ES2834102T3

ES2834102T3 - Variantes de alfa-amilasa

Info

Publication number: ES2834102T3
Application number: ES18183123T
Authority: ES
Inventors: Svend Kaasgaard; Jens Oebro; Signe Larsen; Allan Svendsen; Annette Johansen; Michael Skjoet; Carsten Andersen; Lars Beier; Esben Friis; Miguel Toscano; Mads Bjoernvad; Frank W Rasmussen; Liv S Christiansen
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2011-06-30
Filing date: 2012-06-29
Publication date: 2021-06-16
Anticipated expiration: 2032-06-29
Also published as: CN103649307A; US9434932B2; US20210355470A1; IN2014CN00650A; US20200339969A1; BR112013033782A2; US20160326506A1; US12012623B2; ZA201400678B; US11091748B2; DK2726607T3; CN109097347A; EP3421595A1; KR20140056237A; DK3421595T3; EP3421595B1; BR112013033782B1; EP2726607B1; US20140141489A1; MX353621B

Abstract

Variante aislada de una alfa-amilasa parental, donde la variante tiene al menos un 80%, o al menos un 87%, pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipéptido manduro de SEQ ID NO1, y donde la variante tiene actividad de alfa-amilasa y dicha variante comprende o consiste en sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones del polipéptido de SEQ ID NO:1, seleccionadas del grupo consistente en: **(Ver fórmula)**

Description

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DESCRIPCIÓN

Variantes de alfa-amilasa

Referencia a un listado de secuencias

[0001] Esta patente contiene un listado de secuencias.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo de la invención

[0002] La presente invención se refiere a variantes de una alfa-amilasa, polinucleótidos que codifican las variantes, constructos de ácido nucleico, vectores de expresión, células hospedadoras y métodos para producir las variantes.

Descripción de la técnica relacionada

[0003] Las alfa-amilasas (alfa-1,4-glucan-4-glucanohidrolasas, E.C. 3.2.1.1) constituyen un grupo de enzimas, que cataliza la hidrólisis de almidón y otros oligo y polisacáridos 1,4-gluosídicos lineales y ramificados.

[0004] Hay una larga historia de uso industrial de alfa-amilasas en diferentes aplicaciones conocidas tales como detergentes, panadería, elaboración de cerveza, licuefacción y sacarificación de almidón, por ejemplo, en la preparación de jarabes con alto contenido de fructosa o como parte de la producción de etanol a partir de almidón. Estas y otras aplicaciones de las alfa-amilasas se conocen y utilizan alfa-amilasas derivadas de microorganismos, en particular alfaamilasas bacterianas.

[0005] Entre las primeras alfa-amilasas bacterianas en ser usadas se encontraba una alfa-amilasa de B. licheniformis, conocida también como Termamyl que se ha caracterizado extensivamente y se ha determinado la estructura cristalina para esta enzima. Las amilasas alcalinas, tales como la AA560, forman un grupo particular de alfa-amilasas que han hallado uso en detergentes. Muchas de estas amilasas bacterianas conocidas se han modificado para mejorar su funcionalidad en una aplicación particular.

[0006] Los métodos para aumentar la termoestabilidad de alfa-amilasas han sido bien estudiados. Suzuki et al. (1989) revelan alfa-amilasas quiméricas, en las que se han sustituido regiones específicas de una alfa-amilasa de B." amyloliquefaciens por las regiones correspondientes de una alfa-amilasa de B. licheniformis. Las alfa-amilasas quiméricas se construyeron con el fin de identificar regiones responsables de la termoestabilidad. Se descubrió que tales regiones incluían los residuos aminoacídicos 177-186 y los residuos aminoacídicos 255-270 de la alfa-amilasa de B. amyloliquefaciens. Igarashi et al. 1998 muestran que la termoestabilidad de amilasas de tipo AmyS se puede aumentar mediante la deleción de dos residuos aminoacídicos, R179-G180, (numeración de AmyS) de un bucle (F 178 a A184). Sin embargo, Shiau et al. (2003) mostraron que una enzima AmyS con deleción en el mismo bucle tiene una actividad específica para la hidrólisis de almidón de maíz a alta temperatura menor que la enzima parental, refutando una de las ventajas principales de las amilasas AmyS.

[0007] Debido a cuestiones medioambientales ha aumentado la importancia de disminuir la temperatura en los procesos de lavado, de lavado de vajillas y/o de limpieza. Sin embargo, la mayoría de enzimas incluidas las amilasas tienen una temperatura óptima que supera la temperatura usada normalmente en el lavado a baja temperatura. La alfa-amilasa es una enzima clave para el uso en composiciones detergentes y su uso se ha vuelto cada vez más importante para la eliminación de manchas amiláceas durante el lavado de ropa o de vajillas. Por lo tanto, resulta importante encontrar variantes de alfa-amilasa que retengan su rendimiento de lavado, efecto de eliminación de manchas y/o actividad cuando se reduce la temperatura. Sin embargo, a pesar de la eficiencia de las composiciones detergentes con enzimas actuales, hay muchas manchas que son difíciles de eliminar completamente. Estos problemas se agravan con el mayor uso de temperaturas de lavado bajas (por ejemplo, agua fría) y ciclos de lavado más cortos. Así, es deseable tener enzimas amilolíticas que puedan funcionar a baja temperatura y al mismo tiempo conservar o aumentar otras propiedades deseables tales como la actividad específica (actividad amilolítica), estabilidad y/o rendimiento de lavado.

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[0008] La WO 2001/66712A2 divulga una variante de alfa amilasa (SEQ ID NO: 12) con un 87% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 en la misma. La SEQ ID NO: 12 comprende las modificaciones D134E y E260N. Además, se identifican variantes adicionales que comprenden una o más mutaciones adicionales de una lista de residuos que incluye W189R y W439R.

[0009] La US 2001/039253A1 divulga mutantes de alfa amilasa que comprenden modificaciones en residuos específicos incluido el W189 de la SEQ ID NO: 2 que mejorarían la termoestabilidad.

[0010] La EP 2,308,980A2 divulga la SEQ ID NO: 4 que es un 100% idéntica a la SEQ ID NO: 1 de la presente invención y divulga además una variante que comprende una sustitución en la posición D134.

[0011] Así, es un objeto de la presente invención proporcionar variantes de alfa-amilasa que podrían usarse en procesos de lavado, lavado de vajillas y/o limpieza a baja temperatura, tales como temperaturas de 5-35°C. Otro objeto de la presente invención es proporcionar variantes de alfa-amilasa que tienen un rendimiento de lavado a baja temperatura mejorado en comparación con la alfa-amilasa parental o en comparación con la alfa-amilasa de cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11 o 12.

Resumen de la invención

[0012] La presente invención se refiere a variantes aisladas de una alfa-amilasa parental, donde la variante tiene al menos un 80%, o al menos un 87%, pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO 1, y donde la variante tiene actividad de alfa-amilasa y dicha variante comprende o consiste en sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones del polipéptido de SEQ ID NO: 1, seleccionadas del grupo consistente en:

W140Y+N195F+V206Y+Y243F,

N195F+V206Y+Y243F+W284D,

W140F+R181H,

N195F+V206Y+E260R+G273D,

N195F+V206Y+Y243F+E260K+G273D,

D134E+G476E,

K72R+N195F+V206Y+Y243F+E260H+G273V,

N195F+V206Y+Y243F+E260N+G273V,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

N195F+V206Y+Y243F+E260K+W284D,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D,

W140Y N195F V206Y Y243F E260T W284D,

W189E N195F V206Y Y243F,

W140Y N195F V206Y Y243F W284D,

N195F V206Y Y243F G477R,

N195F V206Y Y243F G477M,

W140Y W189G N195F V206Y Y243F E260G,

W140Y N195F V206Y Y243F E260G G477E,

W140Y N195F V206Y Y243F E260G G476E,

W140Y N195F V206Y Y243F E260G S303G,

W140Y W189T N195F V206Y Y243F E260G,

W140Y N195F V206Y Y243F E260G G337N,

Y100I W140Y N195F V206Y Y243F E260G,

G109A W140Y N195F V206Y Y243F E260G,

W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W439R,

G109A+W140Y+E194D+N195F+V206Y+Y243F+ E260G,

G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+ G476E,

T51I+Y100I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+ Y243F+ E260G,

T51I+G109A+W140Y+N195F+V206Y Y243F+E260G+ W439R,

T51I+ S52Q+ N54K+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G476E,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G304R+ G476K,

W140Y+ N195F+ V206Y+243F+E260G+W284R+G477K,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284F+ G477R,

N195F+V206Y+ Y243F+ E260G+ W284D,

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N195F+ V206Y Y243F S473T+ G476R y

N195F+ V206Y+ Y243F+ G476E.

[0013] La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican las variantes; constructos de ácido nucleico, vectores y células hospedadoras que incluyen los polinucleótidos; y métodos para producir las variantes.

Descripción detallada de la invención

[0014] La presente invención se refiere a variantes aisladas de una alfa-amilasa parental, donde la variante tiene al menos un 80%, o al menos un 87%, pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO 1, y donde la variante tiene actividad de alfa-amilasa y dicha variante comprende o consiste en sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones del polipéptido de SEQ ID NO: 1, seleccionadas del grupo consistente en:

W140Y+N195F+V206Y+Y243F,

N195F+V206Y+Y243F+W284D,

W140F+R181H,

N195F+V206Y+E260R+G273D,

N195F+V206Y+Y243F+E260K+G273D,

D134E+G476E,

K72R+N195F+V206Y+Y243F+E260H+G273V,

N195F+V206Y+Y243F+E260N+G273V,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

N195F+V206Y+Y243F+E260K+W284D,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D,

W140Y N195F V206Y Y243F E260T W284D,

W189E N195F V206Y Y243F,

W140Y N195F V206Y Y243F W284D,

N195F V206Y Y243F G477R,

N195F V206Y Y243F G477M,

W140Y W189G N195F V206Y Y243F E260G,

W140Y N195F V206Y Y243F E260G G477E,

W140Y N195F V206Y Y243F E260G G476E,

W140Y N195F V206Y Y243F E260G S303G,

W140Y W189T N195F V206Y Y243F E260G,

W140Y N195F V206Y Y243F E260G G337N,

Y100I W140Y N195F V206Y Y243F E260G,

G109A W140Y N195F V206Y Y243F E260G,

W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W439R,

G109A+W140Y+E194D+N195F+V206Y+Y243F+ E260G, G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+ G476E, T51I+Y100I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+ Y243F+ E260G,

T51I+G109A+W140Y+N195F+V206Y Y243F+E260G+ W439R,

T51I+ S52Q+ N54K+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G476E, W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G304R+ G476K,

W140Y+ N195F+ V206Y+243F+E260G+W284R+G477K, W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284F+ G477R,

N195F+V206Y+ Y243F+ E260G+ W284D,

N195F+ V206Y Y243F S473T+ G476R y

N195F+ V206Y+ Y243F+ G476E.

Definiciones

[0015] Actividad de alfa-amilasa: el término "actividad alfa-amilasa" se refiere a la actividad de alfa-1,4-glucan-4-glucanohidrolasas, E.C. 3.2.1.1, que constituyen un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de almidón y otros oligo y polisacáridos 1,4-gluosídicos lineales y ramificados.

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[0016] Variante: el término "variante" se refiere a un polipéptido con actividad de alfa-amilasa que incluye una modificación, es decir, una sustitución, inserción y/o deleción, en una o más (varias) posiciones. Una sustitución se refiere a una sustitución de un aminoácido que ocupa una posición por un aminoácido diferente; una deleción se refiere a la eliminación de un aminoácido que ocupa una posición; y una inserción se refiere a la adición de 1-3 aminoácidos adyacentes a un aminoácido que ocupa una posición.

