CN104152482A

CN104152482A - 运动发酵单胞菌RecET重组系统表达质粒及其构建方法与应用

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Publication number: CN104152482A
Application number: CN201410332018.1A
Authority: CN
Inventors: 谭雪梅; 李涛; 曹庆华; 张义正; 王海燕; 冯红
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2014-07-14
Filing date: 2014-07-14
Publication date: 2014-11-19

Abstract

本发明公开了6个用于运动发酵单胞菌的RecET重组系统表达质粒pSUZM1a-RecET(RecE588T)、pSUZM2a-RecET(RecE588T)、pSUZM3a-RecET(RecE588T)及其构建方法与应用。这6个表达质粒都包含卡那霉素筛选标记基因、组成型启动子Ppdc和RecET（或RecE588T）基因。其区别在于质粒pSUZM1a-RecET(RecE588T)包含运动发酵单胞菌染色体上复制起点oriC、质粒pSUZM2a-RecET(RecE588T)包含运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM401上的复制蛋白序列、质粒pSUZM3a-RecET(RecE588T)包含运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM402上的复制蛋白序列。把表达质粒转入Z. mobilis，在敲入的筛选标记基因同源臂为60bp时，敲入基因能够准确地替换靶基因。本发明的质粒具有很好的应用前景。

Description

运动发酵单胞菌RecET重组系统表达质粒及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及运动发酵单胞菌RecET重组系统的表达质粒pSUZM1a-RecET、pSUZM2a-RecET、pSUZM3a-RecET和pSUZM1a-RecE588T、pSUZM2a-RecE588T、pSUZM3a-RecE588T的构建以及RecET重组系统表达质粒在运动发酵单胞菌中的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)是一种高产乙醇的兼性厌氧型革兰氏阴性细菌。相对于其它菌株， ZM4（ATCC31821）菌株的乙醇生产效率更高，其还具备许多突出的优点，比如糖类摄取能力强，细胞生物质较少，较高的乙醇耐受性，在发酵时不需要加氧控制。但运动发酵单胞菌只能利用葡萄糖、果糖、蔗糖三种碳源，遗传转化率低，严重限制了其在工业生产上的应用，因此，采用分子遗传学的方法来对其进行改造，扩大其底物利用范围具有重要意义。

来源于Rac噬菌体的RecET系统能够有效的介导带有短同源序列的PCR产物进行同源重组，在原核生物中具有很高的重组效率。通过建立体外RecET系统，用于打靶的线性DNA分子能够作用于宿主染色体上的靶基因进行基因组的重组。在大肠杆菌中sbcA缺陷菌株中，整合在染色体上Rac噬菌体的RecE和RecT被激活表达，线性DNA分子在酶的作用下与靶基因两端的同源臂进行同源重组。将重组系统的相关基因克隆到载体或染色体上，其表达的蛋白可直接修饰BAC载体或大肠杆菌染色体，该系统被称为RecET重组系统。RecET重组系统不依赖于RecA，仅依赖RecE、RecT；所需的同源臂短，长度为30~50bp就有很高的重组效率。RecET系统有别于宿主自身的重组系统，与另一种λ-Red重组系统功能相似。Rac噬菌体重组系统由两个基因所编码，recE、recT分别与λ exo和λ bet功能相似，RecE蛋白具有5’-3’双链外切酶活性，产生3’突出端。RecT是一种单链退火蛋白。当发生同源重组时，带有同源臂的供体DNA分子首先经RecE蛋白作用而使其两端形成单链悬突； RecT蛋白形成低聚环和C-形结构并结合到3’突出末端，对ssDNA进行保护，并依靠被结合的同源臂进行配对重组，对靶基因进行分子遗传修饰。

虽然Z.mobilis优点突出，但是其自身存在强大的修复系统，异源表达效率低，很难获得乙醇高产的工程菌。因此，采用RecET同源重组方法，构建的运动单胞菌的RecET重组系统的表达质粒，对Z.mobilis基因组进行遗传改造，可敲除或插入感兴趣基因，使其稳定存在于基因组上，建立一种高效率快捷的重组系统。

发明内容

本发明的目的是提供运动发酵单胞菌RecET重组系统表达质粒pSUZM1a-RecET、pSUZM1a-RecE588T、pSUZM2a-RecET、pSUZM2a-RecE588T、pSUZM3a-RecET、pSUZM3a-RecE588T的构建方法。

本发明提供的运动发酵单胞菌中RecET重组系统表达质粒分别命名为pSUZM1a-RecET、pSUZM1a-RecE588T、pSUZM2a-RecET、pSUZM2a-RecE588T、pSUZM3a-RecET、pSUZM3a-RecE588T。

其中，pSUZM1a-RecET包含来自于运动发酵单胞菌染色体上复制起点oriC、来自于质粒pUC18上的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、运动发酵单胞菌组成型基因启动子-丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc，来自大肠杆菌 DH10B的recE和recT基因；

pSUZM2a-RecET包含来自运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM401的复制蛋白序列、来自于质粒pUC18上的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、来自于运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc，来自大肠杆菌 DH10B的recE和recT基因；

pSUZM3a- RecET包含来自运动发酵内源性质粒pZZM402上的复制蛋白序列、来自质粒pUC18上的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、来自运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc，来自大肠杆菌 DH10B的recE和recT基因；

pSUZM1a-RecE588T 包含来自运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM401的复制蛋白序列、来自于质粒pUC18上的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、来自运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc，来自大肠杆菌 DH10B的recE588片段（recE基因编码其蛋白N端588个氨基酸的序列被删减，称为recE588）和recT基因；

pSUZM2a-RecE588T包含来自于运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM401的复制蛋白序列、来自于质粒pUC18上的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、来自运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc，来自大肠杆菌 DH10B的recE588片段和recT基因；

pSUZM3a-RecE588T包含来自于运动发酵内源性质粒pZZM402上的复制蛋白序列、来自于质粒pUC18上的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、来自运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc，来自大肠杆菌 DH10B的 recE588片段和recT基因；

