JP2024509047A - Ｃｒｉｓｐｒ関連トランスポゾンシステム及びその使用方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、標的核酸配列を修飾するためのシステム、組成物及び方法に関する。

Description

関連出願
本願は、２０２１年１月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／１４２，９９０号明細書に対する優先権を主張する。前述の優先権出願の内容全体は、本明細書に参照により援用される。

配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、この配列表は、本明細書によって全体として参照により援用される。２０２２年１月２６日に作成された前記ＡＳＣＩＩ複製物は、名称がＡ１１２０２９＿１０２０ＷＯ＿（００１０＿７）＿ＳＬ．ｔｘｔであり、１６，７１５バイトのサイズである。

まとめてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムとして公知の、クラスター化した規則的な間隔の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子は、外来性遺伝要素から特定の種を防御する古細菌及び細菌の適応免疫系である。

本明細書には、標的配列の配列特異的修飾のための組換え核酸組成物及び組換え核酸ターゲティングシステム、並びに組換え核酸ターゲティングシステムを使用する方法が記載される。

一態様において、本開示は、第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーターと第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターとを含む組換え核酸を提供する。第１のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのクラスター化した間隔が置かれた短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）関連トランスポザーゼタンパク質、又はその機能性断片をコードする核酸配列と、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする核酸配列とを含む。第２のポリヌクレオチドは、標的配列とハイブリダイズする能力を有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸配列を含む。

別の態様において、本開示は、第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーターと第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターとを含む組換え核酸を提供し、ここで第１のポリヌクレオチドは、ＴｎｉＡタンパク質、又はその機能性断片をコードする核酸配列、ＴｎｉＢタンパク質、又はその機能性断片をコードする核酸配列、及びＴｎｉＱタンパク質、又はその機能性断片をコードする核酸配列と、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする核酸配列であって、Ｃａｓタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、核酸配列とを含み；ここで第２のポリヌクレオチドは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸配列であって、ｇＲＮＡが標的配列とハイブリダイズする能力を有する、核酸配列を含む。

更に別の態様において、本開示は、第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーターと第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターとを含む組換え核酸を提供し、ここで第１のポリヌクレオチドは、ＴｎｉＡタンパク質、又はその機能性断片をコードする核酸配列、ＴｎｉＢタンパク質、又はその機能性断片をコードする核酸配列、及びＴｎｉＱタンパク質、又はその機能性断片をコードする核酸配列と、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする核酸配列であって、Ｃａｓタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、核酸配列とを含み；ここで第２のポリヌクレオチドは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸配列であって、ｇＲＮＡが標的配列とハイブリダイズする能力を有する、核酸配列を含む。

一実施形態において、組換え核酸は、ＴｎｉＡタンパク質、ＴｎｉＢタンパク質、及びＴｎｉＱタンパク質からなる群から選択される１つ以上のタンパク質を含む少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質、又はその機能性断片を含む。別の実施形態において、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質、又はその機能性断片は、ＴｎｉＡタンパク質、ＴｎｉＢタンパク質、及びＴｎｉＱタンパク質からなる群から選択される２つ以上のタンパク質を含む。更に別の実施形態において、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質、又はその機能性断片は、ＴｎｉＡタンパク質、ＴｎｉＢタンパク質、及びＴｎｉＱタンパク質を含む。上記に記載する特定の実施形態において、ＴｎｉＡタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。上記に記載する特定の実施形態において、ＴｎｉＡタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。上記に記載する特定の実施形態において、ＴｎｉＢタンパク質は、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。上記に記載する特定の実施形態において、ＴｎｉＢタンパク質は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む。上記に記載する特定の実施形態において、ＴｎｉＱタンパク質は、配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。上記に記載する特定の実施形態において、ＴｎｉＱタンパク質は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態において、組換え核酸は、配列番号２に示されるとおりのアミノ酸配列を含むＴｎｉＡタンパク質をコードする核酸配列と、配列番号３に示されるとおりのアミノ酸配列を含むＴｎｉＢタンパク質をコードする核酸配列と、配列番号４に示されるとおりのアミノ酸配列を含むＴｎｉＱタンパク質をコードする核酸配列とを含む第１のポリヌクレオチドを含む。

一部の実施形態において、組換え核酸は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＴｎｉＡタンパク質をコードする核酸配列と、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＴｎｉＢタンパク質をコードする核酸配列と、配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＴｎｉＱタンパク質をコードする核酸配列とを含む第１のポリヌクレオチドを含む。

一部の実施形態において、組換え核酸は、Ｖ－Ｋ型Ｃａｓタンパク質であるＣａｓタンパク質をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態において、Ｖ－Ｋ型Ｃａｓタンパク質は、配列番号１に示されるとおりのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＣａｓ１２ｋタンパク質である。具体的な実施形態において、Ｃａｓ１２ｋタンパク質は、配列番号１に示されるとおりのアミノ酸配列を含む。

一実施形態において、組換え核酸は、ＴｎｉＡタンパク質、又はその機能性断片をコードする核酸配列、ＴｎｉＢタンパク質、又はその機能性断片をコードする核酸配列、及びＴｎｉＱタンパク質、又はその機能性断片をコードする核酸配列と、配列番号１に示されるとおりのアミノ酸配列を含むＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｋタンパク質）をコードする核酸配列とを含む第１のポリヌクレオチドを含む。組換え核酸は、標的配列とハイブリダイズする能力を有するｇＲＮＡをコードする核酸配列を含む第２のポリヌクレオチドを更に含む。

一部の実施形態において、組換え核酸は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｋタンパク質）と複合体化してＣａｓタンパク質／ｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する能力を有するｇＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム関連ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列を含む。特定の実施形態において、ｇＲＮＡは、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列を更に含むシングルガイドＲＮＡである。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号５に示されるとおりのヌクレオチド配列を含む。

一態様において、本開示は、本明細書における組換え核酸を含むベクターを提供する。別の態様において、本開示は、本明細書に記載されるベクターを含む細菌細胞を提供する。

一態様において、本開示は、標的配列の配列特異的修飾のための組換え核酸ターゲティングシステムを提供する。このシステムは、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質又は少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｋタンパク質）又はＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドと；ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとを含む。一部の実施形態において、組換え核酸ターゲティングシステムは、Ｃａｓタンパク質と複合体化してＣａｓタンパク質／ｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体を形成する能力を有するｇＲＮＡを含む。

一実施形態において、組換え核酸ターゲティングシステムは、ＴｎｉＡタンパク質、ＴｎｉＢタンパク質、及びＴｎｉＱタンパク質からなる群から選択される１つ以上のタンパク質を含む少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質、又はその機能性断片を含む。別の実施形態において、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質、又はその機能性断片は、ＴｎｉＡタンパク質、ＴｎｉＢタンパク質、及びＴｎｉＱタンパク質からなる群から選択される２つ以上のタンパク質を含む。更に別の実施形態において、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質、又はその機能性断片は、ＴｎｉＡタンパク質、ＴｎｉＢタンパク質、及びＴｎｉＱタンパク質を含む。上記に記載する特定の実施形態において、ＴｎｉＡタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。上記に記載する特定の実施形態において、ＴｎｉＡタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。上記に記載する特定の実施形態において、ＴｎｉＢタンパク質は、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。上記に記載する特定の実施形態において、ＴｎｉＢタンパク質は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む。上記に記載する特定の実施形態において、ＴｎｉＱタンパク質は、配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。上記に記載する特定の実施形態において、ＴｎｉＱタンパク質は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態において、組換え核酸ターゲティングシステムは、配列番号２に示されるアミノ酸と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＴｎｉＡタンパク質をコードする核酸配列と、配列番号３に示されるアミノ酸と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＴｎｉＢタンパク質をコードする核酸配列と、配列番号４に示されるアミノ酸と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＴｎｉＱタンパク質をコードする核酸配列とを含む第１のポリヌクレオチドを含む。他の実施形態において、組換え核酸ターゲティングシステムは、配列番号２に示されるとおりのアミノ酸配列を含むＴｎｉＡタンパク質をコードする核酸配列と、配列番号３に示されるとおりのアミノ酸配列を含むＴｎｉＢタンパク質をコードする核酸配列と、配列番号４に示されるとおりのアミノ酸配列を含むＴｎｉＱタンパク質をコードする核酸配列とを含む第１のポリヌクレオチドを含む。

一部の実施形態において、組換え核酸ターゲティングシステムは、Ｖ－Ｋ型Ｃａｓタンパク質であるＣａｓタンパク質をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態において、Ｖ－Ｋ型Ｃａｓタンパク質は、配列番号１に示されるとおりのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＣａｓ１２ｋタンパク質である。具体的な実施形態において、Ｃａｓ１２ｋタンパク質は、配列番号１に示されるとおりのアミノ酸配列を含む。

一実施形態において、標的配列の配列特異的修飾のための組換え核酸ターゲティングシステムは、ＴｎｉＡタンパク質、ＴｎｉＢタンパク質、並びにＴｎｉＱタンパク質、又はＴｎｉＡタンパク質、ＴｎｉＢタンパク質、及びＴｎｉＱタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、配列番号１に示されるとおりのアミノ酸配列を含むＣａｓタンパク質又は配列番号１に示されるとおりのアミノ酸配列を含むＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとを含み、ここでｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と複合体化してｇＲＮＡ－Ｃａｓタンパク質複合体を形成する能力を有する。

一部の実施形態において、組換え核酸ターゲティングシステムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム関連ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列を含むｇＲＮＡを含む。特定の実施形態において、ｇＲＮＡは、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列を更に含むシングルガイドＲＮＡである。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号５に示されるとおりのヌクレオチド配列を含む。

一部の実施形態において、組換え核酸ターゲティングシステムは、標的ポリヌクレオチドを更に含む。標的ポリヌクレオチドは、（ｉ）ｇＲＮＡにハイブリダイズする能力を有する標的配列及び（ｉｉ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含む。特定の実施形態において、ＰＡＭは、ヌクレオチド配列５’－ＧＴＮ－３’、５’－ＮＧＴＮ－３’、又は５’－ＧＧＴＮ－３’を含む。特定の実施形態において、ＰＡＭは、ヌクレオチド配列５’－ＧＧＴＴ－３’を含む。特定の実施形態において、ＰＡＭは、ヌクレオチド配列５’－ＧＴＴ－３’、５’－ＧＴＡ－３’、５’－ＧＴＣ－３’、又は５’－ＧＴＧ－３’を含む。特定の実施形態において、ＰＡＭは、５’－ＧＧＴＡ－３’、５’－ＧＧＴＣ－３’、又は５’－ＧＧＴＧ－３’を含む。詳細な実施形態において、ＰＡＭは、５’－ＧＧＴＴ－３’に示されるとおりのヌクレオチド配列を含む。

一部の実施形態において、組換え核酸ターゲティングシステムは、ドナーポリヌクレオチドを更に含む。ドナーポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドへの挿入のためのペイロード配列を含む。一部の実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、トランスポゾン左末端（ＴＥ－Ｌ）をコードする核酸配列とトランスポゾン右末端（ＴＥ－Ｒ）をコードする核酸配列とを更に含む。特定の実施形態において、ＴＥ－Ｌは、配列番号６に示される核酸配列と少なくとも９５％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態において、ＴＥ－Ｌは、配列番号６に示されるとおりの核酸配列を含む。特定の実施形態において、ＴＥ－Ｒは、配列番号７に示される核酸配列と少なくとも９５％同一の核酸配列を含む。特定の実施形態において、ＴＥ－Ｒは、配列番号７に示されるとおりの核酸配列を含む。

一部の実施形態において、組換え核酸ターゲティングシステムは、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＴｎｉＡタンパク質と、ドナーポリヌクレオチドであって、標的配列への挿入のためのペイロード配列、配列番号６に示される核酸配列と少なくとも９５％同一のトランスポゾン左末端（ＴＥ－Ｌ）をコードする核酸配列、及び配列番号７に示される核酸配列と少なくとも９５％同一のトランスポゾン右末端（ＴＥ－Ｒ）をコードする核酸配列を含むドナーポリヌクレオチドとを含む。特定の実施形態において、組換え核酸ターゲティングシステムは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｋタンパク質）又はＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、Ｃａｓタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチドと、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとを更に含み、ここでｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と複合体化してｇＲＮＡ－Ｃａｓタンパク質複合体を形成する能力を有する。特定の実施形態において、組換え核酸ターゲティングシステムは、ＴｎｉＢタンパク質及びＴｎｉＱタンパク質のうちの１つ以上を更に含む。

特定の実施形態において、組換え核ターゲティング（ｎｕｃｌｅｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）システムは、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｋタンパク質）、ＴｎｉＡタンパク質、ＴｎｉＢタンパク質、及びＴｎｉＱタンパク質のうちの少なくとも１つを精製タンパク質として含む。

一態様において、本開示は、本明細書に記載される組換え核酸ターゲティングシステムを含む細菌細胞を提供する。

一態様において、本開示は、細菌細胞における標的ポリヌクレオチドの修飾方法を提供する。本方法は、細胞に第１、第２及び第３の組換え核酸を導入することを含む。第１の組換え核酸は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質、又はその機能性断片をコードするポリヌクレオチドと、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｋタンパク質）をコードするポリヌクレオチドと；ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとを含む。第２の組換え核酸は、ｇＲＮＡにハイブリダイズする能力を有する標的配列とＰＡＭ配列とを含む標的ポリヌクレオチドを含む。第３の組換え核酸は、標的ポリヌクレオチドへの挿入のためのペイロード配列を含むドナーポリヌクレオチドを含む。