[0017] Mutante: el término "mutante" se refiere a un polinucleótido que codifica una variante.

[0018] Enzima de tipo salvaje: el término alfa-amilasa "de tipo salvaje" se refiere a una alfa-amilasa expresada por un microorganismo de origen natural, tales como una bacteria, levadura u hongo filamentoso encontrados en la naturaleza.

[0019] Progenitor o alfa-amilasa parental: el término "progenitor" o "alfa-amilasa parental" se refiere a una alfaamilasa a la que se le hace una modificación para producir las variantes enzimáticas de la presente invención. El progenitor puede ser un polipéptido de origen natural (de tipo salvaje) o una variante de la misma.

[0020] Variante aislada: el término "variante aislada" se refiere a una variante que está modificada por la mano del hombre. En un aspecto, la variante es al menos un 1% pura, por ejemplo, al menos un 5% pura, al menos un 10% pura, al menos un 20% pura, al menos un 40% pura, al menos un 60% pura, al menos un 80% pura y al menos un 90% pura, como se determina por SDS-PAGE.

[0021] Variante sustancialmente pura: el término "variante sustancialmente pura" se refiere a una preparación que contiene como máximo un 10%, como máximo un 8%, como máximo un 6%, como máximo un 5%, como máximo un 4%, como máximo un 3%, como máximo un 2%, como máximo un 1% y como máximo un 0,5% en peso de otro material polipeptídico con el cual se asocia originalmente o por recombinación. Preferiblemente, la variante es al menos un 92% pura, por ejemplo, al menos un 94% pura, al menos un 95% pura, al menos un 96% pura, al menos un 97% pura, al menos un 98% pura, al menos un 99%, al menos un 99,5% pura y el 100% pura en peso del material polipeptídico total presente en la preparación. Las variantes de la presente invención están preferiblemente en una forma sustancialmente pura. Esto puede conseguirse, por ejemplo, preparando la variante por métodos recombinantes bien conocidos o por métodos tradicionales de purificación.

[0022] Polipéptido maduro: el término "polipéptido maduro" se refiere a un polipéptido en su forma final tras la traducción y cualquier modificación postraduccional, tal como procesado del extremo N-terminal, truncamiento del extremo C-terminal, glicosilación, fosforilación, etc.

[0023] Secuencia codificante del polipéptido maduro: el término "secuencia codificante del polipéptido maduro" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro con actividad de alfa-amilasa.

[0024] Identidad de secuencia: la relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe con el parámetro "identidad de secuencia".

[0025] Para los fines de la presente invención, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) tal como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente la versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales usados son una penalización por apertura de espacio de 10, una penalización por extensión de espacio de 0,5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión de EMBOSS de BLOSUM62). El resultado de Needle etiquetado como "identidad más larga" (obtenido utilizando la opción -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:

(Residuos idénticos x 100)/(Longitud del alineamiento - Número total de espacios en el alineamiento)

[0026] Para los fines de la presente invención, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias desoxirribonucleótidas se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, supra) tal como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferiblemente la versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales usados son una penalización por apertura de espacio de 10, una penalización por extensión de espacio de 0,5 y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión de EMBOSS de NCBI NUC4.4). El resultado de Needle etiquetado como

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"identidad más larga" (obtenido utilizando la opción -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:

(Desoxirribonucleótidos idénticos x 100)/(Longitud del alineamiento - Número total de espacios en el alineamiento)

[0027] Fragmento: el término "fragmento" se refiere a un polipéptido con uno o más (varios) aminoácidos eliminados del extremo amino y/o carboxilo terminal de un polipéptido maduro; donde el fragmento tiene actividad de alfa-amilasa.

[0028] Subsecuencia: el término "subsecuencia" se refiere a un polinucleótido con uno o más (varios) nucleótidos eliminados del extremo 5' y/o 3' de una secuencia codificante del polipéptido maduro; donde la subsecuencia codifica un fragmento con actividad de alfa-amilasa.

[0029] Variante alélica: el término "variante alélica" se refiere a cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de mutaciones y puede resultar en polimorfismos dentro de poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

[0030] Polinucleótido aislado: el término "polinucleótido aislado" se refiere a un polinucleótido que está modificado por la mano del hombre. En un aspecto, el polinucleótido aislado es al menos un 1% puro, por ejemplo, al menos un 5% puro, al menos un 10% puro, al menos un 20% puro, al menos un 40% puro, al menos un 60% puro, al menos un 80% puro, al menos un 90% puro y al menos un 95% puro, como se determina por electroforesis de agarosa. Los polinucleótidos pueden ser de origen genómico, de ADNc, de ARN, semisintético, sintético o cualquier combinación de los mismos.

[0031] Polinucleótido sustancialmente puro: el término "polinucleótido sustancialmente puro" se refiere a una preparación de polinucleótido libre de otros nucleótidos extraños o no deseados y en una forma adecuada para el uso en sistemas de producción de polipéptidos genéticamente modificados. Así, un polinucleótido sustancialmente puro contiene como máximo un 10%, como máximo un 8%, como máximo un 6%, como máximo un 5%, como máximo un 4%, como máximo un 3%, como máximo un 2%, como máximo un 1% y como máximo un 0,5% en peso de otro material polinucleotídico con el cual se asocia originalmente o por recombinación. Un polinucleótido sustancialmente puro puede incluir, no obstante, regiones 5'- y 3'- no traducidas de origen natural, tales como promotores y terminadores. Se prefiere que el polinucleótido sustancialmente puro sea al menos un 90% puro, por ejemplo, al menos un 92% puro, al menos un 94% puro, al menos un 95% puro, al menos un 96% puro, al menos un 97% puro, al menos un 98% puro, al menos un 99% puro y al menos un 99,5% puro en peso. Los polinucleótidos de la presente invención están preferiblemente en una forma sustancialmente pura.

[0032] Secuencia codificante: el término "secuencia codificante" se refiere a un polinucleótido, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su producto polipeptídico. Los límites de la secuencia codificante se determinan generalmente mediante un marco de lectura abierto, que empieza normalmente con el codón de inicio ATG o codones de inicio alternativos tales como GTG y TTG y termina con un codón de terminación tal como, TAA, TAG y TGA. La secuencia codificante puede ser un polinucleótido de ADN, ADNc, sintético o recombinante.

[0033] ADNc: el término "ADNc" se refiere a una molécula de ADN que se puede preparar por transcripción inversa a partir de una molécula de ARNm madura y empalmada, obtenida de una célula eucariota. El ADNc carece de secuencias de intrones que pueden estar presentes en el ADN genómico correspondiente. El transcrito de ARN primario inicial es un precursor del ARNm que se procesa a través de una serie de pasos, incluyendo el empalme, antes de aparecer como ARNm empalmado maduro.

[0034] Constructo de ácido nucleico: el término "constructo de ácido nucleico" se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea mono- o bicatenario, que se aísla de un gen de origen natural o se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos de manera que de otro modo no existiría en la naturaleza o que es sintético. El término constructo de ácido nucleico es sinónimo del término "casete de expresión" cuando el constructo de ácido nucleico contiene las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención.

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[0035] Secuencias de control: el término "secuencias de control" se refiere a todos los componentes necesarios para la expresión de un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o exógena al polinucleótido que codifica la variante o nativa o exógena entre sí. Tales secuencias de control incluyen, pero de forma no limitativa, una secuencia líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de propéptido, un promotor, una secuencia de péptido señal y un terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de terminación transcripcional y traduccional. Las secuencias de control pueden estar provistas de conectores con el propósito de introducir sitios de restricción específicos que faciliten el ligamiento de las secuencias de control con la región codificante del polinucleótido que codifica una variante.

[0036] Operativamente unido: el término "operativamente unido" se refiere a una configuración en la que una secuencia de control se coloca en una posición apropiada con relación a la secuencia codificante de un polinucleótido tal que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante.

[0037] Expresión: el término "expresión" incluye cualquier paso implicado en la producción de la variante incluyendo, pero de forma no limitativa, la transcripción, la modificación postranscripcional, la traducción, la modificación postraduccional y la secreción.

[0038] Vector de expresión: el término "vector de expresión" se refiere a una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica una variante y está operativamente unido a nucleótidos adicionales que proveen a su expresión.

[0039] Célula hospedadora: el término "célula hospedadora" se refiere a cualquier tipo celular que es susceptible de transformación, transfección, transducción y similar con un constructo de ácido nucleico o vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. El término "célula hospedadora" abarca cualquier descendiente de una célula parental que no es idéntica a la célula parental debido a mutaciones que ocurren durante la replicación.

[0040] Proceso de eliminación de almidón: la expresión "proceso de eliminación de almidón" se refiere a cualquier tipo de proceso por el cual se elimina (o convierte) el almidón tal como en procesos de lavado donde el almidón se elimina de tejidos, por ejemplo, limpieza textil tal como lavado de ropa. Un proceso de eliminación de almidón podría ser también la limpieza de superficies duras tal como lavado de vajillas o podría consistir en procesos de limpieza en general tales como la limpieza industrial o institucional. La expresión también comprende otros procesos de eliminación o conversión de almidón, producción de etanol, licuefacción de almidón, desaprestado textil, producción de papel y pulpa, fabricación de cerveza y detergentes en general.

[0041] Propiedad mejorada: el término "propiedad mejorada" se refiere a una característica asociada a una variante que se ha mejorado en comparación con el progenitor. Tales propiedades mejoradas incluyen, pero de forma no limitativa, actividad térmica, termoestabilidad, actividad de pH, estabilidad de pH, especificidad por sustrato/cofactor, propiedades superficiales mejoradas, especificidad por el producto, estabilidad aumentada o solubilidad en presencia de biomasa pretratada, estabilidad mejorada en condiciones de almacenamiento y estabilidad química.

[0042] Rendimiento de lavado: en el presente contexto el término "rendimiento de lavado" se usa como la capacidad de una enzima para eliminar almidón o manchas que contienen almidón presentes en el objeto que va a limpiarse durante, por ejemplo, el lavado de ropa o la limpieza de superficies duras, tal como el lavado de vajillas. El rendimiento de lavado se puede cuantificar calculando el denominado valor de intensidad (Int) definido en la descripción de AMSA o en la prueba de rendimiento de lavado de vaso de precipitados en la sección Métodos de más adelante.

[0043] Rendimiento de lavado mej orado: el término "rendimiento de lavado mejorado" se define en la presente como una enzima variante que exhibe una modificación del rendimiento de lavado de una variante de amilasa con respecto al rendimiento de lavado de la amilasa parental o con respecto a una alfa-amilasa con la secuencia de aminoácidos idéntica a dicha variante pero sin la deleción en una o más de las posiciones específicas o con respecto a la actividad de una alfa-amilasa con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO 4, por ejemplo, con una mayor eliminación de manchas. El término "rendimiento de lavado" incluye limpiezas en general, por ejemplo, limpieza de superficies duras como en el lavado de vajillas, pero también rendimiento de lavado en tejidos tales como lavado de ropa, y también limpieza industrial e institucional.

[0044] Baj a temperatura: "baja temperatura" es una temperatura de 5-35°C, preferiblemente 5-30°C, más preferiblemente 5-25°C, más preferiblemente 5-20°C, de la forma más preferible 5-15°C y en particular 5-10°C. En una

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forma de realización preferida, "baja temperatura" es una temperatura de 10-35°C, preferiblemente 10-30°C, más preferiblemente 10-25°C, de la forma más preferible 10-20°C y en particular 10-15°C.

