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CN110484548B - 一步法Gateway反应构建表达载体的方法及应用 - Google Patents

一步法Gateway反应构建表达载体的方法及应用 Download PDF

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CN110484548B CN201910677970.8A CN201910677970A CN110484548B CN 110484548 B CN110484548 B CN 110484548B CN 201910677970 A CN201910677970 A CN 201910677970A CN 110484548 B CN110484548 B CN 110484548B
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Abstract

本发明公开了一种一步法Gateway反应构建表达载体的方法及应用，旨在解决现有技术构建表达载体耗时、操作繁琐、成功率低，成本高昂的技术问题。该方法为：以L1‑F、L1‑R、L2‑F和L2‑R为引物扩增含有attL1、attL2的DNA片段；以上下游序列包括目的基因的特异序列和接头序列的特异引物扩增目的基因；将含有attL1片段、含有attL2片段和目的基因片段混合，利用L1‑F和L2‑F进行融合PCR，得含attL重组位点的目的基因；将含有attL重组位点的目的基因与目标载体进行LR反应，得目的基因表达载体。本发明应用于在植物或微生物中表达目的基因，特异性高、成功率100%，操作简单、成本低。

Description

一步法Gateway反应构建表达载体的方法及应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种一步法Gateway反应构建表达载体的方法及应用。
背景技术
传统构建基因工程和分子生物学使用载体，常规采用的方法是酶切和连接，对DNA目的片段DNA进行切割并且回收，既浪费时间过程又繁琐，当质粒载体的分子量比较大时，用酶切和连接的方法构建载体成功率不高。
Gateway技术是Invitrogen已经商业化的技术，它是基于噬菌体的位点特异性重组反应，在目的片段添加重组位点，将两端含有attB1/2位点序列的PCR产物与含attP1/2重组位点的供体载体（Donor clone）混合进行BP反应获得入门载体(Entry clone)，入门载体中目的基因两端为attL1/2重组位点序列，入门载体可以和不同用途的含有attR1/2重组位点的目标载体（Destination clone）进行LR反应获得相应的表达载体（Expressionclone），表达载体中目的基因两侧的位点重组为attB1/2位点。也就是说利用该技术获得表达载体通常需要通过BP反应和LR反应两个步骤，第一步BP反应使目的基因两侧重组位点为attL，第二步使目的基因两侧序列为较短的attB。然而，Gateway 两步反应所用到的酶都很贵，导致成本高昂，制约了Gateway技术更好的使用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种一步法Gateway反应构建表达载体的方法及应用，以解决现有技术中构建表达载体耗时、操作繁琐、成功率低，成本高昂的问题。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一步法Gateway反应构建表达载体的方法，包括以下步骤：
（1）以L1-F和L1-R为引物扩增含有attL1的DNA片段；以L2-F和L2-R为引物扩增含有attL2的DNA片段；所述引物L1-F、L1-R、L2-F和L2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示；
（2）以特异引物扩增目的基因；所述特异引物的上下游序列包括目的基因的特异序列和接头序列；所述上游接头序列为所述引物L1-R的互补序列中任一连续22bp的序列；所述下游接头序列为所述引物L2-R的互补序列中任一连续22bp的序列；
（3）将含有attL1的DNA片段、含有attL2的DNA片段和目的基因片段混合，利用所述引物L1-F和L2-F进行融合PCR，得含有attL重组位点的目的基因片段；
（4）将所得含有attL重组位点的目的基因片段与目标载体进行LR反应，即得目的基因表达载体。
优选的，在步骤（1）～（3）中，进行PCR扩增时，退火温度设为63℃。
优选的，在步骤（1）中，attL1、attL2的扩增以任一入门载体为模板。
优选的，在步骤（2）中，目的基因的以扩增以含有所述基因的DNA为模板。
优选的，在步骤（3）中，所述融合PCR的步骤为：将含有attL1的DNA片段、含有attL2的DNA片段和目的基因片段混合，加入除引物以外其他PCR体系的组分，进行5轮PCR；再加入所述引物L1-F和L2-F进行25个PCR循环。
优选的，在步骤（4）中，LR反应后，转化宿主菌，经鉴定阳性重组菌，再提取质粒，得目的基因表达载体。
将所述方法应用于在植物或微生物中表达目的基因。
