CN116355938A - 基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因组学及基因工程和生物技术领域，具体涉及基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统及其构建方法和应用。本发明中基于TnpB的基因编辑系统只需要构建一个含tnpB基因及其3’非翻译区和供体DNA片段的质粒。利用在源宿主中TnpB蛋白与来源于其自身基因的向导RNA形成的效应复合物对靶向位点产生特异性切割，并且以质粒上供体DNA为模板，通过同源重组修复完成靶向位点的精确编辑。上述方法具有基因编辑效率高、蛋白表达兼容性强、载体构建简单、适用于单碱基基因组编辑、可应用宿主范围广等优点，因此具有良好的实际应用之价值。
Description
技术领域
本发明属于基因组学及基因工程和生物技术领域，具体涉及基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统及其构建方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
以CRISRP-Cas系统编码的可编程RNA引导核酸酶为代表的核酸酶(Cas9以及Cas12等)在微生物基因组编辑中的应用极大加速了微生物合成生物学等领域的发展(Yao etal.,2018)。然而当前可以的CRSPR核酸酶在微生物基因组编辑中的应用依然存在以下局限性和挑战。(a)目前常用的单亚基核酸酶Cas9和Cas12普遍存在蛋白尺寸大以及Cas9蛋白表达毒性的问题。(b)Cas9和Cas12会对未成功编辑的细胞产生持续靶向切割，从而极大减少了转化子数目。(c)Cas9和Cas12在单碱基编辑中的局限性。(d)CRISPR系统引导RNA与蛋白编码序列需要独立表达，这增加了遗传操作的难度。(e)当前多数开发的CRISPR-Cas系统仅能在常温微生物中应用，能够适用于高温微生物的系统亟待开发。鉴于以上问题，亟待新型可编程核酸酶的开发与应用。
2021年，Science和Nature杂志同时报导了细菌IS200/605转座子编码的转座相关蛋白TnpB为一种新型的可编程RNA引导核酸酶(Karvelis et al.,2021；Altae et al.,2021)。这种蛋白能够特异性识别并切割双链DNA，然而其蛋白大小仅为400个氨基酸左右，比常用Cas9和Cas12核酸酶大小小一倍以上，代表了一类新型的微型可编程核酸酶。另外与CRISPR系统不同的是：TnpB的引导RNA由其自身基因以及其基因3’端紧邻的非编码区域编码，这表明TnpB系统的RNA组分的构建与表达将更加容易。目前耐辐射奇球菌的TnpB蛋白在哺乳动物细胞系中能够引起小片段DNA的插入与缺失，揭示了TnpB蛋白在基因组编辑中的潜力(Karvelis et al.,2021)。然而TnpB系统是否能够在普遍缺失非同源末端连接修复途径的微生物中进行基因编辑尚未得到研究。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统及其构建方法和应用。具体的，本发明通过对冰岛硫化叶菌Rey15A中TnpB蛋白的研究提出了TnpB在源宿主高保真基因组编辑中的应用，并提供了TnpB系统的构建方法及基因编辑流程。本发明中的TnpB编辑系统只需要构建一个含有TnpB蛋白、3’端非编码区域和16nt的引导序列、以及供体DNA片段的质粒。极大简化了编辑载体的构建。利用质粒编码的TnpB和引导RNA自发形成的效应复合物对基因组靶向位点进行切割，通过质粒上的供体DNA模板为细胞内的同源重组修复过程提供模板，从而实现靶向位点的精确编辑。更为重要的是，该TnpB编辑系统能够用于微生物单碱基基因组编辑，因此具有良好的实际应用之价值。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统，所述基因编辑载体系统包含编辑质粒，所述编辑质粒至少含有TnpB编码基因序列、3’端非编码区和引导序列、以及供体DNA片段；
其中，所述引导序列为靶向位点对应序列克隆至TnpB编码基因3’端非编码区保守序列之后获得；所述引导序列长度为13-24nt；
由于TnpB蛋白切割双链DNA时需要靶向位点5’端存在TTGAT序列(或者TTTAA序列)，因此所述靶向位点需要位于基因组TTGAT/TTTAA序列紧邻的下游区域，所述靶向位点长度为13-24bp。