Convenciones para la designación de variantes

[0045] Para los fines de la presente invención, el polipéptido maduro descrito en SEQ ID NO: 1 se usa para determinar el residuo aminoacídico correspondiente en otra alfa-amilasa. La secuencia de aminoácidos de otra alfa-amilasa se alinea con el polipéptido maduro descrito en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, y en base al alineamiento, el número de posición aminoacídica que corresponde con cualquier residuo de aminoácido en el polipéptido maduro descrito en SEQ ID NO: 1 se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) tal como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet.

16: 276-277), preferiblemente la versión 3.0.0 o posterior.

[0046] La identificación del residuo aminoacídico correspondiente en otra alfa-amilasa se puede confirmar con un alineamiento de múltiples secuencias polipeptídicas utilizando "ClustalW" (Larkin et al., 2007, Bioinformatics 23: 2947 2948).

[0047] Cuando la otra enzima ha divergido del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6 de manera tal que la comparación tradicional de secuencias no consigue detectar su relación (Lindahl y Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615), se pueden usar otros algoritmos de comparación de secuencia por pares. Se puede lograr una sensibilidad superior en la búsqueda de secuencias utilizando programas de búsqueda que utilicen representaciones probabilísticas de familias de polipéptidos (perfiles) para buscar en las bases de datos. Por ejemplo, el programa PSI-BLAST genera perfiles a través de un proceso de búsqueda reiterativa en bases de datos y es capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Se puede conseguir incluso una mayor sensibilidad si la familia o superfamilia del polipéptido tiene uno o más representantes en las bases de datos de estructura de proteínas. Programas tales como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin y Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizan información de una variedad de fuentes (PSI-BLAST, predicción de estructura secundaria, perfiles de alineamiento estructural y potenciales de solvatación) como entrada a una red neuronal que predice el plegamiento estructural para una secuencia de consulta. De forma similar, el método de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, puede utilizarse para alinear una secuencia de estructura desconocida con los modelos de la superfamilia presentes en la base de datos de SCOP. Estos alineamientos pueden usarse sucesivamente para generar modelos de homología para el polipéptido, y tales modelos se pueden evaluar para determinar su exactitud utilizando una variedad de herramientas desarrolladas para ese fin.

[0048] Para proteínas de estructura conocida, hay disponibles diferentes herramientas y recursos para recuperación y generación de alineamientos estructurales. Por ejemplo, las superfamilias de proteínas de SCOP han sido estructuralmente alineadas, y esos alineamientos son accesibles y descargables. Se pueden alinear dos o más estructuras de proteínas utilizando una variedad de algoritmos tales como la matriz de alineamiento de distancias (Holm and Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) o la extensión combinatoria (Shindyalov y Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), y se pueden utilizar adicionalmente implementaciones de estos algoritmos para consultar bases de datos de estructuras con una estructura de interés para descubrir posibles homólogos estructurales (por ejemplo, Holm y Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).

[0049] Al describir las variantes de alfa-amilasa de la presente invención, la nomenclatura descrita más adelante se adapta para facilitar la referencia. Se emplean las abreviaturas de una o tres letras de los aminoácidos aceptadas por la IUPAC.

[0050] Sustituciones. Para una sustitución aminoacídica, se utiliza la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición, aminoácido sustituido. Por consiguiente, la sustitución de treonina por alanina en la posición 226 se designa como "Thr226Ala" o "T226A". Las mutaciones múltiples se separan con signos de suma ("+"), por ejemplo, "Gly205Arg Ser411 Phe" o "G205R S411F", que representan sustituciones en las posiciones 205 y 411 de glicina (G) por arginina (R) y serina (S) por fenilalanina (F), respectivamente.

[0051] Deleciones. Para una deleción aminoacídica, se utiliza la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición*. Por consiguiente, la deleción de glicina en la posición 195 se designa como "Gly195*" o "G195*". Las deleciones múltiples se separan con signos de suma ("+"), por ejemplo, "Gly195* Ser411*" o "G195* S411*".

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[0052] Inserciones. Para una inserción aminoacídica, se utiliza la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición, aminoácido original, aminoácido insertado. Por consiguiente, la inserción de lisina después de glicina en la posición 195 se designa como "Gly195GlyLys" o "G195GK". Una inserción aminoacídica múltiple se designa [aminoácido original, posición, aminoácido original, aminoácido insertado n.01, aminoácido insertado n.02; etc.]. Por ejemplo, la inserción de lisina y alanina después de glicina en la posición 195 se indica como "Gly195GlyLysAla" o "G195GKA".

[0053] En tales casos el/los residuo(s) de aminoácido insertado(s) se numera(n) mediante la adición de letras minúsculas al número de posición del residuo de aminoácido precedente al/a los residuo(s) de aminoácido insertado(s). En el ejemplo anterior, la secuencia sería así:

[0054] Modificaciones múltiples. Las variantes que comprenden modificaciones múltiples se separan con signos de suma ("+"), por ejemplo, "Arg170Tyr+Gly195Glu" o "R170Y+G195E" representan una sustitución de tirosina y ácido glutámico por arginina y glicina en las posiciones 170 y 195, respectivamente.

[0055] Sustituciones diferentes. Cuando se puedan introducir sustituciones diferentes en una posición, las sustituciones diferentes se separan con una coma, por ejemplo, "Arg170Tyr,Glu" representa una sustitución de arginina por tirosina o ácido glutámico en la posición 170. Así, "Tyr167Gly,Ala Arg170Gly,Ala" designa las siguientes variantes:

"Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167AIa+Arg170Gly" y "Tyr167Ala+Arg170Ala".

Alfa-amilasas parentales

[0056] La alfa-amilasa parental puede ser un polipéptido con al menos un 80% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1.

[0057] En un aspecto, el progenitor tiene una identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1 de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o el 100%, que tiene actividad de alfa-amilasa. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del progenitor difiere en no más de diez aminoácidos, por ejemplo, en cinco aminoácidos, en cuatro aminoácidos, en tres aminoácidos, en dos aminoácidos y en un aminoácido del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1.

[0058] El progenitor comprende o consiste preferiblemente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En otro aspecto, el progenitor comprende o consiste en el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1.

[0059] En otra forma de realización, el progenitor es una variante alélica del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1.

[0060] El progenitor puede obtenerse a partir de microorganismos de cualquier género. Para los fines de la presente invención, el término "obtenido de" como se utiliza en la presente en relación con una fuente dada significará que el progenitor codificado por un polinucleótido lo produce una fuente o una célula en la que se ha insertado el polinucleótido de la fuente. En un aspecto, el progenitor es secretado extracelularmente.

[0061] El progenitor puede ser una alfa-amilasa bacteriana. Por ejemplo, el progenitor puede ser un polipéptido bacteriano grampositivo tal como una alfa-amilasa de Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus o Streptomyces, o un polipéptido bacteriano gramnegativo tal como una alfa-amilasa de Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella o Ureaplasma.

[0062] En un aspecto, el progenitor es una alfa-amilasa de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus

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licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis o Bacillus thuringiensis.

[0063] En otro aspecto, el progenitor es una alfa-amilasa de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis o Streptococcus equi subesp. Zooepidemicus.

[0064] En otro aspecto, el progenitor es una alfa-amilasa de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus o Streptomyces lividans.

[0065] El progenitor puede ser una alfa-amilasa fúngica. Por ejemplo, el progenitor puede ser una alfa-amilasa de levadura tal como una alfa-amilasa de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia. Por ejemplo, el progenitor puede ser una alfa-amilasa de hongos filamentosos tal como una alfa-amilasa de Acremonium, Agaricus, Alternaría, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophylum, Scytalidium, Talaromyces, Termoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella o Xylaria.

[0066] En otro aspecto, el progenitor es una alfa-amilasa de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis.

[0067] En otro aspecto, el progenitor es una alfa-amilasa de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.

[0068] En otro aspecto, el progenitor es una alfa-amilasa de Bacillus sp., por ejemplo, la alfa-amilasa de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6.

[0069] Se entiende que, para las especies anteriormente mencionadas, la invención abarca tanto los estados perfectos como los imperfectos, y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo, anamorfos, independientemente del nombre de la especie por el que se conocen. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de equivalentes apropiados.

[0070] Las cepas de estas especies son fácilmente accesibles al público en varias colecciones de cultivo, tales como la American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[0071] El progenitor se puede identificar y obtener de otras fuentes, que incluyen microorganismos asilados de la naturaleza (por ejemplo, suelos, abonos, agua, etc.) o muestras de ADN obtenidas directamente de materiales naturales (por ejemplo, suelos, abonos, agua, etc.) utilizando las sondas mencionadas anteriormente. Las técnicas para aislar microorganismos y ADN directamente de hábitats naturales son bien conocidas en la técnica. Puede obtenerse entonces de forma similar un polinucleótido que codifique un progenitor cribando una genoteca de ADNc o genómica de otro microorganismo o muestra de ADN mezclado. Una vez ha sido detectado con una(s) sonda(s) un polinucleótido que codifica un progenitor, el polinucleótido se puede aislar o clonar utilizando técnicas que conocen los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

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[0072] El progenitor puede ser un polipéptido híbrido en el cual se fusiona una porción de un polipéptido en el extremo N-terminal o el C-terminal de una porción de otro polipéptido.

[0073] El progenitor también puede ser un polipéptido fusionado o polipéptido de fusión escindible en el cual se fusiona un polipéptido en el extremo N-terminal o el C-terminal de otro polipéptido. Un polipéptido fusionado se produce por fusión de un polinucleótido que codifica un polipéptido con un polinucleótido que codifica otro polipéptido. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión se conocen en la técnica e incluyen ligar las secuencias codificantes que codifican los polipéptidos de modo que estas estén en marco y que la expresión del polipéptido fusionado esté bajo control del mismo promotor(es) y terminador. Las proteínas de fusión también se pueden construirse usando tecnología de inteína en la cual las fusiones se crean postraduccionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-7799).

[0074] Un polipéptido de fusión puede además comprender un sitio de escisión entre los dos polipéptidos. Cuando se secreta la proteína de fusión, el sitio se escinde y se liberan los dos polipéptidos. Los ejemplos de sitios de escisión incluyen, pero de forma no limitativa, los sitios descritos en Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568 576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488 3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; y Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; and Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

Preparación de variantes

[0075] Se describen métodos para obtener una variante con actividad de alfa-amilasa, que comprenden: (a) la introducción en una alfa-amilasa parental de una modificación en dos o más (varias) posiciones correspondientes a las posiciones 140, 181, 189, 134, 195, 206, 243, 260, 262, 284, 304, 347, 439, 469, 476 y 477 del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12, donde la numeración corresponde a la SEQ ID NO 1 y la variante tiene actividad de alfa-amilasa; y (b) la recuperación de la variante.

[0076] Se describen métodos para obtener una variante con actividad de alfa-amilasa, que comprenden: (a) la introducción en una alfa-amilasa parental de una modificación en dos o más (varias) posiciones correspondientes a W140, R181, W189, D134, N195, V206, Y243, E260, F262, W284, G304, W347, W439, W469, G476 y G477 del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12, donde la numeración corresponde a la SEQ ID NO 1 y la variante tiene actividad de alfa-amilasa; y (b) la recuperación de la variante.

[0077] La modificación introducida puede ser una sustitución.

[0078] Se describen métodos para obtener una variante con actividad de alfa-amilasa, que comprende: (a) la introducción en una alfa-amilasa parental de una sustitución en dos o más (varias) posiciones correspondientes a G304RKEQ, W140YF, W189EGT, D134E, E260ADCQLMFPSWVGHIKNRTY, F262GP, W284DHFYR, W347HFY, W439RG, G476EQRK, G477EQKMR del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12, donde la numeración está según SEQ ID NO 1 y la variante tiene actividad de alfa-amilasa; y (b) la recuperación de la variante.

[0079] Las sustituciones introducidas pueden ser dos o más de G304R, W140YF, W189EGT, D134E, E260GHIKNRTY, W284DFR, W439RG, G476EK, G477EKMR. Las sustituciones introducidas pueden ser G304R, W140YF, E260GHIKNPRTY y G476EQRK. El método para obtener una variante con actividad de alfa-amilasa comprende: (a) la introducción en una alfa-amilasa parental sustituciones de G304R, W140Y, E260G y G476K en cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12, donde la numeración corresponde a la SEQ ID NO 1 y la variante tiene actividad de alfa-amilasa; y (b) la recuperación de la variante.

[0080] Las variantes se pueden preparar utilizando cualquier procedimiento de mutagénesis conocido en la técnica, tal como mutagénesis dirigida, construcción de gen sintético, construcción de gen semisintético, mutagénesis aleatoria, recombinación aleatoria, etc.

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[0081] La mutagénesis dirigida es una técnica en la que una o más (varias) mutaciones se crean en uno o más sitios definidos en un polinucleótido que codifica el progenitor.

[0082] La mutagénesis dirigida se puede realizar in vitro mediante PCR empleando cebadores oligonucleótidos con la mutación deseada. La mutagénesis dirigida también puede realizarse in vitro mediante mutagénesis de casete, que implica la escisión por una enzima de restricción en un sitio del plásmido que comprende un polinucleótido que codifica el progenitor y el ligamiento posterior de un oligonucleótido con la mutación con el polinucleótido. Normalmente la enzima de restricción que digiere el plásmido y el oligonucleótido es la misma, permitiendo que los extremos cohesivos del plásmido y del inserto se enlacen uno con otro. Véase, por ejemplo, Scherer and Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955; and Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.

[0083] La mutagénesis dirigida al sitio también puede realizarse in"vivo mediante métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, U.S. Patent Application Publication No. 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290; and Calissano and Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett.43: 15-16.

[0084] Se puede usar cualquier procedimiento de mutagénesis dirigida en la presente invención. Hay muchos kits comerciales disponibles que pueden utilizarse para preparar variantes.

[0085] La construcción de genes sintéticos implica la síntesis in vitro de una molécula de polinucleótido diseñada para codificar un polipéptido de interés. La síntesis génica se puede realizar utilizando varias técnicas, tales como la tecnología con microchip de síntesis múltiple descrita por Tian et al. (004, Nature 432: 1050-1054) y tecnologías similares en las que los oligonucleótidos se sintetizan y se ensamblan en chips microfluídicos fotoprogramables.

[0086] Las sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos únicas o múltiples se pueden realizar y evaluar usando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o recombinación aleatoria, seguido de un procedimiento de cribado pertinente, tal como los descritos por Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; o WO 95/22625. Otros métodos que se pueden usar incluyen PCR propensa a errores, presentación en fagos (por ejemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; U.S. Patent No. 5,223,409; WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[0087] Los métodos de mutagénesis/recombinación aleatoria pueden combinarse con métodos de cribado automatizados de alto rendimiento para detectar actividad de polipéptidos mutagenizados clonados expresados por células hospedadoras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos se pueden recuperar de las células hospedadoras y secuenciar rápidamente usando métodos estándar en la técnica. Estos métodos permiten determinar rápidamente la importancia de residuos de aminoácidos individuales de un polipéptido.

[0088] La construcción de genes semisintéticos se realiza combinando aspectos de la construcción de genes sintéticos, y/o mutagénesis dirigida al sitio, y/o mutagénesis aleatoria, y/o recombinación aleatoria. La construcción semisintética se caracteriza por un proceso que utiliza fragmentos de polinucleótidos que son sintetizados, en combinación con técnicas de PCR. Regiones definidas de genes se pueden sintetizar así de novo, mientras que otras regiones se pueden amplificar utilizando cebadores de mutagénesis dirigida al sitio, mientras que otras regiones más se pueden someter a amplificación por PCR propensa a errores o no propensa a errores. Las subsecuencias de polinucleótido pueden entonces recombinarse.

Variantes

[0089] La presente invención también proporciona variantes de una alfa-amilasa parental, donde la variante tiene al menos un 80%, o al menos un 87%, pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO 1, y donde la variante tiene actividad de alfa-amilasa y dicha variante comprende o consiste en sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones del polipéptido de SEQ ID NO: 1, seleccionadas del grupo consistente en:

W140Y+N195F+V206Y+Y243F,

N195F+V206Y+Y243F+W284D,

W140F+R181H,

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N195F+V206Y+E260R+G273D,

N195F+V206Y+Y243F+E260K+G273D,

D134E+G476E,

K72R+N195F+V206Y+Y243F+E260H+G273V,

N195F+V206Y+Y243F+E260N+G273V,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

N195F+V206Y+Y243F+E260K+W284D,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D,

W140Y N195F V206Y Y243F E260T W284D,

W189E N195F V206Y Y243F,

W140Y N195F V206Y Y243F W284D,

N195F V206Y Y243F G477R,

N195F V206Y Y243F G477M,

W140Y W189G N195F V206Y Y243F E260G,

W140Y N195F V206Y Y243F E260G G477E,

W140Y N195F V206Y Y243F E260G G476E,

W140Y N195F V206Y Y243F E260G S303G,

W140Y W189T N195F V206Y Y243F E260G,

W140Y N195F V206Y Y243F E260G G337N,

Y100I W140Y N195F V206Y Y243F E260G,

G109A W140Y N195F V206Y Y243F E260G,

W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W439R,

G109A+W140Y+E194D+N195 F+V206Y+Y243F+ E260G, G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+ G476E, T51I+Y100I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+ Y243F+ E260G,

T51I+G109A+W140Y+N195F+V206Y Y243F+E260G+ W439R,

N195F+V206Y+ Y243F+ E260G+ W284D,

N195F+ V206Y Y243F S473T+ G476R y

N195F+ V206Y+ Y243F+ G476E.

[0090] En una forma de realización, la variante tiene una identidad de secuencia de al menos un 80%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99%, pero menos del 100%, con la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa parental.

[0091] En otra forma de realización, la variante tiene al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95%, tal como al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% y al menos un 99%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1.

[0092] En un aspecto, el número de modificaciones en las variantes de la presente invención es de 2-20, por ejemplo, 2-10 y 2-5, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 modificaciones.

[0093] Las variantes pueden comprender además una modificación en una o más (varias) posiciones distintas. Por ejemplo, las variantes pueden comprender una modificación en una posición que corresponde con las posiciones G182*+D183* o D183*+G184*.

[0094] Los aminoácidos esenciales en un progenitor se pueden identificar según procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta última técnica, se introducen mutaciones de una única alanina en cada residuo de la molécula, y se determina la actividad de alfa-amilasa de las moléculas mutantes resultantes para identificar residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Véase también, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la alfa-amilasa u otra interacción biológica también puede determinarse mediante análisis físico de la estructura, como se determina por técnicas tales como la resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o marcaje por fotoafinidad, junto con la mutación de aminoácidos del posible sitio de contacto. Véase, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver

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et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. La identidad de los aminoácidos esenciales también puede inferirse a partir de análisis de identidad con polipéptidos relacionados con el progenitor.

Polinucleótidos

[0095] La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican cualquiera de las variantes de la presente invención.

Constructos de ácido nucleico

[0096] La presente invención se refiere a polinucleótidos aislados que codifican variantes de la invención. La presente invención también se refiere a constructos de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención operativamente unido a una o más (varias) secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula hospedadora adecuada en condiciones compatibles con las secuencias de control.

[0097] Un polinucleótido se puede manipular en una variedad de maneras para proveer a la expresión de una variante. La manipulación del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria en función del vector de expresión. Las técnicas para la modificación de polinucleótidos utilizando métodos de ADN recombinante se conocen en la técnica.

[0098] La secuencia de control puede ser una secuencia promotora, que es reconocida por una célula hospedadora para la expresión del polinucleótido. La secuencia promotora contiene secuencias de control transcripcional que median la expresión de la variante. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico que muestre actividad transcripcional en la célula hospedadora incluyendo promotores mutantes, truncados e híbridos, y se puede obtener de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares bien homólogos o bien heterólogos a la célula hospedadora.

[0099] Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácido nucleico de la presente invención en una célula hospedadora bacteriana son los promotores obtenidos del gen de la alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), el gen de la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), el gen de la penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP), el gen de la amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM), el gen de la levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB), los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, el operón lac de E. coli, el gen de la agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA) y el gen de la beta-lactamasa procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21 25). Otros promotores se describen en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; y en Sambrook et al., 1989, supra.

[0100] Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácido nucleico de la presente invención en una célula hospedadora de hongo filamentoso son los promotores obtenidos de los genes de la acetamidasa de Aspergillus nidulans, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable en medio ácido de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger o Aspergillus awamori (glaA), TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteasa alcalina de Aspergillus orizae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipasa de de Rhizomucor miehei, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, así como el promotor NA2-tpi (un promotor modificado incluyendo un gen que codifica una alfa-amilasa neutra de Aspergilli en el que la secuencia líder no traducida se ha sustituido por una secuencia líder no traducida de un gen que codifica la triosa fosfato isomerasa en Aspergilli; ejemplos no limitativos incluyen promotores modificados incluyendo el gen que codifica la alfa-amilasa neutra en Aspergillus"niger en el que la secuencia líder no traducida se ha sustituido por una secuencia líder no traducida del gen que codifica la triosa fosfato isomerasa en el Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae); y promotores mutantes, truncados e híbridos de los mismos.

[0101] En un huésped de levadura, se obtienen promotores útiles de los genes de la enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactocinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), deshidrogenasa de alcohol

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dehidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP), triosa fosfato isomerasa de Saccharomyces cerevisiae (TPI), metalotioneína de Saccharomyces cerevisiae (CUP1) y cinasa de 3-fosfoglicerato de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para células hospedadoras de levadura se describen en Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

[0102] La secuencia de control también puede ser una secuencia terminadora de transcripción adecuada, que es reconocida por una célula hospedadora para terminar la transcripción. La secuencia terminadora está operativamente unida al extremo 3'-terminal del polinucleótido que codifica la variante. Puede utilizarse cualquier terminador que sea funcional en la célula hospedadora.

[0103] Los terminadores preferidos para células hospedadoras fúngicas filamentosas se obtienen de los genes de la antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[0104] Los terminadores preferidos para células hospedadoras de levadura se obtienen de los genes de la enolasa de Saccharomyces cerevisiae, el citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae y la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para células hospedadoras de levadura se describen en Romanos et al., 1992, supra.

[0105] La secuencia de control también puede ser una secuencia líder adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción en la célula hospedadora. La secuencia líder está operativamente unida al extremo 5'-terminal del polinucleótido que codifica la variante. Puede utilizarse cualquier secuencia líder que sea funcional en la célula hospedadora.

[0106] Las secuencias líderes preferidas para células hospedadoras fúngicas filamentosas se obtienen de los genes de la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.

[0107] Las secuencias líderes adecuadas para células hospedadoras de levadura se obtienen de los genes de la enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, la 3-fosfoglicerato cinasa de Saccharomyces cerevisiae, el factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y la alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.

[0108] La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia operativamente unida al extremo 3'-terminal de la secuencia codificante de la variante y, cuando se transcribe, la célula hospedadora la reconoce como una señal para añadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Puede utilizarse cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula hospedadora.

[0109] Las secuencias de poliadenilación preferidas para células hospedadoras fúngicas filamentosas se obtienen de los genes de la antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxisporum.

[0110] Las secuencias de poliadenilación útiles para células hospedadoras de levadura se describen en Guo y Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.

