CN115747243A

CN115747243A - 植物病原细菌基因组编辑工具的开发及应用

Info

Publication number: CN115747243A
Application number: CN202210927081.4A
Authority: CN
Inventors: 周焕斌; 严芳; 王敬文; 张素杰
Original assignee: Institute of Plant Protection of CAAS
Current assignee: Institute of Plant Protection of CAAS
Priority date: 2022-08-03
Filing date: 2022-08-03
Publication date: 2023-03-07

Abstract

本发明公开了一种植物病原细菌基因组编辑工具的开发及应用。本发明提供了DNA分子Ⅰ，其中具有元件甲、元件乙和元件丙；元件甲为用于表达ligD基因和Ku基因的表达盒；元件乙为用于表达Cas12a基因的表达盒；所述元件丙中具有插入位点以及用于编码crRNA骨架的DNA区段；所述插入位点供用于编码crRNA的特异结合区的DNA区段插入；crRNA的特异结合区特异性结合靶标序列。本发明通过将ligD/Ku蛋白与CRISPR/FnCas12a系统融合构建一套适用于植物病原细菌的基因组编辑工具，该方法为植物病原细菌的遗传学分析工具箱增添新的利器，对研究寄主植物和病原菌的分子互作机理研究具有重大价值。

Description

植物病原细菌基因组编辑工具的开发及应用

技术领域

本发明属于基因编辑领域，涉及一种植物病原细菌基因组编辑工具的开发及应用。

背景技术

细菌中最常用的功能基因组学方法是转座子测序(Tn-Seq)。转座子是一段特殊的DNA序列，通过转座酶催化将其插入到目标菌株的基因组DNA上，应用广泛的有Tn3、Tn5、Tn10、Tn7、Mariner类转座子等，主要应用于芽孢杆菌、假单胞菌、黄单胞菌、劳尔氏菌等细菌中。一般而言，转座子插入含有筛选标记，并且因为携带有转座子片段容易对插入位点进行鉴定。但是，转座子的插入是随机的，可能是单拷贝插入，也可能是多拷贝插入，这就导致在相同的遗传背景下，表型的改变不能确定是由基因插入突变引起的。对于基因家族的基因，由于基因功能的冗余性，单个基因的敲除并不一定就能知悉该基因的功能。对某些必需基因，敲除失活会造成细胞致死，也不能利用该技术研究其基因功能。

基于CRISPR技术的基因组编辑技术的出现改变了生命科学研究的发展速度。CRISPR/Cas技术利用人工核酸酶在生物基因组靶位点处进行切割，产生DNA双链断裂(Double strand break，DSB)，由此激活细胞的非同源末端连接(non-homologous endjoining，NHEJ)修复和同源重组修复(homology-directed repair，HDR)机制而达到目的。CRISPR/Cas系统由于具有效率高、操作简单、成本低等优点，已成功应用于拟南芥、水稻、小麦、玉米等植物中，特别是用于主要农作物的抗病基因功能研究和重要农艺性状遗传改良。尽管如此，CRISPR/Cas系统在微生物中的应用仍然比较局限，特别是病原细菌中。因此开发高效的开发一套适用于植物病原细菌的基因组编辑工具具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物病原细菌基因组编辑工具的开发及应用。

