CN102703424A - 一种重组工程介导的大肠杆菌基因组点突变的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于重组工程的大肠杆菌基因组点突变的方法。本方法是先通过重叠－延伸聚合酶链式反应获得一个两端为与靶位点两侧序列一致的各50bp同源臂，中间为突变位点、与靶位点下游序列一致的30bp同源片段、两侧为两个归巢核酸酶I-SceI酶切位点的卡那霉素抗性基因的修饰片段；然后将50bp同源臂之间的片段整合至大肠杆菌基因组，突变位点取代基因组上的靶位点，获得卡那霉素抗性突变株。随后热失活的氯四环素诱导I-SceI酶的表达，催化30bp同源片段与靶位点下游30bp之间发生同源重组，从而将30bp同源片段、两个I-SceI酶切位点及卡那霉素抗性基因消除，获得发生点突变的大肠杆菌突变株。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一种高效的运用重组工程手段实现大肠杆菌基因组点突变的方法。
背景技术
大肠杆菌是遗传学研究的最为透彻的微生物菌株，广泛用于生物学的基础研究。大肠杆菌同时也是工业生产中最重要的微生物菌株之一，是合成生物学和代谢工程的首选菌株。大肠杆菌在生产药物、精细化工产品以及具工业催化价值的酶等方面有着广泛的用途。这些实际的功能均与基因组上的基因密切关联，因此阐述这些基因的功能和改善这些基因的品质是发挥大肠杆菌功能的重要途径。在诸多研究手段中，基因组的点突变（即基因位点的点突变）是关键的一种。
经典的大肠杆菌基因组点突变的方法有两种。均首先是通过重叠－延伸聚合酶链式反应等方法将引入突变位点的基因克隆在载体上，突变位点两侧含有与基因组序列一致的同源片段（设为A和B)。第一种方法选择的是含有温度敏感型复制子的载体。大肠杆菌的生长温度是37°C，温度敏感型复制子只能在30°C时进行复制，在37°C时，含温度敏感型复制子的质粒因为不能复制而失去。当含有突变位点的含温度敏感型复制子的质粒转化至大肠杆菌后，首先在30°C培养，通过抗性选择得到质粒游离于基因组的菌株，随后提高培养温度至37°C或42°C，迫使质粒通过突变位点一侧的同源片段（任为A或B)整合至基因组上，随后在30°C之下进行培养，筛选失去抗性（即失去质粒的）菌株，此时菌株有两种类型，一种类型是用于第一步整合的片段（A或B)再次用于发生同源重组，而得到回复至原株基因组的菌株；另外一种类型是第二个同源片段（第一次为A，则此时为B；第一次为B，则此时为A）发生同源重组，而得到目的位点发生突变的突变株。第二种方法选择的是含有不能在常规大肠杆菌中复制的复制子（如需要Pir蛋白才能复制的R6K复制子）和含有负筛选标记的质粒。一种典型的负筛选标记是编码6-果糖基转移酶的sacB基因，含有此基因的菌株（在质粒上或基因组上）不能在含10%的蔗糖培养基中生存。将克隆有突变位点和同源片段的重组质粒转化至大肠杆菌后，由于质粒不能复制，在抗性筛选之下，迫使突变位点一侧的同源片段（任为A或B)整合至基因组上。随后将菌株在负筛选的条件下进行培养，与第一种方法类似，如相同的同源片段再次发生同源重组，则得到原株基因型的菌株；如不同的同源片段方式重组，则得到目的位点发生突变的菌株。由此可见，这两个经典的方法的不足是：1.因为所需的同源片段较长（一般需1kb），故需要步骤烦琐和耗时长的基因克隆步骤；2.在最终菌株中发生突变的比例可能相差较大，即需要筛选较多的克隆才能得到正确的突变株。
随着重组工程方法学的兴起，直接合成含突变位点的寡核苷酸，将之转化大肠杆菌后筛再选点突变的菌株成为可能。重组工程一般使用来源于lambda噬菌体的三个基因。其中exo基因编码5'->3外切酶，其作用于双链DNA而得到3'端突出的DNA分子；bet基因编码3'突出端的单链结合蛋白，同时促进同源片段之间的同源重组；gam基因编码抑制内源性核酸酶的Gam蛋白，使得转化的DNA分子免受菌株本身的核酸酶所降解，这三个基因共同行使重组酶的活性。重组工程突出优点是可以催化短至36bp之间的同源片段（称为同源臂）之间的同源重组而实现DNA的克隆和修饰。突变寡核苷酸的方法虽然简便，但迄今报道的突变率往往很低，在1%左右甚至更少，这就需要筛选大量的克隆才能得到正确的突变株。因此突变寡核苷酸的方法目前只具有基础研究意义，目前难以推广应用。
发明内容
为克服上述不足，本发明申请提出了一种基于重组工程的大肠杆菌基因组的点突变方法。
