BRPI0611535B1

BRPI0611535B1 - Método para processar células de levedura para produzir beta-glucanos e mananas

Info

Publication number: BRPI0611535B1
Application number: BRPI0611535-7A
Authority: BR
Inventors: Joseph James Sedmak
Original assignee: Sensient Flavors Inc
Priority date: 2005-05-05
Filing date: 2006-05-05
Publication date: 2021-11-30
Also published as: BRPI0611535A8; EP1877447B1; WO2006121803A1; CA2912012C; BRPI0611535A2; US20100190872A1; CA2607004A1; CN101184780A; MX2007013725A; JP2008541700A; EP1877447A1; US8753668B2; US20060263415A1; CN101184780B; CA2912012A1; JP5296531B2; CA2607004C

Abstract

métodos para processar células de mlcroorganismos e células de levedura, composição, suplemento alimentar, produto farmacêutico, cosmético ou produto nutracêutico e ração animal. a presente invenção refere-se a métodos para produzir preparações de glucanos e mananas de leveduras. os métodos empregam um processo de autólise, e em seguida, um tratamento enzimático usando uma protease de ph alto ou uma protease de ph alto e em seguida um tratamento com uma enzima que compreende pelo menos uma entre uma amilase, uma lipase e uma combinação das mesmas.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS

Este pedido de patente reivindica a prioridade do pedido de patente provisório no US 60/677.973, depositado em 5 de maio de 2005, cujo teor é aqui inteiramente incorporado como referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a preparações de β-glucanos e mananas e métodos para sua preparação. Particularmente, a invenção refere-se a preparações, incluindo β-(1,3/1,6)-glucano e manana, produzidos a partir de microorganismos, incluindo, porém sem limitações, leveduras."Glucano" é um termo genérico que refere-se a um oligossacarídeo ou polissacarídeo composto predominantemente ou inteiramente do monossacarídeo D- gicose. Os glucanos estão amplamente distribuídos na natureza, e são particularmente importantes quanto ao seu papel em manter a integridade estrutural de células de bactérias, leveduras e plantas. Por exemplo, o glucano, em combinação com outros polissacarídeos, tais como manana e quitina, é responsável pelo formato e pela resistência mecânica da parede celular. Os glucanos são responsáveis tipicamente por aproximadamente 40% a 50% do peso da parede celular nessas células.

Na qualidade de polímeros de D-glicose, as unidades de D- glicose podem estar ligadas entre si de uma série de maneiras. Por exemplo, os glucanos com ligações (1,3), (1,4), (1,6) e (1,2) (ligações glicosídicas) são todos conhecidos. A variedade de ligações possíveis significa que os gluca- nos são normalmente compostos altamente ramificados. Muitas formas são possíveis como resultado desta maneira altamente variável na qual as unidades individuais de glicose podem ser unidas, bem como o formato estérico global da molécula originária. Um glucano comum é a glicopiranose ligada em β-(1,3) acoplada à glicopiranose ligada em β-(1,6). Por exemplo, a parede celular de Saccharomyces cerevisiae é composta principalmente de glu- cano ligado em β, que é principalmente uma cadeia principal de unidades de glicose ligadas em β-(1,3), com um componente minoritário de ramificação intermolecular e intramolecular por intermédio de ligações β-(1.6)

Por causa das suas propriedades químicas, os glucanos encontraram uma ampla série de usos nas indústrias químicas, alimentícias e farmacêuticas. Por exemplo, eles podem ser úteis como agentes que conferem viscosidade, emulsificantes, fibras, filmes, substâncias de revestimento, suportes para cromatografia por afinidade e eletroforese em gel, em meios de cultura de células, como leitos filtrantes, e em cimento. Eles são também amplamente utilizados como espessantes de alimentos e como uma fonte de fibra dietética, e como veículos e agentes de revestimento em produtos farmacêuticos. Os glucanos demonstraram ter atividade imunofarmacológica em humanos e animais. Por exemplo, uma forte imunoestimulação e proteção contra microrganismos patogênicos foram demonstradas no camarão, peixes, aves, suínos, gado bovino, coelhos, camundongos, ratos e humanos. Os β-glucanos de leveduras podem estimular a resposta imune inata (ines- pecífica) de vertebrados e invertebrados por intermédio da interação com o receptor semelhante a Toll, Dectina-1 .Essa ligação estimula a produção de espécies oxigenadas ativas em macrófagos e intensifica sua fagocitose e exterminação de microorganismos. Essas células imunes estimuladas produzem também citocinas que podem circular pelo animal inteiro e interagem com outras células imunes para intensificar o estado imunológico do animal.

A purificação de β-glucanos a partir de levedura e outros organismos foi investigada exaustivamente, e uma série de métodos é conhecida. A maioria deles se baseia na insolubilidade de β-(1,3)-glucano em álcalis ou em solventes orgânicos. Os principais métodos conhecidos são: (a) extração em alta temperatura com hidróxido de sódio concentrado, e em seguida, extração em alta temperatura com ácido e precipitação com etanol (vide, por exemplo, Manners, D.J. et al., Biochem. J. 135:19-30 (1973); Jamas, S. et al., patentes n22 US 4.810.646, 5.028.703 e 5.250.436). Muitos destes protocolos requerem uma homogeneização preliminar das células de levedura, e muitos requerem repetição múltipla de cada uma das etapas de extração; (b) extração de preparações de paredes celulares de levedura resultantes de autólise ou degradação enzimática de levedura com um a mis- tura de fenol conecntrado:água 1:1 (vide, por exemplo, patente n- US 4.138.479, expedida para Truscheit, E. et al.); e (c) extração com solventes orgânicos, tais como isopropanoi, etanol, acetona ou metanol, isoladamente ou na presente de álcali (vide, por exemplo, pedido de patente europeu n2 515216). O tratamento com ácido reconhecidamente reduz o número de ligações β-(1,6) no material de glucano, o que resulta em um aumento na viscosidade.

A manana é um polímero constituído de unidades de manose. Em leveduras a manana está associada com proteína na superfície externa da parede celular da levedura, como um polissacarídeo musgoso, e também na membrana celular interna. Ela é responsável genericamente por cerca de 20-50% em peso seco da parede celular. A manana está ligada a uma cadeia peptídica nuclear como um oligômero ou polímero. O complexo contém cerca de 5-50% de proteínas. A manana oligomérica está ligada diretamente à serina e treonina, enquanto que a manana polimérica está ligada à aspa- ragina por intermédio de N-acetilglicosamina, No complexo mano-proteína, as unidades de manose estão ligadas por ligações a-1,6, a-1,2 e a-1,3.

Os oligossacarídeos de manana (MOS) podem ser liberados das paredes celulares de leveduras por ação proteolítica. Os MOS liberados podem se ligar eficazmente a patógenos bacterianos do trato intestinal e bloqueiam sua capacidade de colonizar o trato intestinal. Por exemplo, E. coli, Salmonella spp. e Vibrio cholera têm proteínas sobre sua superfície (lecti- nas) que se ligam especificamente aos resíduos do açúcar manose do MOS.

Considerando os muitos usos e aplicações de glucanos, há uma clara necessidade nessas técnicas de se obter um método de extração de β- glucanos/mananas, que evita o uso de altas concentrações de álcali ou ácido e o uso de altas temperaturas, que tem melhor recuperação de glucanos e mananas, e que resulta em uma preparação biologicamente útil. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 é um fluxograma de uma modalidade de um processo para a produção de preparações de β-glucanos/mananas, de acordo com a presente invenção.

