CN114507683A

CN114507683A - 一种敲除Kan抗性基因的SURE菌株及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN114507683A
Application number: CN202111375759.4A
Authority: CN
Inventors: 陈书元; 李中万; 周智; 叶国杰; 吴振华; 王立军
Original assignee: Hangzhou Jiayin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Jiayin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-11-19
Filing date: 2021-11-19
Publication date: 2022-05-17

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种敲除Kan抗性基因的SURE菌株及其构建方法和应用。本发明利用新兴的单碱基编辑技术，将SURE基因组中的Kanamycin抗性进行有效敲除，构建无Kanamycin抗性的SURE菌株用于后续的感受态制备以及AAV相关质粒构建，降低了ITR丢失频率，解决了目前AAV载体和SURE菌株由于具备相同Kan抗性标签而无法使用的问题。

Description

一种敲除Kan抗性基因的SURE菌株及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种敲除Kan抗性基因的 SURE菌株及其构建方法和应用。

背景技术

作为基因治疗新兴的明星载体，腺相关病毒(AAV)载体备受关注，其基因组两端的两个反向末端重复序列(ITR)是AAV包装复制必须的结构，但是ITR非常容易丢失从而影响病毒颗粒的包装和感染力。研究表明，ITR序列的不同区段缺失，都会对rAAV的生产造成影响。特别是在产业化生产过程中，大规模发酵时产生的ITR序列的部分或完全缺失，将造成AAV产量的严重下降。AAV载体质粒构建过程中，提高ITR稳定性愈发重要。

SURE菌种是K-12系大肠杆菌，菌株体内重组酶系统整条通路被破坏，从而利用SURE菌株制备的感受态细胞在克隆实验中提高了外源甲基化DNA 的克隆效率，增强外源DNA的稳定性；解决真核生物DNA存在较多“十字型”、“Z字型”等二级或三级结构导致的克隆问题，可进行蓝白斑筛选。此菌种可以抑制无用处的DNA重排，故专门用来克隆那些在常规菌种不稳定的DNA片段，如重复DNA片段、Z-DNA、超长质粒和其他不稳定片段，针对AAV相关质粒构建，防止ITR丢失有非常好的效果。

SURE菌株自身携带Kanamycin抗性，同时临床使用的AAV质粒同样需要使用Kanamycin抗性，导致临床使用的质粒无法利用SURE感受态进行构建、扩繁，而目前尚未有有效的构建方法来构建能够有效敲除Kan抗性基因的SURE菌株，从而限制了AAV载体质粒产业化应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种敲除Kan抗性基因的SURE菌株及其构建方法，是的所述构建方法能够有效敲除SURE菌株Kan抗性基因，用于后续的感受态制备以及AAV相关质粒构建，降低ITR丢失频率；

本发明的另外一个目的在于提供上述菌株及其构建方法在AAV质粒构建或疫苗制备中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种敲除Kan抗性基因的SURE菌株，由单碱基编辑系统敲除SURE基因组中的Kanamycin抗性基因。

单碱基基因编辑技术，又称不依赖于DNA链断裂的基因编辑技术； dCas9-PmCDA1-UGI和Cas9n-PmCDA1-UGI单碱基编辑系统是基于七鳃鳗的胞嘧啶脱氨酶PmCDA1开发的两种单碱基编辑系统，PmCDA1能催化C脱氨基变成U，而U在DNA复制过程中会被识别成T，尿嘧啶糖基化酶抑制剂 UGI能防止尿嘧啶糖基化酶将U糖基化引起碱基切除修复。利用sgRNA将Cas9-胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶糖基化酶抑制子三者构成的融合蛋白靶向于 gRNA(sgRNA中与目标DNA互补配对的序列)互补配对的靶位点，并将该靶位点的胞嘧啶(C)的氨基去除，从而使得C变成尿嘧啶(U)，随着DNA的复制， U又会被胸腺嘧啶(T)替代，最终实现单碱基C→T的精确、高效突变。

