CN114317493A - 适用于假单胞菌的基因组编辑系统及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适用于假单胞菌的基因组编辑系统，包括PBBR1‑B质粒，该质粒包含有以下原件：Ptrc启动子、编码“识别pyrF基因的gRNA”的DNA片段，pyrF基因的上、下游同源臂、xylR—pxylA启动子、λ‑Red重组酶的编码基因、Pmin启动子、Cas9n蛋白的编码基因。本发明还公开了该基因组编辑系统在假单胞菌的基因编辑中的应用，包括基因敲除、基因插入和基因替换。本发明还公开了利用该基因组编辑系统进行基因编辑的具体方法。本发明的适用于假单胞菌的基因组编辑系统，克服了Cas9蛋白在假单胞菌中引起的致死问题，降低了脱靶效应带来的影响，具有基因编辑效率高、能进行大片段插入、质粒消除迅速等优点。

Description

适用于假单胞菌的基因组编辑系统及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一种适用于假单胞菌的基因组编辑系统及其构建方法与应用，属于基因工程领域。

背景技术

基因编辑(gene editing)，又称基因组编辑(genome editing)或基因组工程(genome engineering)，是一种比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术或过程。基因编辑依赖于经过基因工程改造的核酸酶，现有技术中常用的主要包括以下三种特异性核酸酶：1、锌指核酸酶(ZFNs，Zincfingernucleases)；2、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN，Transcriptio nactivator-likeeffectornucleases)；3、成簇规律间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)系统。

ZFNs在基因组编辑过程中，每个锌指单元只能识别3个固定碱基而非单个碱基，这导致靶向位点的选择有较高的限制性，并且该方法在编辑过程中较难，细胞毒性较高。TALENs的向位点的选择更加灵活且应用更为广泛但TALENs相比于ZFNs蛋白尺寸较大，加大了导入细胞的难度，在编辑过程中难。相较于前两种人工核酸酶技术，CRISPR-Cas系统是一种天然存在于原核生物RNA干扰系统，其介导的基因组编辑是由gRNA指导的，通过RNA与DNA的剪辑配对实现靶序列的识别，故具有精确度高、操作简便、低成本等优点。但是，CRISPR-Cas系统在原核基因组编辑中也存在一些不足，第一，CRISPR-Cas9系统容易导致细菌死亡：CRISPR-Cas9导致细菌双链DNA断裂，细菌缺少或低表达NHEJ系统的主要成分，从而使得断裂的DNA无法及时修复，造成细菌死亡；虽然多种重组酶，如SSr，λ-Red的引入，能增加DNA修复效率，但其效果在不同菌株，不同基因位点差异很大。第二，CRISPR-Cas9系统编辑效率差异很大：虽然该系统以高效闻名，但在不同位点效率差异很大(0.7％～100％)，极大限制了其在低编辑效率位点的应用。此外，该系统还存在大片段插入受限和质粒消除较为繁琐等问题，限制了其在原核细胞的广泛使用。

假单胞菌(Pseudomonas putida)属腐生革兰氏阴性假单胞菌，具有降解环境中有害芳香族及脂肪族类化合物、促进化学元素循环、生物催化、生物排污、合成生物塑料等多种功能的模式环境微生物菌株，也是基因克隆和蛋白表达的首选菌株之一，其基因组已在2002年被测序和解析。

利用CRISPR-Cas9系统建立适用于假单胞菌的高效基因组编辑方法，理论上具有可行性，但其需要解决以下技术问题：

第一，针对Cas9蛋白引起致死的问题，需要设计合理策略避免Cas9引起的细菌细胞死亡。

第二，原核生物基因编辑需要同时引入2～3个质粒，易造成遗传不稳定等问题。

第三，针对现有基因组编辑系统不能进行大片段插入的问题，需要提高编辑效率实现大片段插入(大于10kb)。

第四，针对现有编辑方法效率不一且突变子难以筛选的问题，需要提高编辑效率或添加选择标记实现突变子的快速筛选。

第五，针对现有的编辑方法质粒消除过程繁琐的问题，需要开发合适的质粒消除原件实现质粒的快速消除。

发明内容

针对上述现有技术，为实现高效的基因编辑，本发明提供了一种适用于假单胞菌的基因组编辑系统——CRISPR/Cas9-pyrF系统。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种适用于假单胞菌的基因组编辑系统CRISPR/Cas9-pyrF，包括PBBR1-B质粒，PBBR1-B质粒是以PBBR1为载体构建的重组载体，其上包含有以下原件：Ptrc启动子、编码“识别pyrF基因的gRNA”的DNA片段，pyrF基因的上游同源臂、xylR—pxylA启动子、λ-Red重组酶的编码基因(λ-Red)、Pmin启动子、Cas9n蛋白的编码基因(Cas9n)、pyrF基因的下游同源臂。

所述Ptrc启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述编码“识别pyrF基因的gRNA”的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，该gRNA所靶向PyrF基因的20nt-spacer序列为：5’-ttcgaagcccttgtcacaca-3’(如SEQ IDNO.3所示)。

所述pyrF基因的上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述pyrF基因的下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

所述xylR—pxylA启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

所述λ-Red重组酶的编码基因(λ-Red)的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

所述Pmin启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

所述Cas9n蛋白的编码基因(Cas9n)的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

所述PBBR1-B质粒的构建方法，包括以下步骤：

(1)构建Pmin::Cas9n-xylR-pxylA::λ-Red表达盒：

将Pmin启动子与Cas9n连接(通过重叠延伸PCR技术，overlapPCR)，得到Pmin::Cas9n；

将xylR-pxylA启动子与λ-Red连接，得到xylR-pxylA::λ-Red；

将Pmin::Cas9n与xylR-pxylA::λ-Red连接，得到Pmin::Cas9n-xylR-pxylA::λ-Red表达盒。

(2)构建PBBR1-B质粒：以假单胞菌A514基因组DNA为模板，PCR扩增得到pyrF基因的上游同源臂、下游同源臂；将pyrF基因的上游同源臂、下游同源臂、Pmin::Cas9n-xylR-pxylA::λ-Red表达盒、Ptrc启动子和编码“识别pyrF基因的gRNA”的DNA片段连接到pBBR1质粒上，得到PBBR1-B质粒。

上述适用于假单胞菌的基因组编辑系统在假单胞菌的基因编辑中的应用；所述基因编辑，选自基因敲除、基因插入和/或基因替换。

一种利用上述适用于假单胞菌的基因组编辑系统敲除假单胞菌的基因的方法，包括以下步骤：

(1)将λ-Red和Cas9n元件整合到假单胞菌的基因组上：将PBBR1-B质粒电转进入假单胞菌的感受态细胞；电转复苏后，转入含有木糖的LB培养基培养，涂5-FOA筛选平板，得到基因组上的pyrF基因被Pmin::Cas9n-PxylA::λ-Red表达盒替换了的突变菌株；

(2)构建pUCP18-A质粒：以假单胞菌基因组DNA为模板，PCR扩增得到待敲除基因的上游同源臂、下游同源臂；将待敲除基因的上游同源臂、pyrF基因、下游同源臂、Ptrc启动子、编码“识别待敲除基因的gRNA”的DNA片段、Pvan启动子和编码gRNAp的DNA片段连接到pUCP18上，得到pUCP18-A质粒；

(3)将pUCP18-A质粒电转进入步骤(1)所得突变菌株的感受态细胞，复苏后转移至含有木糖的LB培养基中，诱导编辑；

(4)将编辑后菌液转接至含有香草酸的质粒消除培养基培养至稳定期，进行质粒消除；

(5)质粒消除后，菌液涂布在Ura-筛选平板上，挑选不亮的菌落，即获得待敲除基因被敲除了的菌株；

(6)消除pyrF标记：将pUCP18-B质粒转入感受态的待敲除基因被敲除了的菌株，pUCP18-B质粒包含待敲除基因的上、下游同源臂，同源臂中间不包含pyrF基因；在LB编辑培养基中培养后完成编辑；将菌液涂布5-FOA平板，筛选得到去掉了pyrF标记的菌株。

下面以精确敲除假单胞菌A514的clpV基因为例进行详细描述：

(1)将基因编辑的重要元件λ-Red和Cas9n元件整合到假单胞菌的基因组上(以减少编辑过程中多质粒的使用，实现这一目的的质粒为PBBR1-B)：将PBBR1-B质粒电转进入假单胞菌A514的感受态细胞；电转复苏后，转入含有木糖的LB培养基培养(18h)，涂5-FOA筛选平板，得到基因组上的pyrF基因被Pmin::Cas9n-PxylA::λ-Red表达盒替换了的突变菌株ATc9n。

