CN107287226B

CN107287226B - 一种基于Cpf1的DNA构建物以及DNA体外拼接方法

Info

Publication number: CN107287226B
Application number: CN201610199930.3A
Authority: CN
Inventors: 王金; 李诗渊; 赵国屏
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2016-03-31
Filing date: 2016-03-31
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2036-03-31
Also published as: CN107287226A

Abstract

本发明提供了一种DNA构建物，所述DNA构建物中包括前缀与后缀，并且所述DNA构建物含有结构Ta‑C‑Tb，式中，Ta为前缀，含有酶切割位点的核酸序列；C为待拼接的核酸序列；Tb为后缀，含有不同于前缀的酶切割位点的核酸序列；其中，所述前缀和后缀包含的酶切位点(T2与T3)经酶切割后产生同尾序列。本发明还提供了上述DNA构建物的应用和使用该DNA构建物的一种DNA体外拼接方法。使用本发明的构建物和方法能够对DNA进行工程化、标准化、模块化的改造或组装。

Description

一种基于Cpf1的DNA构建物以及DNA体外拼接方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种用于遗传改造的构建物以及DNA体外拼接方法。

背景技术

40多年前由于限制性内切酶和DNA连接酶的发现，人类开始拥有体外剪接生命遗传物质DNA的能力(Zimmerman et al.1967；Lobban&Kaiser 1973；Cohen et al.1973)。近几十年的发展，已经发展出不少DNA拼接技术，使得拼接DNA更容易，拼接得长度更大。虽然化学合成DNA的价格在不断下降，但由于通常只能合成200bp-2,000bp的长度，因此化学合成目前不能完全替代DNA的拼接技术(Kosuri&Church 2014)。DNA拼接技术主要可以归纳为3种基本的原理：内切酶介导的拼接、位点特异性重组拼接和基于长重叠序列的拼接(Casini et al.2015)。

由于合成生物学的出现，除了使得拼接DNA更容易、更大，另外一个DNA拼接的目标是建立一个科学、标准化的拼接标准(Kelwick et al.2014；Ellis et al.2011)。一方面，合成生物学的一个研究方向是将一个个生物元件组装成一个系统，在此过程中，需要标准、可靠的工程化方式拼接来代替特定的重复、繁琐的拼接。另一方面，合成生物学需要测试、重新设计基因、回路、途径、网络等不同层次的组件，一个标准的拼接方法，可以方便的实现所有科学家的共享。在未来，任何非专业领域的人员、甚至在校学生都可以设计组装特定特征的细胞。

目前，已经有一些标准拼接方法的建立，Arturo Casini等人在综述中已有总结(Casini et al.2015)。其中，生物砖块(BioBricks^TM)是最早出现的拼接方法之一(Shettyet al.2008)，在此基础上建立了国际竞赛International Genetically EngineeredMachine Competition(iGEM)，目前已经拥有了超过20,000个元件的库。在BioBrick基础上，BglBrick标准改用BamHI与BglII同尾酶，使得拼接后的疤痕更合理，在融合蛋白的组装上更有优势(Anderson et al.2010)。随着拼接技术的发展，无缝拼接也应用于标准的建立。如基于type IIS限制性内切酶的拼接，基于片段间长重叠区的拼接技术In-Fusion和Gibson组装等 (Zhu et al.2007；Gibson et al.2009)。

虽然目前已经建立了不少组装的标准，但是这些组装技术还有一些不足之处和改进空间。例如，基于type II限制性内切酶和type IIS内切酶的拼接技术，必须要求拼接的元件中不能含有这些位点，否则必须先通过PCR方法或者从头合成去除这些酶切位点，增大了工作量和成本。ibrick的方法利用了基于归位内切酶的组装方法，识别并切割长的特定序列(>18bp)，避免了限制性内切酶的限制，但是它的缺点是拼接后会留下较长的疤痕(21bp)(Liu et al.2014)。基于片段间长重叠区的Gibson组装等方法可以很好的进行无缝拼接，而且可以实现大片段、多片段一次拼接，但是这个方法不太适合迭代拼接，因为这些片段的获得往往要通过PCR，PCR方法可能会引入不必要的突变，而且一次PCR对长度有很大的限制(例如，目前的PCR产物长度一般<20Kb)。

在2015年，张锋等人发现了由crRNA介导的内切酶Cpf1，能切割双链DNA并产生粘性末端(Zetsche et al.2015)。基于该酶的特性，本发明人通过设计构建，发明了C-Brick标准组装方法，简单易用，并解决了上述拼接方法的缺点。因此，C-Brick标准组装具有巨大的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种DNA构建物及其应用。

本发明的另一目的是提供一种体外拼接DNA的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种DNA构建物，所述DNA构建物中包括酶切割位点，并且所述DNA构建物含有结构如式I所示的核酸序列：

Ta-C-Tb I

式中，Ta为前缀序列；C为待拼接的核酸序列；Tb为后缀序列；

其中，所述前缀序列中含有第二酶切割位点，所述后缀序列中含有第三酶切割位点，所述第二酶切割位点不同于所述第三酶切割位点，并且所述第二酶切割位点和所述第三酶切割位点经酶切割后产生同尾序列。

在另一优选例中，所述酶切割位点需要在crRNA的参与下被定位(识别)并切割。

在另一优选例中，所述酶切割位点能够被CRISPR相关酶识别并切割。

在另一优选例中，所述酶切割位点能够被选自下组的酶识别并切割：Cpf1、Cas9、C2C1，C2C2，C2C3等CRISPR相关酶。

在另一优选例中，所述Cpf1酶为FnCpf1(即，来源于Francisella tularensis(土拉弗朗西斯菌)的Cpf1)。FnCpf1，能够在特定的crRNA的引导下切割Cpf1的切割位点。