A figura 2 é um fluxograma de outra modalidade do processo para a produção de preparações de β-glucanos/mananas, de acordo com a presente invenção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para processar células de leveduras, usando as etapas de efetuar a autólise das células de levedura para liberar paredes celulares da levedura, incubar as paredes celulares da levedura com uma protease exógena, separar as paredes celulares da levedura em um componente enriquecido em glucanos e um componente enriquecido em mananas, e efetuar a ultrafiltração do componente enriquecido em manana, para formar um filtrado e um material retido no filtro.

Em outro aspecto, a invenção fornece um método para processar células de leveduras, usando as etapas de efetuar a autólise das células de levedura em uma temperatura de 40°C a 65°C, para liberar paredes celulares da levedura, incubar as paredes celulares da levedura com uma protease exógena em um pH de 9 a 10, e incubar as paredes celulares tratadas com protease com uma enzima, tal como uma amilase, lipase, ou uma combinação delas.

Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição que compreende a-mananas, onde pelo menos 85% (p/p) das a-mananas totais têm um peso molecular de 10.000 Da ou mais.

Outras modalidades da invenção incluem rações animais, su-plementos alimentares, produtos farmacêuticos, cosméticos e produtos nu- tracêuticos que compreendem glucanos ou mananas produzidas pelos métodos da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Em uma modalidade, a invenção fornece um processo que produz preparações de paredes celulares insolúveis enriquecidas em β(1,3)- e β(1,6)-glucanos e uma fração solúvel enriquecida em mananas. O processo de acordo com a presente invenção inclui uma etapa de autólise de uma fonte de paredes celulares, como por exemplo, uma levedura, tal como levedura dos cervejeiros ou levedura dos padeiros, e em seguida, uma etapa de digestão enzimática. Em um aspecto, a digestão enzimática é conduzida u- sando uma protease de pH alto. Em outro aspecto, a digestão enzimática é conduzida usando uma combinação de enzimas, tal como uma protease, uma amilase, uma glicoamilase e/ou uma lipase, de pH alto. Em uma modalidade, a digestão enzimática é conduzida usando uma protease de alto pH, e em seguida, uma ou mais outras enzimas, tais como uma amilase, uma glicoamilase e/ou uma lipase.

Em outra modalidade, a invenção fornece uma preparação de paredes celulares, que é enriquecida em β-(1,3)- e β-(1,6)-glucanos, e em outra modalidade, uma fração solúvel enriquecida em mananas.

Outros aspectos da invenção tornar-se-ão evidentes levando em consideração a descrição detalhada que se segue e os desenhos que a a- companham.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Antes que quaisquer modalidades da invenção sejam explicadas detalhadamente, deve-se entender que a invenção não está limitada em sua aplicação aos detalhes dos componentes e ao arranjo dos componentes e- nunciados na descrição que se segue ou ilustrados nos desenhos. A invenção tem outras modalidades e é capaz de ser praticada ou ser conduzida de várias maneiras. Além disso, deve-se entender que a fraseologia e a terminologia aqui utilizadas são com o propósito descritivo e não devem ser consideradas como limitativas. O uso dos termos "incluindo", "compreendendo" ou "tendo" e suas variações, pretende englobar os itens listados depois deles e seus equivalentes, bem como itens adicionais.

Deve-se entender também que qualquer faixa numérica aqui e- nunciada inclui todos valores desde o valor inferior até o valor superior. Por exemplo, se uma faixa de concentração é enunciada como 1% a 50%, pretende-se que os valores, tais como 2% a 40%, 10% a 30%, ou 1% a 3%, etc., estejam expressamente enumerados neste relatório descritivo. Eles são apenas exemplos do que é especificamente pretendido, e todas combinações de valores numéricos entre o valor mais baixo e o valor mais alto enu merados são considerados como sendo expressamente enunciados neste pedido de patente.

A menos que diferentemente indicado, todos números que expressam quantidades de ingredientes, condições de reação, e assim por diante, utilizados no relatório descritivo e nas reivindicações, devem ser entendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo "cerca de1'. Conseqüentemente, a menos que diferentemente indicado, os parâmetros numéricos enunciados no relatório descritivo e nas reivindicações apensadas são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas buscadas pela presente invenção. No mínimo, e não como uma tentativa de limitar a aplicação da doutrina de equivalentes ao âmbito das reivindicações, cada parâmetro numérico deve pelo menos ser interpretado à luz do número de dígitos significantes relatados e aplicando técnicas usuais de arredondamento.

Não obstante o fato de que as faixas e parâmetros numéricos que enunciam o amplo âmbito da invenção sejam uma aproximação, os valores numéricos enunciados nos exemplos específicos estão relatados tão precisamente quanto possível. Qualquer valor numérico, entretanto, contém inerentemente certos erros resultantes necessariamente de um desvio- padrão encontrado nas suas respectivas medições dos testes.

As preparações de β-glucanos/mananas podem ser preparadas a partir de microorganismos, tais como leveduras, usando um simples processo de autólise, em pH ligeiramente ácido perto de neutro e temperatura apenas moderadamente elevada. A autólise é seguida de uma digestão en- zimática. Em uma modalidade, a etapa enzimática utiliza uma protease de pH alto (por exemplo, Protex 6L, disponível na Genecore International, ou a partir da fermentação de Bacillus lichenformis), tipicamente cerca de 0,05%- 1% em peso, em pH alcalino e temperatura elevada.

As espécies de leveduras apropriadas como uma fonte de β- glucanos/mananas incluem, porém sem limitações, cepas de leveduras de Saccharomyces cerevisiae (incluindo cepas da levedura dos padeiros e cepas da levedura dos cervejeiros), Kluyveromyces fragilis, e cepas de Candi- da; tais como Candida utilis, e combinações delas. Outras cepas de leveduras apropriadas como fontes de β-glucanos/mananas incluem, porém sem limitações, Saccharomyces delbruekii, Saccharomyces rosei, Saccharomy- ces microelliposodis, Saccharomyces carlsbergensis, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces polysporus, Candida albicans, Candida cloacae. Candida tropicalis, Candida guilliermondii, Hansenula win- gei, Hansenula arni, Hansenula henricii, Hansenula americana, e combinações delas. Estas cepas de leveduras podem ser produzidas usando cultura em nutrientes grau alimentício, por fermentação em batelada ou fermentação contínua.

Muitos outras espécies de microorganismos, incluindo, porém sem limitações, bactérias, fungos e plantas, por exemplo, algas unicelulares, que foram relatadas nessas técnicas como uma fonte de β-glucanos e/ou mananas, incluem, porém sem limitações, bactérias tais como Alkaligenes, especialmente Alkaligenes faecalis Var. mixogenes (ATCC-21680), Agrobac- terium, Cellulomonas, tal como ATCC 21399, e Cellulomonas flavigena (ATCC 53703), e Pestalotia; fungos, por exemplo, Aureobasidum, tal como a cepa de Aureobasidum pullulans IFO446 e a espécie de Aureobasidum K-1 (FERM P1289), Agaricus, Lentinus, Pleurotus ostreatus, Macrophomopsis, tal como a cepa KOB55; Gaoderma, Schizophylla, Fachyma hoelen, Pestalotia, Coriolus, e combinações deles. Não-microorganismos, tais como plantas, também podem ser úteis na invenção como fontes de β-glucanos e/ou mananas.