在本发明具体实施方式中，所述单碱基编辑器系统为基于 dCas9-PmCDA1-UGI的单基因编辑器系统，可通过将各基因原件可被承载在市售载体上使用；dCas9、PmCDA1、UGI序列来自Addgene质粒 pScI_dCas9-CDA-UL，质粒编号：108551。

在本发明具体实施方式中，所述单碱基编辑器系统的gRNA序列为SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示核苷酸序列：CGAGCGAGCACGUACUCGGA 和/或GAACAAGAUGGAUUGCACGC。

所述gRNA所针对的Kanamycin抗性基因靶点分别为其序列的259-278bp 靶点(GAACAAGATGGATTGCACGC)和675-694bp靶点 (CGAGCGAGCACGTACTCGGA)，Kanamycin抗性基因如SEQ ID NO.3所示。所述gRNA同样可以通过载体转录出来，更为高效的是可以同dCas9-PmCDA1-UGI构建到相同的载体上，在载体上的转录gRNA的序列如SEQ ID NO.4(CGAGCGAGCACGTACTCGGA)和SEQ ID NO.5 (GAACAAGATGGATTGCACGC)所示，同时gRNA还需要一段结合Cas9 必需的scaffold序列(支架序列)，可选择本领域常规的序列，在本发明中为SEQ ID NO.6所示。通过gRNA的引导，在目标靶点位置实现单碱基C→T的突变，从而使靶点位置均突变出终止密码子，导致Kanamycin无法正常表达，丢失Kanamycin抗性。

本发明中，支架序列为：

SEQ ID NO.6：

GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGT TATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC。

同时，本发明还提供了所述敲除Kan抗性基因的SURE菌株的构建方法，包括：

步骤1、构建可调控质粒丢失的基因元件和包含针对SURE基因组中 Kanamycin抗性基因的单碱基编辑系统的载体；

步骤2、将步骤1所述基因元件插入到所述载体中，获得重组载体；

步骤3、将所述重组载体转化至SURE菌株中进行敲除，获得Kanamycin 抗性敲除的Sure菌株；

步骤4、启动可调控手段控制所述基因元件，使Kanamycin抗性敲除的 Sure菌株中的重组载体丢失，获得纯净的Kanamycin抗性敲除的Sure菌株。

为了在敲除Kanamycin抗性基因后能够获得纯净的Sure菌株，本发明构建方法通过构建诸如温敏型复制子的方式来调控质粒丢失，后期通过控制温度即可使转化的重组载体丢失。在本发明具体实施方式中，所述温敏型复制子为pSC101 ori&repA101，以pCas-DC133质粒(图谱见图1)为模板可以扩增出目标复制子，将该温敏型复制子替换单碱基编辑系统所在载体的复制子。

构建包含针对SURE基因组中Kanamycin抗性基因的单碱基编辑系统的载体，可在市售载体pUC19质粒基础上添加转录gRNA的序列(SEQ ID NO.4 和SEQ ID NO.5所示)、dCas9-PmCDA1-UGI的表达序列，如本发明所使用的通过试剂公司构建的Sureko-pUC19 ori质粒(图谱见图2)。

通过双酶切、overlap PCR等方式可以将温敏型复制子插入到单碱基编辑系统所在载体的复制子位置，获得重组载体，在转入到SURE菌株后即可完成Kanamycin抗性基因的敲除，然后通过温度调节丢失重组载体，获得纯净的菌株。

本发明曾尝试Red/ET重组技术以及基因编辑敲除技术，结果显示并不能有效的敲除SURE基因组中Kanamycin抗性基因，只有在本发明的碱基编辑技术下可以做到对SURE菌株的改造。