在另一优选例中，所述式I中，所述Tb还包括第四酶切割位点(T4),所述第四酶切割位点与所述第二酶切割位点和所述第三酶切割位点不同。

在另一优选例中，所述第四酶切割位点，需要在crRNA的参与下被定位并切割。

在另一优选例中，所述式I中，所述Ta还包括第一酶切割位点(T1),所述第一酶切割位点与所述第四酶切割位点、所述第二酶切割位点和所述第三酶切割位点不同。

在另一优选例中，所述第一酶切割位点，需要在crRNA的参与下被定位并切割。

在另一优选例中，在不同crRNA的参与下，所述第二酶切割位点和所述第三酶切割位点能够被同一种酶切割；优选地，能够被选自下组的酶切割：Cpf1、Cas9、C2C1，C2C2，C2C3等CRISPR相关酶。

在另一优选例中，在不同crRNA的参与下，所述第一酶切割位点、所述第二酶切割位点、所述第三酶切割位点和所述第四酶切割位点能够被同一种酶切割；优选地，能够被选自下组的酶切割：Cpf1、Cas9、C2C1，C2C2，C2C3等CRISPR相关酶。

在另一优选例中，所述的待拼接的核酸序列包括CDS序列、编码基因序列、抗生素生物合成基因簇、负责接合转移的元件或有特定功能的DNA序列。

在另一优选例中，所述待拼接的核酸序列长度≥1bp，较佳地≥500bp，更佳地≥1kb，如1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、5kb、10kb、15kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、45kb、50kb、100kb。

在另一优选例中，所述C中不含有所述酶切位点。

在另一优选例中，定位所述第一酶切割位点的crRNA序列为：

5’-GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUUAUCGCAACUUUCUACUGAAUUC-3’。

在另一优选例中，定位所述第二酶切割位点的crRNA序列为：

5’-GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUCUCUAGAAAGAGGAGAAAGGAUCC-3’。

在另一优选例中，定位所述第三酶切割位点的crRNA序列为：

5’-GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCGAGCUAGAGACUAGUGGAUCC-3’。

在另一优选例中，定位所述第四酶切割位点的crRNA序列为：

5’-GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUAGCUAGCUGCAGUUUCUCCUUGAA-3’。

在另一优选例中，所述第二酶切割位点包含选自下组的核酸序列：

(a)5’-TTTACTCTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC-3’(T2)

(b)将(a)中的核酸序列经过一个或多个核苷酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且能够被FnCpf1与相应crRNA识别的核酸序列。

在另一优选例中，所述第三酶切割位点包含选自下组的核酸序列：

(a)5’-GGATCCACTAGTCTCTAGCTCGAGAAA-3’(T3)

在另一优选例中，所述第四酶切割位点包含选自下组的核酸序列：

(a)5’-TTCAAGGAGAAACTGCAGCTAGCTTAAA-3’(T4)，

在另一优选例中，所述第一酶切割位点包含选自下组的核酸序列：

(a)5’-TTTGTTATCGCAACTTTCTACTGAATTC-3’(T1)，

在另一优选例中，Ta包含选自下组的核酸序列：

(a)5’-TTTGTTATCGCAACTTTCTACTGAATTCAAGCTTTACTCTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC-3’；

在另一优选例中，Tb包含选自下组的核酸序列：

(a)5’-GGATCCACTAGTCTCTAGCTCGAGAAATTCAAGGAGAAACTGCAGCTAGCTTAAA-3’。

在另一优选例中，所述的构建物还含有位于式I所示的核酸序列上游或下游的选自下组的元件：

选择性标记基因、复制元件、启动子、终止子、poly(A)元件、转运元件、基因靶向元件、筛选标记基因、增强子和转座酶编码基因。

在另一优选例中，所述选择性标记基因选自抗性标记。

本发明的第二方面，提供了一种载体，所述载体包含本发明第一方面所述的构建物。

本发明的第三方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞的基因组的一个或多个位点整合有本发明的第一方面所述的构建物，或者所述宿主细胞中含有本发明的第二方面所述的载体。

本发明的第四方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包含的试剂选自下组中的一种或多种：

(a)权利要求1所述的构建物；

(b)权利要求5所述的载体；

(c)权利要求6所述的细胞；

(d)切割权利要求1中所述的构建物的酶切割位点的酶或其表达载体；和

(e)定位权利要求1中所述的构建物的酶切割位点的crRNA转录产物或crRNA转录模板。

本发明的第五方面，提供了如本发明的第一方面所述的构建物、本发明的第二方面所述的载体、本发明的第三方面所述的细胞或本发明的第四方面所述试剂盒的用途，用于细胞基因组的遗传改造和/或用于基因回路的构建。

本发明的第六方面，提供了一种DNA体外拼接方法，包括步骤：

(1)提供含有第一构建物的第一载体，所述第一构建物含有结构如式Ia所示的第一核酸序列，

Ta-Ca-Tb Ia

式中Ta、Tb的定义如本发明的第一方面中所述，Ca为第一待拼接的核酸序列；

(2)酶切所述第一载体的第三酶切位点，形成线性化的第一酶切产物；

(3)提供第二构建物，所述第二构建物含有结构如式Ib所示的第二核酸序列，

Ta-Cb-Tb Ib

式中Ta、Tb的定义如上所述，Cb为第二待拼接的核酸序列；

酶切所述第二构建物的第二酶切位点和第三酶切位点，形成经酶切的第二酶切产物；

(4)将第二酶切产物与所述第一酶切产物进行连接反应，从而形成含有式II所示的拼接序列的载体：

Ta-Ca-Scar-Cb-Tb II

式中，Ta、Tb、Ca、和Cb的定义如上所述，而Scar为拼接过程中所形成的拼接接头序列。

在另一优选例中，所述的Scar的长度为0～50。

在另一优选例中，所述的Scar的长度是3的倍数。

在另一优选例中，所述Scar的长度为6bp。

在另一优选例中，所述的第二构建物被整合或连接入第一载体的第二酶切位点。

在另一优选例中，所述方法的步骤(2)中，酶切所述第一载体的第三酶切位点和第四酶切位点，形成线性化的第一酶切产物；并且

在步骤(3)中，酶切所述第二构建物的第二酶切位点和第四酶切位点，形成经酶切的第二酶切产物；然后进行步骤(4)的连接反应。

在另一优选例中，所述的方法还包括任选地重复以下步骤一次或多次：

(5)对于上一步骤获得的载体，酶切其第二酶切位点和第三酶切位点，获得线性化的酶切产物，并将所述酶切产物与经第一酶切位点和第三酶切位点酶切的酶切产物进行连接反应，从而形成含多级拼接序列的连接产物。