(2)构建pUCP18-A质粒：以假单胞菌A514基因组DNA为模板，PCR扩增得到待敲除基因(clpV基因)的上游同源臂、下游同源臂；将待敲除基因的上游同源臂、pyrF基因、下游同源臂、Ptrc启动子、编码“识别clpV基因的gRNA”的DNA片段、Pvan启动子和编码gRNAp的DNA片段连接到pUCP18上，得到pUCP18-A质粒。

所述clpV基因的上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述clpV基因的下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

所述pyrF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

所述编码“识别clpV基因的gRNA”的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

所述Pvan启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

所述编码gRNAp的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

(3)将pUCP18-A质粒电转进入突变菌株ATc9n的感受态细胞，复苏后转移至含有木糖的LB培养基中，诱导编辑18h。

(4)在编辑18h后，将编辑后菌液转接至M9质粒消除培养基(含有香草酸)培养至稳定期，在此期间香草酸诱导Pvan启动子表达gRNAp，该gRNAp与Cas9n结合，靶向切割质粒本身的小回文序列，切断质粒，进行质粒消除；经过香草酸诱导24h后基本上能实现90％以上的质粒消除，而未经诱导的菌株只能实现30％的质粒消除。

(5)质粒消除后，菌液涂布在Ura-筛选平板上，挑选不亮的菌落，即获得clpV基因敲除菌株ATc9nΔclpV(pyrF)。

(6)消除pyrF标记(因为clpV基因敲除是通过pyrF突变子辅助筛选，在完成clpV基因敲除后，会留下pyrF标记，最后一步需要消除pyrF标记，便于连续编辑的进行)：将pUCP18-B质粒转入感受态菌株ATc9nΔclpV(pyrF)，pUCP18-B质粒包含clpV基因的上、下游同源臂，同源臂中间不包含pyrF基因；在LB编辑培养基中培养18h后完成编辑；将菌液涂布5-FOA平板，筛选得到去掉了pyrF标记的菌株。

所述质粒pUCP18-B是通过以下方法构建得到的：以假单胞菌A514基因组DNA为模板，PCR扩增得到clpV基因的上、下游同源臂；将clpV基因的上、下游同源臂、Ptrc启动子、编码“识别pyrF基因的gRNA”的DNA片段、Pvan启动子和编码gRNAp的DNA片段，连接到pBBR1上，得到pUCP18-B质粒。

本发明的适用于假单胞菌的基因组编辑系统，可以进行基因的编辑，包括插入、替换和删除，对不同基因进行编辑时，CRISPR/Cas9-pyrF编辑效率均能达到100％，且能够进行大片段(15kb)的插入，这一点对于改造较大基因簇有非常重要的意义。

本发明的适用于假单胞菌的基因组编辑系统，是在CRISPR-Cas9编辑系统的基础上进行的改造，将Cas9替换成Cas9n，引入λ-Red重组蛋白，并将Pmin::Cas9n-xylR-pxylA::λ-Red表达盒插入到假单胞菌的基因组上，提高基因编辑的稳定性，引入同源臂，同时利用pyrF正负筛选标记辅助筛选突变子，CRISPR/Cas9-pyrF技术和其它假单胞菌的基因编辑技术相比，具有编辑效率更高、稳定、能进行大片段插入、质粒消除迅速等优势。设计sgRNA时，参照文献中报道的细菌sgRNA设计原则进行20nt-spacer的选取，由于手工挑选较为繁琐费时，根据手工挑选原则自主开发了一个perl程序Cas9.pl，用于快速sgRNA设计，pyrF基因的sgRNA设计出来后，再利用CasOT工具进行脱靶率预测，保证筛选的20nt-spacer没有错配脱靶的可能性。经过筛选和脱靶预测后，选择5’-ttcgaagcccttgtcacaca-3’作为靶向pyrF基因的20nt-spacer序列，其它基因的靶向sgRNA设计也参照该流程进行。

本发明的适用于假单胞菌的基因组编辑系统，工作原理如下：

首先，将PBBR1-B质粒通过电转化导入假单胞菌A514的感受态细胞中，PBBR1-B质粒上的Cas9n表达产生只能单链切割的Cas9n蛋白(不容易引起致死)，在gRNA(由编码“识别pyrF基因的gRNA”的DNA片段表达得到)的引导下，Cas9n蛋白在假单胞菌A514细胞基因组的pyrF基因位点产生切割位点，并使其发生同源重组修复(引入pyrF基因的上下游同源臂，提高了同源重组效率，进而提高了基因编辑效率)，从而将基因组上的pyrF基因敲除，替换成Pmin::Cas9n-xylR-pxylA::λ-Red表达盒，得到突变菌株ATc9n。选择将Pmin::Cas9n-xylR-pxylA::λ-Red表达盒替换pyrF基因的原因是：pyrF基因编码乳清苷-5’-磷酸脱羧酶,能够催化5-氟乳清酸(5-FOA)形成有毒化合物，从而致死细胞；野生型假单胞菌A514菌株中含有pyrF基因，其能在Ura-筛选平板上生长，不能在5-FOA筛选平板上生长；敲除pyrF基因后，突变菌株能在5-FOA筛选平板上生长，而不能在Ura-筛选平板上生长，如图1所示。基于pyrF的这种特性，本发明选择pyrF基因作为第一个编辑的基因(后续在编辑的时候也选择pyrF作为敲除基因)，敲除pyrF基因后只需涂布5-FOA平板进行筛选，通过表型便能快速鉴定是否含有突变子，检测通量较大，即使较低的突变率也能被较好地检测出。

然后，在进行基因编辑时(以敲除假单胞菌A514基因组上的clpV基因为例，假单胞菌A514为商用菌株)，将pUCP18-A质粒通过电转化方法导入突变菌株ATc9n的感受态细胞中，添加木糖诱导λ-Red蛋白表达，pUCP18-A质粒包含clpV基因上下游同源臂，且clpV基因上下游同源臂之间为pyrF基因，在gRNA(clpV)(由编码“识别clpV基因的gRNA”的DNA片段转录得到)的引导下，突变体ATc9n表达的Cas9n蛋白在clpV基因上切割，并发生同源重组修复，从而将clpV基因敲除，替换成pyrF基因。

然后，由于pUCP18-A质粒能够转录诱导Pvan启动子(香草酸诱导型启动子)启动表达gRNAp、gfp(绿色荧光蛋白)，因此通过添加香草酸即可达到去除质粒的目的：香草酸诱导pvan启动子启动，表达gRNAp，该gRNAp与Cas9n蛋白结合，靶向质粒的小回文序列，切断质粒，进行质粒消除；质粒消除后，菌液涂布在Ura-筛选平板上，挑选不亮的菌落，即为质粒消除干净的clpV基因敲除菌株ATc9nΔclpV(pyrF)。

消除质粒后，pyrF基因还留在clpV基因位点，要对其进行去疤：将pUCP18-B质粒通过电转化导入感受态细胞中，gRNA(pyrF)能够引导突变体ATc9n产生的Cas9n在pyrF基因上切割，从而将pyrF基因敲除，达到去疤目的，最终实现无痕敲除clpV基因的目的。

本发明的适用于假单胞菌的基因组编辑系统，克服了Cas9蛋白在假单胞菌中引起的致死问题。针对CRISPR-Cas9系统引起的细菌致死现象，本发明通过以下方法进行减缓细菌致死：1、通过添加同源臂，进行同源重组；2、加入λ-Red重组蛋白增加重组修复的概率，减少致死并实现基因组编辑；3,使用Cas9n蛋白代替Cas9蛋白，使得基因组DNA产生单链缺口，避免细菌致死。利用这些策略对假单胞菌的pyrF基因进行编辑，并对每种方法的编辑效率进行检测，如表1所示。最终本发明的这种CRISPR/Cas9-pyrF系统的编辑效率能达到1/108。最后，通过优化xylR-pxylA 启动子调整λ-Red重组蛋白的表达量，使得CRISPR/Cas9-pyrF系统的编辑效率达到1/10。

