糖酶并包含SEQ ID NO：9所示DNA序列(至少第94-1086位所示DNA序列或者第94-1761位所DNA序列)的全长DNA序列；和编码本发明的甘露聚糖酶并包含SEQ ID NO：11所示DNA序列(至少第97-993位所示DNA序列)的全长DNA序列；和编码本发明的甘露聚糖酶并包含SEQ ID NO：13所示DNA序列(至少第498-1464位所DNA序列或者第64-1464位所示DNA序列)的全长DNA序列；和编码本发明的甘露聚糖酶并包含SEQ ID NO：15所示DNA序列(至少第204-1107位所示DNA序列或者第76-1107位所示DNA序列)的全长DNA序列；和部分编码本发明的甘露聚糖酶并包含SEQ ID NO：17所示DNA序列的DNA序列；和部分编码本发明的甘露聚糖酶并包含SEQ ID NO：19所示DNA序列的DNA序列；和编码本发明的甘露聚糖酶并包含SEQ ID NO：21所示DNA序列(至少第88-960位所示DNA序列)的全长DNA序列；和部分编码本发明的甘露聚糖酶并包含SEQ ID NO：23所示DNA序列的DNA序列；和编码本发明的甘露聚糖酶并包含SEQ ID NO：25所示DNA序列(至少第904-1875位所示DNA序列或者第88-2445位所示DNA序列)的全长DNA序列；和编码本发明的甘露聚糖酶并包含SEQ ID NO：27所示DNA序列(至少第498-1488位所DNA序列或者第112-1488位所示DNA序列)的全长DNA序列；和编码本发明的甘露聚糖酶并包含SEQ ID NO：29所示DNA序列(至少第79-1083位所示DNA序列)的全长DNA序列；和编码本发明的甘露聚糖酶并包含SEQ ID NO：31所示DNA序列(至少第1779-2709位所示DNA序列或者第67-2709位所示DNA序列)的全长DNA序列。

通过本领域已知的常规步骤进行克隆，诸如通过

■由芽孢杆菌菌株，尤其是芽孢杆菌I633、芽孢杆菌AAI12、芽孢杆菌AA349、Bacillus agaradhaerens、耐盐芽孢杆菌、Bacillusclausii和地衣芽孢杆菌的菌株，或由真菌菌株，尤其是Humicolainsolens菌株，制备基因组文库；

■将这种文库在合适的底物平板上铺板；

■通过常规杂交技术，使用基于SEQ ID NO：1、5、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31任何序列的探针，鉴定包含本发明的多核苷酸序列的克隆；或

■通过反向PCR策略，使用基于SEQ ID NO：1、5、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31的序列信息的引物，鉴定来自所述基因组文库的克隆。关于反向PCR的进一步细节，参考文献有M.J.McPherson等人，“PCR A practical approach”，InformationPress Ltd，牛津，英国。

根据此处公开的序列信息(SEQ ID NO：1、2、5、6、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32)，通过类似策略，使用来自有关微生物生物体的基因组文库，特别是来自芽孢杆菌属其它菌株诸如芽孢杆菌物种的嗜碱性物种或来自真菌菌株诸如腐质霉属物种的基因组文库，分离编码本发明同源甘露聚糖酶的同源多核苷酸序列，是本领域技术人员的常规工作。

或者，依照众所周知的步骤，根据可由下列任何菌株中存在的质粒得到的DNA序列制备人工合成的寡核苷酸探针：大肠杆菌DSM 12197、DSM 12180、DSM 12433、DSM 12441、DSM 9984、DSM 12432、DSM12436、DSM12846、DSM12847、DSM12848、DSM 12849、DSM12850、DSM12851和DSM 12852，使用这些寡核苷酸特征，可以方便的由合适来源诸如任何上文提及的生物体，克隆编码本发明的甘露聚糖或半乳甘露聚糖降解酶的DNA序列。

相应的，可以由大肠杆菌DSM 12197、DSM 12180、DSM 12433、DSM 12441、DSM 9984、DSM 12432、DSM12436、DSM12846、DSM12847、DSM12848、DSM 12849、DSM12850、DSM12851和DSM 12852中任何菌株，分离本发明的多核苷酸分子，其中含有如上所述通过克隆得到的质粒。还有，本发明涉及下列任何大肠杆菌菌株的分离的基本上纯的生物学培养物：DSM 12197、DSM 12180、DSM 12433、DSM 12441、DSM9984、DSM 12432、DSM12436、DSM12846、DSM12847、DSM12848、DSM12849、DSM12850、DSM12851和DSM12852。

在本文中，术语“酶制剂”意欲指：常规的酶发酵产物，来自微生物的单一物种，可能经分离和纯化，此制剂通常包含许多不同的酶活性；或单组分酶的混和物，优选使用常规重组技术由细菌或真菌物种得到的酶，所述酶已经发酵且可能个别经分离和纯化，而且可以来源于不同物种，优选真菌或细菌物种；或作为宿主细胞用于表达重组甘露聚糖酶，但同时产生其它酶，如果胶降解酶、蛋白酶、或纤维素酶(微生物天然产生的发酵产物)的微生物的发酵产物，即通过相应天然存在的微生物常规生产的酶复合物。

本发明的甘露聚糖酶制剂还可以包含一种或几种下列酶：蛋白酶、纤维素酶(内切-β-1，4-葡聚糖酶)、β-葡聚糖酶(内切-β-1，3(4)-葡聚糖酶)、脂酶、角质酶、过氧化物酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、半纤维素酶、果胶酸裂解酶(pectate lyase)、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonase)、果胶裂解酶、果胶甲酯酶、纤维二糖水解酶、转谷氨酰胺酶(transglutaminase)；或它们的混和物。在优选的实施方案中，制剂中的一种或几种或所有酶是使用重组技术生产的，即所述酶与其它酶混和形成期望的酶混和物制剂。

在另一个方面，本发明还涉及生产本发明酶制剂的方法，包括在允许酶产生的条件下培养能够产生甘露聚糖酶的微生物，如野生型菌株，和由培养物回收酶。可以使用常规发酵技术进行培养，如在摇瓶或发酵罐(搅拌以保证足够的通气)中在诱导甘露聚糖酶产生的生长培养基中进行培养。生长培养基可以含有常规N源诸如蛋白胨、酵母提取物或酪蛋白水解物，减量的常规C源诸如葡萄糖或蔗糖，和诱导剂诸如瓜尔胶(guar gum)或豆角胶(locust bean gum)。可以使用常规技术进行回收，如通过离心或过滤，将生物质与上清液分开，回收上清液或裂解细胞(如果感兴趣的酶在细胞内)，可能随后如EP 0406 314所述进行进一步纯化，或如WO97/15660所述进行结晶。

产生本发明酶或酶制剂的有用细菌的实例，是革兰氏阳性细菌，优选来自芽孢杆菌/乳杆菌亚门，优选芽孢杆菌属的菌株，更优选芽孢杆菌属之种的菌株。

在还有一个方面，本发明涉及具有上述特性，不含同源杂质，并使用常规重组技术生产的分离甘露聚糖酶。

免疫交叉反应

在测定免疫学交叉反应中将要使用的多克隆抗体，可以使用经纯化的甘露聚糖酶制备。更具体地说，可以根据N.Axelsen等人在AManual of Quantitative Immunoelectrophoresis，BlackwellScientific Publications，1973，第23章，或A.Johnstone和R.Thorpe，在Immunochemistry in Practice，Blackwell ScientificPublications，1982(更详细的第27-31页)中描述的步骤，通过免疫兔子(或其它啮齿类动物)制备针对本发明甘露聚糖酶的抗血清。可以由抗血清得到经纯化的免疫球蛋白，例如通过(NH₄)₂SO₄盐沉淀，随后进行透析和离子交换层析，例如在DEAE-Sephadex上进行。蛋白质的免疫化学定性分析可以通过Outcherlony双向扩散分析(double-diffusion analysis)(O.Ouchterlony，Handbook ofExperimental Immunology(D.M.Weir编)，Blackwell ScientificPublications，1967，第655-706页)，通过交叉免疫电泳(N.Axelsen等人，见上文，第3和4章)，或通过火箭免疫电泳(N.Axelsen等人，第2章)进行。

在洗涤剂工业中的使用

在另一个方面，本发明涉及包含本发明甘露聚糖酶或甘露聚糖酶制剂的洗涤剂组合物，涉及机械处理织物的工艺，包括在机械清洗工艺的清洗循环中用含本发明甘露聚糖酶或甘露聚糖酶制剂的清洗液处理织物，还涉及清洁组合物，包括清洗衣物、洗碗碟、硬表面清洁、个人清洁和口腔/牙齿清洁组合物，其中包含甘露聚糖酶，且任选含另选自下组的酶：纤维素酶、淀粉酶、果胶降解酶和木葡聚糖酶，并提供上佳的清洁性能，即有效清除污渍、清洁黑斑和维持洁白。

不囿于这种理论，相信本发明甘露聚糖酶能有效降解或水解含半乳甘露聚糖的任何污渍或斑点，因此能够清洁含有这种污渍或斑点的衣物。

本发明清洁组合物必须含有至少一种额外的洗涤剂组分。这些额外组分的具体性质和掺入水平取决于组合物的物理形态，以及它将使用的清洁操作的性质。

本发明清洁组合物优选还含有选自选定的表面活性剂、其它酶、助洗剂和/或漂白体系的洗涤剂成分。

本发明的清洁组合物可以是液体、膏状、凝胶、条状、片状、喷洗剂、泡沫、粉末或颗粒形式。颗粒组合物也可以是“致密”形式，而液体组合物也可以是“浓缩”形式。

本发明的组合物可以例如制成手洗和机洗碗碟组合物，手洗和机洗衣物洗涤剂组合物，包括衣物添加剂组合物和适用于脏织物浸泡和/或预处理的组合物，漂洗加入的织物柔软剂组合物，以及适用于一般性家庭硬表面清洁操作的组合物。含有这种糖酶的组合物也可制成卫生产品、隐形眼镜清洁剂以及健康和美容护理产品，如口腔/牙齿护理以及个人清洁组合物。

当配制成用于人工碗碟洗涤方法的组合物时，本发明的组合物优选含有表面活性剂，并优选含有选自有机聚合化合物、发泡剂、II族金属离子、溶剂、水溶助长剂和其它酶的其它去污化合物。

当配制成用于机洗衣物方法的组合物时，本发明的组合物优选含有表面活性剂和助洗剂化合物，并且额外含有一种或多种优选选自下述的去污成分：有机聚合化合物、漂白剂、其它酶、抑泡剂、分散剂、钙皂分散剂、污垢悬浮和防再污染剂以及防腐蚀剂。衣物洗涤剂组合物中还可以含有柔软剂作为额外的去污组分。含有糖酶的这种组合物在配制成衣物洗涤剂组合物时可以保证清洁织物，除去污渍、维持洁白、柔软化，保持颜色，抑制染料转移和卫生。

本发明的组合物还可以固体或液体形式的去污添加剂产品使用。这样的添加剂产品意图补充或增强常规洗涤剂组合物的性能，并可在洗涤过程的任何阶段加入。

需要的话，本文中衣物洗涤剂组合物的密度可以是在20℃测得为400-1200g/l，优选500-950g/l组合物。

本文中组合物的“致密”形式最好由密度反映，就组合物而言，由无机填充盐的量反映。无机填充盐是粉末状洗涤剂组合物中的常规成分。在常规洗涤剂组合物中，填充盐以显著量存在，通常为总组合物重量的17-35％。在致密组合物中，填充盐的存在量不超过总组合物重量的15％，优选不超过10％，更优选不超过5％。无机填充盐，例如在本发明组合物中所指，选自碱金属和碱土金属的硫酸盐和氯化物。

优选的填充盐是硫酸钠。

本发明的液体洗涤剂组合物也可以是“浓缩”形式。这时，本发明的液体洗涤剂组合物中将含有与常规液体洗涤剂相比更少量的水。通常浓缩液体洗涤剂中的水含量少于40％，优选少于30％，更优选少于20％(占洗涤剂组合物的重量百分比)。

清洁组合物

表面活性剂体系

本发明的清洁或洗涤剂组合物中含有表面活性剂体系，其中表面活性剂可以选自非离子型和/或阴离子型和/或阳离子型和/或两性型和/或两性离子型和/或半极性型表面活性剂。

表面活性剂一般以0.1-60％重量的量存在。优选将表面活性剂配制成与组合物中存在的酶组分和酶杂合体相容。在液体或凝胶组合物中，最优选将表面活性剂配制成能促进或至少是不降低这些组合物中的任何酶或酶杂合体的稳定性。

根据本发明使用的合适体系包括本文中所述的作为表面活性剂的一种或多种非离子和/或阴离子表面活性剂。

烷基酚的聚氧乙烯、聚氧丙烯和聚氧丁烯缩合物适合用作本发明表面活性剂体系的非离子表面活性剂，其中优选聚氧乙烯缩合物。这些化合物包括具有含约6-14个碳原子，优选约8-14个碳原子直链或支链构型之烷基的烷基酚与烯化氧的缩合产物。在优选的实施方案中，环氧乙烷存在的量等于每摩尔烷基酚约2-25摩尔，更优选约3-15摩尔的环氧乙烷。这类市售的非离子表面活性剂包括：由GAFCorporation销售的Igepal^TM CO-630；和均由Rohm & Haas Company销售的Triton^TM X-45、X-114、X-100和X-102。这些表面活性剂通常被称之为烷基酚烷氧基化物(例如，烷基酚乙氧基化物)。

伯和仲脂族醇与约1-25摩尔环氧乙烷的缩合物适合用作本发明的非离子表面活性剂。该脂族醇的烷基链可以是直链或支链的、伯或仲的，并且通常含有约8-22个碳原子。优选的是具有含约8-20个碳原子，更优选约10-18个碳原子烷基的醇与每摩尔醇约2-10摩尔环氧乙烷的缩合产物。所述的缩合产物中每摩尔醇有约2-7摩尔的环氧乙烷，最优选2-5摩尔的环氧乙烷。可从市场上购得的这类非离子表面活性剂的例子包括：由Union Carbide Corporation销售的Tergitol^TM15-S-9(C₁₁-C₁₅直链醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)和Tergitol^TM24-L-6 NMW(C₁₂-C₁₄伯醇与6摩尔环氧乙烷的窄分子量分布的缩合产物)；和由Shell Chemical Company销售的Neodol^TM45-9(C₁₄-C₁₅直链醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)、Neodol^TM23-3(C₁₂-C₁₃直链醇与3.0摩尔环氧乙烷的缩合产物)、Neodol^TM45-7(C₁₄-C₁₅直链醇与7摩尔环氧乙烷的缩合产物)、Neodol^TM-45-5(C₁₄-C₁₅直链醇与5摩尔环氧乙烷的缩合产物)；由Procter&Gamble Company销售的Kyro^TM EOB(C₁₃-C₁₅醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)；和由Hoechst销售的GenapolLA050(C₁₂-C₁₄醇与5摩尔环氧乙烷的缩合产物)。这些产物的HLB的优选范围是8-11，最优选8-10。

也可用作本发明表面活性剂体系的非离子表面活性剂是在US4565647中公开的烷基多糖，该多糖具有含约6-30，优选约10-16个碳原子的疏水基团和含约1.3-10，优选约1.3-3，最优选约1.3-2.7个糖单元的多糖如多糖苷亲水基团。可以使用任何含有5或6个碳原子的还原糖，例如，可以用葡萄糖、半乳糖和半乳糖基部分代替葡萄糖基部分(任选地，在2-，3-，4-等位连接该疏水基团从而得到与葡糖苷或半乳糖苷不同的葡萄糖或半乳糖)。该糖间键可以在，例如，附加糖单元的1位和前一糖单元的2-，3-，4-，和/或6-位之间。

优选的烷基多糖苷具有下式：

R²O(C_nH_2nO)_t(糖基)_x

其中R²选自：烷基、烷基苯基、羟基烷基、羟基烷基苯基、和其混合形式，其中烷基含有约10-18，优选约12-14个碳原子；n是2或3，优选2；t是0-约10，优选0；x是约1.3-10，优选约1.3-3，最优选约1.3-2.7。该糖基优选是从葡萄糖衍生的。为了制备这些化合物，先形成醇或烷基多乙氧基醇，然后与葡萄糖或葡萄糖源反应，从而形成葡糖苷(在1-位连接)。然后另外的糖基单元可以在其1-位置与前面的糖基单元2-，3-，4-，和/或6-位置，优选主要在2-位之间连接。

环氧乙烷与通过环氧丙烷与丙二醇缩合形成的疏水基之间的缩合产物也适合用作本发明的附加非离子表面活性剂体系。这些化合物的疏水部分的分子量优选为约1500-1800并显示出水不溶性。将聚氧乙烯部分加成到该疏水部分会增加整个分子的水溶性，在聚氧乙烯含量为该缩合产物总重量的约50％(相当于与多达约40摩尔的环氧乙烷缩合)时，仍能保持该产品的液体性质到这种水平。这类化合物的例子包括某些可从市场上购得的由BASF销售的Pluronic^TM表面活性剂。

也适合用作本发明非离子表面活性剂体系的非离子表面活性剂是环氧乙烷与从环氧丙烷和乙二胺反应得到的产物的缩合产物。这些产物的疏水部分由乙二胺和过量环氧丙烷的反应产物组成，并且分子量一般是约2500-3000。该疏水部分与环氧乙烷缩合，缩合程度为该缩合产物含有约40-80％重量的聚氧乙烯并且分子量为约5000-11000。这类非离子表面活性剂的例子包括某些可从市场上购得的由BASF销售的Tetronic^TM化合物。

优选用作本发明表面活性剂体系的非离子表面活性剂是：烷基酚的聚氧乙烯缩合物、伯和仲脂族醇与约1-25摩尔环氧乙烷的缩合产物、烷基多糖、和其混合物。最优选的是具有3-15个乙氧基的C₈-C₁₄烷基酚乙氧基化物和具有2-10个乙氧基的C₈-C₁₈(优选平均为C₁₀)醇乙氧基化物、和其混合物。

非常优选的非离子表面活性剂是下式的多羟基脂肪酸酰胺表面活性剂：

其中R¹是H，或R¹是C_1-4烃基、2-羟基乙基、2-羟基丙基或其混合形式，R²是C_5-31烃基，Z是具有直链烃基链、至少3个羟基直接连接到该链上的多羟基烃基，或其烷氧基化的衍生物。优选地，R¹是甲基，R²是直链C_11-15烷基或C_16-18烷基或链烯基链，例如椰油烷基，或其混合形式，Z是在还原性胺化反应中从还原糖如葡萄糖、果糖、麦芽糖或乳糖衍生的。