[0111] La secuencia de control también puede ser una región codificante del péptido señal que codifica un péptido señal unido al extremo N-terminal de una variante y dirige la variante a la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante del polinucleótido puede contener intrínsecamente una región codificante del péptido señal naturalmente unida en el marco de lectura de traducción con el segmento de la región codificante que codifica la variante. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una región codificante del péptido señal que es exógena a la secuencia codificante. La región codificante del péptido señal exógena puede requerirse donde la secuencia codificante no contiene de manera natural una región codificante del péptido señal. Alternativamente, la región codificante del péptido señal exógena puede reemplazar simplemente la región codificante del péptido señal natural para mejorar la secreción de la variante. Sin embargo, puede utilizarse cualquier región codificante del péptido señal que dirija la variante expresada a la vía secretora de una célula hospedadora.

[0112] Las secuencias codificantes del péptido señal eficaces para células hospedadoras bacterianas son las secuencias codificantes del péptido señal obtenidas de los genes de la amilasa maltogénica de Bacillus NCIB 11837,

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subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, proteasas neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus y Bacillus subtilis prsA. Se describen péptidos señal adicionales en Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

[0113] Las secuencias codificantes del péptido señal eficaces para células hospedadoras fúngicas filamentosas son las secuencias codificantes del péptido señal obtenidas de los genes de la amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, celulasa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens, lipasa de Humicola lanuginosa y proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei.

[0114] Los péptidos señal útiles para células hospedadoras de levadura se obtienen de los genes del factor alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Se describen otras secuencias codificantes del péptido señal útiles en Romanos et al., 1992, supra.

[0115] La secuencia de control también puede ser una región codificante del propéptido que codifica un propéptido situado en el extremo N-terminal de una variante. El polipéptido resultante se conoce como una proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). Un propolipéptido es generalmente inactivo y se puede convertir en un polipéptido activo por escisión catalítica o autocatalítica del propéptido desde el propolipéptido. La región codificante del propéptido se puede obtener de los genes de la proteasa alcalina de Bacillus subtilis (aprE), la proteasa neutra de Bacillus subtilis (nprT), la lacasa de Myceliophthora thermofila (WO 95/33836), la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei y el factor alfa de Saccharomyces cerevisiae.

[0116] Cuando tanto el péptido señal como las regiones de propéptido están presentes en el extremo N-terminal de una variante, la región de propéptido se sitúa junto al extremo N-terminal de la variante y la región del péptido señal se sitúa junto al extremo N-terminal de la región de propéptido.

[0117] También puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión de la variante en relación con el crecimiento de la célula hospedadora. Ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que causa que la expresión del gen se active o se desactive en respuesta a una sustancia química o un estímulo físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en sistemas procarióticos incluyen los sistemas operadores lac, tac y trp. En levaduras, puede utilizarse el sistema ADH2 o GAL1. En hongos filamentosos, pueden usarse el promotor de la glucoamilasa de Aspergillus niger, el promotor de la TAKA alfa-amilasa de Aspergillus oryzae y el promotor de la glucoamilasa de Aspergillus orizae. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación génica. En sistemas eucarióticos, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato y los genes de metalotioneína que se amplifican con metales pesados. En estos casos, el polinucleótido que codifica la variante estaría operativamente unido a la secuencia reguladora.

Vectores de expresión

[0118] La presente invención se refiere a vectores de expresión que comprenden el polinucleótido de la presente invención. La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido de la presente invención, un promotor y señales de terminación transcripcional y traduccional. Las varias secuencias de nucleótidos y de control se pueden unir para producir un vector de expresión recombinante que pueden incluir uno o más (varios) sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido que codifica la variante en tales sitios. Alternativamente, el polinucleótido se puede expresar mediante la inserción del polinucleótido o de un constructo de ácido nucleico que comprende el polinucleótido, en un vector apropiado para la expresión. En la creación del vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector, de modo que la secuencia codificante está operativamente unida a las secuencias de control apropiadas para la expresión.

[0119] El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que pueda someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y pueda provocar la expresión del polinucleótido. La elección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la célula hospedadora en la que el vector va a introducirse. El vector puede ser un plásmido lineal o cerrado circular.

[0120] El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, la replicación del cual es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula

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hospedadora, se integra en el genoma y se replica con el cromosoma(s) en el que se ha integrado. Además, se pueden utilizar un vector o plásmido único o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total que se va a introducir en el genoma de la célula hospedadora, o un transposón.

[0121] El vector contiene preferiblemente uno o más (varios) marcadores seleccionares que permiten la selección fácil de células transformadas, transfectadas, transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un gen el producto del cual proporciona resistencia vírica o a biocidas, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos y similar.

[0122] Ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son los genes dal de Bacillus licheniformis o de Bacillus subtilis, o marcadores que confieren resistencia antibiótica tal como resistencia a ampicilina, cloranfenicol, kanamicina o tetraciclina. Marcadores adecuados para células hospedadoras de levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 y URA3. Marcadores seleccionables para uso en una célula hospedadora de hongo filamentoso incluyen, pero de forma no limitativa, amdS (acetamidasa), argB (ornitina-carbamoiltransferasa), bar (fosfinotricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5-fosfato descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa) y trpC (antranilato sintasa), así como equivalentes de los mismos. Los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus se prefieren para uso en una célula de Aspergillus.

[0123] El vector contiene preferiblemente un elemento(s) que permite(n) la integración del vector en el genoma de la célula hospedadora o la replicación autónoma del vector en la célula independientemente del genoma.

[0124] Para la integración en el genoma de la célula hospedadora, el vector puede depender de la secuencia del polinucleótido que codifica la variante o cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma mediante recombinación homóloga o no homóloga. Alternativamente, el vector puede contener secuencias nucleótídicas adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula hospedadora en una ubicación(es) precisa(s) en el cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integradores deberían contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como de 100 a 10.000 pares de bases, de 400 a 10.000 pares de bases y de 800 a 10.000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad con la secuencia diana correspondiente para aumentar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integradores pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga a la secuencia diana en el genoma de la célula hospedadora. Además, los elementos integradores pueden ser secuencias nucleotídicas codificantes o no codificantes. Por otro lado, el vector se puede integrar en el genoma de la célula hospedadora por recombinación nohomóloga.

[0125] Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permite al vector replicarse autónomamente en la célula hospedadora en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador de plásmido que medie la replicación autónoma que funcione en una célula. El término "origen de replicación" o "replicador de plásmido" significa una secuencia nucleotídica que permite que un plásmido o vector se replique in vivo.

[0126] Ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177 y pACYC184 que permiten la replicación en E. coli, y pUB110, pE194, pTA1060 y pAMV1 que permiten la replicación en Bacillus.

[0127] Ejemplos de orígenes de replicación para uso en una célula hospedadora de levadura son los orígenes de replicación de 2 micras, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6.

[0128] Ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula de hongo filamentoso son AMA1 y ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen pueden conseguirse según los métodos descritos en WO 00/24883.

[0129] Se pueden insertar más de una copia de un polinucleótido de la presente invención en la célula hospedadora para aumentar la producción de una variante. Se puede obtener un aumento en el número de copias del polinucleótido integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula hospedadora o incluyendo un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable y, así, copias adicionales del polinucleótido, se pueden seleccionar por cultivo de las células en presencia del agente seleccionable apropiado.

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[0130] Los procedimientos usados para unir los elementos anteriormente descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son bien conocidos por un experto en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra) para obtener variantes sustancialmente puras.

Células hospedadoras

[0131] La presente invención también se refiere a células hospedadoras que comprenden el polinucleótido de la invención. La presente invención también se refiere a células hospedadoras recombinantes, que comprenden un polinucleótido de la presente invención operativamente unido a una o más (varias) secuencias de control que dirigen la producción de una variante de la presente invención. Una construcción o vector que comprende un polinucleótido se introduce en una célula hospedadora de modo que la construcción o vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico que se autorreplica como se ha descrito anteriormente. El término "célula hospedadora" abarca cualquier descendiente de una célula progenitora que no es idéntica a la célula progenitora debido a mutaciones que ocurran durante la replicación. La elección de una célula hospedadora dependerá en gran parte del gen codificante de la variante y su fuente.

[0132] La célula hospedadora puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de una variante, por ejemplo, una procariota o una eucariota.

[0133] La célula hospedadora procariótica puede ser cualquier bacteria grampositiva o gramnegativa. Las bacterias grampositivas incluyen, pero de forma no limitativa, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus y Streptomyces. Las bacterias gramnegativas incluyen, pero de forma no limitativa, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella y Ureaplasma.

[0134] La célula hospedadora bacteriana puede ser cualquier célula de Bacillus, incluyendo, pero de forma no limitativa, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis y Bacillus thuringiensis.

[0135] La célula hospedadora bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptococcus, incluyendo, pero de forma no limitativa, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis y Streptococcus equi subesp. Zooepidemicus.

[0136] La célula hospedadora bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptomyces, incluyendo, pero de forma no limitativa, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus y Streptomyces lividans.

[0137] La introducción de ADN en una célula de Bacillus puede, por ejemplo, efectuarse por transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Chang y Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), usando células competentes (véase, por ejemplo, Young y Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol.

56: 209-221), por electroporación (véase, por ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988 Biotechniques 6: 742-751), o por conjugación (véase, por ejemplo, Koehler y Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). La introducción de ADN en una célula de E. coli puede, por ejemplo, efectuarse por transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) o electroporación (véase, por ejemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127 6145). La introducción de ADN en una célula de Streptomyces puede, por ejemplo, efectuarse por transformación de protoplastos y electroporación (véase, por ejemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), por conjugación (véase, por ejemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), o por transducción (véase, por ejemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). La introducción de ADN en una célula de Pseudomonas puede, por ejemplo, efectuarse por electroporación (véase, por ejemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) o por conjugación (véase, por ejemplo, Pinedo y Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51 57). La introducción de ADN en una célula de Streptococcus puede, por ejemplo, ser efectuada por competencia natural (véase, por ejemplo, Perry and Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), por transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Catt y Jollick, 1991, Microbios 68: 189-2070, por electroporación (véase, por ejemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) o por conjugación (véase, por ejemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev.

45: 409-436). Sin embargo, puede usarse cualquier método conocido en la técnica para introducir ADN en una célula hospedadora.

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[0138] La célula hospedadora también puede ser un eucariota, tal como un mamífero, un insecto, una planta o una célula fúngica.

[0139] La célula hospedadora puede ser una célula fúngica. Los "hongos" como se utilizan en la presente incluyen los filos de Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota, así como los hongos Oomycota y todos los mitospóricos (como se definen en Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8a edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido).

[0140] La célula hospedadora fúngica puede ser una célula de levadura. La "levadura" como se utiliza en la presente incluye levadura ascoesporógena (Endomycetales), levadura basidioesporógena y levadura perteneciente a los Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Ya que la clasificación de levadura puede cambiar en el futuro, para los fines de esta invención, la levadura debe ser definida como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., y Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

[0141] La célula hospedadora de levadura puede ser una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia tal como una célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis o Yarrowia lipolytica.

[0142] La célula hospedadora fúngica puede ser una célula fúngica filamentosa. Los "hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como se define en Hawkswort et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos se caracterizan generalmente por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo se produce por crecimiento hifal y el catabolismo de carbono es aeróbico estricto. En cambio, el crecimiento vegetativo de las levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae se produce por gemación de un talo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.

[0143] La célula hospedadora fúngica filamentosa puede ser una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes o Trichoderma.

[0144] Por ejemplo, la célula hospedadora fúngica filamentosa puede ser una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.