表1是通过各种元件的组合来得到最佳的编辑整合，从而提高基因编辑效率。首先，引入同源臂和重组酶编辑效率均不高，用Cas9n替换Cas9，能达到缓解致死的作用但编辑效率仅为1/7259；引入λ-Red重组蛋白也能缓解Cas9的致死性，但编辑效率只有1/7730。其次，将上面这两种策略融合，编辑效率能达到1/108，通过优化λ-Red重组蛋白表达量，该技术编辑效率最终能达到1/10。

表1

本发明通过引入pyrF正反标记克服了编辑效率不一的问题，通过诱导重组酶(λ-Red)高表达提高重组效率克服了大片段插入受限的问题，通过CRISPR-Cas9系统实现了基因编辑和质粒消除在同一系统内完成，缩短了质粒消除周期，提高了消除效率。本发明所采用的各启动子，是通过实验筛选、验证，综合考量后选定的效果最佳的启动子。

本发明取得了以下有益效果：

第一，编辑效率理论可达100％。CRISPR/Cas9-pyrF利用pyrF正负筛选标记辅助筛选使得突变效率达到100％，比现有的原核生物基因编辑效率都要高：首先，用Cas9n替换Cas9，能达到缓解致死的作用；引入λ-Red重组蛋白也能缓解Cas9的致死性；其次，将这两种策略融合形成CR(CRISPR-Cas9n-λ-Red)，通过优化λ-Red重组蛋白表达量，CR技术编辑效率最终能达到1/10；最后，引入pyrF正负筛选标记辅助筛选突变子，建立CRISPR/Cas9-pyrF(CRISPR-Cas9n-λ-Red-pyrF)技术，编辑效率几乎达100％。CRISPR/Cas9-pyrF还克服了现有方法很难进行大片段插入的困难，可在ATc9n基因位点2040441～2041327插入15000bp的pPROBE-GT DNA序列(pPROBE-GT是可以购买的质粒)。

第二，用Cas9n替换Cas9减少了致死现象，降低了脱靶效应带来的影响。CRISPR-Cas9中存在的脱靶现象，一方面会降低编辑效率，另一方面也会产生非靶向切割。这种非靶向切割在真核细胞中会进行NHEJ修复导致非目标突变，而在有些细菌中，例如A514中则会导致细胞死亡，进而无法进行基因编辑过程。本研究对gRNA进行了精心挑选并经过CasOT软件预测脱靶，但实际应用中仍可能发生脱靶，这时候用Cas9n不会发生脱靶致死，比Cas9更加安全。

第三，将CRISPR/Cas9n表达簇整合到基因组中，不仅简化质粒构建流程，还避免质粒易丢失问题，保证基因组编辑过程中菌株的遗传稳定性。

第四，质粒快速可视化消除。通常的质粒消除方法，如无抗性消除，耗时耗力。本发明利用编辑时使用的Cas9n蛋白和诱导表达的gRNAp靶向质粒上设计好的一小段回文序列，将质粒快速切断，在24h内质粒消除率能达到90％以上。同时在质粒中加入GFP元件，质粒被消除后，只需挑选无荧光信号的单克隆，而不需要提质粒或者PCR验证，更加的方便快捷。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。

附图说明

图1：Cas9在假单胞菌A514中的致死性，其中，A:含有质粒pBgRNA(只含有gRNA(pyrF))的A514菌株；B:含有质粒pCas9的A514菌株(只含有cas9)；C:含有质粒pBgRNA和pCas9的A514菌株，箭头处为逃逸致死的单克隆。虽然同时表达gRNA(pyrF)和Cas9蛋白的A514菌株会致死，但这种致死性是不完全的，涂板时每个板子一般都能发现1～2颗的逃逸子(图中箭头所示)这可能是由于A514中存在其它保护机制使其逃避了Cas9的切割。实验结果表明：单独表达gRNA(pyrF)或者Cas9蛋白的菌株都不会致死，只有同时表达这两个元件会造成死亡。

图2：PCR检测ATc9n突变子，其中，泳道1-20为ATc9n突变子，泳道C为对照A514。

图3：PCR检测ATc9nΔclpV(pyrF)突变子。泳道1-8和9-16为ATc9nΔclpV(pyrF)突变子，泳道C为对照ATc9n。

图4：PCR检测ATc9nΔclpV突变子，其中，泳道1-4和5-8为ATc9nΔclpV突变子，泳道泳道C为对照ATc9nΔclpV(pyrF)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

本发明中所用的实验方法操作如下所述。

1.质粒DNA的提取

E.coil MachI和P.putida A514的质粒提取均采用碱裂解法，具体操作如下：

(1)取菌：挑取单克隆接入LB培养基，过夜培养获得新鲜菌液。将菌液分装在2mL的EP管中，12000rpm离心1min，弃上清，获得沉菌。

(2)将上述步骤中的2管沉菌重悬在250μL预冷的SI(使用前加入RNaseA)。

(3)加入250μL的SII(现配现用)，轻柔颠倒10次，室温静置4min。

(4)加入350μL的SIII，轻柔颠倒20次后置于冰上4min。

(5)12000rpm离心10min，收集上清于干净的1.5mLEP管，加入预冷的异丙醇270μL，放-20℃冰箱30min，沉淀核酸。

(6)将上一步溶液加入2mL吸附柱(6层DNA吸附柱购自国产众泰耗材)，12000rpm离心1min,弃流出液。

(7)吸附柱中加入700μL70％乙醇，12000rpm离心1min,弃流出液。

(8)重复步骤7一次。

(9)空转吸附柱，12000rpm离心2min,去除残留乙醇。

(10)将吸附柱收集管换成干净的1.5mL的EP管，吸附柱中心加100μL灭菌ddH2O，室温静置4min，12000rpm离心1min,收集提取的质粒DNA于EP管中。

(11)抽提的质粒DNA跑TAE胶检测提取效果；使用nanodrop(Pultton，美国)测定质粒浓度，A260/A280比值在1.8-2.0之间说明质量较好.

2.质粒载体的构建

本发明中构建的质粒均采取酶切连接法获得。包含插入片段的获得(例如通过PCR或者酶切质粒获得)；质粒backbone的获得(例如通过酶切空载体后获得)；T4DNALigase过夜连接；转化大肠杆菌MachI；转化子菌液PCR验证；转化子酶切验证；转化子测序验证。下面对载体构建中的常用关键操作进行详述。

DNA片段割胶回收：用于酶连的DNA片段，例如质粒酶切片段或者PCR片段，它们的胶回收用OMEGA的GelExtractionKit试剂盒完成(货号D2500)。

融胶：跑完回收胶，切割下含有目的条带的回收片段放入干净的2mLEP管中，加入Bindingbuffer没过胶块即可。放在55℃金属浴，融胶。

收集：将融好胶液加入的2mL的HibandDNAminicolumn，12000rpm离心1min,弃流出液。如果溶胶液体较多，可反复加入吸附柱，然后离心，弃流出液，直至所有DNA都富集在吸附柱上。

洗脱：将700μL SPWwashbuffer加入至HibandDNAminicolumn，12000rpm离心1min,弃流出液。重复该操作。空转HibandDNAminicolumn，12000rpm离心2min,去除残留SPWwashbuffer。

溶出和检测：丢弃3步骤使用的2mL收集管，换成干净的1.5mL的EP管，吸附柱中心加50μL灭菌ddH2O，室温静置4min，12000rpm离心1min,收集提取DNA片段于EP管中。抽提的回收的DNA片段跑胶检测大小和浓度。载体片段连接。回收好的的连接片段，16℃连接16h。

3.P.putida假单胞菌基因组DNA的提取

P.putida假单胞菌基因组的提取，使用Easy

BacteriaGenomclpVNAKit试剂盒(Transgene，北京)。

取菌：挑取单克隆，LB中过夜培养后，用干净的2mL的EP管取1mL菌液,12000rpm离心1min,弃上清，获得沉菌。

破碎：沉菌中加入100μLLB11和20μLProteinaseK，震荡至菌液彻底悬浮。金属浴55℃孵育15min,直至溶液清亮。加入20μLRNaseA混匀。加入400μLB11，涡旋30S。

吸附收集：上一步溶液加入2mL吸附柱，12000rpm离心1min,弃流出液。

洗脱：吸附柱中加入500μLCB11(使用前检测是否加无水乙醇)，12000rpm离心1min,弃流出液。吸附柱中加入500μLWB11(使用前检测是否加无水乙醇)，12000rpm离心1min,弃流出液。空转吸附柱，12000rpm离心2min,去除残留WB11。