本方法的基本原理是首先通过重组工程的手段在基因组上引入含突变位点（单个或数个碱基）、30bp同源片段、两侧为归巢核酸酶I-SceI酶切位点的卡那霉素抗性基因，随后诱导表达的I-SceI作用于整合在基因组上的I-SceI酶切位点，促使30bp同源片段之间发生同源重组而将一个30bp同源片段、两个I-SceI酶切位点和卡那霉素抗性基因去除，最终得到不含有任何冗余序列的、发生点突变的大肠杆菌突变株。
本发明所采用的技术方案包括以下步骤：
（1）通过重叠-延伸聚合酶链式反应获得一个DNA修饰片段，所述DNA修饰片段依次由下列结构组成：基因组上靶位点（即待突变位点）上游50bp序列一致的50bp同源臂、突变位点（即突变成功的位点）、与靶位点下游30bp序列一致的30bp同源片段、两侧为两个归巢核酸酶I-SceI酶切位点的卡那霉素抗性基因、与靶位点下游50bp序列一致的50bp同源臂；
（2）将含重组酶基因和I-SceI基因的质粒pLS134转化至大肠杆菌MG1655中；所述的质粒pLS134是将PCR扩增的tetR-ptetA-I-SceI基因盒片段以NsiI酶切后，克隆至pBAD322的NsiI位点，得到重组克隆pLS133；再将exo，bet和gam三个重组酶基因从lambda噬菌体DNA中PCR扩增后，以NcoI和XhoI酶切后，克隆至pLS133的NcoI和SaII位点，得到目的质粒pLS134；
（3）将步骤（1）得到的DNA修饰片段电转化至以终浓度为0.15%的L-阿拉伯糖诱导下表达Red重组酶基因的步骤（2）的大肠杆菌电转化感受态细胞中，通过重组酶介导的同源臂和大肠杆菌基因组上相同序列之间的同源重组，将所述DNA修饰片段中，左右50bp同源臂之间的片段整合至大肠杆菌基因组，在卡那霉素抗性筛选之下，获得整合有突变位点、30bp同源片段和两侧为I-SceI酶切位点的卡那霉素抗性基因的卡那霉素抗性突变株；
（4）将步骤（3）得到的菌株在含终浓度为20μg/ml热处理的氯四环素的培养基中进行培养，热失活的氯四环素诱导I-SceI酶的表达，I-SceI酶作用于整合在基因组上的I-SceI酶切位点，基因组发生双链断裂，促使菌株利用自身的重组功能催化30bp同源片段与靶位点下游30bp之间发生同源重组，从而将30bp同源片段、两个I-SceI酶切位点及卡那霉素抗性基因消除，最终获得发生点突变的大肠杆菌突变株。
本发明中所述的靶位点，可以是一个或数个碱基，相应地，突变位点也可以是一个或数个碱基。
I-SceI基因来源于酵母，所编码的I-SceI酶作用于18个碱基对的5'-TAGGGATAACAGGGTAAT-3'序列，在AC位点之间进行切割。此18个碱基对的序列在大肠杆菌基因组中不存在，故I-SceI不会作用于大肠杆菌的基因组，也就不会影响大肠杆菌的生存。I-SceI基因克隆在ptetA启动子之下，ptetA启动子受tetR调节基因所控制，在四环素及其类似物存在时，TetR解除对ptetA启动子的抑制，ptetA启动子开始启动I-SceI基因的表达。将PCR扩增得到的tetR-ptetA-I-SceI基因盒片段以NsiI酶切后，克隆至低拷贝质粒pBAD322的NsiI位点，得到重组克隆pLS133。
重组酶基因选择是来自于lambda噬菌体的exo，bet和gam，将这三个重组酶基因从lambda噬菌体DNA中扩增，以NcoI和XhoI酶切后，克隆至pLS133的NcoI和SaII位点，得到目的质粒pLS134。
pLS134在L-阿拉伯糖诱导下表达red重组酶基因，在失活的氯四环素诱导下表达I-SceI。
优选实施例是对大肠杆菌基因组上的lacZ基因位点和nanA基因位点的点突变。lacZ为β-半乳糖苷酶基因，在MG1655基因组上的基因编号是b0344，突变的是单个位点，即开放阅读框的第70位碱基C突变为T，这使得第24位的氨基酸谷氨酰胺突变为终止密码子。nanA为神经氨酸醛缩酶基因，在MG1655基因组上的基因编号是b3225，突变的是三个位点（尽管中间的一个碱基是一致的，但原理上来说是三个碱基发生了突变），即开放阅读框的第574-576碱基GAA突变为AAC，这使得第192位的氨基酸谷氨酸突变为天冬酰胺。两个点突变实验充分证明了本发明方法的可行性和较常规方法的优越性。
本方法非常简捷，无需克隆和测序，只涉及PCR、转化和培养等步骤，因此可以同时进行多个位点的突变实验；方法也非常高效，第一步的重组酶催化的同源重组的效率在60%左右，第二步同源重组的效率可达100%，只要筛选几个克隆就足以得到点突变菌株。本方法无需任何特殊的设备，整个实验周期在一周之内，有可能成为通用的大肠杆菌基因组点突变的方法，有着良好的基础研究和实际应用的经济前景。
附图说明
图1是本发明所采用的方法的示意图。