本发明提供pSUZM1a-RecET、pSUZM1a-RecE588T、pSUZM2a-RecET、pSUZM2a-RecE588T、pSUZM3a-RecET、pSUZM3a-RecE588T质粒的构建方法，包括如下步骤：

1）pSUZM1a-RecET，pSUZM2a-RecET，pSUZM3a-RecET的构建方法。

（1）分别以运动发酵单胞菌表达质粒pSUZM1a（含有运动发酵单胞菌染色体上复制起点oriC、质粒pUC18上的复制起点、运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc）、pSUZM2a（含有运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM401的复制起点和DNA复制酶基因序列、质粒pUC18上的复制起点、运动发酵单胞菌的组成型基因启动子Ppdc）、pSUZM3a（含有运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM402的复制起点和DNA复制酶基因序列、质粒pUC18上的复制起点、运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc）为模板，用以下引物5’-TGTAATCGATAATTCAGAGGAATAAAGGTAGCTTGCAGTGGG-3’和5’-GGAAGAGTGGTTTTGTGCTCATTGCTTACTCCATATAT-3’进行PCR扩增，得到载体骨架片段A(pSUZM1a)、B(pSUZM2a)和C（pSUZM3a）。

（2）以大肠杆菌DH10B基因组DNA为模板，用以下引物5’-ATATATGGAGTAAGCAATGAGCACAAAACCACTCTTCC-3’和5’- CCCACTGCAAGCTACCTTTATTCCTCTGAATTATCGATTACA -3’进行PCR扩增，得到编码RecET系统的串联基因片段recET（包含recE和recT基因）；

（3）将载体骨架片段A、B和C分别与基因片段recET分别经电泳凝胶回收后等摩尔混合，混合片段用T4 DNA聚合酶进行处理，然后进行退火反应重组，转化大肠杆菌，获得重组质粒pSUZM1a-RecET，pSUZM2a-RecET，pSUZM3a-RecET。

2）pSUZM1a-RecE588T，pSUZM2a-RecE588T，pSUZM3a-RecE588T的构建方法。

（1）分别以运动发酵单胞菌表达质粒pSUZM1a、pSUZM2a、pSUZM3a为模板，用以下引物5’-TGTAATCGATAATTCAGAGGAATAAAGGTAGCTTGCAGTGGG-3’和5’- TTCTACGATTACGGGATCCATTGCTTACTCCATATAT -3’进行PCR扩增，得到载体骨架片段D(pSUZM1a)、E(pSUZM2a)和F(pSUZM3a)。

（2）以大肠杆菌DH10B基因组DNA为模板，用以下引物5’ -ATATATGGAGTAAGCAATGGATCCCGTAATCGTAGAA-3’和5’- TTCTACGATTACGGGATCCATTGCTTACTCCATATAT -3’进行PCR扩增，得到编码RecET系统的串联基因片段recE588T；

（3）将载体骨架片段D、E和F分别与基因片段recE588T分别经电泳凝胶回收后等摩尔混合，混合片段用T4 DNA聚合酶进行处理，然后进行退火反应重组，转化大肠杆菌，获得重组质粒pSUZM1a-RecE588T，pSUZM2a-RecE588T，pSUZM3a-RecE588T。

附图说明

图1 表达质粒pSUZM1a-RecET的构建策略。

图2 表达质粒pSUZM2a-RecET的构建策略。

图3 表达质粒pSUZM3a-RecET的构建策略。

图4 RecET基因、RecE588T基因片段和构建表达质粒的pSUZM2a-RecET，pSUZM2a-RecE588T，pSUZM3a-RecET，pSUZM3a-RecE588T的B，E，C，F线性载体骨架的PCR电泳图。1：RecET基因片段；2：RecE588T基因片段；3:B(pSUZM2a)；4:E(pSUZM2a)；5:C(pSUZM3a)；6:F(pSUZM3a)。

图5 构建表达质粒pSUZM1a-RecET，pSUZM1a-RecE588T的A，D线性载体骨架的PCR电泳图。M：λEcoT14 DNA marker；1：A(pSUZM1a)；2：D(pSUZM1a)。

图6 表达质粒pSUZM1a-RecET，pSUZM1a-RecE588T，pSUZM2a-RecET，pSUZM2a-RecE588T，pSUZM3a-RecET，pSUZM3a-RecE588T的PCR鉴定电泳图。1-6分别为pSUZM1a-RecET，pSUZM2a-RecET， pSUZM3a-RecET，pSUZM1a-RecE588T， pSUZM2a-RecE588T， pSUZM3a-RecE588T的PCR结果。