本明細書に記載される方法の一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と複合体化してＣａｓタンパク質／ｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体を形成する能力を有する。

細菌細胞における標的ポリヌクレオチドの修飾方法の一実施形態において、本方法は、細胞に、ＴｎｉＡタンパク質、又はその機能性断片をコードするポリヌクレオチド、ＴｎｉＢタンパク質、又はその機能性断片をコードするポリヌクレオチド、及びＴｎｉＱタンパク質、又はその機能性断片をコードするポリヌクレオチドと、配列番号１に示されるとおりのアミノ酸配列を含むＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、Ｃａｓタンパク質と複合体化してｇＲＮＡ－Ｃａｓタンパク質複合体を形成する能力を有するｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとを含む第１の組換え核酸を導入することを含む。上記に記載される実施形態において、本方法は、細胞に、ｇＲＮＡにハイブリダイズする能力を有する標的配列とＰＡＭ配列とを含む標的ポリヌクレオチドを含む第２の組換え核酸を導入することを更に含む。本方法は、細胞に、標的ポリヌクレオチドへの挿入のためのペイロード配列を含むドナーポリヌクレオチドを含む第３の組換え核酸を導入することを更に含む。

本明細書に記載される方法の一部の実施形態において、組換え核酸ターゲティングシステムは、ドナーポリヌクレオチドを更に含む。ドナーポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドへの挿入のためのペイロード配列を含む。一部の実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、ＴＥ－Ｌをコードする核酸配列とＴＥ－Ｒをコードする核酸配列とを更に含む。特定の実施形態において、ＴＥ－Ｌは、配列番号６に示されるとおりの核酸配列を含む。特定の実施形態において、ＴＥ－Ｒは、配列番号７に示されるとおりの核酸配列を含む。

本方法の一実施形態において、組換え核酸は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質、又はその機能性断片を含むポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、このポリヌクレオチドは、ＴｎｉＡタンパク質、又はその機能性断片、ＴｎｉＢタンパク質、又はその機能性断片、又はＴｎｉＱタンパク質、又はその機能性断片をコードする。別の実施形態において、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質、又はその機能性断片は、ＴｎｉＡタンパク質、ＴｎｉＢタンパク質、及びＴｎｉＱタンパク質からなる群から選択される２つ以上のタンパク質を含む。更に別の実施形態において、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質、又はその機能性断片は、ＴｎｉＡタンパク質、ＴｎｉＢタンパク質、及びＴｎｉＱタンパク質を含む。上記に記載する特定の実施形態において、ＴｎｉＡタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。上記に記載する特定の実施形態において、ＴｎｉＢタンパク質は、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。上記に記載する特定の実施形態において、ＴｎｉＱタンパク質は、配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。本方法の一部の実施形態において、ＴｎｉＡタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、ＴｎｉＢタンパク質は、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、及びＴｎｉＱタンパク質は、配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。本方法の一部の実施形態において、ＴｎｉＡタンパク質は、配列番号２に示されるとおりのアミノ酸配列を含み、ＴｎｉＢタンパク質は、配列番号３に示されるとおりのアミノ酸配列を含み、及びＴｎｉＱタンパク質は、配列番号４に示されるとおりのアミノ酸配列を含む。

本方法の一部の実施形態において、ＰＡＭは、ヌクレオチド配列５’－ＧＴＮ－３’、５’－ＮＧＴＮ－３’、又は５’－ＧＧＴＮ－３’を含む。特定の実施形態において、ＰＡＭは、ヌクレオチド配列５’－ＧＧＴＴ－３’を含む。特定の実施形態において、ＰＡＭは、ヌクレオチド配列５’－ＧＴＴ－３’、５’－ＧＴＡ－３’、５’－ＧＴＣ－３’、又は５’－ＧＴＧ－３’を含む。特定の実施形態において、ＰＡＭは、５’－ＧＧＴＡ－３’、５’－ＧＧＴＣ－３’、又は５’－ＧＧＴＧ－３’を含む。詳細な実施形態において、ＰＡＭは、５’－ＧＧＴＴ－３’に示されるとおりのヌクレオチド配列を含む。

本方法の一部の実施形態において、細菌細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。

ＴｎｉＡ、ＴｎｉＢ、ＴｎｉＱ、Ｃａｓ１２ｋ、ｓｇＲＮＡ足場、及びアンピシリン耐性タンパク質（Ａｍｐ^Ｒ）のコード領域を有するｐＥｆｆｅｃｔｏｒプラスミドＡ２の構造を描く。 ペイロード配列のコード領域を有するｐＤｏｎｏｒプラスミドＢ２の構造を描き、これは、カナマイシン耐性遺伝子、並びに左（ＴＥ－Ｌ）及び右（ＴＥ－Ｒ）トランスポゾン末端の配列を含む。 プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列及び標的配列のコード領域を有するｐＴａｒｇｅｔプラスミドＣ２の構造を描く。 ｐＥｆｆｅｃｔｏｒプラスミドＡ２の媒介によってｐＤｏｎｏｒプラスミドＢ２ペイロード配列をｐＴａｒｇｅｔプラスミドＣ２に挿入するＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼイベントを示す。ｘ軸及びｙ軸は、それぞれｐＴａｒｇｅｔプラスミドＣ２及びｐＤｏｎｏｒプラスミドＢ２とのアラインメント位置を表し、一方、縦軸及び横軸のヒストグラムは、それぞれｐＤｏｎｏｒプラスミドＢ２又はｐＴａｒｇｅｔプラスミドＣ２とアラインメントしたペアエンドリードのうちの一方におけるシーケンシングリードの数を表示する。

本開示は、標的配列の配列特異的修飾のための組換え核酸組成物及び組換え核酸ターゲティングシステムに関する。本開示はまた、細菌細胞における標的ポリヌクレオチドの修飾方法も提供する。本明細書に記載される組成物及び方法は、１つ以上のクラスター化した間隔が置かれた短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）関連トランスポザーゼタンパク質、又はその機能性断片、配列特異的ヌクレオチド結合タンパク質（例えば、Ｃａｓタンパク質）の１つ以上の成分、及びガイド分子（例えばガイドＲＮＡ分子）をコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書に記載される組成物及び方法は、ｇＲＮＡにハイブリダイズする能力を有する標的配列を含む標的ポリヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドへの挿入のためのペイロード配列を含むドナーポリヌクレオチドとを更に含む。

Ｉ．定義
特に定義しない限り、本開示で使用される全ての用語は、当業者によって一般的に理解されるとおりの意味を有する。更なる手引きとして、本開示の教示をより良く理解するための用語定義が含まれる。

本明細書で使用されるとき、用語「約」又は「近似的に」は、パラメータ、量などの測定可能な値に言及するとき、指定される値の、且つその値から±１０％以下、好ましくは±５％以下、及びより好ましくは±１％以下の変動を、かかる変動が本開示において機能を果たすのに適切である限りにおいて包含することが意図される。

本明細書で使用されるとき、用語「ドナーポリヌクレオチド」は、本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ、又は方法を使用して標的核酸配列に挿入される能力を有するペイロード配列を含むポリヌクレオチド分子である。

本明細書で使用されるとき、用語「エフェクター複合体」は、酵素活性を実行するか、又はガイドＲＮＡによって指定される核酸上の標的部位に結合する少なくとも１つのタンパク質を有する複合体を指す。

本明細書で使用されるとき、用語「～をコードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」又は「～をコードする（ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ）」は、１つ又は複数の適切な調節配列の制御下に置かれているとき転写される（及び任意選択で翻訳される）核酸配列（即ち、ＤＮＡ）を指す。

本明細書で使用されるとき、用語「ハイブリダイゼーション」は、１つ以上のポリヌクレオチドが相互作用して、それらのポリヌクレオチドの残基の塩基間での水素結合によって安定化した複合体を形成する反応を指す。

本明細書で使用されるとき、用語「核酸ターゲティングシステム」は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベースのシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼシステム）の発現に関わるか、又は他の場合にはその活性を仕向ける転写物及び他のエレメントを指し、これには、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼシステムをコードするヌクレオチド配列が含まれることもある。

用語「作動可能に連結された」は、本明細書で使用されるとき、目的のヌクレオチド配列（又は複数のヌクレオチド配列）の発現を可能にするような方法で１つ又は複数の調節エレメントに連結している目的の核酸配列（又は複数の核酸配列）を指す。用語「調節エレメント」には、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、及び他の発現制御エレメントが含まれることが意図される。

本明細書で使用されるとき、用語「ペイロード配列」は、標的配列に組み込まれる能力を有する目的の核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列）を指す。ペイロード配列は、細胞（例えば、細菌細胞）にとって内因性又は外因性の配列であってもよい。ペイロード配列の非限定的な例としては、タンパク質をコードするＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、及び非コードＲＮＡ配列（例えば、マイクロＲＮＡ）が挙げられる。

本明細書で使用されるとき、「プロモーター」は、遺伝子の転写開始部位（又はタンパク質コード領域）の上流、又はそれの５’末端に位置し、且つ転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼ及び他のタンパク質（トランス作用性転写因子）の認識及び結合に関わるＤＮＡ配列を指す。

本明細書で使用されるとき、用語「プロトスペーサー隣接モチーフ」又は「ＰＡＭ」は、エフェクター複合体とＲＮＡガイドとを含む複合体が結合する標的配列に隣接するＤＮＡ配列を指す。一部の実施形態において、ＰＡＭは酵素活性に必要である。

本明細書で使用されるとき、用語「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」又は「ガイドＲＮＡ配列」は、本明細書に記載されるポリペプチドを標的核酸配列へとターゲティングするのを容易にする任意のＲＮＡ分子を指す。例えば、ＲＮＡガイドは、標的核酸配列を認識する（例えば、それに結合する）分子であり得る。ガイドＲＮＡは、特異的核酸配列と相補的になるように合成的に設計されてもよい。一態様において、本明細書に提供されるガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む。一態様において、本明細書に提供されるガイドＲＮＡは、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と複合体化したＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む。別の態様において、本明細書に提供されるガイドＲＮＡは、単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む。一態様において、本明細書に提供される単鎖ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの両方を含む。

本明細書で使用されるとき、用語「実質的に同一」は、参照配列とある程度の同一性を有する配列、即ち、ポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列を指す。

本明細書で使用されるとき、用語「標的配列」、「標的核酸」、「標的核酸配列」及び「標的部位」は、同義的に、本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼによって修飾されるか、又は方法によって修飾されたヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態において、標的配列は遺伝子内にある。

本明細書で使用されるとき、用語「標的ポリヌクレオチド」は、本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ又は方法を用いてそこにペイロード配列を挿入せしめる能力を有する標的配列を含むポリヌクレオチド分子を指す。

本明細書で使用されるとき、用語「トランス活性化ｃｒＲＮＡ」及び「ｔｒａｃｒＲＮＡ」は、ｃｒＲＮＡ配列とハイブリダイズするのに十分な相補性を有する、且つガイドＲＮＡが標的核酸に結合することに関わるか、又は結合するのに必要とされる任意のポリヌクレオチド配列を指す。

ＩＩ．組成物及びシステム
本開示は、標的配列の配列特異的修飾のための組換え核酸組成物及び組換え核酸ターゲティングシステムを提供する。一態様において、本開示は、第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーターと第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターとを含む組換え核酸を提供する。一部の実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのクラスター化した間隔が置かれた短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）関連トランスポザーゼタンパク質、又はその機能性断片をコードする核酸配列と、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする核酸配列とを含む。一部の実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、標的配列とハイブリダイズする能力を有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸配列を含む。別の態様において、本開示は、標的配列の配列特異的修飾のための組換え核酸ターゲティングシステムを提供する。一部の実施形態において、核酸ターゲティングシステムは、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質、又は少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｋタンパク質）、又はＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、又はｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとを含む。別の実施形態において、本明細書に提供される核酸ターゲティングシステム（又は組換え核酸）は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つの（ＣＲＩＳＰＲ）関連トランスポザーゼタンパク質をコードする少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのポリヌクレオチドに作動可能に連結された少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つ（又はそれ以上）のプロモーターを含む。一部の実施形態において、本明細書に提供される核酸ターゲティングシステム（又は組換え核酸）は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つ（又はそれ以上）のガイドＲＮＡをコードする。一部の実施形態において、核酸ターゲティングシステムは、トランスポゾン左末端（ＴＥ－Ｌ）をコードする少なくとも１つの核酸配列と、トランスポゾン右末端（ＴＥ－Ｒ）をコードする少なくとも１つの核酸配列とを更に含む。

一部の実施形態において、核酸ターゲティングシステムは、ｇＲＮＡのうちの少なくとも１つにハイブリダイズする能力を有する少なくとも１つの標的配列と少なくとも１つのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列とを更に含む。