与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：
1. 本发明通过一步法Gateway反应构建目的基因的表达载体，利用融合PCR获得含有attL重组位点PCR产物，无需BP反应，即由传统的两步反应Gateway克隆技术改为一步，利用融合PCR代替BP反应，技术上得到改进，成功率100%。
2. 发明人于2018年申请发明专利CN 108342409 A，利用引物进行两轮PCR和长引物方法引入attL序列进行一步LR反应，构建一种植物RNAi表达载体；文献Rapid one-steprecombinational cloning（Fu C, Wehr DR, Edwards J, Hauge B. Nucleic acidsresearch. 2008.）利用其引物进行基因克隆，菌液PCR鉴定LR反应的反应成功率平均值为84%，而本发明的成功率为100%，准确性和特异性得到大幅提高。
3. 本发明方法在PCR程序中，突破了传统的做法，设置较高的退火温度，最低63摄氏度（一般PCR退火温度在60摄氏度以下），研究表明该设置能更好的保证PCR的特异性。
4. 本发明方法在引物设计方面，扩增attL1的引物上创造性的引入ATG，在基因中为起始密码子，不会对基因的功能造成任何影响；扩增attL2的引物上创造性的引入GGG密码子，为最小的氨基酸甘氨酸的密码子，不会对蛋白的结构、功能造成影响；引物的全新改造提高了attL1和attL2序列的差异性，可显著提高扩增的特异性，同时引物所需接头的序列由传统的29bp降到22bp，相对较短的引物不但保证了PCR的成功率，还减少了引物合成的费用。
5. 传统的Gateway需要BP反应和LR反应两步反应，需要Gateway技术的两种酶，即BP酶和LR酶，需要两次大肠杆菌转回和转化子的培养鉴定，耗时4～5天，每个质粒构建的成本将近500元；本发明的方法无需BP反应，只需要一种酶即LR酶，只需一次大肠杆菌转化和转化子的鉴定，需时两天，每个质粒构建的成本不到300元；该方法快速、经济，与现有技术相比，可节约一半以上的时间和约40%的成本。
附图说明
图1为attL1和attL2的序列对比图；
图中，实线框为引物区域，虚线框为attL1和attL2序列区域。
图2为本发明一步法Gateway反应构建表达载体方法原理示意图；
图中，A为引物的结构示意图；B为构建表达载体的流程图。
图3为attL1和attL2序列扩增产物回收后的电泳检测图；
图中，M为Marker，L1为attL1序列扩增产物，L2为attL2序列扩增产物。
图4为GFP序列扩增产物回收后电泳检测图；
图中，M为Marker，GFP为含接头序列的GFP序列扩增产物。
图5为融合PCR产物回收后电泳检测图；
图中，M为Marker，GFP为含有attL重组位点接头的GFP序列扩增产物。
图6为植物表达载体菌液PCR检测图；
图中，M为Marker，GFP为GFP序列扩增产物。
图7为MLA10, MLA10CC，MLA10CC-NB，MLA10CC-NB-ARC序列扩增产物回收后电泳检测图。
图8为融合PCR产物回收后电泳检测图。
图9为菌液PCR鉴定电泳检测图。
图10为植物表达载体瞬时表达烟草表皮细胞的荧光显微镜检测图。
图11为烟草叶片中瞬时表达不同基因引起的细胞坏死状态图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1：一步法Gateway反应构建表达载体的方法
在目的DNA片段的两侧加上attL1/2重组位点序列就直接用于Gateway系统的LR反应，得到反应载体。具体步骤如下：
（1）设计attL重组位点序列特异性引物
鉴于attL1和attL2在序列上高度相似，如图1所示，很难特异的扩增出来，本发明针对该特点设计引物：
对于attL1片段，正向引物L1-F为入门载体上attL1位点上游特异序列，且为了增加序列特异性，在attL1片段反向引物L1-R末端增加了ATG三个碱基的互补序列CTA，ATG为基因起始密码子，增加后不影响最终载体的功能；
对于attL2片段，正向引物L2-F为入门载体上attL2位点下游特异序列，和attL1同源性极小，且为了增加序列特异性，在attL2片段反向引物L2-R末端增加了GGG三个碱基，这三个碱基为甘氨酸的密码子，甘氨酸为分子量最小的氨基酸，空间位阻最小，当目的基因C端融合表达抗原标签时，不会对基因的功能造成影响，当基因C端不融合表达任何氨基酸时，基因会在GGG之前终止，该密码子不参与蛋白质的编码，也不会对基因功能造成影响，即：在不影响功能的前提下增加了序列特异性。
L1-F、L1-R、L2-F和L2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示。
（2）设计扩增目的基因的引物
为了能够使基因片段两端特异的融合attL1和attL2重组位点序列，用于扩增基因的特异引物上下游序列除了目的基因的特异序列以外，还包含一段22bp的接头序列，接头序列为attL1和attL2反向引物（即L1-R和L2-R）的互补序列的部分序列。
（3）扩增attL1、attL2和目的基因
利用L1-F、L1-R、L2-F、L2-R和目的基因的引物分别进行PCR扩增，克隆出attL1、attL2和目的基因。