溶出：将吸附柱收集管换成干净的1.5mLEP管，吸附柱中心加100μLEB，室温静置4min，12000rpm离心1min,溶出基因组DNA。

检测：抽提的基因组DNA跑胶检测提取效果。

4.大肠杆菌感受的制备及转化

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化使用CaCl2法化：制备感受态和转化过程涉及到的加样过程都在超净台进行。

种子液获得：挑取大肠杆菌MachI单克隆，接入液体LB，37℃，200rpm过夜培养,获得种子液。

扩培：将种子液1％接种至50mLLB液体培养基中。37℃，200rpm培养至值为0.35左右，约1.5h。

将培养好的菌在超净台中转移至50mL的无菌离心管中，5000rpm，4℃离心10min，弃上清。

将沉菌重新悬浮在20mL的预冷的化转buffer1溶液中，冰浴30min。然后，5000rpm，4℃离心10min，弃上清。

移除上清液，将细胞重新悬浮在3mL预冷的化转buffer2溶液中。分装细胞悬浮液，每100μL一管，放-80℃保存，可用6个月。感受态制备好后，就可以进行转化步骤。

进行转化前，取出1管感受态放在冰上融化3min，加入需要转化的质粒或者连接产物，质粒一般转200ng，连接产物一般转10μL连接体系，冰上涡旋，放置在冰上30min。

42℃金属浴中热击60s，热击后冰浴3min,然后加入900μLLB培养基。37℃，160rpm培养1h，进行复苏。○3复苏后，5000rpm，离心5min，弃上清，留100μLLB重悬，涂布合适抗性平板。

5.转化子的验证

挑菌：待连接的新质粒载体在抗性平板上长出，在超净台中挑选24个单克隆，分别接种至含有1mL液体抗性LB的EP管中，37℃，200rpm培养4h。

菌液PCR过程：选择合适的PCR引物，一般菌液PCR引物设计在插入片段上，产物长度在800-2000bp最为合适。菌液PCR需要设阴性对照，即以载体backbone为模板进行PCR。菌液PCR的阳对，即以插入片段为模板进行PCR。PCR使用全式金的2×Easy

PCRSuperMix(+dye)进行，PCR反应体系如表2.3所示。扩增反应条件为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s，55℃退火30s(实际退火温度根据设计引物Tm值来设置)，72℃延伸1min，变性退火延伸进行30个循环；72℃延伸10min，1个循环。

完成菌液PCR后点样跑胶检测，挑选能够PCR出条带的单克隆。接种至5mL的LB培养基中过夜培养。

提取转化子质粒，酶切验证，送测序。

6.假单胞菌感受态的制备及转化

种子液获得：挑取假单胞菌单克隆，接入液体LB、30℃、200rpm过夜培养,获得种子液。

扩培：将种子液2％接种至50mLLB液体培养基中。30℃，200rpm培养至OD600值为0.6左右，约2.5h。

将培养好的菌在超净台中转移至50mL的无菌离心管中，5000rpm，4离心10min，弃上清。

将沉菌重新悬浮在20mL的预冷的电转buffer溶液中，5000rpm，4℃离心10min，弃上清。重复3次上述操作。

移除上清液，将细胞重新悬浮在1mL预冷的电转buffer溶液中。分装细胞悬浮液，每100μL一管，放-80℃保存，可用5天，最好能现做现转。感受态制备好后，就可以进行转化步骤。

取1管感受态细胞放在冰上，加入需要转化的质粒，质粒一般转500ng，然后一起将添加了质粒的感受态细胞转移至预冷的电击杯。

电转仪电击：电击条件：2.5kv(12.5kv/cm)，25μF，200Ω(4.5ms)。

电击后，向电击杯中先加入2次500μL的LB培养基冲洗细胞至1.5mL的EP管中，30℃，160rpm复苏2h。

复苏后，5000rpm，离心5min，弃上清，留100μLLB重悬，涂布合适抗性平板。

7.假单胞菌基因组中插入Pmin::Cas9n-xylR-pxylA::λ-Red表达盒

编辑：假单胞菌划线5-FOA筛选平板，然后按照2.3.4章节中所述进行假单胞菌感受制备，转化质粒pBBR1-B，复苏2h后接入5mL液LB编辑培养基培养18h(不同基因培养时间会有细微差别，标准是摇到假单胞菌的稳定期)。

筛选突变子和菌落PCR验证：将100μLLB编辑培养基涂布于5-FOA筛选平板，待长出单克隆，挑选单克隆进行菌落PCR验证突变子。突变子菌落PCR的引物为Cas9-7：5’ggctacaaggaagtgaagaagg3’和pyrFseqR(pyrFdeleteR)：5’gaacgaaggcaagtcctacatc3’。突变子菌落PCR验证引物的设计，一般是一条在基因组上，一条在突变插入序列上。菌落PCR过程：在超净台中取干净灭菌1.5mLEP管(20个)，加入30μL含Ura的LB，挑选5-foa板子上的单克隆，溶于30μLLB中，取10μL放入8连排PCR管中煮菌(100℃煮10min，-20度放20min,100℃再煮5min)，把煮过的菌液当模板进行PCR。剩下的20μL菌液放4℃保存。

测序和保种：确定PCR出目标带的突变子送测序，同时将它剩下的20μL菌液,划线5-FOA筛选平板和Ura-筛选平板，能在5-FOA筛选平板生长而完全不能在Ura-筛选平板生长的突变子且测序比对无误，就是我们最终要的ATc9n突变子。

在菌株ATc9n基础上进行基因的编辑，以clpV基因为例子(其他基因的敲除与此方法相似)，操作流程如下：

编辑：制备ATc9n的感受态，制备感受态的时候，用液体LB添加Ura进行摇菌。感受态转化质粒pUCP18-A，复苏2h后接入液体5mLLB编辑培养基培养18h(不同基因培养时间会有差别，标准是摇到稳定期)。

质粒消除和筛选突变子：将100μL编辑后菌液接种到5mLM9质粒消除培养基中，培养至稳定期，稀释10000倍，涂布Ura-筛选平板，待长出单克隆，挑选不发荧光单克隆进行菌落PCR验证突变子。

测序和保种：确定PCR出目标带的突变子送测序，同时将菌落PCR剩下的20μL菌液,划线5-FOA筛选平板和Ura-筛选平板，不能在5-FOA筛选平板生长而能在Ura-筛选平板生长，且PCR条带测序比对正确，就是我们要的ATc9nΔclpV(pyrF)菌株。

pyrF筛选标记的去除：

编辑：制备ATc9nΔclpV(pyrF)感受态，转化pUCP18-B，复苏2h后接入液体5mLLB编辑培养基培养至稳定期。

质粒消除和筛选突变子：将100μL编辑菌液涂布5-FOA筛选平板，待长出单克隆，挑选不发荧光单克隆进行菌落PCR验证突变子。

测序和保种：确定PCR出目标带的突变子送测序，同时将菌落PCR剩下的20μL菌液,划线5-FOA筛选平板和Ura-筛选平板，能在5-FOA筛选平板生长而不能在Ura-筛选平板生长，且PCR条带测序比对正确，就是我们要的ATc9nΔclpV菌株。

本发明中所用到的部分质粒如表2所示。

表2使用到的部分质粒

实验1构建PBBR1-B质粒

步骤如下：

(1)构建Pmin::Cas9n-xylR-pxylA::λ-Red表达盒：

将Pmin启动子与Cas9n连接(通过重叠延伸PCR技术，overlapPCR)，得到Pmin::Cas9n；

将xylR-pxylA启动子与λ-Red连接，得到xylR-pxylA::λ-Red；

将Pmin::Cas9n与xylR-pxylA::λ-Red连接，得到Pmin::Cas9n-xylR-pxylA::λ-Red表达盒。

所述Cas9n蛋白是Cas9蛋白的突变体，其突变位点为：D10A，即第10位的天冬氨酸突变为丙氨酸；所述Cas9n蛋白的编码基因是对来自S.pyogenesSF370的Cas9序列进行了密码子优化(根据假单胞菌的密码子偏好性进行优化)后得到的，优化算法的过程在jcat网站进行，http://www.jcat.de/；CAI-Value由优化前的0.109提高到优化后的0.992(其中CAI-Value越接近1说明优化效果越好)。

(2)构建PBBR1-B质粒：以假单胞菌A514基因组DNA为模板，PCR扩增得到pyrF基因的上游同源臂、下游同源臂；将pyrF基因的上游同源臂、下游同源臂、Pmin::Cas9n-xylR-pxylA::λ-Red表达盒、Ptrc启动子和编码“识别pyrF基因的gRNA”的DNA片段连接到pBBR1质粒上，得到PBBR1-B质粒。