Ａ．ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ
本明細書に記載される組換え核酸組成物及び組換え核酸ターゲティングシステムは、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質、又はその機能性断片を含む。例えば、一部の実施形態において、本開示は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質、又はその機能性断片をコードする第１のポリヌクレオチドを含む組換え核酸組成物を提供する。他の実施形態において、本開示は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質、又は少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え核酸ターゲティングシステムを提供する。用語「トランスポザーゼ」は、１つ又は複数のトランスポゾン末端配列（即ち、トランスポゾンの遠位端にあるヌクレオチド配列）と機能複合体を形成する能力、及び一本鎖又は二本鎖標的核酸配列（例えば、ＤＮＡ）へのトランスポゾン末端含有配列の挿入又は転移を触媒する能力を有する酵素を指す。用語「ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ」は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に関連するトランスポザーゼ酵素及び／又はタンパク質を指す。更に、本明細書で使用されるとき、用語「転移」又は用語「転移反応」は、トランスポザーゼがドナーポリヌクレオチド配列（例えば、ドナーポリヌクレオチドのペイロード配列）を標的ポリヌクレオチドの標的部位内へと、又はそれに隣接して挿入する反応を指す。一部の実施形態において、ドナーポリヌクレオチドのペイロード配列は、トランスポゾン末端配列（例えば、トランスポゾン右末端（ＴＥ－Ｒ）配列及びトランスポゾン左（ＴＥ－Ｌ）末端配列）又はトランスポザーゼによって認識される二次構造エレメントを含有し、ここでは認識が起こると、トランスポザーゼが標的ポリヌクレオチドに付着末端型の切断を切り出し、又は導入し、そこにドナーポリヌクレオチド配列のペイロード配列が挿入されることになり得る。

例示的トランスポザーゼとしては、限定はされないが、Ｔｎトランスポザーゼ（例えば、Ｔｎ３、Ｔｎ５、Ｔｎ７、Ｔｎ１０、Ｔｎ５５２、Ｔｎ９０３）、原核生物トランスポザーゼ、並びに本明細書に提供されるトランスポザーゼに関係する、及び／又はそれに由来する任意のトランスポザーゼが挙げられる。特定の実施形態において、親トランスポザーゼに関係する、及び／又はそれに由来するトランスポザーゼは、親トランスポザーゼの対応するポリペプチド、又はその機能性断片と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約９９．５％又はそれ以上のアミノ酸配列相同性のあるポリペプチド、又はその機能性断片を含み得る。一部の実施形態において、本明細書に記載される少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質は、完全なトランスポゾンシステム（例えば、Ｔｎ７トランスポゾンシステム）を含む。一部の実施形態において、本明細書に提供される少なくとも１つの（ＣＲＩＳＰＲ）関連トランスポザーゼタンパク質は、配列番号２～４から選択される少なくとも１つの配列、又はその機能性断片と少なくとも約５０％の配列同一性、少なくとも約５５％の配列同一性、少なくとも約６０％の配列同一性、少なくとも約６５％の配列同一性、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約７５％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８１％の配列同一性、少なくとも約８２％の配列同一性、少なくとも約８３％の配列同一性、少なくとも約８４％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約８６％の配列同一性、少なくとも約８７％の配列同一性、少なくとも約８８％の配列同一性、少なくとも約８９％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９１％の配列同一性、少なくとも約９２％の配列同一性、少なくとも約９３％の配列同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、少なくとも約９９％の配列同一性（又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、本明細書に提供される少なくとも２つの（ＣＲＩＳＰＲ）関連トランスポザーゼタンパク質は、配列番号２～４から選択される少なくとも１つの配列、又はその機能性断片と少なくとも約５０％の配列同一性、少なくとも約５５％の配列同一性、少なくとも約６０％の配列同一性、少なくとも約６５％の配列同一性、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約７５％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８１％の配列同一性、少なくとも約８２％の配列同一性、少なくとも約８３％の配列同一性、少なくとも約８４％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約８６％の配列同一性、少なくとも約８７％の配列同一性、少なくとも約８８％の配列同一性、少なくとも約８９％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９１％の配列同一性、少なくとも約９２％の配列同一性、少なくとも約９３％の配列同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、少なくとも約９９％の配列同一性（又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、本明細書に提供される少なくとも３つの（ＣＲＩＳＰＲ）関連トランスポザーゼタンパク質は、配列番号２～４から選択される少なくとも１つの配列、又はその機能性断片と少なくとも約５０％の配列同一性、少なくとも約５５％の配列同一性、少なくとも約６０％の配列同一性、少なくとも約６５％の配列同一性、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約７５％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８１％の配列同一性、少なくとも約８２％の配列同一性、少なくとも約８３％の配列同一性、少なくとも約８４％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約８６％の配列同一性、少なくとも約８７％の配列同一性、少なくとも約８８％の配列同一性、少なくとも約８９％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９１％の配列同一性、少なくとも約９２％の配列同一性、少なくとも約９３％の配列同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、少なくとも約９９％の配列同一性（又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を含む。特定の好ましい実施形態において、本明細書に記載される組成物及びシステムは、ＴｎｉＡタンパク質、ＴｎｉＢタンパク質、及びＴｎｉＱタンパク質から選択される少なくとも１つのタンパク質、又はその機能性断片を含む。他の好ましい実施形態において、本明細書に記載される組成物及びシステムは、ＴｎｉＡタンパク質、ＴｎｉＢタンパク質、及びＴｎｉＱタンパク質から選択される少なくとも２つのタンパク質、又はその機能性断片を含む。更に他の好ましい実施形態において、本明細書に記載される組成物及びシステムは、ＴｎｉＡタンパク質、ＴｎｉＢタンパク質、及びＴｎｉＱタンパク質、又はその機能性断片を含む。

特定の実施形態において、本明細書に記載される少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質は、限定はされないが、標的切断及びポリヌクレオチド挿入を含めた機能を提供し得る。具体的な実施形態において、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質は、標的ポリヌクレオチド認識を提供するのでなく、標的ポリヌクレオチド切断及び標的配列へのドナーポリヌクレオチドの挿入を提供する。他の実施形態において、本明細書に提供される少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質を標的ポリヌクレオチドの標的配列に仕向けるＣａｓタンパク質／ｇＲＮＡ複合体と複合体を形成し、ここで少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質は、それがドナーポリヌクレオチドを挿入するところである標的ポリヌクレオチドに２つの一本鎖切断を導入する。特定の実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は一本鎖又は二本鎖ＤＮＡであり得る。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質／ｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体と少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質とを含む複合体が形成されると、標的ポリヌクレオチドの標的配列にある、又はその近傍にある（例えば、それから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０塩基対又はそれ以上の範囲内にある）一方又は両方の鎖にドナーポリヌクレオチドの挿入が起こる。他の実施形態において、Ｃａｓタンパク質／ｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体と少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質とを含む複合体が形成されると、標的ポリヌクレオチドの標的配列にある、又はその近傍にある（例えば、それから１～１０塩基対、５～１５塩基対、１０～２０塩基対、１５～２５塩基対、２０～３０塩基対、２５～３５塩基対、３０～４０塩基対、３５～４５塩基対、４５～６０塩基対、４５～７０塩基対、４５～８０塩基対又はそれ以上の塩基対の範囲内にある）一方又は両方の鎖にドナーポリヌクレオチドの挿入が起こる。

本明細書に記載される組成物及びシステムは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質とを含む。一部の実施形態において、標的部位には、１つ以上のトランス遺伝子を含む組換え核酸が組み込まれる。

Ｂ．Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡシステム
本明細書に記載される組換え核酸組成物及び組換え核酸ターゲティングシステムは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｋタンパク質）、又はＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、組換え核酸ターゲティングシステムのヌクレオチド結合成分として働き得る。特定の実施形態において、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質はＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質と会合するか、又はそれと複合体を形成する。好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質は少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質を標的ポリヌクレオチドの標的配列に仕向け、そこでは少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質がドナーポリヌクレオチドのペイロード配列を標的ポリヌクレオチドの標的配列に容易に挿入することができる。

特定の他の実施形態において、本明細書に記載される組換え核酸組成物及び組換え核酸ターゲティングシステムは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｋタンパク質）又はＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、標的ポリヌクレオチドの標的配列とハイブリダイズする能力を有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む。好ましい実施形態において、ｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と複合体化してｇＲＮＡ－Ｃａｓタンパク質複合体を形成する能力を有する。特定の他の実施形態において、Ｃａｓタンパク質及びｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの基本単位を含む。他の実施形態において、ガイドＲＮＡは約６０～８０ｎｔ長の１つ以上の低分子干渉ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含み、その各々がトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と会合してＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｋ）を標的配列へと導く。結果として得られるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター複合体は、標的配列（例えば、ＤＮＡ）中のプロトスペーサーとして公知の相同な二本鎖ＤＮＡ配列を認識し、それに結合する。一部の実施形態において、切断のための必要条件は、標的配列の下流に、保存されたプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が存在することである。特定の実施形態において、ＰＡＭは、ヌクレオチド配列５’－ＧＴＮ－３’、５’－ＮＧＴＮ－３’、又は５’－ＧＧＴＮ－３’を含む。特定の実施形態において、ＰＡＭは、ヌクレオチド配列５’－ＧＧＴＴ－３’を含む。特定の実施形態において、ＰＡＭは、ヌクレオチド配列５’－ＧＴＴ－３’、５’－ＧＴＡ－３’、５’－ＧＴＣ－３’、又は５’－ＧＴＧ－３’を含む。特定の実施形態において、ＰＡＭは、５’－ＧＧＴＡ－３’、５’－ＧＧＴＣ－３’、又は５’－ＧＧＴＧ－３’を含む。

概して当業者によって認識されているＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのクラスは２つあり、それらはクラス１及び２と称される。クラス１及び２は、多成分の、又は一成分のＣａｓタンパク質を含むと認識されている。本開示の一態様において、標的ポリヌクレオチドの標的配列の切断又は結合に好ましいシステムは、クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのＣａｓタンパク質（Ｖ型Ｃａｓタンパク質）である。一部の実施形態において、Ｖ型Ｃａｓタンパク質は、Ｖ－Ｋ型Ｃａｓタンパク質である。他の好ましい実施形態において、Ｖ－Ｋ型Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１２ｋタンパク質である。一部の実施形態において、Ｃａｓ１２ｋタンパク質は、配列番号１に示されるとおりのアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態において、本明細書に記載される組換え核酸は、配列番号１に示されるとおりのアミノ酸配列と最小約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％を有する、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８１％の配列同一性、少なくとも約８２％の配列同一性、少なくとも約８３％の配列同一性、少なくとも約８４％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約８６％の配列同一性、少なくとも約８７％の配列同一性、少なくとも約８８％の配列同一性、少なくとも約８９％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９１％の配列同一性、少なくとも約９２％の配列同一性、少なくとも約９３％の配列同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、少なくとも約９９％の配列同一性（又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする核酸配列を含む。特定の他の実施形態において、本明細書に記載される組換え核酸は、Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、ここでＣａｓタンパク質は、配列番号１に示されるとおりのＣａｓ１２ｋタンパク質のアミノ酸配列と約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。２つの配列間（例えば、核酸又はアミノ酸配列間）のパーセント同一性は、手作業で、２つの最適にアラインメントしたアミノ酸配列を調べることによるか、又は標準パラメータを用いたソフトウェアプログラム又はアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬ）を使用することにより決定し得る。２つの核酸配列が実質的に同一であることの一つの指標は、それらの２つの核酸分子がストリンジェントな条件下で（例えば、中程度から高度にまで及ぶ範囲内のストリンジェンシーで）互いにハイブリダイズすることである。

一部の実施形態において、本明細書に記載される組換え核酸ターゲティングシステムは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と最小約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％を有する、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８１％の配列同一性、少なくとも約８２％の配列同一性、少なくとも約８３％の配列同一性、少なくとも約８４％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約８６％の配列同一性、少なくとも約８７％の配列同一性、少なくとも約８８％の配列同一性、少なくとも約８９％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９１％の配列同一性、少なくとも約９２％の配列同一性、少なくとも約９３％の配列同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、少なくとも約９９％の配列同一性（又はそれ以上）を有するアミノ酸配列を含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質又はＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。特定の他の実施形態において、本明細書に記載される組換え核酸ターゲティングシステムは、配列番号１に示されるＣａｓ１２ｋタンパク質のアミノ酸配列と約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質又はＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。２つのポリペプチドが実質的に同一であることの一つの指標は、第１のポリペプチドが第２のポリペプチドと免疫学的に交差反応性を示すことである。典型的には、保存的アミノ酸置換が異なるポリペプチドは、免疫学的に交差反応性を示す。従って、あるポリペプチドが第２のポリペプチドと、例えば、ある保存的アミノ酸置換又は２つ以上の保存的アミノ酸置換のみ異なる場合、それらの２つのペプチドは実質的に同一である。

一部の実施形態において、組換え核酸ターゲティングシステムは、１つ以上の精製タンパク質成分を含む。例えば、本システムは、精製ＴｎｉＡタンパク質、精製ＴｎｉＢタンパク質、精製ＴｎｉＱタンパク質、及び精製Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｋタンパク質）のうちの１つ以上を含み得る。本システムのタンパク質は、当該技術分野において公知の方法により精製することができる。特定の実施形態において、タンパク質成分には、発現、折り畳み、安定性、単離、検出などに役立つタグが含まれ得る。一部の実施形態において、タグはタンパク質のＣ末端に位置する。他の実施形態において、タグはタンパク質のＮ末端に位置する。他の実施形態において、タグはタンパク質内の内側部分に位置する。本明細書に開示されるタンパク質は、当該技術分野において公知の機能性タンパク質タグによってタグを付加することができる。例えば、Ｎ末端Ｈｉｓ－ＳＵＭＯタグを使用することができる。

一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｋタンパク質）の生化学が、１つ以上のアッセイを用いて分析される。一部の実施形態において、本開示のＣａｓタンパク質の生化学的特性は、実施例１及び２に記載されるとおり、インビトロで、ガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）及び標的ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ分子）と共にインキュベートした精製Ｃａｓタンパク質を使用して分析される。