同时，针对本发明获得的Kanamycin抗性敲除的Sure菌株进行了ITR丢失频率的验证，结果显示随着培养时间延长，导入AAV载体的各菌株的ITR 丢失比例逐渐上升；但本发明菌株的ITR丢失比例远低于作为对照的EPI300 菌株，即使培养23.5h本发明菌株的ITR丢失比例仍然低于10％；在培养19.5h 内本发明菌株丢失比例可以保持在很低的水平，这完全可以满足产业化的需求。基于此优异的技术效果，本发明提出了所述SURE菌株或本发明所述构建方法在构建AAV载体或疫苗制备中的应用。

由以上技术方案可知，本发明利用新兴的单碱基编辑技术，将SURE基因组中的Kanamycin抗性进行有效敲除，构建无Kanamycin抗性的SURE菌株用于后续的感受态制备以及AAV相关质粒构建，降低了ITR丢失频率，解决了目前AAV载体和SURE菌株由于具备相同Kan抗性标签而无法使用的问题。

附图说明

图1所示为pCas-DC133质粒图谱；

图2所示为Sureko-pUC19 ori质粒图谱；

图3所示为本发明重组载体构建示意图；

图4所示为TSori融合片段的电泳检测结果；Lane1:Marker条带；Lane2: Tsori融合片段(2488bp)；

图5所示为Sureko-pUC19 ori质粒双酶切结果；Lane1:Marker条带； Lane2:Sureko-pUC19 ori质粒SmaI+PvuI酶切(6765bp/1267bp)；

图6所示为菌落PCR鉴定Sureko-TsOri质粒结果；LaneM:Marker；Lane1-6:Sureko-pUCori 1#至6#菌落PCR；

图7所示为Kanamycin敲除菌落过夜培养结果(PCR管)；

图8所示为Kanamycin敲除菌落过夜培养结果(平板)；左侧为Ampicillin 抗性平板，右侧为Kanamycin抗性平板；

图9所示Kanamycin敲除PCR鉴定结果；LaneM:Marker；Lane1-3: Kanamycin-KO 1#至3#菌液PCR结果；Lane4-6:Kanamycin-KO 6#至8#菌液 PCR结果；

图10所示Kanamycin-KO菌株鉴定测序结果；

图11所示转化pEXG102-030K的SURE菌株10个克隆AhdI酶切前后电泳结果；AhdI表示经过酶切的结果，其左侧为对应的未经酶切结果；

图12所示转化pEXG102-031K的SURE菌株10个克隆AhdI酶切前后电泳结果；AhdI表示经过酶切的结果，其左侧为对应的未经酶切结果；

图13所示转化pEXG102-030K和pEXG102-031K的SURE菌株以及对照EPI300菌株经过13.5h(Lane1-12)19.5h(Lane13-24)培养后AhdI酶切前后电泳结果；AhdI表示经过酶切的结果，其左侧为对应的未经酶切结果；

图14所示转化pEXG102-030K和pEXG102-031K的SURE菌株以及对照EPI300菌株经过23.5h(Lane25-36)38.5h(Lane37-48)培养后AhdI酶切前后电泳结果；AhdI表示经过酶切的结果，其左侧为对应的未经酶切结果；

图15所示不同培养基时间和不同培养菌液的ITR丢失比例结果；每组柱形从左至右依次为030K-SureKo-2#、030K-SureKo-3#、031K-SureKo-26#、 031K-SureKo-27#、030K-EPI300和031K-EPI300结果；

图16示对比例1利用Red/ET重组技术敲除Sure基因组中卡那抗性的两套技术路线；

图17示对比例1将表达Red/ET重组酶的质粒pCas-DC133改造成氨苄抗性的过程；

图18示不同阿拉伯糖诱导浓度条件下Red/ET重组效率检测结果；

图19示转化pCas-A的SURE菌株在IPTG+X-gal平板上过夜培养结果(平板)；左侧为菌液稀释1000倍涂板结果，右侧为稀释100倍的结果；

图20示转化pCas-A的SURE菌株在100μg/ml Amp，20μg/ml Gent， 50μg/ml Kan，12.5μg/ml Tetracyclin平板上过夜培养结果；