图2MG1655lacZ点突变和nanA点突变的原株和变株的基因型分析的凝胶电泳结果。
1.DL2000分子量标准：2.0,1.0,0.75,0.5,0.25,0.1kb；
2.以MG1655的基因组为模板，R1165和R1166扩增得到595bp；
3.以含lacZ点突变的卡那霉素抗性菌株的基因组为模板，R1165和R1166扩增得到1750bp；
4.以lacZ点突变变株的基因组为模板，R1165和R1166扩增得到595bp；
5.DL2000分子量标准：2.0,1.0,0.75,0.5,0.25,0.1kb；
6.以MG1655的基因组为模板，R1175和R1176扩增得到349bp；
7.以含nanA点突变的卡那霉素抗性菌株的基因组为模板，R1175和R1176扩增得到1505bp；
8.以nanA点突变变株的基因组为模板，R1175和R1176扩增得到349bp。
图3是MG1655原株和lacZ突变株突变位点区域的测序图。
图的上部分和下部分分别为以R1165为测序引物，对MG1655和lacZ点突变变株的基因组为模板，R1165和R1166扩增得到595bp进行测序的结果。可见在测序图谱中，在MG1655原株的第231位置处的碱基为C，而lacZ点突变变株的碱基为T，表明实现了C突变为T。
图4是MG1655原株和nanA突变株突变位点区域的测序图。
图的上部分和下部分分别为以R1175为测序引物，对MG1655和nanA点突变变株的基因组为模板，R1175和R1176扩增得到349bp进行测序的结果。可见在测序图谱中，在MG1655原株的第131至133位置处的碱基为GAA，而nanA点突变变株的第131至133位置处的碱基为AAC，表明实现了GAA突变为AAC。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例中所用到的菌株和质粒，均为已公开的菌株和质粒：
1.Escherichia coli MG1655。基因型F-LAM-rph-1，来自美国大肠杆菌保藏中心。
2.Escherichia coli DH10B。基因型F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80dlacZΔM15ΔlacX74deoR recA1 araD139Δ(ara,leu)7697galU galK rpsL endA1nupG.。文献：Life Technologies,Inc.Focus,1990,12:19。购自美国Invitrogen公司。
3.pST98-AS。文献：Posfai G.,Kolisnychenko V.,Bereczki Z,Blattner FR.Markerless gene replacement in Escherichia coli stimulated by a double-strandbreak in the chromosome.Nucleic Acids Res.1999,27(22):4409-15。来自美国University of Wisconsin,Madison的Frederick Blattner教授。
4.pBAD322。文献：Cronan JE.A family of arabinose-inducible Escherichia coliexpression vectors having pBR322copy control.Plasmid.2006,55(2):152-7。来自美国University of Illinois at Urbana-Champaign的John Cronan教授。
5.pKD4和Escherichia coli BW25141。文献：Datsenko KA,Wanner BL.One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proc Natl Acad Sci U S A.2000,97(12):6640-5。来自美国Purdue大学BarryWanner的教授。