所述供体DNA片段用于提供细胞修复TnpB产生的靶位点DNA断裂的模板；在本发明的一个具体实施方式中，当基因编辑具体为基因敲除时，所述供体DNA片段包括拟敲除DNA片段上下游两侧各500bp左右的侧翼DNA序列；当基因编辑具体为单碱基编辑时，所述供体DNA为含有拟突变位点的DNA片段，其突变位点应位于引导序列-靶向序列配对区的前13个位点的任一位置。
本发明的第二个方面，提供上述基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统的构建方法，所述构建方法包括；
S1、基因组上靶向位点的选择；
S2、靶向位点对应序列克隆至tnpB基因3’端保守序列之后形成引导序列；
S3、将步骤S2获得的融合片段克隆至表达载体上获得重组表达载体；
S4、克隆供体DNA片段至所述步骤S3获得的重组表达载体上即得。
需要说明的是，上述技术方案虽然以冰岛硫化叶菌Rey15A TnpB基因为例，介绍了微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统及其构建方法，但显然只要在任意编码TnpB系统的原核生物中，均可实现，因此本发明的第三个方面，提供上述基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统在原核生物基因组编辑中的应用。
本发明的第四个方面，提供一种原核生物基因组编辑的方法，所述方法包括：将上述基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统转化至待进行基因组编辑的原核生物中，获得转化子，进而成功获得进行基因组编辑的原核生物。
其中，所述待进行基因组编辑的原核生物可以为任意编码TnpB系统的原核生物，包括细菌和古菌。例如：冰岛硫化叶菌(优选冰岛硫化叶菌Sulfolobus islandicusREY15A)，耐辐射奇球菌Deinococcus radiodurans，幽门螺杆菌Helicobacter pylori，牙周梭杆菌Fusobacterium periodonticum，嗜碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus，艰难梭菌Clostridioides difficile，沼泽毛球菌Trichococcus palustris，耐盐海洋丝状菌Marininema mesophilum等。
所述基因组编辑包括但不限于基因敲除、DNA片段插入、点突变中的任意一种或多种，同时由于上述系统具有高保真度，因此能够用于单碱基编辑。
与现有技术相比，上述一个或多个技术方案存在如下有益技术效果：
上述技术方案提供的基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统转化效率高，能得到更多的转化子菌落；同时上述系统编辑载体构建较为简便，TnpB编码序列与引导RNA位于同一DNA片段，更易于在宿主内的完成正确折叠与效应复合物的形成。上述技术方案采用内源宿主，确保了蛋白表达以及正确折叠。同时该系统具有高保真度，能够用于单碱基编辑，这在基因编辑过程中具有极大优势。最后TnpB蛋白广泛分布于原核生物中，可用宿主范围广，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是本发明构建的TnpB基因编辑系统引导序列的插入位置。
图2为本发明各实施例中所用到的表达载体pSeSD的质粒图谱。
图3是本发明在原核生物细胞中利用TnpB基因编辑系统进行基因编辑的原理示意图。
图4为本发明实施例1中进行lacS基因敲除的PCR验证结果图。其中，A图为转化子得菌落PCR验证结果，上图为lacS基因编辑验证结果，而下图为质粒引物验证结果。1-8为8个随机挑取的单菌落。B图为1号和2号单菌落PCR测序结果与野生型基因组位点的比对结果。其中第一条和第二条序列分别为1号转化子PCR产物使用正向和反向引物测序结果。第三条和第四条序列为2号转化子PCR产物使用正向和反向引物测序结果。
图5为本发明实施例2中进行herA1基因敲除的PCR验证结果图。其中1-24为24个随机挑取的单菌落。
图6为本发明实施例3中进行cas1基因敲除的PCR验证结果图。其中1-24为24个随机挑取的单菌落。
图7为本发明实施例4中进行lacS基因点突变的结果验证图。其中图A中测序结果的上幅图和下幅图分别为野生型出发菌株和纯化的编辑菌株对应位点的测序结果图。
图8为本发明实施例5中进行orc1-2基因单碱基突变的结果验证图。其中测序结果的上幅图和下幅图分别为野生型出发菌株和纯化的编辑菌株对应位点的测序结果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
如前所述，TnpB系统是否能够在普遍缺失非同源末端连接修复途径的微生物中进行基因编辑尚未得到研究。
