CN109971789A - 一种基因编辑系统及其在新金色分枝杆菌中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基因编辑系统及其在新金色分枝杆菌中的应用，属于基因工程技术领域以及生物工程技术领域。此系统可达到对新金色分枝杆菌进行基因编辑的目的，其工作机制如下：先将pML‑Cpf1质粒导入新金色分枝杆菌中，使得pML‑Cpf1质粒上的Cpf1基因、编码DNA末端结合蛋白mku的基因以及编码DNA连接酶LigD的基因表达，然后将pJM‑crRNA质粒导入新金色分枝杆菌中，使得pJM‑crRNA质粒转录生成crRNA序列，crRNA序列会与Cpf1基因结合形成复合物，此复合物会靶向并切割需编辑基因使得新金色分枝杆菌中需编辑的基因被敲除。

Description

一种基因编辑系统及其在新金色分枝杆菌中的应用

技术领域

本发明涉及一种基因编辑系统及其在新金色分枝杆菌中的应用，属于基因工程技术领域以及生物工程技术领域。

背景技术

甾体药物在化药工业中地位突出，是仅次于抗生素的第二大类药物，对机体起着重要的调节作用，包括改善蛋白质代谢、恢复和增强体力、利尿降压等；并且，甾体药物还可治疗风湿性关节炎、湿疹等皮肤病以及前列腺、爱迪森式等内分泌疾病；另外，甾体药物亦可用于避孕、安胎及手术麻醉等领域，在临床上具有广泛的应用。

目前，我国已经把甾体药物新资源开发作为医药行业近期发展的方向和重点之一，甾体药物及甾体药物中间体的出口也已成为我国药物走向世界的重要品种。但是，由于甾体药物合成步骤多、反应复杂、收率低、分离纯化困难，我国在甾体药物研究、生产和临床研究方面与世界先进国家相比还有一定的差距，我国现有的甾体药物品种仅为国外已经上市的甾体药物的三分之一，且大多为中低档产品。因此，急需提升我国甾体药物的生产水平。

雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)是重要的甾体药物中间体，可通过结构上的化学修饰合成几乎所有的甾体类药物，在甾体药物行业中的地位日益突出。目前，我国多使用微生物转化法生产ADD，然而，由于底物投料浓度低、发酵转化周期长以及对甾体微生物代谢机理认知的不足等问题，我国在甾体微生物转化生产上仍明显落后于欧美等国家，这严重制约了我国甾体药物产业绿色转型的步伐。因此，急需提升我国甾体药物中间体ADD的生产水平以提升我国甾体药物的生产水平。

新金色分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)可转化植物甾醇合成ADD，且具有生长快的优势，是一种极具潜力的ADD生产菌，若能对新金色分枝杆菌转化植物甾醇合成ADD过程中的关键酶3-甾酮-Δ1-脱氢酶(KSDD)、胆固醇氧化酶(Cho M)、甾酮C27单加氧酶(SMO)以及3-甾酮-9α-羟化酶(KSH)进行研究，并结合代谢工程策略对新金色分枝杆菌进行改造，极有可能获得能够高效积累ADD的新金色分枝杆菌，此经改造的新金色分枝杆菌无疑是提升我国甾体药物中间体ADD生产水平的一个重要突破。

然而，由于新金色分枝杆菌自身所存在的保护机制排他性较强，外源基因不易在新金色分枝杆菌中稳定存在并表达，因此，可适用于新金色分枝杆菌的基因编辑方法较少，例如，同源重组，但是，由于分枝杆菌同源重组的发生率比其他细菌明显低很多，仅为10^-6～10^-5，并且，利用同源重组对新金色分枝杆菌进行基因编辑还需在基因组上带入抗性标签，利用同源重组对新金色分枝杆菌进行基因编辑具有效率低、周期长、筛选量大、操作复杂等劣势；自杀载体系统(pNIL/pGOAL系列质粒)等其他基因编辑方法虽然可以对新金色分枝杆菌进行基因编辑，但效率也不高，与同源重组相比不具备任何优势。

因此，基因编辑无疑是对新金色分枝杆菌的代谢工程进行改造的一个难点，我们迫切需要完善针对新金色分枝杆菌的基因编辑系统，以便更有效率地对新金色分枝杆菌进行改造。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种对新金色分枝杆菌针对性强且效率高的基因编辑系统。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一种可用于基因编辑的质粒，所述质粒包含pMV261表达载体、Cpf1基因、Pj23119启动子以及NHEJ修复基因，命名为pML-Cpf1质粒；所述pMV261表达载体上的Hsp60启动子被替换为了Tac启动子；所述NHEJ修复基因包含编码DNA末端结合蛋白mku的基因以及编码DNA连接酶LigD的基因；所述Cpf1基因位于pMV261表达载体的Tac启动子的下游以及pMV261表达载体的rrnB终止子上游，由Tac启动子驱动表达；所述Pj23119启动子位于pMV261表达载体的KanR抗性基因的下游；所述NHEJ修复基因位于Pj23119启动子的下游以及pMV261表达载体的复制起点(ori)的上游，由Pj23119启动子驱动表达。

在本发明的一种实施方式中，所述Cpf1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述Pj23119启动子的基因的核苷酸序列如SEQID NO:2所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述DNA末端集合蛋白mku的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述DNA连接酶LigD的基因的核苷酸序列如SEQID NO:4所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述Tac启动子的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示。