在另一优选例中，所述的Ca和Cb中不含有所述第一酶切位点和所述第二酶切位点。

在另一优选例中，所述酶为Cpf1，优选为FnCpf1。

在另一优选例中，所述的待拼接的核酸序列包括CDS序列、编码基因序列、抗生素生物合成基因簇。

在另一优选例中，所述的构建物还含有位于式Ia或Ib所示的核酸序列上游或下游的选自下组的元件：

在另一优选例中，所述选择性标记基因选自：营养缺陷型标记、抗性标记、报告基因标记等。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了C-Brick标准拼接和Cpf1内切酶的切割示意图。其中特定的crRNA引导Cpf1切割DNA双链，形成5’突出粘性末端，基于此特性，设计了C-Brick标准拼接的方法。

图2显示利用本发明的C-Brick的载体质粒，接口序列(即前缀与后缀序列)及其切割位点的测序结果。其中前缀包含T1和T2序列，后缀包含T3和T4序列。主要切割位点在离PAM第18个碱基(非互补链)和第23个碱基(互补链)。

图3显示利用本发明的C-Brick系统拼接一个表达盒的流程。

图4显示利用本发明的C-Brick系统拼接三种颜色表达相关基因的结果。图4a表示液体培养基中培养含不同构建质粒的大肠杆菌，其中标有1,2,3分别是表达eforRed，amilGFP和cjBlue的大肠杆菌，4,5,6分别是表达eforRed+amilGFP，eforRed+cjBlue和amilGFP+cjBlue的大肠杆菌；图4b表示利用4a中的大肠杆菌在固体培养基上作画，经过37℃1天培养得到。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，通过对Cpf1酶切割特性的研究，开发了一种体外DNA拼接的技术方案。采用C-Brick标准载体作为拼接的载体，对DNA进行工程化、标准化、模块化的改造或组装。实验结果表明，采用上述技术方案成功地拼接了eforRed，cjBlue和amilGFP三种蛋白表达盒的拼接构建。再此基础上申请人开发了新一代的生物砖块组装标准，并完成了本发明。

具体地，本发明提供了一种DNA构建物，所述DNA构建物中包括前缀与后缀(分别为一段能被CRISPR相关酶切割的DNA序列)，并且所述DNA构建物含有结构Ta-C-Tb，式中，Ta为前缀，含有酶切割位点的核酸序列；C为待拼接的核酸序列；Tb为后缀，含有不同于前缀的酶切割位点的核酸序列；其中，所述前缀和后缀包含的酶切位点(T2与T3)经酶切割后产生同尾序列。本发明还提供了上述DNA构建物的应用和使用该DNA构建物的一种DNA体外拼接方法。使用本发明的构建物和方法能够对DNA进行工程化、标准化、模块化的改造或组装。

术语

术语“生物砖块(BioBricks^TM)”指由Tom Knight等人在2003年提出的一种DNA标准化组装标准(Idempotent Vector Design for Standard Assembly of BioBricks.DSpace2003http://hdl.handle.net/1721.1/21168.)。

术语“crRNA”是指CRISPR RNA，是短的引导Cpf1到靶向DNA序列的RNA。

术语“CRISPR”是指成簇的、规律间隔的短回文重复序列(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats)，该序列是许多原核生物的免疫系统。

术语“Cpf1”是指crRNA依赖的内切酶，它是CRISPR系统分类中V型(type V)的酶。

术语“FnCpf1”是指来源于Francisella novicida U112的Cpf1，它需要TTN的PAM序列，在特定crRNA的引导下，切割双链DNA，主要形成5’突出的粘性末端，主要切割位置是离PAM第18个碱基(非互补链)和第23个碱基(互补链)。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述FnCpf1的编码多核苷酸序列如下：

>FnCpf1(SEQ ID NO.1)