有鉴于此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统，所述基因编辑载体系统包含编辑质粒，所述编辑质粒至少含有TnpB编码基因序列、3’端非编码区和引导序列、以及供体DNA片段；
本发明的又一具体实施方式中，所述引导序列为靶向位点对应序列克隆至TnpB编码基因3’端非编码区保守序列之后获得；所述引导序列长度为13-24nt；
由于TnpB蛋白切割双链DNA时需要靶向位点5’端存在TTGAT序列(或者TTTAA序列)，因此所述靶向位点需要位于基因组TTGAT/TTTAA序列紧邻的下游区域，所述靶向位点长度为13-24bp。
所述供体DNA片段用于提供细胞修复TnpB产生的靶位点DNA断裂的模板；在本发明的一个具体实施方式中，当基因编辑具体为基因敲除时，所述供体DNA片段包括拟敲除DNA片段上下游两侧各500bp左右的侧翼DNA序列；当基因编辑具体为单碱基编辑时，所述供体DNA为含有拟突变位点的DNA片段，其突变位点应位于引导序列-靶向序列配对区的前13个位点的任一位置。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统的构建方法，所述构建方法包括；
S1、基因组上靶向位点的选择：由于TnpB蛋白切割双链DNA时需要靶向位点5’端存在TTGAT序列(或者TTTAA序列)，所以靶向位点需要位于基因组TTGAT/TTTAA序列紧邻的下游区域；靶向位点长度可以是13bp-24bp之间的任一长度；
S2、靶向位点对应序列克隆至tnpB基因3’端保守序列之后形成引导序列；由于TnpB蛋白使用其编码基因3’端非编码区保守序列之后的序列作为引导序列，所以需要将选定的靶向序列融合到tnpB基因3’端非编码区保守序列之后；由于TnpB所使用的引导序列较短(13-24nt均可)，所以可以通过将引导序列加到引物上，然后直接与tnpB基因引物一步扩增出含有tnpB基因、3’端非编码区保守序列以及引导序列的DNA片段；
S3、将步骤S2获得的融合片段克隆至表达载体上获得重组表达载体；其中，所述表达载体可以为硫化叶菌表达载体pSeSD；具体的，将PCR产生的融合片段连接到硫化叶菌表达载体pSeSD(Peng et al.,2012，图2)的NdeI-NheI位点之间；载体的ParaS(阿拉伯糖启动子)将会驱动tnpB基因和其3’端区域在硫化叶菌的表达；
S4、克隆供体DNA片段至所述步骤S3获得的重组表达载体上即得。其中，所述供体片段DNA提供细胞修复TnpB产生的靶位点DNA断裂的模板；对于基因敲除实验来说，其供体DNA片段包括拟敲除DNA片段上下游两侧各500bp左右的侧翼DNA序列。分别扩增出拟删除位点两侧各500bp的DNA片段，再通过重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)将两个片段进行融合；然后将融合片段克隆至步骤S3产生的TnpB表达质粒的SalI-NotI位点之间；对于单碱基编辑实验，其供体DNA为含有拟突变位点的DNA片段，其突变位点应位于引导序列-靶向序列配对区的前13个位点的任一位置。
需要说明的是，上述技术方案虽然以冰岛硫化叶菌Rey15A TnpB基因为例，介绍了微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统及其构建方法，但显然只要在任意编码TnpB系统的原核生物中，均可实现，因此本发明的又一具体实施方式中，提供上述基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统在原核生物基因组编辑中的应用。
所述原核生物可以为任意编码TnpB系统的原核生物，包括细菌和古菌。例如：冰岛硫化叶菌(优选冰岛硫化叶菌Sulfolobus islandicus REY15A)，耐辐射奇球菌Deinococcus radiodurans，幽门螺杆菌Helicobacter pylori，牙周梭杆菌Fusobacteriumperiodonticum，嗜碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus，艰难梭菌Clostridioidesdifficile，沼泽毛球菌Trichococcus palustris，耐盐海洋丝状菌Marininemamesophilum等。