图7 表达质粒pSUZM1a-RecET的双酶切鉴定。M：λEco T14 DNA marker；1：EcoR I和Nco I双酶切。

图8表达质粒pSUZM2a-RecET的双酶切鉴定。M：λEco T14 DNA marker；1：EcoR I和Nco I双酶切。

图9表达质粒pSUZM3a-RecET的单酶切鉴定。M：λEco T14 DNA marker；1：Pst I单酶切。

图10 表达质粒pSUZM1a-RecE588T表达质粒的构建策略。

图11 表达质粒pSUZM2a-RecE588T表达质粒的构建策略。

图12 表达质粒pSUZM3a-RecE588T表达质粒的构建策略。

图13 表达质粒pSUZM1a-RecE588T的双酶切鉴定。M：λEco T14 DNA marker；EcoR I和Nco I双酶切。

图14 表达质粒pSUZM2a-RecE588T的双酶切鉴定M：λEco T14 DNA marker；1：EcoR I和Nco I双酶切。

图15 表达质粒pSUZM3a-RecE588T的单酶切鉴定。M：λEco T14 DNA marker；1：Pst I单酶切。

图16 PCR扩增ADH B基因的敲入片段。M：λEco T14 DNA marker；1：经两次PCR扩增产物“ADH B-tet-ADH B”

图17 用于鉴定敲入四环素基因tet引物位置的示意图。

图18运动发酵单胞菌ZM4菌株ADH B基因敲除及tet基因敲入的PCR鉴定。1：敲除重组子菌液以引物tet-in 上游和tet-in 下游扩增的产物；2：重组子以引物Gen-ADH B 上游和tet-in 下游扩增片段；3：重组子以引物tet-in 上游和Gen-ADH B 下游扩增的产物；4：重组子以引物Gen-ADH B 上游和Gen-ADH B 下游扩增的产物；M：λ-EcoT14 I digest DNA Marker；6：野生型ZM4以引物tet-in 上游和tet-in 下游扩增的产物对照；7：引物Gen-ADH B 上游和tet-in 下游扩增对照；泳道8：引物tet-in 上游和Gen-ADH B 下游扩增对照；9：引物Gen-ADH B 上游和Gen-ADH B 下游扩增对照。

图19 重组菌株ZM4-ΔADH B的PCR产物测序结果。阴影部分为同源重组后将ADH B基因替换为Tet基因部分，非阴影部分为ZM4基因组

图20 PCR扩增ADH A基因的敲入片段。M：λEco T14 DNA marker；1：经两次PCR扩增产物“ADH A-tet-ADH A”。

图21鉴定敲入四环素基因tet的引物的位置示意图。

图22运动发酵单胞菌ZM4菌株ADH A基因敲除及tet基因敲入的PCR鉴定。1：敲除重组子菌液以引物tet-in 上游和Gen-ADH A 下游扩增的产物；2：野生型ZM4以引物tet-in 上游和Gen-ADH A 下游扩增的阴性对照；3：重组子以引物Gen-ADH A 上游和Gen-ADH A 下游扩增的产物；4：野生型ZM4以引物Gen-ADH A 上游和Gen-ADH A 下游扩增的阴性对照；5：重组子以引物Gen-ADH A 上游和tet-in下游扩增片段；6：野生型ZM4以引物Gen-ADH A 上游和tet-in下游扩增的阴性对照；7：重组子以引物tet-in 上游和tet-in 下游扩增的产物；泳道8：生型ZM4以引物tet-in 上游和tet-in 下游扩增的阴性对照；M：λ-EcoT14 I digest DNA Marker。

具体实施方式

实施实例1 表达质粒pSUZM1a-RecET、pSUZM2a-RecET、pSUZM3a-RecET和pSUZM1a-RecE588T、pSUZM2a-RecE588T、pSUZM3a-RecE588T的构建。

运动发酵单胞菌RecET表达质粒pSUZM1a-RecET、pSUZM2a-RecET、pSUZM3a-RecET的构建策略如图1，图2，图3，具体步骤如下：

1）大肠杆菌DH10B基因组DNA提取。取2mL菌液，12000rpm离心2min后的沉淀用TE洗涤，离心后再用1mLTE重悬菌体。加入53μL 10%SDS，混匀，加入11μL 10mg/mL蛋白酶K，混匀，37℃温育1 h。加入211μL 5mol/L NaCl，再加入146μL CTAB/NaCl（50 g/ L CTAB ,0.5 mol/ L NaCl），混匀，65℃温育10min。加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），混匀，12000rpm离心5min，保留上清。上清中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），混匀，12000rpm离心5min，保留上清。加入0.6倍的异丙醇，混匀，12000rpm离心5min，收集DNA沉淀，用70%乙醇洗涤DNA沉淀后离心，弃上清。用100μL TE或去离子水溶解DNA，加入终浓度为20μg/mLRNaseA，4℃保存。

2）设计引物ETpdc 上游和ETpdc 下游，ETpdc上游引物下划线所标识的碱基为与所连接载体的pdc启动子基因同源，ETpdc 下游引物下划线所标识的碱基与所连接载体Kan抗性基因同源。设计引物Ppdc上游和Ppdc下游，其中， Ppdc上游引物和Ppdc下游引物下划线部分与RecET基因同源的序列。其具体序列如下：

ETpdc 上游：5’-ATATATGGAGTAAGCAATGAGCACAAAACCACTCTTCC-3’

ETpdc 下游：5’-CCCACTGCAAGCTACCTTTATTCCTCTGAATTATCGATTACA-3’，

Ppdc 上游：5’-TGTAATCGATAATTCAGAGGAATAAAGGTAGCTTGCAGTGGG-3’

PpdcET 下游：5’-GGAAGAGTGGTTTTGTGCTCATTGCTTACTCCATATAT-3’

以大肠杆菌DH10B基因组DNA为模板，引物ETpdc 上游和ETpdc 下游扩增RecET基因片段；以pSUZM1a、pSUZM2a、pSUZM3a质粒为模板，引物Ppdc上游和Ppdc下游扩增载体骨架片段A、B、C。