图21示转化pCas-A的SURE菌株的菌落PCR鉴定结果；左1泳道: Marker；泳道2～24:菌落PCR结果，pCas-K1为使用引物K1-F2和K1-R2验证的结果，pCas-K2为使用引物K2-F2和K2-R2验证的结果，pCas-K3为使用引物K3-F2和K3-R2验证的结果；

图22示pCas-K2-Sure菌落PCR鉴定结果；

图23示pCas-K2-Sure Kan菌株平板验证结果；A为pCas-K1菌株，B为 pCas-K2菌株，C为pCas-K3菌株。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种敲除Kan抗性基因的SURE菌株及其构建方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明所述系统、应用以及方法已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的系统、应用以及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在具体实施方式中，本发明以pCas-DC133质粒为模板设计上下游扩增引物，扩增出目标片段F1：部分Kan抗性3’端基因+pSC101 ori温敏型复制子 +repA101温敏型基因(3’端带有第一酶切位点)；

以Sureko-pUC19 ori质粒为模板，设计上下游扩增引物，扩增出目标片段 F2：部分Kan抗性3’端基因(5’端带有第二酶切位点，长度长于F1中的Kan 抗性3’端基因)。

第一酶切位点和第二酶切位点均根据要插入的载体的复制子上下游(具体实施过程中是Sureko-pUCori质粒)的酶切位点选择，例如SmaI酶切位点和PvuI酶切位点；

通过overlap PCR将F1和F2片段连接为TSori片段：部分Kan抗性3’端基因(5’端带有PvuI酶切位点)+pSC101 ori温敏型复制子+repA101温敏型基因(3’端带有SmaI酶切位点)；

由于第一酶切位点和第二酶切位点分别在要插入载体的复制子上下游，覆盖了其原有的复制子和部分Kan抗性3’端基因，通过双酶切即可将温敏型的复制子插入到既定位置，替换之前不具备温敏型的复制子，获得预导入 SURE菌株的重组载体Sureko-Tsori，整个构建示意图见图3，图中具体的酶切位点和采用的质粒载体均不能限制本发明的核心技术原理，其只是更加形象的用于描述本发明构建思路。

本发明中所用试剂如无特殊说明均可以从市售途径获得。

以下就本发明所提供的一种敲除Kan抗性基因的SURE菌株及其构建方法和应用做进一步说明。

实施例1：重组载体Sureko-Tsori的构建

1、引物信息

表1

2、PCR扩增F1

扩增体系和PCR扩增程序见表2和表3；

表2

表3

3、PCR扩增F2

扩增体系和PCR扩增程序见表4和表5；

表4

表5

4、重叠PCR扩增TSori

扩增体系和PCR扩增程序见表6和表7；

表6

表7

PCR扩增完成后进行电泳检测，检测结果见图4，胶回收2488bp片段， PvuI+SmaI酶切,利用Promega胶回收试剂盒进行胶回收，获得Tsori片段，本文将其命名为F片段；

5、Sureko-pUC19 ori质粒双酶切

表8酶切体系：

37℃酶切反应3h，电泳胶回收获得载体V1，胶回收电泳结果见图5；

6、Sureko-Tsori重组质粒构建

酶切载体V1与酶切回收片段F进行连接，连接体系如下表9；

表9

室温连接2h，根据EPI300感受态细胞使用说明书转化流程，取3ul连接产物转化EPI300感受态细胞，涂布Ampicillinicillin抗性平板，30℃过夜培养；

挑取过夜培养的单克隆菌斑至30ul无菌水中，混匀，取混匀后的单克隆菌斑稀释液8ul作为模板进行PCR鉴定(扩增目的片段为repA101至dCas9段)，扩增体系和PCR程序如下表10和表11；