特定の他の実施形態において、本明細書に記載される組換え核酸及び組換え核酸ターゲティングシステムは、Ｃａｓタンパク質とハイブリダイズしてｇＲＮＡ－Ｃａｓタンパク質複合体を形成する能力を有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。例えば、一部の実施形態において、本明細書に提供される組換え核酸及び組換え核酸ターゲティングシステムは、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態において、本明細書に提供される組換え核酸及び組換え核酸ターゲティングシステムは、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、又は１０個以上のガイドＲＮＡをコードする１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、又は１０個以上のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本明細書に提供されるガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている。特定の他の実施形態において、本明細書に提供されるガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、Ｕ６ ｓｎＲＮＡプロモーターに作動可能に連結されている。更に別の実施形態において、本明細書に提供されるガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、Ｊ２３１１９プロモーターに作動可能に連結されている。他の実施形態において、本明細書に提供されるガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、国際公開第２０１５０１３１１０１号パンフレット（参照によって本明細書に援用される）に記載されるとおりのＵ６ ｓｎＲＮＡプロモーターに作動可能に連結されている。別の実施形態において、本明細書に提供されるガイドＲＮＡは、単離されたＲＮＡである。特定の他の実施形態において、本明細書に提供されるガイドＲＮＡは、ベクター、プラスミド、又は細菌ベクターにコードされる。好ましい実施形態において、ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム関連ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列とトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列とを含む。本明細書に提供される特定の他の実施形態において、本明細書に提供されるガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡを含む。他の実施形態において、本明細書に提供されるガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。更に別の実施形態において、本明細書に提供されるガイドＲＮＡは、単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む。具体的な実施形態において、本明細書に提供される単鎖ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの両方を含む。他の実施形態において、本明細書に提供されるガイドＲＮＡは、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列、又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物を含む。一部の実施形態において、本明細書に提供されるガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡを含まない。

一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と複合体化し、及びｇＲＮＡ－Ｃａｓタンパク質複合体を標的核酸配列との配列特異的結合に仕向ける能力を有する。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と複合体化してｇＲＮＡ－Ｃａｓタンパク質複合体を形成する能力を有する。特定の好ましい実施形態において、ｇＲＮＡは、本明細書に記載されるとおりのＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｋタンパク質）を標的ポリヌクレオチドの特定の標的配列に仕向ける。当業者は、一部の実施形態において、ｇＲＮＡ配列が部位特異的であることを理解するであろう。即ち、一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、１つ以上の標的核酸配列（例えば、特異的ＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ配列）と特異的に会合し、非標的配列（例えば、非特異的ＤＮＡ又はランダム配列）とは会合しない。

一部の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの組成物は、本明細書に記載されるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｋ）と会合してＣａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチドの標的配列（例えば、ＤＮＡ）に仕向けるｇＲＮＡを含む。ｇＲＮＡは標的配列と会合して、Ｃａｓタンパク質及び／又は少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質の機能を改変し得る（例えば、Ｃａｓ１２ｋの親和性を、例えば、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又はそれ以上改変する）。

本明細書に記載されるｇＲＮＡは、標的配列の１つ以上のヌクレオチドを標的化し得る（例えば、それと会合し、それに仕向けられ、それと接触し、又はそれを結合し得る）。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼのトランスポザーゼ活性は、Ｃａｓタンパク質／ｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体の形成を受けて活性化する。

一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、スペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡのスペーサー配列は、概して、１６～２５ヌクレオチドの長さ（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５ヌクレオチド）を有し、且つ特異的核酸配列と相補的であるように設計されてもよい。一部の実施形態において、ｇＲＮＡのスペーサー配列は、概して、最長約３５ヌクレオチドまでの長さ（例えば、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５ヌクレオチド）を有し、且つ特異的核酸配列と相補的であるように設計されてもよい。一部の詳細な実施形態において、ｇＲＮＡは、例えば、ゲノム遺伝子座の、特異的ＤＮＡ鎖と相補的であるように設計されてもよい。一部の実施形態において、スペーサー配列は、特異的ＤＮＡ鎖、例えば、特異的ゲノム遺伝子座と相補的であるように設計される。

特定の実施形態において、ｇＲＮＡには、ある配列又はスペーサー配列に連結されたダイレクトリピート配列が含まれるか、又はｇＲＮＡはそれを含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡには、ダイレクトリピート配列及びスペーサー配列又はダイレクトリピート－スペーサー－ダイレクトリピート配列が含まれる。特定の実施形態において、ｇＲＮＡには、トランケート型ダイレクトリピート配列及びスペーサー配列が含まれ、これは、プロセシングされた、又は成熟したｃｒＲＮＡに典型的である。他の実施形態において、Ｃａｓタンパク質はｇＲＮＡと複合体を形成し、ｇＲＮＡが複合体をｇＲＮＡ配列の少なくとも一部分と相補的な部位特異的標的核酸と会合するように仕向ける。

一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、標的配列と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の相補性を有する配列、例えば、ＲＮＡ配列を含む。他の実施形態において、ｇＲＮＡは、ＤＮＡ配列と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％相補的な配列を含む。別の実施形態において、ｇＲＮＡは、ゲノム配列と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％相補的な配列を含む。更に他の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号５に示される配列と相補的な配列又はそれと少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の相補性を含む配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号５に示されるとおりの配列を含む。

一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムには、１個以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８個、又はそれ以上の）ｇＲＮＡ配列が含まれる。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、例えば国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット及び同第２０１５／０７００８３号パンフレット（これらの各々の内容全体は参照により本明細書に援用される）と同様の構成を有する。

一部の実施形態において、本明細書に記載されるとおりのＣａｓタンパク質とｇＲＮＡとは、複合体（例えば、リボ核タンパク質（ＲＮＰ））を形成する。一部の実施形態において、この複合体には、他の成分（例えば、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質）が含まれる。一部の実施形態において、複合体は、ｇＲＮＡ中の配列と相補性を有する標的配列に結合すると、活性化する。一部の実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）である。一部の実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である。他の実施形態において、配列特異性には、ｇＲＮＡ中の配列と標的配列とが完全に一致する必要がある。更に他の実施形態において、配列特異性には、ｇＲＮＡ中の配列と標的配列とが部分的に（連続して又は非連続的に）一致する必要がある。一部の実施形態において、この複合体は、標的配列に結合すると活性化するようになる。

特定の他の実施形態において、本明細書に記載されるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｋタンパク質）は、ｇＲＮＡと標的ポリヌクレオチドとの間の相補性領域によって定義される配列において標的配列に結合する。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣａｓタンパク質によって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が標的ポリヌクレオチドの標的配列のすぐ上流（例えば、標的配列のすぐ５’側）に位置する。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣａｓタンパク質によって認識されるＰＡＭ配列は、標的ポリヌクレオチドの非相補鎖（例えば、非標的鎖）のすぐ５’側に位置する。本明細書に記載される特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＰＡＭに隣接する配列を標的化し、ここでＰＡＭは、ヌクレオチド配列５’－ＧＧＴＴ－３’を含む。特定の実施形態において、ＰＡＭは、ヌクレオチド配列５’－ＧＴＮ－３’、５’－ＮＧＴＮ－３’、又は５’－ＧＧＴＮ－３’を含む。特定の実施形態において、ＰＡＭは、ヌクレオチド配列５’－ＧＧＴＴ－３’を含む。特定の実施形態において、ＰＡＭは、ヌクレオチド配列５’－ＧＴＴ－３’、５’－ＧＴＡ－３’、５’－ＧＴＣ－３’、又は５’－ＧＴＧ－３’を含む。特定の実施形態において、ＰＡＭは、５’－ＧＧＴＡ－３’、５’－ＧＧＴＣ－３’、又は５’－ＧＧＴＧ－３’を含む。本明細書で使用されるとき、「相補鎖」はＲＮＡガイドにハイブリダイズする。本明細書で使用されるとき、「非相補鎖」はＲＮＡに直接ハイブリダイズしない。

特定の実施形態において、標的ポリペプチドへの標的配列の挿入は、Ｃａｓ結合部位で起こる。他の実施形態において、挿入は、核酸分子上のＣａｓ結合部位より遠位の位置で起こる。一部の実施形態において、挿入は、Ｃａｓ結合部位から３’側にある位置、例えば、Ｃａｓ結合部位から３’側にある少なくとも約１塩基対（ｂｐ）、少なくとも約５ｂｐ、少なくとも約１０ｂｐ、少なくとも約１５ｂｐ、少なくとも約２０ｂｐ、少なくとも約３５ｂｐ、少なくとも約４０ｂｐ、少なくとも約４５ｂｐ、少なくとも約５０ｂｐ、少なくとも約５５ｂｐ、少なくとも約６０ｂｐ、少なくとも約６５ｂｐ、少なくとも約７０ｂｐ、少なくとも約７５ｂｐ、少なくとも約８０ｂｐ、少なくとも約８５ｂｐ、少なくとも約９０ｂｐ、少なくとも約９５ｂｐ、又は少なくとも約１００ｂｐで起こり得る。

一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質／ｇＲＮＡの結合により、標的配列への１つ以上の内因性細胞分子のアクセス又は経路が遮断され、それによって標的配列が修飾される。例えば、Ｃａｓタンパク質／ｇＲＮＡの結合により、内因性転写又は翻訳機構が遮断され、それによって標的核酸の発現が減少し得る。本明細書に記載されるＣａｓタンパク質をコードする核酸分子は、更にコドン最適化されてもよい。核酸は、細菌細胞など、特定の宿主細胞における使用に合わせてコドン最適化されてもよい。

一部の実施形態において、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質（例えばＴｎｉＡ、ＴｎｉＢ、及びＴｎｉＱ）のうちの少なくとも１つ、Ｃａｓ１２ｋ、及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む組換え核酸ターゲティングシステムを提供する。他の実施形態において、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質（例えば、ＴｎｉＡ、ＴｎｉＢ、及びＴｎｉＱ）のうちの少なくとも２つ、及びＣａｓ１２ｋ、及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む組換え核酸ターゲティングシステムを提供する。特定の他の実施形態において、本開示は、ＴｎｉＡ、ＴｎｉＢ、ＴｎｉＱ、Ｃａｓ１２ｋ、及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む組換え核酸ターゲティングシステムを提供する。本開示はまた、標的配列の配列特異的修飾のための組換え核酸ターゲティングシステムも提供する。一部の実施形態において、本開示のＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼシステムの生化学的特性が、実施例１に記載されるとおり、細菌細胞で分析される。

Ｃ．組換え核酸組成物及び組換え核酸ターゲティングシステム
本明細書に記載される組換え核酸組成物及び組換え核酸ターゲティングシステムは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｋタンパク質）、又はＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質、又は少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む。例えば、一部の実施形態において、本明細書に記載される組換え核酸組成物及び組換え核酸ターゲティングシステムは、Ｃａｓタンパク質、ＴｎｉＡ、ＴｎｉＢ、及びＴｎｉＱを含む。特定の実施形態において、本明細書に記載される組換え核酸組成物及び組換え核酸ターゲティングシステムは、Ｃａｓタンパク質、ＴｎｉＡ、ＴｎｉＢ、及びＴｎｉＱを含み、ここでＣａｓタンパク質、ＴｎｉＡタンパク質、ＴｎｉＢタンパク質、及びＴｎｉＱタンパク質のタンパク質配列のうちの１つは、Ｃａｓタンパク質、ＴｎｉＡタンパク質、ＴｎｉＢタンパク質、及びＴｎｉＱタンパク質についての、それぞれ配列番号１、２、３、及び４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。

特定の他の実施形態において、本明細書に記載される組換え核酸ターゲティングシステムは、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｋタンパク質）、ＴｎｉＡ、ＴｎｉＢ、及びＴｎｉＱのうちの１つ以上を含み、更に、トランスポゾン左末端（ＴＥ－Ｌ）をコードする少なくとも１つの核酸配列とトランスポゾン右末端（ＴＥ－Ｒ）をコードする核酸配列とを含む。一部の実施形態において、本明細書に記載される組換え核酸ターゲティングシステムは、ＴｎｉＡ並びにＴＥ－Ｌ及びＴＥ－Ｒを含む。一部の実施形態において、好ましいＴＥ－Ｌ及びＴＥ－Ｒは、組換え核酸ターゲティングシステムのＴｎｉＡによって決まる。例えば、一部の実施形態において、組換え核酸ターゲティングシステムは、配列番号２に記載されるとおりのＴｎｉＡ（即ち、配列番号２と少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９９％の配列同一性、又は約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴｎｉＡ）と、ＴＥ－Ｌ（即ち、配列番号６と少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９９％の配列同一性、又は約１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＴＥ－Ｌ）と、ＴＥ－Ｒ（即ち、配列番号７と少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９９％の配列同一性、又は約１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＴＥ－Ｒ）とを含む。特定の実施形態において、本明細書に記載される組換え核酸ターゲティングシステムは、ＴｎｉＡとドナーポリヌクレオチドとを含み、ここでドナーポリヌクレオチドは、標的配列への挿入のためのペイロード配列と、配列番号６に示される核酸配列と少なくとも９５％同一のＴＥ－Ｌ核酸配列と、配列番号７に示される核酸配列と少なくとも９５％同一のＴＥ－Ｒ核酸配列とを含む。