所述基因组编辑包括但不限于基因敲除、DNA片段插入、点突变中的任意一种或多种，同时由于上述系统具有高保真度，因此能够用于单碱基编辑。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种原核生物基因组编辑的方法，所述方法包括：将上述基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统转化至待进行基因组编辑的原核生物中，获得转化子，进而成功获得进行基因组编辑的原核生物。
其中，所述待进行基因组编辑的原核生物可以为任意编码TnpB系统的原核生物，包括细菌和古菌。例如：冰岛硫化叶菌(优选冰岛硫化叶菌Sulfolobus islandicusREY15A)，耐辐射奇球菌Deinococcus radiodurans，幽门螺杆菌Helicobacter pylori，牙周梭杆菌Fusobacterium periodonticum，嗜碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus，艰难梭菌Clostridioides difficile，沼泽毛球菌Trichococcus palustris，耐盐海洋丝状菌Marininema mesophilum等。
所述基因组编辑包括但不限于基因敲除、DNA片段插入、点突变中的任意一种或多种，同时由于上述系统具有高保真度，因此能够用于单碱基编辑。
同时，为保证TnpB蛋白的表达以及正确折叠，所述待进行基因组编辑的原核生物为内源宿主。考虑到TnpB蛋白广泛分布于原核生物中(Karvelis et al.,2021)，因此可用宿主范围非常广泛，也因此该技术应用前景广阔。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。若未特别说明，实施例中的实验操作均按常规实验条件或按照材料、试剂制造厂商说明书建议的条件。其中，下述各实施例中所用到的引物序列如表1所示。
表1.各实施例中所用到的引物序列
实施例1
本实施例以利用TnpB基因编辑系统构建lacS基因缺失的冰岛硫化叶菌Rey15A突变株为例进行说明。
1.编辑载体的构建
(1)靶向位点的选择以及引导序列与tnpB序列的融合。首先选择lacS基因(SiR e_2224)TTGAT序列下游紧邻的24nt序列作为靶向序列(GCCATAATAAGGGGTGAG ATTATG)。其次设计tnpB基因(SiRe_2474)正向扩增引物tnpB-F-NdeI以及反向扩增引物tnpB-R-lacS-NheI。tnpB-R-lacS-NheI引物5’端融合了24nt引导序列(与靶向序列相同)(见表1引物序列)。以冰岛硫化叶菌Rey15A基因组DNA为模板，使用tnpB-F-NdeI和tnpB-R-lacS-NheI引物，以及高保真DNA聚合酶PCR扩增tnpB以及含有引导序列的3’端保守区域的融合DNA片段。
(2)将融合片段克隆至pSeSD载体(载体序列图3)。将扩增出的DNA片段进行NdeI-NheI双酶切，并使用T4 DNA连接酶连接至经过NdeI-NheI酶切过的pSeSD载体。
(3)供体DNA的扩增与克隆至表达载体。以冰岛硫化叶菌Rey15A基因组DNA为模板，使用mlacS-Larm-F-SalI/kolacS-Larm-R和kolacS-Rarm-F/mlacS-Rarm-R-NotI引物对(表1)，以及高保真DNA聚合酶分别PCR扩增供体DNA交换臂的左臂和右臂。然后使用扩增出的左臂和右臂DNA为模板，以mlacS-Larm-F-SalI和mlacS-Rarm-R-No tI为引物进行SOE-PCR扩增，获得左右臂融合片段。融合片段经过SalI和NotI双酶切后，连接至经过SalI-NotI酶切的载体，得到lacS基因敲除载体pTnpB-kolacS。
2.突变菌株的获得
(1)编辑质粒的转化实验
一株来源于冰岛硫化叶菌Rey15A的遗传操作菌株(△pyrEF的突变株)，作为出发菌株，制备成感受态细胞。将500ng编辑质粒pTnpB-kolacS电转化至20μl感受态细胞(1200kv,25μF,600Ω)，取20μl电击后细胞涂布至SVT(在基础培养基上补加0.2％sucrose，0.1％ Tryptone和1％vitamin solution)固体培养基平板，76℃培养6天。
(2)转化子进行稀释分离纯化。由于转化子菌落边缘区域含有一定的背景菌落(不含有质粒的感受态细胞)，同时考虑到转化子菌落可能含有一定比例的未编辑的细胞，在此步骤中通过将转化子菌落进行梯度稀释分离，重新涂布平板。具体做法是：首先随机选择5-10个菌落，将其重悬至200μl培养基中进行充分涡旋以打散细胞。而后将涡旋后的细胞进行10倍的梯度稀释。涂布50μl 10-4梯度稀释的细胞至SVT固体平板(补加尿嘧啶)。76℃培养6天，直至单菌落出现。