本发明的方法示意图如图1，图中各符号的意义如下。X为靶位点（即待突变位点）；Y为突变位点（即突变成功的位点）；A为靶位点上游50bp用于重组工程的同源臂序列；B为靶位点下游30bp序列；C为30bp序列下游的20bp序列；A，X，B和C序列在基因组上相连；I-SceI为归巢核酸酶I-SceI基因；S为I-SceI的酶切位点；neo为卡那霉素抗性基因；5'-neo为卡那霉素抗性基因的5'端；3'-neo为卡那霉素抗性基因的3″端；Red表示重组工程；双交叉号表示同源重组重组工程介导的同源重组；Kan表示卡那霉素筛选；双箭头表示B片段之间的同源重组；PCR表示聚合酶链式反应；OE-PCR表示重叠－延伸聚合酶链式反应。P1至P8为PCR引物，P1由A，Y，B和扩增S位点和5'-neo的序列所组成；P2为neo中间的一段序列；P3为P2的反向互补序列；P4由C和B的反向互补序列以及扩增S位点和3'-neo的序列所组成；P5为P1前端约21个碱基的序列；P6为P2前端约21个碱基的序列。简要的实验过程是：以含两侧为S位点的卡那霉素抗性基因的质粒为模板，P1和P2扩增出A-Y-B-S-5'-neo的片段，P3和P4扩增出3'-neo-S-B-C的片段，以这两个片段为模板，P5和P6通过OE-PCR扩增出A-Y-B-S-neo-S-B-C的重组工程修饰片段。将此约1.2kb的片段点转化至表达重组酶的大肠杆菌原株MG1655中，重组酶催化50bp同源臂（上游为A序列，下游为B+C序列）和基因组上相同序列之间发生同源重组，在卡那霉素的抗性筛选之下，修饰片段中两个同源臂之间的序列取代了基因组上两个同源臂之间的序列，靶位点X突变为Y，同时将30bp同源片段和两侧为I-SceI酶切位点的卡那霉素小基因组整合至基因组。P7为A上游相隔约150至300个碱基的序列，P8为C下游相隔约150至300个碱基的序列。以抗性菌株的基因组DNA为模板，P7和P8为引物，扩增得到突变区域的片段，通过测序确证靶位点X突变为Y。将含卡那霉素抗性基因的突变株在含热失活的氯四环素培养基进行培养，热失活的氯四环素诱导I-SceI的表达，随后作用的S位点，导致大肠杆菌基因组发生双链断裂，迫使大肠杆菌利用自身的重组系统催化30bp同源片段之间的同源重组而将一段30bp同源片段、两个S位点序列及其中间的卡那霉素抗性基因去除，最后获得不含任何溶于序列的点突变变株。P7和P8用于原株和点突变变株的基因型验证，并以P7为测序引物对扩增片段测序以确证验证突变的发生。
实施例1.载体的构建
1.重组酶和I-SceI表达载体的构建
设计引物IPM1：5'-GGGATGCATTTAAGACCCACTTTCACATTTAAG-3'，（SEQ ID NO.1）；IPM2：5'-GGGATGCATTTATTTCAGGAAAGTTTCGGAG-3'，（SEQ ID NO.2）。以pST98-AS为模板，IPM1和IPM2扩增得到1.4kb的tetR-ptetA-I-SceI片段。将1.4kb片段以NsiI酶切后，克隆至pBAD322的NsiI位点，得到重组克隆pLS133。
设计引物IPM3：5'-GGGCCATGGATATTAATACTGAAACTG-3'，（SEQ IDNO.3）；IPM4：5'-GGGCTCGAGCTATCGCCATTGCTCCCCAAATAC-3′，（SEQ IDNO.4）。以HindIII酶切的lambda噬菌体DNA（购自大连宝生物公司）为模板，IPM3和IPM4扩增得到1.9kb的red基因片段，将之以NcoI和XhoI酶切后，克隆至pLS133的NcoI和SaII位点，得到目的克隆pLS134。XhoI和SaII是同尾酶，酶切后可以连接克隆，连接后两个酶切位点均消失。pLS134在L-阿拉伯糖诱导下表达Red重组酶，在失活的氯四环素诱导下表达I-SceI。
以上质粒的克隆宿主菌均为大肠杆菌DH10B，所有克隆均经酶切和测序验证所得序列正确性。
2.抗性基因和I-SceI酶切位点的模板载体的构建
设计引物IPM5：5'-GGAATCGATTAGGGATAACAGGGTAATTATGGACAGCAAGCGAACCGG-3′，（SEQ ID NO.5）；IPM6：5'-GGGTCTAGAATTACCCTGTTATCCCTATCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3′，（SEQ ID NO.6）。以pKD4为模板，IPM5和IPM6扩增1.1kb的片段，以ClaI和XbaI双酶切后，与以ClaI和XbaI双酶切的pKD4相连，转化大肠杆菌BW25141的感受态细胞，获得重组克隆pLS135。pLS135即为克隆两侧含有I-SceI酶切位点的卡那霉素抗性基因的载体，此载体用做大肠杆菌基因组点突变实验中扩增两侧两个I-SceI酶切位点和卡那霉素抗性基因的模板。pLS135使用R6K复制子，因为R6K复制子需要Pir蛋白才能行使复制的功能，而常规的大肠杆菌如MG1655不含Pir蛋白，以pLS135做模板就没有质粒背景的干扰，PCR产物可以直接沉淀回收。