Ｄ．標的ポリヌクレオチド
本明細書に記載される組換え核酸ターゲティングシステムは、ｇＲＮＡにハイブリダイズする能力を有する標的配列を含む標的ポリヌクレオチドを更に含み得る。標的ポリヌクレオチドは、そこに転移因子が挿入される標的部位に相当するものであり得る。本明細書に記載される組換え核酸ターゲティングシステムの特定の実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列と、ｇＲＮＡにハイブリダイズする能力を有する標的配列とを含む。本明細書に記載されるとおり、「標的配列」は、ｇＲＮＡ配列が相補性を有する（又はそれを有するように設計される）配列を指す。標的配列とｇＲＮＡ中にあるその相補配列との間でのハイブリダイゼーションにより、Ｃａｓ／ｇＲＮＡ／標的配列複合体の形成が容易になる。他の実施形態において、本明細書に提供される標的ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている。更に他の実施形態において、本明細書に記載される標的ポリヌクレオチドは、５’－ＧＧＴＴ－３’を含むヌクレオチド配列のＰＡＭ配列を少なくとも含む。特定の実施形態において、ＰＡＭは、ヌクレオチド配列５’－ＧＴＮ－３’、５’－ＮＧＴＮ－３’、又は５’－ＧＧＴＮ－３’を含む。特定の実施形態において、ＰＡＭは、ヌクレオチド配列５’－ＧＧＴＴ－３’を含む。特定の実施形態において、ＰＡＭは、ヌクレオチド配列５’－ＧＴＴ－３’、５’－ＧＴＡ－３’、５’－ＧＴＣ－３’、又は５’－ＧＴＧ－３’を含む。特定の実施形態において、ＰＡＭは、５’－ＧＧＴＡ－３’、５’－ＧＧＴＣ－３’、又は５’－ＧＧＴＧ－３’を含む。一部の実施形態において、ＰＡＭは、５’ＰＡＭ配列であってもよい（即ち、プロトスペーサーの５’末端の上流に位置する）。標的ポリヌクレオチド配列は、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを含み得る。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質と、ｇＲＮＡと、１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質とを含む複合体が形成されると、標的ポリヌクレオチドの標的配列にある、又はその近傍にある（例えば、それから約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約２０、約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０塩基対又はそれ以上の範囲内にある）一方又は両方の鎖にドナーポリヌクレオチドの挿入が起こる。他の実施形態において、Ｃａｓタンパク質／ｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体と少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質とを含む複合体が形成されると、標的ポリヌクレオチドの標的配列にある、又はその近傍にある（例えば、それから１～１０塩基対、５～１５塩基対、１０～２０塩基対、１５～２５塩基対、２０～３０塩基対、２５～３５塩基対、３０～４０塩基対、３５～４５塩基対、４５～６０塩基対、４５～７０塩基対、４５～８０塩基対又はそれ以上の塩基対の範囲内にある）一方又は両方の鎖にドナーポリヌクレオチドの挿入が起こる。

Ｅ．ドナーポリヌクレオチド
本明細書に記載される組換え核酸ターゲティングシステムは、標的ポリヌクレオチドへの挿入のためのペイロード配列を含むドナーポリヌクレオチドを更に含み得る。ドナーポリヌクレオチドは、標的配列に組み込まれる能力を有する転移因子に相当するものであり得る。ドナーポリヌクレオチドは、ペイロード配列を含む任意の種類のポリヌクレオチド、例えば、遺伝子、遺伝子断片、非コードポリヌクレオチド、調節性ポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、及びその断片又は成分であってよい。より具体的には、本明細書に記載されるとおりの用語「ドナーポリヌクレオチド」は、本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ、又は方法を使用して標的核酸に挿入される能力を有するペイロード配列を含むポリヌクレオチド分子を指す。一部の実施形態において、本明細書に提供されるペイロード配列は、プロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、トランスポゾン左末端（ＴＥ－Ｌ）をコードする核酸配列と、トランスポゾン右末端（ＴＥ－Ｒ）をコードする核酸配列とを含む。用語「トランスポゾン末端配列」は、本明細書で使用されるとき、インビトロ又はインビボ転移反応を用いて決められたとおりの機能性を有する１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質と複合体を形成するのに必要なヌクレオチド配列を指す。ＴＥ－Ｒ及びＴＥ－Ｌ配列は、典型的には、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質によって認識される特徴である逆方向反復配列としてドナーポリペプチドのペイロード配列に隣接するものであり、ペイロード配列が標的ポリヌクレオチドの標的配列に挿入されるのを容易にする。一部の実施形態において、ＴＥ－Ｌは、配列番号６に示される核酸を含み、ＴＥ－Ｒは、配列番号７に示される核酸を含む。

特定の他の実施形態において、ドナーポリヌクレオチドのペイロード配列は、共組込み機構によって標的ポリヌクレオチドに挿入される。例えば、ドナーポリヌクレオチド及び標的ポリヌクレオチドにニックが入れられ、それらが融合してもよい。融合したドナーポリヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとの複製がポリメラーゼによって生成されてもよい。他の実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、カット・アンド・ペースト機構によって標的ポリヌクレオチドに挿入される。例えば、ドナーポリヌクレオチドが核酸分子に含まれてもよく、切り出されてその核酸分子の別の部分に挿入されてもよい。

Ｆ．ベクター
本開示は、本明細書に記載される組換え核酸及び／又は組換え核酸ターゲティングシステムを含む１つ以上のベクターを提供する。一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載される組換え核酸又は組換え核酸ターゲティングシステムの発現用の１つ以上のベクターを提供する。本明細書に提供されるベクターはまた、本明細書に記載されるとおりの標的ポリヌクレオチドの修飾方法においても使用される。一実施形態において、本明細書に提供されるベクターは、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質又はその機能性断片、及びＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｋタンパク質）をコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーターを含む。上記に記載される実施形態において、ベクターはまた、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターも含む。ベクターとしては、限定はされないが、一本鎖、二本鎖、又は部分的に二本鎖である核酸分子；１つ以上の自由端を含む、自由端を含まない（例えば環状の）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は両方を含む核酸分子；及び当該技術分野において公知の他の各種ポリヌクレオチドが挙げられる。一部の実施形態において、本明細書に記載されるベクターは、プラスミドである。用語「プラスミド」は、本明細書で使用されるとき、追加のＤＮＡセグメントを、例えば、標準的な分子クローニング技術を用いて挿入することのできる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。本明細書に記載される特定の実施形態において、ベクターは、それが作動可能に連結されている遺伝子の発現を仕向ける能力を有する「発現ベクター」である。典型的な発現ベクターは、本明細書に記載されるある種のベクターを含め、所望のポリヌクレオチドの発現に有用な転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、及びプロモーターを含む。天然又は合成ポリヌクレオチドの発現は、典型的には、天然又は合成ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドをプロモーターに作動可能に連結し、及びその構築物を発現ベクターに取り込むことによって実現する。詳細な一実施形態において、１つ以上の目的の遺伝子、例えば、ＴｎｉＡ、ＴｎｉＢ、ＴｎｉＱ、Ｃａｓ１２ｋをコードする１つ以上のポリヌクレオチドの発現は、典型的には、１つ以上の目的の遺伝子をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、例えば、ＴｎｉＡ、ＴｎｉＢ、ＴｎｉＱ、Ｃａｓ１２ｋをコードする１つ以上のポリヌクレオチドをプロモーターに作動可能に連結し、及びその構築物を発現ベクターに取り込むことによって実現する（例えば、本明細書に記載されるとおりのｐＥｆｆｅｃｔｏｒプラスミドＡ２を参照）。

詳細な実施形態において、本明細書に記載される組成物及びシステムの成分の１つ以上は、発現プラスミド上で発現させた。詳細な一実施形態において、本開示は、図１Ａに示されるとおりのｐＥｆｆｅｃｔｏｒプラスミドＡ２を提供する。別の実施形態において、ｐＥｆｆｅｃｔｏｒプラスミドＡ２は、Ｃａｓ１２ｋタンパク質、ＴｎｉＡタンパク質、ＴｎｉＢタンパク質、及びＴｎｉＱタンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。更に別の実施形態において、ｐＥｆｆｅｃｔｏｒプラスミドＡ２は、表１に示されるとおりのＣａｓ１２ｋタンパク質（配列番号１）、ＴｎｉＡタンパク質（配列番号２）、ＴｎｉＢタンパク質（配列番号３）、及びＴｎｉＱタンパク質（配列番号４）のアミノ酸配列並びにアンピシリン耐性タンパク質（ＡｍｐＲ）をコードするポリヌクレオチドを含む。

他の実施形態において、ｐＥｆｆｅｃｔｏｒプラスミドは、ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを更に含む。一実施形態において、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態において、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。更に別の実施形態において、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと、スペーサー配列とを含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列を含む。詳細な実施形態において、ｓｇＲＮＡ配列は、表１に示される配列番号５に示されるとおりのヌクレオチド配列を含む。配列番号５のスペーサー配列は、Ｎとして表される。

他の実施形態において、本開示は、ペイロード配列を含むｐＤｏｎｏｒプラスミドを提供する。詳細な一実施形態において、本開示は、図１Ｂに示されるとおりの、ペイロード配列及びカナマイシン耐性タンパク質のコード領域を含み、更に左（ＴＥ－Ｌ）及び右（ＴＥ－Ｒ）トランスポゾン末端の配列を含むｐＤｏｎｏｒプラスミドＢ２を提供する。詳細な実施形態において、ＴＥ－Ｌは、配列番号６（表１）に示されるとおりの核酸配列を含む。詳細な実施形態において、ＴＥ－Ｒは、配列番号７（表１）に示されるとおりの核酸配列を含む。

他の実施形態において、本開示は、標的配列を含むｐＴａｒｇｅｔプラスミドを提供する。詳細な一実施形態において、本開示は、図１Ｃに示されるとおりの、標的配列及びプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含むｐＴａｒｇｅｔプラスミドＣ２を提供する。別の実施形態において、ＰＡＭ配列は、ヌクレオチド配列５’－ＧＧＴＴ－３’を含む。特定の実施形態において、ＰＡＭは、ヌクレオチド配列５’－ＧＴＮ－３’、５’－ＮＧＴＮ－３’、又は５’－ＧＧＴＮ－３’を含む。特定の実施形態において、ＰＡＭは、ヌクレオチド配列５’－ＧＧＴＴ－３’を含む。特定の実施形態において、ＰＡＭは、ヌクレオチド配列５’－ＧＴＴ－３’、５’－ＧＴＡ－３’、５’－ＧＴＣ－３’、又は５’－ＧＴＧ－３’を含む。特定の実施形態において、ＰＡＭは、５’－ＧＧＴＡ－３’、５’－ＧＧＴＣ－３’、又は５’－ＧＧＴＧ－３’を含む。

一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載される組換え核酸及び／又は組換え核酸ターゲティングシステムを含む細胞を提供する。一部の実施形態において、細胞は、原核細胞である。特定の実施形態において、細胞は、細菌細胞又は細菌細胞に由来する細胞である。他の実施形態において、本明細書に記載される組換え核酸及び／又は組換え核酸ターゲティングシステムの発現用の１つ以上の核酸、プラスミド、及び／又はベクターは、細菌細胞に導入される。別の実施形態において、本明細書に提供される核酸、プラスミド、及び／又はベクターは、細菌細胞に形質転換される。細菌細胞における発現に典型的に適している核酸、プラスミド、及び／又はベクターは、適切に選択することができる。本明細書に記載される１つ以上の核酸、プラスミド、及び／又はベクターを導入する技法としては、限定はされないが、熱ショック及び電気穿孔が挙げられ、当業者に周知の技法である。一部の実施形態において、細菌細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。一部の実施形態において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、ｐｉｒ－１１６Ｄ株（例えば、ＰＩＲ１）である。一実施形態において、ｐＥｆｆｅｃｔｏｒプラスミドＡ２は、細菌細胞に導入される。別の実施形態において、ｐＤｏｎｏｒプラスミドＢ２は、細菌細胞に導入される。更に別の実施形態において、ｐＴａｒｇｅｔプラスミドＣ２は、細菌細胞に導入される。好ましい実施形態において、ｐＥｆｆｅｃｔｏｒプラスミドＡ２、ｐＤｏｎｏｒプラスミドＢ２及びｐＴａｒｇｅｔプラスミドＣ２は、同じ細菌細胞に導入される。別の実施形態において、ｐＥｆｆｅｃｔｏｒプラスミドＡ２、ｐＤｏｎｏｒプラスミドＢ２及びｐＴａｒｇｅｔプラスミドＣ２は、同じ細菌細胞に同時に導入される。別の実施形態において、ｐＥｆｆｅｃｔｏｒプラスミドＡ２、ｐＤｏｎｏｒプラスミドＢ２及びｐＴａｒｇｅｔプラスミドＣ２は、同じ細菌細胞に逐次的に導入される。

一部の実施形態において、本明細書に提供される核酸、プラスミド、及び／又はベクターは、核酸、プラスミド、及び／又はベクターを含む細胞の同定及び選択を容易にする選択可能なマーカー遺伝子及び／又はレポーター遺伝子を更に含む。選択可能なマーカー及びレポーター遺伝子には、両方ともに、細胞における発現を可能にするための適切な転写制御配列が隣接し得る。好適な選択可能なマーカーの例としては、適切な抗生物質耐性タンパク質、例えば、アンピシリン耐性タンパク質、カナマイシン耐性タンパク質などをコードする核酸配列が挙げられる。かかる選択マーカーを使用することにより、本明細書に記載される組換え核酸及び／又は組換え核酸ターゲティングシステムを含む核酸、プラスミド、及び／又はベクターの取込みの成功を、抗生物質の存在下における細胞の生存によって確認することができる。好適なレポーター遺伝子の例としては、蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などをコードする核酸配列が挙げられる。かかるレポーター遺伝子を使用することにより、本明細書に記載される核酸、プラスミド、及び／又はベクターの取込みの成功を、蛍光タンパク質の発現の観察によって確認することができる。