非常优选的阴离子表面活性剂包括烷基烷氧基化的硫酸盐表面活性剂。其例子是式RO(A)_mSO₃M的水溶性盐或酸，其中R是未取代的C₁₀-C₂₄烷基或具有C₁₀-C₂₄烷基部分的羟基烷基，优选C₁₂-C₂₀烷基或羟基烷基，更优选C₁₂-C₁₈烷基或羟基烷基，A是乙氧基或丙氧基单元，m大于0，一般为约0.5-6，更优选约0.5-3，M是H或阳离子，该阳离子可以是：例如金属阳离子(如钠、钾、锂、钙、镁等)、铵或取代铵阳离子。本文也涵盖烷基乙氧基化硫酸盐以及烷基丙氧基化硫酸盐。取代铵阳离子的具体例子包括：甲基、二甲基、三甲基铵阳离子和季铵阳离子如四甲基铵和二甲基哌啶鎓阳离子和从烷基胺如乙胺、二乙胺、三乙胺、其混合物衍生的那些阳离子等。举例说明的表面活性剂是：C₁₂-C₁₈烷基聚乙氧基化物(1.0)硫酸盐(C₁₂-C₁₈E(1.0)M)、C₁₂-C₁₈烷基聚乙氧基化物(2.25)硫酸盐(C₁₂-C₁₈E(2.25)M)、C₁₂-C₁₈烷基聚乙氧基化物(3.0)硫酸盐(C₁₂-C₁₈E(3.0)M)、C₁₂-C₁₈烷基聚乙氧基化物(4.0)硫酸盐(C₁₂-C₁₈E(4.0)M)，其中M方便地选自钠和钾。

适用的阴离子表面活性剂是烷基酯磺酸盐表面活性剂，包括按照“The Journal of the American Oil Chemists Society”，52(1975)，pp.323-329用气态SO₃磺化的C₈-C₂₀羧酸(即脂肪酸)的直链酯。合适的材料包括从牛脂、棕榈油等衍生的天然脂类物质。

优选的烷基酯磺酸盐表面活性剂(尤其是用于洗衣用途的)包括下面结构式的烷基酯磺酸盐表面活性剂：

其中R³是C₈-C₂₀烃基，优选烷基，或其组合，R⁴是C₁-C₆烃基，优选烷基，或其组合，M是与烷基酯磺酸根形成水溶性盐的阳离子。合适的成盐阳离子包括金属阳离子(如钠、钾和锂)和取代或未取代的铵阳离子(例如单乙醇胺、二乙醇胺、和三乙醇胺)。优选地，R³是C₁₀-C₁₆烷基，R⁴是甲基、乙基或异丙基。特别优选的是甲基酯磺酸盐，其中R³是C₁₀-C₁₆烷基。

其它合适的阴离子表面活性剂包括：烷基硫酸盐表面活性剂，它们是式ROSO₃M的水溶性盐或酸，其中R优选是C₁₀-C₂₄烃基，优选具有C₁₀-C₂₀烷基部分的烷基或羟基烷基，更优选C₁₂-C₁₈烷基或羟基烷基，M是H或阳离子，例如碱金属阳离子(如钠、钾、锂)，或者铵或取代铵(如甲基、二甲基和三甲基铵阳离子，和季铵阳离子例如四甲基铵和二甲基哌啶鎓阳离子，和从烷基胺例如乙胺、二乙胺、三乙胺和其混合形式衍生的季铵阳离子)等。一般地，对于较低的洗涤温度(例如低于约50℃)，C₁₂-C₁₆烷基链是优选的，而对于较高的洗涤温度(例如高于约50℃)，C₁₆-C₁₈烷基链是优选的。

其它对洗涤目的有用的阴离子表面活性剂也可以包括在本发明的衣物洗涤组合物中。它们可以包括：皂的盐(包括，例如钠、钾、铵、和取代的铵如单、二和三乙醇胺盐)、C₈-C₂₂伯或仲烷烃磺酸盐、C₈-C₂₄烯烃磺酸盐、通过碱土金属柠檬酸盐热解产物的磺化制备的磺化多羧酸(例如在英国专利说明书号1082179中所述的)、C₈-C₂₄烷基聚二醇醚硫酸盐(含有多达10摩尔的环氧乙烷)；烷基甘油磺酸盐、脂肪酰基甘油磺酸盐、脂肪油基甘油硫酸盐、烷基酚氧乙烯醚硫酸盐、石蜡烃磺酸盐、烷基磷酸盐、羟乙磺酸盐如酰基羟乙磺酸盐、N-酰基牛磺酸盐、烷基琥珀酰胺酸盐和磺基琥珀酸盐、磺基琥珀酸的单酯(特别是饱和和不饱和C₁₂-C₁₈单酯)和磺基琥珀酸的二酯(特别是饱和和不饱和C₆-C₁₂二酯)、酰基肌氨酸盐、烷基多糖的硫酸盐例如烷基多葡糖苷(下面所述的非离子型非硫酸化的化合物)的硫酸盐、支链伯烷基硫酸盐、和烷基多乙氧基羧酸盐例如那些式RO(CH₂CH₂O)_k-CH₂COO^-M⁺的盐，其中R是C₈-C₂₂烷基，k是1-10的整数，M是形成可溶性盐的阳离子。树脂酸及氢化的树脂酸也是合适的，例如松香、氢化松香，以及存在于或衍生于松浆油的树脂酸和氢化树脂酸。

烷基苯磺酸盐是非常优选的。特别优选的是线性(直链)烷基苯磺酸盐(LAS)，其中该烷基优选含有10-18个碳原子。

其它例子描述于“Surface Active Agents and Detergents”(Vol.I and II，Schwartz，Perry and Berch)中。各种这样的表面活性剂也一般性地公开于US3929678中(第23栏58行-第29栏23行，该文献引入本文作为参考)。

当包括在其中时，本发明的衣物洗涤组合物一般含有约1-40％，优选约3-20％重量的这种阴离子表面活性剂。

本发明的清洁或衣物洗涤组合物也可以含有阳离子、两性、两性离子和半极性表面活性剂，以及上文中并未述及的非离子和/或阴离子表面活性剂。

适用于本发明衣物洗涤组合物中的阳离子洗涤表面活性剂是具有一个长链烃基的那些表面活性剂。这样的阳离子表面活性剂的例子包括铵表面活性剂例如烷基三甲基铵卤化物，和具有下式的那些表面活性剂：

[R²(OR³)_y][R⁴(OR³)_y]₂R⁵N+X-

其中R²是在烷基链中具有约8-18个碳原子的烷基或烷基苄基，每个R³选自：-CH₂CH₂-、-CH₂CH(CH₃)-、-CH₂CH(CH₂OH)-、-CH₂CH₂GH₂-、和其混合形式；每个R⁴选自：C₁-C₄烷基、C₁-C₄羟基烷基、由两个R⁴基团连接在一起形成的苄基环结构、-GH₂CHOHGHOHGOR⁶CHOHGH₂OH(其中R⁶是任何己糖或分子量低于约1000的己糖聚合物，并且当y不是0时是氢)；R⁵与R⁴所述相同或是烷基链，其中R²+R⁵的总碳原子数不大于约18；每个y是0-约10，且该y值的和是0至约15；X是任何相容的阴离子。

非常优选的阳离子表面活性剂是具有下式的、在本发明组合物中有用的水溶性季铵盐化合物：

R₁R₂R₃R₄N⁺X^-(i)

其中R₁是C₈-C₁₆烷基，每个R₂、R₃和R₄各自独立地是C₁-C₄烷基、C₁-C₄羟基烷基、苄基和-(C₂H₄O)_xH(其中x的值为2-5)，X是阴离子。R₂、R₃、R₄中不多于1个是苄基。

R₁的优选烷基链长度是C₁₂-C₁₅，当该烷基是从椰油或棕榈仁脂衍生的链长度的混合物，或是通过烯烃合成或OXO醇合成而合成衍生的时尤为如此。

用于R₂、R₃和R₄的优选基团是甲基和羟基乙基，阴离子X可以选自：卤素离子、甲基硫酸根(methosulphate)、醋酸根和磷酸根离子。

用于本文中的合适的式(I)季铵化合物的例子是：

氯化或溴化椰油基三甲基铵；

氯化或溴化椰油基甲基二羟基乙基铵；

氯化癸基三乙基铵；

氯化或溴化癸基二甲基羟基乙基铵；

氯化或溴化C_12-15二甲基羟基乙基铵；

氯化或溴化椰油基二甲基羟基乙基铵；

甲基硫酸肉豆蔻基三甲基铵；

氯化或溴化月桂基二甲基苄基铵；

氯化或溴化月桂基二甲基(乙氧基)₄铵；

胆碱酯(式(i)的化合物，其中R₁是

烷基，R₂、R₃、R₄是甲基)。

二烷基咪唑啉[式(i)的化合物]。

其它在本文中有用的阳离子表面活性剂也描述于US4228044和EP000224中。

当包括在其中时，本发明的衣物洗涤组合物一般含有约0.2-25％，优选约1-8％重量的这种阳离子表面活性剂。

两性表面活性剂也适用于本发明的衣物洗涤组合物中。这些表面活性剂可以概括地描述为仲或叔胺的脂族衍生物，或杂环仲和叔胺的脂族衍生物，其中脂族基团可以是直链或支链的。其中1个脂族取代基含有至少约8个碳原子，一般约8-18个碳原子，并且至少一个脂族取代基含有阴离子型水增溶性基团，例如羧基、磺酸根、硫酸根。见US3929678(第19栏18-35行)的两性表面活性剂的例子。

当包括在其中时，本发明的衣物洗涤组合物一般含有约0.2-15％重量，优选约1-10％重量的上述两性表面活性剂。

两性离子表面活性剂也适用于本发明的衣物洗涤组合物中。这些表面活性剂可以概括地描述为仲和叔胺的衍生物，杂环的仲和叔胺的衍生物，或者季铵、季鏻或叔锍化合物的衍生物。见US3929678(第19栏38行-22栏48行)的两性离子表面活性剂的例子。

当包括在其中时，本发明的衣物洗涤组合物一般含有约0.2-15％重量，优选约1-10％重量的上述两性离子表面活性剂。

半极性非离子表面活性剂是一特殊类型的非离子表面活性剂，它们包括：含有1个约10-18个碳原子的烷基部分和选自含有约1-3个碳原子的烷基或羟基烷基的2个部分的水溶性氧化胺；含有1个约10-18个碳原子的烷基部分和选自含有约1-3个碳原子的烷基或羟基烷基的2个部分的水溶性氧化膦；和含有1个约10-18个碳原子的烷基部分和1个选自含有约1-3个碳原子的烷基或羟基烷基的部分的水溶性亚砜。

半极性非离子表面活性剂包括具有下式的氧化胺表面活性剂：

其中R³是含有约8-22个碳原子的烷基、羟基烷基、或烷基苯基，或其混合形式；R⁴是含有约2-3个碳原子的亚烷基或羟基亚烷基或其混合形式；x是0-约3；每个R⁵是含有约1-3个碳原子的烷基或羟基烷基，或含有约1-3个氧乙烯基团的多氧乙烯基。R⁵基团可以彼此连接，例如通过氧或氮原子，从而形成环结构。

特别地，这些氧化胺表面活性剂包括氧化C₁₀-C₁₈烷基二甲基胺和氧化C₈-C₁₂烷氧基乙基二羟基乙基胺。

当包括在其中时，本发明的衣物洗涤组合物一般含有约0.2-15％重量，优选约1-10％重量的上述半极性非离子表面活性剂。

助洗剂体系

本发明的组合物还可含有助洗剂体系。任何常规助洗剂体系都适用于本文中，其包括硅铝酸盐材料、硅酸盐、多羧酸盐和脂肪酸、诸如乙二胺四乙酸盐的材料、金属离子螯合剂例如氨基多膦酸盐特别是乙二胺四亚甲基膦酸和二亚乙基三胺五亚甲基膦酸。尽管由于明显的环境原因并不优选，但本文中也可以使用磷酸盐助洗剂。

合适的助洗剂可以是无机离子交换材料，通常是无机水合的硅铝酸盐材料，更具体地是水合的合成沸石，例如水合的沸石A、X、B、HS或MAP。

另一种合适的无机助洗剂材料是层状硅酸盐例如SKS-6(Hoechst)。SKS-6是由硅酸钠(Na₂Si₂O₅)组成的结晶层状硅酸盐。

合适的含有1个羧基的多羧酸盐包括：乳酸、乙醇酸和其醚衍生物，如在比利时专利号831368、821369和821370中所公开的。含有2个羧基的多羧酸盐包括：琥珀酸、丙二酸、(亚乙二氧基)二乙酸、马来酸、二甘醇酸、酒石酸、丙醇二酸和富马酸的水溶性盐，以及在德国专利2446686和2446487及US3935257中所述的醚羧酸盐，和在比利时专利号840623中所述的亚硫酰基羧酸盐。含有3个羧基的多羧酸盐具体地包括水溶性柠檬酸盐、乌头酸盐(aconitrate)和柠康酸盐以及琥珀酸盐衍生物，例如，在英国专利号1379241中所述的羧基甲基氧基琥珀酸盐，在荷兰申请7205873中所述的乳氧琥珀酸盐(lactoxysuccinate)，和氧多羧酸盐材料例如在英国专利号1387447中所述的2-氧杂-1，1，3-丙三羧酸盐。

含有4个羧基的多羧酸盐包括：在英国专利号1261829中公开的氧联二琥珀酸盐、1，1，2，2-乙四羧酸盐、1，1，3，3-丙四羧酸盐和1，1，2，3-丙四羧酸盐。含有磺基取代基的多羧酸盐包括：在英国专利号1398421和1398422和US3936448中公开的磺基琥珀酸盐衍生物、和在英国专利号1082179中所述的磺化的热解柠檬酸盐，而英国专利号1439000中公开了含有膦取代基的多羧酸盐。

脂环和杂环多羧酸盐包括：环戊烷-顺，顺，顺-四羧酸盐、环戊二烯五羧酸盐(cyclopentadienide pentacarboxylate)、2，3，4，5-四氢呋喃-顺，顺，顺-四羧酸盐、2，5-四氢呋喃-顺-二羧酸盐、2，2，5，5-四氢呋喃-四羧酸盐、1，2，3，4，5，6-己烷-六羧酸盐和多元醇(例如山梨醇、甘露糖醇和木糖醇)的羧甲基衍生物。芳香族多羧酸盐包括：苯六甲酸、1，2，4，5，-苯四酸和在英国专利号1425343中公开的苯二甲酸衍生物。

在上面的多羧酸盐中，优选的多羧酸盐是每分子含有最多达3个羧基的羟基羧酸盐，更具体地是柠檬酸盐。

用于本发明组合物中的优选的助洗剂体系包括水不溶性硅铝酸盐助洗剂例如沸石A或层状硅酸盐(SKS-6)的混合物，以及水溶性羧酸螯合剂例如柠檬酸。

包括在本发明洗涤组合物中的合适的螯合剂包括：乙二胺-N，N’-二琥珀酸(EDDS)或其碱金属、碱土金属、铵或取代铵盐，或其混合物。优选的EDDS化合物是游离酸形式的和其钠或镁盐。这样的优选EDDS钠盐的例子包括Na₂EDDS和Na₄EDDS。这样的优选EDDS镁盐的例子包括MgEDDS和Mg₂EDDS。镁盐是最优选包括在本发明组合物中的。

优选的助洗剂体系包括水不溶性硅铝酸盐助洗剂例如沸石A和水溶性羧酸螯合剂例如柠檬酸的混合物。

可以形成用于粒状组合物的助洗剂体系中一部分的其它助洗剂材料包括：无机材料例如碱金属碳酸盐、碳酸氢盐、硅酸盐，和有机材料例如有机膦酸盐、氨基多亚烷基膦酸盐和氨基多羧酸盐。

其它合适的水溶性有机盐是均聚或共聚的酸或其盐，其中该多羧酸包括两两之间被不多于2个碳原子分开的至少两个羧基。

这类聚合物公开于GB-A-1596756中。这样的盐的例子是MW2000-5000的聚丙烯酸盐和其与马来酸酐的共聚物，这样的共聚物具有20000-70000，特别是约40000的分子量。

洗涤助洗剂盐的量通常为组合物重量的5-80％。用于液体洗涤剂的助洗剂的优选量是5-30％。

酶

根据本发明，将甘露聚糖酶掺入到清洁或洗涤剂组合物中，优选的含量是0.0001％-2％，更优选0.0005％-0.5％，最优选0.001-0.1％(纯酶占组合物的重量百分比)。

本发明的清洁组合物还可以包含选自下组的糖酶作为必需成分：纤维素酶、淀粉酶、果胶降解酶和木葡聚糖酶。本发明的清洁组合物优选包含甘露聚糖酶、淀粉酶和选自下组的另一种生物洗涤类酶：纤维素酶、果胶降解酶和木葡聚糖酶。

在本发明中可使用的纤维素酶包括细菌的和真菌的纤维素酶。优选它们的最适pH在pH5-12之间，比活性超过50CEVU/mg(CelluloseViscosity Unit，纤维素粘度单位)的特效活性。合适的纤维素酶公开于美国专利4,435,307，J61078384和WO96/02653，这些文献分别公开了由Humicola insolens、木霉属(Trichoderma)、梭孢壳属(Thielavia)和孢子丝菌属(Sporotrichum)产生的真菌纤维素酶。EP 739 982描述了由新的芽孢杆菌物种分离得到的纤维素酶。合适的纤维素酶还公开于GB-A-2075028、GB-A-2095275、DE-OS-22 47 832和WO95/26398。

这些纤维素酶的实例是由Humicola insolens(Humicolainsolens var.thermoidea)菌株，特别是Humicola insolens菌株DSM 1800产生的纤维素酶，其它合适的纤维素酶是起源于Humicolainsolens、分子量大约50kD、等电点5.5、含有415个氨基酸的纤维素酶；和得自Humicola insolens DSM 1800的、大约43kD的内切-β-1，4-葡聚糖酶；优选的纤维素酶具有公开于PCT专利申请号WO91/17243的氨基酸序列。同样，合适的纤维素酶是WO94/21801中描述的、长柄木霉(Trichoderma Longibrachiatum)的EGIII纤维素酶。特别合适的纤维素酶是具有颜色护理优势的纤维素酶。这些纤维素酶的实例是描述于WO96/29397、EP-A-0495257、WO91/17243、WO91/17244和WO91/21801的纤维素酶。其它适合于织物护理和/或清洁的纤维素酶描述于WO96/34092、WO96/17994和WO95/24471。

所述纤维素酶通常以0.0001％-2％纯酶的量(占洗涤剂组合物的重量百分比)掺入到洗涤剂组合物中。

用于本发明的优选纤维素酶是碱性纤维素酶，即在pH范围7-12具有最大活性的至少25％、更优选至少40％的酶。更优选的纤维素酶是在pH范围7-12具有最大活性的酶。优选的碱性纤维素酶是NovoNordisk A/S出售的商品名的纤维素酶。

可以包括(α和/或β)淀粉酶，用于除去基于糖类污渍。NovoNordisk A/S公开于1994年2月3日的WO94/02597，描述了掺入突变淀粉酶的清洁组合物。同样，见Novo Nordisk A/S公开于1995年4月20日的WO95/10603。已知用于清洁组合物的其它淀粉酶包括α-和β-淀粉酶。α-淀粉酶本领域是知道的，包括描述于美国专利号5,003,257、EP 252 666、WO91/00353、FR 2,676,456、EP 285 123、EP 525 610、EP 368 341、和英国专利说明书1,296,839(Novo)的那些α-淀粉酶。其它合适的淀粉酶是描述于1994年8月18日公开的WO94/18314和1996年2月22日公开的WO96/05295(Genencor)的稳定性增强的淀粉酶和具有额外修饰的淀粉酶突变体，其直接亲本可以由Novo Nordisk A/S获得，具体描述于1995年4月公开的WO95/10603。同样合适的淀粉酶描述于EP 277 216、WO95/26397和WO96/23873(都属于Novo Nordisk)。

