CN104673816A - 一种pCr-NHEJ载体及其构建方法及其用于细菌基因定点敲除的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种pCr-NHEJ载体及其构建方法及其用于细菌基因定点敲除的应用。本发明的pCr-NHEJ载体的序列具有SEQ ID NO: 1所示的序列。该pCr-NHEJ载体在定点敲除细菌基因中的应用。本发明的技术原理在于：NHEJ与CRISPR-Cas9联合应用，以实现在CRISPR-Cas9系统切割细菌基因组DNA造成DNA断裂后，NHEJ系统即可自动连接DNA断端，使细菌存活，而无需人工引入与靶序列具有同源性的双链DAN修复DNA断端，从而简化CRISPR-Cas9技术的操作步骤。
Description
技术领域
[本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种pCr-NHEJ载体及其构建方法及其用于细菌基因定点敲除的应用。
背景技术
2013年出版的《Science》报道了一种简单、高效的基因定点编辑技术——CRISPR-Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeat; CRISPR-associated，CRISPR-Cas9）。该技术系统由一种来自链球菌的Cas9核酸酶、一个序列恒定的tracrRNA（trans-activating crRNA）和一个与靶基因特异性互补的20nt-crRNA（CRISPR RNAs）组成。tracrRNA的3’端形成的高级结构结合并激活Cas9，tracrRNA的5’端与crRNA的3’端互补连接，而crRNA的5’端与靶基因互补配对，由此引导Cas9到达并切断靶序列。现在已经把两种小RNA 融合成一条RNA 链，简称sgRNA（single guide RNA），采用sgRNA进行操作更便捷。由于该技术只需要针对靶基因设计一段特异性的crRNA序列，即可快捷地实现基因的定点敲除。这一技术不仅彻底改变了传统基因组定点编辑技术的概念，并在短短两年内被成功应用于对多种生物的基因组进行定点敲除、敲入或者突变。
sgRNA 分子由间隔序列（spacer）和trancrRNA两段序列构成：1）间隔序列长度为20nt，与基因的靶位点互补，它位于PAM（Protospacer-Adjacent Motif）序列（NGG）的5’端，需要根据靶基因序列单独设计；2）tracrRNA序列恒定，能结合并激活Cas9蛋白质。在spacer的引导下，sgRNA将活化的Cas9蛋白带至基因的靶位点，在PAM序列上游3-8碱基间将靶基因的DNA 双链切断，形成钝性末端的断裂。在真核细胞中，Cas9切断双链DNA后，细胞可自主产生同源重组（homologous recombination，HR）或者非同源末端连接（Non-homologous End Joining, NHEJ）两种机制修复受损DNA，产生插入突变、移码突变、基因敲入等。
sgRNA 和Cas9 基因和sgRNA编码DNA可位于同一个或不同质粒中，在相应启动子的调控下，在细胞内表达。此外，sgRNA也可以通过体外转录合成，与Cas9质粒共转化宿主细胞。
在CRISPR-Cas9技术发明以前，细菌的基因敲除主要依靠基于同源重组技术。这种技术存在效率低下，操作过程复杂，需要耗费长的时间筛选阳性克隆等缺点。研究表明，与上述同源重组技术相比，CRISPR-Cas9 技术具有以下有点：1）效率高，CRISPR-Cas9 技术敲除目的基因是同源重组技术的1000倍；2）可采用同一个CRISPR-Cas9 载体同时或先后对多个靶点进行敲除3）操作简便，只需要根据靶基因设计一条或者两条sgRNA，并将sgRNA的编码DNA克隆入载体，然后转化细菌即可实现基因敲除。
然而，由于绝大部分细菌不具备自主的非同源末端链接系统，Cas9蛋白切割细菌基因组DNA造成的DSB将直接导致细菌死亡，基因敲除操作也随之失败。因此，现有技术中，为避免细菌死亡，需要同时通过电穿孔转化向细菌内导入与靶序列具有高度同源性的线性双链DNA，从而增加了操作步骤和费用。由于构建同源线性双链DNA需要经过多次PCR并连接PCR产物，进一步增加了操作步骤和费用。因此，现有技术的CRISPR-Cas9系统存在操作繁琐、操作难度大、基因敲除效率仍然不够高的缺点。
发明内容
本发明的目的之一在于针对现有技术的不足，提供一种pCr-NHEJ载体，该pCr-NHEJ载体能够用于细菌基因敲除，具有基因敲除效率高的优点。
本发明的目的之二在于针对现有技术的不足，提供一种pCr-NHEJ载体的构建方法，该pCr-NHEJ载体的构建方法具有操作简单、操作难度低的优点。
本发明的目的之三在于针对现有技术的不足，提供pCr-NHEJ载体用于细菌基因定点敲除的应用。
为了实现上述目的之一，本发明采用如下技术方案：
提供一种pCr-NHEJ载体，所述pCr-NHEJ载体的序列具有SEQ ID NO: 1所示的序列。
为了实现上述目的之二，本发明采用如下技术方案：
提供上述所述一种pCr-NHEJ载体在定点敲除细菌基因中的应用。
为了实现上述目的之三，本发明采用如下技术方案：
提供一种pCr-NHEJ载体的构建方法，包括如下步骤：
（1）采用革兰阴性菌的广宿主质粒PBBR1MCS-2（GI:773412）作为基础载体；cas9
（2）采用带有用于mRNA转录的原核启动子PLtetO-1的上游引物和下游引物分别扩增如下三个蛋白基因：cas9（GI:674296984）、ku（GI:444893469）和ligD（GI:444893469），分别得到cas9扩增产物、ku扩增产物和ligD扩增产物；其中，cas9、ku和ligD三个蛋白基因的开放读码框均位于独立的PLtetO-1下游，以便使cas9、ku和ligD三个蛋白基因的表达均受该启动子的调控；所述cas9扩增产物、所述ku扩增产物和所述ligD扩增产物之间带有15nt的碱基重叠；
（3）所述cas9扩增产物的3’端与所述ku扩增产物的5’端，所述ku扩增产物的3’端与所述ligD扩增产物3’端之间，均带有15nt的碱基重叠，通过in-fusion PCR连接所述cas9扩增产物、所述ku扩增产物和所述ligD扩增产物，得到第一连接物；
（4）用限制性核酸内切酶KpnI和HindIII进行双酶切基础载体PBBR1MCS-2，得到基础载体的酶切产物；所述酶切产物经凝胶电泳、切胶并采用DNA回收试剂盒纯化酶切产物；然后采用in-fusion PCR连接所述纯化后的酶切产物和第一连接物，得到载体pNHEJ；
（5）利用NotI和SpeI双酶切所述载体pNHEJ，得到载体pNHEJ的酶切产物；
（6）向所述载体pNHEJ中同时引入相邻的两个倒置的BsaI酶切位点和相邻的两个倒置的BsmAI酶切位点，用于转录形成能够同时结合目的基因两个位置的sgRNA；其中，带有相邻的两个倒置的BsaI酶切位点的DNA片段为DBsaI，带有相邻的两个倒置的BsmAI酶切位点的DNA片段为DBsmAI；
（7）通过in-fusion PCR将DBsaI、DBsmAI进行链接，得到第二连接产物；
（8）通过in-fusion PCR将所述第二连接产物和载体pNHEJ的酶切产物连接起来，获得用于敲除靶基因的CRISPR-Cas9系统，即pCr-NHEJ载体。
上述技术方案中，所述步骤（2）中，采用具有SEQ ID NO: 2所示序列的引物PPLtetO-1-cas9U和具有SEQ ID NO: 3所示序列的引物PCas9D扩增所述cas9蛋白基因，得到cas9扩增产物；
采用具有SEQ ID NO: 4所示序列的引物PPLtetO-1-KuU和具有SEQ ID NO: 5所示序列的引物PkuD扩增所述ku蛋白基因，得到ku扩增产物；
采用具有SEQ ID NO: 6所示序列的引物PLtetO-1-ligDU和具有SEQ ID NO: 7所示序列的引物PligDD扩增所述ligD蛋白基因，得到ligD扩增产物。
上述技术方案中，所述步骤（6）中，带有相邻的两个倒置的BsaI酶切位点的DNA片段DBsaI的构建如下：
首先直接合成具有SEQ ID NO: 8所示序列的DNA序列BsaIU和具有SEQ ID NO: 9所示序列的DNA序列BsaID，其中，BsaIU的3’端和BsaID的5’端有15nt的重叠序列；其中，BsaID含有tracrRNA序列；
通过in-fusion PCR将BsaIU和BsaID连接起来；然后采用具有SEQ ID NO: 10所示序列的引物PBsaIU和具有SEQ ID NO: 11所示序列的引物PBsaID，PCR扩增，即得到带有相邻的两个倒置的BsaI酶切位点的DNA片段DBsaI。
上述技术方案中，所述步骤（6）中，带有相邻的两个倒置的BsmAI酶切位点的DNA片段DBsmAI的构建如下：
首先直接合成具有SEQ ID NO: 12所示序列的DNA序列BsmAIU和具有SEQ ID NO: 13所示序列的DNA序列BsmAID；其中，BsmAID含有tracrRNA序列；
通过in-fusion PCR将所述DNA序列BsmAIU和所述DNA序列BsmAID连接起来；然后采用具有SEQ ID NO: 14所示序列的引物PBsmAIU和具有SEQ ID NO: 15所示序列的引物PBsmAID，进行PCR扩增，即得到带有相邻的两个倒置的BsmAI酶切位点的DNA片段DBsmAI。