(3)突变菌株的验证与获得。将长出的单菌落进行菌落PCR验证：将单菌落重悬至20μl水中作为PCR反应的模板，使用lacS-checkF/lacS-checkR和pSeSD-F/pSeSD-R引物对(表1)进行PCR扩增。PCR结果如图4A所示。结果显示在随机挑取的8个转化子中，有5个为不含有质粒的缺失菌株。为进一步验证基因缺失的结果，选择其中1号和5号PCR产物进行Sanger测序分析。结果如图4B所示，2个PCR产物的测序结果均显示lacS基因在预设位点发生了基因确定。证明TnpB能够介导精确的基因敲除。将PCR验证和测序验证正确的转化子进行扩大培养，并保存突变菌株。
实施例2
本实施例以利用TnpB基因编辑系统构建herA1(SiRe_1715)基因缺失的冰岛硫化叶菌Rey15A突变株为例进行说明。
1.编辑载体的构建
(1)靶向位点的选择以及引导序列与tnpB序列的融合。首先选择herA1(SiRe_1715)基因内部TTGAT序列下游紧邻的16nt序列作为靶向序列(AGATCTGGACGTAG AG)。其次使用tnpB-F-NdeI以及反向扩增引物tnpB-R-herA1-NheI(见表1引物序列)，以冰岛硫化叶菌Rey15A基因组DNA为模板，PCR扩增tnpB以及含有引导序列的3’端保守区域的融合DNA片段。
(2)将融合片段克隆至pSeSD载体。将扩增出的DNA片段进行NdeI-NheI双酶切，并使用T4 DNA连接酶连接至经过NdeI-NheI酶切过的pSeSD载体。
(3)供体DNA的扩增与克隆至表达载体。以冰岛硫化叶菌Rey15A基因组DNA为模板，使用koherA1-Larm-F-SalI/koherA1-Larm-R和koherA1-Rarm-F/koherA1-Rarm-R-NotI引物对(表1)，以及高保真DNA聚合酶分别PCR扩增供体DNA交换臂的左臂和右臂。然后使用扩增出的左臂和右臂DNA为模板，以koherA1-Larm-F-SalI和koher A1-Rarm-R-NotI为引物进行SOE-PCR扩增，获得左右臂融合片段。融合片段经过SalI和NotI双酶切后，连接至经过SalI-NotI酶切的载体，得到herA1基因敲除载体pTnpB-koherA1。
2.突变菌株的获得
(1)编辑质粒的转化实验
将500ng编辑质粒pTnpB-koherA1电转化至20μl冰岛硫化叶菌Rey15A的遗传操作菌株(△pyrEF的突变株)的感受态细胞(1200kv,25μF,600Ω)，取20μl电击后细胞涂布至SVT(在基础培养基上补加0.2％sucrose，0.1％ Tryptone和1％vitamin solution)固体培养基平板，76℃培养6天。
(2)转化子进行稀释分离纯化。由于转化子菌落边缘区域含有一定的背景菌落(不含有质粒的感受态细胞)，同时考虑到转化子菌落可能含有一定比例的未编辑的细胞，在此步骤中通过将转化子菌落进行梯度稀释分离，重新涂布平板，从而分离出纯化的菌落。具体做法是：首先随机选择5-10个菌落，将其重悬至200μl培养基中进行充分涡旋以打散细胞。而后将涡旋后的细胞进行10倍的梯度稀释。涂布50μl 10-4梯度稀释的细胞至SVT固体平板(补加尿嘧啶)。76℃培养6天，直至单菌落出现。
(3)突变菌株的验证与获得。将长出的单菌落进行菌落PCR验证：将单菌落重悬至20μl水中作为PCR反应的模板，使用herA1-checkF/herA1-checkR引物对(表1)进行PCR扩增。PCR结果如图5所示。结果显示在随机挑取的24个转化子中，有17个为纯化的缺失菌株，表明TnpB能够介导不同位点的基因敲除。将PCR验证正确的转化子进行扩大培养，并保存突变菌株。
实施例3
本实施例以利用TnpB基因编辑系统构建cas1基因缺失的冰岛硫化叶菌Rey15A突变株为例进行说明。
1.编辑载体的构建
(1)靶向位点的选择以及引导序列与tnpB序列的融合。首先选择cas1(SiRe_0761)基因内部TTGAT序列下游紧邻的22nt序列作为靶向序列(CAGCCGAGTCCGTATC TCTTCC)。其次使用tnpB-F-NdeI以及反向扩增引物tnpB-R-cas1-NheI(见表1引物序列)，以冰岛硫化叶菌Rey15A基因组DNA为模板，PCR扩增tnpB以及含有引导序列的3’端保守区域的融合DNA片段。
(2)将融合片段克隆至pSeSD载体。将扩增出的DNA片段进行NdeI-NheI双酶切，并使用T4 DNA连接酶连接至经过NdeI-NheI酶切过的pSeSD载体。