本发明提供了一种DNA分子，命名为DNA分子Ⅰ，其中具有元件甲、元件乙和元件丙；

所述元件甲为用于表达ligD基因和Ku基因的表达盒；

所述元件乙为用于表达Cas12a基因的表达盒；

所述元件丙中具有插入位点以及用于编码crRNA骨架的DNA区段；所述插入位点供用于编码crRNA的特异结合区的DNA区段插入；

crRNA的特异结合区特异性结合靶标序列；

用于编码crRNA的特异结合区的DNA区段插入所述元件丙中的所述插入位点后，与编码crRNA骨架的DNA区段连接，从而表达靶向所述靶标序列的全长crRNA。

ligD基因表达ligD蛋白。

ligD蛋白为NHEJ途径的ligD蛋白。

具体的，所述ligD蛋白如序列表的序列11所示。

具体的，所述ligD基因具体如序列表的序列2中第6133-8412位核苷酸所示(编码链)。

Ku基因表达Ku蛋白。

Ku蛋白为NHEJ途径的Ku蛋白。

Ku蛋白具体为mKu蛋白。

具体的，所述Ku蛋白如序列表的序列12所示。

具体的，所述Ku基因具体如序列表的序列2中第8441-9262位核苷酸所示(编码链)。

具体的，所述元件甲中的启动子为J23119启动子。

具体的，J23119启动子如序列表的序列2中第6072-6106位核苷酸所示(编码链)。

具体的，所述元件甲中的终止子如序列表的序列2中第9263-9300位核苷酸所示(编码链)。

所述元件甲中，ligD基因位于Ku基因的上游。

所述元件甲中，ligD基因上游具有RBS。

具体的，所述RBS如序列表的序列2中第6107-6132位核苷酸所示。

所述元件甲中，Ku基因上游具有RBS。

具体的，所述RBS如序列表的序列2中第8413-8440位核苷酸所示。

具体的，所述元件甲如序列表的序列2中第6072-9300位核苷酸所示(编码链)。

所述Cas12a基因表达Cas12a蛋白。

所述Cas12a蛋白为Cas12a核酸酶。

所述Cas12a蛋白具体可为FnCas12蛋白、LbCas12a蛋白或AsCas12a蛋白。

具体的，所述FnCas12蛋白如序列表的序列13所示。

具体的，所述元件乙中的启动子为Ptet启动子。

具体的，所述元件乙中的终止子为rrnB T2 terminator。

具体的，所述Ptet启动子如序列表的序列2中第5924-6060位核苷酸所示(模板链)。

具体的，所述rrnB T2 terminator如序列表的序列2中第1950-1977位核苷酸所示(模板链)。

具体的，所述Cas12a基因如序列表的序列2中第2021-5923位核苷酸所示(模板链)。

具体的，所述Cas12a基因如序列表的序列1中第1366-5268位核苷酸所示(编码链)。

具体的，所述元件乙如序列表的序列2中第1950-6060位核苷酸所示(模板链)。

所述元件丙中，所述用于编码crRNA骨架的DNA区段如序列表的序列2中第1729-1747位核苷酸所示(编码链)。

所述元件丙中，所述插入位点位于编码crRNA骨架的DNA区段的下游。

所述插入位点为DNA区段，其中具有n个酶切识别序列。

n为1或2或3或4或5或6或7或8或9。

具体的，所述插入位点中具有2个SapI酶切识别序列。

具体的，所述插入位点如序列表的序列2中第1748-1772位核苷酸所示。

具体的，所述元件丙中的启动子为J23119启动子。

具体的，J23119启动子如序列表的序列2中第1693-1728位核苷酸所示(编码链)。

具体的，所述元件丙中的终止子为rrnBT1 terminator。

具体的，rrnBT1 terminator如序列表的序列2中第1773-1858位核苷酸所示(编码链)。

具体的，所述元件丙如序列表的序列2中第1693-1858位核苷酸所示(编码链)。

DNA分子Ⅰ中还具有TetR基因。

TetR基因编码TetR蛋白。

TetR蛋白为四环素阻遏蛋白。

具体的，TetR蛋白如序列表的序列14所示。

具体的，所述TetR基因如序列表的序列2中第9471-10094位核苷酸所示(模板链)。

具体的，所述TetR基因如序列表的序列1中第438-1061位核苷酸核苷酸所示(编码链)。

具体的，所述DNA分子Ⅰ如序列表的序列2中第1693-10216位核苷酸所示。

本发明还提供了一种载体，命名为载体Ⅰ，其中具有所述DNA分子Ⅰ。

所述载体具体可为环形质粒。

所述载体具体可为pHZB4载体。

pHZB4载体具体如序列表的序列2所示。

本发明还提供了一种DNA分子，命名为DNA分子Ⅱ，其中具有元件甲、元件乙和元件丁；

所述元件甲为用于表达ligD基因和Ku基因的表达盒；

所述元件乙为用于表达Cas12a基因的表达盒；

所述元件丁为用于表达crRNA的表达盒。

所述特异crRNA根据目标靶序列设计，用于靶向并结合目标基因中的目标靶序列。

所述crRNA具体如序列表的序列4所示。

所述crRNA具体如序列表的序列6所示。

所述crRNA具体如序列表的序列8所示。

所述crRNA具体如序列表的序列10所示。

所述元件甲为以上任一所述元件甲。

所述元件乙为以上任一所述元件乙。

所述元件丁为如下任一所述：

(1)用“GCAGCCTGCAGTGTCGCCGAATA”取代所述元件丙中的“AgaagagcCTCGAGgctcttcATTT”，保持其他部分不变；

(2)用“CTGGCAGCCAGGGCTCGTGCAGCAATTTCTACTGTTGTAGATCGACTTGAGCAGCCCCGCCAGGC”取代所述元件丙中的“AgaagagcCTCGAGgctcttcATTT”，保持其他部分不变；