为了提高特异性，退火温度设为63℃。attL1、attL2的扩增以任意入门载体为模板，目的基因片段的扩增以含有该基因的DNA为模板。扩增结束切胶纯化PCR产物。
（4）融合PCR获得含有attL重组位点接头的目的基因片段
将步骤（3）所得的含有attL1位点的DNA片段、含有attL2位点的DNA片段和目的基因片段混合，加入除引物以外的所有PCR体系组分，进行5轮PCR。
再加入引物L1-F和L2-F继续进行25个PCR循环，其中特异性PCR退火温度均为63℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化，即得含有attL重组位点的目的基因片段。
（5）LR反应构建表达载体
将步骤（4）所得的含有attL重组位点的目的基因片段与目标载体进行LR反应，转化大肠杆菌，经鉴定阳性重组菌，再提取质粒，即得目的基因表达载体。
上述一步法Gateway反应构建表达载体方法原理示意图如图2所示。
实施例2：一步法Gateway反应构建GFP（绿色荧光蛋白）表达载体的方法
（1）试验载体
大麦CEBiP的入门载体pENTY-CEBiP、Gateway过表达载体35ss-GW-3HA（Yu etal., Development of a Gateway-compatible pCAMBIA binary vector for RNAi-mediated gene knockdown in plants. Plasmid. 2018.）和pSAT6-GFP-N1载体（Xu etal., A rapid, highly efficient and economical method of Agrobacterium-mediated in planta transient transformation in living onion epidermis. PloSone. 2014.）为周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室保存。
35ss-GW-3HA为35s强启动子驱动3HA标签基因融合融合表达载体，pSAT6-GFP-N1载体含有GFP基因序列。
（2）构建GFP植物表达载体
a. 扩增attL1、attL2序列
以L1-F和L1-R为引物，以pENTY-CEBiP为模板，扩增含有attL1的DNA片段；以L2-F和L2-R为引物，以pENTY-CEBiP为模板，扩增含有attL2的DNA片段。
PCR反应使用KAPA HiFi PCR Kits(Kapa Biosystems)，体系（50 μL）按照试剂盒说明书配制，每管0.5μL模板，正向引物、反向引物各2.5μL。
PCR反应条件：95℃预变性3 min；98℃变性20 s，63℃退火 20 s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。
如图3所示，扩增片段经电泳检测为单一条带，切胶回收，并纯化。
b. 扩增含接头序列的GFP序列
以GFP-F（SEQ ID NO.5）和GFP-R（SEQ ID NO.6）为引物，以载体pSAT6-GFP-N1为模板，扩增含接头序列的GFP序列。
PCR反应使用KAPA HiFi PCR Kits(Kapa Biosystems)，体系（50 μL）按照试剂盒说明书配制，每管0.5μL模板，正向引物、反向引物各2.5μL。
PCR反应条件：95℃预变性3 min；98℃变性20 s，63℃退火 20 s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。
如图4所示，扩增片段经电泳检测为单一条带，切胶回收，并纯化。
c. 扩增含有attL位点的GFP序列
将上述扩增得到的含有attL1的DNA片段、含有attL2的DNA片段和含接头序列的GFP片段各取2μL，利用融合PCR获得含有attL位点的GFP基因片段。
PCR反应使用KAPA HiFi PCR Kits(Kapa Biosystems)，体系（30 μL）按照试剂盒说明书配制，GFP基因片段、含有attL1的DNA片段和含有attL2的DNA片段各取1μL，先不加引物。PCR反应条件：95℃预变性3 min；98℃变性20 s，63℃退火 20 s，72℃延伸30s，5个循环；72℃延伸5 min。
再打开PCR仪，在反应体系中加入引物L1-F和L2-F各2μL，补加KAPA HiFi PCR 2×Mix 4μL进行PCR。PCR程序：95℃预变性3 min；98℃变性20 s，63℃退火 20 s，72℃延伸40s，25个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。
如图5所示，扩增片段经电泳检测为单一条带，切胶回收，并纯化。
d. 构建表达载体
用含有attL位点的GFP基因片段和35ss-GW-3HA载体在LR酶的催化下进行LR反应。
反应条件：attL位点的GFP基因片段3μL，35ss-GW-3HA载体1μL，LR酶1μL，25℃反应3小时。
将反应产物转化大肠杆菌DH5α，涂布在含有卡那霉素的LB固体培养基上，37℃过夜倒置培养至长出单克隆。
将单克隆转接入LB液体培养基中培养，再进行菌液PCR鉴定，引物为Vect-F（SEQID NO.7）和Vect-R（SEQ ID NO.8），如图6所示统计结果如表1所示，正确率100%。