(3)供体DNA的扩增与克隆至表达载体。以冰岛硫化叶菌Rey15A基因组DNA为模板，使用kocas1-Larm-F-SalI/kocas1A1-Larm-R和kocas1-Rarm-F/kocas1-Rarm-R-NotI引物对(表1)，以及高保真DNA聚合酶分别PCR扩增供体DNA交换臂的左臂和右臂。然后使用扩增出的左臂和右臂DNA为模板，以kocas1-Larm-F-SalI和kocas1-Ra rm-R-NotI为引物进行SOE-PCR扩增，获得左右臂融合片段。融合片段经过SalI和No tI双酶切后，连接至经过SalI-NotI酶切的载体，得到cas1基因敲除载体pTnpB-kocas1。
2.突变菌株的获得
(1)编辑质粒的转化实验
将500ng编辑质粒pTnpB-kocas1电转化至20μl冰岛硫化叶菌Rey15A的遗传操作菌株(△pyrEF的突变株)的感受态细胞(1200kv,25μF,600Ω)，取20μl电击后细胞涂布至SVT(在基础培养基上补加0.2％sucrose，0.1％ Tryptone和1％vitamin solution)固体培养基平板，76℃培养6天。
(2)转化子进行稀释分离纯化。由于转化子菌落边缘区域含有一定的背景菌落(不含有质粒的感受态细胞)，同时考虑到转化子菌落可能含有一定比例的未编辑的细胞，在此步骤中通过将转化子菌落进行梯度稀释分离，重新涂布平板。具体做法是：首先随机选择5-10个菌落，将其重悬至200μl培养基中进行充分涡旋以打散细胞。而后将涡旋后的细胞进行10倍的梯度稀释。涂布50μl 10-4梯度稀释的细胞至SVT固体平板(补加尿嘧啶)。76℃培养6天，直至单菌落出现。
(3)突变菌株的验证与获得。将长出的单菌落进行菌落PCR验证：将单菌落重悬至20μl水中作为PCR反应的模板，使用cas1-checkF/cas1-checkR引物对(表1)进行PCR扩增。PCR结果如图6所示。结果显示在随机挑取的24个转化子中，有19个为纯化的缺失菌株，5个为野生型和缺失株混合菌落，再次表明TnpB能够介导不同位点的高效基因敲除。将PCR验证正确的转化子进行扩大培养，并保存突变菌株。
实施例4
本实施例以利用TnpB基因编辑系统构建lacS基因终止突变的冰岛硫化叶菌Rey15A突变株为例进行说明。
1.编辑载体的构建
(1)靶向位点的选择以及引导序列与tnpB序列的融合。首先选择lacS(SiRe_2224)基因内部TTGAT序列下游紧邻的24nt序列作为靶向序列(GCCATAATAAGGGGTG AGATTATG)。其次使用tnpB-F-NdeI以及反向扩增引物tnpB-lacS-R-NheI(见表1引物序列)，以冰岛硫化叶菌Rey15A基因组DNA为模板，PCR扩增tnpB以及含有引导序列的3’端保守区域的融合DNA片段。
(2)将融合片段克隆至pSeSD载体。将扩增出的DNA片段进行NdeI-NheI双酶切，并使用T4 DNA连接酶连接至经过NdeI-NheI酶切过的pSeSD载体。
(3)供体DNA的扩增与克隆至表达载体。不同于基因敲除载体的供体DNA，用于点突变的供体DNA序列于野生型位点lacS基因的序列差异仅在于突变位点处的AT A密码子(突变为TAA终止密码子)。为构建该供体DNA，以冰岛硫化叶菌Rey15A基因组DNA为模板，使用mlacS-Larm-F-SalI/lacS-Larm-R和lacS-Rarm-F/mlacS-Rarm-R-NotI引物对(表1)，以及高保真DNA聚合酶分别PCR扩增供体DNA交换臂的左臂和右臂。然后使用扩增出的左臂和右臂DNA为模板，以mlacS-Larm-F-SalI和mlacS-Rarm-R-NotI为引物进行SOE-PCR扩增，获得左右臂融合片段。融合片段经过SalI和NotI双酶切后，连接至经过SalI-NotI酶切的载体，得到lacS基因编辑载体pTnpB-mlacS。
2.突变菌株的获得
(1)编辑质粒的转化实验
将500ng编辑质粒pTnpB-mlacS电转化至20μl冰岛硫化叶菌Rey15A的遗传操作菌株(△pyrEF的突变株)的感受态细胞(1200kv,25μF,600Ω)，取20μl电击后细胞涂布至SVT(在基础培养基上补加0.2％sucrose，0.1％ Tryptone和1％vitamin sol ution)固体培养基平板，76℃培养6天。
(2)转化子进行稀释分离纯化。由于转化子菌落边缘区域含有一定的背景菌落(不含有质粒的感受态细胞)，同时考虑到转化子菌落可能含有一定比例的未编辑的细胞，在此步骤中通过将转化子菌落进行梯度稀释分离，重新涂布平板。具体做法是：首先随机选择5-10个菌落，将其重悬至200μl培养基中进行充分涡旋以打散细胞。而后将涡旋后的细胞进行10倍的梯度稀释。涂布50μl 10-4梯度稀释的细胞至SVT固体平板(补加尿嘧啶)。76℃培养6天，直至单菌落出现。