上述所述的一种pCr-NHEJ载体的构建方法所构建的pCr-NHEJ载体在定点敲除细菌基因中的应用。
本发明与现有技术相比较，有益效果在于：
（1）本发明的一种pCr-NHEJ载体，该pCr-NHEJ载体能够用于细菌基因敲除，具有基因敲除效率高的优点。
（2）本发明的一种pCr-NHEJ载体的构建方法，该pCr-NHEJ载体的构建方法具有操作简单、操作难度低的优点。
（3）本发明提供pCr-NHEJ载体用于细菌基因定点敲除的应用，具有技术操作简单、操作难度低和基因敲除效率高的优点。
（4）为省去PCR及PCR产物的连接步骤，本发明在一种广宿主质粒PBBR1MCS-2的基础上，构建了适合于多种革兰阴性细菌基因敲除的pCr-NHEJ载体，并向pCr-NHEJ载体中引入结核分枝杆菌的非同源末端链接系统（ Non-homologous end joining，NHEJ ）——ku和ligD基因。其中，Ku能够结合于DNA断端并募集DNA连接酶LigD，而LigD能够不依赖模板DNA，直接连接断裂DNA的末端。本申请采用结核分枝杆菌的NHEJ系统连接Cas9切割DNA所形成的断端，使接受基因敲除的细菌基因组DNA恢复环形结构，并使细菌得以存活（技术原理见图2）。
（5）采用本发明的技术实现只需构建靶基因的CRIPR-Cas9质粒，并进行质粒转化，构建pCr-NHEJ载体，无需同时转化线性同源DNA，即可实现对细菌基因组的敲除。本发明的技术操作更加简单，操作难度大大降低，基因敲除的效率达到87.5%～100%。
（6）本发明的一种pCr-NHEJ载体的构建方法，步骤（2）中，由于cas9扩增产物、ku扩增产物和ligD扩增产物之间带有15nt的碱基重叠，以便于采用In-fusion PCR连接使得cas9扩增产物、ku扩增产物和ligD扩增产物均位于独立的启动子调控下。
（7）本发明的技术原理在于：NHEJ与CRISPR-Cas9联合应用，以实现在CRISPR-Cas9系统切割细菌基因组DNA造成DNA断裂后，NHEJ系统即可自动连接DNA断端，使细菌存活，而无需人工引入与靶序列具有同源性的双链DAN修复DNA断端，从而简化CRISPR-Cas9技术的操作步骤。
附图说明
图1是革兰阴性菌的广宿主质粒PBBR1MCS-2的物理图谱。附图中，MCS，multiple cloning sites，多克隆位点；KmR为卡那霉素抗性基因；mob为质粒结合转移所需的序列；rep为质粒自主复制蛋白基因。
图2是本发明的技术原理图。
图3是本发明的载体pCr-NHEJ的物理图谱。图3中，在pBBR1MCS的多克隆位点上构建；双BsaI和双BsmAI为spacer DNA序列插入位点。
图4是本发明的载体pNHEJ构建过程中的电泳图。图4中，A、B和C为cas9、ku和ligD基因PCR产物电泳图，泳道1均为DNA marker，从上至下依次为2000、1000、750、500、250和100；D，泳道2为cas9、ku和ligD基因连接后的PCR产物，泳道3为质粒pBBR1MCR的KpnI和HindIII的双酶切结果；E，质粒pNHEJ的电泳结果，箭头所指DNA条带大小为7500bp。
图5是本发明的载体pCr-NHEJ构建过程中的电泳图。图5中，A，泳道1-7分别为BsaID、BsaIU、DBsaI、DBsmAI、BsmAIU和BsmAID 的PCR产物；B，为DBsaI和DBsmAI连接的产物；C，质粒pCr-NHEJ的电泳图。
图6是敲除效率PCR鉴定结果。图6中，A、B和C分别为为大肠杆菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的菌落PCR鉴定结果；鉴定的克隆数依次为11、11和8；A和B中的泳道12为阳性对照，C中的泳道5为阳性对照，基因敲除的阳性率分别为100%、100%和87.5%。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
其中，本发明构建的pCr-NHEJ载体带有两个sgRNA骨架序列，能够先后通过在BsaI或BsmAI位点插入spacer DNA片段构建基因定点敲除的载体。
其中，本发明的一种pCr-NHEJ载体的构建方法，步骤（2）中，采用具有SEQ ID NO: 2所示序列的引物PPLtetO-1-cas9U（ gctctagaactagtgGAGATTGACATCCCTATCAGTGATAGAGATACTGAGCACAAGGAGTATACCATGGATAAGAAATACTCAATAGG），其中，引物PPLtetO-1-cas9U的5’端下划线与pBBR1MCS-2的HindIII酶切产物的末端有15nt相同，以便于用in-fusion PCR连接；粗体字区域为启动子PLtetO-1-1、下划线碱基区域为启动子-33和-10区域。
其中，本发明的一种pCr-NHEJ载体的构建方法，步骤（2）中，采用具有SEQ ID NO: 3所示序列的引物cas9D（agggatgtcaatctcTCAGTCACCTCCTAGCTGACTC），其中，引物cas9D的5’端下划线区与引物PPLtetO-1-KuU的5’端有15nt相同，以便于用in-fusion PCR连接。
其中，本发明的一种pCr-NHEJ载体的构建方法，步骤（2）中，采用具有SEQ ID NO: 4所示序列的引物PPLtetO-1-KuU（ gctctagaactagtgGAGATTGACATCCCTATCAGTGATAGAGATACTGAGCACAAGGAGTATACCATGCGAGCCATTTGGACGGGTT），其中，粗体字部分为启动子PLtetO-1-1序列，粗体字区域为启动子PLtetO-1-1、下划线碱基区域为启动子-33和-10区域。
其中，本发明的一种pCr-NHEJ载体的构建方法，步骤（2）中，采用具有SEQ ID NO: 6所示序列的引物PLtetO-1-ligDU（ gctctagaactagtgGAGATTGACATCCCTATCAGTGATAGAGATACTGAGCACAAGGAGTATACCATGGGTTCGGCGTCGGAG），其中，引物PLtetO-1-ligDU的5’端下划线区域与PkuD的5’端有15nt相同，以便于用in-fusion PCR连接；粗体字区域为启动子PLtetO-1-1、下划线碱基区域为启动子-33和-10区域。
其中，本发明的一种pCr-NHEJ载体的构建方法，步骤（2）中，采用具有SEQ ID NO: 7所示序列的引物PligDD（GGGAACAAAGCTGG CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTCATTCGCGCACCACCTCACT），其中，引物PligDD的5’端下划线区域与pBBR1MCS-2的KpnI酶切产物的末端有15nt相同，以便于用in-fusion PCR连接；斜体字部分为T7-转录终止因子。
其中，本发明的一种pCr-NHEJ载体的构建方法，在构建带有相邻的两个倒置的BsaI酶切位点的DNA片段DBsaI的过程中，所合成的DNA序列BsaIU（GAGATTGACATCCCTATCAGTGATAGAGATACTGAGCAC gagacc aaa GGTCTC gttttagagctaGAAAtagcaagttaa，SEQ ID NO: 8），其中，粗体字为用于RNA转录的PLtetO-1-2启动子序列。
其中，本发明的一种pCr-NHEJ载体的构建方法，在构建带有相邻的两个倒置的BsaI酶切位点的DNA片段DBsaI的过程中，所合成的DNA序列BsaID(GAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTC，SEQ ID NO: 9，tracrRNA序列)，其中，BsaIU的3’端和BsaID的5’端有15nt的重叠序列，这样即可通过In-fusion PCR将BsaIU和BsaID二个基因片段连接起来。
其中，本发明的一种pCr-NHEJ载体的构建方法，在构建带有相邻的两个倒置的BsmAI酶切位点的DNA片段DBsmAI的过程中，所合成的DNA序列BsmAIU（GAGATTGACATCCCTATCAGTGATAGAGATACTGAGCAC gagacaaagtctcg ttttagagctaGAAAtagcaagttaa，SEQ ID NO: 12），其中，粗体字为用于RNA转录的PLtetO-1-2启动子序列。
其中，本发明的一种pCr-NHEJ载体的构建方法，通过In-fusion PCR将DBsaI、DBsmAI和载体pNHEJ的酶切产物连接起来的过程中，由于PBsaID和PBsmAIU的5’端有15nt的重叠序列，这样即可通过In-fusion PCR将二个基因片段连接起来。而PBsaIU的5’端分别带有与pNHEJ酶切位点NotI的下游有15个碱基的重叠序列，而PBsmAID的5’端与pNHEJ酶切位点SpeI的上游有15个碱基的重叠序列，这样即可通过In-fusion PCR将DBsaI和DBsmAI与经NotI和SpeI双酶切的pNHEJ片段连接起来，从而获得用于敲除靶基因的CRISPR-Cas9系统，即pCr-NHEJ载体。