所述Ptrc启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述编码“识别pyrF基因的gRNA”的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；该gRNA所靶向PyrF基因的20nt-spacer序列为：5’-ttcgaagcccttgtcacaca-3’(如SEQ IDNO.3所示)。

所述pyrF基因的上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述pyrF基因的下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

所述xylR—pxylA启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

所述λ-Red重组酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

所述Pmin启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

所述Cas9n蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

实验2精确敲除假单胞菌A514的clpV基因

步骤如下：

(1)将基因编辑的重要元件λ-Red和Cas9n元件整合到假单胞菌的基因组上：将PBBR1-B质粒电转进入假单胞菌A514的感受态细胞；电转复苏后，转入含有木糖的LB培养基培养(18h)，涂5-FOA筛选平板，得到基因组上的pyrF基因被Pmin::Cas9n-PxylA::λ-Red表达盒替换了的突变菌株ATc9n。

本实验中，挑取20个单克隆和1个未编辑的假单胞菌A514(作为对照)，用引物Cas9-7：5’-ggctacaaggaagtgaagaagg-3’和pyrFseqR：5’-gaacgaaggcaagtcctacatc-3’进行菌落PCR，结果如图2所示，显示20个单克隆均编辑成功，挑选1号PCR产物送测序验证后显示正确；最终得到基因组上的pyrF基因被Pmin::Cas9n-PxylA::λ-Red表达盒替换了的突变菌株ATc9n。

(2)构建pUCP18-A质粒：以假单胞菌A514基因组DNA为模板，PCR扩增得到待敲除基因(clpV基因)的上游同源臂、下游同源臂；将待敲除基因的上游同源臂、pyrF基因、下游同源臂、Ptrc启动子、编码“识别clpV基因的gRNA”的DNA片段、Pvan启动子和编码gRNAp的DNA片段连接到pUCP18上，得到pUCP18-A质粒。

所述clpV基因的上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述clpV基因的下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

所述pyrF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

所述编码“识别clpV基因的gRNA”的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

所述Pvan启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

所述编码gRNAp的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

(3)将pUCP18-A质粒电转进入突变菌株ATc9n的感受态细胞，复苏后转移至含有木糖的LB培养基中，诱导编辑18h。

(4)在编辑18h后，将编辑后菌液转接至M9质粒消除培养基(含有香草酸)培养至稳定期，在此期间香草酸诱导Pvan启动子表达gRNAp，该gRNAp与Cas9n结合，靶向切割质粒本身的小回文序列，切断质粒，进行质粒消除；经过香草酸诱导24h后基本上能实现90％以上的质粒消除，而未经诱导的菌株只能实现30％的质粒消除。

(5)质粒消除后，菌液涂布在Ura-筛选平板上，挑选不亮的菌落，即获得clpV基因敲除菌株ATc9nΔclpV(pyrF)。

本实验中，挑选16个单克隆和1个未编辑的ATc9n(作为PCR的阴性对照)，用引物0133clpV-F(genomePCR)：5’-TAGTGTTCGCCGTCTTCACT-3’和pyrF-R：5’-agcctcaggagcaagtattgc-3’进行菌落PCR验证，结果如图3所示，条带全部正确，挑选1号突变子测序验证，序列正确，获得clpV基因敲除菌株ATc9nΔclpV(pyrF)。

(6)消除pyrF标记(因为clpV基因敲除是通过pyrF突变子辅助筛选，在完成clpV基因敲除后，会留下pyrF标记，最后一步需要消除pyrF标记，便于连续编辑的进行)：将pUCP18-B质粒转入感受态菌株ATc9nΔclpV(pyrF)，pUCP18-B质粒包含clpV基因的上、下游同源臂，同源臂中间不包含pyrF基因；在LB编辑培养基中培养18h后完成编辑；将菌液涂布5-FOA平板，筛选得到去掉了pyrF标记的菌株。

本实验中，2块板子共挑选8个单克隆，以Tc9nΔclpV(pyrF)做对照，用引物0133clpV-F：5’-TAGTGTTCGCCG TCTTCACT-3’和0133clpV-R(genomePCR)：5’-CGTGTCGATCAACAGTTTTACC-3’进行PCR验证。PCR结果显示(如图4所示)这8个单克隆都去掉了pyrF标记，而对照ATc9nΔclpV(pyrF)含有pyrF标记。

所述质粒pUCP18-B是通过以下方法构建得到的：以假单胞菌A514基因组DNA为模板，PCR扩增得到clpV基因的上、下游同源臂；将clpV基因的上、下游同源臂、Ptrc启动子、编码“识别pyrF基因的gRNA”的DNA片段、Pvan启动子和编码gRNAp的DNA片段，连接到pBBR1上，得到pUCP18-B质粒。

本发明还对假单胞菌A514的其它基因进行了敲除实验，同时对假单胞菌KT2440也进行了基因编辑，部分结果如表3所示。结果表明，该编辑系统利用pyrF正负筛选标记辅助筛选使得突变效率达到100％，比现有的假单胞菌基因编辑效率都要高；还克服了现有方法很难进行大片段插入的困难，能够插入15kb的大片段，用Cas9n替换Cas9减少了致死现象，降低了脱靶效应带来的影响质粒快速可视化消除。通常的质粒消除方法，如无抗性消除，耗时耗力。这里利用编辑时使用的Cas9n蛋白和诱导表达的gRNAp靶向质粒上设计好的一小段回文序列，将质粒快速切断，在24h内质粒消除率能达到90％以上。同时在质粒中加入GFP元件，质粒被消除后，只需挑选无荧光信号的单克隆，而不需要提质粒或者PCR验证，更加的方便快捷，本发明的适用于假单胞菌的基因组编辑系统，非常适合于假单胞菌，编辑效率高且可进行连续编辑。

表3

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 申请人名称

<120> 适用于假单胞菌的基因组编辑系统及其构建方法与应用

<141> 2022-01-04

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg 30

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ttcgaagccc ttgtcacaca 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ttcgaagccc ttgtcacaca 20