(3)用“GCATACTCGTAACATGCTCCGCAA”取代所述元件丙中的“AgaagagcCTCGAGgctcttcATTT”，，保持其他部分不变；

(4)用“ATCCGGGACAGCTGATAGCGCTAAATTTCTACTGTTGTAGATACAGGGTCTCATCGCAAGTGAAT”取代所述元件丙中的“AgaagagcCTCGAGgctcttcATTT”，保持其他部分不变。

所述DNA分子Ⅱ具体可为将所述DNA分子Ⅰ进行如下任一所述取代后得到的DNA分子：

本发明还提供了一种载体，命名为载体Ⅱ，其中具有所述DNA分子Ⅱ。

所述载体具体可为环形质粒。

所述载体具体可为将所述DNA分子Ⅱ插入pHM1载体的BamHI位点得到的重组质粒。

所述载体具体可为用所述DNA分子Ⅱ取代pHM1载体中BamHI位点之间的小片段得到的重组质粒。

所述载体具体可为将所述DNA分子Ⅱ插入pBBR1MCS-2载体的BamHI位点得到的重组质粒。

所述载体具体可为用所述DNA分子Ⅱ取代pBBR1MCS-2载体中BamHI位点之间的小片段得到的重组质粒。

所述载体具体可为实施例中的打靶载体pHM1-pHZB4-fgXopN、打靶载体

pHM1-pHZB4-fgXopAY/AU、打靶载体pBBR1MCS-2-pHZB4-fgHopAB2或者打靶载体pBBR1MCS-2-pHZB4-fgHopD/R。

本发明还保护以上任一所述DNA分子或者以上任一所述载体在对细菌进行基因编辑中的应用。

本发明还保护以上任一所述DNA分子或者以上任一所述载体在对细菌进行功能基因组研究中的应用。

本发明还保护一种试剂盒，包括以上任一所述DNA分子或者以上任一所述载体；

所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)：

(a)对细菌进行基因编辑；

(b)对细菌进行功能基因组研究。

本发明还提供了一种对细菌中的目标基因进行基因编辑的方法，包括如下步骤：

制备具有特异DNA分子的重组质粒；所述特异DNA分子是将用于编码crRNA的特异结合区的DNA区段插入所述DNA分子Ⅰ的所述插入位点得到的DNA分子；用于编码crRNA的特异结合区的DNA区段与靶标序列特异性结合；所述靶标序列根据目标基因选择；

将所述重组质粒导入细菌，然后培养获得重组细菌，从重组细菌中筛选目标基因发生基因编辑的细菌。

所述目标基因具体可为XopN基因。

所述目标基因具体可为XopAY基因、XopAV基因和XopAU基因。

所述目标基因具体可为HopAB2基因。

所述目标基因具体可为HopD基因和HopR基因。

示例性的，XopN基因部分区段如序列表的序列3所示。

示例性的，XopAY基因、XopAV基因和XopAU基因部分相关区段如序列表的序列5所示。

示例性的，HopAB2基因部分区段如序列表的序列7所示。

示例性的，HopD基因和HopR基因部分相关区段如序列表的序列9所示。

本发明还提供了一种对细菌进行功能基因组研究的方法，包括如下步骤：

将所述重组质粒导入出发细菌，然后培养获得重组细菌，从重组细菌中筛选目标基因发生基因编辑的细菌，即为目标细菌；

通过比较出发细菌与目标细菌的性状差异确定目标基因的功能。

具体的，以上任一所述细菌可为植物病原细菌。

具体的，所述细菌为稻黄单胞菌或假单胞菌。

所述稻黄单胞菌具体可为水稻黄单胞菌PXO99A。

所述假单胞菌具体可为丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000。

本发明通过将ligD/Ku蛋白与CRISPR/FnCas12a系统融合构建一套适用于植物病原细菌的基因组编辑工具，该方法为植物病原细菌的遗传学分析工具箱增添新的利器，对研究寄主植物和病原菌的分子互作机理研究具有重大价值。

本发明的有益效果：实现了对植物病原细菌基因组中靶标基因的敲除。

附图说明

图1位实施例3中静置培养3-5天的照片。

图2为实施例3的结果图。

图3为实施例4的结果图。

图4为实施例5的结果图。

图5为实施例6的结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中的重组质粒均已进行测序验证。

pHM1载体，其全序列记载于NCBI中(NCBI登录号：EF059993.1；14-JUL-2016)。

pBBR1MCS-2载体：Addgene,Plasmid：#85168。

水稻黄单胞菌PXO99A，即Xanthomonas oryzae pv.oryzae PXO99A，其全基因组序列记载于NCBI中(NCBI登录号：CP000967.2；16-NOV-2015)。

丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000，即Pseudomonas syringae pv.tomatostr.DC3000，其全基因组序列记载于NCBI中(NCBI登录号：NC_004578.1；26-OCT-2021)。

实施例1、工具载体的构建

一、pHZB3载体的构建

pHZB3载体为双链DNA形成的环形质粒。

pHZB3载体的全序列如序列表的序列1所示。

序列1中的元件顺序如下：

TetR-Ptet-FnCas12-rrnB T2 terminator-rrnB T1 terminator-crRNA骨架-J23119。

序列表的序列1中，第310-315位核苷酸为BamHI酶切识别序列，第438-1061位核苷酸组成TetR基因(编码链)，第1229-1365位核苷酸组成Ptet启动子(编码链)，1366-5268位核苷酸组成FnCas12基因(编码链)，第5312-5339位核苷酸组成rrnB T2 terminator(编码链)，第5431-5516位核苷酸组成rrnBT1 terminator(模板链)，第5521-5527位核苷酸为SapI酶切识别序列，第5534-5540位核苷酸为SapI酶切识别序列，第5542-5560位核苷酸编码crRNA骨架(模板链)，第5561-5596位核苷酸组成J23119启动子(模板链)，第5597-5602位核苷酸为BamHI酶切识别序列。

二、pHZB4载体的构建

pHZB4载体为双链DNA形成的环形质粒。

pHZB4载体的全序列如序列表的序列2所示。

序列2中的元件顺序如下：J23119-crRNA骨架-rrnB T1 terminator-rrnB T2terminator-FnCas12-Ptet-J23119-RBS-ligD-RBS-mKu-Terminator-TetR。

序列表的序列2中，第1687-1692位核苷酸为BamHI酶切识别序列，第1693-1728位核苷酸组成J23119启动子(编码链)，第1729-1747位核苷酸编码crRNA骨架(编码链)，第1749-1755位核苷酸组成SapI酶切识别序列，第1762-1768位核苷酸组成SapI酶切识别序列，第1773-1858位核苷酸组成rrnBT1 terminator(编码链)，第1950-1977位核苷酸组成rrnB T2 terminator(模板链)，第2021-5923位核苷酸组成FnCas12基因(模板链)，第5924-6060位核苷酸组成Ptet启动子(模板链)，第6072-6106位核苷酸组成J23119启动子(编码链)，第6107-6132位核苷酸组成RBS(编码链)，第6133-8412位核苷酸组成ligD基因(编码链)，第8413-8440位核苷酸组成RBS(编码链)，第8441-9262位核苷酸组成mKu基因(编码链)，第9263-9300位核苷酸组成terminator(编码链)，第9471-10094位核苷酸组成TetR基因(模板链)，第10217-10222位核苷酸为BamHI酶切识别序列。

实施例2、打靶载体以及对照载体的构建

一、pHM1-pHZB3-fgXopN载体及其对照载体的构建

靶基因为水稻黄单胞菌PXO99A的XopN基因。

水稻黄单胞菌PXO99A的基因组DNA中的部分相关区段如序列表的序列3所示。

1、以TTN为PAM，选择靶基因中的靶标序列(选择的靶标序列位于序列3中的第225-247位)。根据靶标序列设计crRNA中的特异性结合区。分别合成单链DNA分子fgXopN-F1和单链DNA分子fgXopN-R1。单链DNA分子fgXopN-F1和单链DNA分子fgXopN-R1退火后形成具有粘末端的双链DNA分子。将具有粘末端的双链DNA分子插入pHZB3载体的两个SapI酶切识别序列的切割位点之间(即用“TATTCGGCGACACTGCAGGCTGC”取代pHZB3载体中的“AAATgaagagcCTCGAGgctcttcT”，保持其他部分不变)，得到重组质粒。重组质粒表达序列表的序列4所示的crRNA。

fgXopN-F1：gatGCAGCCTGCAGTGTCGCCGAATA；

fgXopN-R1：aaaTATTCGGCGACACTGCAGGCTGC。

2、取步骤1获得的重组质粒，采用限制性内切酶BamHI进行酶切，回收约5.3kb的片段。

3、取pHM1载体，采用限制性内切酶BamHI进行酶切，然后进行去磷酸化处理，然后回收约12kb的片段。

4、将步骤2回收的片段和步骤3回收的片段连接，得到重组质粒，即为用于打靶水稻黄单胞菌的XopN基因的打靶载体pHM1-pHZB3-fgXopN(又称为pHM1-B3-fgXopN)。