本发明还提供了一种可用于基因编辑的质粒，所述质粒依次包含OriM复制子、pMB1复制子、Pj23119启动子、crRNA序列、rrnB终止子以及aadA抗性基因，命名为pJM-crRNA质粒；所述crRNA序列是靶向序列，可特异性靶向靶序列；所述靶序列是指需编辑基因的核苷酸序列。

在本发明的一种实施方式中，编码所述OriM复制子的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述pMB1复制子的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:7所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述Pj23119启动子的基因的核苷酸序列如SEQID NO:2所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述rrnB终止子的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:8所示。

在本发明的一种实施方式中，所述aadA抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。

本发明还提供了一种双质粒CRISPR/Cpf1基因编辑系统，所述系统同时含有上述pML-Cpf1质粒以及pJM-crRNA质粒。

本发明还提供了一种编辑新金色分枝杆菌基因的方法，所述方法为使用上述一种双质粒CRISPR/Cpf1基因编辑系统。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为先将上述一种双质粒CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的pML-Cpf1质粒导入新金色分枝杆菌中，使得pML-Cpf1质粒上的Cpf1基因、编码DNA末端结合蛋白mku的基因以及编码DNA连接酶LigD的基因表达，然后将上述一种双质粒CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的pJM-crRNA质粒导入新金色分枝杆菌中，使得pJM-crRNA质粒转录生成crRNA序列，crRNA序列会与Cpf1基因结合形成复合物，此复合物会靶向并切割需编辑基因使得新金色分枝杆菌中需编辑的基因被敲除，需编辑基因的敲除会使得新金色分枝杆菌基因产生DSB断裂，此时，pML-Cpf1质粒上的表达的DNA末端结合蛋白mku以及DNA连接酶LigD会修复DSB断裂，完成新金色分枝杆菌基因的编辑过程。

本发明还提供了上述pML-Cpf1质粒或上述pJM-crRNA质粒或上述一种双质粒CRISPR/Cpf1基因编辑系统或上述一种编辑新金色分枝杆菌基因的方法在编辑新金色分枝杆菌基因方面的应用。

[有益效果]

(1)本发明提供了一种基于双质粒的CRISPR/Cpf1基因编辑系统，此系统可达到对新金色分枝杆菌进行基因编辑的目的，其工作机制如下：先将pML-Cpf1质粒导入新金色分枝杆菌中，使得pML-Cpf1质粒上的Cpf1基因、编码DNA末端结合蛋白mku的基因以及编码DNA连接酶LigD的基因表达，然后将pJM-crRNA质粒导入新金色分枝杆菌中，使得pJM-crRNA质粒转录生成crRNA序列，crRNA序列会与Cpf1基因结合形成复合物，此复合物会靶向并切割需编辑基因使得新金色分枝杆菌中需编辑的基因被敲除，需编辑基因的敲除会使得新金色分枝杆菌基因产生DSB断裂，此时，pML-Cpf1质粒上的表达的DNA末端结合蛋白mku以及DNA连接酶LigD会修复DSB断裂，完成新金色分枝杆菌基因的编辑过程；

(2)本发明的CRISPR/Cpf1基因编辑系统系统使用的pML-Cpf1质粒和pJM-crRNA质粒就能够在新金色分枝杆菌中稳定存在、表达，不会被新金色分枝杆菌自身所存在的保护机制排斥；

(3)利用本发明的CRISPR/Cpf1基因编辑系统系统对新金色分枝杆菌进行基因编辑，敲除效率较高，可达40％。

附图说明

图1：pMV261表达载体的图谱。

图2：pML-Cpf1质粒的图谱。

图3：pJM-crRNA质粒的图谱。

图4：新金色分枝杆菌JC-12与新金色分枝杆菌JC-12/KshA发酵所得3-甾酮-9α-羟化酶的酶活对比。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的限定。

下述实施例中涉及的pCas9表达载体、pMV261表达载体、ptrc99A表达载体购自优宝生物；下述实施例中涉及的pJYS1Ptac质粒购自南京金斯瑞生物科技有限公司；下述实施例中涉及的ClonExpress II One Step Cloning Kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司；下述实施例中涉及的新金色分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)购自北纳生物，资源编号为ATCC 25795。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：葡萄糖10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L。

斜面/固体培养基：葡萄糖10g/L、胰蛋白胨6g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L、琼脂粉20g/L，pH 7.5。

种子培养基：葡萄糖20g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母粉6g/L、NaCl 10g/L，pH 7.5。

感受态培养基：葡萄糖20g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母粉6g/L、NaCl 10g/L、Tween-800.2％(V/V)，pH 7.5。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

3-甾酮-9α-羟化酶酶活的检测方法：

最适KSH测定体系包含：105μM NADH，200μM甾体底物雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)(溶于100％异丙醇)，50mM Tris-HC1(200μL，pH 7.0)以及30μg KSH酶；底物加入后引发反应，酶标仪SpectraMax 190(Molecular Devices)记录于35℃下，NADH在340nm处的吸光值变化(ε＝6.22mM·cm^-1)，软件Soft-max PRO用以分析酶促反应初速度；