Ｇ．標的ポリヌクレオチドの修飾方法
本開示は、細菌細胞における標的ポリヌクレオチドの修飾方法であって、細菌細胞に、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質又は少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｋタンパク質）又はＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとを含む第１の組換え核酸；標的ポリヌクレオチドを含む第２の組換え核酸；及びドナーポリヌクレオチドを含む第３の組換え核酸を導入することを含む方法を更に提供する。

本明細書に記載される組換え核酸は、細菌細胞又は細菌細胞集団に、本明細書に記載される組換え核酸をコードする核酸配列を含む１つ以上の送達ポリヌクレオチド（例えば、プラスミド）を形質転換することによって導入されてもよい。本明細書に記載される組換え核酸をコードする核酸配列は、それらの核酸配列から、細菌細胞又は細菌細胞集団におけるタンパク質及び核酸の発現を制御する１つ以上の調節配列（例えば、プロモーター）に作動可能に連結されているとき発現し得る。本明細書に記載される組換え核酸は、同じ送達ポリヌクレオチド上に、個別の送達ポリヌクレオチド上に、又はこれらの組み合わせにコードされてもよい。一部の実施形態において、送達ポリヌクレオチドは、ベクターであってもよい。他の実施形態において、送達ポリヌクレオチドは、プラスミドである。更に他の実施形態において、送達ポリヌクレオチドは、プラスミドであるか、又はベクターとプラスミドとの組み合わせである。例示的ベクター及びプラスミドは本明細書に提供され、記載される。

特定の実施形態において、本開示は、細菌細胞における標的ポリヌクレオチドの修飾方法であって、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質をコードする組換え核酸を導入することを含む方法を提供し、ここで少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質をコードする組換え核酸は、少なくとも１つの異種プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）に作動可能に連結されている。一部の実施形態において、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質は、細菌細胞において、少なくとも１つの異種プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）に作動可能に連結された少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を発現させることにより提供される。他の実施形態において、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質は、細菌細胞に、少なくとも１つの異種プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）に作動可能に連結された少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質をコードするＤＮＡ分子を含むプラスミドを形質転換することにより提供される。特定の他の実施形態において、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質は、細菌細胞に、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質をコードするＲＮＡ分子を含む組成物を導入することにより提供される。

一部の実施形態において、本明細書に提供される細菌細胞における標的ポリヌクレオチドの修飾方法は、細菌細胞に、ＴｎｉＡタンパク質、ＴｎｉＢタンパク質、及びＴｎｉＱタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質をコードする組換え核酸を導入することを含む。他の実施形態において、本明細書に提供される方法は、細菌細胞に、ＴｎｉＡタンパク質、ＴｎｉＢタンパク質、及びＴｎｉＱタンパク質からなる群から選択される少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入することを含む。更に別の実施形態において、本明細書に提供される方法は、細菌細胞に、ＴｎｉＡタンパク質、ＴｎｉＢタンパク質、及びＴｎｉＱタンパク質からなる群から選択される３つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入することを含む。一部の実施形態において、本明細書に提供される方法は、細菌細胞に、配列番号２に示されるとおりのアミノ酸配列を含むＴｎｉＡタンパク質と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％、又は少なくとも約９９．５％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入することを含む。他の実施形態において、本明細書に提供される方法は、細菌細胞に、配列番号２に示されるとおりのアミノ酸配列を含むＴｎｉＡタンパク質と約１００％同一のアミノ酸配列を含むＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入することを含む。特定の他の実施形態において、本明細書に提供される方法は、細菌細胞に、配列番号３に示されるとおりのアミノ酸配列を含むＴｎｉＢタンパク質と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は少なくとも約９９．５％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入することを含む。別の実施形態において、本明細書に提供される方法は、細菌細胞に、配列番号３に示されるとおりのアミノ酸配列を含むＴｎｉＢタンパク質と約１００％同一のアミノ酸配列を含むＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入することを含む。特定の他の実施形態において、本明細書に提供される方法は、細菌細胞に、配列番号４に示されるとおりのアミノ酸配列を含むＴｎｉＱタンパク質と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は少なくとも約９９．５％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入することを含む。他の実施形態において、本明細書に提供される方法は、細菌細胞に、配列番号４に示されるとおりのアミノ酸配列を含むＴｎｉＱタンパク質と約１００％同一のアミノ酸配列を含むＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入することを含む。

特定の実施形態において、本開示は、細菌細胞における標的ポリヌクレオチドの修飾方法であって、細菌細胞に、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質及びＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｋ）をコードする組換え核酸を導入することを更に含む方法を提供し、ここで少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質及びＣａｓタンパク質をコードする組換え核酸は、少なくとも１つの異種プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）に作動可能に連結されている。一部の実施形態において、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ及びＣａｓタンパク質は、細菌細胞において、各々が独立に少なくとも１つの異種プロモーターに作動可能に連結された、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼをコードする組換えＤＮＡ分子及びＣａｓタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を発現させることにより提供される。一部の実施形態において、本明細書に提供される方法は、細菌細胞に、配列番号１に示されるとおりのＣａｓ１２ｋタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．５％又はそれ以上の配列同一性を含むアミノ酸配列を含むＣａｓタンパク質をコードする組換え核酸を導入することを含む。特定の他の実施形態において、本明細書に提供される方法は、細菌細胞に、配列番号１に示されるとおりのアミノ酸配列を含むＣａｓ１２ｋタンパク質のアミノ酸配列と約１００％の配列同一性であるアミノ酸配列を含むＣａｓタンパク質をコードする組換え核酸を導入することを含む。

特定の実施形態において、本開示は、細菌細胞における標的ポリヌクレオチドの修飾方法であって、細菌細胞に、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｋ）、及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする組換え核酸を導入することを含む方法を提供し、ここで少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質及びＣａｓタンパク質をコードする組換え核酸は、異種プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）に作動可能に連結されており、及びここでｇＲＮＡをコードする組換え核酸は、異なる異種プロモーター（例えば、Ｊ２３１１９プロモーター）に作動可能に連結されている。一部の実施形態において、本開示は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｋ）、及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を２つ以上のプラスミド上にコードする組換え核酸の細菌細胞への導入方法を提供する。特定の好ましい実施形態において、本開示は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｋ）、及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をシングルプラスミド上にコードすることを含む組換え核酸の細菌細胞への導入方法を提供する。詳細な実施形態において、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｋ）、及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、図１Ａに示されるとおりのシングルプラスミド（ｐＥｆｆｅｃｔｏｒプラスミドＡ２）上にコードされる。他の実施形態において、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｋ）、及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、予め形成されたリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として細菌細胞に導入される。更に別の実施形態において、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、予め形成されたリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として細菌細胞に導入され、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質をコードする組換え核酸として細菌細胞に導入される。

一部の実施形態において、本明細書に提供される方法は、細菌細胞に、ｇＲＮＡ配列をコードする組換え核酸を導入することを含み、ここでｇＲＮＡ配列は、標的ポリヌクレオチドの標的配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％又はそれ以上相補的である。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、ＤＮＡ配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％又はそれ以上相補的である配列を含む。特定の他の実施形態において、ｇＲＮＡは、ゲノム配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％ 少なくとも約９９．５％又はそれ以上又はそれ以上相補的な配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号５に示される配列と相補的な配列又は少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％又はそれ以上の相補性を含む配列を含む。本明細書に記載される方法の一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号５に示されるとおりの配列を含む。

特定の実施形態において、本方法は、細菌細胞に、標的ポリヌクレオチドを含む組換え核酸を導入することを更に含み、ここで標的ポリヌクレオチドは、ｇＲＮＡにハイブリダイズする能力を有する標的配列を含み、及びプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含む。特定の実施形態において、標的配列は、異種プロモーター（例えば、ｃａｔプロモーター）に作動可能に連結されている。他の実施形態において、ＰＡＭ配列は、５’－ＧＧＴＴ－３’を含むヌクレオチド配列である。特定の実施形態において、ＰＡＭは、ヌクレオチド配列５’－ＧＴＮ－３’、５’－ＮＧＴＮ－３’、又は５’－ＧＧＴＮ－３’を含む。特定の実施形態において、ＰＡＭは、ヌクレオチド配列５’－ＧＧＴＴ－３’を含む。特定の実施形態において、ＰＡＭは、ヌクレオチド配列５’－ＧＴＴ－３’、５’－ＧＴＡ－３’、５’－ＧＴＣ－３’、又は５’－ＧＴＧ－３’を含む。特定の実施形態において、ＰＡＭは、５’－ＧＧＴＡ－３’、５’－ＧＧＴＣ－３’、又は５’－ＧＧＴＧ－３’を含む。別の実施形態において、本開示は、細菌細胞における標的ポリヌクレオチドの修飾方法であって、細菌細胞に、シングルプラスミドを使用して標的ポリペプチドを導入することを含む方法を提供する。詳細な実施形態において、シングルプラスミドは、図１Ｃに示されるとおりのｐＴａｒｇｅｔプラスミドＣ２である。

特定の実施形態において、本方法は、細菌細胞に、ドナーポリヌクレオチドを含む組換え核酸を導入することを更に含む。好ましい実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの標的配列への挿入のためのペイロード配列を含む。別の実施形態において、ペイロード配列は、異種プロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、トランスポゾン左末端（ＴＥ－Ｌ）をコードする核酸配列とトランスポゾン右末端（ＴＥ－Ｒ）をコードする核酸配列とを更に含む。具体的な実施形態において、ＴＥ－Ｌ及びＴＥ－Ｒ配列は、それぞれ配列番号６及び配列番号７に示されるとおりのＴＥ－Ｌ及びＴＥ－Ｒの核酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約９９．５％又はそれ以上同一である。一部の実施形態において、ＴＥ－Ｌは、配列番号６に示されるとおりの核酸を有し、ＴＥ－Ｒは、配列番号７に示されるとおりの核酸を有する。特定の実施形態において、本開示は、細菌細胞における標的ポリヌクレオチドの修飾方法であって、細菌細胞に、シングルプラスミドを使用してドナーポリペプチドを導入することを含む方法を提供する。詳細な実施形態において、シングルプラスミドは、図１Ｂに示されるとおりのｐＤｏｎｏｒプラスミドＢ２である。

一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、細菌細胞に、本明細書に記載されるとおりの、（ｉ）少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｉｉ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドを含む第１の組換え核酸；標的ポリヌクレオチドを含む第２の組換え核酸；及びドナーポリヌクレオチドを含む第３の組換え核酸を導入することにより、標的ポリヌクレオチドを修飾することを含む。一部の実施形態において、第１の組換え核酸、第２の組換え核酸及び第３の組換え核酸は、細菌細胞に同時に導入される。特定の他の実施形態において、第１の組換え核酸、第２の組換え核酸及び第３の組換え核酸は、細菌細胞に逐次的に導入される。更に別の実施形態において、本明細書に記載される方法は、細菌細胞に、上記に記載される第１の組換え核酸、第２の組換え核酸及び第３の組換え核酸の各々を独立に導入することにより、標的ポリヌクレオチドを修飾することを含む。特定の他の実施形態において、本明細書に記載される方法は、細菌細胞に、図１Ａに示されるとおりのｐＥｆｆｅｃｔｏｒプラスミドＡ２、図１Ｂに示されるとおりのｐＤｏｎｏｒプラスミドＢ２及び図１Ｃに示されるとおりのｐＴａｒｇｅｔプラスミドＣ２を導入することにより、標的ポリヌクレオチドを修飾することを含む。好ましい実施形態において、細菌細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。他の実施形態において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、ｐｉｒ－１１６Ｄ株からの細胞（例えばＰＩＲ１）である。他の実施形態において、ｐＥｆｆｅｃｔｏｒプラスミドＡ２、ｐＤｏｎｏｒプラスミドＢ２及びｐＴａｒｇｅｔプラスミドＣ２は、同じ細菌細胞に同時に導入される。他の実施形態において、ｐＥｆｆｅｃｔｏｒプラスミドＡ２、ｐＤｏｎｏｒプラスミドＢ２及びｐＴａｒｇｅｔプラスミドＣ２は、同じ細菌細胞に逐次的に導入される。本明細書に開示される方法は、当業者に公知のシーケンシング解析（例えば、ｎｅｘｔｓｅｑ ＮＧＳシーケンシング）及び／又はバイオインフォマティクス解析（例えば、多重配列アラインメント）を用いた標的ポリヌクレオチドに導入された修飾の同定及び標的ポリヌクレオチドへのペイロード配列に対する％組込み率の決定を更に提供する。

一部の実施形態において、本明細書に記載される方法には、本明細書に記載されるとおりの少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼタンパク質、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｋタンパク質）及びｇＲＮＡを標的配列に結合させて前記標的配列へのドナーポリペプチドの挿入を容易にすることであって、それによって標的配列を修飾することにより、標的ポリヌクレオチドを修飾することを含む方法が含まれる。別の実施形態において、本開示は、本明細書に記載される組換え核酸ターゲティングシステムを使用して細菌細胞の遺伝子座を修復する方法を更に提供する。別の実施形態において、本開示は、細菌細胞における標的ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を修飾する方法を提供し、ここでこの方法は、インビボ方法、エキソビボ方法又はインビトロ方法である。