(3)突变菌株的验证与获得。由于lacS点突变的编辑不改变lacS基因的大小，所以转化子是否编辑无法通过PCR产物电泳进行验证。而由于编辑菌落在突变位点形成终止密码子，会导致lacS编码蛋白的提前终止和功能失活。lacS编码蛋白为半乳糖苷酶，能够将X-gal水解产生颜色菌落。野生型细胞因为编码有功能lacS蛋白从而会在含有X-gal平板上为蓝色，而lacS基因成功突变的菌落则因为该蛋白失活而呈现白色。利用这一原理，为此将长出的单菌落进行X-gal染色并统计蓝白菌落的比例，以此推断la cS基因点突变的编辑比例。如图7所示：稀释平板上白色菌落比例达到89.75％。为验证该结果，将随机挑选的白色菌落使用lacS-checkF/lacS-checkR引物对进行菌落PCR，并将PCR产物送测序验证。如图7所示：白色菌落的lacS靶向位点含有设计的终止密码子突变。这表明TnpB能够高效介导基因组点突变编辑。将PCR验证正确的转化子进行扩大培养，并保存突变菌株。
实施例5
本实施例以利用TnpB基因编辑系统构建orc1-2基因单碱基点突变的冰岛硫化叶菌Rey15A突变株为例进行说明。
1.编辑载体的构建
(1)靶向位点的选择以及引导序列与tnpB序列的融合。首先选择orc1-2(SiRe_1231)基因内部TTGAT序列下游紧邻的20nt序列作为靶向序列(ATGAATTGTTATACC TCATC)。其次使用tnpB-F-NdeI以及反向扩增引物tnpB-orc1-2-R-NheI(见表1引物序列)，以冰岛硫化叶菌Rey15A基因组DNA为模板，PCR扩增tnpB以及含有引导序列的3’端保守区域的融合DNA片段。
(2)将融合片段克隆至pSeSD载体。将扩增出的DNA片段进行NdeI-NheI双酶切，并使用T4 DNA连接酶连接至经过NdeI-NheI酶切过的pSeSD载体。
(3)供体DNA的扩增与克隆至表达载体。不同于基因敲除载体的供体DNA，此处用于点突变的供体DNA序列于野生型位点orc1-2基因的序列差异仅在于突变位点处的TTA密码子(突变为TAA终止密码子)(图8)。为构建该供体DNA，以冰岛硫化叶菌Rey15A基因组DNA为模板，使用orc1-2-Larm-F-SalI/orc1-2-Larm-R和orc1-2-Rarm-F/orc1-2-Rarm-R-NotI引物对(表1)，以及高保真DNA聚合酶分别PCR扩增供体DN A交换臂的左臂和右臂。然后使用扩增出的左臂和右臂DNA为模板，以lacS-Larm-F-SalI和lacS-Rarm-R-NotI为引物进行SOE-PCR扩增，获得左右臂融合片段。融合片段经过SalI和NotI双酶切后，连接至经过SalI-NotI酶切的载体，得到orc1-2基因编辑载体pTnpB-morc1-2。
2.突变菌株的获得
(1)编辑质粒的转化实验
将500ng编辑质粒pTnpB-morc1-2电转化至20μl冰岛硫化叶菌Rey15A的遗传操作菌株(△pyrEF的突变株)的感受态细胞(1200kv,25μF,600Ω)，取20μl电击后细胞涂布至SVT(在基础培养基上补加0.2％sucrose，0.1％ Tryptone和1％vitamin solution)固体培养基平板，76℃培养6天。
(2)转化子进行稀释分离纯化。由于转化子菌落边缘区域含有一定的背景菌落(不含有质粒的感受态细胞)，同时考虑到转化子菌落可能含有一定比例的未编辑的细胞，在此步骤中通过将转化子菌落进行梯度稀释分离，重新涂布平板。具体做法是：首先随机选择5-10个菌落，将其重悬至200μl培养基中进行充分涡旋以打散细胞。而后将涡旋后的细胞进行10倍的梯度稀释。涂布50μl 10-4梯度稀释的细胞至SVT固体平板(补加尿嘧啶)。76℃培养6天，直至单菌落出现。
(3)突变菌株的验证与获得。由于orc1-2点突变的编辑不改变基因的大小，所以转化子是否编辑无法通过PCR产物电泳进行验证。为此将长出的单菌落进行菌落PCR，并将PCR产物直接送测序验证。随机挑选8个单菌落，并分别重悬至20μl水中作为PCR反应的模板，使用morc1-2-checkF/morc1-2-checkR引物对(表1)进行PCR扩增。结果显示在随机挑取的8个转化子中，有1个为纯化的点突变菌株，PCR产物测序结果如图8所示。这表明TnpB能够介导单碱基突变，提示TnpB介导的基因编辑具有高保真度。最后将PCR验证正确的转化子进行扩大培养，并保存突变菌株。