实施例2 lacZ基因开放阅读框的第70位碱基C突变为T
1.表达Red重组酶基因的大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
pLS134转化至MG1655，以含50μg/ml的氨苄青霉素抗性进行筛选。将所得菌株单菌落接种至3ml LB液体培养基中，37°C振荡过夜，以1/50体积转至50ml LB，振荡培养至菌体OD600约为0.2时，加入终浓度为0.15%的L-阿拉伯糖以诱导重组酶，继续培养至OD600约为0.4，将菌液倒入预冷的离心管，冰浴10分钟，4°C，5000rpm离心5分钟，弃上清。以冰冷的10%甘油洗涤沉淀两次最后悬浮于200μl冰冷的10%甘油中，50μl每管分装。
将溶解于双蒸水的DNA加至50μl重组酶表达的电转化感受态细胞中，轻弹混匀。将混合液转移至冰上预冷的1mm电转杯中进行电击转化。电转化条件：200Ω，1800V，美国Bio-Rad公司Gene Pulser IIR电转化仪。加1ml LB液体培养基至电转杯，吹打混匀，将溶液转移至一个无菌的1.5ml离心管中，37°C振荡培养60分钟后，转化液涂布在含相应抗生素的抗性平板上，37°C培养。挑取单菌落，菌落PCR验证基因型，扩增产物进行测序确证其突变。
2.lacZ基因开放阅读框的第70位碱基C突变为T
在此实施例中，靶位点为lacZ基因开放阅读框的第70位碱基C，突变位点为T，即将C突变为T。
设计引物R1161：5'-
AACAAATAGGGGTTCCGCGC-3'，（SEQID NO.7），在此引物中，靶位点上游的50bp同源臂以小写字母表示，突变位点以粗体字母表示，靶位点下游的30bp同源片段以斜体字母表示，扩增引物以下划线字母表示；R1162：5'-GCTATTACGCCAGCTGGCGA
TCCTTAGTTCCTATTCCGAAG-3'，（SEQ ID NO.8），在此引物中，靶位点下游的30bp同源片段下游的20bp的反向互补序列以常规字母表示，靶位点下游的30bp同源片段的反向互补序列以斜体字母表示，扩增引物以下划线字母表示。R1161和R1162分别对应图1中的P1和P4。R1102：5'-GCCTCGTCCTGCAGTTCATTC-3'，（SEQ ID NO.9），R1103：5'-GAATGAACTGCAGGACGAGGC-3'，（SEQ ID NO.10），R1102为卡那霉素抗性基因中326至346的21bp序列，R1103为R1102的反向互补序列。R1102和R1103分别对应图1中的P2和P3。R1163：5'-CACTGGCCGTCGTTTTACAAC-3'，（SEQ IDNO.11）；R1164：5'-GCTATTACGCCAGCTGGCGAAAG-3'，（SEQ ID NO.12），R1163为R1161前端的21bp序列，R1164为R1162前端的23bp序列。R1163和R1164分别对应图1中的P5和P6。
以pLS135为模板，R1161和R1102为引物，PCR扩增得到0.5kb的DNA片段，R1103和R1162为引物，PCR扩增得到0.8kb的DNA片段。凝胶回收0.5kb和0.8kb，合并作为模板，以R1163和R1164为引物，OE-PCR扩增得到1.3kb的DNA片段，电转化至由上所得重组酶表达的电转化感受态细胞，在含50μg/ml的氨苄青霉素和30μg/ml卡那霉素的抗性平板上筛选。
设计引物R1165：5'-AACCGCCTCTCCCCGCGCGTTG-3'，（SEQ ID NO.13）；R1166：5'-CATCAACATTAAATGTGAGCG-3'，（SEQ ID NO.14），R1165为靶位点C上游270bp的序列，R1166为靶位点C下游203bp的序列。R1165和R1166分别对应图1中的P7和P8。
随机挑选5个抗性克隆，分别以之基因组为模板，R1165和R1166为引物，5个克隆均经PCR扩增得到1.7kb的DNA片段。将此1.7kb以R1165和R1166为测序引物进行测序，序列分析表明其中的三个克隆发生了点突变。此时即得到lacZ点突变的、30bp同源片段以及两侧为I-SceI酶切位点的卡那霉素抗性基因整合至大肠杆菌基因组上的菌株。其中一个正确克隆的扩增产物为图2中的第3泳道。
将含点突变的抗性菌株接种至含20μg/ml热处理的氯四环素的3ml液体LB中培养20小时，稀释10-6后，涂布LB平板。随机挑选25个克隆同时划线至含30μg/ml卡那霉素和不含抗生素的LB固体平板进行培养，结果显示所有的克隆均没有卡那霉素抗性，这表明卡那霉素抗性基因区域已失去。以MG1655原株和任意挑取5个没有抗性的克隆，以R1165和R1166为引物菌落PCR扩增，扩增均得到595bp，MG1655原株和一个变株的扩增结果分别为图2中的第2和第4泳道。