<210> 4

<211> 966

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

aatcctacat tccgccggta ggcattggtg aagtgatgcg ggcgctgggc gtaggcaagg 60

tgattgcttc aaaccatccg aacttttcag tcggcgacta tgtgaatggc gcgctgggcg 120

tacaggatta tttcctgggc gagccacggg gtttctataa ggtcgacccg acactcgccc 180

ctctgccccg ctacctgtca gccctcggca tgaccggcat gaccgcctac ttcgccctgc 240

tcgataccgg tgcccccaag gctggcgaaa cggtggtgat ttccggcgcc gccggtgcgg 300

tcggcagcat tgccgggcaa attgccaaga tcaaaggctg tcgcgtggtg ggcatcgccg 360

gtggcgccga caagtgcaag ttcctggtgg atgaactggg cttcgacgcc gccatcgact 420

acaaaaacga agatgtgcct gccgccctca agcgcgaatg ccccaaaggc gtggacgtgt 480

atttcgataa cgtcggcggc gacattctcg acgccgtgct cagccgcctg gcattgaagg 540

cgcgggtggt gatctgcggt gcgatcagcc agtacaacaa taaagaagcc gtgaaaggcc 600

cggccaacta tttgtcattg ctggttaatc gcgcgcgcat ggaaggcttt gtggtgatgg 660

accatacggc gaactttgct gcggccgggc aggaaatggc cggttggatg gcgcagggca 720

agctcaagag caaggaagat attgtcgagg ggctggaaac gttcccggag acgttgatga 780

agctgttcaa cggcgagaac tttgggaagc tggtgttgaa ggtcagctga cagaccccgg 840

aaccgggtct gggcaaggtc gatgcgcacg ctggcttgcc agcaatagca tcaactcaat 900

agcactgtag gaccgagctg cctgcatcgc aggcaagccc ggcgcccaca gttgaccgca 960

aaccgg 966

<210> 5

<211> 1000

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

gcaaaaaggc gcggtgatcg ccgaagacaa gcgctggaat acccgcgcgc tgatcgtcga 60

cgacgatgtt ccgattcgtg agctgctgat cgattacctg gcgcgcttca atattttcgc 120

cgtcggcgtg accgacggtg ccgccatgcg cctggccctg caagccgaaa cctttgatgt 180

ggtggtgctc gacctgatgc tgccgggtga agacggcctg tcgctgtgcc gctggttgcg 240

cactgaatcg gacatcccga tcctgatgct caccgcccgt tgtgagccca ccgaccgcat 300

tatcggcctg gaactgggcg ccgatgacta catgtccaaa ccgttcgaac cccgtgaact 360

ggtagcacgc atccagacca tcctgcgccg agtacgcgat gaccgcaccg agcagcgcgc 420

caacatccgc ttcgacaact ggcgcctgaa tagcgtattg cgccaactgg tggccgacga 480

cgggttggtc gtgccactgt ccaacgccga gtttcgtctg ttgtgggtgt ttatcgagcg 540

cccacgtcgc gtgctgagcc gcgaacaatt gctggacgct gcccgggggc gctccattga 600

agcgtttgac cgcagcatcg acttgctggt ctcgcgcctg cgccaaaagc tgggggatga 660

ccccaaagct ccgcaattga tcaagaccgt gcgtggcgaa ggctacctgt tcgacgcccg 720

agacatcggc taatgcgcgc caccttcaat acgctgttcg gaaggctgtt cggtgtattg 780

ctggtggcca ttgtgctggc ccatgtgctg gcattctttt ggtttcacca ctacggcccg 840

ccaccgccac cgcctcagga aaccttcgtc gaacagccgg acggcacgat gaaacccctg 900

caccggcatc gtcgcccctg gtttggtggc ccggtggtgc cgctgacgtt ccagtttatc 960

tcgctgatca tcgccgcctg gtacggtgcc aaactgttga 1000

<210> 6

<211> 1182

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

ctacggtgta attgcgccat gctggtactc acgcggcgta cagccaaact cccgccgaaa 60

cacggtgtgc aggtactgcg ccgatttaaa gccacaccgt gtcgccacct cggcaatcgc 120

cagggtctga ttttccaggc ccttggcggc ggccgcgagt ttgaagcgca ggatctcatc 180

gtgcacgctg cagccacgcg ccttgcgaaa gtgtgattcg agggaggagc gcgacacacc 240

gacataggcc gccacctggg cggtcttgat gccctggcag gcgtattggc ggatgaacaa 300

cagcgcctgc atcacgtacg ggttgcccaa cggttgatgc aagctggacg cctgcacatt 360

gatcgcatcc ggtggcacca gaatctgcgt gcccgcgcag ggtttgccgt gcagcatctg 420

gtgcagcagc gcggccgcag tgcggcccat ggtctcggtg ccctggatga ctgagctcaa 480

cggcacccgc gtcagcgtgc gggtcagcgg gtcattgtcg atgccaatca acgccacttg 540

ttccggcacc gcgatgccgg cggtgaggca ggcttgcagc agttgccgcg cacgggcgtc 600

ggtgacggcg atgatgccga tgggcttggg caaactgtgc agccaggcaa tctgttgctc 660

cacggcgctg tcccacaacg gcgcgctggt gcccaggccg cgatagacct cgacgtgcag 720

gccatcacgt tgcaacaagc tgcggaaggc attctcgcgt tcctgggccc agcgattggc 780

ctgggcttgc ggcaggctga agcaggcgaa gcggctcaag ccggcctcga tcaaatgctc 840

gtacgccatc cgcatcaacg catggttgtc agtggcgaca tagggaatgc ccgtggggta 900

agcgcgcgca tcctgatagg agccgcccac ggccaccacg gggagcttga tgtcggccag 960

cgcctcgccg atcagcgggt cgtcgaagtc ggcaatgatg ccgtcgccct gccagcgttc 1020

gatgcctttg aggcgacaca aaaagtcctc ctccaggaac agatcccacg atacgcgcgt 1080

gctgctcagg taattaccga tgccggtaat gatgccgcgg tcgtaaatct tgctgccatt 1140

gaacagcagg gcaatgcggt gaacaggcgg aagggttttc at 1182

<210> 7

<211> 1208

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

atggatatta atactgaaac tgagatcaag caaaagcatt cactaacccc ctttcctgtt 60

ttcctaatca gcccggcatt tcgcgggcga tattttcaca gctatttcag gagttcagcc 120

atgaacgctt attacattca ggatcgtctt gaggctcaga gctgggcgcg tcactaccag 180

cagctcgccc gtgaagagaa agaggcagaa ctggcagacg acatggaaaa aggcctgccc 240

cagcacctgt ttgaatcgct atgcatcgat catttgcaac gccacggggc cagcaaaaaa 300

tccattaccc gtgcgtttga tgacgatgtt gagtttcagg agcgcatggc agaacacatc 360

cggtacatgg ttgaaaccat tgctcaccac caggttgata ttgattcaga ggtataaaac 420

gaatgagtac tgcactcgca acgctggctg ggaagctggc tgaacgtgtc ggcatggatt 480

ctgtcgaccc acaggaactg atcaccactc ttcgccagac ggcatttaaa ggtgatgcca 540

gcgatgcgca gttcatcgca ttactgatcg ttgccaacca gtacggcctt aatccgtgga 600

cgaaagaaat ttacgccttt cctgataagc agaatggcat cgttccggtg gtgggcgttg 660

atggctggtc ccgcatcatc aatgaaaacc agcagtttga tggcatggac tttgagcagg 720

acaatgaatc ctgtacatgc cggatttacc gcaaggaccg taatcatccg atctgcgtta 780

ccgaatggat ggatgaatgc cgccgcgaac cattcaaaac tcgcgaaggc agagaaatca 840

cggggccgtg gcagtcgcat cccaaacgga tgttacgtca taaagccatg attcagtgtg 900

cccgtctggc cttcggattt gctggtatct atgacaagga tgaagccgag cgcattgtcg 960

aaaatactgc atacactgca gaacgtcagc cggaacgcga catcactccg gttaacgatg 1020

aaaccatgca ggagattaac actctgctga tcgccctgga taaaacatgg gatgacgact 1080

tattgccgct ctgttcccag atatttcgcc gcgacattcg tgcatcgtca gaactgacac 1140

aggccgaagc agtaaaagct cttggattcc tgaaacagaa agccgcagag cagaaggtgg 1200

cagcatga 1208

<210> 8

<211> 69

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

attgaaatag ctgagacaca agcgtaaaat gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca 60

cactaggag 69

<210> 9

<211> 4104

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

atggacaaga agtactcgat cggcctggcc atcggcacca actcggtggg ctgggccgtg 60

atcaccgacg aatacaaggt gccgtcgaag aagttcaagg tgctgggcaa caccgaccgc 120

cactcgatca agaagaacct gatcggcgcc ctgctgttcg actcgggcga aaccgccgaa 180

gccacccgcc tgaagcgcac cgcccgccgc cgctacaccc gccgcaagaa ccgcatctgc 240

tacctgcagg aaatcttctc gaacgaaatg gccaaggtgg acgactcgtt cttccaccgc 300

ctggaagaat cgttcctggt ggaagaagac aagaagcacg aacgccaccc gatcttcggc 360

aacatcgtgg acgaagtggc ctaccacgaa aagtacccga ccatctacca cctgcgcaag 420

aagctggtgg actcgaccga caaggccgac ctgcgcctga tctacctggc cctggcccac 480

atgatcaagt tccgcggcca cttcctgatc gaaggcgacc tgaacccgga caactcggac 540

gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga agaaaacccg 600

atcaacgcct cgggcgtgga cgccaaggcc atcctgtcgg cccgcctgtc gaagtcgcgc 660

cgcctggaaa acctgatcgc ccagctgccg ggcgaaaaga agaacggcct gttcggcaac 720

ctgatcgccc tgtcgctggg cctgaccccg aacttcaagt cgaacttcga cctggccgaa 780

gacgccaagc tgcagctgtc gaaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc 840