其中，本发明的一种pCr-NHEJ载体的构建方法，所构建的pCr-NHEJ载体带有两个sgRNA骨架序列，因此，该pCr-NHEJ载体能够先后通过在BsaI或BsmAI位点插入spacer DNA片段构建基因定点敲除的载体。
实施例1。
一种pCr-NHEJ载体，该pCr-NHEJ载体的序列具有SEQ ID NO: 1所示的序列。本实施例的pCr-NHEJ载体能够用于细菌基因敲除，具有基因敲除效率高的优点。
实施例2。
实施例1的一种pCr-NHEJ载体在定点敲除细菌基因中的应用。
实施例3。
实施例1的一种pCr-NHEJ载体的构建方法，包括如下步骤：
（1）采用革兰阴性菌的广宿主质粒PBBR1MCS-2（GI:773412）作为基础载体；cas9
（2）采用带有用于mRNA转录的原核启动子PLtetO-1的上游引物和下游引物分别扩增如下三个蛋白基因：cas9（GI:674296984）、ku（GI:444893469）和ligD（GI:444893469），分别得到cas9扩增产物、ku扩增产物和ligD扩增产物；其中，cas9、ku和ligD三个蛋白基因的开放读码框均位于独立的PLtetO-1下游，以便使cas9、ku和ligD三个蛋白基因的表达均受该启动子的调控；cas9扩增产物、ku扩增产物和ligD扩增产物之间带有15nt的碱基重叠；
（3）cas9扩增产物的3’端与ku扩增产物的5’端，ku扩增产物的3’端与ligD扩增产物3’端之间，均带有15nt的碱基重叠，通过in-fusion PCR连接cas9扩增产物、ku扩增产物和ligD扩增产物，得到第一连接物；
（4）用限制性核酸内切酶KpnI和HindIII进行双酶切基础载体PBBR1MCS-2，得到基础载体的酶切产物；酶切产物经凝胶电泳、切胶并采用DNA回收试剂盒纯化酶切产物；然后采用in-fusion PCR连接纯化后的酶切产物和第一连接物，得到载体pNHEJ；
（5）利用NotI和SpeI双酶切载体pNHEJ，得到载体pNHEJ的酶切产物；
（6）向载体pNHEJ中同时引入相邻的两个倒置的BsaI酶切位点和相邻的两个倒置的BsmAI酶切位点，用于转录形成能够同时结合目的基因两个位置的sgRNA；其中，带有相邻的两个倒置的BsaI酶切位点的DNA片段为DBsaI，带有相邻的两个倒置的BsmAI酶切位点的DNA片段为DBsmAI；
（7）通过in-fusion PCR将DBsaI、DBsmAI进行链接，得到第二连接产物；
（8）通过in-fusion PCR将第二连接产物和载体pNHEJ的酶切产物连接起来，获得用于敲除靶基因的CRISPR-Cas9系统，即pCr-NHEJ载体。
其中，步骤（2）中，采用具有SEQ ID NO: 2所示序列的引物PPLtetO-1-cas9U和具有SEQ ID NO: 3所示序列的引物PCas9D扩增cas9蛋白基因，得到cas9扩增产物；
采用具有SEQ ID NO: 4所示序列的引物PPLtetO-1-KuU和具有SEQ ID NO: 5所示序列的引物PkuD扩增ku蛋白基因，得到ku扩增产物；
采用具有SEQ ID NO: 6所示序列的引物PLtetO-1-ligDU和具有SEQ ID NO: 7所示序列的引物PligDD扩增ligD蛋白基因，得到ligD扩增产物。
其中，步骤（6）中，带有相邻的两个倒置的BsaI酶切位点的DNA片段DBsaI的构建如下：
首先直接合成具有SEQ ID NO: 8所示序列的DNA序列BsaIU和具有SEQ ID NO: 9所示序列的DNA序列BsaID，其中，BsaIU的3’端和BsaID的5’端有15nt的重叠序列；其中，BsaID含有tracrRNA序列；
通过in-fusion PCR将BsaIU和BsaID连接起来；然后采用具有SEQ ID NO: 10所示序列的引物PBsaIU和具有SEQ ID NO: 11所示序列的引物PBsaID，PCR扩增，即得到带有相邻的两个倒置的BsaI酶切位点的DNA片段DBsaI。
其中，步骤（6）中，带有相邻的两个倒置的BsmAI酶切位点的DNA片段DBsmAI的构建如下：
首先直接合成具有SEQ ID NO: 12所示序列的DNA序列BsmAIU和具有SEQ ID NO: 13所示序列的DNA序列BsmAID；其中，BsmAID含有tracrRNA序列；
通过in-fusion PCR将DNA序列BsmAIU和DNA序列BsmAID连接起来；然后采用具有SEQ ID NO: 14所示序列的引物PBsmAIU和具有SEQ ID NO: 15所示序列的引物PBsmAID，进行PCR扩增，即得到带有相邻的两个倒置的BsmAI酶切位点的DNA片段DBsmAI。
实施例4。
实施例1的pCr-NHEJ载体敲除细菌基因的应用如下：
为验证载体敲除不同革兰阴性菌基因的效率，本发明将载体应用于对大肠杆菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的基因敲除。分别针对大肠杆菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的三种外排泵基因tolC（GI:224015931）、RND family drug transporter（locus_tag="A1S_1773"）和RND型多重耐药外排泵基因mexA（locus_tag="OU9_00435"）分别设计一对spacer DNA序列。采用以下方法设计20nt spacer序列：
1) 将上述三个基因ORF的前250nt用在线软件（http://crispr.dbcls.jp/）设计spacer DNA，并在PUBMED上，通过BLAST比对spacer DNA和对应细菌的基因组DNA，去除靠近PAM区12nt重复的spacer DNA,获得脱靶可能性最低的spacer序列。
2) 为将两个20bp spacer编码DNA的序列克隆入，需要同时合成gcaagcacgccttagtaaccspacer DNA的正向和反向序列，并且在正向序列的5’端加上序列“AGCAC”，3’端加上“G”，反向序列的5’端加上“5’-AAAAC-3’”,3’端加上“G”。Spacer DNA的序列如下：
大肠杆菌spacer DNA：
正大spacer DNA1：AGCACaaattgctccccattcttatG（SEQ ID.18）
反大spacer DNA1：AAAACATAAGAATGGGGAGCAATTTG（SEQ ID.19）
正大spacer DNA2：AGCACgcaagcacgccttagtaaccG（SEQ ID.20）
反大spacer DNA2：AAAACGGTTACTAAGGCGTGCTTGCG（SEQ ID.21）
铜绿假单胞菌spacer DNA：
正铜spacer DNA1：AGCACAACGCCAGCCATGCGTGTACG（SEQ ID.22）
反铜spacer DNA1：AAAACGTACACGCATGGCTGGCGTTG（SEQ ID.23）
正铜spacer DNA2：AGCACCATCCTCAAGCGCCTGTTCAG（SEQ ID.24）
反铜spacer DNA2：AAAACTGAACAGGCGCTTGAGGATGG（SEQ ID.25）
鲍曼不动杆菌spacer DNA：
正鲍spacer DNA1：AGCACTTAAGTTCTTAGGTCAACGGG（SEQ ID.26）
反鲍spacer DNA2：AAAACCCGTTGACCTAAGAACTTAAG（SEQ ID.27）
正鲍spacer DNA2：AGCACTTGCCTGTGGCATTGTCTGGG（SEQ ID.28）
反鲍spacer DNA2：AAAACCCAGACAATGCCACAGGCAAG（SEQ ID.29）
3) 下面以大spacer1和大spacer2为例作说明，其他spacer DNA的合成方法相同:
① 合成序列5’-AGCACaaattgctccccattcttat-3’和5’-GATAAGAATGGGGAGCAATTT-3’，将二者等比例混合，加热变性后退火，使二者形成互补链，获得两端带有突出碱基的双链DNA——大spacerD1’：
5’-AGCACaaattgctccccattcttat-3’
||||||||||||||||||||
3’-TTTAACGAGGGGTAAGAATAG-5’，
所获得的双链DNA可插入BsaI或BsmAI酶切位点。
② 合成序列5’-AGCACgcaagcacgccttagtaacc-3’和5’-GGGTTACTAAGGCGTGCTTGC-3’，将二者等比例混合，加热变性后退火，使二者形成互补链，获得两端带有突出碱基的双链DNA——大spacerD2’：
5’-AGCACgcaagcacgccttagtaacc-3’
||||||||||||||||||||
3’-CGTTCGTGCGGAATCATTGGG-5’，
所获得的双链DNA可插入BsaI或BsmAI酶切位点。
4) 将大spacerD1’和大spacerD2’先后克隆入pCr-NHEJ经过BsaI或BsmAI酶切位点，构建靶向目的基因的CRISPR-Cas9载体。