表10

表11

PCR结束后取8ul产物进行电泳检测，检测结果见图6，取阳性菌落2#、3#、6#进行菌液培养，30℃培养过夜，提取质粒，送测序验证。

实施例2：SureKo菌株(敲除Kan抗性基因的SURE菌株)构建

1、Kanamycin敲除Sure菌株筛选

选取测序验证正确的Sureko-Tsori重组质粒，取2ul使用Sure感受态说明书推荐的转化体系进行热激转化，30℃孵育4h,取50ul孵育后的菌体进行 Ampicillin平板涂布，30℃过夜培养。

挑取30℃过夜培养的单克隆至含有50ul无抗SOB培养基的无菌PCR管中混匀，取8ul混匀后的菌液分别接种至含有50ul Kan抗性和Ampicillin抗性SOB 培养基的无菌PCR管中，30℃过夜培养，实验结果见图7。

选取Ampicillin抗性PCR管中生长，但是对应Kanamycin抗性PCR管中不生长的菌液5ul，分别接种至Ampicillin抗性平板和Kanamycin抗性平板中，过夜培养。

取Ampicillin平板生长同时对应Kanamycin不生长的菌斑，30℃过夜培养即获得Kanamycin抗性筛除的菌株，菌板生长结果见图8。

2、Kanamycin敲除Sure菌株鉴定

(1)引物信息

表12

(2)PCR鉴定

针对Sure菌株基因组上Kan序列设计的ChkSureKO-PF1+ChkSureKO-PR1 以Kanamycin敲除菌液为模板进行PCR扩增，取PCR产物进行测序验证。

扩增体系和PCR程序见表13和表14。

表13

表14

PCR扩增获得产物进行电泳检测，电泳检测阳性条带送有康生物测序验证Kanamycin敲除情况，电泳检测结果见图9。

取1#、2#、3#、6#、7#、8#菌株PCR扩增Kanamycin阳性的产物测序，分析gRNA靶点上预计的突变位点序列，检测Kanamycin表达框是否突变出终止密码子，从而导致Kanamycin抗性基因无法正确表达，失去Kanamycin抗性，获得Kanamycin抗性敲除的Sure菌株，PCR产物测序结果分析见图10。

(3)获取纯净SureKo菌株

敲除Kanamycin抗性的SureKo菌株，利用温敏复制子的功能，通过37℃培养使SureKO-Tsori重组质粒丢失，获得纯净的菌株。

实施例3：SureKo菌株功能比较

制备SureKo菌株感受态转化两种Kanamycin抗性AAV质粒pEXG102-030K 及pEXG102-031K，对ITR丢失情况进行筛选统计。

转化pEXG102-030K及pEXG102-031K，挑取过夜培养的单克隆菌斑至 30ul无菌水中，混匀，取混匀后的单克隆菌斑稀释液8ul作为模板进行PCR鉴定，扩增体系如下表15。

表15

上、下游引物分别如下：

chkck_030k_F:AAACAATTAGTAAGGCCAAAG；

chkck_030k_R:AGTGTAGTGGTTATGGAGGGC；

chkck_031k_F:TCCGGATCTGAGATGAAGAAA；

chkck_031k_R:AGTAGGGTCTAGCGTCGGTGC；

以上菌落PCR阳性克隆，030K、031K各挑10个克隆进行酶切，鉴定ITR 完整性，对感受态细胞进行初步鉴定。酶切体系如下表16。

表16

酶切结果见图11和图12，根据AhdI酶切结果选择ITR完整的菌株进行下一步培养，进行进一步鉴定；其中030K选取2#、3#；031K选取26#、27#。

030K-SureKo-2#/3#、031K-SureKo-26#/27#以及030K-EPI300和 031K-EPI300(大肠杆菌EPI300转化AAV质粒pEXG102-030K及 pEXG102-031K)接种摇瓶，37摄氏度培养13.5h、19.5h、23.5h以及38.5h小时取样，测定OD600数据，取5ml菌体提取质粒，同时利用AhdI酶切质粒进行ITR 鉴定，酶切体系同前，结果见图13-15和表17。