表1 克隆结果
Figure 208580DEST_PATH_IMAGE001
。
e. 保存阳性克隆菌株，并提质粒，得GFP植物表达载体35ss-GFP-3HA。
实施例3：一步法Gateway反应构建MLA(大麦对白粉病抗病蛋白编码序列)不同区段表达载体的方法
（1）试验载体和目的基因
同实施例2。
MLA的序列参照文献Structure-function analysis of barley NLR immunereceptor MLA10 reveals its cell compartment specific activity in cell deathand disease resistance。序列由上海生工合成，作为模板。
（2）构建MLA不同区段植物表达载体
a. 扩增attL1、attL2序列
同实施例2。
b. 扩增含接头序列的MLA不同区段序列
以MLA-F（SEQ ID NO.9）和MLA-R1 / MLA-R2/ MLA-R3/ MLA-R4（SEQ ID NO.10～13）为引物，以合成的MLA基因为模板，扩增含接头序列的MLA不同区段序列，依次为MLA10全长长度2850bp, MLA10CC长度480bp，MLA10CC-NB长度999bp，MLA10CC-NB-ARC长度1650bp。
PCR反应条件同实施例2；
其中，延伸时间根据基因长度进行调整， 具体为：MLA10全长延伸为72℃ 2min；MLA10CC延伸为72℃ 40s；MLA10CC-NB延伸为72℃ 40s；MLA10CC-NB-ARC延伸为72℃ 1min。
如图7所示，扩增片段经电泳检测为单一条带，切胶回收，并纯化。
c. 扩增含有attL位点的MLA不同区段序列
将上述扩增得到的含有attL1的DNA片段、含有attL2的DNA片段和含接头序列的MLA不同区段序列片段各取2μL，利用融合PCR获得含有attL位点的MLA不同区段序列。
PCR反应同实施例2；
其中延伸时间根据基因长度进行调整，具体为：MLA10全长延伸为72℃ 2min；MLA10CC延伸为72℃ 40s；MLA10CC-NB延伸为72℃ 1min；MLA10CC-NB-ARC延伸为72℃1min20s。
如图8所示，扩增片段经电泳检测为单一条带，切胶回收，并纯化。
d. 构建表达载体
用含有attL位点的MLA不同区段序列片段和35ss-GW-3HA载体在LR酶的催化下进行LR反应。
反应条件：attL位点的GFP基因片段3μL，35ss-GW-3HA载体1μL，LR酶1μL，25℃反应3小时。
将反应产物转化大肠杆菌DH5α，涂布在含有卡那霉素的LB固体培养基上，37℃过夜倒置培养至长出单克隆。
将单克隆转接入LB液体培养基中培养，再进行菌液PCR鉴定，引物为Vect-F（SEQID NO.7）和Vect-R（SEQ ID NO.8），如图9所示，统计结果如表2所示，正确率100%。
表2 克隆结果
Figure 988317DEST_PATH_IMAGE002
。
e. 保存阳性克隆菌株，并提质粒，得系列植物表达载体CTAPi-MLA10-3HA(MLA)、CTAPi-MLA10CC-3HA(CC)、CTAPi-MLA10CC-NB -3HA(CC-NB) 和 CTAPi-MLA10CC-NB-ARC-3HA(CC-NB-ARC)。
实施例3：植物表达载体在本生烟中的表达
（1）植物材料和培养条件
植物材料：本生烟；
培养条件：温室培养；16h 光照（150 μmol·m-2·s-1）、温度 21℃； 8h 黑暗、温度19℃；相对湿度 55%。
（2）转化农杆菌
将实施例2构建的表达载体35ss-GFP-3HA和实施例3构建的表达载体CTAPi-MLA10-3HA、 CTAPi-MLA10CC-3HA、CTAPi-MLA10CC-NB -3HA和 CTAPi-MLA10CC-NB-ARC-3HA的质粒分别通过冻融法转化农杆菌 GV3101；涂布LB平板（含有利福平50mg/L，卡那霉素50mg/L，庆大霉素50mg/L相应抗生素），28℃倒置培养3天至长出单菌落；挑单克隆到1.5mlLB液体培养基（含有利福平50mg/L，卡那霉素50mg/L，庆大霉素50mg/L相应抗生素），28℃200rpm过夜培养；菌液PCR鉴定，得到含相应表达载体的农杆菌GV3101阳性菌株，保存菌株备用。
（3）转化本生烟
a. 活化
将含有35ss-GFP-3HA、CTAPi-MLA10-3HA、CTAPi-MLA10CC-3HA、CTAPi-MLA10CC-NB-3HA、和 CTAPi-MLA10CC-NB-ARC-3HA质粒农杆菌菌液分别在LB平板（含有利福平50mg/L，卡那霉素50mg/L，庆大霉素50mg/L相应抗生素）上划线，28℃倒置培养3天至长出单克隆；挑取农杆菌单克隆，于含有相应抗生素（利福平50mg/L，卡那霉素50mg/L，庆大霉素50mg/L）、乙酰丁香酮（终浓度20μM）和MES（终浓度10mM）的LB液体培养基中28℃培养过夜，然后将菌液按照1：200体积比分别转接到新鲜的相同培养基中继续培养至OD600=1.0～1.5。
b. 预处理
将菌液分别在3000rpm/min下离心15min，收集菌体，用重悬液悬起至OD600=0.7。其中，重悬液成分为：2%重量比的蔗糖； 0.5g/L MS盐；200μM乙酰丁香酮；10mM的MES。重悬后的菌液在暗处放置1～3小时。