综上，本发明利用在源宿主中TnpB蛋白与来源于其自身基因的向导RNA形成的效应复合物对靶向位点产生特异性切割，并且以质粒上供体DNA为模板，通过同源重组修复完成靶向位点的精确编辑。上述方法具有基因编辑效率高、蛋白表达兼容性强、载体构建简单、适用于单碱基基因组编辑、可应用宿主范围广等优点。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统，其特征在于，所述基因编辑载体系统包含编辑质粒，所述编辑质粒至少含有TnpB编码基因序列、3’端非编码区和引导序列、以及供体DNA片段；
其中，所述引导序列为靶向位点对应序列克隆至TnpB编码基因3’端非编码区保守序列之后获得；所述引导序列长度为13-24nt。
2.如权利要求1所述的基因编辑载体系统，其特征在于，所述靶向位点位于基因组TTGAT/TTTAA序列紧邻的下游区域，所述靶向位点长度为13-24bp。
3.如权利要求1所述的基因编辑载体系统，其特征在于，所述供体DNA片段用于提供细胞修复TnpB产生的靶位点DNA断裂的模板；进一步的，
当基因编辑具体为基因敲除时，所述供体DNA片段包括拟敲除DNA片段上下游两侧各500bp左右的侧翼DNA序列；
当基因编辑具体为单碱基编辑时，所述供体DNA为含有拟突变位点的DNA片段，其突变位点应位于引导序列-靶向序列配对区的前13个位点的任一位置。
4.权利要求1-3任一项所述基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统的构建方法，所述构建方法包括；
S1、基因组上靶向位点的选择；
S2、靶向位点对应序列克隆至tnpB基因3’端保守序列之后形成引导序列；
S3、将步骤S2获得的融合片段克隆至表达载体上获得重组表达载体；
S4、克隆供体DNA片段至所述步骤S3获得的重组表达载体上即得。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述靶向位点位于基因组TTGAT/TTTAA序列紧邻的下游区域，所述靶向位点长度为13-24bp。
6.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中，将引导序列加到引物上，然后直接与tnpB基因引物一步扩增出含有tnpB基因、3’端非编码区保守序列以及引导序列的DNA片段即融合片段。
7.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述表达载体为硫化叶菌表达载体pSeSD；具体的，将PCR产生的融合片段连接到硫化叶菌表达载体pSeSD的NdeI-NheI位点之间。
8.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述供体DNA片段用于提供细胞修复TnpB产生的靶位点DNA断裂的模板；进一步的，
当基因编辑具体为基因敲除时，所述供体DNA片段包括拟敲除DNA片段上下游两侧各500bp左右的侧翼DNA序列；
当基因编辑具体为单碱基编辑时，所述供体DNA为含有拟突变位点的DNA片段，其突变位点应位于引导序列-靶向序列配对区的前13个位点的任一位置。
9.权利要求1-3任一项所述基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统在原核生物基因组编辑中的应用。
10.一种原核生物基因组编辑的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1-3任一项所述基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统转化至待进行基因组编辑的原核生物中，获得转化子，进而成功获得进行基因组编辑的原核生物；
进一步的，所述待进行基因组编辑的原核生物为任意编码TnpB系统的原核生物，包括细菌和古菌；更进一步包括冰岛硫化叶菌(包括冰岛硫化叶菌Sulfolobus islandicusREY15A)，耐辐射奇球菌Deinococcus radiodurans，幽门螺杆菌Helicobacter pylori，牙周梭杆菌Fusobacterium periodonticum，嗜碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus，艰难梭菌Clostridioides difficile，沼泽毛球菌Trichococcus palustris，耐盐海洋丝状菌Marininema mesophilum；
进一步的，所述基因组编辑包括基因敲除、DNA片段插入、点突变中的任意一种或多种，所述基因组编辑为单碱基编辑；
进一步的，所述待进行基因组编辑的原核生物为内源宿主。
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