5) 构建成功后，采用电穿孔转化宿主菌，在抗生素平板上筛选抗性克隆，并采用一条位于敲除区域的引物和一条位于非敲除区域的引物进行菌落PCR，扩增靶基因（电泳结果见图6A）。如不能扩增出靶基因，则证明敲除成功，否则表示该菌落的目的基因未敲除成功。针对三个基因的引物对序列如下：
大肠杆菌基因敲除鉴定引物：
大P1（SEQ ID.30）：5’-CCCATTCTTATCGGCCTGAG-3’
大P2（SEQ ID.31）：5’-CTTGGCGTTGTACAACGTGG-3’
铜绿假单胞菌基因敲除鉴定引物：
鲍P1（SEQ ID32.）：5’-AAGTTCTTAGGTCAACGGTG-3’
鲍P2（SEQ ID.33）：5’-TGTATGTACAGGCGAACTTC-3’
鲍曼不动杆菌基因敲除鉴定引物：
铜P1（SEQ ID.34）：5’-AGCCATGCGTGTACTGGTTC-3’
铜P2（SEQ ID.35）：5’-GCTGTCGGTTTTCGCCGGAG-3’
铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌感受态制备、电穿孔转化的方法与上述针对大肠杆菌的基因敲除方法完全相同。大肠杆菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌基因敲除的鉴定结果见图6A、B和C。
实施例5。
1. cas9、ku、ligD基因的扩增及三个基因片段的连接。
1) cas9基因扩增：采用引物PPLtetO-1-1-cas9U（SEQ ID.4；）和cas9D（SEQ ID.5；）扩增cas9基因，模板为pCas9质粒（Addgene，GI:669193757）。PCR 反应体系：pfu高保真DNA聚合酶(北京天根)1μL，10×PCR buffer 5μL，上游引物（5μM ）1μL，下游引物（5μM ）1μL，模板DNA 10ng，补充灭菌超纯水至50μL。
2) ku基因扩增：采用引物PPLtetO-1-1-KuU（SEQ ID.6；）和PkuD（SEQ ID.7；）扩增ku基因，模板为pET16b-MtKu质粒（Science. 2002, 6; 297(5587):1686-9）。PCR 反应体系：pfu高保真DNA聚合酶1μL，10×PCR buffer 5μL，上游引物（5μM ）1μL，下游引物（5μM ）1μL，模板DNA 10ng，补充灭菌超纯水至50μL。PCR循环条件：98℃变性10 s，68℃延伸2min，共30 个循环，72℃最后延伸5min。
3) ligD基因扩增：采用引物PPLtetO-1-1-PligDU（SEQ ID.8；）和PligDD（SEQ ID.9；）扩增ku基因，模板为pET16b-MtligD质粒[Science. 2002, 6; 297(5587):1686-9]。PCR 反应体系：pfu高保真DNA聚合酶1μL，10×PCR buffer 5μL，上游引物（5μM ）1μL，下游引物（5μM ）1μL，模板DNA 10ng，补充灭菌超纯水至50μL。PCR循环条件：98℃变性10 s，68℃延伸2min，共30 个循环，72℃最后延伸5min。
4) PCR产物回收：采用QIAGEN公司的PCR产物回收试剂盒回收上述三种PCR产物。
5) cas9、ku、ligD基因的in-fusion PCR连接及扩增：取三个基因的等量的PCR产物，用TBiotech的In-fusion PCR试剂盒进行连接。反应体系：cas9 、ku和ligD的PCR产物按照摩尔比1：1:1的比例混合（DNA总量为1μg），5×In-Fusion HD Enzyme Premix（In-Fusion? HD Cloning Plus，Clontech, TAKARA) 2μL，补充灭菌超纯水至10μL，37℃温育1h，以连接上述三个PCR产物。用引物为PPLtetO-1-cas9U和RPligDD扩增上述连接产物。PCR反应体系：pfu高保真DNA聚合酶1μL，10×PCR buffer 5μL，上游引物（5μM ）1μL，下游引物（5μM ）1μL，模板1μL。取3μL PCR产物进行电泳。
2. 广宿主质粒PBBR1MCS-2的质粒转化、提取及酶切。
1) 氯化钙法制备大肠杆菌DH5α感受态：用接种环挑取单克隆大肠杆菌的DH5α菌落于2ml LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜。将上述过夜培养的细菌按1：100的比例转接至5ml LB液体培养基中振荡培养2-3小时(OD600约0.2<0.4)。将上述生长对数期的菌液置冰上10分钟，4℃离心8000rpm, 30秒,弃去上清。用100mmol/L的氯化钙溶液400μL悬浮菌体，冰浴10分钟，4℃离心，4000rpm，5分钟，弃去上清。再把菌体悬浮在400μL冰上预冷的100mmol/L氯化钙溶液中，此菌液即为感受态细菌，按100μL分装在已消毒的Eppendorf管内，置4℃冰箱中备转化用。
2) 质粒转化：将质粒DNA（100ng/μL ）1μL加入至100μL感受态细菌中（置于1.5mL离心管中），混匀，置冰上30分钟。然后立即置42℃水浴中热激90秒，取出后立即置冰水浴中冷却2分钟。向细菌中加入900μL SOC液体培养基（无卡那霉素），在37℃摇床上温和摇动，转速200 rpm，1小时。取10μL涂布与1.5%的LB琼脂固体培养基（含卡那霉素50ug/ml）平皿上，于37℃培养12小时，长出单菌落。
3) 质粒扩大培养及大量提取：挑取单菌落，接种于3ml LB液体培养基(含卡那霉素50ug/ml），置37℃摇床上温和摇动，转速200 rpm，培养12小时。采用质粒提取试剂盒（高纯度质粒小提中量试剂盒，北京天根）提取质粒。
4) 质粒酶切：反应体系：质粒1μg，KpnI（NEB）和HindIII（NEB）各1μL，10×缓冲液Cutsmart 1μL，补充水至20μL，37℃酶切2小时。酶切产物采用DNA胶回收试剂盒回收（QIAGEN）。
3. cas9、ku、ligD基因与载体的连接：取三基因连接片段和酶切后的载体pBBR1MCS-2按照1:1的摩尔比混合（DNA总量为1μg），加入5×In-Fusion HD Enzyme Premix（In-Fusion? HD Cloning Plus，Clontech, TAKARA) 2μL，补充灭菌超纯水至10μL，37℃温育1h，以连接上述两个DNA片段，连接成功即获得pNHEJ。
4. sgRNA的设计:首先在PUBMED上获得tolC（GI:224015931）、RND family drug transporter（locus_tag="A1S_1773"）和RND型多重耐药外排泵基因mexA（locus_tag="OU9_00435"）的基因序列，然后选取开放读码框的前250nt序列作为靶位点，使用在线sgRNA设计软件（http://crispr.dbcls.jp/）,在靶基因上寻找spacer序列。序列模式为3’-N20 NGG-5’，spacer即为为与N20互补的序列。然后在pubmed上通过BLAST软件，与铜绿假单胞菌PAO1的全基因组进行比对，去除3’端12个碱基完全重复的spacer序列，以避免发生脱靶效应。
5. Spacer DNA的克隆：
由于针对三个基因的载体的构建完全相同，在此仅针对大肠杆菌tolC基因的敲除载体的构建为例进行说明，其他两种载体的构建步骤、实验条件完全相同。
双链Spacer DNA的制备：
取合成好的正大spacer DNA1（SEQ ID.18）和反大spacer DNA1（SEQ ID.19）片段，等摩尔浓度混合，然后进行变性、退火。
变性、退火体系为：，
2.5μl 正向 spacer DNA (100μM)
2.5μl 反向 spacer DNA (100μM)
1μl NEB buffer2
4μl 灭菌水
在PCR 仪中按照以下程序运行：95℃，5min ；95–85℃ at-2℃/s ；85–25℃ at-0.1℃ /s。退火后，两条DNA单链互补形成双链。正大spacer DNA2（SEQ ID.20）和反大spacer DNA1（SEQ ID.21）的变性退火条件同上。
双链Spacer DNA的克隆
6. 首先对质粒进行单酶切，反应体系：质粒pNHEJ 1μg，BsaI（NEB）或BsmAI（NEB）1μL，10×缓冲液Cutsmart 1μL，补充水至20μL，37℃酶切2小时，然后对酶切产物采用DNA胶回收试剂盒回收（QIAGEN）。将双链Spacer DNA与载体回收片段按照1:1的比例进行混合，加入5×In-Fusion HD Enzyme Premix（In-Fusion? HD Cloning Plus，Clontech, TAKARA) 2μL，补充灭菌超纯水至10μL，37℃温育1h，以连接上述两个DNA片段。连接产物转化大肠杆菌DH5α并提取质粒（氯化钙法感受态制备、质粒转化、提取如前所述）。然后再对质粒进行BsmAI（NEB）或BsaI（NEB）单酶切。反应体系：1μL，10×缓冲液Cutsmart 1μL，补充水至20μL，37℃酶切2小时，然后对酶切产物采用DNA胶回收试剂盒回收（QIAGEN）。将双链Spacer DNA与载体回收片段按照1:1的比例进行混合（DNA总量为1μg），加入5×in-Fusion HD Enzyme Premix（In-Fusion? HD Cloning Plus，Clontech, TAKARA) 2μL，补充灭菌超纯水至10μL，37℃温育1h，以连接上述两个DNA片段。连接成功后即获得基因定点敲除的质粒载体。取连接产物转化大肠杆菌DH5α，并采用前述方法提取质粒。