5、取pHZB3载体，采用限制性内切酶BamHI进行酶切，回收约5.3kb的片段。

6、将步骤5回收的片段和步骤3回收的片段连接，得到重组质粒，即为打靶载体pHM1-pHZB3-fgXopN的对照载体，简称为pHM1-pHZB3载体(又称为pHM1-B3)。

二、pHM1-pHZB4-fgXopN载体及其对照载体的构建。

1、以TTN为PAM，选择靶基因中的靶标序列(选择的靶标序列位于序列3中的第225-247位)。根据靶标序列设计crRNA中的特异性结合区。分别合成单链DNA分子fgXopN-F1和单链DNA分子fgXopN-R1。单链DNA分子fgXopN-F1和单链DNA分子fgXopN-R1退火后形成具有粘末端的双链DNA分子。将具有粘末端的双链DNA分子插入pHZB4载体的两个SapI酶切识别序列的切割位点之间(即用“GCAGCCTGCAGTGTCGCCGAATA”取代pHZB4载体中的“AgaagagcCTCGAGgctcttcATTT”，保持其他部分不变)，得到重组质粒。重组质粒表达序列表的序列4所示的crRNA。

2、取步骤1获得的重组质粒，采用限制性内切酶BamHI进行酶切，回收约8.5kb的片段。

4、将步骤2回收的片段和步骤3回收的片段连接，得到重组质粒，即为用于打靶水稻黄单胞菌的XopN基因的打靶载体pHM1-pHZB4-fgXopN(又称为pHM1-B4-fgXopN)。

5、取pHZB4载体，采用限制性内切酶BamHI进行酶切，回收片段。

6、将步骤5回收的片段和步骤3回收的片段连接，得到重组质粒，即为打靶载体pHM1-pHZB4-fgXopN的对照载体，简称为pHM1-pHZB4载体(又称为pHM1-B4)。

三、pHM1-pHZB4-fgXopAY/AU载体的构建

靶基因为水稻黄单胞菌PXO99A的XopAY基因、XopAV基因和XopAU基因。

水稻黄单胞菌PXO99A的基因组DNA中的部分相关区段如序列表的序列5所示。

1、以TTN为PAM，选择靶基因中的双靶标序列(选择的靶标序列分别位于序列5中的第251-273位以及第3724-3746位)。根据双靶标序列设计crRNA中的特异性结合区。分别合成单链DNA分子fgXopAY/AU-F1和单链DNA分子fgXopAY/AU-R1。单链DNA分子fgXopAY/AU-F1和单链DNA分子fgXopAY/AU-R1退火后形成具有粘末端的双链DNA分子。将具有粘末端的双链DNA分子插入pHZB4载体的两个SapI酶切识别序列的切割位点之间(即用“CTGGCAGCCAGGGCTCGTGCAGCAATTTCTACTGTTGTAGATCGACTTGAGCAGCCCCGCCAGGC”取代pHZB4载体中的“AgaagagcCTCGAGgctcttcATTT”，保持其他部分不变)，得到重组质粒。重组质粒表达序列表的序列6所示的crRNA。

fgXopAY/AU-F1：gatCTGGCAGCCAGGGCTCGTGCAGCAATTTCTACTGTTGTAGATCGACTTGAGCAGCCCCGCCAGGC；

fgXopAY/AU-R1：aaaGCCTGGCGGGGCTGCTCAAGTCGATCTACAACAGTAGAAATTGCTGCACGAGCCCTGGCTGCCAG。

4、将步骤2回收的片段和步骤3回收的片段连接，得到重组质粒，即为用于打靶水稻黄单胞菌的XopAY基因、XopAV基因和XopAU基因的打靶载体pHM1-pHZB4-fgXopAY/AU。

四、pBBR1MCS-2-pHZB4-fgHopAB2载体的构建

靶基因为丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000的HopAB2基因。

丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000的基因组DNA中的部分相关区段如序列表的序列7所示。

1、以TTN为PAM，选择靶基因中的靶标序列(选择的靶标序列位于序列7中的第598-621位)。根据靶标序列设计crRNA中的特异性结合区。分别合成单链DNA分子fgHopAB2-F1和单链DNA分子fgHopAB2-R1。单链DNA分子fgHopAB2-F1和单链DNA分子fgHopAB2-R1退火后形成具有粘末端的双链DNA分子。将具有粘末端的双链DNA分子插入pHZB4载体的两个SapI酶切识别序列的切割位点之间(即用“GCATACTCGTAACATGCTCCGCAA”取代pHZB4载体中的“AgaagagcCTCGAGgctcttcATTT”，保持其他部分不变)，得到重组质粒。重组质粒表达序列表的序列8所示的crRNA。

fgHopAB2-F1：gatGCATACTCGTAACATGCTCCGCAA；

fgHopAB2-R1：aaaTTGCGGAGCATGTTACGAGTATGC。

3、取pBBR1MCS-2载体，采用限制性内切酶BamHI进行酶切，回收约5.1kb的片段

4、将步骤2回收的片段和步骤3回收的片段连接，得到重组质粒，即为用于打靶丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000的HopAB2基因的打靶载体pBBR1MCS-2-pHZB4-fgHopAB2。