cagatcggcg accagtacgc cgacctgttc ctggccgcca agaacctgtc ggacgccatc 900

ctgctgtcgg acatcctgcg cgtgaacacc gaaatcacca aggccccgct gtcggcctcg 960

atgatcaagc gctacgacga acaccaccag gacctgaccc tgctgaaggc cctggtgcgc 1020

cagcagctgc cggaaaagta caaggaaatc ttcttcgacc agtcgaagaa cggctacgcc 1080

ggctacatcg acggcggcgc ctcgcaggaa gaattttaca agttcatcaa gccgatcctg 1140

gaaaagatgg acggcaccga agaactgctg gtgaagctga accgcgaaga cctgctgcgc 1200

aagcagcgca ccttcgacaa cggctcgatc ccgcaccaga tccacctggg cgaactgcac 1260

gccatcctgc gccgccagga agacttctac ccgttcctga aggacaaccg cgaaaagatc 1320

gaaaagatcc tgaccttccg catcccgtac tacgtgggcc cgctggcccg cggcaactcg 1380

cgcttcgcct ggatgacccg caagtcggaa gaaaccatca ccccgtggaa cttcgaagaa 1440

gtggtggaca agggcgcctc ggcccagtcg ttcatcgaac gcatgaccaa cttcgacaag 1500

aacctgccga acgaaaaggt gctgccgaag cactcgctgc tgtacgaata cttcaccgtg 1560

tacaacgaac tgaccaaggt gaagtacgtg accgaaggca tgcgcaagcc ggccttcctg 1620

tcgggcgaac agaagaaggc catcgtggac ctgctgttca agaccaaccg caaggtgacc 1680

gtgaagcagc tgaaggaaga ctacttcaag aagatcgaat gcttcgactc ggtggaaatc 1740

tcgggcgtgg aagaccgctt caacgcctcg ctgggcacct accacgacct gctgaagatc 1800

atcaaggaca aggacttcct ggacaacgaa gaaaacgaag acatcctgga agacatcgtg 1860

ctgaccctga ccctgttcga agaccgcgaa atgatcgaag aacgcctgaa gacctacgcc 1920

cacctgttcg acgacaaggt gatgaagcag ctgaagcgcc gccgctacac cggctggggc 1980

cgcctgtcgc gcaagctgat caacggcatc cgcgacaagc agtcgggcaa gaccatcctg 2040

gacttcctga agtcggacgg cttcgccaac cgcaacttca tgcagctgat ccacgacgac 2100

tcgctgacct tcaaggaaga catccagaag gcccaggtgt cgggccaggg cgactcgctg 2160

cacgaacaca tcgccaacct ggccggctcg ccggccatca agaagggcat cctgcagacc 2220

gtgaaggtgg tggacgaact ggtgaaggtg atgggccgcc acaagccgga aaacatcgtg 2280

atcgaaatgg cccgcgaaaa ccagaccacc cagaagggcc agaagaactc gcgcgaacgc 2340

atgaagcgca tcgaagaagg catcaaggaa ctgggctcgc agatcctgaa ggaacacccg 2400

gtggaaaaca cccagctgca gaacgaaaag ctgtacctgt actacctgca gaacggccgc 2460

gacatgtacg tggaccagga actggacatc aaccgcctgt cggactacga cgtggaccac 2520

atcgtgccgc agtcgttcct gaaggacgac tcgatcgaca acaaggtgct gacccgctcg 2580

gacaagaacc gcggcaagtc ggacaacgtg ccgtcggaag aagtggtgaa gaagatgaag 2640

aactactggc gccagctgct gaacgccaag ctgatcaccc agcgcaagtt cgacaacctg 2700

accaaggccg aacgcggcgg cctgtcggaa ctggacaagg ccggcttcat caagcgccag 2760

ctggtggaaa cccgccagat caccaagcac gtggcccaga tcctggactc gcgcatgaac 2820

accaagtacg acgaaaacga caagctgatc cgcgaagtga aggtgatcac cctgaagtcg 2880

aagctggtgt cggacttccg caaggacttc cagttctaca aggtgcgcga aatcaacaac 2940

taccaccacg cccacgacgc ctacctgaac gccgtggtgg gcaccgccct gatcaagaag 3000

tacccgaagc tggaatcgga atttgtgtac ggcgactaca aggtgtacga cgtgcgcaag 3060

atgatcgcca agtcggaaca ggaaatcggc aaggccaccg ccaagtactt cttctactcg 3120

aacatcatga acttcttcaa gaccgaaatc accctggcca acggcgaaat ccgcaagcgc 3180

ccgctgatcg aaaccaacgg cgaaaccggc gaaatcgtgt gggacaaggg ccgcgacttc 3240

gccaccgtgc gcaaggtgct gtcgatgccg caggtgaaca tcgtgaagaa gaccgaagtg 3300

cagaccggcg gcttctcgaa ggaatcgatc ctgccgaagc gcaactcgga caagctgatc 3360

gcccgcaaga aggactggga cccgaagaag tacggcggct tcgactcgcc gaccgtggcc 3420

tactcggtgc tggtggtggc caaggtggaa aagggcaagt cgaagaagct gaagtcggtg 3480

aaggaactgc tgggcatcac catcatggaa cgctcgtcgt tcgaaaagaa cccgatcgac 3540

ttcctggaag ccaagggcta caaggaagtg aagaaggacc tgatcatcaa gctgccgaag 3600

tactcgctgt tcgaactgga aaacggccgc aagcgcatgc tggcctcggc cggcgaactg 3660

cagaagggca acgaactggc cctgccgtcg aagtacgtga acttcctgta cctggcctcg 3720

cactacgaaa agctgaaggg ctcgccggaa gacaacgaac agaagcagct gttcgtggaa 3780

cagcacaagc actacctgga cgaaatcatc gaacagatct cggaattttc gaagcgcgtg 3840

atcctggccg acgccaacct ggacaaggtg ctgtcggcct acaacaagca ccgcgacaag 3900

ccgatccgcg aacaggccga aaacatcatc cacctgttca ccctgaccaa cctgggcgcc 3960

ccggccgcct tcaagtactt cgacaccacc atcgaccgca agcgctacac ctcgaccaag 4020

gaagtgctgg acgccaccct gatccaccag tcgatcaccg gcctgtacga aacccgcatc 4080

gacctgtcgc agctgggcgg cgac 4104

<210> 10

<211> 681

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

agataccttc ctgttccatc aaccggctga cgaagtcgaa gctggtttcg cggtactgca 60

cgcagtattc ccactcgcgg tacgggcggc tcagggcgtc ttcgaagtcg gaaaagccca 120

ggtcgcgaaa cacctgcttg atgatctgcg ggatgctcag gttctggaaa atccgacagt 180

ccgaggtgcg gctcagcagc cagaaccatg ggcgcagcgt cacttggtaa ctggcgaact 240

ggccctggtc gatgttctgg ctgcaccgcg cgacgatgcc gtggaaatgc cgctcgccac 300

cgtccgccag ttgcacgctc acactcatcg gcttgcccag cagctggttg aggtcgatgt 360

tggcgtcgag cgaggtcagt tgcagctcat agttgaacaa gcggcccagc tcttcgccgc 420

cccccatttc attgagcaac agcacatccg cccccagggg gctggtgatc ttggccaggc 480

gtgaggcttg gttgaatagc atcggttaac ccgtaaatga cttaatagct gaagaaaccg 540

aattcaactg tgggaggggg cttgctcccg atagcagtgc gtcagttgat gcctgaggtg 600

actgattcac cgctatcggg gcaagccccc tcccgccgtt gtgatcgcat tccgtcaggt 660

caatcggcgt cgttgaagtc g 681

<210> 11

<211> 593

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

gccacgctgt tgagtttgcc gaacagtgcg gcgcgactga tttcacccat gctctggatt 60

ccttgaggtg ctggcgtgat cggcgtaatg ccgagccagg attaggtcgt tggcgtcgtg 120

cgcggggcag ccgagccatg tgttgaagcc caggcggaac tggccgttaa gctgcagctt 180

cgggacttca ggttgttgca aaaccaggtt caagtcccag tccaattcat ggcccaggta 240

ctcggccacc cacgccacca gctcgttgaa cggctggctg ccaggcagca tgcccatgta 300

gtcatccagc ttgagcgggc ccaggcggat gcgaaactta tgctggcggt cccacacgtg 360