注：由于宿主菌DH5α携带TolC基因，因此，在接受质粒后，其TolC基因已经开始接受敲除，其靶基因的相应位点已经被切开，在切除数个碱基后，由NHEJ系统进行连接。如DH5α接受的是敲除铜绿假单胞菌或鲍曼不动杆菌的基因敲除质粒，则理论上不会发生上述情况。
基因敲除实验
用于电击转化的感受态细菌的制备（大肠杆菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的制备方法完全相同，在此一并描述）：
1) 电转化感受态细胞的制备
① 用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有２ml LB液体培养基的玻璃试管中。37℃，220rpm，培养14-16个小时。
② 第二天，以体积比1：100的比例转接种于100ml LB液体培养基中，37℃，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。
③ 将细菌培养液置于冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到50ml 预冷的离心管中，4℃，4000g离心10分钟。
④ 弃上清，离心管中加入少量灭菌超纯水，使沉淀悬浮后，再加入适量灭菌超纯水，4℃，4000rpm离心10分钟。
⑤ 重复步骤4。
⑥ 弃上清后，加入少量灭菌、冰上预冷的10%甘油，重悬细菌，再加满10%甘油, 4℃, 4000rpm, 离心10min。
⑦ 弃上清，每个离心管中加入2ml 10％的甘油，重悬细菌，即用于电转化。
2) 电转化
① 取2 μl针对不同基因的 CRISPR-Cas9载体于1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。
② 将40μL解冻的感受态细胞转移至此1.5ml 的离心管中，小心混匀，冰上放置10min。
③ 将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部；
④ 将电极杯推入电转化仪，进行电穿孔转化（1.8kV,6mS），电击结束后，立即向电击杯中加入1000μl的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。
⑤ 37℃，220－250rpm复苏1小时。
⑥ 取10μL转化产物加90μL SOC涂布于含有卡那霉素（50 μg/ml）的LB平板上，放于37℃温室，过夜培养。
⑦ 次日挑选菌落，进行菌落PCR鉴定基因敲除阳性率。
3) 敲除率鉴定
采用如前所述的鉴定引物进行PCR。在PCR管中按照下列条件混合PCR反应体系：
pfu高保真DNA聚合酶1μL，10×PCR buffer 5μL，上游引物（5μM ）1μL，下游引物（5μM ）1μL，补充灭菌超纯水至50μL，然后从平板上随机选取10个菌落，用接菌针尖挑取极少量的细菌接种于上述PCR反应体系中。然后进行PCR扩增：PCR循环条件：98℃变性10 s，52℃延伸2min，共30 个循环，72℃最后延伸5min。
鉴定结果表明，该方法敲除基因的效率可达到87.5%～100%。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
基因序列表
<110> 广东医学院
<120> 一种pCr-NHEJ载体及其构建方法及其用于细菌基因定点敲除的应用
<160> 15
<210> SEQ ID NO: 1
<211> 12621
<212> DNA
<213> pCr-NHEJ
<400> SEQ ID NO: 1
ctcgggccgtctcttgggcttgatcggccttcttgcgcatctcacgcgctcctgcggcggcctgtagggcaggctcatacccctgccgaaccgcttttgtcagccggtcggccacggcttccggcgtctcaacgcgctttgagattcccagcttttcggccaatccctgcggtgcataggcgcgtggctcgaccgcttgcgggctgatggtgacgtggcccactggtggccgctccagggcctcgtagaacgcctgaatgcgcgtgtgacgtgccttgctgccctcgatgccccgttgcagccctagatcggccacagcggccgcaaacgtggtctggtcgcgggtcatctgcgctttgttgccgatgaactccttggccgacagcctgccgtcctgcgtcagcggcaccacgaacgcggtcatgtgcgggctggtttcgtcacggtggatgctggccgtcacgatgcgatccgccccgtacttgtccgccagccacttgtgcgccttctcgaagaacgccgcctgctgttcttggctggccgacttccaccattccgggctggccgtcatgacgtactcgaccgccaacacagcgtccttgcgccgcttctctggcagcaactcgcgcagtcggcccatcgcttcatcggtgctgctggccgcccagtgctcgttctctggcgtcctgctggcgtcagcgttgggcgtctcgcgctcgcggtaggcgtgcttgagactggccgccacgttgcccattttcgccagcttcttgcatcgcatgatcgcgtatgccgccatgcctgcccctcccttttggtgtccaaccggctcgacgggggcagcgcaaggcggtgcctccggcgggccactcaatgcttgagtatactcactagactttgcttcgcaaagtcgtgaccgcctacggcggctgcggcgccctacgggcttgctctccgggcttcgccctgcgcggtcgctgcgctcccttgccagcccgtggatatgtggacgatggccgcgagcggccaccggctggctcgcttcgctcggcccgtggacaaccctgctggacaagctgatggacaggctgcgcctgcccacgagcttgaccacagggattgcccaccggctacccagccttcgaccacatacccaccggctccaactgcgcggcctgcggccttgccccatcaatttttttaattttctctggggaaaagcctccggcctgcggcctgcgcgcttcgcttgccggttggacaccaagtggaaggcgggtcaaggctcgcgcagcgaccgcgcagcggcttggccttgacgcgcctggaacgacccaagcctatgcgagtgggggcagtcgaaggcgaagcccgcccgcctgccccccgagcctcacggcggcgagtgcgggggttccaagggggcagcgccaccttgggcaaggccgaaggccgcgcagtcgatcaacaagccccggaggggccactttttgccggagggggagccgcgccgaaggcgtgggggaaccccgcaggggtgcccttctttgggcaccaaagaactagatatagggcgaaatgcgaaagacttaaaaatcaacaacttaaaaaaggggggtacgcaacagctcattgcggcaccccccgcaatagctcattgcgtaggttaaagaaaatctgtaattgactgccacttttacgcaacgcataattgttgtcgcgctgccgaaaagttgcagctgattgcgcatggtgccgcaaccgtgcggcaccctaccgcatggagataagcatggccacgcagtccagagaaatcggcattcaagccaagaacaagcccggtcactgggtgcaaacggaacgcaaagcgcatgaggcgtgggccgggcttattgcgaggaaacccacggcggcaatgctgctgcatcacctcgtggcgcagatgggccaccagaacgccgtggtggtcagccagaagacactttccaagctcatcggacgttctttgcggacggtccaatacgcagtcaaggacttggtggccgagcgctggatctccgtcgtgaagctcaacggccccggcaccgtgtcggcctacgtggtcaatgaccgcgtggcgtggggccagccccgcgaccagttgcgcctgtcggtgttcagtgccgccgtggtggttgatcacgacgaccaggacgaatcgctgttggggcatggcgacctgcgccgcatcccgaccctgtatccgggcgagcagcaactaccgaccggccccggcgaggagccgcccagccagcccggcattccgggcatggaaccagacctgccagccttgaccgaaacggaggaatgggaacggcgcgggcagcagcgcctgccgatgcccgatgagccgtgttttctggacgatggcgagccgttggagccgccgacacgggtcacgctgccgcgccggtagcacttgggttgcgcagcaacccgtaagtgcgctgttccagactatcggctgtagccgcctcgccgccctataccttgtctgcctccccgcgttgcgtcgcggtgcatggagccgggccacctcgacctgaatggaagccggcggcacctcgctaacggattcaccgtttttatcaggctctgggaggcagaataaatgatcatatcgtcaattattacctccacggggagagcctgagcaaactggcctcaggcatttgagaagcacacggtcacactgcttccggtagtcaataaaccggtaaaccagcaatagacataagcggctatttaacgaccctgccctgaaccgacgaccgggtcgaatttgctttcgaatttctgccattcatccgcttattatcacttattcaggcgtagcaccaggcgtttaagggcaccaataactgccttaaaaaaattacgccccgccctgccactcatcgcagtcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgagcgcgcgtaatacgactcactatagggcgaattggagctccaccgcggtggcGAGATTGACATCCCTATCAGTGATAGAGATACTGAGCACGAGACCaaaGGTCTCgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcTTTTTTTGACGACGACGACGACGAGATTGACATCCCTATCAGTGATAGAGATACTGAGCACGAGACaaaGTCTCgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcTTTTTTTgatcccccgggctgcaggaattcgatatcaGAGATTGACATCCCTATCAGTGATAGAGATACTGAGCACAAGGAGTATACCATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGATTATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGACAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGCAGATTCTACTGATAAAGTGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAACCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTAGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAAAAATGGATTGTTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGATTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATACTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATAGTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAACGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGCGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCTATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAGGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGCGTTGAAGATCGGTTTAATACGTCATTAGGTACCTACCATGATTTGCTAAAAATTATCAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATTTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAAGGAAATGATTGAGGAACGACTTAAAAAGTATGCTAACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCATTATACTGGCTGGGGGCGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAACTTTATGCAGCTTATCAATGATGATAGTTTAACATTCAAGGAAGCTATTCAAAAAGCACAGGTGTCTGGACAAGGCCATAGTTTACATGAACAGATTGCTAACTTAGCTGGCAGTCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAATTGTTGATGAACTGGTCAAAGTAATGGGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTCCAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCCTTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTGCTAACACGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTTAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAGGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGTGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAGAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTTTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAATTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAAAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGAACGAAACCGTTACAAATCAATTAAGGAAGTCTTAGATGCAACCCTCATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGAGAGATTGACATCCCTATCAGTGATAGAGATACTGAGCACAAGGAGTATACCATGCGAGCCATTTGGACGGGTTCGATCGCCTTCGGGCTGGTGAACGTGCCGGTCAAGGTGTACAGCGCTACCGCAGACCACGACATCAGGTTCCACCAGGTGCACGCCAAGGACAACGGACGCATCCGGTACAAGCGCGTCTGCGAGGCGTGTGGCGAGGTGGTCGACTACCGCGATCTTGCCCGGGCCTACGAGTCCGGCGACGGCCAAATGGTGGCGATCACCGACGACGACATCGCCAGCTTGCCTGAAGAACGCAGCCGGGAGATCGAGGTGTTGGAGTTCGTCCCCGCCGCCGACGTGGACCCGATGATGTTCGACCGCAGCTACTTTTTGGAGCCTGATTCGAAGTCGTCGAAATCGTATGTGCTGCTGGCTAAGACACTCGCCGAGACCGACCGGATGGCGATCGTGCATTTCACGCTGCGCAACAAGACCAGGCTGGCGGCGTTGCGCGTCAAGGATTTCGGCAAGCGAGAGGTGATGATGGTGCACACGTTGCTGTGGCCCGATGAGATCCGCGACCCCGACTTCCCGGTGCTGGACCAGAAGGTGGAGATCAAACCCGCGGAACTCAAGATGGCCGGCCAGGTGGTGGACTCGATGGCCGACGACTTCAATCCGGACCGCTACCACGACACCTACCAGGAGCAGTTACAGGAGCTGATCGACACCAAACTCGAAGGTGGGCAGGCATAAGGTGGGCAGGCATGAGATTGACATCCCTATCAGTGATAGAGATACTGAGCACAAGGAGTATACCATGGGTTCGGCGTCGGAGCAACGGGTGACGCTGACCAACGCCGACAAGGTGCTCTATCCCGCCACCGGGACCACAAAGTCCGATATCTTCGACTACTACGCCGGTGTTGCCGAAGTCATGCTCGGCCACATCGCGGGACGGCCGGCGACGCGCAAGCGCTGGCCTAACGGCGTCGACCAACCCGCGTTCTTCGAAAAGCAGTTGGCGTTGTCGGCGCCGCCTTGGCTGTCACGTGCAACGGTGGCGCACCGGTCCGGGACGACGACCTATCCGATCATCGATAGCGCAACCGGGCTGGCCTGGATCGCCCAACAGGCGGCGCTGGAGGTGCACGTGCCGCAGTGGCGGTTTGTCGCCGAGCCCGGATCAGGTGAGTTAAATCCGGGCCCGGCAACGCGTTTGGTGTTCGACCTGGACCCGGGCGAAGGCGTGATGATGGCCCAGCTGGCCGAGGTGGCGCGCGCGGTTCGTGATCTTCTCGCCGATATCGGGTTGGTCACCTTCCCGGTCACCAGCGGCAGCAAGGGATTGCATCTGTACACACCGCTGGATGAGCCGGTGAGCAGCAGGGGAGCCACGGTGTTGGCCAAGCGCGTCGCGCAGCGATTGGAGCAGGCGATGCCCGCGTTGGTCACCTCGACCATGACCAAAAGCCTGCGGGCCGGGAAGGTGTTTGTGGACTGGAGCCAGAACAGCGGCTCGAAGACCACCATCGCGCCGTACTCACTACGTGGCCGGACGCATCCGACCGTCGCGGCGCCACGCACCTGGGCGGAGCTCGACGACCCCGCACTGCGTCAGCTCTCCTACGACGAGGTGCTGACCCGGATTGCCCGCGACGGCGATCTGCTCGAGCGGCTGGATGCCGACGCTCCGGTAGCGGACCGGTTGACCCGATACCGCCGCATGCGCGACGCATCGAAAACTCCCGAGCCGATTCCCACGGCGAAACCCGTTACCGGAGACGGCAATACGTTCGTCATCCAGGAGCATCACGCGCGTCGGCCGCACTACGATTTCCGGCTGGAATGCGACGGCGTGCTGGTCTCGTGGGCGGTACCGAAAAACCTGCCCGACAACACATCGGTTAACCATCTAGCGATACACACCGAGGACCACCCGCTGGAATACGCCACGTTCGAGGGCGCGATTCCCAGCGGGGAGTACGGCGCCGGCAAGGTGATCATCTGGGACTCCGGCACTTACGACACCGAGAAGTTCCACGATGACCCGCACACGGGGGAGGTCATCGTGAATCTGCACGGCGGCCGGATCTCTGGGCGTTATGCGCTGATTCGGACCAACGGCGATCGGTGGCTGGCGCACCGCCTAAAGAATCAGAAAGACCAGAAGGTGTTCGAGTTCGACAATCTGGCCCCAATGCTTGCCACGCACGGCACGGTGGCCGGTCTAAAGGCCAGCCAGTGGGCGTTCGAAGGCAAGTGGGACGGCTACCGGTTGCTGGTTGAGGCTGACCACGGCGCCGTGCGGCTGCGGTCCCGCAGCGGGCGCGATGTCACCGCCGAGTATCCGCAATTGCGGGCATTGGCGGAGGATCTCGCCGATCACCACGTGGTGCTGGACGGCGAGGCCGTCGTACTTGACTCCTCTGGTGTGCCCAGCTTCAGCCAGATGCAGAATCGGGGCCGCGACACCCGTGTCGAGTTCTGGGCGTTCGACCTGCTCTACCTCGACGGCCGCGCGCTGCTAGGCACCCGCTACCAAGACCGGCGTAAGCTGCTCGAAACCCTAGCTAACGCAACCAGTCTCACCGTTCCCGAGCTGCTGCCCGGTGACGGCGCCCAAGCGTTTGCGTGCTCGCGCAAGCACGGCTGGGAGGGCGTGATCGCCAAGAGGCGTGACTCGCGCTATCAGCCGGGCCGGCGCTGCGCGTCGTGGGTCAAGGACAAGCACTGGAACACCCAGGAAGTCGTCATTGGTGGCTGGCGCGCCGGGGAAGGCGGGCGCAGCAGTGGCGTCGGGTCGCTGCTCATGGGCATCCCCGGTCCAGGTGGGCTGCAGTTCGCCGGGCGGGTCGGTACCGGCCTCAGCGAACGCGAACTGGCCAACCTCAAGGAGATGCTGGCGCCGCTGCATACCGACGAGTCCCCCTTCGACGTACCACTGCCCGCGCGTGACGCCAAGGGCATCACATATGTCAAGCCGGCGCTGGTTGCAGAGGTGCGCTACAGCGAGTGGACTCCGGAGGGCCGGCTGCGTCAATCAAGCTGGCGTGGGCTGCGGCCGGACAAGAAACCCAGTGAGGTGGTGCGCGAATGAccagcttttgttccctttagtgagggttaattgcgcgcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgcatgcataaaaactgttgtaattcattaagcattctgccgacatggaagccatcacaaacggcatgatgaacctgaatcgccagcggcatcagcaccttgtcgccttgcgtataatatttgcccatgggggtgggcgaagaactccagcatgagatccccgcgctggaggatcatccagccggcgtcccggaaaacgattccgaagcccaacctttcatagaaggcggcggtggaatcgaaatctcgtgatggcaggttgggcgtcgcttggtcggtcatttcgaaccccagagtcccgctcagaagaactcgtcaagaaggcgatagaaggcgatgcgctgcgaatcgggagcggcgataccgtaaagcacgaggaagcggtcagcccattcgccgccaagctcttcagcaatatcacgggtagccaacgctatgtcctgatagcggtccgccacacccagccggccacagtcgatgaatccagaaaagcggccattttccaccatgatattcggcaagcaggcatcgccatgggtcacgacgagatcctcgccgtcgggcatgcgcgccttgagcctggcgaacagttcggctggcgcgagcccctgatgctcttcgtccagatcatcctgatcgacaagaccggcttccatccgagtacgtgctcgctcgatgcgatgtttcgcttggtggtcgaatgggcaggtagccggatcaagcgtatgcagccgccgcattgcatcagccatgatggatactttctcggcaggagcaaggtgagatgacaggagatcctgccccggcacttcgcccaatagcagccagtcccttcccgcttcagtgacaacgtcgagcacagctgcgcaaggaacgcccgtcgtggccagccacgatagccgcgctgcctcgtcctgcagttcattcagggcaccggacaggtcggtcttgacaaaaagaaccgggcgcccctgcgctgacagccggaacacggcggcatcagagcagccgattgtctgttgtgcccagtcatagccgaatagcctctccacccaagcggccggagaacctgcgtgcaatccatcttgttcaatcatgcgaaacgatcctcatcctgtctcttgatcagatcttgatcccctgcgccatcagatccttggcggcaagaaagccatccagtttactttgcagggcttcccaaccttaccagagggcgccccagctggcaattccggttcgcttgctgtccataaaaccgcccagtctagctatcgccatgtaagcccactgcaagctacctgctttctctttgcgcttgcgttttcccttgtccagatagcccagtagctgacattcatcccaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcgcccgcgttcctgctggcgctgggcctgtttctggcgctggacttcccgctgttccgtcagcagcttttcgcccacggccttgatgatcgcggcggccttggcctgcatatcccgattcaacggccccagggcgtccagaacgggcttcaggcgctcccgaaggt
<210> SEQ ID NO: 2
<211> 89