PCR反应体系：PrimeSTAR MAX (5 U/μL) 12.5μL，上游引物 1.5μL，下游引物 1.5μL，模板DNA 1 μL，加水至25μL。

PCR扩增条件为：94℃预变性3min，98℃ 10 s，58℃退火30 s，72℃延伸1min 30s，扩增35个循环。最后72℃充分延伸10 min。。

基因片段PCR结果如图4所示，扩增RecET基因大小为3.4Kb，与预期结果相符。扩增后的载体骨架A(pSUZM1a)、B(pSUZM2a)、C(pSUZM3a)电泳结果如图4，图5。 A、B、C大小分别为3.3Kb，4.8Kb，4.4Kb，与预期相符。

3）将以上扩增得到的PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。

4）不依赖基因序列和连接反应克隆(SLIC)，具体步骤如下：

在3个（编号为1、2、3）0.5mL的EP管中，分别加入4 μL 5×T4 DNA 聚合酶缓冲液（Fermentas），0.1 μL T4 DNA 聚合酶（5 U/μL Fermentas）；1号管加入1μL A片段、1 μL RecET基因片段；2号管加入1μL B片段、1 μL RecET基因片段；3号管加入1μL C片段、1 μL RecET基因片段。然后3管都分别加ddH₂O 到20 μL。

37℃孵育6 min，然后将EP管置于70℃的水浴中孵育10min，终止反应。取8 μL上述T4 DNA 聚合酶处理的DNA到另外一个新的0.5mL的 EP管，加入2μL 10×退火缓冲液（100mmol/L Tris，pH 8.0，1mol/L NaCl，10mmol/L EDTA），10μL ddH₂O。将混合物置于75℃的水浴中反应15min，然后自然冷却至室温。

5）SLIC产物转化大肠杆菌

将10μL SLIC反应产物与200 μL大肠杆菌感受态细胞混匀，置于冰上静置30 min，42 ℃热激30 s后，冰浴2 min，加入0.8 mL SOC培养液，37 ℃振荡恢复培养1 h，直接取0.1 mL转化混合物或4,000 rpm 离心收集全部菌体悬液，涂布于含有卡那霉素（50ng/mL）的琼脂平板上，37 ℃倒置培养过夜。

6）质粒pSUZM1a-RecET, pSUZM2a-RecET, pSUZM3a-RecET提取

接种菌落于2mL LB培养基，取1.5 mL菌液于EP 管中，10,000 rpm 离心2 min，弃上清液。加入0.1mL 溶液I，充分混合，静置5 min，加入0.2 mL 溶液Ⅱ，混匀，置冰浴上5 min，加入0.15 mL 溶液III，混匀后置冰浴上20 min。10,000 rpm 离心5 min，取上清液，加入2 倍体积的无水乙醇，混匀后于-20℃静置30 min。10,000rpm 离心5 min，弃上清液，用70%乙醇清洗一次，10000rpm离心2min，弃上清，沉淀干燥后溶于50 μL ddH₂O 或TE 中，加入0.5μL10 mg/mL RNaseA 37℃消化10min，获得重组质粒pSUZM1a-RecET, pSUZM2a-RecET, pSUZM3a-RecET。

7）表达质粒pSUZM1a-RecET, pSUZM2a-RecET, pSUZM3a-RecET的PCR鉴定

以pSUZM1a-RecET, pSUZM2a-RecET, pSUZM3a-RecET质粒为模板，用引物ETpdc 上游和ETpdc下游扩增RecET基因片段。

对PCR产物进行电泳检测结果如图6，扩增片段大小均为3.4Kb，与预期相符。

8）表达质粒pSUZM1a-RecET, pSUZM2a-RecET, pSUZM3a-RecET的酶切鉴定

采用限制性内切酶EcoR I （Fermentas）和Nco I双酶切方法对重组pSUZM1a-RecET、pSUZM2a-RecET质粒进行验证，体系为：EcoR I 1μL，Nco I 1μL，重组质粒3μL，10×Tango Buffer 2μL，ddH₂O 3μL，37℃孵育3h。pSUZM1a-RecET、pSUZM2a-RecET双酶切电泳检测结果如图7，图8，其DNA条带大小分别为5038bp+2742bp和6176bp+2742bp，与预期一致。

采用Pst I 对pSUZM3a-RecET重组质粒进行单酶切验证，体系为Pst I 1μL，重组质粒3μL，10×Tango Buffer 2μL，ddH₂O 3μL，37℃孵育3h。电泳检测结果如图9，酶切获得的两条片段为8039bp+439bp，与预期一致。

实例2 运动发酵单胞菌RecET表达质粒pSUZM1a-RecE588T、pSUZM2a-RecE588T、pSUZM3a-RecE588T的构建

表达质粒pSUZM1a-RecE588T、pSUZM2a-RecE588T、pSUZM3a-RecE588T的构建策略如图10，11，12，具体步骤如下：

1）设计引物588p 上游和ETpdc下游， 588p 上游引物中下划线标识的碱基与所连接载体的pdc启动子基因同源，ETpdc 下游引物中下划线表示的碱基与所连接载体的Kan抗性基因同源。设计引物Ppdc上游和Ppdc588 下游，其两端加入下划线部分与RecE588T基因同源的序列。具体序列如下：

588p 上游：5’- ATATATGGAGTAAGCAATGGATCCCGTAATCGTAGAA-3’

ETpdc 下游：5’-CCCACTGCAAGCTACCTTTATTCCTCTGAATTATCGATTACA-3’