Especificamente, o processo de acordo com a presente invenção refere-se à geração de preparações de paredes celulares enriquecidas em teor de β-(1,3)- e β-(1,6)-glucanos e teor de mananas, produzidas partir de microorganismos, incluindo, porém sem limitações, leveduras. Em uma modalidade exemplificada, o processo inclui uma primeira etapa de autólise da levedura, por exemplo, levedura dos cervejeiros (tipicamente uma pasta de sólidos a 7% a 18%, particularmente 10% a 17%, e mais particularmente, 8% a 12% ou 13% a 16%). A autólise pode ser conduzida adequadamente em um pH de pelo menos 4, particularmente pelo menos 4,5, e mais particu larmente, pelo menos 5. A autólise pode ser conduzida adequadamente em um pH menor do que 8, particularmente menor do que 7, e ainda mais particularmente menor do que 6. A temperatura para conduzir a autólise pode ser adequadamente pelo menos 30 °C, particularmente pelo menos 35 °C, mais particularmente pelo menos 40 °C, e ainda mais particularmente, pelo menos 45 °C. A temperatura para conduzir a autólise pode ser adequadamente menor do que 55 °C, particularmente menor do que 52 °C, e ainda mais particularmente, menor do que 50 °C. A autólise pode ser conduzida adequadamente por pelo menos 10 horas, particularmente pelo menos 16 horas, e mais particularmente, pelo menos 24 horas. A autólise pode ser conduzida adequadamente por menos de 100 horas, particularmente menos de 48 horas, e mais particularmente, menos de 36 horas. A levedura pode ser então separada, adequadamente por centrifugação, para produzir um extrato, e uma corrente de paredes celulares com baixo teor de β-glucano. Uma outra etapa trata a corrente de paredes celulares com uma enzima, incluindo, porém sem limitações, uma protease, por exemplo, uma protease alcalina, em um pH de pelo menos 8,5, particularmente pelo menos 9, e mais particularmente pelo menos 9,2. O pH pode ser também adequadamente menor do que 10,5, particularmente menor do que 10, e ainda mais particularmente, menor do que 9,8. O tratamento com protease pode ser conduzido adequadamente em uma temperatura de pelo menos 45 °C, particularmente pelo menos 50 °C, e mais particularmente, pelo menos 53 °C. O tratamento com protease pode ser conduzido adequadamente em uma temperatura menor do que 70 °C, particularmente menor do que 65 °C, mais particularmente, menor do que 60 °C, e ainda mais particularmente, menor do que 57°C. O tratamento com protease pode ser conduzido adequadamente por pelo menos 5 horas, particularmente pelo menos 8 horas, mais particularmente pelo menos 10 horas, e ainda mais particularmente, pelo menos 12 horas. O tratamento com protease pode ser conduzido adequadamente por um tempo menor do que 48 horas, particularmente menor do que 36 horas, mais particularmente menor do que 24 horas, e ainda mais particularmente, menor do que 18 horas. O segundo produto é então separado por centrifugação para produzir um extrato enriquecido com manana (a-manana), e um produto de paredes celulares enriquecido em β-glucano. Este produto de paredes celulares β-(1,3/1,6) é então secado, por exemplo, atomizado, o que resulta na agregação do produto em partículas de cerca de 100-300 microns ou mais. O extrato de manana é então submetido a uma ultrafiltração de peso molecular de 10.000, para produzir um material retido no filtro de alto peso molecular, que é enriquecido em manana.

Este processo exemplificado descrito acima está ilustrado no fluxograma da figura 1. As células de levedura vivas são submetidas à autólise em um processo no qual enzimas de levedura endógenas degradam e solubilizam algumas moléculas da levedura. O extrato solúvel é separado das paredes celulares da levedura insolúveis por centrifugação. As paredes celulares são então tratadas com uma protease de alto pH para remover a- inda mais a proteína das paredes celulares, e subseqüentemente, remover também a manana que está anexada à proteína da parede celular. As paredes celulares enriquecidas com β-glucano são então separadas do extrato secundário por centrifugação. A manana, que tem um alto peso molecular, pode ser purificada ainda mais e concentrada passando o extrato secundário através de um ultrafiltro de 10.000 Da.

Em outra modalidade, o processo inclui uma primeira etapa de autólise de levedura, por exemplo, levedura dos cervejeiros (tipicamente, uma pasta com 8%-12% de sólidos). A autólise é conduzida adequadamente em um pH de pelo menos 4, particularmente pelo menos 4,5, e mais particularmente, pelo menos 5. O pH pode ser também adequadamente menor do que 8, particularmente menor do que 7, e ainda mais particularmente menor do que 6. A temperatura para conduzir a autólise pode ser adequadamente pelo menos 30 °C, particularmente pelo menos 40 °C, e mais particularmente pelo menos 45 °C. A temperatura pode ser também adequadamente menor do que 55 °C, particularmente menor do que 53 °C, e ainda mais particularmente, menor do que 50 °C. A autólise pode ser conduzida adequada-mente por pelo menos 10 horas, particularmente pelo menos 16 horas, e mais particularmente, pelo menos 24 horas. A autólise pode ser conduzida adequadamente por menos de 100 horas, particularmente menos de 48 horas, e mais particularmente, menos de 36 horas. A levedura é então separada, adequadamente por centrifugação, para produzir um extrato, e uma corrente de paredes celulares com baixo teor de β-glucano. Uma outra etapa trata a corrente de paredes celulares com enzimas. A etapa enzimática utiliza primeiramente uma protease de pH alto em um ph alcalino, por exemplo, em um pH de pelo menos 8,5, particularmente pelo menos 9, e mais particularmente pelo menos 9,2. O pH pode ser também adequadamente menor do que 10,5, particularmente menor do que 10, e ainda mais particularmente, menor do que 9,8. O tratamento com protease pode ser conduzido adequadamente em uma temperatura de pelo menos 45 °C, particularmente pelo menos 50 °C, e mais particularmente, pelo menos 53 °C. O tratamento com protease pode ser conduzido adequadamente em uma temperatura menor do que 70 °C, particularmente menor do que 65 °C, mais particufarmente, menor do que 60 °C, e ainda mais particularmente, menor do que 57 °C. O tratamento com protease pode ser conduzido adequadamente por pelo menos 5 horas, particularmente pelo menos 8 horas, mais particularmente pelo menos 10 horas, e ainda mais particularmente, pelo menos 12 horas. O tratamento com protease pode ser conduzido adequadamente por um tempo menor do que 48 horas, particularmente menor do que 36 horas, mais particularmente menor do que 24 horas, e ainda mais particularmente, menor do que 18 horas. A etapa enzimática com protease é seguida de incubação com glicoamilase (por exemplo, da espécie Aspergillus), uma amilase (por exemplo, cc-amilases de Bacillus subtilis, Aspergillus oryzae; amiloglicosidases de Aspergillus Níger ou do mofo Rhizopus) e/ou lipase (por exemplo, lipase de Pseudomonas cepacia, Candida rugosa e Mucor javanicus; tipicamente 0,05%-1% em peso). A incubação com glicoamilase, amilase e/ou lipase é conduzida adequadamente em pH neutro a ligeiramente ácido e temperatura elevada. Por exemplo, o pH pode ficar adequadamente na faixa de pelo menos 3,5, particularmente pelo menos 4, e ainda mais particularmente pelo menos 4,5. O pH pode ficar adequadamente na faixa de menos do que 7, particularmente menos do que 6, e ainda mais particularmente menos do que 5,5, A temperatura para conduzir a incubação com glicoamilase. amilase e/ou lipase pode ser na faixa de pelo menos 40 °C, particularmente pelo menos 45 °C, mais particularmente pelo menos 50 °C, e ainda mais preferivelmente, pelo menos 53 °C. A temperatura pode ficar também adequadamente 5 na faixa de menos do que 70 °C, particularmente menos do que 65 °C, mais particularmente menos do que 60 °C, e ainda mais particularmente, menos do que 58 °C. Temperaturas de pelos menos 60 °C, pelo menos 65 °C, pelo menos 70 °C, pelo menos 75 °C, pelo menos 80 °C, pelo menos 85 °C ou pelo menos 90 °C, podem ser usadas adequadamente, particularmente se a 10 protease, amilase e/ou lipase é uma enzima termoestável. A incubação com a protease alcalina pode ser também seguida de incubação com uma combinação de uma glicoamilase e uma lipase, uma combinação de uma amilase e uma lipase, ou uma combinação de uma glicoamilase, uma amilase e uma lipase.