<212> DNA
<213> PPLtetO-1-cas9U
<400> SEQ ID NO: 2
gctctagaactagtgGAGATTGACATCCCTATCAGTGATAGAGATACTGAGCACAAGGAGTATACCATGGATAAGAAATACTCAATAGG
<210> SEQ ID NO: 3
<211> 37
<212> DNA
<213> cas9D
<400> SEQ ID NO: 3
agggatgtcaatctcTCAGTCACCTCCTAGCTGACTC
<210> SEQ ID NO: 4
<211> 88
<212> DNA
<213> PPLtetO-1-KuU
<400> SEQ ID NO: 4
gctctagaactagtgGAGATTGACATCCCTATCAGTGATAGAGATACTGAGCACAAGGAGTATACCATGCGAGCCATTTGGACGGGTT
<210> SEQ ID NO: 5
<211> 23
<212> DNA
<213> PkuD
<400> SEQ ID NO: 5
ATGCCTGCCCACCTTCGAGTTTG
<210> SEQ ID NO: 6
<211> 84
<212> DNA
<213> PLtetO-1-ligDU
<400> SEQ ID NO: 6
gctctagaactagtgGAGATTGACATCCCTATCAGTGATAGAGATACTGAGCACAAGGAGTATACCATGGGTTCGGCGTCGGAG
<210> SEQ ID NO: 7
<211> 83
<212> DNA
<213> PligDD
<400> SEQ ID NO: 7
GGGAACAAAGCTGG CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTCATTCGCGCACCACCTCACT
<210> SEQ ID NO: 8
<211> 81
<212> DNA
<213> BsaIU
<400> SEQ ID NO: 8
GAGATTGACATCCCTATCAGTGATAGAGATACTGAGCAC gagacc aaa GGTCTC gttttagagctaGAAAtagcaagttaa
<210> SEQ ID NO: 9
<211> 72
<212> DNA
<213> BsaID
<400> SEQ ID NO: 9
GAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTC
<210> SEQ ID NO: 10
<211> 33
<212> DNA
<213> PBsaIU
<400> SEQ ID NO: 10
ctccaccgcggtggcGAGATTGACATCCCTATC
<210> SEQ ID NO: 11
<211> 33
<212> DNA
<213> PBsaID
<400> SEQ ID NO: 11
GTCGTCGTCGTCGTCAAAAAAAGCACCGACTCG
<210> SEQ ID NO: 12
<211> 79
<212> DNA
<213> BsmAIU
<400> SEQ ID NO: 12
GAGATTGACATCCCTATCAGTGATAGAGATACTGAGCAC gagacaaagtctcg ttttagagctaGAAAtagcaagttaa
<210> SEQ ID NO: 13
<211> 71
<212> DNA
<213> BsmAID
<400> SEQ ID NO: 13
GAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcTTTTTTT
<210> SEQ ID NO: 14
<211> 33
<212> DNA
<213> PBsmAIU
<400> SEQ ID NO: 14
GACGACGACGACGACGAGATTGACATCCCTATC
<210> SEQ ID NO: 15
<211> 33
<212> DNA
<213> PBsmAID
<400> SEQ ID NO: 15
GCCACCGCGGTGGAGAAAAAAAGCACCGACTCG
Claims (7)
1.一种pCr-NHEJ载体，其特征在于：所述pCr-NHEJ载体的序列具有SEQ ID NO: 1所示的序列。
2.权利要求1所述的一种pCr-NHEJ载体在定点敲除细菌基因中的应用。
3.权利要求1所述的一种pCr-NHEJ载体的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）采用革兰阴性菌的广宿主质粒PBBR1MCS-2（GI:773412）作为基础载体；
（2）采用带有用于mRNA转录的原核启动子PLtetO-1的上游引物和下游引物分别扩增如下三个蛋白基因：cas9（GI:674296984）、ku（GI:444893469）和ligD（GI:444893469），分别得到cas9扩增产物、ku扩增产物和ligD扩增产物；其中，cas9、ku和ligD三个蛋白基因的开放读码框均位于独立的PLtetO-1下游，以便使cas9、ku和ligD三个蛋白基因的表达均受该启动子的调控；所述cas9扩增产物、所述ku扩增产物和所述ligD扩增产物之间带有15nt的碱基重叠；
（3）所述cas9扩增产物的3’端与所述ku扩增产物的5’端，所述ku扩增产物的3’端与所述ligD扩增产物3’端之间，均带有15nt的碱基重叠，通过in-fusion PCR连接所述cas9扩增产物、所述ku扩增产物和所述ligD扩增产物，得到第一连接物；
（4）用限制性核酸内切酶KpnI和HindIII进行双酶切基础载体PBBR1MCS-2，得到基础载体的酶切产物；所述酶切产物经凝胶电泳、切胶并采用DNA回收试剂盒纯化酶切产物；然后采用in-fusion PCR连接所述纯化后的酶切产物和第一连接物，得到载体pNHEJ；
（5）利用NotI和SpeI双酶切所述载体pNHEJ，得到载体pNHEJ的酶切产物；
（6）向所述载体pNHEJ中同时引入相邻的两个倒置的BsaI酶切位点和相邻的两个倒置的BsmAI酶切位点，用于转录形成能够同时结合目的基因两个位置的sgRNA；其中，带有相邻的两个倒置的BsaI酶切位点的DNA片段为DBsaI，带有相邻的两个倒置的BsmAI酶切位点的DNA片段为DBsmAI；
（7）通过in-fusion PCR将DBsaI、DBsmAI进行链接，得到第二连接产物；
（8）通过in-fusion PCR将所述第二连接产物和载体pNHEJ的酶切产物连接起来，获得用于敲除靶基因的CRISPR-Cas9系统，即pCr-NHEJ载体。
4.根据权利要求3所述的一种pCr-NHEJ载体的构建方法，其特征在于：所述步骤（2）中，采用具有SEQ ID NO: 2所示序列的引物PPLtetO-1-cas9U和具有SEQ ID NO: 3所示序列的引物PCas9D扩增所述cas9蛋白基因，得到cas9扩增产物；
采用具有SEQ ID NO: 4所示序列的引物PPLtetO-1-KuU和具有SEQ ID NO: 5所示序列的引物PkuD扩增所述ku蛋白基因，得到ku扩增产物；
采用具有SEQ ID NO: 6所示序列的引物PLtetO-1-ligDU和具有SEQ ID NO: 7所示序列的引物PligDD扩增所述ligD蛋白基因，得到ligD扩增产物。
5.根据权利要求3所述的一种pCr-NHEJ载体的构建方法，其特征在于：所述步骤（6）中，带有相邻的两个倒置的BsaI酶切位点的DNA片段DBsaI的构建如下：
首先直接合成具有SEQ ID NO: 8所示序列的DNA序列BsaIU和具有SEQ ID NO: 9所示序列的DNA序列BsaID，其中，BsaIU的3’端和BsaID的5’端有15nt的重叠序列；其中，BsaID含有tracrRNA序列；
通过in-fusion PCR将BsaIU和BsaID连接起来；然后采用具有SEQ ID NO: 10所示序列的引物PBsaIU和具有SEQ ID NO: 11所示序列的引物PBsaID，PCR扩增，即得到带有相邻的两个倒置的BsaI酶切位点的DNA片段DBsaI。
6.根据权利要求3所述的一种pCr-NHEJ载体的构建方法，其特征在于：所述步骤（6）中，带有相邻的两个倒置的BsmAI酶切位点的DNA片段DBsmAI的构建如下：
首先直接合成具有SEQ ID NO: 12所示序列的DNA序列BsmAIU和具有SEQ ID NO: 13所示序列的DNA序列BsmAID；其中，BsmAID含有tracrRNA序列；
通过in-fusion PCR将所述DNA序列BsmAIU和所述DNA序列BsmAID连接起来；然后采用具有SEQ ID NO: 14所示序列的引物PBsmAIU和具有SEQ ID NO: 15所示序列的引物PBsmAID，进行PCR扩增，即得到带有相邻的两个倒置的BsmAI酶切位点的DNA片段DBsmAI。
7.权利要求3至6任意一项所述的一种pCr-NHEJ载体的构建方法所构建的pCr-NHEJ载体在定点敲除细菌基因中的应用。
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