ATGAGCATCTATCAGGAGTTCGTGAATAAGTACAGCCTGTCCAAGACCCTGCGGTTTGAGCTGATCCCCCAGGGCAAGACACTGGAGAACATCAAGGCCAGGGGCCTGATCCTGGACGATGAGAAGCGCGCCAAGGACTATAAGAAGGCCAAGCAGATCATCGATAAGTACCACCAGTTCTTTATCGAGGAGATCCTGAGCAGCGTGTGCATCTCTGAGGATCTGCTGCAGAATTACAGCGACGTGTATTTCAAGCTGAAGAAGTCTGACGATGACAACCTGCAGAAGGACTTCAAGAGCGCCAAGGACACCATCAAGAAGCAGATCAGCGAGTATATCAAGGACTCCGAGAAGTTTAAGAATCTGTTCAACCAGAATCTGATCGATGCCAAGAAGGGCCAGGAGTCCGACCTGATCCTGTGGCTGAAGCAGTCTAAGGACAATGGCATCGAGCTGTTCAAGGCCAACTCTGATATCACCGATATCGACGAGGCCCTGGAGATCATCAAGAGCTTTAAGGGCTGGACCACATACTTTAAGGGCTTCCACGAGAACAGGAAGAACGTGTACAGCAGCAACGACATCCCTACAAGCATCATCTACCGCATCGTGGATGACAATCTGCCAAAGTTCCTGGAGAACAAGGCCAAGTATGAGTCCCTGAAGGACAAGGCCCCCGAGGCCATCAATTACGAGCAGATCAAGAAGGATCTGGCCGAGGAGCTGACCTTCGATATCGACTATAAGACATCCGAGGTGAACCAGCGGGTGTTTTCTCTGGACGAGGTGTTTGAGATCGCCAATTTCAACAATTACCTGAACCAGTCCGGCATCACCAAGTTCAATACAATCATCGGCGGCAAGTTTGTGAACGGCGAGAATACCAAGAGAAAGGGCATCAACGAGTACATCAATCTGTATAGCCAGCAGATCAACGACAAGACCCTGAAGAAGTACAAGATGAGCGTGCTGTTCAAGCAGATCCTGTCCGATACAGAGTCTAAGAGCTTTGTGATCGATAAGCTGGAGGATGACTCTGACGTGGTGACCACAATGCAGAGCTTTTATGAGCAGATCGCCGCCTTCAAGACCGTGGAGGAGAAGTCTATCAAGGAGACACTGAGCCTGCTGTTCGATGACCTGAAGGCCCAGAAGCTGGACCTGTCTAAGATCTACTTCAAGAACGATAAGTCCCTGACCGACCTGTCTCAGCAGGTGTTTGATGACTATAGCGTGATCGGCACCGCCGTGCTGGAGTACATCACACAGCAGATCGCCCCAAAGAACCTGGATAATCCCTCTAAGAAGGAGCAGGAGCTGATCGCCAAGAAGACCGAGAAGGCCAAGTATCTGAGCCTGGAGACAATCAAGCTGGCCCTGGAGGAGTTCAATAAGCACCGGGATATCGACAAGCAGTGCAGATTTGAGGAGATCCTGGCCAACTTCGCCGCCATCCCCATGATCTTTGATGAGATCGCCCAGAACAAGGACAATCTGGCCCAGATCTCCATCAAGTACCAGAACCAGGGCAAGAAGGACCTGCTGCAGGCCTCTGCCGAGGATGACGTGAAGGCCATCAAGGATCTGCTGGACCAGACCAACAATCTGCTGCACAAGCTGAAGATCTTCCACATCTCCCAGTCTGAGGATAAGGCCAATATCCTGGATAAGGACGAGCACTTTTATCTGGTGTTCGAGGAGTGTTACTTCGAGCTGGCCAACATCGTGCCCCTGTACAACAAGATCAGAAATTATATCACACAGAAGCCTTACTCCGACGAGAAGTTTAAGCTGAACTTCGAGAACAGCACCCTGGCCAACGGCTGGGATAAGAATAAGGAGCCTGACAACACAGCCATCCTGTTCATCAAGGATGACAAGTACTATCTGGGCGTGATGAATAAGAAGAACAATAAGATCTTCGATGACAAGGCCATCAAGGAGAACAAGGGCGAGGGCTACAAGAAGATCGTGTATAAGCTGCTGCCCGGCGCCAATAAGATGCTGCCTAAGGTGTTCTTTTCCGCCAAGTCTATCAAGTTCTACAACCCATCCGAGGACAT CCTGCGGATCAGAAATCACTCCACCCACACAAAGAACGGCTCTCCCCAGAAGGGCTATGAGAAGTTTGAGTTCAATATCGAGGATTGCCGGAAGTTTATCGACTTCTACAAGCAGAGCATCTCCAAGCACCCTGAGTGGAAGGATTTTGGCTTCAGGTTTAGCGACACCCAGCGGTACAACTCCATCGACGAGTTCTACAGAGAGGTGGAGAATCAGGGCTATAAGCTGACATTTGAGAACATCTCTGAGAGCTACATCGACAGCGTGGTGAATCAGGGCAAGCTGTACCTGTTCCAGATCTATAACAAGGACTTCAGCGCCTATTCCAAGGGCCGGCCAAACCTGCACACCCTGTACTGGAAGGCCCTGTTCGATGAGAGAAATCTGCAGGACGTGGTGTATAAGCTGAACGGCGAGGCCGAGCTGTTTTACAGGAAGCAGTCCATCCCTAAGAAGATCACACACCCAGCCAAGGAGGCCATCGCCAACAAGAATAAGGACAATCCTAAGAAGGAGAGCGTGTTCGAGTACGATCTGATCAAGGACAAGCGGTTCACCGAGGATAAGTTCTTTTTCCACTGTCCAATCACAATCAACTTCAAGTCCTCTGGCGCCAACAAGTTTAATGACGAGATCAATCTGCTGCTGAAGGAGAAGGCCAACGATGTGCACATCCTGAGCATCGACCGGGGCGAGAGACACCTGGCCTACTATACCCTGGTGGATGGCAAGGGCAATATCATCAAGCAGGATACCTTCAACATCATCGGCAATGACAGGATGAAGACAAACTACCACGATAAGCTGGCCGCCATCGAGAAGGATAGGGACTCCGCCCGCAAGGACTGGAAGAAGATCAACAATATCAAGGAGATGAAGGAGGGCTATCTGTCTCAGGTGGTGCACGAGATCGCCAAGCTGGTCATCGAGTACAATGCCATCGTGGTGTTCGAGGATCTGAACTTCGGCTTTAAGAGGGGCCGCTTTAAGGTGGAGAAGCAGGTGTATCAGAAGCTGGAGAAGATGCTGATCGAGAAGCTGAATTACCTGGTGTTTAAGGATAACGAGTTCGACAAGACCGGAGGCGTGCTGAGGGCATACCAGCTGACCGCCCCCTTTGAGACATTCAAGAAGATGGGCAAGCAGACAGGCATCATCTACTATGTGCCAGCCGGCTTCACCTCCAAGATCTGCCCCGTGACAGGCTTTGTGAACCAGCTGTACCCTAAGTATGAGTCCGTGTCTAAGAGCCAGGAGTTTTTCAGCAAGTTCGATAAGATCTGTTATAATCTGGACAAGGGCTACTTCGAGTTTTCCTTCGATTATAAGAACTTTGGCGACAAGGCCGCCAAGGGCAAGTGGACCATCGCCTCTTTCGGCAGCCGGCTGATCAACTTTAGAAATTCCGATAAGAACCACAATTGGGACACCCGGGAGGTGTACCCAACAAAGGAGCTGGAGAAGCTGCTGAAGGACTACAGCATCGAGTATGGCCACGGCGAGTGCATCAAGGCCGCCATCTGTGGCGAGAGCGATAAGAAGTTTTTCGCCAAGCTGACCTCCGTGCTGAATACAATCCTGCAGATGCGGAACAGCAAGACCGGCACAGAGCTGGACTACCTGATCTCCCCCGTGGCCGATGTGAACGGCAACTTCTTCGACAGCAGACAGGCCCCCAAGAATATGCCTCAGGATGCCGACGCCAACGGCGCCTATCACATCGGCCTGAAGGGCCTGATGCTGCTGGGCAGGATCAAGAACAATCAGGAGGGCAAGAAGCTGAACCTGGTCATCAAGAACGAGGAGTACTTTGAGTTCGTGCAGAACCGCAACAAT