3-甾酮-9α-羟化酶的酶活定义为：1min内氧化1nmol甾体底物所需要的酶量，表示为1min内氧化1nmol NADH所需要的酶量，单位为U。

3-甾酮-9α-羟化酶比酶活的检测方法：

3-甾酮-9α-羟化酶比酶活的计算公式如下：3-甾酮-9α-羟化酶比酶活＝(3-甾酮-9α-羟化酶酶活/3-甾酮-9α-羟化酶重量)，单位为U·mg^-1。

基因敲除效率的检测方法：

基因敲除效率的计算公式如下：基因敲除效率＝(验证敲除成功的菌落数量/挑取转化子的总数量)×100％。

新金色分枝杆菌JC-12感受态细胞的制备方法如下：

将冻管中的新金色分枝杆菌JC-12接种至于10mL LB液体培养基中，30℃摇床培养48h，得到种子液；以1％的接种量将种子液转接至50mL感受态培养基中，30℃摇床培养4～6h，得到菌液；将菌液、10％甘油、干燥无菌的电击杯及灭菌的50mL离心管置于冰上预冷30min；于超净工作台将预冷的菌液装入离心管中，8000rpm、4℃冷冻离心5min，弃去上清，加入10mL 10％甘油并将菌体悬浮起来，8000rpm、4℃冷冻离心5min，重复上一步骤，弃去上清，加入2mL 10％甘油并将菌体悬浮起来，分装至EP管中，每管80μL，得到JC-12感受态细胞。

新金色分枝杆菌JC-12的转化方法如下：

于无菌的超净工作台在JC-12感受态细胞中加入需转化质粒(双蒸无菌水脱)，混匀，冰上放置30min；30min后，将感受态细胞全部转入预冷的电击杯中，迅速擦干杯外壁，置于电穿孔仪中，2200V，5ms电击转化；电击结束后，向电击杯中加入1mL种子培养基，混匀，全部转移至EP管中，30℃摇床复苏4～6h；复苏后，离心收集细胞，去除部分上清，涂布于含抗性的斜面/固体培养基上，30℃培养箱倒置培养5～7天，得到转化后的新金色分枝杆菌JC-12。

实施例1：CRISPR/Cpf1基因编辑系统的构建及使用

具体步骤如下：

1、CRISPR/Cpf1基因编辑系统的构建

(1)通过限制性内切酶Xba I和BamH I和T4连接酶将pMV261表达载体上的Hsp60启动子替换为Tac启动子，并通过限制性内切酶Xba I和HindIII对pMV261表达载体酶切进行线性化，获得基本骨架；

(2)以pJYS1Ptac质粒为模板，使用表1中的P1引物和P2引物进行PCR扩增(PCR扩增反应体系见表2)，获得Cpf1基因，即Frag1；

(3)通过化学合成得到编码DNA末端集合蛋白mku的基因(核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示)以及编码DNA连接酶LigD的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)；以化学合成得到的编码DNA末端集合蛋白mku的基因以及编码DNA连接酶LigD的基因为模板，分别使用表1中的P3引物、P4引物以及P5引物、P6引物进行克隆，获得线性化的编码DNA末端集合蛋白mku的基因以及编码DNA连接酶LigD的基因；将获得的线性化的编码DNA末端集合蛋白mku的基因以及编码DNA连接酶LigD的基因通过P3和P6引物PCR融合，得到融合片段NHEJ修复基因；将得到的NHEJ修复基因通过ClonExpress II One Step Cloning Kit C112连接到pMD18T载体上，得到重组pMD18T-LigD::mku载体；以得到的重组pMD18T-LigD::mku载体为模板，使用表1中的P7引物和P8引物进行克隆，获得Pj23119-LigD::mku表达框架，即Frag2；

(4)将(1)中获得的基本骨架与(2)中获得的Frag1通过ClonExpress II One StepCloning Kit C112组装(Gibson组装连接反应体系见表3)，得到环形载体；通过限制性内切酶Spe I对获得的环形载体酶切进行线性化，得到线性载体；将获得的线性载体与(3)中获得的Frag2通过ClonExpress II One Step Cloning Kit C112组装(Gibson组装连接反应体系见表3)，得到pML-Cpf1质粒(质粒图谱见图1)，其中，Cpf1基因位于pMV261表达载体的Hsp60启动子的下游以及pMV261表达载体的rrnB终止子上游，由Hsp60启动子驱动表达；Pj23119启动子位于pMV261表达载体的KanR抗性基因的下游；NHEJ修复基因位于Pj23119启动子的下游以及pMV261表达载体的复制起点(ori)的上游，由Pj23119启动子驱动表达；

(5)以pMV261表达载体为模板，使用表1中的P11引物和P12引物进行克隆得到OriM复制子，即Frag3；

(6)以ptrc99A载体为模板，使用表1中的P9引物和P10引物进行克隆得到pMB1复制子和aadA抗性基因，即Frag4；

(7)以新金色分枝杆菌中需编辑基因的序列为靶序列，设计可特异性靶向靶序列的靶向序列，得到crRNA序列；由金维智生物科技公司合成此crRNA序列并连接到pMD18T载体上，得到重组pMD18T-crRNA载体；以得到的重组pMD18T-crRNA载体为模板，使用表1中的P13引物和P14引物进行克隆，获得Pj23119-crRNA-rrnB表达框架，即Frag5；

(8)将(6)得到的Frag4、(7)得到的Frag5通过ClonExpress II One Step CloningKit C112组装(Gibson组装连接反应体系见表3)后与(5)得到的Frag3通过ClonExpress IIOne Step Cloning Kit C112组装(Gibson组装连接反应体系见表3)，得到pJM-crRNA质粒(质粒图谱见图2)，其中，pJM-crRNA质粒依次包含OriM复制子、pMB1复制子、Pj23119启动子、crRNA序列、rrnB终止子以及aadA抗性基因。