O processo exemplificado descrito acima está ilustrado no fluxo-grama da figura 2. No processo representado na figura 2, a levedura viva é submetida à autólise em um processo no qual enzimas de levedura endógenas degradam e solubilizam algumas macromoléculas da levedura. As paredes celulares da autólise são primeiramente tratadas com uma protease de 20 pH alto. A incubação com a protease de pH alto é conduzida adequadamente em uma temperatura de 50 °C a 65 °C por aproximadamente 10 a 16 horas. As paredes celulares são então tratadas com uma amilase (ou outra glicanase) ou lipase, ou uma combinação de amilase e lipase. A incubação com a amilase e/ou uma lipase é conduzida adequadamente em um pH de 4 25 a 7 e uma temperatura de 50 °C a 65 °C por aproximadamente 4 a 10 horas.

A amilase pode digerir os alfa-glucanos residuais, tal como glicogênio, que pode ainda existir na parede celular. A lipase pode degradar a membranas das paredes celulares enriquecidas com lipídeos e gorduras. A corrente de paredes celulares pode ser então separada por centrifugação, para produzir 30 um extrato secundário enriquecido com manana, e um produto de paredes celulares enriquecido em β-glucanos. O produto de paredes celulares pode ser secado, por exemplo, atomizado. O extrato secundário de manana pode ser passado através de um ultrafiltro, tal como um ultrafiltro de 10.000 Da; um ultrafiltro de 50.000 Da, ou um ultrafiltro de 100.000 Da, para enriquecer o teor de manana do material retido no filtro.

As preparações da invenção podem ser secadas por qualquer processo apropriado, incluindo, porém sem limitações, atomização, secagem com cilindros e rolos, secagem em forno, secagem por aspersão, secagem em anel, e combinações deles e/ou secadas usando um equipamento formador de película, e podem ser usadas sem processamento adicional, ou podem ser moídas usando qualquer técnica apropriada.

Adequadamente, a protease de pH alto pode ter uma atividade proteolítica ótima em um pH acima de 7. As proteases apropriadas incluem, porém sem limitações, aquelas obtidas a partir de Actinidia chinensis, Ananas comosus, Aspergillus spp. (por exemplo, A.niger, A. niger var. awamori, A. oryzae, A. sojae, A, melleus), Bacillus spp. (por exemplo, Bacillus subtilis, B. alcalophilus. B. amyloliquefaciens, B. halodurans, B. lentus,B. lichenifor- mis, B. stearothermophilus, B. thermoprotolyticus), Carica papya, Crypho- nectria parasitica, Endothia parasitica, Ficus glabrata, Kluyveromyces lactis, Penicillum citrinum, Rhizomucor miehei, Rhizopus niveus de estômagos de bezerro, caprino ou boi, ou pancreases porcinas, e combinações deles. As proteases apropriadas podem incluir, porém sem limitações, enzimas disponíveis comercialmente, tais como subtilisina Carlsberg, subtilisina BPN', sub- tilisina Novo, subtilisina 309, subtilisina 147 e subtilisina 168, Alcalase®, Sa- vinase®, Primase®, Duralase®, Durazym®, Esperase®, e Kannase® (disponíveis na Novo Nordisk A/S); Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Optimase®, Properase®, Purafect®, Prafect OxP®, FN2®, e FN3® (disponíveis na Genecor International, Inc.); e Validase® AFP, Validase® FP Concentrado, Bromelaína (disponíveis na Valley Research, South Bend, IN), e combinações delas.

As amilases apropriadas incluem as de origem vegetal, animal, bacteriana ou fúngica, e combinações delas. As amilases incluem, porém sem limitações, glicoamilases ou a-amilases obtidas a partir de Bacillus spp, (por exemplo, B. licheniformis,B. amyloliquefaciens,Bacillus subtilis, B. stea-rothermophilus), Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Asprgillus niger var. awamori, Microbacterium imperiale, Termomnospora viridis, malte de cevada (Hordeum spp.), pâncreas porcino (Sus spp.), e combinações delas. Os e- xemplos de amilases úteis incluem, porém sem limitações, as amilases disponíveis comercialmente, tais como Concentrado de Glicoamilase, Duram- yl®, Termamyl®, Fungamyl®, e BAN® (disponíveis na Novo Nordisk A/S); Ra- pidase® e Purastar® (disponíveis na Genencor International, Inc.); e Valida- se® BAA, Validase® HT340L, Validase® FAA, Validase® AGS, Validase® GA, Validase® RGA (disponíveis na Valley Research, South Bend, IN); e combinações delas. A amilase pode ser usada adequadamente em uma concentração final de pelo menos 0,001%, particularmente pelo menos 0,01%, e ainda mais particularmente, pelo menos 0,02%. A amilase pode ser usada adequadamente em uma concentração final de menos do que 0,1%, particularmente menos do que 0,05%, e ainda mais particularmente, menos do que 0,1%.

As lipases úteis na invenção incluem, porém sem limitações, lipases de Humicola (sinônimo Thermomyces), por exemplo de H. lanuginosa (T. lanuginosus), H. insolens, uma lipase de Pseudomonas, por exemplo, de P. alcaligenes ou P. pseudoalcaligenes, P. cepacia, P. stutzeri, P. fluores- cens, Pseudomonas sp. cepa SD 705, P. wisconsinensis, uma lipase de Bacillus, por exemplo, de Bacillus subtilis, B. stearothermophilus ou B. pumilus (documento n2 WO 91/16422); Aspergillus oryzae, Aspergillus niger,Candida lipolytica, Candida rugosa, Mucor javanicus, Penicillum roqueforti, Rhizomu- cor miehei, Rhizopus delemar, Rhizopus niveus, Rhizopusoryzae, Rhizopus arrhizus, e combinações delas. As enzimas lipase disponíveis comercialmente incluem, porém sem limitações, Lipolase®, Lipolase Ultra® (Novo Nordisk A/S), e Lipase Fúngica 8000 e Lipase Pancreática 250 (disponíveis na Valley Research, South Bend, IN).

O produto resultante da autólise das células de levedura compreende também adequadamente pelo menos 20%, particularmente pelo menos 23% e mais particularmente pelo menos 25% de proteína do produto total em base de sólidos secos. O produto compreende também adequadamente menos do que 45%, particularmente menos do que 40%, e mais parti cularmente, menos do que 35% de proteína do produto total em base de sólidos totais. O produto resultante da autólise das células de levedura compreende também adequadamente pelo menos 20%, particularmente pelo menos 23% e mais particularmente pelo menos 25% de glucanos do produto total em base de sólidos secos. O produto compreende também adequadamente menos do que 45%, particularmente menos do que 40%, e mais particularmente, menos do que 35% de glucanos do produto total em base de sólidos totais.