分别以R1165为测序引物对MG1655原株和一个变株的R1165和R1166的扩增产物进行测序，测序图谱见图3的上半部分和下半部分。可见在测序图谱中，在MG1655原株测序图谱的第231位置处（即lacZ基因开放阅读框的第70位碱基）为C，而lacZ点突变变株的第231位置处（即lacZ基因开放阅读框的第70位碱基）为T，表明实现了C突变为T，即点突变完成。
实施例3nanA基因开放阅读框的第574-576碱基GAA突变为AAC
在此实施例中，靶位点为nanA基因开放阅读框的第574-576碱基GAA，突变位点为AAC，即将GAA突变为AAC。
设计引物R1171：5'-
AACAAATAGGGGTTCCGCGC-3'，（SEQ ID NO.15），在此引物中，靶位点上游的50bp同源臂以小写字母表示，突变位点以粗体字母表示，靶位点下游的30bp同源片段以斜体字母表示，扩增引物以下划线字母表示；R1172：5'-GTACTGCCGATACCACCATCAGC
TTCCTATTCCGAAG-3'，（SEQ IDNO.16），在此引物中，靶位点下游的30bp同源片段下游的20bp的反向互补序列以常规字母表示，靶位点下游的30bp同源片段的反向互补序列以斜体字母表示，扩增引物以下划线字母表示。R1171和R1172分别对应图1中的P1和P4。R1102：5'-GCCTCGTCCTGCAGTTCATTC-3'，（SEQ ID NO.9），R1103：5'-GAATGAACTGCAGGACGAGGC-3'，（SEQ ID NO.10），R1102为卡那霉素抗性基因中326至346的21bp序列。R1103为R1102的反向互补序列，R1102和R1103分别对应图1中的P2和P3。R1173：5'-AGCAGATCCGTCGTGAACATC-3'，（SEQID NO.17）；R1174：5'-GTACTGCCGATACCACCATCAG-3'（SEQ ID NO.18）。R1173为R1161前端的21bp序列，R1174为R1162前端的22bp序列，R1173和R1174分别对应图1中的P5和P6。
以pLS135为模板，R1171和R1102为引物，PCR扩增得到0.5kb的DNA片段，R1103和R1172为引物，PCR扩增得到0.8kb的DNA片段（R1102和R1103与实施例2中的引物相同）。凝胶回收0.5kb和0.8kb，合并作为模板，以R1173和R1174为引物，OE-PCR扩增得到1.3kb的DNA片段，电转化至由重组酶表达的电转化感受态细胞（与实施例2相同），在含50μg/ml的氨苄青霉素和30μg/ml卡那霉素的抗性平板上筛选。
设计引物R1175：5'-TACAACATTCCAGCCCTGAG-3'，（SEQ ID NO.19）；R1176：5'-GGAATACGCCCGTTTTGATC-3'，（SEQ ID NO.20），R1175为靶位点GAA上游164bp的序列，R1176为靶位点GAA下游161bp的序列。R1175和R1176分别对应图1中的P7和P8。
随机挑选5个抗性克隆，分别以之基因组为模板，R1175和R1176为引物，5个克隆均经PCR扩增得到1.5kb的DNA片段。将此1.5kb以R1175和R1176为测序引物进行测序，序列分析表明其中的三个克隆发生了点突变。此时即得到nanA点突变的、30bp同源片段以及两侧为I-SceI酶切位点的卡那霉素抗性基因整合至大肠杆菌基因组上的菌株。其中一个正确克隆的扩增产物为图2中的第7泳道。
将含点突变的抗性菌株接种至含20μg/ml热处理的氯四环素的3ml液体LB中培养20小时，稀释10-6后，涂布LB平板。随机挑选25个克隆同时划线至含30μg/ml卡那霉素和不含抗生素的LB固体平板进行培养，结果显示所有的克隆均没有卡那霉素抗性，这表明卡那霉素抗性基因区域已失去。任意挑取5个没有抗性的克隆，以R1175和R1176为引物菌落PCR，扩增均扩增得到349bp。MG1655原株和一个变株的扩增结果分别为图2中的第6和第8泳道。