2、CRISPR/Cpf1基因编辑系统的使用

CRISPR/Cpf1基因编辑系统同时含有pML-Cpf1质粒以及pJM-crRNA质粒，此CRISPR/Cpf1基因编辑系统在使用时，需先将pML-Cpf1质粒导入新金色分枝杆菌中，待筛选验证成功后，再以筛选出来的新金色分枝杆菌转化子做感受态，将pJM-crRNA质粒导入该转化子中。

表1引物及其序列

表2PCR扩增反应体系

ddH<sub>2</sub>0	upto50μL
		2×PhantaMaxMasterMix	25μL
上游引物	2μL
		下游引物	2μL
模板DNA	1μL

表3Gibson组装连接反应体系

线性化载体	90ng
		插入片段	180ng
5×CEIIBuffer	4μL
		ExnaseII	2μL
ddH<sub>2</sub>O	addto20μL

实施例2：CRISPR/Cpf1基因编辑系统的应用

具体步骤如下：

方案一：

(1)CRISPR/Cpf1基因编辑系统的构建

以新金色分枝杆菌JC-12的KshA基因作为需敲除基因，以需敲除基因的核苷酸序列为靶序列，根据靶序列设计用于特异性靶向靶序列crRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示)；按照实施例1，根据设计得到的crRNA构建得到方案一的CRISPR/Cpf1基因编辑系统；

(2)新金色分枝杆菌JC-12的基因编辑

以未使用CRISPR/Cpf1基因编辑系统编辑的新金色分枝杆菌JC-12作为空白对照，将(1)得到的方案一的CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的pML-Cpf1质粒转化到新金色分枝杆菌JC-12感受态细胞中，涂布在斜面/固体培养基(含50μg/mL卡那霉素)上，30℃培养3～4天；挑取转化子，用表4的P15引物和P16引物进行PCR初步验证，挑取验证成功的转化子做感受态，在制备感受态的同时加入0.5mM IPTG于30℃诱导，将(1)得到的方案一的CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的pJM-crRNA质粒转化到转化子感受态细胞中，涂布在斜面/固体培养基(含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL链霉素)上，30℃培养3～4天；挑取转化子，用表4的P15引物和P16引物进行PCR初步验证，挑取验证成功的转化子测序验证。

检测使用方案一的CRISPR/Cpf1基因编辑系统对新金色分枝杆菌JC-12基因进行编辑的基因编辑效率，检测结果为：KshA的敲除效率可达到40％。

挑取空白对照组的新金色分枝杆菌JC-12以及使用方案一的CRISPR/Cpf1基因编辑系统敲除KshA基因后的新金色分枝杆菌JC-12/KshA的单菌落，分别接种于种子培养基中于30℃培养48h，得到菌液；将菌液通过细胞破碎仪破碎，获取粗酶液，将粗酶液离心取沉淀，得到3-甾酮-9α-羟化酶，检测空白对照组的新金色分枝杆菌JC-12发酵得到3-甾酮-9α-羟化酶以及使用方案一的CRISPR/Cpf1基因编辑系统敲除KshA基因后的新金色分枝杆菌JC-12/KshA发酵得到3-甾酮-9α-羟化酶的比酶活，检测结果为：使用方案一的CRISPR/Cpf1基因编辑系统敲除KshA基因后的新金色分枝杆菌JC-12/KshA发酵得到3-甾酮-9α-羟化酶的比酶活较空白对照组的新金色分枝杆菌JC-12发酵得到3-甾酮-9α-羟化酶的比酶活下降了88％(具体可见图3)。

表4引物及其序列

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种基因编辑系统及其在新金色分枝杆菌中的应用

<160> 26

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3903

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtccatct accaagagtt tgtgaataaa tactccctgt ccaagaccct ccgttttgag 60