本明細書に引用される全ての参考文献及び刊行物は、本明細書によって参照により援用される。

以下の例は、本開示の特定の実施形態を更に説明するために提供されるが、本開示の範囲を限定することは意図されない。その例示的性質から、当業者に公知の他の手順、方法論、又は技法を代わりに用い得ることが理解されるであろう。

実施例１－大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるトランスポザーゼ活性の決定
本実施例は、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスシステムを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に導入することによるトランスポザーゼ活性の試験について記載する。

４つのタンパク質、Ｃａｓ１２ｋ、ＴｎｉＡ、ＴｎｉＢ、及びＴｎｉＱを各々、本明細書において「ｐＥｆｆｅｃｔｏｒプラスミドＡ２」と称されるプラスミドにクローニングした。ｐＥｆｆｅｃｔｏｒプラスミドＡ２の概略図は図１Ａに示し、Ｃａｓ１２ｋ、ＴｎｉＡ、ＴｎｉＢ、及びＴｎｉＱタンパク質のアミノ酸配列は表１に示す。ｐＥｆｆｅｃｔｏｒプラスミドＡ２は、ターゲティング配列（例えば、スペーサー）を含有するシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列を更に含む。配列番号５のｓｇＲＮＡ配列では、スペーサー配列はＮとして表される。

本明細書に記載される組換え核酸ターゲティングシステムの細菌活性を試験するため、試験ペイロードとトランスポゾン末端とを含むプラスミド（本明細書において「ｐＤｏｎｏｒプラスミドＢ２」と称される）及び指定される標的配列を含むプラスミド（本明細書において「ｐＴａｒｇｅｔプラスミドＣ２」と称される）もまたクローニングした。ｐＤｏｎｏｒプラスミドＢ２の概略図を図１Ｂに示し、左末端及び右末端の配列を表１に示す。ｐＴａｒｇｅｔプラスミドＣ２は、ｐＥｆｆｅｃｔｏｒプラスミドＡ２中のｓｇＲＮＡのターゲティング配列と一致する特異的標的部位及び上流ＧＧＴＴ配列を含有する低コピー数細菌プラスミドであった（図１Ｃ）。ｐＴａｒｇｅｔプラスミドＣ２に標的部位を導入し、これは、ｐＴａｒｇｅｔプラスミドＣ２へのクローニング用の制限酵素部位が両側に隣接する特異的標的配列を有する合成ＤＮＡ配列として合成した。

標的及びｓｇＲＮＡ配列を２つのオーバーラップオリゴでＰＣＲ増幅し、鋳型ＤＮＡとして使用した。ＰＣＲアンプリコンは、目的の配列の両側に２つのユニークなＢｓａＩ切断部位が隣接するように設計した。ｐＥｆｆｅｃｔｏｒプラスミドＡ２及びｐＴａｒｇｅｔプラスミドＣ２に、対応する部位が存在した。次にＰＣＲアンプリコン及び関連するｐＥｆｆｅｃｔｏｒプラスミドＡ２又はｐＴａｒｇｅｔプラスミドＣ２を本明細書に記載される部位で切断し、標準的な分子生物学クローニング技術を用いて一緒にライゲートした。

ライゲートしたｐＥｆｆｅｃｔｏｒプラスミドＡ２及びｐＴａｒｇｅｔプラスミドＣ２を化学的にコンピテントな細菌細胞株に熱ショックによって形質転換し、カルベニシリン（ｐＥｆｆｅｃｔｏｒプラスミドＡ２用の抗生物質耐性マーカー）又はクロラムフェニコール（ｐＴａｒｇｅｔプラスミドＣ２用の抗生物質耐性マーカー）を含有するＬＢ寒天プレートに播き、３７℃で一晩インキュベートした。次に個々のコロニーをピッキングし、カルベニシリン（ｐＥｆｆｅｃｔｏｒ）又はクロラムフェニコール（ｐＴａｒｇｅｔ）を含有する２～５ｍＬのＬＢで約１２～１６時間成長させ、市販のキットを使用してミニプレップ精製した。精製したプラスミドをＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングを用いて配列検証した。

ｐＥｆｆｅｃｔｏｒプラスミドＡ２、ｐＤｏｎｏｒプラスミドＢ２、及びｐＴａｒｇｅｔプラスミドＣ２を１０ｎｇ／μＬに標準化し、次に各２μＬ（２０ｎｇ）を等量で合わせ、次にエレクトロコンピテントなＰＩＲ１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に共形質転換した。３７℃で１時間、振盪しながら増殖させた後、カナマイシン、カルベニシリン、及びクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天バイオアッセイプレートに細胞を播き、３７℃で１６時間インキュベートした。次にプレートから細胞を回収し、プラスミドＤＮＡをミニプレップ精製した。

ミニプレップ精製したプラスミドＤＮＡを約１ｎｇ／ｕｌに標準化し、Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡライブラリ調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、関連するＴａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ及びＰＣＲプロトコルに従いシーケンシング用に調製した。ＰＣＲ後、試料を合わせ、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用したゲル抽出により精製して、３５０～５００ｂｐ長の断片を選択した。精製したＤＮＡをＮｅｘｔＳｅｑ ５５０シーケンサーにロードし、１５０ Ｍｉｄキット（ｖ２．５）によるいずれかの２×７５ペアエンドプロトコルを使用してシーケンシングした。

シーケンシングリードをデマルチプレックス化して、試料毎の個々のｆａｓｔｑファイルを作成した。各ペアエンドリードの最初の５０ヌクレオチドを、ｐＤｏｎｏｒプラスミドＢ２、ｐＴａｒｇｅｔプラスミドＣ２、及びｐＥｆｆｅｃｔｏｒプラスミドＡ２と別個にアラインメントした。２つのペアエンドリードが別個のｐＤｏｎｏｒプラスミドＢ２及びｐＴａｒｇｅｔプラスミドＣ２に別個にアラインメントしたインスタンスは、可能性のある転移イベントに相当し、それらの「トランスリード」を追跡し、分析した。リードがｐＤｏｎｏｒプラスミドＢ２及びｐＥｆｆｅｃｔｏｒプラスミドＡ２にアラインメントするインスタンスもまた陰性対照として追跡し、分析した。次に２つの末端の位置をプロットして、標的部位近傍に標的化された形で転移が起こっているかどうかを決定した。本明細書に記載される組換え核酸ターゲティングシステムに特異的である転移イベントは、トランスポザーゼ末端にマッピングされ、標的配列の近傍に位置するものと思われた。

図２は、ｐＴａｒｇｅｔにおけるペイロード挿入イベントについてマッピングしたトランスリードを示す。ｘ軸及びｙ軸は、それぞれｐＴａｒｇｅｔプラスミドＣ２及びｐＤｏｎｏｒプラスミドＢ２とのアラインメント位置を表し、ここでは各点が、一方の末端がｐＤｏｎｏｒプラスミドＢ２にアラインメントし、他方の末端がｐＴａｒｇｅｔプラスミドＣ２にアラインメントするペアエンドリードである。縦軸及び横軸に沿ったヒストグラムは、それぞれｐＤｏｎｏｒプラスミドＢ２又はｐＴａｒｇｅｔプラスミドＣ２とアラインメントするペアエンドリードの一方におけるリード数を表示する。「ＴＥ－Ｌ」又は「ＴＥ－Ｒ」と示される網掛け領域は、それぞれトランスポゾン左末端及びトランスポゾン右末端を表し、これらはペイロード配列の外縁（配列位置１２３７～２８２１の間）を画成する。「標的」と示される網掛け領域は、ｐＴａｒｇｅｔプラスミドＣ２内で転移の標的となる配列を表す。

図２に示されるとおり、ｙ軸上のＴＥ－Ｌ領域の間及びｘ軸上の標的領域の左（上流）並びにｙ軸上のＴＥ－Ｒ領域内及び標的領域の右に、点のクラスターが２つ見出された。これは、最終産物が（順番に）：標的配列、トランスポゾン左末端（ＴＥ－Ｌ）、及びトランスポゾン右末端（ＴＥ－Ｒ）で終わるような決まった向きでペイロードが挿入されたことを示すものであった。

本システムの組込み効率を決定するため、シスリード（両方のペアエンドリードが同じプラスミドにアラインメントした）及びトランスリード（ペアエンドリードが別個のプラスミドにアラインメントした）を、標的配列から４００ヌクレオチド以内でｐＴａｒｇｅｔプラスミドＣ２にアラインメントしたもののみが含まれるようにフィルタリングした。次に、これらのフィルタを通過したトランスリードの数をカウントし、これらの条件を満たすリードの総数で除して、組込み率を求めた。そうすることで、本明細書に記載される組換え核酸ターゲティングシステムによる組込み率は６５．６％±２．５％であることが分かった。挿入は、標的配列の５’側から４０～６０ｂｐ下流で起こった。ｐＴａｒｇｅｔの代わりに、ｐＥｆｆｅｃｔｏｒ（陰性対照）への挿入イベントは観察されなかった。

このように、本実施例は、本明細書に記載される組換え核酸ターゲティングシステムが、決められたペイロード配列を特異的な位置に特異的な向きで挿入することにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で活性であったことを示している。

実施例２－トランスポザーゼ活性のインビトロ分析
この例は、本明細書に記載される組換え核酸ターゲティングシステムの活性に必要な最小成分についてのインビトロ検証を記載する。

Ｎ末端Ｈｉｓ－ＳＵＭＯタグを有する本明細書に記載される組換え核酸ターゲティングシステム中の各タンパク質をコードするプラスミドを設計し、複数断片のギブソンアセンブリによって作成する。Ｃａｓ１２ｋ、ＴｎｉＡ、ＴｎｉＢ、及びＴｎｉＱタンパク質の各々をＴ７プロモーターのすぐ下流に置き、高コピー数複製起点及び選択用アンピシリン耐性カセットを提供する。ギブソンアセンブリ反応用の断片を実施例１に記載されるプラスミドのＰＣＲによって作成するか、又はＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）に合成ＤＮＡとして注文する。次にアセンブルしたプラスミドを化学的にコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換し、カルベニシリンを含有するＬＢ寒天上に置く。単一のコロニーを成長させて、ミニプレップし、実施例１に記載されるとおり配列検証する。

これらのプラスミドを化学的にコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換し、カルベニシリン含有ＬＢ寒天プレート上で一晩成長させて新鮮なコロニーを作り出す。次に１つ又は複数のコロニーをカルベニシリン含有のＬＢに接種し、振盪インキュベーターにて３７℃で一晩成長させる。次にこのスターター培養物を１ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃブロスで１０００倍希釈し、振盪インキュベーターにて０．４～１．０の光学濃度に達するまで成長させる。ＩＰＴＧ（２００ｎＭ～１ｕＭ最終濃度）を加えることによって目的のタンパク質の発現を誘導し、細胞を引き続き１８～２０℃で振盪しながら一晩成長させる。次に細胞をペレット化する。

５０ｍＭトリス－ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、１４．３ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１ｍＭ ＤＴＴ、５％グリセロール、及びｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害薬カクテル（Ｓｉｇｍａ）の１×希釈液を含む緩衝液に４℃で細胞ペレットを再懸濁する。細胞を溶解させて、氷上で保存する。４℃で３０分間の１８，０００ｒｐｍでの遠心を２ラウンド行うことによって細胞デブリを取り除き、続いて上清を回収する。次に精製後のライセートを高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）により精製する。目的のタンパク質を含有する画分をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により同定し、一緒にしてプールする。

約４００ＵのＳＵＭＯプロテアーゼ１（ＬｉｆｅＳｅｎｓｏｒｓ又はＬｕｃｉｇｅｎ）をプール画分と合わせ（Ｎ末端Ｈｉｓ－ＳＵＭＯタグの切断用）、適切な分子量カットオフのＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（商標）Ｇ２透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、５０ｍＭトリス－ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、１４．３ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１ｍＭ ＤＴＴ、及び５％グリセロールを含む３Ｌの緩衝液で試料を４℃で一晩透析する。次に試料をＦＰＬＣにより精製し、フロースルーを回収する。目的のタンパク質を含有する画分をＰＡＧＥにより同定し、一緒にしてプールする。次にプールした画分を濃縮し、サイズ排除により精製し、目的のタンパク質を含有する画分を合わせる。タンパク質濃度を紫外可視分光法により決定する。最終的な緩衝液は、５０ｍＭトリス－ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１４．３ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１ｍＭ ＤＴＴ、及び１５％グリセロールを含む。一次配列に基づきタンパク質消衰係数を計算する。

Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流にあるｓｇＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ鋳型を、ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２×ＰＣＲマスターミックス（ＮＥＢ）を使用してＰＣＲ増幅により調製する。ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７高収率ＲＮＡ合成キット（ＮＥＢ）、続いてＮＥＢ標準ＲＮＡ合成プロトコルを使用してＴ７転写を実施する。転写反応は３７℃で２～１６時間進行させておく。ＴＵＲＢＯ ＤＮアーゼ緩衝液（１×最終濃度）及びＴＵＲＢＯ ＤＮアーゼ（０．０２～０．２Ｕ／ｕｌ最終濃度；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えることによってＤＮＡ鋳型を取り除く。ＤＮアーゼ反応は３７℃で１５～３０分間実施する。ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ Ｋｉｔ－２５（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用してＲＮＡを精製する。ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）２０００ｃ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）又はＱｕｂｉｔ（商標）３蛍光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とＱｕｂｉｔ ＲＮＡ ＨＳアッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による紫外可視分光法により、最終的なＲＮＡ収率を決定する。ＲＮＡ一次配列に基づき消衰係数を推定する。

