CN118685436B - 一种简单快速高效的rna干扰载体构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程及分子生物学领域，具体涉及一种简单快速高效的RNA干扰载体构建方法及应用。该方法具体包括设计带同源臂和酶切位点的特异引物，利用特异引物扩增外源DNA片段，利用限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ酶切RNA干扰空载体，利用同源重组的方法将外源DNA片段连入到RNA干扰空载体中，形成RNA干扰终载体。该方法在RNA干扰的骨架载体上引入了致死基因，结合同源重组方法，只需要一次同源重组，即可将两个外源DNA片段同时连入RNA干扰载体的两个多克隆位点中，大大缩短了RNA干扰载体构建的周期，载体构建阳性率达到100%。另外，外源片段的选择不再受到酶切位点的限制，可以自由选择，拓宽了靶标的范围。
Description
技术领域
本发明属于基因工程及分子生物学领域，具体涉及一种简单快速高效的RNA干扰载体构建方法及应用。
背景技术
在基因功能研究中，会通过改变基因的表达量来探究基因的功能。改变基因的表达量分为提高基因表达量和降低基因表达量两种不同的方式，其中降低基因表达量又分为部分降低和基因敲除两种类型。近年来由于CRISPR/Cas9基因编辑技术的诞生，使得基因敲除变的非常简单和高效，但是对于一些重要的基因，将基因突变失活以后，可能会导致非常严重甚至是致死的表型，因此无法获得稳定的实验材料，给研究这些重要基因的功能带来困难。而RNA干扰并不会使目标基因突变，只是降低基因的表达量，在保证实验材料能存活的同时又会使生物体产生一定的表型，所以RNA干扰是一种不可替代的研究重要基因功能的方法。
构建RNA干扰载体时需要将目标基因的同一DNA片段构建到RNA干扰载体的两个多克隆位点中，两个多克隆位点中的DNA片段互为反向互补的关系。利用传统的方法构建RNA干扰载体时，首先要使用特异的引物将外源DNA片段扩增出来，然后利用酶切酶连的方法，将外源DNA片段分步连入RNA干扰载体。连接第一个外源DNA片段时，需要使用两个限制性内切酶线性化RNA干扰载体，连接第二个外源DNA片段时，需要以包含第一个外源DNA片段的质粒为中间载体，使用另外两个限制性内切酶线性化中间载体。该构建RNA干扰载体的方法复杂繁琐、费时又费力，而且效率低，需要经验丰富的研究人员才能操作成功；此外，由于需要使用限制性内切酶处理目标DNA，所以目标DNA不能含有限制性内切酶酶切位点，使得外源片段的选择受到限制。
同源重组法是另一种构建载体的常用方法，但是由于构建RNA干扰载体时连入两个多克隆位点中的DNA片段互为反向互补的关系。如果用同源重组的方法构建RNA干扰载体，重组到两个多克隆位点中的DNA片段互为同源臂，可能导致重组失败，所以还未有研究人员用同源重组法构建RNA干扰载体。
发明内容
为解决现有技术中RNA干扰载体构建时操作复杂，耗时长，且效率低的技术问题，本发明提供一种简单快速高效的RNA干扰载体构建方法及应用。
具体的，本发明的技术方案如下：
一种简单快速高效的RNA干扰载体构建方法，其不同之处在于，所述RNA干扰载体构建方法包括：
设计带同源臂和酶切位点的特异引物，利用特异引物扩增外源DNA片段A和外源DNA片段B，利用限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ酶切RNA干扰空载体，利用同源重组的方法将外源DNA片段A和外源DNA片段B连入到RNA干扰空载体中，形成RNA干扰终载体。
所述特异引物的同源臂和酶切位点的序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQID NO.3，SEQ ID NO.4所示。
SEQ ID NO.1：gggagggcgcgcctgcaggtacc
SEQ ID NO.2：cacgcgtacgtaaggttggatcc
SEQ ID NO.3：aacaattcaattcagtggagctc
SEQ ID NO.4：agcaggactctagacccactagt
其中，用于扩增外源DNA片段A的正向特异引物的同源臂和酶切位点的序列如SEQID NO.1所示，反向特异引物的同源臂和酶切位点的序列如SEQ ID NO.2所示，用于扩增外源DNA片段B的正向特异引物的同源臂和酶切位点的序列如SEQ ID NO.3所示，反向特异引物的同源臂和酶切位点的序列如SEQ ID NO.4所示；所述外源DNA片段A和外源DNA片段B除同源臂和酶切位点序列以外，其他序列为反向互补序列。
所述RNA干扰空载体具有两个ccdB基因表达盒，所述两个ccdB基因表达盒分别位于RNA干扰载体的两个多克隆位点内部，所述ccdB基因能够使普通大肠杆菌致死。
所述RNA干扰空载体序列如SEQ ID NO.5所示。
SEQ ID NO.5：
tggcaagctgctctagccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgacatgattacgaattccaatcccacaaaaatctgagcttaacagcacagttgctcctctcagagcagaatcgggtattcaacaccctcatatcaactactacgttgtgtataacggtccacatgccggtatatacgatgactggggttgtacaaaggcggcaacaaacggcgttcccggagttgcacacaagaaatttgccactattacagaggcaagagcagcagctgacgcgtacacaacaagtcagcaaacagacaggttgaacttcatccccaaaggagaagctcaactcaagcccaagagctttgctaaggccctaacaagcccaccaaagcaaaaagcccactggctcacgctaggaaccaaaaggcccagcagtgatccagccccaaaagagatctcctttgccccggagattacaatggacgatttcctctatctttacgatctaggaaggaagttcgaaggtgaaggtgacgacactatgttcaccactgataatgagaaggttagcctcttcaatttcagaaagaatgctgacccacagatggttagagaggcctacgcagcaggtctcatcaagacgatctacccgagtaacaatctccaggagatcaaataccttcccaagaaggttaaagatgcagtcaaaagattcaggactaattgcatcaagaacacagagaaagacatatttctcaagatcagaagtactattccagtatggacgattcaaggcttgcttcataaaccaaggcaagtaatagagattggagtctctaaaaaggtagttcctactgaatctaaggccatgcatggagtctaagattcaaatcgaggatctaacagaactcgccgtgaagactggcgaacagttcatacagagtcttttacgactcaatgacaagaagaaaatcttcgtcaacatggtggagcacgacactctsgtctactccaaraatrtcaaagatacagtctcagaagaccaaagggctattgagacttttcaacaaaggrtaatwtcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcraaaggacagtagaaaaggaaggtggcwcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcrttcaagatsyctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgayatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacacgctcgagcccccatttaaatcccccctcgaggatcaagtgcaaaggtccgccttgtttctcctctgtctcttgatctgactaatcttggtttatgattcgttgagtaattttggggaaagctagcttcgtccacagtttttttttcgatgaacagtgccgcagtggcgctgatcttgtatgctatcctgcaatcgtggtgaacttatttcttttatatccttcactcccatgaaaaggctagtaatctttctcgatgtaacatcgtccagcactgctattaccgtgtggtccatccgacagtctggctgaacacatcatacgatattgagcaaagatcgatctatcttccctgttctttaatgaaagacgtcattttcatcagtatgatctaagaatgttgcaacttgcaaggaggcgtttctttctttgaatttaactaactcgttgagtggccctgtttctcggacgtaaggcctttgctgctccacacatgtccattcgaattttaccgtgtttagcaagggcgaaaagtttgcatcttgatgatttagcttgactatgcgattgctttcctggacccgtgcagctgcggccatgggagggcgcgcctgcaggtaccgctttacactttatgcttccggctcgtataatgtgtggattttgagttaggatccgtcgagattttcaggagctaaggaagctaaaatgcagtttaaggtttacacctataaaagagagagccgttatcgtctgtttgtggatgtacagagtgatattattgacacgcccgggcgacggatggtgatccccctggccagtgcacgtctgctgtcagataaagtctcccgtgaactttacccggtggtgcatatcggggatgaaagctggcgcatgatgaccaccgatatggccagtgtgcctgtctccgttatcggggaagaagtggctgatctcagccaccgcgaaaatgacatcaaaaacgccattaacctgatgttctggggaatataaatgtcaggctcccttatacacagccagtctgcaggtggatccaaccttacgtacgcgtgcacctaggaaggtatacatatatgtttataattctttgtttcccctcttattcagatcgatcacatgcatctttcattgctcgtttttccttacaagtagtctcatacatgctaatttctgtaaggtgttgggctggaaattaattaattaattaattgacttgccaagatccatatatatgtcctgatattaaatcttcgttcgttatgtttggttaggctgatcaatgttattctagaggctagagaaacacacccaggggttttccaactagctccacaagatggtgggctagctgacctagatttgaagtctcactccttataattattttatattagatcattttctaatattcgtgtctttttttattctagagtctagatcttgtgttcaactctcgttaaatcatgtctctcgccactggagaaacagatcaggagggtttattttgggtataggtcaaagctaagattgaaattcacaaatagtaaaatcggaatccaaccaattttagtagccgagttggtcaaaggaaaatgtatatagctagatttattgttttggcaaaaaaaaatctgaatatgcaaaatacttgtatatctttgtattaagaagatgaaaataagtagcagaaaattaaaaaatggattatatttcctgggctaaaagaattgttgatttggcacaattaaattcagtgtcaaggttttgtgcaagaattcagtgtgaaggaatagattctcttcaaaacaatttaatcattcatctgatctgctcaaagctctgtgcatctccgggtgcaacggccaggatatttattgtgcagtaaaaaaatgtcatatcccctagccacccaagaaactgctccttaagtccttataagcacatatggcattgtaatatatatgtttgagttttagcgacaatttttttaaaaacttttggtcctttttatgaacgttttaagtttcactgtctttttttttcgaattttaaatgtagcttcaaattctaatccccaatccaaattgtaataaacttcaattctcctaattaacatcttaactcatttatttgaaaaccagttcaaattcttttaggctcaccaaaccttaaacaattcaattcagtgggtaccgctttacactttatgcttccggctcgtataatgtgtggattttgagttaggatccgtcgagattttcaggagctaaggaagctaaaatgcagtttaaggtttacacctataaaagagagagccgttatcgtctgtttgtggatgtacagagtgatattattgacacgcccgggcgacggatggtgatccccctggccagtgcacgtctgctgtcagataaagtctcccgtgaactttacccggtggtgcatatcggggatgaaagctggcgcatgatgaccaccgatatggccagtgtgcctgtctccgttatcggggaagaagtggctgatctcagccaccgcgaaaatgacatcaaaaacgccattaacctgatgttctggggaatataaatgtcaggctcccttatacacagccagtctgcaggtggatccgggtctagagtcctgctttaatgagatatgcgagacgcctatgatcgcatgatatttgctttcaattctgttgtgcacgttgtaaaaaacctgagcatgtgtagctcagatccttaccgccggtttcggttcattctaatgaatatatcacccgttactatcgtatttttatgaataatattctccgttcaatttactgattgtaccctactacttatatgtacaatattaaaatgaaaacaatatattgtgctgaataggtttatagcgacatctatgatagagcgccacaataacaaacaattgcgttttattattacaaatccaattttaaaaaaagcggcagaaccggtcaaacctaaaagactgattacataaatcttattcaaatttcaaaagtgccccaggggctagtatctacgacacaccgagcggcgaactaataacgctcactgaagggaactccggttccccgccggcgcgcatgggtgagattccttgaagttgagtattggccgtccgctctaccgaaagttacgggcaccattcaacccggtccagcacggcggccgggtaaccgacttgctgccccgagaattatgcagcatttttttggtgtatgtgggccccaaatgaagtgcaggtcaaaccttgacagtgacgacaaatcgttgggcgggtccagggcgaattttgcgacaacatgtcgaggctcagcaggacctgcaggcatgcaagcttggcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactggga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上述简单快速高效的RNA干扰载体构建方法在构建RNA干扰载体中的应用，其特征在于，包括以下步骤:
步骤1: 针对目标基因设计带同源臂和酶切位点的特异引物；
步骤2: 利用设计好的特异引物，通过PCR扩增外源DNA片段，所述外源DNA片段为外源DNA片段A和外源DNA片段B，所述外源DNA片段A和外源DNA片段B除同源臂和酶切位点序列以外，其他序列为反向互补序列；
步骤3: 利用限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ酶切RNA干扰空载体；
步骤4: 使用同源重组酶，将所述步骤2的PCR产物与所述步骤3的空载体酶切产物进行同源重组，得到连接产物；
步骤5：将所述连接产物转接至大肠杆菌后依次进行培养、抽提质粒，酶切验证得到阳性RNA干扰终载体。
所述特异引物的同源臂和酶切位点的序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQID NO.3，SEQ ID NO.4所示，其中，用于扩增外源DNA片段A的正向特异引物的同源臂和酶切位点的序列如SEQ ID NO.1所示，反向特异引物的同源臂和酶切位点的序列如SEQ ID NO.2所示，用于扩增外源DNA片段B的正向特异引物的同源臂和酶切位点的序列如SEQ ID NO.3所示，反向特异引物的同源臂和酶切位点的序列如SEQ ID NO.4所示。
所述RNA干扰空载体具有两个ccdB基因表达盒，所述两个ccdB基因表达盒分别位于RNA干扰载体的两个多克隆位点内部，所述ccdB基因能够使普通大肠杆菌致死。
所述RNA干扰空载体序列如SEQ ID NO.5所示。
酶切RNA干扰空载体的反应体系为：RNA干扰空载体3 μg，10 ×Buffer 5 μl，BamHⅠ 1 μl，KpnⅠ 1 μl，ddH2O补至50 μl，37℃酶切1 h。
同源重组反应体系为：1 μl 外源DNA片段A，1 μl 外源DNA片段B，1 μl RNA干扰空载体酶切产物，2 μl 5×CE II Buffer，1 μl Exnase® II，ddH2O补至10 μl，37℃反应30min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
（1）建立了一种简单快速高效的RNA干扰终载体构建的方法，该方法只需要通过一次重组，就可以将外源DNA片段同时连入RNA干扰载体的两个多克隆位点中，大大缩短了RNA干扰载体构建的周期；
（2）将大肠杆菌致死基因ccdB引入RNA干扰的骨架载体ds1301，然后利用同源重组的方法来构建目标干扰载体。致死基因的引入以及同源重组方法的使用，将显著提高阳性率，结果显示阳性率100%，同时也大大简化了操作步骤；
（3）由于同源重组的载体构建方法不需要酶切外源片段，所以外源片段的选择不再受到酶切位点的限制，而是可以自由选择，拓宽了靶标的范围；
（4）该方法只需使用两个限制性内切酶对载体进行线性化，而传统的需要使用四个限制性内切酶，节约了成本；
（5）该方法使用的外源DNA片段和线性化载体无需纯化，可直接用于同源重组反应，节约了时间和实验成本。
附图说明
图1是RNA干扰载体构建流程图；
图2是RNA干扰空载体DS1301C的载体图；
图3是水稻AL1基因的RNA干扰载体酶切胶图，其中，Marker：DNA分子量标准；泳道1-4：限制性内切酶BamH Ⅰ和KpnⅠ酶切后的4个水稻AL1基因的RNA干扰载体；bp：碱基对。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。若未特别指明，实例中所用的实验方法均为常规方法；所用的试剂、材料均可从商业途径得到。