商业性α-淀粉酶产品的实例是Genencor的Purafect Ox和Novo Nordisk A/S Denmark(丹麦)的和WO95/26397描述了其它合适的淀粉酶，特征为：在温度范围25℃-55℃和pH值范围8-10内，其比活性比的比活性高至少25％的α-淀粉酶(通过α-淀粉酶活性实验测量)。合适的淀粉酶是描述于WO96/23873(Novo Nordisk)的上述酶的突变体。其它具有改进特性(关于活性水平和热稳定性与更高活性水平的组合)的分解淀粉的酶描述于WO95/35382。

用于本发明的优选淀粉酶是以商品名Termamyl、Duramyl和Maxamyl出售的淀粉酶和/或作为WO96/23873的SEQ ID NO：2公开的、具有增强的热稳定性的α-淀粉酶变体。

用于特殊应用的优选淀粉酶是碱性淀粉酶，即在pH范围7-12具有最大活性的至少10％，优选至少25％，更优选至少40％酶活性的酶。更优选的淀粉酶是在pH范围7-12具有最大活性的酶。

将分解淀粉的酶掺入到本发明的洗涤剂组合物中，掺入量为0.0001％-2％，优选0.00018％-0.06％，更优选0.00024％-0.048％(纯酶占组合物的重量百分比)。

术语“果胶降解酶”意欲包括阿拉伯聚糖酶(EC 3.2.1.99)、半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)、聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)、外切聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67)、外切聚-α-半乳糖醛酸糖苷酶(exo-poly-alpha-galacturonidase)(EC 3.2.1.82)、果胶裂解酶(EC 4.2.2.10)、果胶酯酶(EC 3.2.1.11)、果胶裂解酶(EC 4.2.2.2)、外切聚半乳糖醛酸裂解酶(exo-polygalacturonate lyase)(EC4.2.2.9)和半纤维素酶诸如内切-1，3-β-木糖苷酶(EC 3.2.1.32)、木聚糖-1，4，-β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)。果胶降解酶是上述酶活性的天然混和物。果胶酶由此包括水解果胶甲酯键的果胶甲酯酶、切开半乳糖醛酸分子间的糖苷键的聚半乳糖醛酸酶、和作用于果胶酸致使α-1→4糖苷键非水解断裂形成半乳糖醛酸的不饱和衍生物的果胶酸裂解酶或裂解酶。

将果胶降解酶掺入到本发明组合物中，其掺入量为0.0001％-2％，更优选0.0005％-0.5％，最优选0.001％-0.1％(纯酶占总组合物的重量百分比)。

用于特殊应用的优选的果胶降解酶是碱性果胶降解酶，即在pH范围7-12，具有最大活性的至少10％，优选至少25％，更优选40％酶活性的酶。更优选的果胶降解酶是在pH范围7-12具有最大活性的酶。碱性果胶降解酶是由嗜碱性微生物产生的，例如细菌、真菌和酵母微生物，诸如芽孢杆菌属的种。优选的微生物是描述于JP 56131376和JP 56068393的坚硬芽孢杆菌、环状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。碱性果胶分解酶包括半乳糖醛酸聚糖-1，4-α-半乳糖醛酸酶(galacturan-1，4-α-galacturonase)(EC 3.2.1.67)、聚-半乳糖醛酸酶活性(EC 3.2.1.15)、果胶酯酶(EC 3.1.1.11)、果胶裂解酶(EC 4.2.2.2)和它们的同工酶，它们可以由欧文氏菌属的种产生。优选的是JP 59066588、JP 63042988和World J.Microbiol.Microbiotechnol.(1992，8，2，115-120)描述的菊欧文氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、解淀粉欧文氏菌、草生欧文氏菌、溶解欧文氏菌。所述碱性果胶酶还可以由JP 73006557和Agr.Biol.Chem.(1972，36，2，285-293)公开的芽孢杆菌属的种产生。

术语木葡聚糖酶包括Wageningen大学的Vincken和Voragen描述的酶家族(Vincken等人(1994)Plant Physiol.，104，99-107)，而且如Hayashi等人(1989)Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，40，139-168描述的，能够降解木葡聚糖。Vincken等人证明了用由绿色木霉纯化的木葡聚糖酶(内切-IV-葡聚糖酶)能够从分离的苹果细胞壁纤维素中除去木葡聚糖外衣。该酶增强了细胞壁包埋的纤维素的酶促降解，并与果胶酶协同作用。购自Gist-Brocades的Rapidase LIQ+含有木葡聚糖酶活性。

将这种木葡聚糖酶掺入到本发明清洁组合物中，优选掺入量为0.0001％-2％，更优选0.0005％-0.5％，最优选0.001％-0.1％(纯酶占组合物的重量百分比)。

用于特殊应用的优选木葡聚糖酶是碱性木葡聚糖酶，即在pH范围7-12具有最大活性的至少10％，优选至少25％，更优选至少40％酶活性的酶。更优选的木葡聚糖酶是在pH范围7-12具有最大活性的酶。

上述酶可以来自任何合适的来源，诸如植物、动物、细菌、真菌和酵母来源。该来源还可以是嗜温的或嗜极端的(嗜冷、嗜寒(psychrotrophic)、嗜热、嗜压、嗜碱、嗜酸、嗜盐、等等)。可以以纯化或未纯化形式使用这些酶。现在，通过蛋白质/基因工程技术修饰野生型酶，以优化它们在本发明清洁组合物中的性能，已经是普通实践。例如，可以设计与酶经常遭遇的这些组合物成分的相容性增加的突变体。或者，可以设计最适pH、漂白或螯合稳定性、催化活性等等适合特殊清洁应用的酶突变体。

特别的，在漂白稳定性中，注意力应当集中在对氧化敏感的氨基酸上，而对于表面活性剂相容性，则应集中在表面电荷上。这些酶的等电点可以通过一些带电氨基酸的取代改变，例如等电点的升高可能对改进与阴离子表面活性剂的相容性有帮助。酶的稳定性还可以通过例如产生额外的盐桥和加强金属结合位点以提高螯合稳定性而增强。

漂白剂

可以包括在本发明洗涤组合物中的附加的任选洗涤组分包括漂白剂，例如粒径为400-800微米的PB1、PB4和过碳酸盐。这些漂白剂组分可以包括一种或多种氧漂白剂，并且根据所选择的漂白剂，可包括一种或多种漂白活化剂。当存在氧漂白化合物时，其存在的量一般是约1-25％。通常，在非液体配方例如粒状洗涤剂中，漂白化合物是任选加入的组分。

用于本文中的漂白剂组分可以是任何在洗涤组合物中有用的漂白剂，包括氧漂白剂以及本领域已知的其它漂白剂。

适合于本发明的漂白剂可以是活化的或未活化的漂白剂。

一类可以使用的氧漂白剂包括过羧酸漂白剂和其盐。这类试剂的合适的例子包括：单过氧邻苯二甲酸镁六水合物，间氯过苯甲酸的镁盐、4-壬氨基-4-氧代过氧丁酸和双过氧十二烷双酸。这样的漂白剂公开于US4483781、US740446、EP0133354和US4412934中。非常优选的漂白剂也包括如在US4634551所述的6-壬氨基-6-氧代过氧己酸。

另一类可以使用的漂白剂包括卤素漂白剂。例如，次卤酸漂白剂的例子包括三氯异氰脲酸，以及二氯异氰脲酸的钠和钾盐，和N-氯代和N-溴代烷烃磺基酰胺。这样的材料通常以最终产品重量的0.5-10％、优选1-5％的量加入。

可以将过氧化氢释放剂与漂白活化剂一起使用，该漂白活化剂是：例如四乙酰基乙二胺(TAED)、壬酰氧基苯磺酸盐(NOBS，描述于US4412934中)、3，5-三甲基己酰氧基苯磺酸盐(ISONOBS，描述于EP120591中)或五乙酰基葡萄糖(PAG)；它们过水解后能形成过氧酸作为活性漂白物质，导致改进的漂白作用。另外，非常合适的是这些漂白活化剂：C₈(6-辛酰胺基己酰基)羟苯磺酸盐、C₉(6-壬酰胺基己酰基)羟苯磺酸盐和C₁₀(6-癸酰胺基己酰基)羟苯磺酸盐或其混合物。还合适的活化剂是酰化的柠檬酸酯，例如在欧洲专利申请号91870207.7所公开的。

可用于本发明清洗组合物中的有用的漂白剂，包括过氧酸和含有漂白活化剂和过氧漂白化合物的漂白体系描述于专利申请USSN08/136626中。

通过在洗涤和/或漂洗过程的开始或期间加入能够生成过氧化氢的酶体系(即酶和其底物)，也可以存在过氧化氢。这样的酶体系公开于欧洲专利申请EP0537381中。

除了氧漂白剂以外的漂白剂也是本领域已知的，并且可以在本文中使用。特别重要的一类非氧漂白剂包括光活化漂白剂，例如磺化的锌和/或铝酞菁。这些材料可以在洗涤期间沉积在被洗物上。当存在氧时用光照射，例如通过将衣服挂出在日光中干燥时，该磺化的锌酞菁被活化，结果该被洗物被漂白。优选的锌酞菁和光活化漂白方法描述于US4033718中。洗涤剂组合物一般含有约0.025-1.25％重量的磺化锌酞菁。

漂白剂也可以包括锰催化剂。锰催化剂可以是例如在“低温漂白的有效锰催化剂(Efficient manganese catalysts forlow-temperature bleaching)”，自然369，1994，pp.637-639中所述的一种化合物。

抑泡剂

另一个任选的组分是抑泡剂，例如硅氧烷和硅石-硅氧烷混合物。硅氧烷通常可以用烷基化的聚硅氧烷材料来表示，而硅石一般以细分散形式使用，例如二氧化硅气凝胶和干凝胶和各种类型的疏水二氧化硅。这些材料可以作为颗粒加入，其中抑泡剂有利地可释放地掺入到水溶性或水分散性的、基本上无表面活性的洗涤剂不可渗透的载体中。另外，可以将抑泡剂溶解或分散在液体载体中并通过喷雾在一种或多种其它组分上来涂覆。

优选的硅氧烷抑泡剂公开于US3933672中。其它特别有用的抑泡剂是德国专利申请DTOS2646126中所述的自乳化硅氧烷抑泡剂。这样的化合物的例子是可从Dow Corning购得的DC-544，它是硅氧烷-二元醇共聚物。特别优选的抑泡剂是含有硅油和2-烷基-链烷醇混合物的抑泡剂体系。合适的2-烷基-链烷醇是以商品名Isofol 12 R购得的2-丁基-辛醇。

这样的抑泡剂体系公开于欧洲专利申请EPO593841中。

特别优选的硅氧烷泡沫控制剂描述于欧洲专利申请92201649.8中。所述的组合物可以含有硅氧烷/硅石混合物以及熏制的无孔硅石例如Aerosil^R。

按组合物重量计，通常以0.001-2％，优选0.01-1％的量使用上述的抑泡剂。

其它组分

可以在洗涤组合物中使用的其它组分有例如污垢悬浮剂、污垢除去剂、荧光增白剂、磨料、杀菌剂、变色抑制剂、着色剂和/或包覆或未包覆的香料。

特别合适的包覆材料是由多糖基质和多羟基化合物组成的水溶性胶囊，如在GB 1464616中所述的。

其它合适的水溶性包覆材料包括从取代二羧酸的未凝胶化淀粉酸酯衍生的糊精，例如在US3455838中所述的。这些酸酯糊精优选是从诸如蜡质玉米、蜡质高粱、西米、木薯和马铃薯的淀粉制备的。所述的包覆材料的合适例子包括由National Starch制造的N-Lok。该N-Lok包覆材料由改性的玉米淀粉和葡萄糖组成。该淀粉是通过单官能取代基例如辛烯基琥珀酸酐的加成改性的。

适合于本文中的防再污染剂和污垢悬浮剂包括纤维素衍生物，例如甲基纤维素、羧甲基纤维素和羟乙基纤维素，和均聚或共聚的聚羧酸或其盐。这类聚合物包括上述作为助洗剂提到的聚丙烯酸盐和马来酸酐-丙烯酸共聚物，以及马来酸酐与乙烯、甲基乙烯基醚或甲基丙烯酸的共聚物，其中马来酸酐至少构成共聚物的20％摩尔。按组合物重量计，这些材料通常以组合物重量的0.5-10％，更优选0.75-8％，最优选1-6％的量使用。

优选的荧光增白剂是阴离子性的，其例子是：4，4’-双-(2-双乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2：2’-二磺酸二钠盐、4，4’-双-(2-吗啉代-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2：2’-二磺酸二钠、4，4’-双-(2，4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2：2’-二磺酸二钠、4’，4”-双-(2，4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2-磺酸一钠、4，4’-双-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羟乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2：2’-二磺酸二钠、4，4’-双-(4-苯基-2，1，3-三唑-2-基)芪-2：2’-二磺酸二钠、4，4’-双-(2-苯胺基-4-(1-甲基-2-羟乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2：2’-二磺酸二钠、2(芪基-4”-(萘并-1’，2’：4，5)-1，2，3-三唑-2”-磺酸钠和4，4’-双-(2-磺基苯乙烯基)联苯。

其它有用的聚合物材料是聚乙二醇，特别是分子量为1000-10000，更具体是2000-8000和最优选是约4000的那些。以0.20-5％重量，更优选0.25-2.5％重量的量使用这些聚合物材料。这些聚合物和上述均聚或共聚的聚羧酸盐对于存在过渡金属杂质时改进白度维持性，织物灰分沉积和对粘土、蛋白质性和可氧化性污垢的清洗性能是很有价值的。

在本发明组合物中有用的污垢除去剂是对苯二甲酸与乙二醇和/或丙二醇单元各种排列的常规共聚物或三元共聚物。这样的聚合物的例子公开于US4116885和US4711730及EP0272033中。根据EP0272033特别优选的聚合物具有下式：

(CH₃(PEG)₄₃)_0.75(POH)_0.25[(T-PO)_2.8(T-PEG)_0.4]T(POH)_0.25((PEG)₄₃CH₃)_0.75

其中PEG是-(OC₂H₄)O-，PO是(OC₃H₆O)，T是(pOOC₆H₄CO)。

还非常有用的是作为对苯二甲酸二甲酯、磺基间苯二酸二甲酯、乙二醇和1，2-丙二醇无规共聚物的改性聚酯，其端基主要由磺基苯甲酸酯组成，还有一小部分是乙二醇和/或1，2-丙二醇的单酯。目的是“主要”得到在两端由磺基苯甲酸基团封端的聚合物，绝大多数本文所述共聚物是由磺基苯甲酸基团封端的。然而，某些共聚物并未完全封端，因此其端基可以由乙二醇和/或1，2-丙二醇的单酯组成，其“次要”地由这样的物质组成。

本文中选择的聚酯含有约46％重量的二甲基对苯二甲酸，约16％重量的1，2-丙二醇，约10％重量的乙二醇，约13％重量的二甲基磺基苯甲酸和约15％重量的磺基间苯二酸，并且其分子量为约3000。该聚酯和其制备方法详细地叙述于EP311342中。

柔软剂

可以将织物柔软剂加入到本发明的衣物洗涤组合物中。这些试剂在类型上可以是无机或有机的。无机柔软剂的例子是在GB-A-1400898和US5019292中公开的绿土粘土。有机的织物柔软剂包括如在GB-A-1514276和EP 0011340中公开的水不溶性叔胺，其与单C₁₂-C₁₄季胺盐的混合物(公开于EP-B 0026528中)，和如在EP 0242919中所公开的二长链酰胺。织物柔软剂体系的其它有用有机组分包括高分子量的聚氧乙烯材料，如在EP 0299575和0313146中所公开的。

绿土粘土的含量一般在5-15％重量的范围，更优选8-12％重量，作为干混合组分材料加入到配方的其余部分中。以0.5-5％重量，一般1-3％重量的量加入有机织物柔软剂，例如水不溶性叔胺或二长链酰胺材料，而以0.1-2％重量，一般0.15-1.5％重量的量加入高分子量聚氧乙烯材料和水溶性阳离子材料。尽管在某些情况下作为干混颗粒加入它们可以更方便，但一般将这些材料加到该组合物的喷雾干燥组分上，或者作为熔融的液体将它们喷雾到组合物的其它固体组分上。

聚合染料转移抑制剂

按照本发明的洗涤剂组合物还包括0.001-10％重量，优选0.01-2％重量，更优选0.05-1％重量的聚合染料转移抑制剂。一般将所述的聚合染料转移抑制剂加入到洗涤剂组合物中以便抑制染料从有色织物转移到与其一起洗涤的织物上。在染料于洗涤中附着到其它物品上之前，这些聚合物会络合或吸附从染色织物洗涤下来的短效染料。

特别合适的聚合染料转移抑制剂是聚N-氧化胺聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚乙烯基噁唑烷酮和聚乙烯基咪唑，或其混合物。

加入这样的聚合物也增强了本发明酶的性能。

在纸浆业中的用途

此外，预计本发明的甘露聚糖酶可用于纸浆(化学纸浆、半合成纸浆、机械纸浆或牛皮纸浆)的无氯漂白工艺中，以提高其白度，从而使漂白工艺中过氧化氢的需求减少或消除。

在纺织品和纤维素纤维加工业中的用途

本发明的甘露聚糖酶可与其它糖类降解酶(例如木葡聚糖酶、木聚糖酶、各种果胶酶)结合使用以制备纤维，或与洗涤剂结合使用以清洁纤维。

本文中，术语“纤维素材料”意指由棉、棉混纺纱或者天然或人工纤维素(如来源于含木聚糖之纤维素纤维，如来自纸浆)或其混合物制成的纤维、已缝制和未缝制的织物，包括针织物、机织物、粗斜纹布、纱线和毛巾布。混合物的例子是棉或人造丝/粘胶丝与一种或多种配对材料的混合物，所述配对材料例如是羊毛，合成纤维(如聚酰胺纤维，丙烯酸纤维，聚酯纤维，聚乙烯醇纤维，聚氯乙烯纤维，聚偏二氯乙烯纤维，聚氨基甲酸乙酯纤维，聚脲纤维，芳族聚酰胺纤维)，和含纤维素的纤维(如人造丝/粘胶丝，苎麻，大麻，亚麻/亚麻布，黄麻，醋酸纤维素纤维，lyocell)。

纺织工业中，将纤维素材料例如棉纤维处理成适于制衣的材料的方法包括几个步骤：将纤维纺成纱线，将纱线编织成机织织物或针织织物以及后续的准备、染色和整理操作。机织织物是通过在一系列经线之间编织纬线来构造的；纱线可以是两种不同的类型。