表17

图15和表17结果显示，随着培养时间延长，ITR丢失比例逐渐上升；本发明SureKo菌株的ITR丢失比例远低于EPI300菌株，即使培养23.5h SureKo菌株的ITR丢失比例仍然低于10％；在培养19.5h内本发明SureKo菌株丢失比例可以保持在很低的水平。

对比例1：其他基因编辑技术敲除Kanamycin抗性的的实验

(一)基于Red/ET重组技术敲除Sure基因组中卡那抗性

试剂及耗材：

表18

1、实验原理

利用Red/ET重组技术敲除Sure基因组中卡那抗性的实验原理见图16。

2、Sure中卡那序列的扩增

(1)根据文献中的卡那序列设计一对引物：

表19

(2)PCR获取Sure中卡那序列

利用KanF1+KanR1以Sure液为模板进行PCR扩增，取PCR产物进行测序。

3、将表达Red/ET重组酶的质粒pCas-DC133改造成氨苄抗性

3.1实验设计：

实验设计图见图17。

3.2设计一对引物

表20

注：下划线分代表同源臂

3.3 PCR获取带有同源臂的卡那序列

利用RETAMPR+RETAMPF以pUC为模板进行PCR扩增，获取带有同源臂的氨苄抗性PCR产物进行重组。使用胶回收试剂盒回收PCR产物50μl。

3.4将pCas-DC133(本实验室保存)2μl，电转到DH5α细胞中，加入500μlLB 培养基，32℃培养0.5h，取10μl菌液涂布到卡那抗性LB培养皿中，32℃培养过夜。

3.5挑取一株单克隆加入到5ml含有50ug/ml卡那的LB培养基中，32℃培养过夜。

3.6取3.3中PCR回收产物5μl电转至干4组不同浓度L-阿拉伯糖制作的感受态细胞中，冰浴2min，分别添加对应的含20mM，40mM,100mM,200mM 的500μl L-阿拉伯糖的SOB液体培养基30℃培养2h，5000rpm，离心2min，弃上清，将细胞分别涂布到对应含20mM，40mM,100mM,200mM的L-阿拉伯糖的LB固体培养基上，30摄氏度培养过夜。

3.7 4组过夜培养的菌液分别挑取10株单克隆加到20ml含100ug/ml的 Amp的LB培养基中，32℃培养过夜。

3.8按照质粒小提试剂盒(天根DP103)提取质粒，分别取10μl质粒酶切 37℃酶切30min。

3.9酶切体系中加入5*loadingbuffer5μl，电泳30min，结果见图18。

3.10菌落33,35,36,37,38,39,40酶切符合预期,20mM L-阿拉伯糖诱导成功率最高，Red/ET系统工作

4、基于Red/ET重组技术敲除Sure基因组中卡那抗性

4.1将表达Red/ET同源重组酶的pCas-A转入Sure

取5μl 3.9中提取的33号质粒电转至Sure中，冰浴2min，加入0.5ml LB， 32℃培养1h，取100μl菌液涂布至含100ug/ml氨苄和50ug/ml卡那的LB培养板上，32℃培养过夜。

4.2挑取一株单克隆加入到5ml含有100ug/ml氨苄和50ug/ml卡那的LB 培养基中，32℃培养过夜

4.3制作感受态细胞：

4.3.1转移0.1ml过夜培养物至装有100ml LB(含50ug/ml卡那抗性) 的摇瓶中，添加20mM L-阿拉伯糖，30℃下剧烈振荡培养2-6小时。

4.4 PCR获取带有同源臂的LacZ和庆大霉素基因的PCR产物

表21

利用SureLacZ-F+SureLacZ-R以Puc19为模板进行PCR扩增，获取带有同源臂的LacZPCR产物进行重组。使用胶回收试剂盒回收PCR产物50μl。