五、pBBR1MCS-2-pHZB4-fgHopD/R载体的构建

靶基因为丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000的HopD基因和HopR基因。

丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000的基因组DNA中的部分相关区段如序列表的序列9所示。

1、以TTN为PAM，选择靶基因中的双靶标序列(选择的靶标序列分别位于序列9中的第237-259位以及第14028-14050位)。根据双靶标序列设计crRNA中的特异性结合区。分别合成单链DNA分子fgHopD/R-F1和单链DNA分子fgHopD/R-R1。单链DNA分子fgHopD/R-F1和单链DNA分子fgHopD/R-R1退火后形成具有粘末端的双链DNA分子。将具有粘末端的双链DNA分子插入pHZB4载体的两个SapI酶切识别序列的切割位点之间(即用“ATCCGGGACAGCTGATAGCGCTAAATTTCTACTGTTGTAGATACAGGGTCTCATCGCAAGTGAAT”取代pHZB4载体中的“AgaagagcCTCGAGgctcttcATTT”，保持其他部分不变)，得到重组质粒。重组质粒表达序列表的序列10所示的crRNA。

fgHopD/R-F1：gatATCCGGGACAGCTGATAGCGCTAAATTTCTACTGTTGTAGATACAGGGTCTCATCGCAAGTGAAT；

fgHopD/R-R1：aaaATTCACTTGCGATGAGACCCTGTATCTACAACAGTAGAAATTTAGCGCTATCAGCTGTCCCGGAT。

4、将步骤2回收的片段和步骤3回收的片段连接，得到重组质粒，即为用于打靶丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000的HopD基因和HopR基因的打靶载体pBBR1MCS-2-pHZB4-fgHopD/R。

实施例3、靶向水稻黄单胞菌PXO99A的XopN基因的打靶载体的编辑效率检测

供试载体：pHM1-pHZB3载体、打靶载体pHM1-pHZB3-fgXopN、pHM1-pHZB4载体、打靶载体pHM1-pHZB4-fgXopN。

打靶载体针对的靶序列示意图见图2的A。

将供试载体电击转化水稻黄单胞菌PXO99A，具体步骤如下：

1、取供试载体0.7-1μg置于100μl融化的水稻黄单胞菌PXO99A感受态细胞中，轻轻混匀后置于预冷的0.1cm的电击杯中，2.5KV电压电击4-6ms，然后加入700μl液体NB培养基(Nutrient broth 8g/L，pH7.0-7.2)，28℃、200rpm振荡培养2-3h。

2、完成步骤1后，加入四环素并使其在体系中的浓度为200ng/L，28℃、200rpm振荡培养1h，然后离心收集菌体沉淀，涂布于含100ng/μl壮观霉素的固体NB培养基(Nutrientbroth 8g/L，Agar 15g/L，pH7.0-7.2)平板，室温静置培养3-5天。

静置培养3-5天的照片见图1。与转化pHM1-pHZB3载体的处理组相比，转化打靶载体pHM1-pHZB3-fgXopN的处理组菌落数量明显减少，这表明在具有特异性结合区的crRNA的引导下FnCas12a核酸酶能有效的切割细菌染色体。与转化打靶载体pHM1-pHZB3-fgXopN的处理组相比，转化打靶载体pHM1-pHZB4-fgXopN的处理组菌落数量明显增加，菌落数量大约增至5倍。

3、完成步骤2后，随机挑取单克隆。将单克隆扩繁后分别提取基因组DNA。以基因组DNA为模板，采用XopN-F3和XopN-R3组成的引物对进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳。电泳显示扩增产物的回收扩增产物并测序。电泳不显示扩增产物的进行全基因组测序。

XopN-F3：GTTTTCGCTCAATCCCTGCG；

XopN-R3：CCACTGCATCAAGCACCAGG。

转化打靶载体pHM1-pHZB3-fgXopN的处理组，对随机挑取的22个单克隆进行检测。22个单克隆PCR扩增后的电泳均显示扩增产物，测序结果表明这些扩增产物均为野生型。结果表明，在具有特异性结合区的crRNA的引导下FnCas12a核酸酶能有效的发挥切割活性，但是细菌不具有修复DSB的功能。