退浆：为了提高扭曲速度，在纺织之前加入聚合浆料，如甘露聚糖、淀粉、CMC或PVA；在进一步处理之前，必须除去这种物质。本发明的酶可用于除去含甘露聚糖的浆料。

增稠剂的降解

半乳甘露聚糖诸如瓜尔胶和豆角胶，被广泛作为增稠剂(如在食品中)和用于纺织品印花的印花浆(诸如T恤上的印刷物)使用。本发明的酶或酶制剂可以用来降低如加工设备中残留食物的粘性，并因此有助于处理后的清洁。而且，预计酶或酶制剂对降低印花浆的粘性有用，由此有助于在纺织品印花后清洗掉剩余印花浆。

植物材料的降解或修饰

本发明的酶或酶制剂优选用于降解或修饰来源于植物、含甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖或半乳葡甘露聚糖的材料。这些材料的实例是瓜尔胶和豆角胶。

本发明的甘露聚糖酶可以用于修饰植物来源材料的物理-化学特性，诸如粘性。例如，甘露聚糖酶可以用来降低含甘露聚糖的饲料或食品的粘性，和用来促进含粘性甘露聚糖的材料的加工。

咖啡提取

本发明的酶或酶制剂还可以用于水解液体咖啡提取物中存在的半乳甘露聚糖，优选目的是在冻干(速溶)咖啡的过程中抑制凝胶形成。为了降低酶的消耗和避免咖啡的污染，本发明的甘露聚糖酶优选是固定的。这种用途还公开于EP-A-676 145。

裂解地下结构(石油钻探)中的使用

而且，预计本发明的酶可作为酶破乳剂(enzyme breaker)使用，如公开于美国专利号5,806,597、5,562,160、5,201,370和5,067,566(BJ Services Company BJ，Houston，TX，U.S.A.)，所有专利均引用作为参考。

相应的，本发明的甘露聚糖酶可用于裂解井孔中地下结构的方法中，该方法中首先混和水溶液、能水合的聚合体、合适的交联剂(用于交联能水合的聚合体形成聚合体凝胶)和酶破乳剂(即本发明的酶)，形成可凝胶化的压裂液。在足够压力下，将交联聚合体凝胶用泵抽到井孔中，以裂解周围结构。酶破乳剂能够随时间降解交联聚合体，从而降低液体的粘性，从而可以将液体从地下结构抽回井表面。

酶破乳剂可以是压裂液的成分或破乳剂-交联剂-聚合体复合物，该复合物还包含能水合的聚合体和交联剂。压裂液或复合物可以是凝胶或可以是可凝胶的。含复合物的压裂液可用干裂解围绕井孔的地下结构，通过在足够的压力下将液体用泵抽到井孔中期望的位置，以裂解周围的地下结构。复合物可以通过维持特殊条件的pH和温度，以基本无活性的状态供应，直到液体到达井孔中适当位置而且期望的裂解已经完成之时。一旦完成裂解，不再维持复合物无活性的特殊条件.当条件变化足够大时，复合物变得有活性，破乳剂开始催化聚合体的降解，使得压裂液变得足够流畅，能够从地下结构抽到井表面。

材料和方法

活性测试实验

根据本领域已知的常规测试步骤，可以测试具有甘露聚糖酶活性的本发明多肽的甘露聚糖酶活性，诸如在含0.2％AZCL-半乳甘露聚糖(豆角)，即内切-1，4-β-D-甘露聚糖酶实验的底物(可以由Megazyme公司目录编号I-AZMGA获得(Megazyme的因特网地址：http://www.megazyme.com/Purchase/index.html))的琼脂平板上打出的4mm直径的孔中加入将要测试的溶液。

测定甘露聚糖酶的催化活性(ManU)

比色法实验

底物：0.2％AZCL-半乳甘露聚糖(Megazyme，澳大利亚)，来自豆角，于0.1M甘氨酸缓冲液，pH10.0中。

在1.5ml Eppendorf微量离心管中，在搅动和温度控制在40℃的热混和仪上进行实验。将0.750ml底物和0.05ml酶温育20分钟，以15000rpm离心4分钟终止。于600nm在1cm比色杯中测量上清液的颜色。

1 ManU(甘露聚糖酶单位)为1cm 0.24abs。菌株和供体生物体

上述芽孢杆菌I633包含SEQ ID NO：1中所示的β-1，4-甘露聚糖酶编码DNA序列。

大肠杆菌DSM 12197包含含有编码本发明β-1，4-甘露聚糖酶的DNA(SEQ ID NO：1)的质粒。

上述Bacillus agaradhaerens NCIMB 40482包含SEQ ID NO：5中所示的β-1，4-甘露聚糖酶编码DNA序列。

大肠杆菌DSM 12180包含含有编码本发明β-1，4-甘露聚糖酶的DNA(SEQ ID NO：5)的质粒。

上述芽孢杆菌AAI12包含SEQ ID NO：9中所示的β-1，4-甘露聚糖酶编码DNA序列。

大肠杆菌DSM 12433包含含有编码本发明β-1，4-甘露聚糖酶的DNA(SEQ ID NO：9)的质粒。

上述耐盐芽孢杆菌包含SEQ ID NO：11中所示的β-1，4-甘露聚糖酶编码DNA序列。

大肠杆菌DSM 12441包含含有编码本发明β-1，4-甘露聚糖酶的DNA(SEQ ID NO：11)的质粒。

上述Humicola insolens包含SEQ ID NO：13中所示的β-1，4-甘露聚糖酶编码DNA序列。

大肠杆菌DSM 9984包含含有编码本发明β-1，4-甘露聚糖酶的DNA(SEQ ID NO：13)的质粒。

上述芽孢杆菌AA349包含SEQ ID NO：15中所示的β-1，4-甘露聚糖酶编码DNA序列。

大肠杆菌DSM 12432包含含有编码本发明β-1，4-甘露聚糖酶的DNA(SEQ ID NO：15)的质粒。

大肠杆菌DSM 12847包含含有编码本发明β-1，4-甘露聚糖酶的DNA(SEQ ID NO：17)的质粒。

大肠杆菌DSM 12848包含含有编码本发明β-1，4-甘露聚糖酶的DNA(SEQ ID NO：19)的质粒。

上述Bacillus clausii包含SEQ ID NO：21中所示的β-1，4-甘露聚糖酶编码DNA序列。

大肠杆菌DSM 12849包含含有编码本发明β-1，4-甘露聚糖酶的DNA(SEQ ID NO：21)的质粒。

大肠杆菌DSM 12850包含含有编码本发明β-1，4-甘露聚糖酶的DNA(SEQ ID NO：23)的质粒。

芽孢杆菌属的种包含SEQ ID NO：25中所示的β-1，4-甘露聚糖酶编码DNA序列。

大肠杆菌DSM 12846包含含有编码本发明β-1，4-甘露聚糖酶的DNA(SEQ ID NO：25)的质粒。

芽孢杆菌属的种包含SEQ ID NO：27中所示的β-1，4-甘露聚糖酶编码DNA序列。

大肠杆菌DSM 12851包含含有编码本发明β-1，4-甘露聚糖酶的DNA(SEQ ID NO：27)的质粒。

上述地衣芽孢杆菌包含SEQ ID NO：29中所示的β-1，4-甘露聚糖酶编码DNA序列。

大肠杆菌DSM 12852包含含有编码本发明β-1，4-甘露聚糖酶的DNA(SEQ ID NO：29)的质粒。

芽孢杆菌属的种包含SEQ ID NO：31中所示的β-1，4-甘露聚糖酶编码DNA序列。

大肠杆菌DSM 12436包含含有编码本发明β-1，4-甘露聚糖酶的DNA(SEQ ID NO：31)的质粒。

大肠杆菌菌株：制备大肠杆菌SJ2(B.Diderichsen，U.Wedsted，L.Hedegaard，B.R.Jensen，(1990)编码短芽孢杆菌胞外酶α-乙酰乳酸脱羧酶的aldB的克隆，细菌学杂志172：4315-4321)的细胞，并使用购自BIO-RAD的Gene PulserTM电击仪，如供应商所述，通过电穿孔进行转化。

枯草芽孢杆菌PL2306。此菌株是apr和npr基因被破坏的枯草芽孢杆菌DN1885，其中已知的枯草芽孢杆菌纤维素酶基因的转录单位被破坏，产生纤维素酶阴性细胞(B.Diderichsen，U.Wedsted，L.Hedegaard，B.R.Jensen，(1990)编码短芽孢杆菌胞外酶α-乙酰乳酸脱羧酶的aldB的克隆，细菌学杂志172：4315-4321)。破坏基本上如(编：A.L.Sonenshein，J.A.Hoch和Richard Losick(1993)枯草芽孢杆菌和其它革兰氏阳性细菌，American Society formicrobiology，p.618)中所述进行。

制备感受态细胞，并如R.E.Yasbin，G.A.Wilson和F.E.Young(1975)枯草芽孢杆菌溶源菌株中的转化和转染：原噬菌体在感受态细胞中的选择性诱导的证据，细菌学杂志，121：296-304所述，进行转化。

普通分子生物学方法：

除非特别声明，所有的DNA操作和转化是使用分子生物学的常规方法进行的(Sambrook等人(1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；F.M.Ausubel等人(编)“分子生物学的现行方案”，John Wiley and Sons，1995；C.R.Harwood和S.M.Cutting(编)“用于芽孢杆菌的分子生物学方法”，John Wiley and Sons，1990)。

根据供应商的说明书，使用用于DNA操作的酶(如限制型内切酶、连接酶等由New England Biolabs，Inc.购买)。

质粒

pSJ1678：(见作为WO94/19454公开的国际专利申请)。

pBK-CMV(Stratagene Inc.，La Jolla，CA)。

pMOL944。此质粒是pUB110的衍生物，其基本上含有使质粒能够在枯草芽孢杆菌中增殖的元件、卡那霉素抗性基因并具有由地衣芽孢杆菌ATCC14580的amyL基因克隆的强启动子和信号肽。信号肽含有SacII位点，便于克隆编码与信号肽融合的蛋白质成熟部分的DNA。这导致导向细胞外部的前蛋白质(Pre-protein)的表达。

质粒通过普通基因工程方法进行构建，并如下简要描述。

pMOL944的构建：

将pUB110(T.McKenzie等人，1986，Plasmid 15：93-103)用单一的限制酶NciI消化。将由质粒pDN1981(等人，1990，Gene 96：37-41)上编码的amyL启动子扩增的PCR片段，用Nci I消化并插入到经Nci I消化的pUB110中，从而产生质粒pSJ2624.

使用的两种PCR引物具有下列序列：

#LWN54945′-GTCGCCGGGGCGGCCGCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3′

#LWN54955′-GTCGCCCGGGAGCTCTGATCAGGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGAT-3′

引物#LWN5494在质粒中插入了Not I位点。

然后将质粒pSJ2624用Sac I和Not I消化，将由pDN1981上编码的amyL启动子扩增的新的PCR片段用Sac I和Not I消化，并将此DNA片段插入到经Sac I-Not I消化的pSJ2624中，从而产生质粒pSJ2670。

此克隆用相同但方向相反的启动子取代了第一个amyL启动子。PCR扩增中使用的两种引物具有下列序列：

#LWN5938 5`-GTCGGCGGCCGCTGATCACGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATG

AGGCAGCAAGAAGAT-3′

#LWN5939 5`-GTCGGAGCTCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3′

将质粒pSJ2670用限制酶Pst I和Bcl I消化，将由编码碱性淀粉酶SP722的克隆DNA序列(专利号WO9526397-A1)扩增的PCR片段用Pst I和Bcl I消化，并插入产生质粒pMOL944。用于PCR扩增的两种引物具有下列序列：

#LWN7864 5`-AACAGCTGATCACGACTGATCTTTTAGCTTGGCAC-3′

#LWN7901 5`-AACTGCAGCCGCGGCACATCATAATGGGACAAATGGG-3′

引物#LWN7901在质粒中插入了Sac II位点。供体菌株的培养和基因组DNA的分离

将有关芽孢杆菌菌株，如芽孢杆菌I633在pH调到大约9.7(每500ml TY加入50ml 1M倍半碳酸钠)的TY中培养。于30℃和300rpm温育24小时后，收获细胞，并使用Pitcher等人描述的方法，分离基因组DNA(D.G.Pitcher，N.A.Saunders，R.J.Owen；使用硫氰酸胍快速提取细菌基因组DNA；Lett.Appl.Microbiol.1989 8：151-156)。

培养基

TY(如F.M.Ausubel等人(编)“分子生物学的现行方案”，JohnWiley and Sons，1995描述的)。

LB琼脂(如F.M.Ausubel等人(编)“分子生物学的现行方案”，John Wiley and Sons，1995描述的)。

LBPG是补充了0.5％葡萄糖和0.05M磷酸钾(pH7.0)的LB琼脂。

向LBPG-琼脂中加入AZCL-半乳甘露聚糖至0.5％，AZCL-半乳甘露聚糖购自Megazyme，澳大利亚。

BPX培养基描述于EP 0 506 780(WO91/09129)。

NZY琼脂(每升)5g NaCl，2g MgSO₄，5g酵母提取物，10g NZ胺(酪蛋白水解产物)，15g琼脂；加入去离子水至1升，用NaOH调pH至7.5，并高压灭菌。

NZY肉汤(每升)5g NaCl，2g MgSO₄，5g酵母提取物，10g NZ胺(酪蛋白水解产物)；加入去离子水至1升，用NaOH调pH至7.5，并高压灭菌。

NZY顶层琼脂(每升)5g NaCl，2g MgSO₄，5g酵母提取物，10g NZ胺(酪蛋白水解产物)，0.7％(w/v)琼脂；加入去离子水至1升，用NaOH调pH至7.5，并高压灭菌。

下列非限制性实施例举例说明了本发明。

实施例1

得自芽孢杆菌I633的甘露聚糖酶

在lambdaZAPExpress载体中构建芽孢杆菌I633的基因组文库

将芽孢杆菌I633的基因组DNA用限制酶Sau3A部分消化，并在0.7％琼脂糖凝胶(SeaKem琼脂糖，FMC，美国)上通过电泳进行大小分离。分离大小在1.5-10kb之间的片段，并通过将DNA片段在1.5％琼脂糖凝胶上进行反向电泳浓缩成一条DNA条带，随后使用Qiaquick凝胶提取试剂盒，根据制造商的说明书(Qiagen Inc.，美国)，从琼脂糖凝胶切片提取片段。为了构建基因组文库，将约100ng上述经纯化和分离的DNA，与1ug经BamHI酶切、去磷酸化的lambdaZAPExpress载体臂(Stratagene，La Jolla，CA，美国)，根据制造商的说明书，于4℃连接24小时。取3μl连接混和物，直接使用GigaPackIII Gold包装提取物(Stratagene，美国)，根据制造商的说明书，进行包装。使用大肠杆菌XL1-Blue MRF-菌株(Stratagene，La Jolla，美国)，测定基因组lambdaZAPExpress噬菌体文库滴度。未扩增的基因组文库包含3×10⁷噬斑形成单位(plaque-forming units，pfu)，载体背景小于1％。

通过lambdaZAPExpress中的功能表达筛选β-甘露聚糖酶克隆

将基因组文库的大约5000噬斑形成单位(pfu)，在含0.1％AZCL-半乳甘露聚糖(MegaZyme，澳大利亚，目录号I-AZGMA)的NZY琼脂平板上铺板，使用大肠杆菌XL1-Blue MRF’(Stratagene，美国)作为宿主，随后将平板于37℃温育24小时。通过阳性噬菌体克隆周围形成的蓝色水解晕轮，鉴定甘露聚糖酶阳性的λ克隆。通过挖取含感兴趣的噬斑的顶层琼脂切片，转移到500μl SM缓冲液和20μl氯仿中，从筛选平板回收这些甘露聚糖酶阳性λ克隆。将挖取的噬菌体储存物一部分在上述含0.1％AZCL-半乳甘露聚糖的NZY平板上铺板，对甘露聚糖酶阳性lambdaZAPExpress克隆进行噬斑纯化。挖取单个甘露聚糖酶阳性的λ克隆，转移到500μl SM缓冲液和20μl氯仿中，并通过再一轮如上所述铺板进行纯化。

在甘露聚糖酶阳性lambdaZAPExpress克隆中进行噬菌粒单个克隆的体内切除

制备大肠杆菌XL1-Blue细胞(Stratagene，La Jolla，CA)，并如Stratagene(La Jolla，美国)推荐的，重悬于10mM MgSO₄。在Falcon2059管中，将250μl甘露聚糖酶阳性克隆的纯噬菌体储存物，与200μl XL-Blue MRF’细胞(OD₆₀₀＝1.0)和＞10⁶pfu/ml的ExAssist M13辅助噬菌体(Stratagene)混和，并将混和物于37℃温育15分钟。向每管中加入3ml NZY肉汤，并将管于37℃温育2.5小时。将管于65℃加热20分钟，以杀死大肠杆菌细胞和λ噬菌体；噬菌粒对加热有抗性。将管以3000rpm离心15分钟，以除去细胞碎片，并将上清液转移到干净的Falcon 2059管中。取一部分含经切割的单链噬菌粒的上清液，于37℃温育15分钟，用来感染200μl大肠杆菌XLOLR细胞(Stratagene，OD₆₀₀＝1.0，重悬于10mM MgSO₄)。向细胞中加入350μl NZY肉汤，并将管于37℃温育45分钟。取一部分细胞，在LB卡那霉素平板上铺板，于37℃培养24小时。将五个经切割的单菌落在含0.1％AZCL-半乳甘露聚糖(MegaZyme，澳大利亚)的LB卡那霉素琼脂平板上重划线。甘露聚糖酶阳性的噬菌粒克隆的特征为，在阳性克隆周围形成蓝色水解晕轮。将分离的噬菌粒DNA(QiaSpin kit，Qiagen，美国)，用EcoR I、Pst I、EcoR I-Pst I、和HindIII限制酶消化，随后进行琼脂糖凝胶电泳，由此进一步分析这些甘露聚糖酶阳性的噬菌粒克隆。

核苷酸序列分析

通过双脱氧链终止方法(F.Sanger，S.Nicklen，和A.R.Coulson(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74：5463-5467)，测定两条链的基因组β-1，4-甘露聚糖酶克隆pBXM3的核苷酸序列，其中使用500ng经Qiagen纯化的模板(Qiagen，美国)、Taq deoxy-terminalcycle sequencing kit(Perkin-Elmer，美国)、荧光标记的终止物和5pmol pBK-CMV多接头引物(Stratagene，美国)或合成寡核苷酸引物。根据Devereux等人的方法(J.Devereux，P.Haeberli和O.Smithies(1984)Nucleic Acid Res.12：387-395)，进行序列数据的分析。

序列排序

来自本发明的芽孢杆菌I633(SEQ ID NO：2)、环状芽孢杆菌(GenBank/EMBL编号066185)、弧菌属的种(编号069347)、浅青紫链霉菌(编号P51529)、和解糖热解纤维素菌(编号P22533)的糖水解酶家族5的β-1，4-甘露聚糖酶的多序列排序。使用GCG Wisconsin软件包8.1版的PileUp程序产生多序列排序；缺口产生罚分3.00，缺口延伸罚分0.10。