O produto resultante da autólise das células de levedura compreende adequadamente pelo menos 5%, particularmente pelo menos 7% e mais particularmente pelo menos 10% de alfa-glucanos do produto total em base de sólidos secos. O produto compreende também adequadamente menos do que 20%, particularmente menos do que 18%, e mais particularmente, menos do que 15% de alfa-glucanos do produto total em base de sólidos totais. O produto resultante da autólise das células de levedura compreende adequadamente pelo menos 7%, particularmente pelo menos 10% e mais particularmente pelo menos 12% de beta-glucanos do produto total em base de sólidos secos. O produto compreende também adequadamente menos do que 22%, particularmente menos do que 20%, e mais particularmente, menos do que 18% de beta-glucanos do produto total em base de sólidos totais. O produto resultante da autólise das células de levedura compreende adequadamente pelo menos 5%, particularmente pelo menos 7% e mais particularmente pelo menos 10% de mananas do produto total em base de sólidos secos. O produto compreende também adequadamente menos do que 20%, particularmente menos do que 18%, e mais particularmente, menos do que 15% de mananas do produto total em base de sólidos totais.

O produto de paredes celulares com produto enriquecido em β- (1,3/1,6)-glucano caracteriza-se, por exemplo, como pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60% ou pelo menos 65% de β-(1,3/1,6)-glucano, com um teor de proteína de menos do que 20%, menos do que 15%, ou menos do que 10%. O produto enriquecido em manana (extrato secundário de manana) pode ser caracterizar por conter pelo menos 50%, particularmente pelo menos 55%, e ainda mais particularmente, pelo menos 57% de manana. O produto enriquecido em manana pode se caracterizar também por conter menos do que 70%, particularmente menos do que 68%, e ainda mais particularmente, menos do que 65% de manana. O produto enriquecido em manana (extrato secundário de manana) pode ser caracterizar por conter pelo menos 25%, particularmente pelo menos 27%, e ainda mais particularmente, pelo menos 29% de proteína. O produto enriquecido em manana pode se caracterizar também por conter menos do que 35%, particuiarmente menos do que 32%, e mais particularmente, menos do que 30% de proteína.

A etapa de ultrafiltração pode ser conduzida forçando um extrato produzido a partir do processo aqui descrito, tal como um extrato secundário de manana, através de um ultrafiltro sob pressão. Adequadamente, o ultrafiltro compreende uma ou mais membranas semipermeáveis. A membrana semipermeável ou o ultrafiltro pode ter um corte de peso molecular, por e- xemplo, de pelo menos 8.000 Da, particularmente pelo menos 10.000 Da, mais particularmente pelo menos 25.000 Da, e ainda mais particularmente pelo menos 50.000 Da. Deve-se entender que o ultrafiltro por ter um corte de peso molecular de qualquer valor entre aqueles aqui enunciados, incluindo, porém sem limitações, um corte de peso molecular de pelo menos 15.000 Da, 20.000 Da, 30.000 Da, 40.000 Da, 60.000 Da, 70.000 Da, 80.000 Da, 90.000 Da, 110.000 Da, 120.000 Da, 130.000 Da e 140.000 Da. As membranas apropriadas do ultrafiltro incluem, porém sem limitações, membranas de fibras ocas disponíveis na A/G Technology Corp., Needham, MA.

Pelo menos 80% em peso, particularmente pelo menos 85% em peso, e mais particularmente pelo menos 90% em peso das mananas secundárias totais no matéria retido no filtro após a filtração de um extrato de mananas secundárias podem ter um peso molecular acima do corte de peso molecular do filtro usado. Por exemplo, se um corte de 10.000 Da é usado com um extrato de mananas secundárias, tipicamente pelos menos 80% em peso, particularmente pelo menos 85% em peso, e mais particularmente pelo menos 90% em peso das mananas totais no material retido no filtro podem ter um peso molecular acima de 10.000 Da. Se um corte de 50.000 Da é usado com um extrato de mananas secundárias, tipicamente pelos menos 80% em peso, particularmente pelo menos 85% em peso, e mais particularmente pelo menos 90% em peso das mananas totais no material retido no filtro podem ter um peso molecular acima de 50.000 Da. Se um corte de 100.000 Da é usado com um extrato de mananas secundárias, tipicamente pelos menos 80% em peso, particularmente elo menos 85% em peso, e mais particularmente pelo menos 90% em peso das mananas totais no material retido no filtro podem ter um peso molecular acima de 100.000 Da. Se um corte de 150.000 Da é usado com um extrato de mananas secundárias, tipicamente pelo menos 80% em peso, particularmente elo menos 85% em peso, e mais particularmente pelo menos 90% em peso das mananas totais no material retido no filtro podem ter um peso molecular acima de 150.000 Da.

A etapa de ultrafiltração pode incluir opcionalmente passar o extrato de mananas através de dois ou mais ultrafiltros com cortes de peso molecular diferentes. O material final retido no filtro compreende enriquecido em mananas, onde a maior parte das mananas tem um peso molecular que cai dentro da faixa entre os cortes de peso molecular dos ultrafiltros. Nesta modalidade, pelo menos 80% em peso, particularmente elo menos 85% em peso, e mais particularmente pelo menos 90% em peso das mananas totais no material final retido no filtro podem ter um peso molecular entre os cortes de peso molecular dos ultrafiltros.

O extrato de mananas secundárias que resulta da separação do produto enriquecido em glucanos depois do tratamento enzimático de paredes celulares que sofreram autólise caracteriza-se, por exemplo, por 15% a 50% de manana, 20% a 30% de proteína, e 20% a 25% de outros componentes. Quando o extrato de mananas secundárias é ultrafiltrado de acordo com os métodos da invenção, o material retido no filtro pode compreender pelo menos 50%, particularmente pelo menos 52%, mais particularmente pelo menos 55%, e ainda mais particularmente, pelo menos 60% de manana. O material retido no filtro pode compreender menos do que 70%, particularmente menos do que 65%, e mais particularmente, menos do que 62% de manana. O material retido no filtro pode compreender pelo menos 10%: par-ticularmente pelo menos 12%, mais particularmente pelo menos 15%, e ainda mais particularmente, pelo menos 17% de proteína. O material retido no filtro pode compreender ainda menos do que 33%, particularmente menos do que 30%, e mais particularmente, menos do que 22% de proteína.

As preparações de acordo com a presente invenção são consideradas como sendo de valor, por exemplo, com suplementos alimentares, produtos farmacêuticos (por exemplo, para melhorar a resposta imunológica, cosméticos, rações animais e produtos nutracêuticos. Por exemplo, uma ração animal pode conter adequadamente 1 a 10 g de preparação/kg de ração. Adequadamente, a preparação pode compreender pelo menos 0,01%, particularmente pelo menos 0,02%, mais particularmente pelo menos 0,05%, e ainda mais particularmente, pelo menos 0,1%, e menos do que 5%, particularmente menos do que 2%, mais particularmente, menos do que 0,5%, e ainda mais preferivelmente, menos do que 0,3% do peso total da ração, baseado em peso/peso. As rações animais apropriadas incluem, porém sem limitações, rações para gado bovino, eqüinos, suínos, aves, peixes (por e- xemplo, crustáceos, moluscos), pássaros e animais de estimação (por e- xemplo, gatos, cães). Uma composição líquida pode conter 0,1-1% em peso da preparação de acordo com a presente invenção. As preparações de a- cordo com a presente invenção podem ser usadas também em uma compo-sição para proteção de plantas, junto com um veículo de uso agrícola, e op-cionalmente, um nutriente, herbicida ou pesticida de uso agrícola.