[0145] Las células fúngicas se pueden transformar mediante un proceso que implica la formación de protoplastos, transformación de los protoplastos y regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Se describen procedimientos adecuados para la transformación de células hospedadoras de Aspergillus y Trichoderma en EP 238023 y Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474. Se describen métodos adecuados para transformar especies de Fusarium en Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 y WO 96/00787. Se puede transformar levadura utilizando los procedimientos descritos en Becker y Guarente, In Abelson, J.N. y Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, volumen 194, págs 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.

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Métodos de producción

[0146] La presente invención también se refiere a métodos de producción de una variante, que comprende: (a) el cultivo de una célula hospedadora de la presente invención en condiciones adecuadas para la expresión de la variante; y (b) la recuperación de la variante.

[0147] Las células hospedadoras se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción de la variante utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar mediante cultivo en frascos en agitación o mediante fermentación a pequeña o gran escala (incluyendo fermentación en continuo, por lotes, por lotes alimentados o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizadas en un medio adecuado y en condiciones que permitan que se exprese y/o se aísle el polipéptido. El cultivo tiene lugar en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de nitrógeno y carbono y sales inorgánicas, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar según composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture Collection). Si la variante se segrega en el medio nutritivo, la variante se puede recuperar directamente del medio. Si la variante no se segrega, se puede recuperar de lisados celulares.

[0148] La variante se puede detectar utilizando métodos conocidos en la técnica que son específicos para las variantes. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático o la desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo enzimático para determinar la actividad de la variante.

[0149] La variante se puede recuperar por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la variante se puede recuperar del medio nutritivo por procedimientos convencionales incluyendo, pero de forma no limitativa, recolección, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación.

[0150] La variante se puede purificar por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero de forma no limitativa, cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, hidrofóbica, cromatoenfoque y de exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, isoelectroenfoque preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación de sulfato amónico), Sd S-PAGE o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, Nueva York, 1989) para obtener variantes sustancialmente puras.

[0151] En un aspecto alternativo, la variante no se recupera, sino que una célula hospedadora de la presente invención que expresa la variante se usa como fuente de la variante.

Composiciones

[0152] Se describen composiciones que comprenden una variante de la presente invención. Preferiblemente, las composiciones se enriquecen con tal variante. El término "enriquecido" se refiere a que la actividad de alfa-amilasa de la composición ha sido aumentada, por ejemplo, con un factor de enriquecimiento de 1.1.

[0153] La composición puede comprender una variante como el componente enzimático principal, por ejemplo, una composición monocomponente. Alternativamente, la composición puede comprender múltiples actividades enzimáticas, tales como una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrin glicosiltransferasa, desoxirribonucleasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, haloperoxidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peptidoglutaminasa, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa o xilanasa. La enzima(s) adicional puede ser producida, por ejemplo, por un microorganismo del género Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae; Fusarium, por ejemplo, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium toruloseum, Fusarium trichothecioides o Fusarium venenatum; Humicola, por ejemplo, Humicola insolens o Humicola lanuginosa; o Trichoderma, por ejemplo, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.

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[0154] Las composiciones se pueden preparar conforme a métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de un líquido o de una composición seca. Por ejemplo, la composición puede estar en forma de un granulado o un microgranulado. La variante se puede estabilizar conforme a métodos conocidos en la técnica.

[0155] Según la invención, las variantes de alfa-amilasa anteriores pueden típicamente ser un componente en una composición de limpieza, tal como una composición detergente, por ejemplo, una composición de detergente para ropa 0 una composición de detergente de lavado de vajillas. Se prefiere especialmente una composición líquida de detergente para ropa.

[0156] Tales composiciones de limpieza comprenden un complemento de limpieza/detergente, preferiblemente una mezcla de componentes. Típicamente, el complemento de limpieza estará presente en la composición en una cantidad de 0,001 a 99,9% en peso, más típicamente de 0,01 a 80% en peso del complemento de limpieza.

[0157] En otro aspecto preferido, la composición comprende uno o más tensioactivos, que pueden ser no iónicos, incluyendo semipolares, y/o aniónicos y/o catiónicos y/o zwitteriónicos y/o anfolítico y/o semipolar y/o mezclas derivadas. Los tensioactivos están presentes típicamente en una proporción de un 0,1% a un 60% en peso o de un 0,5 a un 50% en peso o de un 1 a un 40% en peso de la composición.

Usos

[0158] Se describen también métodos para utilizar las variantes de alfa-amilasa de la invención.

Las variantes de alfa-amilasa de la invención son útiles en composiciones detergentes, lavado de ropa, lavado de vajillas y/o procesos de limpieza a bajas temperaturas.

EJEMPLOS

Ensayo pNP-G7 para la determinación de la actividad de alfa-amilasa

[0159] La actividad de alfa-amilasa se puede determinar por un método que utiliza el sustrato G7-pNP. El G7-pNP, que es una abreviatura para 4,6-etilideno(G7)-p-nitrofenil(G1)-a,D-maltoheptaósido, es un oligosacárido bloqueado que puede ser escindido por una endo-amilasa, tal como una alfa-amilasa. Después de la escisión, la alfa-glucosidasa incluida en el kit continúa digiriendo el sustrato hidrolizado para liberar una molécula de PNP libre que tiene un color amarillo y así se puede medir por espectrofometría visible a A = 405 nm (400-420 nm). Los kits que contienen el sustrato G7-pNP y alfa-glucosidasa están fabricados por Roche/Hitachi (N.0 cat. 11876473).

REACTIVOS:

[0160] El sustrato G7-pNP de este kit contiene 22 mM de 4,6-etilideno- G7-pNP y 52,4 mM de HEPES (ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-etanosulfónico), pH 7,0).

[0161] El reactivo de alfa-glucosidasa contiene 52,4 mM de HEPES, 87 mM de NaCl, 12,6 mM de MgCl2, 0,075 mM CaCl2, { 4 kU/L de alfa-glucosidasa).

[0162] La solución de trabajo del sustrato se prepara mediante la mezcla de 1 mL del reactivo de alfa-glucosidasa con 0,2 mL del sustrato G7-pNP. Esta solución de trabajo del sustrato se prepara inmediatamente antes de usarla.

[0163] El tampón de dilución: 50 mM de MOPS, 0,05% de Tritón de X100 (p/v) (éter de p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenilo de polietilenglicol (C14H220(C2H40)n (n = 9-10))), 1 mM CaCl2; pH 8,0.

PROCEDIMIENTO:

[0164] La muestra de amilasa que se iba a analizar se diluyó en el tampón de dilución para asegurar que el pH en la muestra diluida era 7. El ensayo se realizó transfiriendo 20 } l de muestras de enzima diluida a una placa de microtitulación de 96 pocillos y añadiendo 80 } l de solución de trabajo del sustrato. La solución se mezcló y preincubó 1 minuto a temperatura ambiente y la absorción se midió cada 20 s. durante 5 minutos a una DO de 405 nm.

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[0165] La pendiente (absorbancia por minuto) de la curva de absorción en función del tiempo es directamente proporcional a la actividad específica (actividad por mg de enzima) de la alfa-amilasa en cuestión en el conjunto de condiciones dado. La muestra de amilasa debería diluirse a una cantidad donde la pendiente sea inferior a 0,4 unidades de absorbancia por minuto.

Ensayo automático de tensión mecánica (AMSA) para lavado de ropa

[0166] Para valorar el rendimiento de lavado en el lavado de ropa se realizan experimentos, utilizando el ensayo automático de tensión mecánica (AMSA). Con el AMSA, se puede evaluar el rendimiento de lavado de una gran cantidad de volúmenes pequeños de soluciones detergentes con enzima. La placa AMSA tiene un número de ranuras para las soluciones de ensayo y una tapa que presiona firmemente la muestra de lavado de ropa, el tejido que se va a lavar, contra todas las aberturas de las ranuras. Durante el tiempo de lavado, la placa, las soluciones de ensayo, el tejido y la tapa se agitan enérgicamente para poner la solución de ensayo en contacto con el tejido y aplicar tensión mecánica de una manera regular, con oscilación periódica. Para una descripción adicional véase W002/42740, especialmente el párrafo "Special method embodiments" en la página 23-24.

Descripción general de rendimiento de lavado

[0167] Se prepara una solución de ensayo que comprende agua (10°dH), detergente, por ejemplo, 5,1 g/L de detergente líquido europeo como se describe a continuación y la enzima de la invención, por ejemplo, en una concentración de 0, 0,8 y/o 1,2 mg de proteína enzimática/L Se añaden tejidos manchados con almidón (por ejemplo, CS-28 del Center For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT, Vlaardingen, Países Bajos) y se lavan durante 20 minutos a 20°C. Tras enjuagar a fondo con agua del grifo corriente y secar a oscuras, la intensidad de luz o los valores de reflectancia de los tejidos manchados se miden posteriormente como medida del rendimiento de lavado. El ensayo con 0 mg de proteína enzimática/L se usa como blanco para obtener un valor de remisión delta. Se aplica preferiblemente acción mecánica durante la etapa de lavado, por ejemplo, agitando, rotando o removiendo la solución de lavado con los tejidos. Los experimentos de rendimiento de lavado AMSA se realizaron en las condiciones experimentales especificadas a continuación:

Tabla 1: condiciones experimentales AMSA

[0168] El tampón de dilución de amilasa: la amilasa se diluyó en agua ultrapura (agua MilliQ) con una concentración pequeña de calcio (0,1 mM) para estabilizar la amilasa durante el almacenamiento y 0,01 % de Tritón X-100 para reducir el riesgo de adsorción de proteína enzimática a los recipientes y las pipetas.

[0169] La dureza del agua se ajustó a 10°dH por adición de CaCl2, MgCl2 y NaHC03 (Ca2+:Mg2+:HC03- = 3:1:4,5) al sistema de ensayo. Después de lavar los tejidos se enjuagaron en agua del grifo y se secaron.

[0170] El rendimiento de lavado se mide como la luminosidad del color del tejido lavado. La luminosidad puede también expresarse como la intensidad de la luz reflejada por la muestra cuando se ilumina con luz blanca. Cuando la muestra está manchada, la intensidad de la luz reflejada es inferior a la de una muestra limpia. Por lo tanto, la intensidad de la luz reflejada puede utilizarse para medir el rendimiento de lavado.

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[0171] Las mediciones de color se realizan con un escáner plano profesional (Kodak ¡Qsmart, Kodak, Midtager 29; DK-2605 Brondby, Dinamarca), que se utiliza para capturar una imagen del tejido lavado.

[0172] Para extraer un valor de la intensidad de luz de las imágenes escaneadas, valores de 24 bits por píxel de la imagen se convierten en valores para rojo, verde y azul (RGB). El valor de intensidad (Int) se calcula añadiendo los valores RGB juntos como vectores y luego obteniendo la longitud del vector resultante:

[0173] Tejidos: la muestra textil CS-28 (almidón de arroz en algodón) se obtiene del Center For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, Países Bajos.

Los resultados del ensayo AMSA de lavado de ropa con diferentes variantes se muestran en la Tabla 3. En el resultado, el índice es 100. Al resultado de rendimiento de la alfa-amilasa parental se le asigna el valor 100 y los resultados de las variantes se comparan con este valor.

Rendimiento de lavado AMSA

[0174] El rendimiento de lavado de las variantes y las alfa-amilasas parentales correspondientes se evaluaron con el método de ensayo AMSA como se describe en la sección de métodos. Los resultados se dan como (el rendimiento de la variante menos el rendimiento del blanco) dividido por (el rendimiento del progenitor menos el rendimiento de del blanco) multiplicados por 100, donde el blanco es el rendimiento obtenido mediante el lavado en las mismas condiciones, pero en ausencia de alfa-amilasa. Por último, se calcularon las medias de rendimiento relativo a las dos concentraciones 0,8 y 1,2 Mg/L. Los resultados se presentan en la Tabla 3.