序列相似性

由芽孢杆菌I633克隆的本发明家族5的β-1，4-甘露聚糖酶推导的氨基酸序列，显示与环状芽孢杆菌β-1，4-甘露聚糖酶(GenBank/EMBL编号066185)75％的相似性和60.1％的序列同一性，与弧菌属的种的β-1，4-甘露聚糖酶(编号069347)64.4％的相似性和44.6％的同一性，与浅青紫链霉菌的β-1，4-甘露聚糖酶(编号P51529)63％的相似性和43.2％的同一性，与解糖热解纤维素菌的β-1，4-甘露聚糖酶(编号P22533)52.5％的相似性和34.4％的序列同一性。各序列使用GCG Wisconsin software package 8.1版的GAP程序进行排序；缺口产生罚分3.00，缺口延伸罚分0.10。

芽孢杆菌I633甘露聚糖酶基因的克隆

A.枯草芽孢杆菌中催化核心甘露聚糖酶的亚克隆和表达：

使用由下列两种寡核苷酸组成的PCR引物对，PCR扩增本发明的甘露聚糖酶编码DNA序列：

BXM2.upper.SacII

5′-GTT GAG AAA GCG GCC GCC TTT TTT CTA TTC TAC AAT CAC ATT ATC-3′

BXM2.core.lower.NotI

5′-GAC GAC GTA CAA GCG GCC GCT CAC TAC GGA GAA GTT CCT CCA TCAG-3′

限制性位点Sac II和Not I标了下划线。

在根据制造商的说明书使用Amplitaq DNA聚合酶(Perkin Elmer)的PCR反应中，将如上所述由芽孢杆菌I633分离的染色体DNA作为模板使用。在含200μM每种dNTP、2.5单位AmpliTaq聚合酶(Perkin-Elmer，Cetus，美国)和100pmol每种引物的PCR缓冲液(10mMTris-HCl，pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，0.01％(w/v)明胶)中建立PCR反应体系。

使用DNA热循环仪(Landgraf，德国)进行PCR反应。预变性94℃1min，随后进行30个PCR循环：变性94℃ 30sec，退火60℃ 1min，延伸72℃2min。取5μl扩增产物，通过0.7％琼脂糖凝胶(NuSieve，FMC)电泳进行分析。大小为1.0kb的DNA片段的出现，说明正确扩增了基因片段。

PCR片段的亚克隆：

取45μl如上所述产生的PCR产物，根据制造商的说明书使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，美国)，进行纯化。将经纯化的DNA用50μl 10mM Tris-HCl(pH8.5)洗脱。将5μg pMOL944和25μl经纯化的PCR片段，用Sac II和Not I进行消化，在0.8％低熔点琼脂糖(SeaPlaque GTG，FMC)凝胶中进行电泳，从凝胶切下有关片段，并根据制造商的说明书使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，美国)进行纯化。然后将经分离的PCR DNA片段与经Sac II-Not I消化和纯化的pMOL944进行连接。连接反应使用0.5μg每种DNA片段、1U T4 DNA连接酶和T4连接酶缓冲液(Boehringer Mannheim，德国)，于16℃进行过夜。

将连接混和物用于转化感受态枯草芽孢杆菌PL2306。将经转化的细胞在LBPG-10μg/ml卡那霉素-琼脂平板上铺板。于37℃温育18小时后，平板上出现菌落。通过由过夜培养肉汤分离质粒DNA，分析了几个克隆。

如上所用，将这样一个阳性克隆在琼脂平板上几次进行划线，这个克隆叫做MB748。将克隆MB748在TY-10μg/ml卡那霉素中于37℃培养过夜，第二天取1ml细胞，根据制造商推荐用于制备枯草芽孢杆菌质粒的方案，使用Qiaprep Spin Plasmid Miniprep Kit #27106从细胞分离质粒。将此DNA进行DNA测序，揭示了相应于甘露聚糖酶成熟部分的DNA序列(相应于所附DNA序列SEQ ID NO：1的第91-990位和所附蛋白质序列SEQ ID NO：2的第31-330位)，导入的终止密码子取代了相应于SEQ ID NO：1的第1201-1203位碱基对的第331位氨基酸残基。

B.枯草芽孢杆菌中成熟全长甘露聚糖酶的亚克隆和表达：

使用由下述两种寡核苷酸组成的PCR引物对，PCR扩增本发明的甘露聚糖酶编码DNA序列：

BXM2.upper.SacII

5′-CAT TCT GCA GCC GCG GCA AAT TCC GGA TTT TAT GTA AGC GG-3′

BXM2.lower.NotI

5′-GTT GAG AAA GCG GCC GCC TTT TTT CTA TTC TAC AAT CAC ATT ATC-

3′

限制性位点Sac II和Not I标了下划线。

使用DNA热循环仪(Landgraf，德国)进行PCR反应。预变性94℃1min，随后进行30个PCR循环：变性94℃30sec，退火60℃1min，延伸72℃2min。取5μl扩增产物，通过0.7％琼脂糖凝胶(NuSieve，FMC)电泳进行分析。大小为1.5kb的DNA片段的出现，说明正确扩增了基因片段。

PCR片段的亚克隆：

取45μl如上所述产生的PCR产物，根据制造商的说明书使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，美国)，进行纯化。将经纯化的DNA用50μl 10mM Tris-HCl(pH8.5)洗脱。将5μg pMOL944和25μl经纯化的PCR片段，用Sac II和Not I进行消化，在0.8％低熔点琼脂糖(SeaPlaque GTG，FMC)凝胶中进行电泳，从凝胶切下有关片段，并根据制造商的说明书使用QIAquick Gel extracton Kit(凝胶提取试剂盒)(Qiagen，美国)进行纯化。然后将经分离的PCR DNA片段与经Sac II-Not I消化和纯化的pMOL944进行连接。连接反应使用0.5μg每种DNA片段、1U T4 DNA连接酶和T4连接酶缓冲液(Boehringer Mannheim，德国)，于16℃进行过夜。

将连接混和物用于转化感受态芽枯草孢杆菌PL2306。将经转化的细胞在LBPG-10μg/ml卡那霉素-琼脂平板上铺板。于37℃温育18小时后，在平板上看到菌落。通过由过夜培养肉汤分离质粒DNA，分析了几个克隆。

如上所用，将这样一个阳性克隆在琼脂平板上几次进行划线，这个克隆叫做MB643。将克隆MB643在TY-10μg/ml卡那霉素中于37℃培养过夜，第二天取1ml细胞，根据制造商推荐用于制备枯草芽孢杆菌质粒的方案，使用Qiaprep Spin Plasmid Miniprep Kit#27106从细胞分离质粒。将此DNA进行DNA测序，揭示的DNA序列相应于甘露聚糖酶成熟部分SEQ ID NO：1的第317-1693位和SEQ ID NO：2的第33-490。

将克隆MB643在含10μg/ml卡那霉素的25×200ml BPX培养基中，在500ml带双挡板的摇瓶中于37℃和300rpm培养5天。

编码未知功能的C端结构域(第341-490位氨基酸残基)的DNA序列，显示与已知甘露聚糖酶的X18表示的结构域有高度同源性。此X18发现于EMBL条目AB007123，来自：S.Yoshida，Y.Sako，A.Uchida：“编码来自环状芽孢杆菌K-1、降解瓜尔胶的酶的基因在大肠杆菌中的克隆、序列分析、和表达”，Biosci.Biotechnol.Biochem.62：514-520(1998)。此基因编码信号肽(第1-34位氨基酸)、家族5的甘露聚糖酶的催化核心(第35-335位氨基酸)、衔接物(第336-362位氨基酸)和最后的未知功能的X18结构域(第363-516位氨基酸)。

此X18结构域还发现存在于枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶Swiss蛋白质数据库条目P55278，其中公开了编码信号肽(第1-26位氨基酸)、家族26的甘露聚糖酶的催化核心(第27-360位氨基酸)和未知功能的此X18蛋白质结构域(第361-513位氨基酸)的基因(来自枯草芽孢杆菌NM-39的β-甘露聚糖酶的克隆和测序，N.S.Mendoza，M.Arai，K.Sugimoto，M.Ueda，T.Kawaguchi，L.M.Joson，Phillippines，Biochimica Et Biophysica Acta，第1243卷，第3期，552-554(1995))。

实施例2

来自芽孢杆菌I633的甘露聚糖酶的表达、纯化和分析将如实施例1和材料与方法中所述得到的克隆MB748，在含10μg/ml卡那霉素的25×200ml BPX培养基中，在500ml带两挡板的摇瓶中于37℃和300rpm培养5天。

收集了4500ml克隆MB748的摇瓶培养液，并将pH调到5.6。一边搅动，一边加入100ml阳离子试剂(10％C521)和180ml阴离子试剂(A130)，用于絮凝。使用Sorval RC 3B离心机以9000rpm于6℃离心20分钟，对絮凝物进行分离。将上清液使用Whatman玻璃滤器GF/D和C进行澄清，最后在截留分子量为10kDa的Filtron滤膜上进行浓缩。

将700ml此浓缩液用NaOH调到pH7.5。将清澈的溶液进行阴离子交换层析，其中使用经50mM Tris(pH7.5)平衡的1000ml Q-Sepharose层析柱。将结合的甘露聚糖酶活性用NaCl梯度洗脱到1100ml中。将此洗脱液使用Filtron滤膜浓缩成440ml。为了得到高纯度的甘露聚糖酶，将浓缩液通过用0.1M醋酸钠(pH6.0)平衡过的Superdex200层析柱。

纯酶在SDS-PAGE中显示分子量为34kDa的单一条带。

使用豆角胶的稳态动力学

使用不同量的豆角胶底物进行实验，于40℃和pH10在0.1M甘氨酸缓冲液中温育20分钟，随后测定形成的还原糖。使用葡萄糖作为计算在稳态过程中形成微摩尔还原糖的标准。

由本发明的高纯度甘露聚糖酶得到下列数据：

KCat为467/sec，标准偏差13；

Km为0.7，标准偏差0.07。

使用Leatherbarrow(Erithacus Software U.K.)提供的电脑程序进行计算。使用PHBAH方法(M.Lever(1972)，糖类比色法测定的新反应，Anal.Biochem.，47：273-279)测定还原糖。

测定了经纯化的蛋白质的下述N端序列：ANSGFYVSGTTLYDANG。

稳定性：甘露聚糖酶在pH 6.0-11之间于室温温育2天后，完全稳定。该酶在低pH下沉淀。

pH活性特性曲线显示酶在pH 7.5-10之间活性高于60％。

最适温度于pH10是50℃。

DSC差异扫描量热法得到熔点是66℃(于pH6.0和醋酸钠缓冲液中)，说明此甘露聚糖酶是热稳定的。

免疫学特性：使用常规技术，在丹麦公司DAKO，制备了针对高纯度的克隆甘露聚糖酶的兔多克隆单一特异性血清。血清在琼脂糖凝胶中与粗制未纯化的本发明甘露聚糖酶形成好的单一沉淀。

实施例3

实施例2的酶在洗涤剂中的使用

如上所述，使用商业性洗涤剂而非缓冲液，与来自豆角的0.2％AZCL-半乳甘露聚糖(Megazyme，澳大利亚)，于40℃温育20分钟，随后测定形成的蓝色，如实施例2所述得到的酶有活性，其在欧洲粉状洗涤剂Ariel Futur中有60％的相对活性，在欧洲液体洗涤剂ArielFutur中有80％的相对活性，在美国Tide粉中有45％的相对活性，在美国Tide液体洗涤剂中有37％的相对活性(相对于在甘氨酸缓冲液中测量的活性)。在这些测试中，洗涤剂浓度如商业性洗涤剂包装上推荐的，而且清洗水是自来水，在欧洲(Ariel Futur)条件下为18度德国硬度，在美国条件(美国Tide)下为9度。

实施例4

芽孢杆菌I633的甘露聚糖酶(实施例1和实施例2)与纤维素结合结构域(CBD)的融合蛋白的构建和表达

先前已经将来自热纤维羧菌(Clostridium thermocellum)菌株YS的CipB基因的CBD编码DNA序列(D.M.Poole，E.Morag，R.Lamed，E.A.Bayer，G.P.Hazlewood，H.J.Gilbert(1992)Identification ofthe cellulose-binding domain of the cellulosome subunit S1 fromClostridium thermocellum YS，FEMS Microbiology Letters，78(2-3)：181-186)导入到载体pMOL1578中。可以如D.M.Poole，E.Morag，R.Lamed，E.A.Bayer，G.P.Hazlewood，H.J.Gilbert(1992)Identification of the cellulose-binding domain of thecellulosome subunit S1 from Clostridium thermocellum YS，FEMSMicrobiology Letters，78(2-3)：181-186中描述的，得到编码CBD的染色体DNA。将编码CBD的DNA样品在PCR中作为模板使用，并将CBD克隆到基于pMOL944载体的合适质粒pMB993中。

pMB993载体含有CipB CBD，在CBD之前有肽衔接物。衔接物由肽序列ASPEPTPEPT组成，后面紧接CipB CBD。AS氨基酸得自构成限制性内切酶位点NheI的DNA序列，此位点随后被用来克隆本发明的甘露聚糖酶。

Mannanase.Upper.SacII

5′-CAT TCT GCA GCC GCG GCA AAT TCC GGA TTT TAT GTA AGC GG-3′

Mannanase.Lower.NheI

5′-CAT CAT GCT AGC TGT AAA AAC GGT GCT TAA TCT CG-3′

限制性位点Nhe I和Sac II标了下划线。

使用DNA热循环仪(Landgraf，德国)进行PCR反应。预变性94℃1min，随后进行30个PCR循环：变性94℃ 30sec，退火60℃1min，延伸72℃ 2min.取5μl扩增产物，通过0.7％琼脂糖凝胶(NuSieve，FMC)电泳进行分析。大小为0.9kb的DNA片段的出现，说明正确扩增了基因片段。

PCR片段的亚克隆：

取45μl如上所述产生的PCR产物，根据制造商的说明书使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，美国)，进行纯化。将经纯化的DNA用50μl 10mM Tris-HCl(pH8.5)洗脱。将5μg pMOL993和25μl经纯化的PCR片段，用SacII和NheI进行消化，在0.7％低熔点琼脂糖(SeaPlaque GTG，FMC)凝胶中进行电泳，从凝胶切下有关片段，并根据制造商的说明书使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，美国)进行纯化。然后将经分离的PCR DNA片段与经SacII-NheI消化和纯化的pMOL993进行连接。连接反应使用0.5μg每种DNA片段、1U T4 DNA连接酶和T4连接酶缓冲液(Boehringer Mannheim，德国)，于16℃进行过夜。

如上所用，将这样一个阳性克隆在琼脂平板上几次进行划线，这个克隆叫做MB1014。将克隆MB1014在TY-10μg/ml卡那霉素中于37℃培养过夜，第二天取1ml细胞，根据制造商推荐用于制备枯草芽孢杆菌质粒的方案，使用Qiaprep Spin Plasmid Miniprep Kit#27106从细胞分离质粒。将此DNA进行DNA测序，揭示的DNA序列相应于SEQID NO：3中和所附蛋白质序列SEQ ID NO：4中描绘的甘露聚糖酶成熟部分-衔接物-cbd。

由此，最终构建物包含下列表达相关元件：amyL启动子-amyL信号肽-甘露聚糖酶-衔接物-CBD。

甘露聚糖酶-CBD融合蛋白的表达和检测：

将MB1014在TY培养基中于37℃和250rpm培养20小时。将1ml不含细胞的上清液与200μl Millipore H20配制的10％Avicel(Merck，Darmstadt，德国)混和。将混和物于0℃放置0.5小时。在BXM2-衔接物-CBD融合蛋白与Avicel结合后，将结合了蛋白质的Avicel以5000g离心5分钟。将沉淀重悬于100μl SDS-PAGE缓冲液，于95℃煮5分钟，以5000g离心5分钟，然后取25μl加样到4-20％Laemmli Tris-甘氨酸、SDS-PAGE NOVEX凝胶(Novex，美国)上。根据制造商推荐的，将样品在Xcell^TM Mini-Cell(NOVEX，美国)中进行电泳，如制造商所述进行所有随后的凝胶操作，包括用考马斯进行染色、脱色和干燥。

大约53kDa的蛋白质条带的出现，证实了在枯草芽孢杆菌中表达了质粒pMB1014上编码的全长甘露聚糖酶-衔接物-CBD融合蛋白。

实施例5

得自Bacillus agaradhaerens的甘露聚糖酶来自Bacillus agaradherens的甘露聚糖酶基因的克隆基因组DNA的制备

如W094/01532所述，在液体培养基中繁殖菌株Bacillusagaradherens NCIMB 40482。于30℃和300rpm培养16小时后，收获细胞，并通过Pitcher等人描述的方法分离基因组DNA(D.G.Pitcher，N.A.Saunders，R.J.Owen(1989)使用硫氰酸胍快速提取细菌基因组DNA；Lett.Appl.Microbiol.8：151-156)。

基因组文库的构建

将基因组DNA用限制酶Sau3A部分消化，并在0.7％琼脂糖凝胶上通过电泳进行大小分离。通过电泳到DEAE-纤维素纸上，分离大小在2-7kb之间的片段(G.Dretzen，M.Bellard，P.Sassone-Corsi，P.Chambon(1981)从琼脂糖和丙烯酰胺回收DNA片段的可靠方法，Anal.Biochem.，112：295-298)。

将经分离的DNA片段与经BamHI消化的pSJ1678质粒DNA连接，并将连接混和物用于转化大肠杆菌SJ2。

阳性克隆的鉴定

在含0.2％AZCL-半乳甘露聚糖(Megazyme)和9μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上，筛选如上所述在大肠杆菌中构建的DNA文库，并于37℃温育过夜。表达甘露聚糖酶活性的克隆出现蓝色扩散晕轮。对这样一个克隆的1ml过夜培养肉汤(在含9μg/ml氯霉素的TY中于37℃和250rpm培养的细胞)，使用Qiagen plasmid spin preps分离质粒DNA(G.Dretzen，M.Bellard，P.Sassone-Corsi，P.Chambon(1981).