gctgcccagg caaaagtcca cgcccagttg attggcgctg acgctgacgc ggctgcgctc 420

gggcagttcc agccactggc cgacgtattc ttcaatctca acgggcaagc cgaagtattc 480

gctgaggatc gccttcaaac cgtccgggta gcgggtctgt gccgacaagt ggccgctgta 540

atgcaacttc gccgtgtcgg gaatcagccc ctgattcagc aggctcggca tac 593

<210> 12

<211> 702

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

atgtccgcct gccagacgcc cctgatcgtc gccctggatt tccctacccg tgaggccgcc 60

ctgaagctgg ctgaccagct tgaccctgcg ctgtgccggg tgaaggttgg caaggagctg 120

ttcaccagca gcgcttcggg cattgtcgaa accctgtgtg acaagggctt cgaagtgttc 180

ctggacctca agttccacga cattcccaac accaccgcca tggcggtaaa ggctgccgcc 240

gagatgggcg tgtggatggt caacgtgcat tgctccgggg gcctgcgcat gatggcggcc 300

tgccgtgaag agctggccaa gcgcagcggc ccgcagccgt tgctgattgg cgtgaccgtg 360

ctgaccagca tggagcgtga agacctggcc ggcattggcc tggatgtcga cccccaagag 420

caagtgctgc gtttggcggc gctggcggaa aaagcgggta tggacggttt ggtgtgctcg 480

gcgctcgagg ccccggcact gaaggcggcg cacccctcgc tgcaattggt gaccccgggc 540

attcgcccgg cgggcagcgc gcaggatgac cagcgccgta tcctcacccc acgccaggca 600

ctggatgccg gttcggacta cctggtaatc ggccggccga tcagccaggc tgcagaccct 660

gcgcaagcgt tggcagcggt ggtggcggag atccgtgggt aa 702

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

gtctacggca gcctgatgtt 20

<210> 14

<211> 277

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

ccaccggcca ggccgcgcac tgcctgcggt gttcggccgg gaataaagcc tcgggggtgg 60

gtcgagcgtt cggcggcgcc tttattgagg actgctttcg cgttgaagtc ggtgatgatc 120

cgctactgaa cgcaatccca tgacggcctg acagccgacc cggaacccga ttgaaggcga 180

ctttatggat ccattaaacc cttttgcgtc cgataatcgc ccggaataac ccgattatcg 240

gcttgacagc cacctgactc tccaatttaa tggatcc 277

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

atttctctgg actgcgtggc catg 24

Claims (10)

1.一种适用于假单胞菌的基因组编辑系统，其特征在于：包括PBBR1-B质粒，PBBR1-B质粒是以PBBR1为载体构建的重组载体，其上包含有以下原件：Ptrc启动子、编码“识别pyrF基因的gRNA”的DNA片段，pyrF基因的上游同源臂、xylR—pxylA启动子、λ-Red重组酶的编码基因、Pmin启动子、Cas9n蛋白的编码基因、pyrF基因的下游同源臂。

2.根据权利要求1所述的适用于假单胞菌的基因组编辑系统，其特征在于：所述Ptrc启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述编码“识别pyrF基因的gRNA”的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述pyrF基因的上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述pyrF基因的下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述xylR—pxylA启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述λ-Red重组酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述Pmin启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

所述Cas9n蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

3.权利要求1或2所述的适用于假单胞菌的基因组编辑系统的构建方法，其特征在于：所述PBBR1-B质粒的构建方法，包括以下步骤：

(1)构建Pmin::Cas9n-xylR-pxylA::λ-Red表达盒：

将Pmin启动子与Cas9n连接，得到Pmin::Cas9n；

将xylR-pxylA启动子与λ-Red连接，得到xylR-pxylA::λ-Red；

将Pmin::Cas9n与xylR-pxylA::λ-Red连接，得到Pmin::Cas9n-xylR-pxylA::λ-Red表达盒；

(2)构建PBBR1-B质粒：以假单胞菌A514基因组DNA为模板，PCR扩增得到pyrF基因的上游同源臂、下游同源臂；将pyrF基因的上游同源臂、下游同源臂、Pmin::Cas9n-xylR-pxylA::λ-Red表达盒、Ptrc启动子和编码“识别pyrF基因的gRNA”的DNA片段连接到pBBR1质粒上，得到PBBR1-B质粒。

4.权利要求1或2所述的适用于假单胞菌的基因组编辑系统在假单胞菌的基因编辑中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述基因编辑选自基因敲除、基因插入和/或基因替换。

6.利用权利要求1或2所述的适用于假单胞菌的基因组编辑系统敲除假单胞菌的基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将λ-Red和Cas9n元件整合到假单胞菌的基因组上：将PBBR1-B质粒电转进入假单胞菌的感受态细胞；电转复苏后，转入含有木糖的LB培养基培养，涂5-FOA筛选平板，得到基因组上的pyrF基因被Pmin::Cas9n-PxylA::λ-Red表达盒替换了的突变菌株；

(2)构建pUCP18-A质粒：以假单胞菌基因组DNA为模板，PCR扩增得到待敲除基因的上游同源臂、下游同源臂；将待敲除基因的上游同源臂、pyrF基因、下游同源臂、Ptrc启动子、编码“识别待敲除基因的gRNA”的DNA片段、Pvan启动子和编码gRNAp的DNA片段连接到pUCP18上，得到pUCP18-A质粒；

(3)将pUCP18-A质粒电转进入步骤(1)所得突变菌株的感受态细胞，复苏后转移至含有木糖的LB培养基中，诱导编辑；

(4)将编辑后菌液转接至含有香草酸的质粒消除培养基培养至稳定期，进行质粒消除；

(5)质粒消除后，菌液涂布在Ura-筛选平板上，挑选不亮的菌落，即获得待敲除基因被敲除了的菌株；

(6)消除pyrF标记：将pUCP18-B质粒转入感受态的待敲除基因被敲除了的菌株，pUCP18-B质粒包含待敲除基因的上、下游同源臂，同源臂中间不包含pyrF基因；在LB编辑培养基中培养后完成编辑；将菌液涂布5-FOA平板，筛选得到去掉了pyrF标记的菌株。

7.根据权利要求6所述的敲除假单胞菌的基因的方法，其特征在于：所述pyrF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

所述Pvan启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

所述编码gRNAp的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

8.根据权利要求6所述的敲除假单胞菌的基因的方法，其特征在于：所述质粒pUCP18-B是通过以下方法构建得到的：以假单胞菌基因组DNA为模板，PCR扩增得到待敲除基因的上、下游同源臂；将待敲除基因的上、下游同源臂、Ptrc启动子、编码“识别pyrF基因的gRNA”的DNA片段、Pvan启动子和编码gRNAp的DNA片段，连接到pBBR1上，得到pUCP18-B质粒。

9.根据权利要求6所述的敲除假单胞菌的基因的方法，其特征在于：所述待敲除基因为假单胞菌A514的clpV基因。

10.根据权利要求9所述的敲除假单胞菌的基因的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)将λ-Red和Cas9n元件整合到假单胞菌的基因组上：将PBBR1-B质粒电转进入假单胞菌A514的感受态细胞；电转复苏后，转入含有木糖的LB培养基培养18h，涂5-FOA筛选平板，得到基因组上的pyrF基因被Pmin::Cas9n-PxylA::λ-Red表达盒替换了的突变菌株ATc9n；

(2)构建pUCP18-A质粒：以假单胞菌A514基因组DNA为模板，PCR扩增得到clpV基因的上游同源臂、下游同源臂；将待敲除基因的上游同源臂、pyrF基因、下游同源臂、Ptrc启动子、编码“识别clpV基因的gRNA”的DNA片段、Pvan启动子和编码gRNAp的DNA片段连接到pUCP18上，得到pUCP18-A质粒；

所述clpV基因的上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述clpV基因的下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

所述编码“识别clpV基因的gRNA”的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

(3)将pUCP18-A质粒电转进入突变菌株ATc9n的感受态细胞，复苏后转移至含有木糖的LB培养基中，诱导编辑18h；

(4)在编辑18h后，将编辑后菌液转接至M9质粒消除培养基培养至稳定期，进行质粒消除；

(5)质粒消除后，菌液涂布在Ura-筛选平板上，挑选不亮的菌落，即获得clpV基因敲除菌株ATc9nΔclpV(pyrF)；

(6)消除pyrF标记：将pUCP18-B质粒转入感受态菌株ATc9nΔclpV(pyrF)，pUCP18-B质粒包含clpV基因的上、下游同源臂，同源臂中间不包含pyrF基因；在LB编辑培养基中培养18h后完成编辑；将菌液涂布5-FOA平板，筛选得到去掉了pyrF标记的菌株；

所述质粒pUCP18-B是通过以下方法构建得到的：以恶臭假单胞菌A514基因组DNA为模板，PCR扩增得到clpV基因的上、下游同源臂；将clpV基因的上、下游同源臂、Ptrc启动子、编码“识别pyrF基因的gRNA”的DNA片段、Pvan启动子和编码gRNAp的DNA片段，连接到pBBR1上，得到pUCP18-B质粒。

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