分别以R1175对MG1655原株和一个变株的R1175和R1176扩增产物进行测序，测序图谱见图4的上半部分和下半部分。可见在测序图谱中，在MG1655原株测序图谱的第131-134位置处（即nanA基因开放阅读框的第574-576碱基）为GAA，而nanA点突变变株测序图谱的第131-134位置处（即nanA基因开放阅读框的第574-576碱基）为AAC，表明实现了GAA突变为AAC，即点突变完成。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京师范大学
<120> 一种重组工程介导的大肠杆菌基因组点突变的方法
<130>
<160> 20
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gggatgcatt taagacccac tttcacattt aag 33
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gggatgcatt tatttcagga aagtttcgga g 31
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gggccatgga tattaatact gaaactg 27
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gggctcgagc tatcgccatt gctccccaaa tac 33
<210> 5
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggaatcgatt agggataaca gggtaattat ggacagcaag cgaaccgg 48
<210> 6
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gggtctagaa ttaccctgtt atccctatca gaagaactcg tcaagaag 48
<210> 7
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc taacttaatc 60
gccttgcagc acatccccct taacaaatag gggttccgcg c 101
<210> 8
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gctattacgc cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt tccttagttc 60
ctattccgaa g 71
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gcctcgtcct gcagttcatt c 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gaatgaactg caggacgagg c 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cactggccgt cgttttacaa c 21
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gctattacgc cagctggcga aag 23
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
aaccgcctct ccccgcgcgt tg 22
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
catcaacatt aaatgtgagc g 21
<210> 15
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
agcagatccg tcgtgaacat cctgatcttg tgctctataa cggttacgac aacatcttcg 60
cctctggtct gctggcgggc gctaacaaat aggggttccg cgc 103
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<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gtactgccga taccaccatc agcgcccgcc agcagaccag aggcgaagat tccttagttc 60
ctattccgaa g 71
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