通过测定克隆的Sau3A DNA片段的序列，进一步分析此克隆(MB525)。使用Taq deoxy-terminal cycle sequencing kit(Perkin-Elmer，美国)、荧光标记的终止物和适当的寡核苷酸作为引物，通过引物行走进行DNA测序。

根据Devereux等人(1984)Nucleic Acid Res.12：387-395，进行序列数据的分析。编码甘露聚糖酶的序列显示于SEQ ID NO：5。衍生的蛋白质序列显示于SEQ ID NO：6。

B.agardhaerens甘露聚糖酶在枯草芽孢杆菌中的亚克隆和表达

Mannanase.upper.SacII

5′-CAT TCT GCA GCC GCG GCA GCA AGT ACA GGC TTT TAT GTT GAT GG-3′

Mannanase.lower.NotI

5′-GAC GAC GTA CAA GCG GCC GCG CTA TTT CCC TAA CAT GAT GAT ATTTTC G-3′

限制性位点Sac II和Nhe I标了下划线。

在根据制造商的说明书使用Amplitaq DNA聚合酶(Perkin Elmer)的PCR反应中，将如上所述由B.agaradherens NCIMB 40482分离的染色体DNA作为模板使用。在含200μM每种dNTP、2.5单位AmpliTaq聚合酶(Perkin-Elmer，Cetus，美国)和100pmol每种引物的PCR缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，0.01％(w/v)明胶)中建立PCR反应体系。

使用DNA热循环仪(Landgraf，德国)进行PCR反应。预变性94℃ 1min，随后进行30个PCR循环：变性94℃ 30sec，退火60℃ 1min，延伸72℃ 2min。取5μl扩增产物，通过0.7％琼脂糖凝胶(NuSieve，FMC)电泳进行分析。大小为1.4kb的DNA片段的出现，说明正确扩增了基因片段。

PCR片段的亚克隆

取45μl如上所述产生的PCR产物，根据制造商的说明书使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，美国)，进行纯化。将经纯化的DNA用50μl 10mM Tris-HCl(pH 8.5)洗脱。将5μg pMOL944和25μl经纯化的PCR片段，用Sa cII和Not I进行消化，在0.8％低熔点琼脂糖(SeaPlaque GTG，FMC)凝胶中进行电泳，从凝胶切下有关片段，并根据制造商的说明书使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，美国)进行纯化。然后将经分离的PCR DNA片段与经Sac II-Not I消化和纯化的pMOL944进行连接。连接反应使用0.5μg每种DNA片段、1U T4 DNA连接酶和T4连接酶缓冲液(Boehringer Mannheim，德国)，于16℃进行过夜。

将连接混和物用于转化感受态枯草芽孢杆菌PL2306。将经转化的细胞在LBPG-10μg/ml卡那霉素平板上铺板。于37℃温育18小时后，在平板上看到菌落。通过由过夜培养肉汤分离质粒DNA，分析了几个克隆。

如上所用，将这样一个阳性克隆在琼脂平板上几次进行划线，这个克隆叫做MB594。将克隆MB594在TY-10μg/ml卡那霉素中于37℃培养过夜，第二天取1ml细胞，根据制造商推荐用于制备枯草芽孢杆菌质粒的方案，使用Qiaprep Spin Plasmid Miniprep Kit#27106从细胞分离质粒。将此DNA进行DNA测序，揭示了相应于甘露聚糖酶的成熟部分，即所附SEQ ID NO：7的第94-1404位的DNA序列。衍生的成熟蛋白质显示于SEQ ID NO：8。由于PCR中使用的下链引物(lower primer)的设计，SEQ ID NO：5序列编码的甘露聚糖酶的3’端变成了SEQ ID NO：7显示的3’端。产生的氨基酸序列显示于SEQ IDNO：8，而且显然SEQ ID NO：6的C端(SHHVREIGVQFSAADNSSGQTALYVDNVTLR)变成了SEQ ID NO：8的C端(IIMLGK)。

实施例6

来自Bacillus agaradherens的甘露聚糖酶的表达、纯化和分析

将如实施例5中所述得到的克隆MB594，在含10μg/ml卡那霉素的25×200ml BPX培养基中，在500ml带双挡板的摇瓶中于37℃和300rpm培养5天。

收集了6500ml克隆MB594(批号#9813)的摇瓶培养液，并将pH调到5.5。一边搅动，一边加入146ml阳离子试剂(C521)和292ml阴离子试剂(A130)，用于絮凝。使用Sorval RC 3B离心机以9000rpm于6℃离心20分钟，对絮凝物进行分离。将上清液使用Whatman玻璃滤器GF/D和C进行澄清，最后在截留分子量为10kDa的Filtron滤膜上进行浓缩。

将750ml此浓缩液用NaOH调到pH7.5。使用50mM Tris(pH7.5)平衡的900ml Q-Sepharose层析柱，将清澈的溶液进行阴离子交换层析。将结合的甘露聚糖酶活性使用NaCl梯度洗脱。

纯酶在SDS-PAGE中显示分子量为38kDa的单一条带。

甘露聚糖酶的氨基酸序列，即DNA序列翻译的结果，显示于SEQ IDNO：6。

动力学常数的测定：

底物：豆角胶(长豆角)和还原糖分析(PHBAH)。豆角胶购自Sigma(G-0753)。

使用不同浓度豆角胶进行动力学测定，于40℃和pH10温育20分钟后，得到下述参数：

Kcat：467/sec

Km：0.08g/l

MW：38kDa

pI(等电点)：4.2

此甘露聚糖酶的最适温度是60℃。

pH活性特性曲线显示在pH 8-10之间活性最高。

DSC差异扫描量热法得到熔点是77℃(于pH7.5在Tris缓冲液中)，说明此甘露聚糖酶是对热很稳定的。

使用来自长豆角的0.2％AZCL-半乳甘露聚糖作为底物，并如上所述于40℃温育的洗涤剂相容性实验显示，该酶与常规液体洗涤剂的相容性极好，而且与常规粉状洗涤剂的相容性也较好。

实施例7

本发明的酶在洗涤剂中的使用

当以1ppm水平在微量清洗测试中使用常规的商业性液体洗涤剂进行测试时，如实施例6所述得到的经纯化的酶(批号#9813)显示有改进的清洁性能。测试在常规的北美清洗条件下进行。

实施例8

得自芽孢杆菌AAI12的甘露聚糖酶

芽孢杆菌AAI12的基因组文库的构建

将芽孢杆菌属之种的基因组DNA用限制酶Sau3A部分消化，并在0.7％琼脂糖凝胶(SeaKem琼脂糖，FMC，美国)上通过电泳进行大小分离。分离大小在1.5-10kb之间的片段，并通过将DNA片段在1.5％琼脂糖凝胶上进行反向电泳浓缩成一条DNA条带，随后根据制造商的说明书(Qiagen Inc.，美国)使用Qiaquick凝胶提取试剂盒，从琼脂糖凝胶切片提取片段。为了构建基因组文库，将约100ng上述经纯化和分离的DNA，与1ug经BamHI酶切、去磷酸化的lambdaZAPExpress载体臂(Stratagene，La Jolla，CA，美国)，根据制造商的说明书，于4℃连接24小时。取3μl连接混和物，直接使用GigaPackIII Gold包装提取物(Stratagene，美国)，根据制造商的说明书，进行包装。使用大肠杆菌XL1-Blue MRF-菌株(Stratagene，La Jolla，美国)，测定基因组lambdaZAPExpress噬菌体文库滴度。未扩增的基因组文库包含7.8×10⁷噬斑形成单位(plaque-forming units，pfu)，载体背景小于1％。

通过lambdaZAPExpress中的功能表达筛选β-甘露聚糖酶克隆

将基因组文库的大约5000个噬斑形成单位(pfu)，使用大肠杆菌XL1-Blue MRF’(Stratagene，美国)作为宿主，在含0.1％AZCL-半乳甘露聚糖(MegaZyme，澳大利亚，目录号I-AZGMA)的NZY琼脂平板上铺板，随后将平板于37℃温育24小时。通过阳性噬菌体克隆周围形成的蓝色水解晕轮，鉴定甘露聚糖酶阳性的λ克隆。通过挖取含感兴趣的噬斑的顶层琼脂片，转移到500μl SM缓冲液和20μl氯仿中，从筛选平板回收这些甘露聚糖酶阳性λ克隆。通过将挖取的噬菌体储存物一部分在上述含0.1％AZCL-半乳甘露聚糖的NZY平板上铺板，对甘露聚糖酶阳性lambdaZAPExpress克隆进行噬斑纯化。挖取单个甘露聚糖酶阳性的λ克隆，转移到500μl SM缓冲液和20μl氯仿中，并通过再一轮如上所述铺板进行纯化。

甘露聚糖酶阳性lambdaZAPExpress克隆中进行噬菌粒单个克隆的体内切除

制备大肠杆菌XL1-Blue细胞(Stratagene，La Jolla，CA)，并如Stratagene(La Jolla，美国)推荐的，重悬于10mM MgSO₄。在Falcon2059管中，将250μl甘露聚糖酶阳性克隆的纯噬菌体储存物，与200μl XL1-Blue MRF’细胞(OD₆₀₀＝1.0)和＞10⁶pfu/ml的ExAssist M13辅助噬菌体(Stratagene)混和，并将混和物于37℃温育15分钟。向每管中加入3ml NZY肉汤，并将管于37℃温育2.5小时。将管于65℃加热20分钟，以杀死大肠杆菌细胞和λ噬菌体；噬菌粒对加热有抗性。将管以3000rpm离心15分钟，以除去细胞碎片，并将上清液转移到干净的Falcon 2059管中。取一部分含经切割的单链噬菌粒的上清液，经于37℃温育15分钟，用来感染200μl大肠杆菌XLOLR细胞(Stratagene，OD₆₀₀＝1.0，重悬于10mM MgS0₄)。向细胞中加入350μl NZY肉汤，并将管于37℃温育45分钟。取一部分细胞，在LB卡那霉素琼脂平板上铺板，并于37℃温育24小时。取五个经切割的单菌落，在含0.1％AZCL-半乳甘露聚糖(MegaZyme，澳大利亚)的LB卡那霉素琼脂平板上重新划线。甘露聚糖酶阳性的噬菌粒克隆的特征为，在阳性克隆周围形成有蓝色水解晕轮。将分离的噬菌粒DNA(QiaSpin kit，Qiagen，美国)，用EcoRI、PstI、EcoRI-PstI、和HindIII限制酶消化，随后进行琼脂糖凝胶电泳，由此进一步分析这些甘露聚糖酶阳性的噬菌粒克隆。

核苷酸序列分析

通过双脱氧链终止方法(F.Sanger，S.Nicklen，和A.R.Coulson(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74：5463-5467)，使用500ng经Qiagen纯化的模板(Qiagen，美国)、Taq deoxy-terminalcycle sequencing kit(Perkin-Elmer，美国)、荧光标记的终止物和5pmol pBK-CMV多接头引物(Stratagene，美国)或合成寡核苷酸引物，测定两条链的基因组β-1，4-甘露聚糖酶克隆pBXM1的核苷酸序列。根据Devereux等人的方法(J.Devereux，P.Haeberli和O.Smithies(1984)Nucleic Acid Res.12：387-395)，进行序列数据的分析。

序列排序

使用GCG Wisconsin软件包8.1版的PileUp程序(见上)，对来自本发明的芽孢杆菌AAI12(SEQ ID NO：10)、解糖热解纤维素菌(GenBank/EMBL编号P77847)、嗜热网球菌(编号030654)、海洋红嗜热盐菌(编号P49425)、ManA编码的Piromyces sp.(编号P55296)、芽孢杆菌属的种(编号P91007)、枯草芽孢杆菌(编号005512)和荧光假单胞菌(编号P49424)的多序列排序糖水解酶家族26的β-1，4-甘露聚糖酶进行；其中缺口产生罚分3.00，缺口延伸罚分0.10。

序列相似性

由芽孢杆菌AAI12克隆的本发明的家族26的β-1，4-甘露聚糖酶推导的氨基酸序列，显示与解糖热解纤维素菌的β-1，4-甘露聚糖酶(GenBank/EMBL编号P77847)45％的相似性和19.8％的序列同一性，与嗜热网球菌的β-1，4-甘露聚糖酶(编号030654)49％的相似性和25.1％的同一性，与海洋红嗜热盐菌的β-1，4-甘露聚糖酶(编号P49425)48.2％的相似性和26.8％的同一性，与ManA编码的Piromycessp.的β-1，4-甘露聚糖酶(编号P55296)46％的相似性和19.5％的序列同一性，与芽孢杆菌属的种的β-1，4-甘露聚糖酶(编号P91007)47.2％的相似性和22％的同一性，与枯草芽孢杆菌的β-1，4-甘露聚糖酶(编号005512)52.4％的相似性和27.5％的同一性，与荧光假单胞菌的β-1，4-甘露聚糖酶(编号P49424)60.6％的相似性和37.4％的同一性。使用GCG Wisconsin软件包8.1版的GAP程序对序列进行排序；缺口产生罚分3.00，其中缺口延伸罚分0.10。

芽孢杆菌AAI12甘露聚糖酶基因的克隆

枯草芽孢杆菌中甘露聚糖酶的亚克隆和表达：

BXM1.upper.SacII

5′-CAT TCT GCA GCC GCG GCA TTT TCT GGA AGC GTT TCA GC-3′

BXM1.lower.NotI

5′-CAG CAG TAG CGG CCG CCA CTT CCT GCT GGT ACA TAT GC-3′

限制性位点Sac II和Not I标了下划线。

在根据制造商的说明书使用Amplitaq DNA聚合酶(Perkin Elmer)的PCR反应中，将如上所述由芽孢杆菌AAI12分离的染色体DNA作为模板使用。在含200μM每种dNTP、2.5单位AmpliTaq聚合酶(Perkin-Elmer，Cetus，美国)和100pmol每种引物的PCR缓冲液(10mMTris-HCl，pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，0.01％(w/v)明胶)中建立PCR反应体系。

使用DNA热循环仪(Landgraf，德国)进行PCR反应。预变性94℃1min，随后进行30个PCR循环：变性94℃30sec，退火60℃1min，延伸72℃2min。取5μl扩增产物，通过0.7％琼脂糖凝胶(NuSieve，FMC)电泳进行分析。大小为1.0kb的DNA片段的出现，说明正确扩增了基因片段。

PCR片段的亚克隆：

取45μl如上所述产生的PCR产物，根据制造商的说明书使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，美国)，进行纯化。将经纯化的DNA用50μl 10mM Tris-HCl(pH8.5)洗脱。将5μg pMOL944和25μl经纯化的PCR片段，用Sac II和Not I进行消化，在0.8％低熔点琼脂糖(SeaPlaque GTG，FMC)凝胶中进行电泳，从凝胶上切下相关片段，并根据制造商的说明书使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，美国)进行纯化。然后将经分离的PCR DNA片段与经Sac II-Not I消化和纯化的pMOL944进行连接。连接反应使用0.5μg每种DNA片段、1U T4 DNA连接酶和T4连接酶缓冲液(Boehringer Mannheim，德国)，于16℃进行过夜。

将连接混和物用于转化感受态枯草芽孢杆菌PL2306。将经转化的细胞在LBPG-10μg/ml卡那霉素-琼脂平板上铺板。于37℃温育18小时后，在平板上看到菌落。通过由过夜培养肉汤分离质粒DNA，分析了几个克隆。

如上所用，将这样一个阳性克隆在琼脂平板上几次进行划线，这个克隆叫做MB747。将克隆MB747在TY-10μg/ml卡那霉素中于37℃培养过夜，第二天取1ml细胞，根据制造商推荐用于制备枯草芽孢杆菌质粒的方案，使用Qiaprep Spin Plasmid Miniprep Kit#27106从细胞分离质粒。将此DNA进行DNA测序，揭示了对应于SEQ ID NO：9中甘露聚糖酶成熟部分的DNA序列。

来自芽孢杆菌从I12的甘露聚糖酶的表达、纯化和分析

将如上所述得到的克隆MB747，在含10μg/ml卡那霉素的25×200ml BPX培养基中，在500ml带双挡板的摇瓶中于37℃和300rpm培养5天。

收集了4100ml克隆MB747的摇瓶培养液，将pH调到7.0，并加入EDTA至终浓度2mM。一边搅动，一边加入185ml阳离子试剂(10％C521)和370ml阴离子试剂(A130)，用于絮凝。使用Sorval RC 3B离心机以9000rpm于6℃离心20分钟，对絮凝物进行分离。将上清液使用Whatman玻璃滤器GF/D和C进行澄清，最后在截留分子量为10kDa的Filtron滤膜上进行浓缩。

将1500ml此浓缩液用NaOH调到pH7.5。将清澈的溶液使用经25mMTris(pH7.5)平衡的1000ml Q-Sepharose层析柱进行阴离子交换层析。将结合的甘露聚糖酶活性使用NaCl梯度洗脱到1100ml中。将此洗脱液使用Filtron滤膜浓缩成440ml。为了得到高纯度的甘露聚糖酶，将浓缩液通过用0.1M醋酸钠(pH6.0)平衡的Superdex层析柱。

纯酶在SDS-PAGE中显示分子量为62kDa的单一条带。

该甘露聚糖酶的氨基酸序列，即DNA序列翻译的结果，显示于SEQID NO：10。

测定了下面的N端序列：FSGSVSASGQELKMTDQN。

pI(等电点)：4.5

DSC差异扫描量热法得到熔点是64℃(于pH6.0在醋酸钠缓冲液中)，说明此甘露聚糖酶是热稳定的。

发现催化活性随离子强度增加，说明酶的比活性可以通过使用具有高离子强度的磷酸盐缓冲液而增加。

本发明的多肽的甘露聚糖酶活性被钙离子抑制。

免疫学特性：使用常规技术，在丹麦公司DAKO，制备了针对高纯度的本发明的甘露聚糖酶的兔多克隆单一特异性血清。血清在琼脂糖凝胶中与粗制的本发明的甘露聚糖酶形成好的单一沉淀。

实施例9

实施例8的酶在洗涤剂中的使用

如上所述，使用商业性洗涤剂而非缓冲液，与来自豆角的0.2％AZCL-半乳甘露聚糖(Megazyme，澳大利亚)，于40℃温育20分钟，随后测定形成的蓝色，测得如实施例8所述得到的酶有活性，在欧洲粉状洗涤剂Ariel Futur中有132％的相对活性，在美国Tide粉中有108％的相对活性，在美国Tide液体洗涤剂中有86％的相对活性(相对于在甘氨酸缓冲液中测量的活性)。在这些测试中，洗涤剂浓度如商业性洗涤剂包装上推荐的，清洗水是自来水，在欧洲(Ariel Futur)条件下为18度德国硬度，在美国条件(美国Tide)下为9度。

实施例10

得自耐盐芽孢杆菌的甘露聚糖酶

在pSJ1678载体中构建耐盐芽孢杆菌的基因组文库

将耐盐芽孢杆菌的基因组DNA用限制酶Sau3A部分消化，并在0.7％琼脂糖凝胶(SeaKem琼脂糖，FMC，美国)上通过电泳进行大小分离。通过电泳到DEAE-纤维素纸上，分离大小在2-10kb之间的DNA片段(G.Dretzen，M.Bellard，P.Sassone-Corsi，P.Chambon(1981)从琼脂糖和丙烯酰胺回收DNA片段的可靠方法，Anal.Biochem.，112：295-298)。将经分离的DNA片段与经BamH I消化的pSJ1678质粒DNA连接，并将连接混和物用于转化大肠杆菌SJ2。

通过大肠杆菌中的功能表达筛选β-甘露聚糖酶克隆

将基因组文库的大约10,000个噬斑形成单位(pfu)，使用大肠杆菌SJ2作为宿主，在含9μg/ml氯霉素和0.1％AZCL-半乳甘露聚糖(MegaZyme，澳大利亚，目录号I-AZGMA)的LB琼脂平板上铺板，随后将平板于37℃温育24小时。通过阳性质粒克隆周围形成的蓝色水解晕轮，鉴定甘露聚糖酶阳性的大肠杆菌菌落。通过将分离的菌落在如上所述含9μg/ml氯霉素和0.1％AZCL-半乳甘露聚糖的LB平板上重新划线，对pSJ1678中的甘露聚糖酶阳性克隆进行菌落纯化。将单个、甘露聚糖酶阳性的质粒克隆接种5ml含9μg/ml氯霉素的LB培养基，用于纯化质粒DNA。