Ppdc 上游：5’-TGTAATCGATAATTCAGAGGAATAAAGGTAGCTTGCAGTGGG-3’

Ppdc588 下游：5’-TTCTACGATTACGGGATCCATTGCTTACTCCATATAT-3’，

以大肠杆菌DH10B基因组DNA为模板，引物588p 上游和ETpdc下游扩增RecE588T基因片段；以pSUZM1a、pSUZM2a、pSUZM3a质粒为模板，引物Ppdc上游和Ppdc588 下游扩增载体骨架片段D、E、F。

PCR扩增条件为：94℃预变性3min，98℃ 10 s，58℃退火30 s，72℃延伸1min 30s，扩增35个循环。最后72℃充分延伸10 min。

基因片段PCR结果如图4所示，扩增RecE588T基因大小为1639bp，与预期结果相符。对扩增后的载体骨架D(pSUZM1a)、E(pSUZM2a)、F(pSUZM3a)线性载体电泳结果如图5，6，扩增出产物大小为3.3Kb，4.8Kb，4.4Kb，与预期相符。

2)将以上扩增得到的PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。

4)不依赖基因序列和连接反应克隆(SLIC)，具体步骤如下：

在3个（编号为4、5、6）0.5mL的EP管中，分别加入4 μL 5×T4 DNA 聚合酶缓冲液（Fermentas），0.1 μL T4 DNA 聚合酶（5 U/μL Fermentas）；4号管加入1μL D片段、1 μL RecE588T基因片段；5号管加入1μL E片段、1 μL RecE588T基因片段；6号管加入1μL F片段、1 μL RecE588T基因片段。然后3管都分别加ddH₂O 到20 μL。

5)SLIC产物转化大肠杆菌

转化方法与实例1相同。

6）质粒pSUZM1a-RecE588T, pSUZM2a-RecE588T, pSUZM3a-RecE588T提取

提取方法与实例1相同。

7）表达质粒pSUZM1a-RecE588T, pSUZM2a-RecE588T, pSUZM3a-RecE588T的PCR鉴定

以pSUZM1a-RecE588T, pSUZM2a-RecE588T, pSUZM3a-RecE588T的PCR质粒为模板， 588p 上游和ETpdc下游为为引物，扩增RecE588T基因片段。

对PCR产物进行电泳检测结果如图6，扩增片段大小为1.6Kb，与预期相符。

8）表达质粒pSUZM1a-RecE588T, pSUZM2a-RecE588T, pSUZM3a-RecE588T的酶切鉴定

采用EcoR I （Fermentas）和Nco I双酶切方法对重组pSUZM1a-RecE588T、pSUZM2a-RecE588T载体进行验证，体系为：EcoR I 1μL，Nco I 1μL，重组质粒3μL，10×Tango Buffer 2μL ddH₂O 3μL，37℃孵育3h。pSUZM1a-RecE588T、pSUZM2a-RecE588T双酶切电泳检测结果如图13，14，双酶切获得的DNA条带分别为3274bp+2189bp和4965bp+2189bp与预期一致。

采用Pst I 对pSUZM3a-RecE588T重组质粒进行单酶切验证，体系为Pst I 1μL，重组质粒3μL，10×Tango Buffer 2μL，ddH₂O 3μL，37℃孵育3h。电泳检测结果如图15，单酶切获得的两条片段为6129bp+439bp与预期一致。

实例3 RecET重组系统表达质粒在运动发酵单胞菌中的应用

1) 运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶II（ADH B）基因的敲除

（1） RecET/RecE588T系统表达质粒运动发酵单胞菌的电转化：挑取运动发酵单胞菌单菌落ATCC31821培养于5 mL RM培养基中（RM培养基1000 mL含：酵母粉5.0 g，葡萄糖20.0 g，(NH₄)₂SO₄1.0 g， KH₂PO₄1.0 g，MgSO₄ · 7H₂O 0.5 g），得到菌液全部接种于100 mL RM培养基中，培养至OD₆₀₀为0.3-0.4。于4℃ 6000 rpm 10 min收集菌体，用10 mL 10%甘油清洗菌体，于4℃ 6000 rpm 10 min收集菌体，重复清洗一次，将收集到的菌体悬浮于2 mL 10%甘油中，制备成感受态。

采用美国BTX 公司的ECM830脉冲导入仪。将1μg RecET/RecE588T系统表达质粒与200 μL Z. mobilis电击感受态混合后在2500 V、200 Ω、50μF条件下电击，电击后把菌液迅速转移至3mL RM培养基中静止恢复3 h，取100 μL菌液涂布于含卡那霉素（200 μg/mL）的平板，3d后先出现转化子。野生型运动发酵单胞菌本身无卡那霉素抗性，因此筛选平板上长出的重组单克隆即为成功导入了RecET或RecE588T系统的运动发酵单胞菌。

（2）敲入基因的制备

运动发酵单胞菌自身具有氨苄青霉素和氯霉素抗性，不具有四环素抗性，RecET表达质粒具有卡那霉素抗性，因此选择质粒pBR322的四环素标记基因作为敲入基因，易于检测RecET系统的重组。

扩增以四环素基因为主体，两端带有与ADH B基因同源的双链DNA片段。扩增出四环素基因，并在引物两端引入ADH B基因上下游同源臂。采用两轮PCR的方法，第一轮扩增以载体pBR322为模板，产生30bp左右的靶向基因同源臂的PCR产物；第二轮扩增以第一轮扩增的PCR产物为模板，使同源臂达到60bp。