利用SureGent-F+SureGent-R以pFB-v275(本实验室保存)为模板进行PCR 扩增，获取带有同源臂的GentPCR产物进行重组。使用胶回收试剂盒回收PCR 产物50μl。

4.5分别将LacZ和Gent的PCR产物取5μl电转到4.3的感受态细胞中，冰浴2min，分别添加含20mM L-阿拉伯糖的500μl SOB液体培养基30℃培养 2h

4.6将转入LacZ基因的菌液稀释100倍和1000倍，分别取取10μl涂布于含1mM IPTG+40ug/mlX-gal+20mM L-阿拉伯糖的LB平板上，30℃培养过夜。将转入Gent基因的感受态细胞取10μl涂布至20ug/ml Gent+20mM L-阿拉伯糖的Kan的LB培养板上，30℃培养过夜。

4.7 IPTG+X-gal平板上未见蓝色的菌落，推测可能是缺乏筛选压力，平板拍照结果见图19。

4.8分别取46株20ug/mlGent的LB培养板上细菌加入20μl的无菌水中，分别取3μl点样于100μg/mlAmp，20μg/ml Gent，50μg/ml Kan，12.5μg/ml。 Tetracyclin，30℃培养过夜。阳性对照47号带有卡那和四环素抗性,48号带有氨苄和庆大霉素抗性，平板培养结果见图20。

4.9Kan和Tet平板菌落41～46号菌株没有生长，Gent平板41～46号菌株没有生长，Gent抗性基因未如期替换卡那基因，平板培养结果见图20。

(二)基于CRISPR-Cas9技术敲除Sure基因组中卡那抗性

1.基于pCasA构建三个靶向卡那序列的，将pCas-A中靶向ori的guide 换成靶向Kan的pCasA-K1,pCasA-K2,pCasA-K3。

1.1通过overlap PCR替换ori序列构建pCasA-K1,pCasA-K2,pCasA-K3 的构建

引物设计

表22

PCR获取K1-1和K1-2两片段，K2-1和K2-2两片段，K3-1和K3-2两片段

1.2通过overlap PCR替换ori序列构建pCasA-K1,pCasA-K2,pCasA-K3 的K1,K2,K3片段。

将K1,K2,K3的PCR产物回收

1.2.1酶切pCasA及K1,K2,K3经过ApaⅠ和BglⅡ，将pCasA酶切产物经电泳后回收大片段，K1-K3酶切产物直接回收。

1.2.2酶切载体V1与酶切回收片段F1进行连接，

1.2.3同样的链接条件连接pCasA-K2，pCasA-K3，室温连接2h。

1.2.4根据Sure感受态细胞使用说明书转化流程，取10μl连接产物转化Sure感受态细胞，涂布Amp抗性平板，30℃过夜培养。

1.2.6各挑取4株单克隆PCR验证

pCas-K1使用引物K1-F2和K1-R2，pCas-K2使用引物K2-F2和K2-R2，

pCas-K3使用引物K3-F2和K3-R2。

各取10μl的PCR产物，电泳见图21。

1.2.7除了pCasA-K3的最后两株未见目的条带均有目的条带，将1， 5，10号单克隆送测，测序结果均成功。测序结果见文件。

2.Kan序列的敲除

2.1将测序正确的菌液稀释1000倍后涂布至1mM IPTG+50ug/mlAmp 的LB，放入32度培养箱培养过夜。

2.2 pCas-K1及pCas-K3的对应的培养板未长出单克隆，将pCas-K2对应的培养板上挑取96株单克隆分别加入20μl的无菌水中，每支单克隆取2μl 进行PCR，同时取2μl Sure细胞为模板进行6支*50μlPCR反应。