核苷酸序列分析

通过双脱氧链终止方法(F.Sanger，S.Nicklen，和A.R.Coulson(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74：5463-5467)，使用500ng经Qiagen纯化的模板(Qiagen，美国)、Taq deoxy-terminalcycle sequencing kit(Perkin-Elmer，美国)、荧光标记的终止物和5pmol pBK-CMV多接头引物(Stratagene，美国)或合成寡核苷酸引物，测定两条链的基因组β-1，4-甘露聚糖酶克隆pBXM5的核苷酸序列。根据Devereux等人的方法(J.Devereux，P.Haeberli和O.Smithies(1984)Nucleic Acid Res.12：387-395)，进行序列数据的分析。

序列排序

对来自本发明的耐盐芽孢杆菌(即SEQ ID NO：12)、环状芽孢杆菌(GenBank/EMBL编号066185)、弧菌属的种(编号069347)、浅青紫链霉菌(编号P51529)、和解糖热解纤维素菌(编号P22533)的糖水解酶家族5的β-1，4-甘露聚糖酶进行多序列排序。使用GCGWisconsin软件包8.1版的PileUp程序产生多序列排序；其中缺口产生罚分3.00，其中缺口延伸罚分0.10。

序列相似性

由耐盐芽孢杆菌克隆的、本发明的家族5的β-1，4-甘露聚糖酶推导的氨基酸序列，显示与环状芽孢杆菌β-1，4-甘露聚糖酶(GenBank/EMBL编号066185)77％的相似性和60％的序列同一性，与弧菌属的种的β-1，4-甘露聚糖酶(编号069347)64.2％的相似性和46％的同一性，与浅青紫链霉菌β-1，4-甘露聚糖酶(编号P51529)63％的相似性和41.8％的同一性，与解糖热解纤维素菌的β-1，4-甘露聚糖酶(编号P22533)60.3％的相似性和42％的序列同一性。使用GCG Wisconsin软件包8.1版的GAP程序对序列进行排序；缺口产生罚分3.00，缺口延伸罚分0.10。

耐盐芽孢杆菌的甘露聚糖酶基因的克隆

枯草芽孢杆菌中成熟全长甘露聚糖酶的亚克隆和表达：

BXM5.upper.SacII

5′-CAT TCT GCA GCC GCG GCA CAT CAC AGT GGG TTC CAT G-3′

BXM5.lower.NotI

5′-GCG TTG AGA CGC GCG GCC GCT TAT TGA AAC ACA CTG CTT CTT TTAG-3′

限制性位点Sac II和Not I标了下划线。

在根据制造商的说明书使用Amplitaq DNA聚合酶(Perkin Elmer)的PCR反应中，将如上所述由耐盐芽孢杆菌分离的染色体DNA作为模板使用。在含200μM每种dNTP、2.5单位AmpliTaq聚合酶(Perkin-Elmer，Cetus，美国)和100pmol每种引物的PCR缓冲液(100mMTris-HCl，pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，0.01％(w/v)明胶)中建立该PCR反应体系。

使用DNA热循环仪(Landgraf，德国)进行PCR反应。预变性94℃1min，随后进行30个PCR循环：变性94℃30sec，退火60℃1min，延伸72℃2min。取5μl扩增产物，通过0.7％琼脂糖凝胶(NuSieve，FMC)电泳进行分析。大小为0.9kb的DNA片段的出现，说明正确扩增了基因片段。

PCR片段的亚克隆：

取45μl如上所述产生的PCR产物，根据制造商的说明书使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，美国)，进行纯化。将经纯化的DNA用50μl 10mM Tris-HCl(pH8.5)洗脱。将5μg pMOL944和25μl经纯化的PCR片段，用Sac II和Not I进行消化，在0.8％低熔点琼脂糖(SeaPlaque GTG，FMC)凝胶中进行电泳，从凝胶上切下相关片段，并根据制造商的说明书使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，美国)进行纯化。然后将经分离的PCR DNA片段与经SacII-NotI消化和纯化的pMOL944进行连接。连接反应使用0.5μg每种DNA片段、1U T4 DNA连接酶和T4连接酶缓冲液(Boehringer Mannheim，德国)，于16℃进行过夜。

将这样一个阳性克隆在如上所用的琼脂平板上几次进行划线，这个克隆叫做MB878。将克隆MB878在TY-10μg/ml卡那霉素中于37℃培养过夜，第二天取1ml细胞，根据制造商推荐用于制备枯草芽孢杆菌质粒的方案，使用Qiaprep Spin Plasmid Miniprep Kit#27106从细胞分离质粒。将此DNA进行DNA测序，揭示了对应于SEQ ID NO：11的第97-993位和SEQ ID NO：12的第33-331位所示甘露聚糖酶成熟部分的DNA序列。

来自耐盐芽孢杆菌的甘露聚糖酶的表达、纯化和分析

将如上所述得到的克隆MB878，在含10μg/ml卡那霉素的25×200ml BPX培养基中，在500ml带双挡板的摇瓶中于37℃和300rpm培养5天。

收集了5000ml克隆MB878的摇瓶培养液，并将pH调到6.0。一边搅动，一边加入125ml阳离子试剂(10％C521)和250ml阴离子试剂(A130)，用于絮凝。使用Sorval RC 3B离心机以9000rpm于6℃离心20min，对絮凝物进行分离。将上清液用NaOH调pH8.0，并使用Whatman玻璃滤器GF/D和C进行澄清。然后将50g DEAE A-50 Sephadex用0.1M醋酸钠(pH6.0)平衡，并加到滤出液中，使酶结合并于室温放置过夜。使用含0.5M NaCl的醋酸盐缓冲液将结合的酶洗脱下来。然后用NaOH调pH8.0，在截留分子量为10kDa的Filtron滤膜上浓缩至450ml，并用20％甘油、20％MPG和2％Berol进行稳定。将产物用于应用试验。

取2ml此浓缩液，用NaOH调pH8.5。为了得到高纯度的甘露聚糖酶，将浓缩液通过用0.1M磷酸钠(pH8.5)平衡的Superdex层析柱。

纯酶在SDS-PAGE中显示分子量为34kDa的单一条带。

该甘露聚糖酶的氨基酸序列，即DNA序列翻译的结果，显示于SEQID NO：12。

测定了经纯化的蛋白质下述的N端序列：AHHSGFHVNGTTLYDA。

使用ManU实验(于40℃温育20分钟)的pH活性特性曲线显示酶在pH 7.5-10之间具有高于50％的相对活性。

最适温度(使用ManU实验；甘氨酸缓冲液)在pH10时在60-70℃之间。

实施例11

实施例10的甘露聚糖酶在洗涤剂中的使用

如上所述，使用商业性洗涤剂而非缓冲液，与来自豆角的0.2％AZCL-半乳甘露聚糖(Megazyme，澳大利亚)，于40℃温育20分钟，随后测定形成的蓝色，测得如实施例10所述得到的甘露聚糖酶有活性，在欧洲液体洗涤剂Ariel Futur中、在美国Tide粉中和在美国Tide液体洗涤剂中的相对活性是在缓冲液中的活性的40％以上。在这些测试中，洗涤剂浓度如商业性洗涤剂包装上推荐的，清洗水是自来水，在欧洲(Ariel Futur)条件下为18度德国硬度，在美国条件(美国Tide)下为9度。

实施例12

得自芽孢杆菌AA349的甘露聚糖酶

芽孢杆菌AA349的甘露聚糖酶基因的克隆

枯草芽孢杆菌中催化核心甘露聚糖酶的亚克隆和表达：

使用由下面两种寡核苷酸组成的PCR引物对，PCR扩增本发明的甘露聚糖酶编码DNA序列：

BXM7.upper.SacII

5′-CAT TCT GCA GCC GCG GCA AGT GGA CAT GGG CAA ATG C-3′

BXM7.lower.NotI

5′-GCG TTG AGA CGC GCG GCC GCT TAT TTT TTG TAT ACA CTA ACG ATTTC-3′

限制性位点Sac II和Not I标了下划线。

在根据制造商的说明书使用Amplitaq DNA聚合酶(Perkin Elmer)的PCR反应中，将如上所述由芽孢杆菌AA349分离的染色体DNA作为模板使用。在含200μM每种dNTP、2.5单位AmpliTaq聚合酶(Perkin-Elmer，Cetus，美国)和100pmol每种引物的PCR缓冲液(10mMTris-HCl，pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，0.01％(w/v)明胶)中建立PCR反应体系。

PCR片段的亚克隆：

将这样一个阳性克隆在如上所用的琼脂平板上几次进行划线，这个克隆叫做MB879。将克隆MB879在TY-10μg/ml卡那霉素中于37℃培养过夜，第二天取1ml细胞，根据制造商推荐用于制备枯草芽孢杆菌质粒的方案，使用Qiaprep Spin Plasmid Miniprep Kit#27106从细胞分离质粒。将此DNA进行DNA测序，揭示有对应于甘露聚糖酶的成熟部分(相应于所附DNA序列SEQ ID NO：15的第204-1107位和所附蛋白质序列SEQ ID NO：16的第26-369位)的DNA序列。来自芽孢杆菌AA349的甘露聚糖酶的表达、纯化和分析

将如上所述得到的克隆MB879，在含10μg/ml卡那霉素的25×200ml BPX培养基中，在500ml带双挡板的摇瓶中于37℃和300rpm培养5天。

收集了400ml克隆MB879的摇瓶培养液，并将pH调到6.5。一边搅动，一边加入19ml阳离子试剂(10％C521)和38ml阴离子试剂(A130)，用于絮凝。使用Sorval RC 3B离心机以5000rpm于6℃离心25分钟，对絮凝物进行分离。然后在截留分子量为10kDa的Filtron滤膜上进行浓缩，并用水清洗以降低电导率，终体积至150ml。然后调pH4.0，并将液体在50mM醋酸钠缓冲液(pH4.0)中进行S-Sepharose层析。首先将层析柱用到0.5M的NaCl梯度进行洗脱，然后用0.1M甘氨酸缓冲液(pH10)洗脱甘露聚糖酶。合并甘露聚糖酶活性部分的收集液，它们在SDS-PAGE中显示分子量为38kDa的单一条带。

甘露聚糖酶的氨基酸序列，即DNA序列翻译的结果，显示于SEQ IDNO：16。

使用ManU实验(于40℃温育20分钟)的pH活性特性曲线显示该酶在pH 5-10之间具有高于30％的相对活性。

免疫学特性：使用常规技术，在丹麦公司DAKO，制备了针对高纯度的克隆甘露聚糖酶的兔多克隆单一特异性血清。该血清在琼脂糖凝胶中与粗制未纯化的本发明甘露聚糖酶形成好的单一沉淀。

实施例13

实施例12的甘露聚糖酶在洗涤剂中的使用

如上所述，使用商业性洗涤剂而非缓冲液，与来自豆角的0.2％AZCL-半乳甘露聚糖(Megazyme，澳大利亚)，于40℃温育20分钟，随后测定形成的蓝色，由此测得如实施例12所述得到的甘露聚糖酶有活性，在欧洲液体洗涤剂Ariel Futur中和在美国Tide液体洗涤剂中的相对活性是缓冲液中的活性的65％以上。甘露聚糖酶在欧洲粉状洗涤剂Ariel Futur中和在美国Tide粉中的活性高于35％。在这些测试中，洗涤剂浓度如商业性洗涤剂包装上推荐的，清洗水是自来水，在欧洲(Ariel Futur)条件下为18度德国硬度，在美国条件(美国Tide)下为9度。

实施例14

得自真菌菌株Humicola insolens DSM 1800的甘露聚糖酶来自Humicola insolens的家族26的β-1，4-甘露聚糖酶的表达克隆真菌菌株和培养条件

如WO97/32014中所述将Humicola insolens菌株DSM 1800发酵。于26℃5天后，收获菌丝体，立即在液氮中冷冻，并冻存于-80℃。制备无RNA酶的玻璃制品、吸头和溶液

在分离RNA中使用的所有玻璃器皿于220℃烘烤至少12小时。Eppendorf管、取液器吸头和塑料柱在EtOH配制的0.1％焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)中处理12小时，并高压灭菌。所有缓冲液和水(除了含Tris的缓冲液)用0.1％DEPC于37℃处理12小时，并高压灭菌。

提取总RNA

通过硫氰酸胍提取及随后通过CsCl层超速离心制备总RNA(Chirgwin等人，1979)，其中作了下列改动。用研钵和杵子将冷冻的菌丝体在液氮中研磨成细粉，随后在预冷的咖啡磨粉机中研磨，并立即重悬于5体积RNA提取缓冲液(4M GuSCN，0.5％十二烷基肌氨酸钠，25mM柠檬酸钠，pH7.0，0.1M β-巯基乙醇)。将混和物于室温搅拌30分钟，并于室温以5000rpm离心30分钟(Heraeus Megafuge1.0R)，以沉淀细胞碎片。收集上清液，以每12.0ml CsCl层加26.5ml上清液的比例，将上清液小心的加到5.7M CsCl层上(5.7M CsCl，0.1MEDTA，pH7.5，0.1％DEPC；使用之前高压灭菌)，并离心得到总RNA(Beckman，SW28转头，25,000rpm，室温，24h)。离心后，小心的除去上清液，并切下含有RNA沉淀的管子底部，用70％EtOH漂洗。将总RNA沉淀转移到Eppendorf管中，重悬于500ml TE(pH7.6)(如果溶解困难，偶尔于65℃加热5分钟)，酚抽提并用乙醇于-20℃沉淀12小时(2.5体积EtOH，0.1体积3M NaAc，pH5.2)。离心收集RNA，用70％EtOH清洗，并重悬于最小体积的DEPC-DIW。通过测量OD_260/280，测定RNA浓度。

分离poly(A)⁺RNA

通过寡(dT)-纤维素亲和层析分离poly(A)⁺RNA(Aviv和Leder，1972)。通常，取0.2g寡(dT)-纤维素(Boehringer Mannheim，检验结合能力)在10ml 1x层析上样缓冲液(20mM Tris-Cl，pH7.6，0.5MNaCl，1mM EDTA，0.1％SDS)中预溶胀，灌到DEPC处理过的、堵住的塑料层析柱(Poly Prep Chromatography Column，Bio Rad)上，并用20ml 1x上样缓冲液平衡。将总RNA于65℃加热8分钟，在冰上骤冷5分钟，并在向RNA样品中加入1体积2x层析上样缓冲液后，加样至层析柱上。收集洗脱液，并重复上样2-3次，每次加样前如上将样品加热并在冰上骤冷。将寡(dT)层析柱用10体积1x加样缓冲液进行清洗，然后用3体积中度盐缓冲液(20mM Tris-Cl，pH7.6，0.1M NaCl，1mM EDTA，0.1％SDS)清洗，随后用3体积预热至65℃的洗脱缓冲液(10mM Tris-Cl，pH7.6，1mM EDTA，0.05％SDS)将poly(A)⁺RNA洗脱，收集500ml级分。读取每份收集液的OD₂₆₀，并合并含mRNA的收集液，于-20℃乙醇沉淀12h。离心收集poly(A)⁺RNA，重悬于DEPC-DIW，并以每份5-10mg冻存于-80℃。

cDNA的合成

第一条链的合成

通过F.S.Hagen(个人交流)发展的、使用发夹修饰的RNase H方法(Gubler和Hoffman 1983，Sambrook等人1989)，由5mg Humicolainsolens的poly(A)⁺RNA合成双链cDNA。将poly(A)⁺RNA(5mg溶于5ml DEPC处理过的水)于70℃加热8分钟，在冰上骤冷，并与含1mM每种dNTP(Pharmacia)、40单位人胎盘核酸酶抑制剂(RNasin，Promega)、10mg寡(dT)_12-18引物(Pharmacia)和1000单位SuperScriptII RNase H-逆转录酶(Bethesda Research Laboratories)的逆转录酶缓冲液(50mM Tris-Cl，pH8.3，75mM KCl，3mM MgCl₂，10mM DTT，Bethesda Research Laboratories)混和，终体积50ml。通过将反应混和物于45℃温育1h，合成cDNA的第一条链。

第二条链的合成

合成后，加入30ml 10mM Tris-Cl，pH7.5，1mM EDTA，并通过加入40mg糖原载体(Boehringer Mannheim)、0.2体积10M NH₄Ac和2.5体积96％EtOH，将mRNA：cDNA杂合体于-20℃乙醇沉淀12h。离心回收杂合体，在70％EtOH中清洗，在空气中干燥，并重悬于250ml含100mM每种dNTP、44单位大肠杆菌DNA聚合酶I(Amersham)、6.25单位RNase H(Bethesda Research Laboratories)和10.5单位大肠杆菌DNA连接酶(New England Biolabs)的第二条链缓冲液(20mMTris-Cl，pH7.4，90mM KCl，4.6mM MgCl₂，10mM(NH₄)₂SO₄，16mM βNAD⁺)。通过将反应管于16℃温育3h，进行cDNA第二条链的合成，并通过加入EDTA至20mM终浓度终止反应，随后酚抽提。

绿豆核酸酶的处理

通过加入2体积96％EtOH和0.1体积3M NaAc(pH5.2)，将双链(ds)cDNA于-20℃乙醇沉淀12h，离心回收，在70％EtOH中清洗，干燥(SpeedVac)，并重悬于30ml含36单位绿豆核酸酶(BethesdaResearch Laboratories)的绿豆核酸酶缓冲液(30mM NaAc，pH4.6，300mM NaCl，1mM ZnSO₄，0.35mM DTT，2％甘油)。将反应体系于30℃温育30分钟剪切掉单链发夹DNA，随后加入70ml 10mM Tris-Cl(pH7.5)和1mM EDTA、酚抽提和用2体积96％EtOH和0.1体积3M NaAc(pH5.2)于-20℃乙醇沉淀12小时。

用T4 DNA聚合酶进行末端补平

与T4 DNA聚合酶在50ml含0.5mM每种dNTP和7.5单位T4 DNA聚合酶(Invitrogen)的T4 DNA聚合酶缓冲液(20mM Tris-醋酸，pH7.9，10mM MgAc，50mM KAc，1mM DTT)中，于37℃温育15分钟，将ds cDNA补平。加入EDTA至20mM终浓度终止反应，随后酚抽提和乙醇沉淀。衔接头连接和大小选择

填充反应后，将cDNA与非回文的BstX I衔接头(1mg/ml，Invitrogen)在30ml含600pmol BstXI衔接头和5单位T4连接酶(Invitrogen)的连接缓冲液(50mM Tris-Cl，pH7.8，10mM MgCl₂，10mM DTT，1mM ATP，25ng/ml牛血清清蛋白)中，于16℃温育12小时，进行连接。于70℃加热5分钟终止反应，并将经衔接的cDNA通过琼脂糖凝胶电泳(0.8％HSB琼脂糖，FMC)进行大小分离，以除去未连接的衔接头和小cDNA。以0.7kb截留值将cDNA进行大小选择，并在10mM Tris-Cl(pH7.5)和1mM EDTA中于100volt进行1小时将cDNA从琼脂糖凝胶上电洗脱，酚抽提，并如上于-20℃乙醇沉淀12小时。