c. 瞬时转化
用1ml注射器，除去针头，吸取上述分别含有35ss-GFP-3HA、CTAPi-MLA10-3HA、CTAPi-MLA10CC-3HA、CTAPi-MLA10CC-NB -3HA、和 CTAPi-MLA10CC-NB-ARC-3HA质粒的农杆菌重悬菌液，从本生烟叶片的背面注射，做好标记，弱光培养三天。
（4）试验结果
a. 三天后进行表型检测转化35ss-GFP-3HA的叶片，取注射叶片用荧光显微镜观察绿色荧光。如图10所示，在注射区域看到明显的绿色荧光，说明GFP基因成功表达，即实施例2所构建的表达载体在本生烟的叶片中表达GFP基因。
b. 在烟草叶片中瞬时表达MLA和其不同的片段能够引起细胞坏死，得到肉眼可见表型。
如图11所示，表达CTAPi-MLA10-3HA、CTAPi-MLA10CC-3HA、CTAPi-MLA10CC-NB -3HA、和 CTAPi-MLA10CC-NB-ARC-3HA的叶片直接观察细胞坏死，可以看到有明显的细胞坏死表型，说明表达成功。
上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。
SEQUENCE LISTING
<110> 周口师范学院
<120> 一步法Gateway反应构建表达载体的方法及应用
<130> 2019
<160> 13
<170> PatentIn version 3.2
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<213> 人工合成
<400> 1
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<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工合成
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tgtacaagaa agctgggtcc ccgatctctt gtacagctcg tc 42
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<212> DNA
<213> 人工合成
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acaatcccac tatccttc 18
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gacacacgaa ataaagtaat c 21
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gtacaaaaaa gcaggcttca tggatattgt caccggtgc 39
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tgtacaagaa agctgggtcc ccaggcctgg cttgatgatc ttc 43

Claims (5)

1.一种一步法Gateway反应构建表达载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以L1-F和L1-R为引物扩增含有attL1的DNA片段；以L2-F和L2-R为引物扩增含有attL2的DNA片段；所述引物L1-F、L1-R、L2-F和L2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示；
（2）以特异引物扩增目的基因；所述特异引物的上下游序列包括目的基因的特异序列和接头序列；上游接头序列为所述引物L1-R的互补序列中任一连续22bp的序列；下游接头序列为所述引物L2-R的互补序列中任一连续22bp的序列；
（3）将含有attL1的DNA片段、含有attL2的DNA片段和目的基因片段混合，利用所述引物L1-F和L2-F进行融合PCR，得含有attL重组位点的目的基因片段；
所述融合PCR的步骤为：将含有attL1的DNA片段、含有attL2的DNA片段和目的基因片段混合，加入除引物以外其他PCR体系的组分，进行5轮PCR；再加入所述引物L1-F和L2-F进行25个PCR循环；
在步骤（1）～（3）中，进行PCR扩增时，退火温度设为63℃；
（4）将所得含有attL重组位点的目的基因片段与目标载体进行LR反应，即得目的基因表达载体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，attL1、attL2的扩增以任一入门载体为模板。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（2）中，目的基因的扩增以含有所述基因的DNA为模板。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（4）中，LR反应后，转化宿主菌，经鉴定阳性重组菌，再提取质粒，得目的基因表达载体。
5.权利要求1所述方法在植物或微生物中表达目的基因的应用。
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