术语“PAM”是指前间区序列邻近基序(protospacer-adjacent motif)，是Cpf1切割所必须，FnCpf1的PAM为TTN序列。

本发明中，C-Brick是指利用Cpf1进行生物元件(part)间迭代拼接的一种DNA标准化组装技术。在C-Brick标准载体中，每一个生物元件的5’端带有前缀序列，而3’端则包含后缀序列。所述前缀后缀序列经过酶切割后留下互补的粘性末端。

本发明中术语“待拼接的核酸序列”是指任一感兴趣的核酸序列，包括(但不限于)CDS序列、抗性基因编码序列、抗生素生物合成基因簇、启动子序列、终止子序列、复制子序列。

术语“part”、“生物元件”具有相同的含义，是指一段DNA序列，按照C-Brick标准分别在序列的5’端加入了前缀和3’端加入了后缀。

术语“scar”是指两个生物元件经过C-Brick标准拼接后，会留下一段短的序列。如利用T2，T3位点的拼接，两个元件之间会形成一段6个碱基的序列为：5’-GGATCC-3’。

根据本发明的C-Brick工作原理

如图1所示，以FnCpf1为例，说明本发明的C-Brick工作原理。在图1中，将需要拼接的各个元件构建到C-Brick标准载体中(比如启动子序列、蛋白编码序列和终止子序列)，然后通过FnCpf1和相应crRNA进行酶切并连接，即可对各个元件进行拼接(比如得到一个功能表达盒)。

如图2所示，a图显示了C-Brick标准载体中接口序列以及Cpf1靶标序列T1、T2、T3和T4，红色线条表示接口序列的4个Cpf1靶向序列的切割位点；b图显示了C-Brick标准载体的示意图；c图显示了分别对4个Cpf1靶向序列用FnCpf1 和相应crRNA切割后，对其切割位点进行测序分析，其主要切割位点在非互补链的18位和互补链的23位。

在本发明的一个优选地实施方式中，参考图3，根据本发明的DNA构建物含有T1(第一酶切位点)、T2(第二酶切位点)、T3(第三酶切位点)、T4(第四酶切位点)四个酶切位点，T1、T2位于待拼接核酸序列的上游(前缀序列)，T3、T4位于待拼接核酸序列的下游(后缀序列)。具体拼接过程描述如下：

酶切载体A(含待拼接元件A，如，RBS启动子载体)的T3和T4酶切位点，形成线性化的酶切产物A；

酶切载体B(含待拼接元件B，如，蛋白编码序列载体)的T1和T3酶切位点，形成经酶切的酶切产物B(蛋白编码序列)；

酶切载体C(含待拼接元件C,如，终止子载体)的T1和T2酶切位点，形成线性化的酶切产物C；

将酶切产物B和酶切产物C连接，从而将酶切产物B(含待拼接元件B)拼接到载体C中，待拼接元件B位于待拼接元件C的上游，获得拼接载体D；

酶切拼接载体D的T2和T4酶切位点，形成经酶切的酶切产物D(含待拼接元件B和待拼接元件C)；

将将酶切产物A和酶切产物D连接，从而将酶切产物D(含待拼接元件B和待拼接元件C)拼接到载体A中，待拼接元件A位于待拼接元件B的上游，从而获得拼接的待拼接元件A-待拼接元件B-待拼接元件C。

在本发明的一个优选地实施方式中，酶切位点为FnCpf1酶切位点，其在特定crRNA的引导下，切割双链DNA，形成5’突出的粘性末端。

本发明中的一个优选地实施方式中，根据本发明的C-Brick包括利用Cpf1进行生物元件(part)间迭代拼接的一种DNA标准化组装技术。在C-Brick标准载体中，每一个生物元件的5’端带有前缀序列(如，包含T1，T2)，而3’端则带有后缀序列(如，包含T3，T4)酶切位点。所述T2和T3经过Cpf1切割后留下互补的粘性末端。

在另一优选例中，相应酶切位点的crRNA序列如下：

T1-crRNA序列为5’-GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUUAUCGCAACUUUCUACUGAAUUC-3’(SEQ ID NO.5)；

T2-crRNA序列为5’-GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUCUCUAGAAAGAGGAGAAAGGAUCC-3’(SEQ ID NO.6)；

T3-crRNA序列为5’-GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCGAGCUAGAGACUAGUGGAUCC-3’(SEQID NO.7)；

T4-crRNA序列为5’-GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUAGCUAGCUGCAGUUUCUCCUUGAA-3’(SEQ ID NO.8)。