Por exemplo, as frações enriquecidas em beta-glucano, fabricadas de acordo com a presente invenção, podem ser usadas adequadamente como estimuladores imunológicos em rações animais e alimentos para consumo humano, produtos farmacêuticos ou emolientes, gentes para reduzir colesterol e agentes espessantes em alimentos e bebidas. Caso adicionado a um emoliente, loção ou creme, e usado para tratar uma condição, o beta- glucano pode estar presente adequadamente em uma concentração (p/p) de pelo menos 0,05%, particularmente pelo menos 0,1%, e mais particularmente, pelo menos 0,5%, e menos do que 10%, particularmente menos do que r-5%, e mais particularmente, menos do que 2%. Adequadamente, as frações de beta-glucano, fabricadas de acordo com a presente invenção, podem ser usadas para tratar eczema, por exemplo, pela incorporação em um creme, loção ou emoliente. O eczema engloba várias condições de pele inflamada, incluindo dermatite atópica ("eczema atópico"), e afeta cerca de 10% a cerca de 20% da população mundial durante a infância. O eczema parece ser uma resposta anormal do sistema imunológico do corpo.

Existem também inúmeros usos para os produtos enriquecidos em mananas, fabricados de acordo com a presente invenção. Por exemplo, os produtos de mananas podem ser usados na indústria de rações animais, tendo vantajosamente a capacidade de se ligarem a micotoxinas e também às bactérias patogênicas, impedindo as bactérias de colonizarem o trato intestinal.

Resumindo, a invenção fornece, dentre outras coisas, reparações enriquecidas de β-glucanos e mananas, utilizando processos em condições relativamente brandas do processo.Várias características e aspectos da invenção estão enunciados nos exemplos que se seguem.

EXEMPLO 1: Processamento de Levedura Usando uma Protease de pH Alto 31,1 kg da fração de paredes celulares de uma autólise comercial de levedura dos cervejeiros (Saccharomyces cerevisiae) foram aquecidos até 55 °C em um vaso de aço inoxidável encamisado. Os sólidos totais eram de 10,7% e a proporção total de proteína nos sólidos era de 24,5%. O pH foi elevado até 9,5 com hidróxido de sódio e adicionou-se 0,1% (baseado no peso total) de Protex 6L (uma protease alcalina disponível na Genencor, Paio Alto, CA, EUA). As paredes celulares foram agitadas a 55 °C por 16 horas. O Protex 6L foi inativado por calor a 85 °C por 30 min, e as paredes celulares foram separadas com uma centrífuga de caneca modelo Alpha Lavai Gyro, usando um processo de decantação contínua. A fração de paredes celulares insolúveis foi condensada até 15,4% de sólidos, o pH foi ajustado para 7,0 com ácido clorídrico e a fração foi atomizada. Uma parte do extrato do tratamento com Protex 6L (correspondente ao 2s extrato ilustrado na figu- ra 1) foi condensada até 28,3% de sólidos, o pH foi ajustado até 7.0. e o extrato foi atomizado. O restante do 2s extrato foi ultrafiltrado usando uma membrana de fibras ocas UFP-10-C-6A 10.000 NMWC (disponível na A/G Technology Corp., Needham, MA, EUA). O material retido no filtro, enriquecido em mananas, e de alto peso molecular, teve seu pH ajustado para 7,0 e atomizado. O 3e extrato (filtrado) teve seu pH ajustado para 7,0, condensado e atomizado.

A composição dos produtos resultantes deste processo foi analisada usando as seguintes técnicas: a proteína foi determinada usando um determinador de proteínas LEGO (LECO Corp., St. Joseph, Ml, EUA); os glucanos, alfa-glucanos e beta-glucanos totais foram medidos usando um kit de Beta-glucanos de Cogumelo e Levedura Megazyme International (disponível na Megazyme International, Wicklow, Irlanda); as mananas foram determinada por hidrólise ácida de carboidratos e ensaio espectrofotométrico ligado para manose livre, usando hexocinase, glicose-6-fosfato desidrogena- se, fosfoglicose isomerase e fosfomanose isomerase; a gordura foi determinada usando o método de extração com metanol/clorofórmio de Blich, E.G. e Dyer, W.J., Can. J. Biochem. Physiol. 37:911 (1959); a glicose livre foi medida usando o Analisador de Bioquímica Yellow Springs Instruments (disponível na YSI Incorporated, Yellow Springs, OH. EUA). Os resultados destas análises estão indicados na Tabela 1. Tabela 1Caracterização de Produtos

ND significa não-determinado

EXEMPLO 2: Processamento de Levedura Usando uma Protease de pH Alto e Glicoamilase A60.560 litros (16.000 gal) de cremes de paredes celulares de uma produção de extrato de levedura dos cervejeiros foram aquecidos até 55 °C e o pH foi ajustado para 9,5 com hidróxido de sódio. Adicionou-se Pro- tex 6L a 0,1% em volume, e a mistura foi mantida a 55 °C por 14 horas. O pH foi baixado até pH 5,0 com HCI. No pH 5, o Protex 6L é inativo e não destruirá as enzimas adicionadas. Adicionou-se Concentrado de Glicoamilase (disponível na Valley Research, South Bend, IN, EUA) a 0,0175% (pe- so:peso total). A temperatura foi mantida em 55 °C por 4 horas, e depois e- levada até 88 °C para inativar as enzimas. O material aquecido foi separado com um separador de caneca Westfalia (disponível a Westfalia Separator, Inc., Northvale, NJ, EUA). A maior parte do extrato (ilustrada como 2- extrato na figura 2) foi condensada e atomizada. Uma parte do 2e extrato foi ultrafil- trada usando uma membrana de fibras ocas UFP-10-C-6A 10.000 NMWC (disponível na A/G Technology Corp., Needham, MA, EUA). O material retido no filtro e o filtrado foram condensados e atomizados. Os produtos atomiza- dos foram analisados de acordo com as técnicas descritas no Exemplo 1. Os resultados estão apresentados na Tabela 2. A fração de paredes celulares foi lavada com água por centrifugação, condensada e atomizada.Tabela 2Caracterização de Produtos Fabricados de Acordo com o Processo Representado na figura 2

ND significa não-determinado

A eficácia da glicoamilase adicionada no processo do Exemplo 2 pode ser observada quando se compara os dados das Tabelas 1 e 2, No processo do Exemplo 2, os alfa-glucanos não foram detectáveis no material retido no filtro e no filtrado depois da ultrafiltração. Além disso, o 2- e o 32 extratos do processo do Exemplo 2 têm um nível muito mais alto de glicose livre, como indicado na Tabela 2, do que o 22 e o 32 extratos do processo do Exemplo 1, como indicado na Tabela 1.