Humicola insolens cDNA文库的构建

离心回收经衔接的ds cDNA，在70％EtOH中清洗，并重悬于25mlDIW。在进行大量文库连接前，先在10ml各含1ml ds cDNA(反应管号#1-#3)、2单位T4连接酶(Invitrogen)和50ng(管号#1)、100ng(管号#2)和200ng(管号#3和#4)经BstX I酶切的pYES2.0载体(Invitrogen)的连接缓冲液(同上)中进行四个测试连接反应。通过于16℃温育12小时进行连接反应，于70℃加热5分钟，每个连接取1ml，电穿孔(200W，2.5kV，25mF)转化40ml感受态大肠杆菌1061细胞(在1升LB肉汤中，OD600＝0.9，在冷的DIW中洗两次，在20ml 10％甘油中洗一次，重悬于2ml 10％甘油)。向每份转化混和物中加入1ml SOC后，将细胞于37℃培养1小时，取50ml在含100mg/ml氨苄青霉素的LB平板上铺板，并于37℃培养12小时。

使用最佳条件，在40ml含9单位T4连接酶的连接缓冲液中建立大量连接体系，并将反应于16℃温育12小时。通过于70℃加热5分钟终止连接反应，于-20℃乙醇沉淀12小时，离心回收，并重悬于10mlDIW。取1ml，使用同上电穿孔条件转化电感受态大肠杆菌1061细胞，并滴定经转化的细胞，将文库以5000-7000cfu/板，在含氨苄青霉素的LB平板上铺板。将包含1×10⁶重组克隆的cDNA文库如下保存：1)多个独立库(5000-7000cfu/库)在20％甘油中冻存于-80℃，2)相同库的细胞沉淀冻存于-20℃，和3)来自多个独立库的经Qiagen纯化的质粒DNA冻存于-20℃(Qiagen Tip 100，Qiagen)。来自Humicola insolens的β-1，4-甘露聚糖酶cDNA在酿酒酵母中的表达克隆

取1ml来自各个独立库的经纯化的质粒DNA(100ng/ml)，电穿孔(200W，1.5kV，25mF)转化40ml电感受态酿酒酵母(S.cerevisiae)W3124(MATa；ura 3-52；leu 2-3，112；his 3-D200；pep 4-1137；prc1::HIS3；prb1::LEU2；cir+)细胞(在500ml YPD中，OD600＝1.5，在冷的DIW中洗两次，在冷的1M山梨糖醇中洗一次，重悬于0.5ml1M山梨糖醇，Becker和Guarante，1991)。加入1ml 1M冷的山梨糖醇后，取80ml样品在SC+葡萄糖-尿嘧啶上铺板，得到250-400个菌落形成单位/板，并于30℃培养3-5天。将平板复制到含AZCL-半乳甘露聚糖(MegaZyme，澳大利亚)的SC+半乳糖-尿嘧啶琼脂平板上。总的来说，对约50,000个来自H.insolens的酵母菌落筛选甘露聚糖酶阳性克隆。

通过酵母菌落周围形成的蓝色水解晕轮，鉴定阳性克隆。以单菌落的形式得到克隆，使用生物素化的pYES2.0多接头引物，直接由酵母细胞裂解物扩增cDNA插入片段，用磁珠(Dynabead M-280，Dynal)系统纯化，并通过使用链终止方法(Sanger等人，1977)和测序酶系统(United States Biochemical)测定每个cDNA克隆的5’端序列进行各个分析。

将甘露聚糖酶阳性酵母菌落接种在装有20ml YPD肉汤的50ml管中。将管于30℃振摇2天，并以3000rpm离心10分钟收获细胞。根据WO94/14953，分离总酵母DNA，溶于50ml灭菌水，并如上通过电穿孔转化大肠杆菌。通过在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上铺板，回收含插入片段的pYES2.0 cDNA克隆，使用常规步骤由大肠杆菌分离质粒DNA，并通过用限制酶消化进行分析。

核苷酸序列分析

通过双脱氧链终止方法(Sanger等人，1977)，使用500ng经Qiagen纯化的模板(Qiagen，美国)、Taq deoxy-terminal cycle sequencingkit(Perkin-Elmer，美国)、荧光标记的终止物和5pmol pYES2.0多接头引物(Invitrogen，美国)，由两条链测定全长H.insolensβ-1，4-甘露聚糖酶cDNA克隆pC1M59的核苷酸序列。根据Devereux等人(1984)的方法进行序列数据的分析。

在米曲霉中的异源表达

米曲霉的转化

如Christensen等人(1988)，Biotechnology 6：1419-1422描述的，进行米曲霉的转化。

用于曲霉属表达的β-1，4-甘露聚糖酶表达盒的构建

使用标准步骤由甘露聚糖酶克隆pC1M59分离质粒DNA，并用限制酶进行分析。使用适当的限制酶切下cDNA插入片段，并连接到曲霉属表达载体pHD414中，此载体是质粒p775(描述于EP 238023)的衍生物。pHD414的构建进一步描述于WO93/11249。

米曲霉或黑曲霉的转化

常规步骤：用米曲霉或黑曲霉的孢子接种100ml YPD(Sherman等人，酵母遗传学方法(Methods in Yeast Genetics)，Cold SpringHarbor Laboratory，1981)，并于37℃振摇培养大约2天。通过？滤布(miracloth)过滤收获菌丝体，并用200ml 0.6M MgSO₄清洗。将菌丝体悬浮于15ml 1.2M MgSO₄、10mM NaH₂PO₄(pH5.8)。将悬浮液在冰上冷却，加入含120mg234的1ml缓冲液。5分钟后，加入1ml 12mg/ml BSA，并于37℃轻轻摇动温育1.5-2.5小时，直至在显微镜下检查，在样品中看见大量原生质体。通过滤布将悬浮液过滤，将滤出液转移到无菌管中，并用5ml 0.6M山梨糖醇和100mMTris-HCl(pH7.0)覆盖。以100g进行离心15分钟，从MgSO₄层顶部收集原生质体。向原生质体悬浮液中加入2体积STC，并将混和物以1000g离心5分钟。将原生质体沉淀重悬于3ml STC，并再次沉淀。重复此步骤。最后，将原生质体重悬于0.2-1ml STC。取100μl原生质体悬浮液，与5-25μg溶于10μl STC的适当DNA混和。将原生质体与p3SR2(携带构巢曲霉amdS基因的载体)混和。将混和物于室温放置25分钟。加入0.2ml 60％PEG4000、10mM CaCl₂和10mMTris-HCl(pH7.5)并小心混和(两次)，最后加入0.85ml相同溶液并小心混和。将混和物于室温放置25分钟，以2500g离心15分钟，并将沉淀重悬于2ml 1.2M山梨糖醇。再一次沉淀后，将原生质体在适当的平板上铺开。将原生质体在基本平板上铺开，以抑制背景生长。于37℃培养4-7天后，挑取孢子并铺开，以获得单菌落。重复此步骤，在第二次再分离后，将单菌落的孢子作为精制转化体保存。

米曲霉转化体的纯化

通过在AmdS+平板(+0.01％Triton X-100)上获取分生孢子并在YPM中于30℃培养3天，对米曲霉菌落进行纯化。

甘露聚糖酶阳性的米曲霉转化体的鉴定

将米曲霉转化体的上清液在含0.2％AZCL-半乳甘露聚糖(MegaZyme，澳大利亚)作为底物的琼脂平板上测试β-1，4-甘露聚糖酶活性。通过于30℃培养24小时后分析平板上的蓝色水解晕轮，鉴定阳性转化体。

SDS-PAGE分析

产生β-1，4-甘露聚糖酶的米曲霉转化体的上清液的SDS-PAGE分析。将转化体在5ml YPM中培养3天。取10μl上清液，进行12％SDS-PAGE电泳，随后用考马斯亮蓝染色。

Humicola insolens甘露聚糖酶的纯化和分析

如上所述将基因转化米曲霉，并将转化菌株在发酵罐中使用标准培养基(麦芽糖浆，蔗糖，MgSO4，Ka₂PO₄，K₂SO₄，柠檬酸，酵母提取物和微量金属)培养。于34℃通气培养6天。

收获发酵肉汤(5000ml)，并将液体过滤分离菌丝体。将清澈的液体在Filtron滤膜上浓缩至275ml。

使用阳离子亲和层析纯化甘露聚糖酶。用25mM柠檬酸(pH4.0)平衡S-Sepharose层析柱，并使用氯化钠梯度(0-0.5M)将结合到层析柱上的甘露聚糖酶洗脱下来。合并有甘露聚糖酶活性的级分，并将pH调到7.3。然后将100ml合并的甘露聚糖酶浓缩至5ml(大约13mg蛋白质/ml)，并用于应用试验。为了进一步纯化，取2ml在醋酸钠缓冲液(pH6.1)中进行Superdex 200上的大小层析。有甘露聚糖酶活性的级分在SDS-PAGE中显示相等的、分子量为45kDa和38kDa的两条染色条带，说明N端非催化结构域发生了蛋白质水解。

甘露聚糖酶的氨基酸序列，即DNA序列翻译的结果，显示于SEQ IDNO：14。

SEQ ID NO：13的DNA序列编码第1-21位的信号肽。也在其它甘露聚糖酶中发现的未知功能的结构域描述于SEQ ID NO：14的第22-159位所示氨基酸序列，催化活性结构域发现存在于SEQ ID NO：14的第160-488位。

发现与嗜热网球菌有最大序列同源性(49％同一性)；甘露聚糖酶序列EMBL；AF013989，R.A.Reeves，M.D.Gibbs，P.L.Bergquist于1997年7月递交。

分子量：38kDa。

DSC测得在醋酸钠缓冲液(pH6.0)中是65℃。

使用ManU实验(于40℃温育20分钟)的pH活性特性曲线显示酶在pH8具有最大活性。

最适温度(使用ManU实验；Megazyme AZCL豆角胶作为底物)在pH10是70℃。

实施例15

Humicola insolens的家族26的甘露聚糖酶的清洗性能评价

通过在洗涤剂溶液中用本发明的甘露聚糖酶清洗豆角胶覆盖的样品，评价本发明的甘露聚糖酶的清洗性能。清洗后，通过将样品用氧化铁弄脏，观察清洗效果。

制备豆角胶样品：将干净的棉花样品浸泡在2g/l豆角胶溶液中，并于室温干燥过夜。将样品在水中预洗，并再次干燥。

清洗：将小的圆形豆角胶样品置于盛有含6,7g/l Ariel Futur液体的15°dH水的烧杯中，并于40℃、磁力搅拌温育30分钟。将样品在自来水中漂洗，并干燥。

弄脏：样品置于盛有0.25g/l Fe₂O₃的烧杯中，并搅拌3分钟。将样品在自来水中漂洗，并干燥。

评价：使用MacBeth ColorEye 7000 remission spectrophotometer测量样品在440nm的消光值(remission)。结果表述为Δ消光值＝(R_清洗后-R_清洗前)_酶-(R_清洗后-R_清洗前)_对照其中R是440nm的消光值。

本发明的甘露聚糖酶对豆角胶样品明显有效，清洗性能略好于芽孢杆菌I633的甘露聚糖酶对照。

Humicola insolens的家族26的甘露聚糖酶与芽孢杆菌I633的甘露聚糖酶(实施例1-3)的清洗性能比较，给出了Δ消光值：

实施例16-40

以下实施例用于例示本发明的组合物，但并不必要限制或定义本发明的范围。

在洗涤剂组合物中，酶的含量由纯酶在总组合物中的重量％来表示，且除另有说明以外，该洗涤剂组合物由总组合物的重量％来表示。本文中的组分缩写名称具有以下含义：

实施例16

根据本发明制备以下高密度衣物洗涤剂组合物：

实施例17

根据本发明制备以下在欧洲机洗条件下用于特殊用途的粒状衣物洗涤剂组合物：

实施例18

根据本发明制备以下在欧洲机洗条件下用于特殊用途的洗涤剂组合物：

实施例19

根据本发明制备以下粒状洗涤剂组合物：

实施例20

根据本发明制备以下不含漂白剂的洗涤剂组合物，该组合物特别用于洗涤有颜色的衣物：

实施例21

根据本发明制备以下洗涤剂组合物：

实施例22

根据本发明制备以下粒状洗涤剂组合物：

实施例23

根据本发明制备以下洗涤剂组合物：

实施例24

根据本发明制备以下洗涤剂组合物：

实施例25

根据本发明制备以下液体洗涤剂配方(用量由重量份表示，酶由纯酶表示)：

实施例26

实施例27

根据本发明制备以下液体洗涤剂组合物(用量由重量份表示，酶由纯酶表示)：

实施例28

实施例29

根据本发明制备以下粒状织物洗涤剂组合物，它具有“通过洗涤使衣物柔软”的功能：

实施例30

根据本发明制备以下漂洗时加入的织物柔软剂组合物：

实施例31

根据本发明制备以下加入织物柔软剂和干燥剂的织物调理剂组合物：

实施例32

根据本发明制备以下块状衣物洗涤剂组合物(用量由重量份表示，酶由纯酶表示)：

(ppm)

实施例33

根据本发明制备以下洗涤添加剂组合物：

实施例34

根据本发明制备以下致密的高密度(0.96千克/升)碗碟洗涤剂组合物：

实施例35

根据本发明制备以下堆积密度为1.02千克/升的粒状碗碟洗涤剂组合物：

实施例36

根据本发明，通过用标准12头旋转压机在13千牛顿/厘米2的压力下压制粒状碗碟洗涤剂组合物来制备以下片状洗涤剂组合物：

实施例37

根据本发明制备以下密度为1.40千克/升的液体碗碟洗涤剂组合物：

实施例38

根据本发明制备以下液体碗碟洗涤组合物：

实施例39

根据本发明制备以下硬表面清洁液体组合物：

实施例40

根据本发明制备以下用于清洁硬表面并除去日用品霉的喷洗组合物：

文献

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Claims

1.分离的甘露聚糖酶，其是

a)SEQ ID NO：12的第33-331位所示氨基酸序列的多肽，或

b)由SEQ ID NO：11的第97-993位所示DNA序列编码的多肽。

2.权利要求1的甘露聚糖酶，其由芽孢杆菌的菌株得到。

3.一种编码权利要求1所述甘露聚糖酶的分离的DNA分子。

4.权利要求3所述的DNA分子，该DNA分子编码SEQ ID NO：1的第33-331位所示氨基酸序列的多肽。

5.权利要求3所述的DNA分子，该DNA分子选自：SEQ ID NO：11的第97-993位所示的DNA序列，或者其互补链。

6.权利要求3-5任一项所述的DNA分子，其中编码具有甘露聚糖酶活性的酶的DNA序列得自丝状真菌、酵母或细菌。

7.权利要求6所述的DNA分子，其中的细菌是芽孢杆菌属或热解纤维素菌属，丝状真菌是腐质霉属。

8.包含下列可操作连接在一起的元件的表达载体：转录启动子；选自下组的DNA片段：编码具有甘露聚糖酶活性的多肽、为SEQ IDNO：11的第97-993位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子。

9.已经导入了权利要求8的表达载体的培养细胞，其中所述细胞表达该DNA片段编码的多肽。

10.具有甘露聚糖酶活性的分离多肽，其选自：SEQ ID NO：12的第33-331位残基所示氨基酸序列的多肽分子。

11.权利要求10的多肽，其由耐盐芽孢杆菌产生。

12.包含权利要求10或11的多肽的酶制剂。

13.生产具有甘露聚糖酶活性的多肽的方法，包括培养已经导入了权利要求8所述表达载体的细胞，从而所述细胞表达所述DNA片段编码的多肽；和回收多肽。

14.权利要求12的制剂，其中还包含一种或多种选自下组的酶：蛋白酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、脂酶、过氧化物酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、角质酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、果胶甲酯酶、纤维二糖水解酶、转谷氨酰胺酶；或它们的混和物。

15.权利要求14的制剂，其中所述的氧化酶是漆酶或酚氧化酶。

16.权利要求14的制剂，其中所述的半纤维素酶是甘露聚糖酶。

17.具有甘露聚糖酶活性的多肽，其中该多肽(i)不含同源杂质，并且(ii)根据权利要求13的方法产生。

18.改进纤维素或合成纤维、纱线、机织或非机织织物的特性的方法，其中使用权利要求12所述制剂或者权利要求1或2所述酶，对纤维、纱线或织物进行处理。

19.权利要求18的方法，其中所述的权利要求12的制剂或权利要求1或2的酶用于脱浆步骤。

20.降解或修饰植物材料的方法，其中使用权利要求12所述制剂或者权利要求1或2所述酶对植物材料进行处理。

21.权利要求20的方法，其中植物材料是再生废纸；牛皮纸或其它制纸纸浆；或者含瓜尔胶或豆角胶的材料。

22.加工液体咖啡提取物的方法，其中使用权利要求12所述制剂或者权利要求1或2所述酶，对咖啡提取物进行处理。

23.包含权利要求12所述酶制剂或者权利要求1或2所述酶的清洁组合物。

24.权利要求23的清洁组合物，其中还包含选自下组的酶：纤维素酶、蛋白酶、脂酶、淀粉酶、果胶降解酶和木葡聚糖酶；以及常规的洗涤剂成分。

25.权利要求23的清洁组合物，其中所述酶或酶制剂的含量为纯酶占总组合物重量的0.0001％-2％。

26.权利要求24的清洁组合物，其中所述酶的含量为纯酶占总组合物重量的0.0001％-2％。

27.权利要求24的清洁组合物，其中所述酶是淀粉酶。

28.权利要求27的清洁组合物，其中还包含选自下组的另一种酶：纤维素酶、蛋白酶、脂酶、果胶降解酶和木葡聚糖酶。

29.权利要求24的清洁组合物，其中包含选自下组的表面活性剂阴离子型、非离子型、阳离子型表面活性剂，和／或它们的混和物。

30.权利要求24的清洁组合物，其中包含漂白剂。

31.权利要求24的清洁组合物，其中包含助洗剂。

32.含有权利要求24的清洁组合物的织物柔软组合物，其中还包含含有两条长链的阳离子表面活性剂。

33.机械处理织物的方法，包括在机洗工艺的洗涤循环过程中，使用含有权利要求12所述酶制剂或者权利要求1或2所述酶的清洗液处理织物。

34.权利要求12所述酶制剂或者权利要求1或2所述酶与选自下组的酶一起，在清洁组合物中用于清洁织物和／或除去织物污渍的用途：纤维素酶、蛋白酶、脂酶、淀粉酶、果胶降解酶和木葡聚糖酶。

35.权利要求12所述酶制剂或者权利要求1或2所述酶与选自下组的酶一起在清洁组合物中用于清洁硬表面：纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂酶、果胶降解酶和木葡聚糖酶。

36.权利要求12所述酶制剂或者权利要求1或2所述酶与选自下组的酶一起在清洁组合物中用于手工和机械洗碗碟的用途：纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂酶、果胶降解酶和木葡聚糖酶。

37.权利要求12所述酶制剂或者权利要求1或2所述酶与选自下组的酶一起在清洁组合物中用于个人清洁：纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂酶、果胶降解酶和／或木葡聚糖酶。