在另一优选例中，所述前缀序列包含选自下组的核酸序列：

(a)5’-TTTGTTATCGCAACTTTCTACTGAATTCAAGCTTTACTCTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC-3’(SEQ ID NO.9)；其中，

T1序列为5’-TTTGTTATCGCAACTTTCTACTGAATTC-3’(SEQ ID NO.10)；

T2序列为5’-TTTACTCTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC-3’(SEQ ID NO.11)；

(b)将(a)中的核酸序列经过一个或多个核苷酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且能够被FnCpf1与相应crRNA识别的核酸序列；

所述后缀序列包含选自下组的核酸序列：

(a)5’-GGATCCACTAGTCTCTAGCTCGAGAAATTCAAGGAGAAACTGCAGCTAGCTTAAA-3’(SEQID NO.12)；其中，

T3序列为5’-GGATCCACTAGTCTCTAGCTCGAGAAA-3’(SEQ ID NO.13)；

T4序列为5’-TTCAAGGAGAAACTGCAGCTAGCTTAAA-3’(SEQ ID NO.14)；

所述T3，T4序列为crRNA的互补链。

将每个生物元件都构建到标准的C-Brick载体中，形成质粒以用于保存。首先将part1用FnCpf1和crRNA-T3、crRNA-T4切割，part2用FnCpf1和crRNA-T2、crRNA-T3切割，琼脂糖凝胶电泳回收，然后把part2片段和part1载体按一定的摩尔比混合连接，并转化大肠杆菌(或其它合适的宿主)得到新的元件。接着将两个元件之间会产生6bp的scar，由于该序列中不含有in-frame的终止密码子，因此，该方法适用于融合蛋白的表达。在进行拼接时，为了防止载体自连，载体酶切完后进行琼脂糖凝胶电泳，并使用DNA凝胶回收试剂盒回收后，可以使用CIP(calf intestinal phosphatase)去磷，然后再次用DNA凝胶回收试剂盒进行回收。

如本文所用，“外源的”或“异源的”是指不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。

DNA构建物

本发明提供了一种DNA构建物，所述DNA构建物含有结构如式I所示的核酸序列：

Ta-C-Tb I

式中，Ta为含有第二酶切割位点(T2)的核酸序列；C为待拼接的核酸序列；Tb为含有第三酶切割位点(T3)的核酸序列；

其中，所述第二酶切割位点和所述第三酶切割位点经酶切割后产生同尾序列。

在另一优选例中，所述的构建物还包括选自下组的元件或其组合：启动子、终止子、poly(A)元件、转运元件、基因靶向元件、筛选标记基因、增强子、抗性基因、转座酶编码基因。

多种选择性标志基因均可应用于本发明，包括但不限于：营养缺陷型标记，抗性标记，报告基因标记。选择性标志的应用对于重组细胞(重组子)的筛选起到作用，使得受体细胞能够与未转化的细胞进行显著区分。营养缺陷型标记是通过转入的标记基因与受体细胞突变基因互补，从而使受体细胞表现野生型生长。抗性标记是指将抗性基因转入受体细胞中，转入的基因使受体细胞在一定的药物浓度下表现抗药性。作为本发明的优选方式，应用抗性标记来实现重组细胞的便捷筛选。

载体，宿主细胞

本发明还提供了一种载体，所述载体含有本发明的DNA构建物。优选地，所述载体选自：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、或动物细胞载体、穿梭载体；所述的载体为转座子载体。用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。

本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。

本发明还提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有所述的构建物或载体，或所述的宿主细胞染色体整合有所述的构建物或载体。在另一优选例中，所述的宿主细胞还包括含有编码转座酶基因的载体或其染色体上整合有转座酶基因。

优选地，所述的宿主细胞为大肠杆菌、链霉菌或真核细胞。

在另一优选例中，所述原核细胞，包括(但不限于)：大肠杆菌等。

在另一优选例中，所述真核细胞，包括(但不限于)：酿酒酵母等。

本发明的构建物或载体，可以用于转化适当的宿主细胞。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等动物细胞，如昆虫细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl₂法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。

本发明的主要优点在于：

(1)由于CIRPSR相关酶，如Cpf1内切酶识别的序列远长于常规的内切酶，多达24个碱基对左右，并且需要PAM序列(TTN)，其识别位点在天然DNA序列中非常稀少。因此，在构建C-Brick标准化元件时，基本上不需要进行DNA内部酶切位点的去除，这使得这个技术能够不需要改造原始的序列就能够容纳更大的生物元件，能够直接利用有更好表征的天然序列，极大地减少了标准化生物元件的工作量，增加了这个组装技术中循环组装策略使用的普适性；

(2)长的识别序列也为长片段的克隆和拼接提供了单一酶切位点，使得单个生物元件的容量可以大大增加。因此，该技术在长片段DNA序列的标准化、组装和表征等方面具有显著的优点。

(3)C-Brick拼接可以留下较短的疤痕，如六个碱基的疤痕GGATCC，翻译成氨基酸序列为甘氨酸-丝氨酸，通常情况下，它是可用于融合蛋白的连接肽序列。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明中所涉及的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。

材料

1.大肠杆菌DH10B菌株购自Takara公司；DNA限制性内切酶，T4DNA连接酶，T4Polynucleotide Kinase，calf intestinal phosphatase等购自New England Biolabs公司；T7RNA聚合酶购自Thermo公司；

SV Gel and PCR Clean-Up System购自Promega公司；pSB1A2质粒购自iGEM；Cpf1序列由南京金斯瑞公司合成；cjBlue(BBa_K592011),eforRed(BBa_K592012),ami lGFP(BBa_K592010)序列由上海吐露港生物科技有限公司合成；培养基(如，Tryptone，Yeast Extract等，如没有特别注明的话)均购自OXOID公司。