Ensayo de lavado Tera-O-tometer PTOMQ

[0175] El Tergo-To-Meter (TOM) es un sistema de lavado modelo a media escala que se puede aplicar para evaluar 12 condiciones de lavado diferentes simultáneamente. Un TOM es básicamente un gran baño de agua con control de temperatura con hasta 12 vasos de precipitados metálicos abiertos sumergidos en él. Cada vaso de precipitados constituye una lavadora pequeña del tipo de carga superior y, durante un experimento, cada una de ellas contendrá una solución de un sistema específico de detergente/enzima y los tejidos sucios y limpios en los que se evalúa su rendimiento. La tensión mecánica se consigue con un brazo de agitación rotativa, que remueve el líquido dentro de cada vaso de precipitados. Debido a que los vasos de precipitados del TOM no tienen tapa, es posible retirar muestras durante un experimento TOM y evaluar la información en línea durante el lavado.

[0176] El sistema de lavado del modelo TOM se usa principalmente en ensayos a media escala de detergentes y enzimas en los EE. UU. o en condiciones de lavado LA/AP. En un experimento TOM, se pueden variar los factores tales como la proporción entre carga y suciedad y la proporción entre tejido y licor de lavado. Por lo tanto, el TOM proporciona la conexión entre los experimentos a pequeña escala, tales como AMSA y mini lavado, y los experimentos de mayor duración a escala real en lavadoras de carga superior.

[0177] Equipo: el baño de agua con 12 vasos de precipitados de acero y 1 brazo rotativo por vaso de precipitados con capacidad de 500 o 1200 mL de solución detergente. La temperatura varía de 5 a 80°C. El baño de agua tiene que llenarse con agua desionizada. La velocidad de rotación se puede ajustar de 70 a 120 rpm/min.

Rendimiento de lavado TOM

[0178] La dureza del agua se ajustó a la fuerza descrita a continuación por adición de CaCl2, MgCl2 y NAHC03. Las soluciones de lavado se prepararon con la cantidad deseada de detergente, temperatura y dureza del agua en un cubo como se describe más adelante. El detergente se disolvió mediante agitación magnética durante 10 min. (La solución de lavado se usó de 30 a 60 min después de la preparación).

[0179] La temperatura y la rotación (rpm) en el baño de agua en el Terg-O-Tometer se fijaron según los ajustes indicados más adelante. Cuando la temperatura se fijó según los ajustes (la tolerancia es /- 0,5°C) se añadió la solución de lavado al vaso de precipitados TOM según la cantidad descrita más adelante.

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[0180] La agitación en el vaso de precipitados fue de 120 rpm.2 muestras de almidón de arroz (CS-28) y carga de tierra se añadieron a cada uno de los vasos de precipitados y el lavado se realizó según el tiempo declarado más adelante. Las muestras se enjuagaron en agua del grifo fría durante 5 min. Las muestras se dejaron secar a oscuras durante la noche.

[0181] Tejido: la muestra de tejido CS-28 (almidón de arroz en algodón) se obtuvo del Center for Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, el Países Bajos.

[0182] Carga de suciedad: algodón/poliéster manchado de almidón de arroz (EMPA 162) se obtuvo del Center for Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, Países Bajos. La salsa de carne Bistro (063KC), el batido de chocolate Frij, los espaguetis Heinz (113KC), el chocolate doble Herseys se obtuvieron de Warwick Equest Ltd, Unit 55, Consett Business Park, Consett, County Durham, DH86BN Reino Unido

[0183] Los resultados del ensayo de lavado TOM de diferentes variantes se muestran en la Tabla 3. En el resultado el índice es 100. Al resultado de rendimiento de la alfa-amilasa parental (SEQ ID NO: 7) se le asigna el valor 100 y los resultados de las variantes se comparan con este valor.

Tabla 2: condiciones experimentales

Los detergentes y materiales de ensayo fueron los siguientes:

[0184] El rendimiento de lavado se midió como la luminosidad del color del tejido lavado expresado en valores de remisión. Las mediciones de remisión se realizaron utilizando un espectrofotómetro Macbeth 7000 Color Eye. Se midieron cada una de las muestras secas. Como existe un riesgo de interferencia con el fondo, las muestras se colocaron encima de 4 capas de tejido durante la medición de la remisión. La remisión se midió a 460 nm. El filtro UV no se incluyó. Se calculó un resultado medio de la remisión de las muestras.

Ejemplo 1

Rendimiento de lavado de las alfa-amilasas en detergente líquido europeo (EU) (ejemplo 1A) y estadounidense (ejemplo 1B) (EE. UU.)

[0185] El rendimiento de lavado de la variante evaluada y la alfa-amilasa parental correspondiente (SEQ ID NO: 7) se evaluaron como se ha descrito anteriormente. Los resultados se dan como (rendimiento de la variante menos

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rendimiento del blanco) dividido entre (rendimiento del progenitor menos rendimiento del blanco) multiplicado por 100; donde el blanco es el rendimiento obtenido mediante lavado en las mismas condiciones, pero en ausencia de alfaamilasa.

Ejemplo 1A: composición de detergente europeo para ropa Heavv Dutv Liauid

[0186]

Ejemplo 1B: composición de detergente estadounidense para ropa Heavv Dutv Liauid

[0187]

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Tabla 3: Rendimiento de lavado

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[0188] Los resultados del ensayo de rendimiento de lavado demuestran claramente que los rendimientos de las variantes han mejorado respecto a su molécula parental respectiva (SEQ ID NO 7) a las temperaturas evaluadas.

Ejemplo 2

Evaluación de rendimiento de lavadora a escala real de variantes de amilasa en detergente liquido.

I. Preparación de las composiciones detergentes de ensayo

[0189] En este experimento se prepararon cuatro composiciones de ensayo basadas en el ejemplo 1A de detergente liquido. Se preparó una base de detergente a partir del ejemplo 1A, sin enzimas y terminado con un pH de 8,2.

[0190] Se prepararon las siguientes cuatro formulaciones de detergente:

Tabla 4:

II. Tejidos de ensayo

[0191] Tres manchas sensibles a la amilasa; CS-28 almidón de arroz, PCS-28 almidón de arroz y CS-29 almidón de tapioca, 5 cm x 5 cm (suministrados por el Centre For Test materials, Países Bajos) se fijaron a 20 cm x 20 cm de algodón blanco tejido (suministrados por Warwick Equest, Durham, Reino Unido). Dos manchas sensibles a la amilasa; salsa barbacoa y batido de chocolate Frijj, 2,5 cm de diámetro, se fijaron a 20 cm x 20 cm de algodón blanco tejido (suministrado por Warwick Equest, Durham, Reino Unido). Se usaron ocho réplicas (2 réplicas en 4 máquinas diferentes) con cada formulación de ensayo.

Tabla 5:

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III. Procedimiento de ensayo de lavado

[0192] El método implica el uso de lavadoras Hotpoint de Europa occidental, modelo Aquarius WF541. Las formulaciones de ensayo como se han descrito anteriormente se usaron para lavar manchas sensibles a la amilasa con la adición de una mezcla de carga sucia y limpia como se ha descrito anteriormente.

[0193] Lavadoras con 6 g/L de formulación de ensayo, 13 L de agua con 10° Clark de dureza, más tejidos de ensayo y carga se lavaron a 15°C en un ciclo rápido de lavado de algodón de 1 hora y 15 minutos de duración. Después del lavado, los tejidos de ensayo se tendieron para secarse en interior.

[0194] El proceso de lavado se repitió otros 3 ciclos de lavado.

[0195] El índice de eliminación de manchas (SRI) (como se mide por comparación de los valores L* a* b* con lavado y sin lavar) se midió entonces para cuantificar el rendimiento de eliminación de manchas de las composiciones detergentes.

[0196] El índice de rendimiento se midió también calculando (rendimiento del ejemplo C o ejemplo D menos el rendimiento del ejemplo comparativo A) dividido entre (rendimiento del ejemplo comparativo B menos el rendimiento del ejemplo comparativo A) multiplicado por 100.

IV. Comparación de las muestras.

[0197]

Tabla 6: SRI medio de 5 manchas 8 réplicas de cada mancha

Tabla 7: Indice de rendimiento para CS-29 almidón de tapioca (8 réplicas]

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[0198] Comparando las muestras lavadas con la composición del ejemplo A (presencia nula de enzima) con el ejemplo B (que contiene Natalase), C y D (que contienen las variantes 1 y 2 respectivamente), es evidente que el rendimiento de eliminación de manchas se mejora con la adición de una enzima amilasa.

[0199] Comparando las muestras lavadas con la composición del ejemplo B (que contiene Natalase) con los ejemplos C y D (que contienen las variantes 1 y 2 respectivamente) según el ejemplo A como referencia (enzima nula), es evidente que ambas variantes 1 y 2 de la invención son capaces de conseguir niveles significativamente más altos de eliminación de manchas que la Natalase®.

Ejemplo 3

Evaluación del rendimiento de lavadora a escala real de variantes de amilasa en detergente liquido.

I. Preparación de las composiciones detergentes de ensayo

[0200] En este experimento se prepararon cuatro composiciones de ensayo basadas en el detergente liquido del ejemplo 1B anterior. Se preparó una base de detergente a partir del ejemplo 1B, sin enzimas y terminado con un pH de 8,2.

[0201] Se prepararon las siguientes cuatro formulaciones:

Tabla 8:

II. Tejidos de ensayo

[0202] Tres manchas sensibles a la amilasa; PCS-28 almidón de arroz, PS-28 almidón de arroz y CS-26 almidón de maíz, 5 cm x 5 cm (suministrados por el Centre For Test materials, Países Bajos) se fijaron a 20 cm x 20 cm de algodón blanco tejido (suministrado por Warwick Equest, Durham, Reino Unido). Dos manchas sensibles a la amilasa; salsa barbacoa y alimento infantil de pudin de chocolate, 2,5 cm de diámetro, se fijaron a 20 cm x 20 cm de algodón blanco tejido (suministrado por Warwick Equest, Durham, Reino Unido). Se usaron ocho réplicas (2 réplicas en 4 máquinas diferentes) con cada formulación.

Tabla 9:

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III. Procedimiento de lavado de ensayo

[0203] El método implica el uso de una lavadora estadounidense Kenmore modelo de la serie 600. Las formulaciones de ensayo como se han descrito anteriormente se usaron para lavar manchas sensibles a la amilasa con la adición de una mezcla de suciedad y carga limpia como se ha descrito anteriormente.

[0204] Lavadoras con 0,78 g/L de formulación de ensayo, 64 L de agua con 6o Clark de dureza, más tejidos de ensayo y carga se lavaron a 15fC en un superlavado de 12 minutos con un aclarado. Después del lavado, los tejidos de ensayo se tendieron para secarse en interior.

[0205] El proceso de lavado se repitió otros 3 ciclos de lavado.

[0206] El índice de eliminación de manchas (como se mide por comparación de los valores L* a* b* con lavado y sin lavar) se midió entonces para cuantificar el rendimiento de eliminación de manchas de las composiciones detergentes.

[0207] El índice de rendimiento también se midió calculando (rendimiento del ejemplo C o ejemplo D menos el rendimiento del ejemplo comparativo A) dividido entre (rendimiento del ejemplo comparativo B menos el rendimiento del ejemplo comparativo A) multiplicado por 100.