ctgatccccc aaggcaagac cctcgaaaac atcaaggcac gcggcctcat cctggatgac 120

gaaaagcgcg ctaaggatta caagaaggca aagcagatca tcgacaagta ccaccagttc 180

ttcatcgaag agatcctgtc ctccgtgtgc atctccgagg acctgctcca gaactactcc 240

gatgtctact tcaagctcaa gaagtccgat gacgataacc tgcagaagga cttcaagtcc 300

gctaaggata ccatcaagaa gcagatctcc gaatacatca aggattccga gaagttcaag 360

aacctcttca accagaacct gatcgacgca aagaagggcc aggaatccga tctcatcctg 420

tggctcaagc agtccaagga taacggcatc gagctcttca aggccaactc cgacatcacc 480

gacatcgatg aagctctgga gatcatcaag tccttcaagg gctggaccac ctacttcaag 540

ggcttccacg aaaaccgcaa gaacgtgtac tcctccaacg atatcccaac ctctatcatc 600

taccgcatcg tcgacgataa cctgccaaag ttcctcgaaa acaaggcaaa gtacgagtcc 660

ctgaaggata aggccccaga agctatcaac tacgagcaga tcaagaagga cctggccgaa 720

gagctcacct tcgacatcga ttacaagacc tctgaagtga accagcgcgt cttctccctc 780

gatgaagtgt tcgagatcgc caacttcaac aactacctga accagtccgg catcaccaag 840

ttcaacacca tcatcggcgg caagttcgtc aacggcgaaa acaccaagcg caagggcatc 900

aacgagtaca tcaacctcta ctcccagcag atcaacgata agaccctgaa gaagtacaag 960

atgtccgtgc tcttcaagca gatcctgtcc gacaccgaat ccaagtcctt cgtcatcgac 1020

aagctggagg acgattccga tgtggtcacc accatgcagt ccttctacga acagatcgca 1080

gccttcaaga ccgtggaaga gaagtccatc aaggagaccc tctccctgct cttcgacgat 1140

ctgaaggctc agaagctgga tctctccaag atctacttca agaacgacaa gtccctgacc 1200

gatctctccc agcaggtctt cgacgattac tccgtgatcg gcaccgcagt cctggaatac 1260

atcacccagc agatcgcccc aaagaacctc gataacccat ccaagaagga acaggagctg 1320

atcgccaaga agaccgaaaa ggctaagtac ctgtccctcg agaccatcaa gctggctctc 1380

gaagagttca acaagcaccg cgacatcgat aagcagtgcc gcttcgaaga gatcctcgca 1440

aacttcgctg caatcccaat gatcttcgac gaaatcgcac agaacaagga taacctggcc 1500

cagatctcca tcaagtacca gaaccagggc aagaaggatc tgctccaggc ctccgctgag 1560

gacgatgtga aggcaatcaa ggacctgctc gatcagacca acaacctgct ccacaagctg 1620

aagatcttcc acatctccca gtccgaagac aaggccaaca tcctcgacaa ggatgagcac 1680

ttctacctgg tgttcgaaga gtgctacttc gaactcgcta acatcgtccc actgtacaac 1740

aagatccgca actacatcac ccagaagcca tactccgatg aaaagttcaa gctcaacttc 1800

gagaactcca ccctggcaaa cggctgggac aagaacaagg aaccagataa caccgccatc 1860

ctcttcatca aggacgataa gtactacctg ggcgtgatga acaagaagaa caacaagatc 1920

ttcgacgata aggccatcaa ggaaaacaag ggcgagggct acaagaagat cgtgtacaag 1980

ctgctcccag gcgctaacaa gatgctccca aaggtcttct tctccgcaaa gtccatcaag 2040

ttctacaacc catccgaaga tatcctgcgc atccgcaacc actccaccca caccaagaac 2100

ggctccccac agaagggcta cgaaaagttc gagttcaaca tcgaagactg ccgcaagttc 2160

atcgatttct acaagcagtc catctccaag cacccagagt ggaaggactt cggcttccgc 2220

ttctccgata cccagcgcta caactccatc gatgaattct accgcgaagt ggagaaccag 2280

ggctacaagc tgaccttcga aaacatctcc gagtcctaca tcgattccgt ggtcaaccag 2340

ggcaagctgt acctcttcca gatctacaac aaggacttct ccgcttactc caagggccgc 2400

ccaaacctgc acaccctcta ctggaaggca ctcttcgacg aacgcaacct gcaggatgtg 2460

gtctacaagc tcaacggcga agcagagctg ttctaccgca agcagtccat cccaaagaag 2520

atcacccacc cagccaagga agcaatcgcc aacaagaaca aggataaccc aaagaaggaa 2580

tccgtgttcg agtacgacct gatcaaggat aagcgcttca ccgaggacaa gttcttcttc 2640

cactgcccaa tcaccatcaa cttcaagtcc tccggcgcca acaagttcaa cgatgaaatc 2700

aacctgctcc tgaaggagaa ggctaacgac gtgcacatcc tgtccatcga tcgcggcgaa 2760

cgccacctcg cctactacac cctggtcgac ggcaagggca acatcatcaa gcaggacacc 2820

ttcaacatca tcggcaacga tcgcatgaag accaactacc acgacaagct ggccgctatc 2880

gagaaggacc gcgattccgc tcgcaaggat tggaagaaga tcaacaacat caaggaaatg 2940

aaggaaggct acctctccca ggtggtccac gaaatcgcta agctggtgat cgagtacaac 3000

gcaatcgtgg tcttcgaaga cctgaacttc ggcttcaagc gcggccgctt caaggtggag 3060

aagcaggtct accagaagct ggaaaagatg ctcatcgaga agctgaacta cctcgtgttc 3120

aaggacaacg aattcgataa gaccggcggc gtcctccgtg cataccagct gaccgcccca 3180

ttcgagacct tcaagaagat gggcaagcag accggcatca tctactacgt gccagctggc 3240

ttcacctcta agatctgccc agtgaccggc ttcgtcaacc agctctaccc aaagtacgaa 3300

tccgtctcca agtcccagga gttcttctcc aagttcgaca agatctgcta caacctggat 3360

aagggctact tcgaattctc cttcgactac aagaacttcg gcgataaggc agccaagggc 3420

aagtggacca tcgcatcctt cggctcccgc ctcatcaact tccgcaactc cgacaagaac 3480

cacaactggg atacccgcga agtgtaccca accaaggaac tggagaagct cctgaaggat 3540

tactccatcg aatacggcca cggcgagtgc atcaaggctg caatctgcgg cgaatccgac 3600

aagaagttct tcgcaaagct gacctctgtg ctcaacacca tcctgcagat gcgcaactcc 3660

aagaccggca ccgagctgga ttacctcatc tccccagtgg ccgacgtcaa cggcaacttc 3720

ttcgattccc gccaggctcc aaagaacatg ccacaggacg ctgatgcaaa cggcgcctac 3780

cacatcggtc tgaagggtct catgctcctg ggtcgcatca agaacaacca ggaaggcaag 3840

aagctgaatc tcgtcattaa gaacgaagaa tactttgaat ttgtccagaa ccgcaataac 3900

taa 3903

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttgacagcta gctcagtcct aggtataat 29