2.培养基配方：液体LB(1％Tryptone，0.5％Yeast extract,1％NaCl)，配置固体LB时，只需要在液体LB中添加1％的琼脂即可。

实施例1 eforRed，cjBlue和amilGFP三种颜色蛋白的拼接

1.以pSB1A2为模板，PCR引入前缀与后缀序列，使得BioBrick的酶切位点被替换。

2.以cjBlue(BBa_K592011),eforRed(BBa_K592012),ami lGFP(BBa_K592010)为模板PCR片段，并插入到标准C-Brick载体中。终止子序列(BBa_B0015)与包含RBS的启动子序列通过PCR引入到标准C-Brick载体中。

>eforRed(BBa_K592012)(SEQ ID NO.2)

ATGTCAGTGATTAAGCAGGTAATGAAGACCAAGTTGCACCTTGAGGGCACTGTCAATGGCCATGATTTTACGATCGAGGGTAAAGGTGAAGGCAAGCCGTACGAAGGGTTACAGCACATGAAAATGACAGTCACCAAAGGCGCGCCTCTGCCGTTTTCCGTTCATATTCTTACACCTAGCCACATGTATGGAAGCAAACCGTTTAATAAGTATCCAGCGGATATCCCAGACTACCACAAACAGTCTTTTCCCGAAGGTATGTCTTGGGAGCGGTCGATGATTTTTGAAGATGGTGGCGTATGCACCGCCAGTAATCACTCCAGCATAAACTTGCAAGAGAACTGTTTCATCTATGATGTTAAATTTCATGGTGTGAACCTGCCTCCGGATGGGCCCGTAATGCAAAAAACCATTGCTGGATGGGAGCCGAGCGTGGAAACACTGTACGTGCGTGACGGGATGTTAAAAAGTGACACTGCAATGGTTTTTAAACTGAAAGGAGGCGGTCATCATCGTGTTGATTTCAAAACGACGTATAAAGCCAAAAAACCTGTCAAGCTGCCAGAATTTCATTTCGTTGAACATCGCCTGGAACTGACCAAACACGATAAAGATTTCACAACTTGGGACCAGCAGGAGGCAGCCGAAGGCCATTTCTCACCGCTGCCGAAGGCTCTCCCATAA

>amilGFP(BBa_K592010)(SEQ ID NO.3)

ATGTCTTATTCAAAGCATGGCATCGTACAAGAAATGAAGACGAAATACCATATGGAAGGCAGTGTCAATGGCCATGAATTTACGATCGAAGGTGTAGGAACTGGGTACCCTTACGAAGGGAAACAGATGTCCGAATTAGTGATCATCAAGCCTGCGGGAAAACCCCTTCCATTCTCCTTTGACATACTGTCATCAGTCTTTCAATATGGAAACCGTTGCTTCACAAAGTACCCGGCAGACATGCCTGACTATTTCAAGCAAGCATTCCCAGATGGAATGTCATATGAAAGGTCATTTCTATTTGAGGATGGAGCAGTTGCTACAGCCAGCTGGAACATTCGTCTCGAAGGAAATTGCTTCATCCACAAATCCATCTTTCATGGCGTAAACTTTCCCGCTGATGGACCCGTAATGAAAAAGAAGACAATTGACTGGGATAAGTCCTTCGAAAAAATGACTGTGTCTAAAGAGGTGCTAAGAGGTGACGTGACTATGTTTCTTATGCTCGAAGGAGGTGGTTCTCACAGATGCCAATTTCACTCCACTTACAAAACAGAGAAGCCGGTCACACTGCCCCCGAATCATGTCGTAGAACATCAAATTGTGAGGACCGACCTTGGCCAAAGTGCAAAAGGCTTTACAGTCAAGCTGGAAGCACATGCCGCGGCTCATGTTAACCCTTTGAAGGTTAAATAA

>cjBlue(BBa_K592011)(SEQ ID NO.4)

ATGGCTTCCAAAATAAGCGACAACGTACGTATCAAACTGTATATGGAGGGCACGGTTAATAATCACCACTTCATGTGTGAAGCGGAGGGTGAGGGCAAGCCATACGAAGGAACGCAGATGGAAAACATTAAAGTGACCAAAGGAGGCCCGCTGCCGTTCTCTTTTGATATCCTGACGCCGAACTGCCAATATGGTTCTGTAGCCATAACCAAGTACACGTCGGGGATTCCGGACTATTTTAAACAGTCATTCCCTGAAGGTTTTACCTGGGAAAGAACCACCATTTATGAAGATGGGGCTTATCTGACAACTCAGCAGGAAACCAAACTTGATGGAAATTGCTTAGTCTACAATATTAAAATCCTCGGCTGCAATTTTCCCCCCAATGGTCCTGTTATGCAGAAAAAAACGCAAGGCTGGGAACCATGTTGCGAGATGCGCTATACACGTGATGGTGTCTTGTGCGGTCAGACATTAATGGCACTGAAATGTGCCGATGGGAACCATCTGACTTGTCATCTGCGGACTACTTACCGATCCAAAAAGGCAGCGAAGGCGTTGCAAATGCCACCTTTCCATTTTTCAGACCATCGTCCGGAAATTGTGAAGGTTAGCGAGAACGGCACACTGTTTGAGCAGCACGAAAGTAGTGTGGCACGCTATTGTCAGACATGCCCGAGCAAACTTGGTCATAATTAA

3.将上述含有cjBlue(BBa_K592011),eforRed(BBa_K592012),ami lGFP (BBa_K592010)的质粒，分别用FnCpf1和crRNA-T1，crRNA-T3切，终止子质粒用FnCpf1和crRNA-T1，crRNA-T2切，回收各个片段分别与终止子载体混合T4DNA连接酶连接。

4.将C-Brick上的包含RBS的启动子质粒用FnCpf1和crRNA-T3，crRNA-T4切，将3中各含终止子的结构基因用FnCpf1和crRNA-T2，crRNA-T4切，然后分别与启动子质粒载体混合T4DNA连接酶连接。