IV. Comparación de las muestras.

[0208]

Tabla 10: SRI medio de 5 manchas (8 réplicas de cada mancha)

Tabla 11: Indice de rendimiento para CS-26 almidón de maíz (8 réplicas]

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[0209] Comparando las muestras lavadas con la composición del ejemplo A (presencia nula de enzima) con el ejemplo B (que contiene Natalase), C y D (que contienen las variantes 3 y 4, respectivamente), es evidente que el rendimiento de eliminación de manchas se mejora con la adición de una enzima amilasa.

[0210] Comparando las muestras lavadas con la composición del ejemplo B (que contiene Natalase) con los ejemplos C y D (que contienen las variantes 3 y 4 respectivamente) según el ejemplo A como referencia (enzima nula), es evidente que ambas variantes 3 y 4 de la invención son capaces de conseguir niveles significativamente más altos de eliminación de manchas que Natalase®.

Ejemplo 4

I. Preparación de las composiciones detergentes de ensayo

[0211] En este experimento se prepararon cuatro composiciones de ensayo basadas en la formulación de detergente liquido 4A de más adelante. Se preparó una base de detergente a partir de la formulación 4A, sin enzimas y terminado con un pH de 8,2.

Tabla 12; Formulación 4A: Composición de detergente para ropa Heavy Duty Liquid

[0212] Se prepararon las siguientes siete formulaciones detergentes:

Tabla 13

ES 2 834 102 T3

II. Tejidos de ensayo

[0213] Tres manchas sensibles a la amilasa; PCS-28 almidón de arroz, CS-128 almidón de arroz envejecido y CS-26 almidón de maíz, 5 cm x 5 cm (suministrados por el Centre For Test materials, Países Bajos) se fijaron a 20 cm x 20 cm de algodón blanco tejido (suministrado por Warwick Equest, Durham, Reino Unido). Dos manchas sensibles a la amilasa; chili con carne y espaguetis Heinz, 2,5 cm de diámetro se fijaron a 20 cm x 20 cm de algodón blanco tejido (suministrado por Warwick Equest, Durham, Reino Unido). Ocho réplicas (2 réplicas en 4 máquinas diferentes) se usaron para cada formulación de ensayo.

Tabla 14

III. Procedimiento de lavado de ensayo

[0214] El método implica el uso de lavadoras Hotpoint de Europa occidental, modelo Aquarius WF541. Las formulaciones de ensayo como se han descrito anteriormente se usaron para lavar manchas sensibles a la amilasa con la adición de una mezcla de carga sucia y limpia como se ha descrito anteriormente.

ES 2 834 102 T3

[0215] Lavadoras con 6 g/L de formulación de ensayo, 13 L de agua con 10o Clark de dureza, más tejidos de ensayo y carga se lavaron a 15fC en un ciclo rápido de lavado de algodón de 1 hora y 15 minutos de duración. Después del lavado, los tejidos de ensayo se tendieron para secarse en interior.

[0216] El proceso de lavado se repitió otros 3 ciclos de lavado.

[0217] El índice de eliminación de manchas (SRI) (como se mide por comparación de los valores L* a* b* con lavado y sin lavar) se midió entonces para cuantificar el rendimiento de eliminación de manchas de las composiciones detergentes.

[0218] El índice de rendimiento se midió también calculando (rendimiento del ejemplo C, D, E, F o G menos el rendimiento del ejemplo comparativo A) dividido entre (rendimiento del ejemplo comparativo B menos el rendimiento del ejemplo comparativo A) multiplicado por 100.

IV. Comparación de las muestras.

[0219]

Tabla 15: SRI medio de 5 manchas (8 réplicas de cada mancha)

Tabla 16: Indice de rendimiento para chili con carne (8 réplicas]

[0220] Comparando las muestras lavadas con la composición del ejemplo A (presencia nula de enzima) con el ejemplo B (que contiene Natalase), C, D, E, F y G (que contienen las variantes 5, 6, 7, 8 y 9, respectivamente), es evidente que el rendimiento de eliminación de manchas se mejora con la adición de una enzima amilasa.

[0221] Comparando las muestras lavadas con la composición del ejemplo B (que contiene Natalase) con los ejemplos C, D, E, F y G (que contienen las variantes 5, 6, 7, 8 y 9, respectivamente) según el ejemplo A como referencia (enzima nula), es evidente que las variantes 5, 6, 7, 8 y 9 de la invención son capaces de conseguir niveles significativamente más altos de eliminación de manchas que Natalase®.

ES 2 834 102 T3

Ejemplo 5

I. Preparación de las composiciones detergentes de ensayo

[0222] En este experimento se prepararon cuatro composiciones de ensayo basadas en la formulación 5A de detergente liquido. Se preparó una base de detergente a partir de la formulación 5A, sin enzimas y terminado con un pH de 8,2.

Tabla 17: Formulación 5A Composición de detergente para ropa Heavy Duty Liquid

Tabla 18

[0223] Se prepararon las siguientes seis formulaciones:

*Añadida como proteína enzimática activa

1Natalase® es suministrada por Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca como 'Natalase 200L'.

2La variante 7 es una variante de amilasa de esta invención de la amilasa tipo salvaje Bacillus sp722 SEQ ID NO 1 con las siguientes dos deleciones D183* G184* y con las sustituciones T51I, S52Q, N54K, G109A, W140Y, N195F, V206Y, Y243F, E260G y G476E. También referidas como SP722 D183* G184* T511 S52Q N54K G109A W140Y N195F V206Y Y243F E260G G476E.

3La variante 8 es una variante de amilasa de esta invención de la amilasa tipo salvaje Bacillus sp722 SEQ ID NO 1 con las siguientes dos deleciones D183* G184* y con las sustituciones W140Y, N195F, V206y , Y243F, E260G, G304R y G476K. También referidas como SP722 D183* G184* W140Y N195F V206Y Y243F E260G G304R G476K.

ES 2 834 102 T3

4La variante 9 es una variante de amilasa de esta invención de la amilasa tipo salvaje Bacillus sp722 SEQ ID NO 1 con las siguientes dos deleciones D183* G184* y con las sustituciones W140Y, N195F, V206Y, Y243F, E260G, W284R y G477K. También referidas como SP722 D183* G184* W140Y N195F V206Y Y243F E260G W284R G477K.

5La variante 10 es una variante de amilasa de esta invención de la amilasa tipo salvaje Bacillus sp722 SEQ ID NO 1 con las siguientes dos deleciones D183* G184* y con las sustituciones w 140Y, N195F, V206Y, Y243F, E260G, W284F y G477R. También referidas como SP722 D183* G184* W140Y N195F V206Y Y243F E260G W284F G477R.

II. Tejidos de ensayo

[0224] Tres manchas sensibles a la amilasa; PCS-28 almidón de arroz, PS-28 almidón de arroz y CS-29 almidón de tapioca, 5 cm x 5 cm (suministrados por el Centre For Test materials, Países Bajos) se fijaron a 20 cm x 20 cm de algodón blanco tejido (suministrado por Warwick Equest, Durham, Reino Unido). Una mancha sensible a la amilasa; espaguetis Heinz, 2,5 cm de diámetro, se fijó a 20 cm x 20 cm de algodón blanco tejido (suministrado por Warwick Equest, Durham, Reino Unido). Una mancha sensible a la amilasa; salsa, 2,5 cm de diámetro, se fijó a 25 cm x 24 cm de algodón blanco tejido (suministrado por Accurate Product Development, Fairfield, Ohio, EE. UU.). Se usaron ocho réplicas (2 réplicas en 4 máquinas diferentes) para cada formulación de ensayo.

Tabla 19

III. Procedimiento de lavado de ensayo

[0225] El método implica el uso de una lavadora estadounidense Kenmore modelo de la serie 600. Las formulaciones de ensayo como se han descrito anteriormente se usaron para lavar manchas sensibles a la amilasa con la adición de una mezcla de suciedad y carga limpia como se ha descrito anteriormente.

[0226] Lavadoras con 0,78 g/L de formulación de ensayo, 64 L de agua con 6o Clark de dureza, más tejidos de ensayo y carga se lavaron a 15fC en un superlavado de 12 minutos con un aclarado. Después del lavado, los tejidos de ensayo se tendieron para secarse en interior. El proceso de lavado se repitió otros 3 ciclos de lavado.

[0227] El índice de eliminación de manchas (como se mide por comparación de los valores L* a* b* con lavado y sin lavar)) se midió entonces para cuantificar el rendimiento de eliminación de manchas de las composiciones detergentes.

[0228] El índice de rendimiento también se midió calculando (rendimiento del ejemplo C, D, E o F menos el rendimiento del ejemplo comparativo A) dividido entre (rendimiento del ejemplo comparativo B menos el rendimiento del ejemplo comparativo A) multiplicado por 100.

IV. Comparación de las muestras.

[0229]

Tabla 20: SRI medio de 5 manchas (8 réplicas de cada mancha)

Claims

ES 2 834 102 T3REIVIN DICACIONES

1. Variante aislada de una alfa-amilasa parental, donde la variante tiene al menos un 80%, o al menos un 87%, pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO 1, y donde la variante tiene actividad de alfa-amilasa y dicha variante comprende o consiste en sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones del polipéptido de SEQ ID NO: 1, seleccionadas del grupo consistente en:

W140Y+N195F+V206Y+Y243F,

N195F+V206Y+Y243F+W284D,

W140F+R181 H,

N195F+V206Y+E260R+G273D,

N195F+V206Y+Y243F+E260K+G273D,

D134E+G476E,

K72R+N195F+V206Y+Y243F+E260H+G273V,

N195F+V206Y+Y243F+E260N+G273V,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

N195F+V206Y+Y243F+E260K+W284D,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D,

W140Y N195F V206Y Y243F E260T W284D,

W189E N195F V206Y Y243F,

W140Y N195F V206Y Y243F W284D,

N195F V206Y Y243F G477R,

N195F V206Y Y243F G477M,

W140Y W189G N195F V206Y Y243F E260G,

W140Y N195F V206Y Y243F E260G G477E,

W140Y N195F V206Y Y243F E260G G476E,

W140Y N195F V206Y Y243F E260G S303G,

W140Y W189T N195F V206Y Y243F E260G,

W140Y N195F V206Y Y243F E260G G337N,

Y100I W140Y N195F V206Y Y243F E260G,

G109A W140Y N195F V206Y Y243F E260G,

W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ W439R,

G109A+W140Y+E194D+N195F+V206Y+Y243F+ E260G,

G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+ G476E,

T51I+Y100I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+ Y243F+ E260G,

T511+G109A+W140Y+N195F+V206Y Y243F+E260G+ W439R,

T51I+ S52Q+ N54K+ G109A+ W140Y+ N195F+ V206Y+ Y243F+ E260G+ G476E,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G304R+ G476K,

W140Y+ N195F+ V206Y+243F+E260G+W284R+G477K,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284F+ G477R,

N195F+V206Y+ Y243F+ E260G+ W284D,

N195F+ V206Y Y243F S473T+ G476R y

N195F+ V206Y+ Y243F+ G476E.

2. Variante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 95% de identidad, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO 1.

3. Variante según la reivindicación 1 o 2, que comprende además deleciones en las posiciones correspondientes a las posiciones G182*+D183* o D183*+G184* de SEQ ID NO: 1.

4. Polinucleótido aislado que codifica la variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Constructo de ácido nucleico que comprende el polinucleótido según la reivindicación 4.

6. Vector de expresión que comprende el polinucleótido según la reivindicación 4.

7. Célula hospedadora que comprende el polinucleótido según la reivindicación 4.

ES 2 834 102 T3

8. Método de producción de una variante de una alfa-amilasa parental, que comprende el cultivo de la célula hospedadora según la reivindicación 7 en condiciones adecuadas para la expresión de la variante; y la recuperación de la variante.