EXEMPLO 3: Processamento de Levedura Usando Glicoamilase e uma Protease de pH Alto Adicionadas às Paredes Celulares de Levedura que Sofreram Autólise em Ordens Diferentes

Foram adicionados 25 kg de paredes celulares a cada um dos dois vasos de aço inoxidável encamisados, a partir de uma corrida industrial de um extrato de levedura dos cervejeiros, na qual as células de levedura tinham sido submetidas à autólise. Os soídos eram de 11,8%. Ambos vasos foram aquecidos até 55 °C. O pH do Vaso 1 foi ajustado para 5,0 e adicionou-se Concentrado de Glicoamilase (disponível na Valley Research, South1 Bend, IN, EUA) a 0,1% (peso:peso total). A incubação foi continuada por 14 horas antes de elevar o pH até 9,5. Depois, adicionou-se Protex 6L a 0,10% e a incubação foi continuada por 4 horas. Amostras foram retiradas em vários pontos no tempo e testadas quanto à glicose livre liberada pela ação da glicoamilase.O pH do Vaso 2 no início foi elevado até 9,5 e adícionou-se Pro- tex 6L a 0,1% (peso:peso total). O foi então reduzido 5,0 e adicionou-se Concentrado de Glicoamilase a 0,1%. A incubação foi continuada por mais 4 horas. Amostras foram retiradas em vários pontos no tempo e testadas quanto à glicose livre liberada pela ação da glicoamilase. A Tabela 3 indica o nível de glicose livre em ambos vasos em vários tempos.Tabela 3Liberação de Glicose a Partir de g-Glucanos Paredes Celulares de Levedura dos Cervejeiros (g/L de glicose livre)

Os dados da Tabela 3 indicam que, quando a glicoamilase é a-dicionada antes do Protex 6L, como no Vaso 1, então as paredes celulares são alteradas suficientemente para permitir que a glicoamilase acesse e digira o α-glucano (glicogênio) de alto peso molecular que fica entranhado dentro das paredes celulares após a autólise da levedura dos cervejeiros. Em contraste, no Vaso 2, adicionando a protease antes da glicoamilase, permite- se que a glicoamilase acesse e digira o a-glucano, e libere substancialmente mais glicose. Este é o caso, muito embora a glicoamilase no Vaso 1 tivesse um tempo mais longo (14 horas) para funcionar em pH 5,0 do que a glicoamilase do Vaso 2 (4 horas). Portanto, para a remoção ótima de glicogênio/a- glucano das paredes celulares da levedura dos cervejeiros, a protease alcalina Protex 6L deve ser adicionada antes da glicoamilase.

EXEMPLO 4: Processamento da Levedura dos Cervejeiros e da Levedura dos Padeiros de Acordo com o Processo Ilustrado na figura 2220 g das paredes celulares de uma autólise comercial de levedura dos cervejeiros primária (a 15% de sólidos) ou da levedura dos padeiros (a 11,8% de sólidos) foram aquecidos até 55°C e os pHs foram ajustados para 9,5. As paredes celulares foram então tratadas por 14 horas com Pro- tex 6L a 0,1% (peso:peso total). Depois de 14 horas, os pHs foram baixados para 5,0 e adicionou-se Concentrado de Glicoamilase a 0,0175% a cada um dos vasos. Os frascos foram incubados a 55 °C por mais 4 horas. A glicose livre foi monitorada com um Analisador de Bioquímica YSI. Os resultados estão indicados na Tabela 4.Tabela 4Comparação de Glicose Liberada a Partir das Paredes Celulares da Levedura dos Padeiros e da Levedura dos Cervejeiros, Usando o Processo Ilustrado na figura 2

As paredes celulares resultantes da autólise da levedura dospadeiros contêm níveis mais baixos de glicogênio do que as paredes celulares da levedura dos cervejeiros porque a levedura dos cervejeiros desenvolvida principalmente de forma aeróbica tende a acumular menos beta- glucano do que a levedura dos cervejeiros desenvolvida de forma anaeróbi- ca. Mais glicose foi liberada a partir das paredes celulares da levedura dos cervejeiros depois da incubação com glicoamilase do que a partir das paredes celulares da levedura dos padeiros. O processo da figura 2 é, portanto, extremamente eficaz para processar beta-glucano a partir de paredes celulares da levedura dos cervejeiros. EXEMPLO 5: Uso de Extratos em Ração Animal

Uma mistura 50:50 (na base de sólidos secos) de células de levedura dos cervejeiros submetidas à autólise:22 extrato do processo da figura 2, fabricada de acordo com o Exemplo 2 (isto é, mananas obtidas depois do tratamento com protease e amilase), foi formulada misturando a seco os dois componentes entre si. Esta mistura foi usada para suplementar as dietas de leitões por 28 dias depois do desmame. A mistura foi adicionada em uma taxa de 1,36 kg/t (3 lb/t) da dieta durante a Fase 1 (0-7 dias), 0,907 kg/t (2 lb/t) da dieta durante a Fase 2 (7-14 dias) e 0,907 kg/t (2 lb/t) da dieta du-rante a Fase 3 (14-28 dias). As dietas do controle e do tratamento continham antibióticos. Os leitões pós-desmame (17-22 dias de idade) foram alocados aleatoriamente à dieta do controle ou do tratamento baseado no peso corporal. Havia 6 chiqueiros com treze porcos para cada dieta. Os resultados estão indicados na Tabela 5.Tabela 5Peso, kg (lb) (médio)

a,bSignificam que diferem significantemente

Os porcos alimentados com a dieta de tratamento ficaram significantemente mais pesados no Dia 14 e houve uma tendência de os porcos apresentarem aumentos de peso durante os 28 dias.EXEMPLO 6: Uso de Extratos de Levedura como Intensificador de Palatabí- lidade em Rações Animais

Grânulos (kibbles) para caninos foram revestidos com óleo, e depois adicionou-se 1,0% do 32 extrato do processo ilustrado na figura 2, fabricado de acordo com o Exemplo 2 (isto é, o filtrado depois da ultrafiltra- ção), ou 1,0% de um intensificador de palatabilidade aceito, por aspersão sobre a superfície dos grânulos revestidos com óleo. 1.000 g de cada ração foram oferecidos a um grupo de 20 cães por dois dias As posições das tige las foram invertidas para impedir permutação "esquerda-direita".

A quantidade de ração comida por cada cão durante o período de dois dias está indicada na Tabela 6. A Tabela 6 indica que o 32 extrato doprocesso da figura 2, fabricado de acordo com o Exemplo 2, intensificou a palatabilidade de uma ração seca para cães tanto quanto, senão mais do que o palatabílizante-padrão.

EXEMPLO 7 (hipotético): Características de Parede Celular de Levedura - Pó Atomizado

Um produto de paredes celulares de levedura, altamente purificado, de Saccaromyces cerevisiae, é produzido de acordo com o processo descrito no Exemplo 2. Ele em uma alta concentração de (β-1 31 ;6)-glucano. O produto é G.R.A.S. (Generalmente Reconhecido como Seguro) pela FDA. O produto pode ser usado para suplementar uma ampla série de alimentos com uma fonte natural de alta qualidade de (β-1.31,6)-glucano. Este material 5 biologicamente ativo demonstrou estimular o sistema imunológico de uma ampla série de animais. A composição e as características do produto estão indicadas na Tabela 7.Tabela 7

EXEMPLO 8 (hipotético)

Um creme de paredes celulares da levedura dos cervejeiros é aquecido até 55°C (131 °F). O pH é elevado para 9,5 com hidróxido de sódio a 50% (cerca de 5 mL/kg de creme de paredes celulares). Adicionou-se Pro- tex 6L (Genencore) a 0,1% (volume:peso total de creme de paredes celula- 15 res). A mistura e mantida a 55°C (131 °F) por 14 horas. O pH é baixado até5,0 com HCI a 28% (ácido muriático) e adiciona-se Concentrado de Glicoamilase a 0,0175% (peso:peso total) (Valley Research). A mistura é mantida a 55 °C por 4 horas, antes de inativar por calor as enzimas aquecendo até 85- 90 °C (185-195 °F). As frações são separadas. Antes de atomizar a fração 20 insolúvel enriquecida em beta-glucano, o pH é ajustado para 6,5. A fração insolúvel enriquecida em beta-glucano é atomizada.