5.用类似的方法，可将已经连接好的3个表达盒再次两两拼接，形成另外3种颜色。

6.通过测序拼接获得的质粒，分析得到接口处的正确率，如表1。最常用的T2-T3切口连接和T4-T4切口连接，正确率达到了90％以上。

表1.C-Brick拼接不同位点的准确率

连接方式	T1-T1	T2-T3	T4-T4
				正确克隆数目/检测数目	10/12	44/47	38/42
准确率	83.3％	93.6％	90.5％

图4显示利用本发明的C-Brick系统拼接颜色蛋白的结果。其中a图显示了6种含有不同C-Brick组装质粒的大肠杆菌在液体培养基中的生长，产生可见的颜色。其中编号1,2,3大肠杆菌分别表达了eforRed，amilGFP和cjBlue蛋白，编号4,5,6大肠杆菌分别表达了2种不同蛋白，分别是eforRed+amilGFP eforRed+cjBlue和amilGFP+cjBlue；b图显示了用6种大肠杆菌在固体培养基上画图。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

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Claims

1.一种用于DNA体外拼接的DNA构建物，其特征在于，所述DNA构建物中包括酶切割位点，并且所述DNA构建物含有结构如式I所示的核酸序列：

Ta-C-Tb I

其中，所述前缀序列中含有第二酶切割位点，所述后缀序列中含有第三酶切割位点，所述第二酶切割位点不同于所述第三酶切割位点，并且所述第二酶切割位点和所述第三酶切割位点经酶切割后产生同尾序列；

其中，所述酶切割位点需要在crRNA的参与下被定位并切割；并且所述酶切割位点能够被CRISPR相关酶识别并切割，

并且，所述酶切割位点能够被Cpf1酶识别并切割，并且所述前缀序列和所述后缀序列经过酶切割后留下互补的用于DNA体外拼接的粘性末端；

并且，所述Tb还包括第四酶切割位点T4,所述第四酶切割位点位于所述第三酶切割位点的下游，并且所述第四酶切割位点与所述第二酶切割位点和所述第三酶切割位点不同；和

所述式I中，所述Ta还包括第一酶切割位点T1,所述第一酶切割位点位于所述第二酶切割位点的上游，且与所述第四酶切割位点、所述第二酶切割位点和所述第三酶切割位点不同。

2.如权利要求1所述的构建物，其中，所述Cpf1酶为FnCpf1酶。

3.如权利要求1所述的构建物，其中，所述待拼接的核酸序列长度≥500bp。

4.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述的待拼接的核酸序列包括CDS序列、编码基因序列、抗生素生物合成基因簇、负责接合转移的元件或有特定功能的DNA序列。

5.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述待拼接的核酸序列长度≥1kb。

6.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述第二酶切割位点的核酸序列为：

5’-TTTACTCTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC-3’。

7.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述第三酶切割位点的核酸序列为：

5’-GGATCCACTAGTCTCTAGCTCGAGAAA-3’。

8.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述第四酶切割位点的核酸序列为：

5’-TTCAAGGAGAAACTGCAGCTAGCTTAAA-3’。

9.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述第一酶切割位点的核酸序列为：

5’-TTTGTTATCGCAACTTTCTACTGAATTC-3’。

10.如权利要求1所述的构建物，其中，Ta的核酸序列为：

5’-TTTGTTATCGCAACTTTCTACTGAATTCAAGCTTTACTCTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC-3’；

和/或

Tb的核酸序列为：

5’-GGATCCACTAGTCTCTAGCTCGAGAAATTCAAGGAGAAACTGCAGCTAGCTTAAA-3’。

11.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述的构建物还含有位于式I所示的核酸序列上游或下游的选自下组的元件：

12.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求1所述的构建物。

13.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞的基因组的一个或多个位点整合有权利要求1所述的构建物，或者所述宿主细胞中含有权利要求12所述的载体。

14.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含的试剂选自下组中的一种或多种：

(a)权利要求1所述的构建物；

(b)权利要求12所述的载体；

(c)权利要求13所述的细胞；

15.如权利要求1所述的构建物、权利要求12所述的载体、权利要求13所述的细胞或权利要求14所述试剂盒的用途，其特征在于，用于细胞基因组的遗传改造和/或用于基因回路的构建。

16.一种DNA体外拼接方法，包括步骤：

Ta-Ca-Tb Ia

式中，Ta为前缀序列；Tb为后缀序列，Ca为第一待拼接的核酸序列；

并且，所述Tb还包括第四酶切割位点T4,所述第四酶切割位点位于所述第三酶切割位点的下游，并且所述第四酶切割位点与所述第二酶切割位点和所述第三酶切割位点不同；和所述Ta还包括第一酶切割位点T1,所述第一酶切割位点位于所述第二酶切割位点的上游，且与所述第四酶切割位点、所述第二酶切割位点和所述第三酶切割位点不同；

Ta-Cb-Tb Ib

式中Ta、Tb的定义如上所述，Cb为第二待拼接的核酸序列；

Ta-Ca-Scar-Cb-Tb II

式中，Ta、Tb、Ca、和Cb的定义如上所述，而Scar为拼接过程中所形成的拼接接头序列；

其中，所述酶切割位点需要在crRNA的参与下被定位并切割；并且所述酶切割位点能够被CRISPR相关酶识别并切割；

并且所述酶切割位点能够被Cpf1酶识别并切割，并且所述前缀序列和所述后缀序列经过酶切割后留下互补的用于DNA体外拼接的粘性末端。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法的步骤(2)中，酶切所述第一载体的第三酶切位点和第四酶切位点，形成线性化的第一酶切产物；并且

18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括重复以下步骤一次或多次：

19.如权利要求16所述的方法，其中，所述的待拼接的核酸序列包括CDS序列、编码基因序列、抗生素生物合成基因簇、负责接合转移的元件或有特定功能的DNA序列。

20.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述待拼接的核酸序列长度≥500bp。

21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述待拼接的核酸序列长度≥1kb。