设计引物Ptetr-ADH B-1上游，Ptetr-ADH B-1下游；引物Ptetr-ADH B -1上游引入30bp同源臂（下划线标识），引物Ptetr-ADH B-1下游引入 32bp同源臂；设计引物Ptetr-ADH B-2上游，Ptetr-ADH B-2下游；引物Ptetr-ADH B -2上游30bp引入30bp同源臂，引物Ptetr-ADH B -2下游引入28bp同源臂（下划线标识）。具体序列如下：

Ptetr-ADH B-1上游：5’-TGAGAAAACGTCTCGAAAACGGGATTAAAAGCCACCTGACGTCTAAGAAAC-3’

Ptetr-ADH B-1下游：5’-TGACGGTAGGCTTAATAGCCTGTAAAAATTTGTGTTCTGCCAAGGGTTGG-3

Ptetr-ADH B-2上游：5’-GGTGATTTTACTCGTTTTCAGGAAAAACTTTGAGAAAACGTCTCGAAAACG-3’

Ptetr-ADH B-2下游：5’-TAATAGGCTTTAAATGGCAAATTATTTATGACGGTAGGCTTAATAGCCTG-3’

第一轮PCR扩增以质粒PBR322做模板，以Ptetr-ADH B-1上游，Ptetr-ADH B-1下游为引物，扩增包含靶向基因同源臂的四环素基因片段1。第二轮PCR以片段1模板，以Ptetr-ADH B-2上游，Ptetr-ADH B-2下游为引物，扩增片段2。

两次PCR扩增后，四环素上下游各带有与ADH B基因同源的60bp（上游：GGTGATTTTACTCGTTTTCAGGAAAAACTTTGAGAAAACGTCTCGAAAACGGGATTAAAA，下游：CAAATTTTTACAGGCTATTAAGCCTACCGTCATAAATAATTTGCCATTTAAAGCCTATTA）二次扩增后的PCR产物类似“ADH B同源臂-tet-ADH B同源臂”，PCR结果如图16，产物大小为1586bp，与预期相符。扩增产物经纯化试剂纯化后用于RecET重组敲除靶基因。

（3）线性双链DNA片段打靶运动发酵单胞菌ADH B基因进行同源重组。

电转化运动发酵单胞菌：挑取含有RecET表达质粒pSUZM2a-RecET、pSUZM2a-RecE588T运动发酵单胞菌单菌落培养于5 mL RM培养基中，得到菌液全部接种于100 mL RM培养基中，培养至OD₆₀₀为0.3-0.4。于4℃ 6000 rpm 10 min收集菌体，用10 mL 10%甘油清洗菌体，于4℃ 6000 rpm 10 min收集菌体，重复清洗一次，将收集到的菌体悬浮于2 mL 10%甘油中，制备感受态。

采用美国BTX 公司的ECM830脉冲导入仪，将600ng“ADH B-tet-ADH B”双链线性DNA片段与100μL Z. mobilis电击感受态混合后注入规格为2mm反应小池内，在2500 V、200 Ω、50 μF条件下电击，电击后把菌液迅速转移至3mL RMG培养基（含酵母粉5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，KH2PO4 1.0 g/L）中静止恢复培养16h，使双链DNA片段在RecET同源重组系统下与运动发酵单基因组上的ADH B基因进行同源重组，四环素基因tet替换了ADH B基因。16h后收集菌液涂布于含卡那霉素（800 μg/mL），四环素（90μg/mL）的RMG琼脂平板，5d后先出现转化子。

（4）运动发酵单胞菌ADH B缺失重组子的鉴定

为验证敲除结果，检测四环素基因携带的同源臂与靶向基因是否实现了同源重组。在四环素基因内部位置处设计一对引物： tet-in上游和tet-in下游；在ADH B基因同源臂上游287bp处和同源臂下游839bp处基因组位置设计一对引物，筛选引物位置如图17，：Gen-ADH B上游和Gen-ADH B下游。其具体序列如下：

tet-in 上游：CTATGGCGTGCTGCTAGCGC

tet-in 下游：TGGACCGCTGATCGTCACG

Gen-ADH B 上游: 5’-AGGCAAAATCGGTAACCACAT-3’

Gen-ADH B 下游:5’-GCGGCTCAAATAAGACGATA-3

以转化的单菌落为模板，以tet-in 上游和tet-in 下游、tet-in 上游和Gen-ADH B 下游、Gen-ADH B 上游和Gen-ADH B 下游、Gen-ADH B 上游和tet-in 下游引物配对方式，对重组子进行PCR验证，以排除电转过程中存在的线性片段干扰产生假阳性。

PCR反应体系：PrimeSTAR MAX (5 U/μL) 12.5μL，上游引物 1.5μL，下游引物 1.5μL，模板DNA 1 μL，加水至25μL。PCR扩增条件为：94℃预变性3min，98℃ 10 s，58℃退火30 s，72℃延伸1min 30s，扩增35个循环。最后72℃充分延伸10 min。

结果显示，PCR均能扩增出特异条带，且符合预期大小相符，结果如图18。将以tet-in 上游和Gen-ADH B 下游引物PCR扩增产物进行回收测序，结果如图19。

结果显示，在运动发酵单胞菌基因组ADH B基因上下游同源臂处，即从基因组5’端GGTGATTTTACTCGTTTTCAGGAAAAACTTTGAGAAAACGTCTCGAAAACGGGATTAAAA开始，发生了同源重组，将ADH B基因替换为tet基因，在CAAATTTTTACAGGCTATTAAGCCTACCGTCATAAATAATTTGCCATTTAAAGCCTATTA3’末端，恢复为正常的运动发酵单胞菌基因组序列，从而使该菌株获得了抗四环素能力，证明通过构建RecET替换了ADH B基因，实现了运动发酵单胞菌的基因敲除，并获得ZM4-ΔADH B菌株。