agcagatccg tcgtgaacat c 21
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gtactgccga taccaccatc ag 22
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tacaacattc cagccctgag 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ggaatacgcc cgttttgatc 20
Claims (5)
1.一种基于重组工程的大肠杆菌基因组点突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）通过重叠－延伸聚合酶链式反应获得一个DNA修饰片段，所述DNA修饰片段依次由下列结构组成：与基因组上位点待突变靶位点上游50bp序列一致的左端50bp同源臂、突变位点、与靶位点下游30bp序列一致的30bp同源片段、两侧为两个归巢核酸酶I-SceI酶切位点的卡那霉素抗性基因和与靶位点下游50bp序列一致的右端50bp同源臂所组成；
（2）将含重组酶基因和I-SceI基因的质粒pLS134转化至大肠杆菌MG1655中；所述的质粒pLS134是将PCR扩增的tetR-ptetA-I-SceI基因盒片段以NsiI酶切后，克隆至pBAD322的NsiI位点，得到重组克隆pLS133；再将exo，bet和gam三个重组酶基因从lambda噬菌体DNA中PCR扩增后，以NcoI和XhoI酶切后，克隆至pLS133的NcoI和SaII位点，得到目的质粒pLS134；
（3）将步骤（1）得到的DNA修饰片段电转化至以终浓度为0.15%的L-阿拉伯糖诱导下表达Red重组酶基因的步骤（2）的大肠杆菌电转化感受态细胞中，通过重组酶介导的同源臂和大肠杆菌基因组上相同序列之间的同源重组，将所述DNA修饰片段中，左右50bp同源臂之间的片段整合至大肠杆菌基因组，在卡那霉素抗性筛选之下，获得整合有突变位点、30bp同源片段和两侧为I-SceI酶切位点的卡那霉素抗性基因的卡那霉素抗性突变株；
（4）将步骤（3）得到的菌株在含终浓度为20μg/ml热处理的氯四环素的培养基中进行培养，热失活的氯四环素诱导I-SceI酶的表达，I-SceI酶作用于整合在基因组上的I-SceI酶切位点，基因组发生双链断裂，促使菌株利用自身的重组功能催化30bp同源片段与靶位点下游30bp之间发生同源重组，从而将30bp同源片段、两个I-SceI酶切位点及卡那霉素抗性基因消除，最终获得发生点突变的大肠杆菌突变株。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所待突变位点和突变位点是一个或多个碱基。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，首先通过一个聚合酶链式反应得到含左侧50bp同源臂、突变位点、30bp同源片段、一个I-SceI酶切位点和5'端卡那霉素抗性基因的DNA片段，再通过另外一个PCR反应得到3'端卡那霉素抗性基因、一个I-SceI酶切位点和右侧50bp同源臂的DNA片段，在5'端卡那霉素抗性基因和3'端卡那霉素抗性基因之间含21bp的重叠序列；随后通过重叠－延伸聚合酶链式反应获得两侧为50bp同源臂的含突变位点、30bp同源片段以及两侧为I-SceI酶切位点的卡那霉素抗性基因的融合DNA修饰片段。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，同源臂用于通过重组酶催化的同源重组将含突变位点的DNA修饰片段整合至大肠杆菌的基因组；右侧的50bp同源臂为靶位点下游的50bp序列，此50bp序列的前30bp为同源片段；30bp同源片段用于同源重组以去除一段30bp序列、两个I-SceI酶切位点及卡那霉素抗性基因的冗余序列，所得变株的基因组不含突变位点外任何序列。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，重组酶基因是来自于lambda噬菌体的exo，bet和gam基因，重组酶基因是克隆在受L-阿拉伯糖所诱导启动子之下；I-SceI基因克隆在受热处理的氯四环素诱导的启动子之下。含重组酶基因和I-SceI基因的质粒pLS134游离于大肠杆菌MG1655的基因组。
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