转化打靶载体pHM1-pHZB4-fgXopN的处理组，对随机挑取的44个单克隆进行检测。测序结果表明，仅3个单克隆为野生型，其余的41个单克隆均发生了突变(突变形式均为缺失，缺失大小从23bp-8808bp不等)，突变效率为93.18％。部分单克隆PCR扩增后的示例性电泳图见图2的B，部分显示扩增产物，部分不显示扩增产物。示例性的某个单克隆的扩增产物的测序结果见图2的C。示例性的某些单克隆的全基因组测序的测序结果见图2的D。按照缺失片段大小对44个单克隆进行统计，结果见图2的E。结果表明，由具有特异性结合区的crRNA和FnCas12a核酸酶引入的稻黄单胞菌的DSB被mtNHEJ蛋白(ligD/Ku)高效修复。

实施例4、稻黄单胞菌多基因XopAY-AU打靶载体编辑效率检测

打靶载体针对的靶序列示意图见图3的A。

1、取0.7-1μg打靶载体pHM1-pHZB4-fgXopAY/AU，置于100μl融化的水稻黄单胞菌PXO99A感受态细胞中，轻轻混匀后置于预冷的0.1cm的电击杯中，2.5KV电压电击4-6ms，然后加入700μl液体NB培养基，28℃、200rpm振荡培养2-3h。

2、完成步骤1后，加入四环素并使其在体系中的浓度为200ng/L，28℃、200rpm振荡培养1h，然后离心收集菌体沉淀，涂布于含100ng/μl壮观霉素的固体NB培养基平板，室温静置培养3-5天。

3、完成步骤2后，随机挑取22个单克隆。将单克隆扩繁后分别提取基因组DNA。以基因组DNA为模板，采用XopAY/AU-F1和XopAY/AU-R2组成的引物对进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳。电泳显示扩增产物的回收扩增产物并测序。电泳不显示扩增产物的进行全基因组测序。

XopAY/AU-F1：AGCAGCGAACACGAATTCCA；

XopAY/AU-R2：TTTCGGTGAAAAAGGGGGCG。

测序结果表明，仅3个单克隆为野生型，其余的19个单克隆均发生了突变(突变形式均为缺失，突变效率为86.36％。发生突变的19个单克隆中，1个单克隆缺失3482bp(缺失区域对于序列5的第259至3740位)，1个单克隆缺失3491bp(缺失区域对于序列5的第254至3744位)，剩余的17个单克隆为大片段缺失(缺失区域均完全覆盖了序列5)。部分单克隆PCR扩增后的示例性电泳图见图3的B，部分显示扩增产物，部分不显示扩增产物。示例性的某个单克隆的扩增产物的测序结果见图3的C。结果表明，可以通过设计一对靶位点对多个基因进行大片段删除，即FnCas12-ligD/Ku介导的基因组编辑系统不仅可以应用于单基因敲除，还可以应用于多基因敲除。

实施例5、假单胞菌HopAB2打靶载体构建及编辑效率检测

1、取0.7-1μg打靶载体pBBR1MCS-2-pHZB4-fgHopAB2，置于100μl融化的丁香假单胞菌番茄变种菌株DC3000感受态细胞中，轻轻混匀后置于预冷的0.1cm的电击杯中，2.5KV电压电击4-6ms，然后加入700μl液体KB培养基(protease peptone NO.3 20g/L，K₂HPO₄1.5g/L，Glycerol 15g/L，pH7.0，灭菌后加入3.2ml的1M MgSO₄)，28℃、200rpm振荡培养2-3h。

2、完成步骤1后，加入四环素并使其在体系中的浓度为200ng/L，28℃、200rpm振荡培养1h，然后离心收集菌体沉淀，涂布于含50ng/μl卡那霉素的固体KB培养基平板(protease peptone NO.3 20g/L，K₂HPO₄ 1.5g/L，Glycerol 15g/L，Agar 15g/L，pH7.0，灭菌后加入3.2ml的1M MgSO₄)，室温静置培养2-3天。

3、完成步骤2后，随机挑取22个单克隆。将单克隆扩繁后分别提取基因组DNA。以基因组DNA为模板，采用HopAB2-F1和HopAB2-R1组成的引物对进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳。电泳显示扩增产物的回收扩增产物并测序。电泳不显示扩增产物的进行全基因组测序。