<210> 3

<211> 822

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgcgagcca tttggacggg ttcgatcgcc ttcgggctgg tgaacgtgcc ggtcaaggtg 60

tacagcgcta ccgcagacca cgacatcagg ttccaccagg tgcacgccaa ggacaacgga 120

cgcatccggt acaagcgcgt ctgcgaggcg tgtggcgagg tggtcgacta ccgcgatctt 180

gcccgggcct acgagtccgg cgacggccaa atggtggcga tcaccgacga cgacatcgcc 240

agcttgcctg aagaacgcag ccgggagatc gaggtgttgg agttcgtccc cgccgccgac 300

gtggacccga tgatgttcga ccgcagctac tttttggagc ctgattcgaa gtcgtcgaaa 360

tcgtatgtgc tgctggctaa gacactcgcc gagaccgacc ggatggcgat cgtgcatttc 420

acgctgcgca acaagaccag gctggcggcg ttgcgcgtca aggatttcgg caagcgagag 480

gtgatgatgg tgcacacgtt gctgtggccc gatgagatcc gcgaccccga cttcccggtg 540

ctggaccaga aggtggagat caaacccgcg gaactcaaga tggccggcca ggtggtggac 600

tcgatggccg acgacttcaa tccggaccgc taccacgaca cctaccagga gcagttacag 660

gagctgatcg acaccaaact cgaaggtggg caggcattta ccgccgagga ccaaccgagg 720

ttgctggacg agcccgaaga cgtctccgac ctgctcgcca agctggaggc cagcgtgaag 780

gcgcgctcga aggccaactc aaacgtccca acgcctccgt ga 822

<210> 4

<211> 2280

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgggttcgg cgtcggagca acgggtgacg ctgaccaacg ccgacaaggt gctctatccc 60

gccaccggga ccacaaagtc cgatatcttc gactactacg ccggtgttgc cgaagtcatg 120

ctcggccaca tcgcgggacg gccggcgacg cgcaagcgct ggcctaacgg cgtcgaccaa 180

cccgcgttct tcgaaaagca gttggcgttg tcggcgccgc cttggctgtc acgtgcaacg 240

gtggcgcacc ggtccgggac gacgacctat ccgatcatcg atagcgcaac cgggctggcc 300

tggatcgccc aacaggcggc gctggaggtg cacgtgccgc agtggcggtt tgtcgccgag 360

cccggatcag gtgagttaaa tccgggcccg gcaacgcgtt tggtgttcga cctggacccg 420

ggcgaaggcg tgatgatggc ccagctggcc gaggtggcgc gcgcggttcg tgatcttctc 480

gccgatatcg ggttggtcac cttcccggtc accagcggca gcaagggatt gcatctgtac 540

acaccgctgg atgagccggt gagcagcagg ggagccacgg tgttggccaa gcgcgtcgcg 600

cagcgattgg agcaggcgat gcccgcgttg gtcacctcga ccatgaccaa aagcctgcgg 660

gccgggaagg tgtttgtgga ctggagccag aacagcggct cgaagaccac catcgcgccg 720

tactcactac gtggccggac gcatccgacc gtcgcggcgc cacgcacctg ggcggagctc 780

gacgaccccg cactgcgtca gctctcctac gacgaggtgc tgacccggat tgcccgcgac 840

ggcgatctgc tcgagcggct ggatgccgac gctccggtag cggaccggtt gacccgatac 900

cgccgcatgc gcgacgcatc gaaaactccc gagccgattc ccacggcgaa acccgttacc 960

ggagacggca atacgttcgt catccaggag catcacgcgc gtcggccgca ctacgatttc 1020

cggctggaat gcgacggcgt gctggtctcg tgggcggtac cgaaaaacct gcccgacaac 1080

acatcggtta accatctagc gatacacacc gaggaccacc cgctggaata cgccacgttc 1140

gagggcgcga ttcccagcgg ggagtacggc gccggcaagg tgatcatctg ggactccggc 1200

acttacgaca ccgagaagtt ccacgatgac ccgcacacgg gggaggtcat cgtgaatctg 1260

cacggcggcc ggatctctgg gcgttatgcg ctgattcgga ccaacggcga tcggtggctg 1320

gcgcaccgcc taaagaatca gaaagaccag aaggtgttcg agttcgacaa tctggcccca 1380

atgcttgcca cgcacggcac ggtggccggt ctaaaggcca gccagtgggc gttcgaaggc 1440

aagtgggacg gctaccggtt gctggttgag gctgaccacg gcgccgtgcg gctgcggtcc 1500

cgcagcgggc gcgatgtcac cgccgagtat ccgcaattgc gggcattggc ggaggatctc 1560

gccgatcacc acgtggtgct ggacggcgag gccgtcgtac ttgactcctc tggtgtgccc 1620

agcttcagcc agatgcagaa tcggggccgc gacacccgtg tcgagttctg ggcgttcgac 1680

ctgctctacc tcgacggccg cgcgctgcta ggcacccgct accaagaccg gcgtaagctg 1740

ctcgaaaccc tagctaacgc aaccagtctc accgttcccg agctgctgcc cggtgacggc 1800

gcccaagcgt ttgcgtgctc gcgcaagcac ggctgggagg gcgtgatcgc caagaggcgt 1860

gactcgcgct atcagccggg ccggcgctgc gcgtcgtggg tcaaggacaa gcactggaac 1920

acccaggaag tcgtcattgg tggctggcgc gccggggaag gcgggcgcag cagtggcgtc 1980

gggtcgctgc tcatgggcat ccccggtcca ggtgggctgc agttcgccgg gcgggtcggt 2040

accggcctca gcgaacgcga actggccaac ctcaaggaga tgctggcgcc gctgcatacc 2100

gacgagtccc ccttcgacgt accactgccc gcgcgtgacg ccaagggcat cacatatgtc 2160

aagccggcgc tggttgcaga ggtgcgctac agcgagtgga ctccggaggg ccggctgcgt 2220

caatcaagct ggcgtgggct gcggccggac aagaaaccca gtgaggtggt gcgcgaatga 2280

<210> 5

<211> 256

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggagcttatc gactgcacgg tgcaccaatg cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg 60

tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc 120

gttctggata atgttttttg cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga 180

gctgttgaca attaatcatc gtgtggtacc atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 240

cacacaggaa acagaa 256

<210> 6

<211> 1896

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtgagcccac cagctccgta agttcgggtg ctgtgtggct cgtacccgcg cattcaggcg 60

gcagggggtc taacgggtct aaggcggcgt gtacggccgc cacagcggct cttagcggcc 120

cggaaacgtc ctcgaaacga cgcatgtgtt cctcctggtt ggtacaggtg gttgggggtg 180

ctcggctgtc gctggtgttt catcatcagg gctcgacggg agagcggggg agtgtgcagt 240

tgtggggtgg cccctcagcg aaatatctga cttggagctc gtgtcggacc atacaccggt 300

gattaatcgt ggtttattat caagcgtgag ccacgtcgcc gacgaatttg agcagctctg 360

gctgccgtac tggtccctgg caagcgacga tctgctcgag gggatctacc gccaaagccg 420

cgcgtcggcc ctaggccgcc ggtacatcga ggcgaaccca acagcgctgg caaacctgct 480

ggtcgtggac gtagaccatc cagacgcagc gctccgagcg ctcagcgccc gggggtccca 540

tccgctgccc aacgcgatcg tgggcaatcg cgccaacggc cacgcacacg cagtgtgggc 600

actcaacgcc cctgttccac gcaccgaata cgcgcggcgt aagccgctcg catacatggc 660

ggcgtgcgcc gaaggccttc ggcgcgccgt cgatggcgac cgcagttact caggcctcat 720

gaccaaaaac cccggccaca tcgcctggga aacggaatgg ctccactcag atctctacac 780

actcagccac atcgaggccg agctcggcgc gaacatgcca ccgccgcgct ggcgtcagca 840

gaccacgtac aaagcggctc cgacgccgct agggcggaat tgcgcactgt tcgattccgt 900

caggttgtgg gcctatcttc ccgccctcat gcggatctac ctgccgaccc ggaacgtgga 960

cggactcggc cgcgcgatct atgccgagtg ccacgcgcga aacgccgaat ttccgtgcaa 1020

cgacgtgtgt cccggaccgc taccggacag cgaggtccgc gccatcgcca acagcatttg 1080

gcgttggatc acaaccaagt cgcgcatttg ggcggacggg atcgtggtct acgaggccac 1140

actcagtgcg cgccatgcgg ccatctcgcg gaagggcgca gcagcgcgca cggcggcgag 1200

cacagttgcg cggcgcgcaa agtccgcgtc agccatggag gcattgctat gagcgacggc 1260

tacagcgacg gctacagcga cggctacaac tggcagccga ctgtccgcaa aaagcggcgc 1320

gtgaccgccg ccgaaggcgc tcgaatcacc ggactatccg aacgccacgt cgtccggctc 1380

gtggcgcagg aacgcagcga gtggttcgcc gagcaggctg cacgccgcga acgcatccgc 1440

gcctatcacg acgacgaggg ccactcttgg ccgcaaacgg ccaaacattt cgggctgcat 1500

ctggacaccg ttaagcgact cggctatcgg gcgaggaaag agcgtgcggc agaacaggaa 1560

gcggctcaaa aggcccacaa cgaagccgac aatccaccgc tgttctaacg caattgggga 1620

gcgggtgtcg cgggggttcc gtggggggtt ccgttgcaac gggtcggaca ggtaaaagtc 1680

ctggtagacg ctagttttct ggtttgggcc atgcctgtct cgttgcgtgt ttcgttgcgc 1740

ccgttttgaa taccagccag acgagacggg gttctacgaa tcttggtcga taccaagcca 1800

tttccgctga atatcgggga gctcaccgcc agaatcggtg gttgtggtga tgtacgtggc 1860

gaactccgtt gtagtgcctg tggtggcatc cgtggc 1896

<210> 7

<211> 589

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 60

agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 120

cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 180

caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 240

tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 300

ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 360

ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 420

gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 480

gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 540

tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaa 589

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc gtttt 45

<210> 9

<211> 792

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atgagggaag cggtgatcgc cgaagtatcg actcaactat cagaggtagt tggcgtcatc 60

gagcgccatc tcgaaccgac gttgctggcc gtacatttgt acggctccgc agtggatggc 120

ggcctgaagc cacacagtga tattgatttg ctggttacgg tgaccgtaag gcttgatgaa 180

acaacgcggc gagctttgat caacgacctt ttggaaactt cggcttcccc tggagagagc 240

gagattctcc gcgctgtaga agtcaccatt gttgtgcacg acgacatcat tccgtggcgt 300

tatccagcta agcgcgaact gcaatttgga gaatggcagc gcaatgacat tcttgcaggt 360

atcttcgagc cagccacgat cgacattgat ctggctatct tgctgacaaa agcaagagaa 420

catagcgttg ccttggtagg tccagcggcg gaggaactct ttgatccggt tcctgaacag 480

gatctatttg aggcgctaaa tgaaacctta acgctatgga actcgccgcc cgactgggct 540

ggcgatgagc gaaatgtagt gcttacgttg tcccgcattt ggtacagcgc agtaaccggc 600

aaaatcgcgc cgaaggatgt cgctgccgac tgggcaatgg agcgcctgcc ggcccagtat 660

cagcccgtca tacttgaagc tagacaggct tatcttggac aagaagaaga tcgcttggcc 720

tcgcgcgcag atcagttgga agaatttgtc cactacgtga aaggcgagat caccaaggta 780

gtcggcaaat aa 792

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgcagaattc gaagcttatg tccatctacc aagagtttgt ga 42