2.2.1引物设计

表23

2.2.2纯化PCR产物，分别取各菌落PCR回收产物100ng菌落加入 100ng Sure PCR回收产物按照T7E1酶的使用说明进行反应，反应后各取20μl 产物电泳检测结果见图22。

2.2.3 pCasA-K2转化Sure涂布IPTG+Amp平板后，菌落PCR后，经 T7E1酶切后电泳，未出现两条T7E1酶切后的两条带。

2.1将2.2中的菌液各取3ul点样于50μg/ml的Kan平板上，37℃培养过夜后所有克隆均有菌斑长出，说明Kan未敲除，推测pCasA-K2的剪切效率不行，所以菌能生长，而pCas-K1，K3的剪切效率较高，而Sure因为同源重组酶完全敲除欠缺修复机制，因此不能长菌，敲除失败。

以上所述只是用于理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利的保护范围。

序列表

<110> 杭州嘉因生物科技有限公司

<120> 一种敲除Kan抗性基因的SURE菌株及其构建方法和应用

<130> MP21018058

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgagcgagca cguacucgga 20

<210> 2

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaacaagaug gauugcacgc 20

<210> 3

<211> 1047

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agctactggg ctatctggac aagggaaaac gcaagcgcaa agagaaagca ggtagcttgc 60

agtgggctta catggcgata gctagactgg gcggttttat ggacagcaag cgaaccggaa 120

ttgccagctg gggcgccctc tggtaaggtt gggaagccct gcaaagtaaa ctggatggct 180

ttcttgccgc caaggatctg atggcgcagg ggatcaagat ctgatcaaga gacaggatga 240

ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg 300

gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg 360

ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc 420

ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct 480

tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa 540

gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg 600

gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa 660

gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat 720

gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg 780

cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc 840

atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac 900

cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg 960

gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc 1020

tatcgccttc ttgacgagtt cttctga 1047

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgagcgagca cgtactcgga 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaacaagatg gattgcacgc 20

<210> 6

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcaccgagt cggtgc 76

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcgg 36

<210> 8

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cacaaccaat taaccaattc tgagcgctta ccaatgctta atcagtgagg cac 53

<210> 9

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttaagcattg gtaagcgctc agaattggtt aattggttgt ggaaac 46

<210> 10

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgagccggaa gcataaagtg taaacccggg aacgtaaatg catgccgctt cg 52

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atccgacgct atttgtgccg atagc 25

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtcttttgaa aacaaatact ctatgaggat ttatgagtgg 40

Claims

1.一种敲除Kan抗性基因的SURE菌株，其特征在于，由单碱基编辑系统敲除SURE基因组中的Kanamycin抗性基因。

2.根据权利要求1所述SURE菌株，其特征在于，所述单碱基编辑器系统的gRNA序列为SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。

3.根据权利要求1或2所述SURE菌株，其特征在于，所述单碱基编辑系统为基于dCas9-PmCDA1-UGI的单基因编辑系统。

4.权利要求1所述SURE菌株的构建方法，其特征在于，包括：

步骤1、构建可调控质粒丢失的基因元件和包含针对SURE基因组中Kanamycin抗性基因的单碱基编辑系统的载体；

步骤3、将所述重组载体转化至SURE菌株中进行敲除，获得Kanamycin抗性敲除的Sure菌株；

步骤4、启动可调控手段控制所述基因元件，使Kanamycin抗性敲除的Sure菌株中的重组载体丢失，获得纯净的Kanamycin抗性敲除的Sure菌株。

5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，步骤1所述可调控质粒丢失的基因元件为温敏型复制子，步骤4所述可调控手段为调控温度。

6.根据权利要求5所述构建方法，其特征在于，所述温敏型复制子为pSC101 ori&repA101。

7.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，所述单碱基编辑系统的gRNA序列为SEQID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。

8.权利要求1-3任意一项所述SURE菌株或权利要求4-7任意一项所述构建方法在构建AAV载体或疫苗制备中的应用。