HopAB2-F1：ATGCGATTCAACGCTACATT；

HopAB2-R1：ATCGGAGAGGATCAGCATAT。

测序结果表明，18个单克隆为野生型，其余的4个单克隆发生了突变(突变形式均为缺失，突变效率为18.18％。发生突变的4个单克隆中，缺失大小从438bp至714bp，1个单克隆缺失438bp(缺失区域对于序列7的第342至779位)，1个单克隆缺失506bp(缺失区域对于序列7的第174至679位)，1个单克隆缺失649bp(缺失区域对于序列7的第94至742位)，1个单克隆缺失714bp(缺失区域对于序列7的第83至796位)。测序结果见图4。结果表明，FnCas12-ligD/Ku介导的基因组编辑系统可以应用于假单胞菌。

实施例6、假单胞菌HopD/R打靶载体构建及编辑效率检测

1、取打靶载体pBBR1MCS-2-pHZB4-fgHopD/R，置于100μl融化的丁香假单胞菌番茄变种菌株DC3000感受态细胞中，轻轻混匀后置于预冷的0.1cm的电击杯中，2.5KV电压电击4-6ms，然后加入700μl液体KB培养基，28℃、200rpm振荡培养2-3h。

2、完成步骤1后，加入四环素并使其在体系中的浓度为200ng/L，28℃、200rpm振荡培养1h，然后离心收集菌体沉淀，涂布于含50ng/μl卡那霉素的固体KB培养基平板，室温静置培养2-3天。

3、完成步骤2后，随机挑取22个单克隆。将单克隆扩繁后分别提取基因组DNA。以基因组DNA为模板，分别采用三个引物对进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳。电泳显示扩增产物的回收扩增产物并测序。电泳不显示扩增产物的进行全基因组测序。三个引物对：HopD-F1和HopD-R1用于扩增HopD基因，HopR-F1和HopR-R1用于扩增HopR基因,HopQ-F1和HopQ-R1用于扩增HopQ基因。HopQ基因位于HopD基因和HopR基因之间。

HopD-F1：CACATTAGTTGCGAGCGAGC；

HopD-R1：CCTGAACCGTCAGCTCGTTAT。

HopQ-F1：GATGTGCACAAAGCCCTCAG；

HopQ-R1：CCAGCATTTTGTCACGCAGT。

HopR-F1：GGTTAAAGTCCAGCGCATGAATAC；

HopR-R1：CGGTAGCCTCCATCGCCTG。

测序结果表明，2个单克隆为野生型，其余的20个单克隆发生了突变(突变形式均为缺失，突变效率为90.91％。2个野生型单克隆采用三个引物对都获得了扩增产物，扩增产物的测序结果均为野生型。20个单克隆采用三个引物对都没有得到扩增产物，全基因组测序结果表明其均发生了大片段缺失。3个发生大片段缺失的单克隆的示例性测序结果见图5，缺失大小均为72kb。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims

1.一种DNA分子，命名为DNA分子Ⅰ，其中具有元件甲、元件乙和元件丙；

所述元件甲为用于表达ligD基因和Ku基因的表达盒；

所述元件乙为用于表达Cas12a基因的表达盒；

crRNA的特异结合区特异性结合靶标序列；

用于编码crRNA的特异结合区的DNA区段插入所述元件丙中的所述插入位点后，与编码crRNA骨架的DNA区段连接，从而表达靶向所述靶标序列的crRNA。

2.一种载体，命名为载体Ⅰ，其中具有权利要求1所述DNA分子Ⅰ。

3.一种DNA分子，命名为DNA分子Ⅱ，其中具有元件甲、元件乙和元件丁；

所述元件甲为用于表达ligD基因和Ku基因的表达盒；

所述元件乙为用于表达Cas12a基因的表达盒；

所述元件丁为用于表达crRNA的表达盒。

4.一种载体，命名为载体Ⅱ，其中具有权利要求3所述DNA分子Ⅱ。

5.权利要求2或4所述载体在对细菌进行基因编辑中的应用。

6.权利要求2或4所述载体在对细菌进行功能基因组研究中的应用。

7.一种试剂盒，包括权利要求1或3所述DNA分子或权利要求2或4所述载体；

所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)：

(a)对细菌进行基因编辑；

(b)对细菌进行功能基因组研究。

8.一种对细菌中的目标基因进行基因编辑的方法，包括如下步骤：

制备具有特异DNA分子的重组质粒；所述特异DNA分子是将用于编码crRNA的特异结合区的DNA区段插入权利要求1所述DNA分子Ⅰ的所述插入位点得到的DNA分子；用于编码crRNA的特异结合区的DNA区段与靶标序列特异性结合；所述靶标序列根据目标基因选择；

9.一种对细菌进行功能基因组研究的方法，包括如下步骤：