2)运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶I（ADH A）基因的敲除（1）扩增以四环素基因为主体，两端带有与ADH A基因同源的双链DNA片段。扩增出四环素基因，并在两端引入ADH A基因上下游同源臂。采用两轮PCR的方法，第一轮扩增以载体pBR322为模板，产生30bp左右的靶向基因同源臂的PCR产物；第二轮扩增以第一轮扩增的PCR产物为模板，使同源臂达到60bp。设计引物Ptetr-ADH A-1上游，Ptetr-ADH A-1下游，引物Ptetr-ADH A -1上游引入31bp同源臂（下划线标识），引物Ptetr-ADH A-1下游引入 30bp同源臂；Ptetr-ADH A-2上游，Ptetr-ADH A-2下游，引物Ptetr-ADH A -2上游30bp引入29bp同源臂，引物Ptetr-ADH A -2下游引入30bp同源臂（下划线标识）。具体序列如下：

Ptetr-ADH A-1上游：

5’-GAAAAAAGCTTGGATAGCGGCTTATAGCAACGCCACCTGACGTCTAAGAAAC-3’

Ptetr-ADH A-1下游：

5’-CGTTTTCCCTATATTCGCAAGATGTATGTCTGTTCTGCCAAGGGTTGG-3’ Ptetr-ADH A-2上游：

5’-TAGCGATCGCCGAATAGAAGGCATGAGAAGAAAAAAGCTTGGATAGCGG-3’

Ptetr-ADH A-2下游：

5’-TAACTTTCTGGATCGTAATCGGCTGGCAATCGTTTTCCCTATATTCGCAAG-3’

PCR反应体系：PrimeSTAR MAX (5 U/μL) 12.5μL，上游引物 1.5μL，下游引物 1.5μL，模板DNA 1 μL，加水至25μL。PCR扩增条件为：94℃预变性3min，98℃ 10 s，58℃退火30 s，72℃延伸1min 30s，扩增35个循环。最后72℃充分延伸10 min。两次PCR扩增后，四环素上下游各带有与ADH A基因同源的60bp，二次扩增后的PCR产物类似“ADH A-tet-ADH A”，PCR结果如图20，产物大小为1586bp与预期相符。扩增产物经纯化试剂纯化后用于RecET重组敲除ADH A基因。

(2)线性双链DNA片段打靶运动发酵单胞菌ADH A基因进行同源重组。电击转化运动发酵单胞菌方法同上。 (3)运动发酵单胞菌ADH A缺失重组子的鉴定为验证敲除结果，检测四环素基因携带的同源臂与靶向基因是否实现了同源重组。首先在四环素基因内部设计验证引物，同时在ADH A基因的上下游设计引物，设计引物位置如图21，将各引物配对后对突变株进行PCR鉴定。

在四环素基因内部位置处设计一对引物： tet-in上游和tet-in下游；在ADH A基因同源臂上游131bp处和同源臂下游149bp处基因组位置设计一对引物：Gen-ADH A上游和Gen-ADH A下游。其具体序列如下：

tet-in 上游：5’-CTATGGCGTGCTGCTAGCGC-3’

tet-in 下游：5’-TGGACCGCTGATCGTCACG-3’

Gen-ADH A 上游：5’-CGCTATGTTGAATATGGGCA-3’

Gen-ADH A 下游：5’-CTCTCAATCCGCTGCCTT-3’

以转化的单菌落为模板，以tet-in 上游和tet-in 下游、tet-in 上游和Gen-ADH A 下游、Gen-ADH A 上游和Gen-ADH A 下游、Gen-ADH A 上游和tet-in 下游引物配对方式，对重组子进行PCR验证，以排除电转过程中因存在的线性片段而干扰产生假阳性。 PCR反应体系：PrimeSTAR MAX (5 U/μL) 12.5μL，上游引物 1.5μL，下游引物 1.5μL，模板DNA 1 μL，加水至25μL。 PCR扩增条件为：94℃预变性3min，98℃ 10 s，58℃退火30 s，72℃延伸1min 30s，扩增35个循环。最后72℃充分延伸10 min。结果显示，PCR均能扩增出特异条带，且符合预期大小的片段，如图22。结果显示，在运动发酵单胞菌基因组ADH A基因上下游同源臂处，发生了同源重组，将ADH A基因替换为tet基因，从而使该菌株获得了抗四环素能力，证明通过构建RecET替换了ADH A基因，实现了运动发酵单胞菌的基因敲除，并获得ZM4-ΔADH A菌株。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学