Ｃａｓ１２ｋ、ＴｎｉＡ、ＴｎｉＢ、及びＴｎｉＱタンパク質の精製したものの各々を２μＭの濃度となるように１×タンパク質希釈緩衝液（２５ｍＭトリス ｐＨ８、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、２５％グリセロール）に希釈する。１５ｍＭ ＭｇＯＡｃ_２を補足した反応緩衝液（例えば、２６ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、４．２ｍＭトリス ｐＨ８、５０μｇ／ｍＬ ＢＳＡ、２ｍＭ ＡＴＰ、２．１ｍＭ ＤＴＴ、０．０５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２８ｍＭ ＮａＣｌ、２１ｍＭ ＫＣｌ、１．３５％グリセロール、ｐＨ７．５）中、５０ｎＭの最終濃度のＣａｓ１２ｋ、ＴｎｉＡ、ＴｎｉＢ、及びＴｎｉＱタンパク質の各々、２０ｎｇのｐＴａｒｇｅｔ、１００ｎｇのｐＤｏｎｏｒ、及び６００ｎＭの最終濃度のＲＮＡを使用して、インビトロ組込みアッセイを実施する。総反応容積は２０μＬであり、反応物は３７℃で２時間インキュベートする。

インキュベーション後、試料中の核酸をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを使用して精製し、１２μＬの最終容積の水に溶出する。Ｑｕａｎｔ ｉＴ Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡアッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、精製した試料中のＤＮＡの濃度を定量化する。定量化後、全ての試料で続く分析に同量の入力ＤＮＡが用いられるように、試料中のＤＮＡ含有量を標準化する。

次に、標準化した試料を一組の２つのプライマー：ｐＴａｒｇｅｔに特異的な１つとｐＤｏｎｏｒに特異的な１つとを使用したＰＣＲで組込みに関して試験する。結果として得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分析する。次に、転移について予想されるサイズのＰＣＲ産物をサンガーシーケンシングにより更に分析して、転移を確認する。ＰＣＲ鋳型材料もまた、実施例１に記載される非アンカリングＮｅｘｔｅｒａ法を用いて分析し、組込みレベルを測定する。ｉ）Ｃａｓ１２ｋの非存在下、ｉｉ）ＲＮＡ成分の非存在下、ｉｉｉ）正しい標的部位を欠くｐＴａｒｇｅｔ、及びｉｖ）ノンターゲティングＲＮＡ成分で追加の対照反応を含めることにより、組込みのプログラム化可能性について試験する。

このインビトロ組込み反応を用いてまた、本明細書に記載される組換え核酸ターゲティングシステムの活性に必要な種々の条件も分析することができる。かかる実験の一つは、ＲＮＡガイドに関して異なる配列を試験することである。他の実験では、ペイロード配列内のトランスポザーゼ末端の最小要件及びペイロードサイズが転移効率に及ぼす効果の決定が実施される。

Claims (46)

1. 第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーターと第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターとを含む組換え核酸であって、
   前記第１のポリヌクレオチドが、
   ＴｎｉＡタンパク質、又はその機能性断片をコードする核酸配列、ＴｎｉＢタンパク質、又はその機能性断片をコードする核酸配列、及びＴｎｉＱタンパク質、又はその機能性断片をコードする核酸配列と、
   ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする核酸配列であって、前記Ｃａｓタンパク質が配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、核酸配列と
   を含み；
   前記第２のポリヌクレオチドが、
   ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸配列であって、前記ｇＲＮＡが標的配列とハイブリダイズする能力を有する、核酸配列
   を含む、
   組換え核酸。
2. 前記ＴｎｉＡタンパク質が、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換え核酸。
3. 前記ＴｎｉＢタンパク質が、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換え核酸。
4. 前記ＴｎｉＱタンパク質が、配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換え核酸。
5. 前記ＴｎｉＡタンパク質が、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＴｎｉＢタンパク質が、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、及び前記ＴｎｉＱタンパク質が、配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換え核酸。
6. 前記ｇＲＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質と複合体化してｇＲＮＡ－Ｃａｓタンパク質複合体を形成する能力を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の組換え核酸。
7. 前記ｇＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム関連ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組換え核酸。
8. 前記ｇＲＮＡが、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列を更に含むシングルガイドＲＮＡである、請求項１～７のいずれか一項に記載の組換え核酸。
9. 前記ｇＲＮＡが、配列番号５に示されるとおりのヌクレオチド配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の組換え核酸。
10. 請求項１～９のいずれか一項に記載の組換え核酸を含むベクター。
11. 請求項１０に記載のベクターを含む細菌細胞。
12. 標的配列の配列特異的修飾のための組換え核酸ターゲティングシステムであって、
    ＴｎｉＡタンパク質、ＴｎｉＢタンパク質、並びにＴｎｉＱタンパク質、又は前記ＴｎｉＡタンパク質、前記ＴｎｉＢタンパク質、及び前記ＴｎｉＱタンパク質をコードするポリヌクレオチドと；
    配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＣａｓタンパク質又は前記Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチドと；
    ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又は前記ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと
    を含み、
    前記ｇＲＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質と複合体化してｇＲＮＡ－Ｃａｓタンパク質複合体を形成する能力を有する、システム。
13. 前記ＴｎｉＡタンパク質が、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の組換え核酸ターゲティングシステム。
14. 前記ＴｎｉＢタンパク質が、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の組換え核酸ターゲティングシステム。
15. 前記ＴｎｉＱタンパク質が、配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の組換え核酸ターゲティングシステム。
16. 前記ＴｎｉＡタンパク質が、配列番号２に示されるアミノ酸と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＴｎｉＢタンパク質が、配列番号３に示されるアミノ酸と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、及び前記ＴｎｉＱタンパク質が、配列番号４に示されるアミノ酸と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の組換え核酸ターゲティングシステム。
17. 前記ｇＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム関連ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列を含む、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の組換え核酸ターゲティングシステム。
18. 前記ｇＲＮＡが、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列を更に含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の組換え核酸ターゲティングシステム。
19. 前記ｇＲＮＡが、配列番号５に示されるとおりのヌクレオチド配列を含む、請求項１２～１８のいずれか一項に記載の組換え核酸ターゲティングシステム。
20. 標的ポリヌクレオチドを更に含む、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の組換え核酸ターゲティングシステムであって、前記標的ポリヌクレオチドが、（ｉ）前記ｇＲＮＡにハイブリダイズする能力を有する標的配列及び（ｉｉ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含む、組換え核酸ターゲティングシステム。
21. 前記ＰＡＭ配列が、５’－ＧＴＮ－３’、５’－ＮＧＴＮ－３’、５’－ＧＧＴＮ－３’、５’－ＧＧＴＡ－３’、５’－ＧＧＴＣ－３’、５’－ＧＧＴＧ－３’、５’－ＧＧＴＴ－３’、５’－ＧＴＴ－３’、５’－ＧＴＡ－３’、５’－ＧＴＣ－３’、及び５’－ＧＴＧ－３’に示されるとおりのヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項２０に記載の組換え核酸ターゲティングシステム。
22. 前記ＰＡＭ配列が、５’－ＧＧＴＴ－３’に示されるとおりのヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載の組換え核酸ターゲティングシステム。
23. ドナーポリヌクレオチドを更に含む、請求項１２～２２のいずれか一項に記載の組換え核酸ターゲティングシステムであって、前記ドナーポリヌクレオチドが、前記標的ポリヌクレオチドへの挿入のためのペイロード配列を含む、組換え核酸ターゲティングシステム。
24. 前記ドナーポリヌクレオチドが、トランスポゾン左末端（ＴＥ－Ｌ）をコードする核酸配列とトランスポゾン右末端（ＴＥ－Ｒ）をコードする核酸配列とを更に含む、請求項２３に記載の組換え核酸ターゲティングシステム。
25. 前記ＴＥ－Ｌが、配列番号６に示されるアミノ酸と少なくとも９５％同一の核酸配列を含む、請求項２４に記載の組換え核酸ターゲティングシステム。
26. 前記ＴＥ－Ｒが、配列番号７に示されるアミノ酸と少なくとも９５％同一の核酸配列を含む、請求項２４又は２５に記載の組換え核酸ターゲティングシステム。
27. 標的配列の配列特異的修飾のための組換え核酸ターゲティングシステムであって、
    配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＴｎｉＡタンパク質と；
    ドナーポリヌクレオチドであって、
    前記標的配列への挿入のためのペイロード配列
    配列番号６に示される核酸配列と少なくとも９５％同一のトランスポゾン左末端（ＴＥ－Ｌ）をコードする核酸配列、及び
    配列番号７に示される核酸配列と少なくとも９５％同一のトランスポゾン右末端（ＴＥ－Ｒ）をコードする核酸配列
    を含むドナーポリヌクレオチドと
    を含む、システム。
28. Ｖ－Ｋ型Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｋタンパク質）を更に含む、請求項２７に記載の組換え核酸ターゲティングシステム。
29. 前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列又は前記Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチドを含む、請求項２８に記載の組換え核酸ターゲティングシステム。
30. ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又は前記ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを更に含む、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の組換え核酸ターゲティングシステムであって、前記ｇＲＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質と複合体化してｇＲＮＡ－Ｃａｓタンパク質複合体を形成する能力を有する、組換え核酸ターゲティングシステム。
31. ＴｎｉＢタンパク質及びＴｎｉＱタンパク質のうちの１つ以上を更に含む、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の組換え核酸ターゲティングシステム。
32. 前記ＴｎｉＢタンパク質が、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列又は前記ＴｎｉＢタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記ＴｎｉＢタンパク質が、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチドを含む、請求項３１に記載の組換え核酸ターゲティングシステム。
33. 前記ＴｎｉＱタンパク質が、配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列又は前記ＴｎｉＱタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記ＴｎｉＱタンパク質が、配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチドを含む、請求項３１に記載の組換え核酸ターゲティングシステム。
34. 前記Ｃａｓタンパク質、前記ＴｎｉＡタンパク質、前記ＴｎｉＢタンパク質、及び前記ＴｎｉＱタンパク質のうちの少なくとも１つが精製タンパク質である、請求項１２～３３のいずれか一項に記載の組換え核酸ターゲティングシステム。
35. 請求項１２～３４のいずれか一項に記載の組換え核酸ターゲティングシステムを含む細菌細胞。
36. 細菌細胞における標的ポリヌクレオチドの修飾方法であって、前記細胞に、
    （ｉ）第１の組換え核酸であって、
    ＴｎｉＡタンパク質、又はその機能性断片をコードするポリヌクレオチド、ＴｎｉＢタンパク質、又はその機能性断片をコードするポリヌクレオチド、及びＴｎｉＱタンパク質、又はその機能性断片をコードするポリヌクレオチドと；
    Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記Ｃａｓタンパク質が配列番号１に示されるとおりのアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチドと；
    ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドであって、前記ｇＲＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質と複合体化してｇＲＮＡ－Ｃａｓタンパク質複合体を形成する能力を有する、ポリヌクレオチドと
    を含む第１の組換え核酸；
    （ｉｉ）標的ポリヌクレオチドを含む第２の組換え核酸であって、前記標的ポリヌクレオチドが、（ａ）前記ｇＲＮＡにハイブリダイズする能力を有する標的配列及び（ｂ）ＰＡＭ配列を含む、第２の組換え核酸；及び
    （ｉｉｉ）ドナーポリヌクレオチドを含む第３の組換え核酸であって、前記ドナーポリヌクレオチドが、前記標的ポリヌクレオチドへの挿入のためのペイロード配列を含む、第３の組換え核酸
    を導入することを含み、
    それによって前記標的ポリヌクレオチドを修飾する方法。
37. 前記ドナーポリヌクレオチドが、トランスポゾン左末端（ＴＥ－Ｌ）をコードする核酸配列とトランスポゾン右末端（ＴＥ－Ｒ）をコードする核酸配列とを更に含む、請求項３６に記載の方法。
38. 前記ＴｎｉＡタンパク質が、配列番号２に示されるとおりのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項３６又は３７に記載の方法。
39. 前記ＴｎｉＢタンパク質が、配列番号３に示されるとおりのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項３６又は３７に記載の方法。
40. 前記ＴｎｉＱタンパク質が、配列番号４に示されるとおりのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項３６又は３７に記載の方法。
41. 前記ＴｎｉＡが、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＴｎｉＢが、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、及び前記ＴｎｉＱが、配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項３６又は３７に記載の方法。
42. 前記ＰＡＭ配列が、５’－ＧＴＮ－３’、５’－ＮＧＴＮ－３’、５’－ＧＧＴＮ－３’、５’－ＧＧＴＡ－３’、５’－ＧＧＴＣ－３’、５’－ＧＧＴＧ－３’、５’－ＧＧＴＴ－３’、５’－ＧＴＴ－３’、５’－ＧＴＡ－３’、５’－ＧＴＣ－３’、及び５’－ＧＴＧ－３’に示されるとおりのヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項３６～４１のいずれか一項に記載の方法。
43. 前記ＰＡＭ配列が、５’－ＧＧＴＴ－３’に示されるとおりのヌクレオチド配列を含む、請求項４２に記載の方法。
44. 前記ＴＥ－Ｌが、配列番号６に示されるとおりの核酸配列を有する、請求項３７～４３のいずれか一項に記載の方法。
45. 前記ＴＥ－Ｒが、配列番号７に示されるとおりの核酸配列を有する、請求項３７～４３のいずれか一項に記載の方法。
46. 前記細菌細胞が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項３７～４５のいずれか一項に記載の方法。