实施例 构建水稻AL1基因的RNA干扰载体
步骤1: 针对目标基因设计带同源臂和酶切位点的特异引物；
本实施例针对水稻基因AL1（基因号LOC_Os03g31150）设计引物，共4条引物，分别为AL1A-F、AL1A-R、AL1B-F、AL1B-R。引物AL1A-F的序列如SEQ ID NO.6所示；引物AL1A-R的序列如SEQ ID NO.7所示；引物AL1B-F的序列如SEQ ID NO.8所示；引物AL1B-R的序列如SEQID NO.9所示。
SEQ ID NO.6：gggagggcgcgcctgcaggtaccgaccgtccgttcttctcagg
SEQ ID NO.7：cacgcgtacgtaaggttggatcccataggagacgcccaacctc
SEQ ID NO.8：aacaattcaattcagtggagctccataggagacgcccaacctc
SEQ ID NO.9：agcaggactctagacccactagtgaccgtccgttcttctcagg
步骤2: 利用设计好的特异引物，通过PCR扩增外源DNA片段；
利用引物AL1A-F和AL1A-R通过PCR扩增AL1基因的DNA片段A，利用引物AL1B-F和AL1B-R通过PCR扩增AL1基因的DNA片段B，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，保存备用。
步骤3: 利用限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ酶切RNA干扰空载体；
酶切体系为：RNA干扰空载体3 μg，10 ×Buffer 5 μl，BamHⅠ 1 μl，KpnⅠ 1 μl，ddH2O补至50 μl，37℃酶切1 h。
步骤4: 使用同源重组酶，将所述步骤2的PCR产物与所述步骤3的空载体酶切产物进行同源重组，得到连接产物；
重组体系为：1 μl AL1基因的DNA片段A，1 μl AL1基因的DNA片段B，1 μl RNA干扰空载体酶切产物，2 μl 5×CE II Buffer，1 μl Exnase® II，ddH2O补至10 μl，37℃反应30min。
步骤5：将所述连接产物转化大肠杆菌后依次进行培养、抽提质粒，酶切验证得到阳性RNA干扰终载体。
连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1。
取30 μL冰浴上融化的大肠杆菌感受态细胞（Trans1-T1 Phage ResistantChemically Competent Cell）加到1.5 mL无菌离心管中，然后加入5 μL连接产物，轻轻混匀，在冰浴中放置30 min。
42 ℃水浴热激30 sec，然后快速转移到冰上放置2 min，该过程不要摇动离心管。
向每个离心管中加入600 μL LB液体培养基（不含抗生素），混匀后置于37 ℃，180r/min培养1 h，使大肠杆菌复苏。
6000 r/min离心30 sec，弃去400 μL上清，用剩余的200 μL培养基悬浮菌体，将菌液全部转移到含有卡那霉素的LB培养皿上，涂开并晾干，做好标记，倒置于37 ℃恒温培养箱，过夜培养。
摇菌培养。
在灭菌过的10 mL离心管中加入2 mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，挑取单菌落至培养基中，置于摇床中，37 ℃，180 r/min培养12-16h。
质粒酶切检测。
用碱裂解法抽提质粒，限制性内切酶BamH Ⅰ和KpnⅠ酶切质粒检测，酶切体系如下：
质粒 500 ng
10×Buffer 2 μL
BamH Ⅰ 0.2 μL
KpnⅠ 0.2 μL
ddH2O 补至20 μL
37 ℃酶切30 min，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
酶切结果如图3所示，4个质粒均切出正确大小的外源片段，阳性率为100％，测序显示无突变。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种高效的RNA干扰载体构建方法，其特征在于，所述RNA干扰载体构建方法包括：
设计带同源臂和酶切位点的特异引物，利用特异引物扩增外源DNA片段A和外源DNA片段B，利用限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ酶切RNA干扰空载体，利用同源重组的方法将外源DNA片段A和外源DNA片段B连入到RNA干扰空载体中，形成RNA干扰终载体；
其中，用于扩增外源DNA片段A的正向特异引物的同源臂和酶切位点的序列如SEQ IDNO .1所示，反向特异引物的同源臂和酶切位点的序列如SEQ ID NO .2所示，用于扩增外源DNA片段B的正向特异引物的同源臂和酶切位点的序列如SEQ ID NO .3所示，反向特异引物的同源臂和酶切位点的序列如SEQ ID NO .4所示；