<120>运动发酵单胞菌RecET重组系统表达质粒及其构建方法与应用

<160> 22

<210> 1

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

atatatggag taagcaatga gcacaaaacc actcttcc 38

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

cccactgcaa gctaccttta ttcctctgaa ttatcgatta ca 42

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

tgtaatcgat aattcagagg aataaaggta gcttgcagtg gg 42

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

ggaagagtgg ttttgtgctc attgcttact ccatatat 38

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

atatatggag taagcaatgg atcccgtaat cgtagaa 37

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

cccactgcaa gctaccttta ttcctctgaa ttatcgatta ca 42

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

tgtaatcgat aattcagagg aataaaggta gcttgcagtg gg 42

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

ttctacgatt acgggatcca ttgcttactc catatat 37

<210> 9

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

tgagaaaacg tctcgaaaac gggattaaaa gccacctgac gtctaagaaa c 51

<210> 10

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

tgacggtagg cttaatagcc tgtaaaaatt tgtgttctgc caagggttgg 50

<210> 11

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

ggtgatttta ctcgttttca ggaaaaactt tgagaaaacg tctcgaaaac g 51

<210> 12

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 12

taataggctt taaatggcaa attatttatg acggtaggct taatagcctg 50

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 13

ctatggcgtg ctgctagcgc 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 14

tggaccgctg atcgtcacg 19

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 15

aggcaaaatc ggtaaccaca t 21

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 16

gcggctcaaa taagacgata 20

<210> 17

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 17

gaaaaaagct tggatagcgg cttatagcaa cgccacctga cgtctaagaa ac 52

<210> 18

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 18

cgttttccct atattcgcaa gatgtatgtc tgttctgcca agggttgg 48

<210> 19

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 19

tagcgatcgc cgaatagaag gcatgagaag aaaaaagctt ggatagcgg 49

<210> 20

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 20

taactttctg gatcgtaatc ggctggcaat cgttttccct atattcgcaa g 51

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 21

cgctatgttg aatatgggca 20

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 22

ctctcaatcc gctgcctt 18

Claims

1.一类能在运动发酵单胞菌中应用RecET重组系统的表达质粒：pSUZM1a-RecET、pSUZM2a-RecET、pSUZM3a-RecET，包含运动发酵单胞菌内源性基因启动子、筛选标记基因、recE和recT基因；以及表达质粒pSUZM1a-RecE588T、pSUZM2a-RecE588T、pSUZM3a-RecE588T，包含运动发酵单胞菌内源性基因启动子、筛选标记基因、recE588 (recE基因编码其蛋白N端588个氨基酸的序列被删减，简称为recE588) 片段和recT基因。

2.根据权利1所述的质粒，其特征在于：

1）pSUZM1a-RecET包含来自运动发酵单胞菌染色体上复制起点oriC、来自质粒pUC18上的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、来自运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc，来自大肠杆菌 DH10B的 recE基因和recT基因；

2）pSUZM2a-RecET包含来自运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM401的复制蛋白序列、来自于质粒pUC18上的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、来自运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc，来自大肠杆菌 DH10B的recE基因和recT基因；

3）pSUZM3a- RecET包含来自运动发酵内源性质粒pZZM402上的复制蛋白序列、来自质粒pUC18上的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、来自运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc，来自大肠杆菌 DH10B的recE基因和recT基因；

4) pSUZM1a-RecE588T 包含来自运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM401的复制蛋白序列、来自于质粒pUC18上的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、来自运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc，来自大肠杆菌 DH10B的recE588片段和recT基因；

5）pSUZM2a-RecE588T包含来自于运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM401的复制蛋白序列、来自于质粒pUC18上的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、来自来自运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc，来自大肠杆菌 DH10B的recE588片段()和recT基因；

6）pSUZM3a-RecE588T包含来自于运动发酵内源性质粒pZZM402上的复制蛋白序列、来自于质粒pUC18上的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、来自运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc，来自大肠杆菌 DH10B的 recE588片段和recT基因。

3.根据权利1所述的质粒，其构建方法如下：

1）pSUZM1a-RecET，pSUZM2a-RecET，pSUZM3a-RecET的构建方法

（1）分别以运动发酵单胞菌表达质粒pSUZM1a（含有运动发酵单胞菌染色体上复制起点oriC、质粒pUC18上的复制起点、运动发酵单胞菌的组成型基因启动子Ppdc）、pSUZM2a（含有运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM401的复制起点和DNA复制酶基因序列、质粒pUC18上的复制起点、运动发酵单胞菌的组成型基因启动子Ppdc）、pSUZM3a（含有运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM402的复制起点和DNA复制酶基因序列、质粒pUC18上的复制起点、运动发酵单胞菌的组成型基因启动子Ppdc）为模板，用以下引物5’-TGTAATCGATAATTCAGAGGAATAAAGGTAGCTTGCAGTGGG-3’和5’-GGAAGAGTGGTTTTGTGCTCATTGCTTACTCCATATAT-3’进行PCR扩增，得到载体骨架片段A(pSUZM1a)、B(pSUZM2a)和C（pSUZM3a）；

（3）将载体骨架片段A、B和C分别与基因片段recET分别经电泳凝胶回收后等摩尔混合，混合片段用T4 DNA聚合酶进行处理，然后进行退火反应重组，转化大肠杆菌，获得重组质粒pSUZM1a-RecET，pSUZM2a-RecET，pSUZM3a-RecET；

2）pSUZM1a-RecE588T，pSUZM2a-RecE588T，pSUZM3a-RecE588T的构建方法

（1）分别以运动发酵单胞菌表达质粒pSUZM1a、pSUZM2a、pSUZM3a为模板，用以下引物5’-TGTAATCGATAATTCAGAGGAATAAAGGTAGCTTGCAGTGGG-3’和5’- TTCTACGATTACGGGATCCATTGCTTACTCCATATAT -3’进行PCR扩增，得到载体骨架片段D(pSUZM1a)、E(pSUZM2a)和F(pSUZM3a)；

（2）以大肠杆菌DH10B基因组DNA为模板，用以下引物5’ -ATATATGGAGTAAGCAATGGATCCCGTAATCGTAGAA-3’和5’- TTCTACGATTACGGGATCCATTGCTTACTCCATATAT -3’进行PCR扩增，得到编码RecET系统的串联基因片段recE588T（包含recE588和recT基因）；