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atttgtccag aaccgcaata actaaatcga tgtcgacgta gt 42

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atgggttcgg cgtcggagca acgggtgac 29

<210> 13

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ctagtattct cctctttaat ctctagtatc attcgcgcac cacctcactg g 51

<210> 14

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

attaaagagg agaatactag atgcgagcca tttggacggg ttcgatcgcc t 51

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tcacggaggc gttgggacgt ttgagttgg 29

<210> 16

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tctagattga cagctagctc agtcctaggt ataatgctag ctactagaga aagaggagaa 60

atactagatg ggttcggcgt cggagca 87

<210> 17

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ttcgaattct gcagcttcac ggaggcgttg ggacgtttga gttggcct 48

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

atgagggaag cggtgatcgc cgaagtatcg 30

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tttccatagg ctccgccccc ctgacgag 28

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gtgagcccac cagctccgta agttcggg 28

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gccacggatg ccaccacagg cact 24

<210> 22

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

aacaacgtcg acatggcgca caggcaacca tagggcagga aattt 45

<210> 23

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tgcgccatgt cgacgttgtt attataccta ggactgagct agctgtcaa 49

<210> 24

<211> 137

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

ggatccgaat ttctactgtt gtagatcagg caaccatagg gcaggaaatt taaataaaac 60

gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc gttttatctg ttgtttgtcg gtgaacgctc 120

tcctgagtag gacaaat 137

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

aatacctgag cggccagccc 20

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cggggctccg ctgcggtcg 19

Claims (10)

1.一种可用于基因编辑的质粒，其特征在于，所述质粒包含pMV261表达载体、Cpf1基因、Pj23119启动子以及NHEJ修复基因，命名为pML-Cpf1质粒；所述pMV261表达载体上的Hsp60启动子被替换为了Tac启动子；所述NHEJ修复基因包含编码DNA末端结合蛋白mku的基因以及编码DNA连接酶LigD的基因；所述Cpf1基因位于pMV261表达载体的Tac启动子的下游以及pMV261表达载体的rrnB终止子上游，由Tac启动子驱动表达；所述Pj23119启动子位于pMV261表达载体的KanR抗性基因的下游；所述NHEJ修复基因位于Pj23119启动子的下游以及pMV261表达载体的复制起点(ori)的上游，由Pj23119启动子驱动表达。

2.如权利要求1所述的一种可用于基因编辑的质粒，其特征在于，所述Cpf1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.如权利要求1或2所述的一种可用于基因编辑的质粒，其特征在于，编码所述DNA末端集合蛋白mku的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

4.如权利要求1-3任一所述的一种可用于基因编辑的质粒，其特征在于，编码所述DNA连接酶LigD的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

5.如权利要求1-4任一所述的一种可用于基因编辑的质粒，其特征在于，编码所述Tac启动子的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

6.一种可用于基因编辑的质粒，其特征在于，所述质粒依次包含OriM复制子、pMB1复制子、Pj23119启动子、crRNA序列、rrnB终止子以及aadA抗性基因，命名为pJM-crRNA质粒；所述crRNA序列是靶向序列，可特异性靶向靶序列；所述靶序列是指需编辑基因的核苷酸序列。

7.一种双质粒CRISPR/Cpf1基因编辑系统，其特征在于，所述系统同时含有权利要求1-5任一所述的一种可用于基因编辑的质粒以及权利要求6所述的一种可用于基因编辑的质粒。

8.一种编辑新金色分枝杆菌基因的方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求7所述的一种双质粒CRISPR/Cpf1基因编辑系统。

9.如权利要求8所述的一种编辑新金色分枝杆菌基因的方法，其特征在于，所述方法为先将权利要求7所述的一种双质粒CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的pML-Cpf1质粒导入新金色分枝杆菌中，使得pML-Cpf1质粒上的Cpf1基因、编码DNA末端结合蛋白mku的基因以及编码DNA连接酶LigD的基因表达，然后将权利要求7所述的一种双质粒CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的pJM-crRNA质粒导入新金色分枝杆菌中，使得pJM-crRNA质粒转录生成crRNA序列，crRNA序列会与Cpf1基因结合形成复合物，此复合物会靶向并切割需编辑基因使得新金色分枝杆菌中需编辑的基因被敲除，需编辑基因的敲除会使得新金色分枝杆菌基因产生DSB断裂，此时，pML-Cpf1质粒上的表达的DNA末端结合蛋白mku以及DNA连接酶LigD会修复DSB断裂，完成新金色分枝杆菌基因的编辑过程。

10.权利要求1-5任一所述的一种可用于基因编辑的质粒或权利要求6所述的一种可用于基因编辑的质粒或权利要求7所述的一种双质粒CRISPR/Cpf1基因编辑系统或权利要求8或9所述的一种编辑新金色分枝杆菌基因的方法在编辑新金色分枝杆菌基因方面的应用。