所述RNA干扰空载体具有两个ccdB基因表达盒，所述两个ccdB基因表达盒分别位于RNA干扰载体的两个多克隆位点内部，所述ccdB基因能够使普通大肠杆菌致死；
所述RNA干扰空载体序列如SEQ ID NO .5所示；
所述外源DNA片段A和外源DNA片段B除同源臂和酶切位点序列以外，其他序列为反向互补序列。
2.权利要求1所述的RNA干扰载体构建方法在构建RNA干扰载体中的应用，其特征在于，包括以下步骤:
步骤1: 针对目标基因设计带同源臂和酶切位点的特异引物；
步骤2: 利用设计好的特异引物，通过PCR扩增外源DNA片段，所述外源DNA片段为外源DNA片段A和外源DNA片段B，所述外源DNA片段A和外源DNA片段B除同源臂和酶切位点序列以外，其他序列为反向互补序列；
步骤3: 利用限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ酶切RNA干扰空载体；
步骤4: 使用同源重组酶，将所述步骤2的PCR产物与所述步骤3的空载体酶切产物进行同源重组，得到连接产物；
步骤5: 将所述连接产物转接至大肠杆菌后依次进行培养、抽提质粒，酶切验证得到阳性RNA干扰终载体；
步骤1中所述特异引物的同源臂和酶切位点的序列分别如SEQ ID NO .1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO .3，SEQ ID NO .4所示，其中，用于扩增外源DNA片段A的正向特异引物的同源臂和酶切位点的序列如SEQ ID NO .1所示，反向特异引物的同源臂和酶切位点的序列如SEQ ID NO .2所示，用于扩增外源DNA片段B的正向特异引物的同源臂和酶切位点的序列如SEQ ID NO .3所示，反向特异引物的同源臂和酶切位点的序列如SEQ ID NO .4所示；
步骤3中酶切RNA干扰空载体的用量为3 μg，50 μl反应体系，37 ℃酶切1 h；
步骤4的同源重组反应体系为：1 μl 外源DNA片段A，1 μl 外源DNA片段B，1 μl RNA干扰空载体酶切产物，2 μl 5×CE II Buffer，1 μl Exnase II，ddH2O补至10 μl，37℃反应30 min。
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113957092A (zh) * | 2021-10-09 | 2022-01-21 | 华中农业大学 | OsSUT4基因在制备抗拟禾本科根结线虫转基因水稻中的应用 |
Family Cites Families (5)
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|---|---|---|---|---|
| CN101139615B (zh) * | 2007-08-06 | 2011-10-19 | 湖北大学 | 一种快速高效构建哺乳动物细胞rna干扰载体及其验证载体的方法 |
| CN106906233A (zh) * | 2017-01-10 | 2017-06-30 | 海南大学 | 一种基于CcdB致死基因和SmaI酶切位点的酶切连接共体系同时进行的方法 |
| CN108486140A (zh) * | 2018-02-27 | 2018-09-04 | 温州医科大学 | 一种基于无缝克隆技术的克隆载体制备方法以及试剂盒 |
| CN110305885A (zh) * | 2019-05-08 | 2019-10-08 | 四川大学 | 利用ccdB致死基因快速构建重组质粒的试剂盒 |
| CN118028327A (zh) * | 2024-03-01 | 2024-05-14 | 广东肇庆星湖生物科技股份有限公司 | 利用同源重组酶进行多基因片段克隆的方法 |
-
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Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN113957092A (zh) * | 2021-10-09 | 2022-01-21 | 华中农业大学 | OsSUT4基因在制备抗拟禾本科根结线虫转基因水稻中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 利用Gateway技术构建黄瓜HPL基因的RNA干扰载体;王聪颖;陈书霞;陈巧;郝丽宁;孟焕文;万旭花;申晓青;程智慧;;西北农业学报;20130225(02);1.2-1.3节、图2 * |
| 叶用莴苣无缝克隆构建LsE3 基因过表达载体和新RNAi 载体及遗传转化体系优化;王婷甄等;中国农学通报;20210415;第37卷(第11期);第16页第3段，第17页第2段 * |
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