Um produto de paredes celulares de levedura, altamente purificado, de Saccaromyces cerevisiae, é produzido. Ele tem uma alta concentração de (β-1.31,6)-glucano. O produto é G.R.A.S. (Genericamente Reco- nhecido como Seguro) pela FDA O produto pode ser usado para suplementar uma ampla série de alimentos com uma fonte natural de alta qualidade de (β-1.31,6)-glucano. Este material biologicamente ativo demonstrou estimular o sistema imunológico de uma ampla série de animais. A composição e as características do produto estão indicadas na Tabela 7.EXEMPLO 9: Processamento de Levedura Usando uma Protease de pH Alto Lipase A220 g das paredes celulares (a 15% de sólidos) de uma autólise comercial de levedura dos padeiros foram colocados em um frasco de vidro e agitados. A temperatura foi elevada até 55 °C e o pH foi ajustados para 9,5 com HCI. Adicionou-se Protex 6L a 0,1% e a amostra foi incubada por 14 horas. Nesta hora, alíquotas de 30 g foram colocadas dentro de tubos de centrífuga de 50 mL (disponíveis na Nalgene), apropriados para uso em um rotor de centrífuga Sorvall SS34. Uma barra de agitador magnético foi adicionada a cada tubo. As seguintes adições, A, B ou C foram feitas aos tubos de centrífuga:A - Concentrado de Glicoamilase a 0,0175% (disponível na Valley Research)B - Lipase CR a 0,1% (uma triglicerol-lipase dispoível na Valley Research)C - Concentrado de Glicoamilase a 0,0175% + Lipase CR a 0,1%

Cada tubo foi incubado a 55 °C por 4 horas sob agitação. As enzimas foram exterminadas com calor a 85 °C por 15 min, e as paredes celulares foram peletizadas usando uma centrífuga Sorvall® com um rotor SS34 (a 12.000 rpm por 10 min). Os péletes foram então lavados três vezes com um volume de água igual ao volume do extrato solúvel removido. As paredes celulares foram recolocadas em suspensão até 15% de sólidos e atomizadas com um miniatomizador Buchi B-191. As paredes celulares secas foram analisadas quanto ao teor de proteína (nitrogênio X 6.25; determinador de proteína LECO, disponível na LECO Corp., St. Joseph, Ml, EUA) e o beta-glucano foi medido usando o kit de Beta-glucanos de Cogumelo e Levedura Me- gazyme International (disponível na Megazyme International, Wicklow, Irlanda). Os resultados estão indicados na Tabela 8.

EXEMPLO 10 (hipotético): Uso do Produto Enriquecido em Beta-glucano doExemplo 2 em Ração para Frangos para Assar na Grelha

Uma ração-padrão para frangos (sem antibiótico), contendo 1 g/kg de produto enriquecido com beta-glucano do Exemplo 2, ou não contendo qualquer beta-glucano (controle), é dada diariamente para galetos desde a idade de 1 dia. Depois de 7 dias, os galetos alimentados com o controle e com beta-glucano recebem um desafio respiratório com uma cepa de E. coli patogênica para frangos. Os galetos continuam a receber sua dieta respectiva, e a mortalidade é registrada por 1 mês.

Espera-se que mortalidade dos frangos alimentados com beta- glucano seja significativamente mais baixa do que a daqueles que receberam a dieta-padrão. A estimulação do sistema imunológico dos frangos é valiosa para diminuir as perdas de produção em virtude da infecção respiratória.EXEMPLO 11 (hipotético): Uso do Material Retido no Ultrafiltrado Enriquecido em Mananas do Exemplo 1 em Ração para Frangos para Assar na Grelha

Uma ração-padrão para frangos (sem antibiótico), contendo 1 g/kg de produto enriquecido com manana dodo material retido a ultrafiltração do Exemplo 1, ou não contendo qualquer manana (controle), é dada diariamente para galetos por 2 semanas. Os galetos (grupo de controle e alimentado com manana) recebem uma inoculação oral de uma cepa de Salmonella patogênica para frangos. Os galetos continuam a receber sua dieta respectiva, e a mortalidade e a morbidez são monitoradas por 1 mês.A manana se liga à Salonella e impede que ela se ligue ao trato intestinal dos frangos na ração com manana Espera-se que isto resulte em uma redução significativa a morbidez e mortalidade dos frangos alimentados com manana.EXEMPLO 12 (hipotético): Uso do Produto Enriquecido em Beta-glicana dos Exemplos 1 ou 2 no Cultivo de Camarão-tigre

Um grupo de camarões-tigre (Penaeus monodon) é imergido em uma solução que não contém produto enriquecido com beta-glucano (grupo de controle). Este grupo é alimentado com um pélete comercial que não contém produto enriquecido com beta-glucano durante o curso do estudo. Um segundo grupo de camarões-tigre é imergido em uma solução que contém 0,1% do produto enriquecido com beta-glucano do Exemplo 1, e depois alimentado com um pélete de produto enriquecido com beta-glucano do Exemplo 1. Um terceiro grupo de camarões-tigre é imergido em uma solução que contém 0,1% de produto enriquecido com beta-glucano do Exemplo 2, e depois alimentado com um pélete comercial que contém 0,1% do produto enriquecido com beta-glucano do Exemplo 2. A mortalidade de cada grupo é monitorada durante vários meses.Existe historicamente um alto índice de mortalidade na criação de camarões. Espera-se que os beta-1,3/1,6-glucanos de levedura dos E- xemplos 1 e 2 estimulem a resposta imune do camarão quando o camarão é imergido em soluções que contêm beta-glucano, e quando o camarão é subsequentemente alimentado com ma ração que contém beta-glucano, em comparação com o grupo de controle. Espera-se que os grupos de camarões-tigre imergidos e alimentados com as dietas de beta-glucano cresçam mais rapidamente e tenham mortalidade reduzida em comparação com o grupo de controle, em virtude da estimulação de seu sistema imunológico inato.EXEMPLO 13 (hipotético): Uso do Produto Enriquecido com Beta-glucano do Exemplo 2 no Tratamento de Eczema

Um seleto grupo de crianças sofrendo de eczema, não- responsivo aos tratamentos atuais aceitos com loção para a pele, é tratado com uma loção que contém 1% de uma suspensão do produto enriquecido em β-glucano do Exemplo 2. A loção é aplicada duas vezes ao dia. A pele c avaliada semanalmente por um dermatologista quanto à melhora das lesões e da dor. Espera-se que a loção de β-glucano diminua a dor associada às lesões e acelere a cicatrização das lesões.EXEMPLO 14 (hipotético): Uso do Produto Enriquecido com Beta-glucano do Exemplo 2 na Produção de Guloseimas Saudáveis

O extrato de beta-glucano de levedura do Exemplo 2 é adicionado a um sorvete a 1% em peso como uma substituição parcial da gordura. O beta-glucano aumenta a firmeza e o corpo do sorvete sem afetar a textura. O sorvete suplementado com beta-glucano contém menos calorias do que o sorvete que não contém beta-glucano. Depois da ingestão do sorvete suplementado, espera-se que os beta-glucanos estimulem o sistema imunoló- gico inato do trato intestinal e beneficiem o estado imunológico do consumidor.

O extrato de beta-glucano de levedura do Exemplo 2 é adicionado em uma quantidade de 0,5% em peso e 1% em peso a bolinhos, barras de guloseimas e itens de confeitaria que não contêm beta-glucano. Depois da ingestão dos bolinhos, barras de guloseimas e itens de confeitaria, suplementados, espera-se que os beta-glucanos estimulem o sistema imunológico inato do trato intestinal e beneficiem o estado imunológico do consumidor.

Embora a presente invenção tenha sido descrita e exemplificada com alguma especificidade, os versados nessas técnicas devem avaliar que várias modificações, incluindo variações, adições e omissões que podem ser feitas no relatório descritivo apresentado. Consequentemente, pretende-se que estas modificações também estejam englobadas pela presente invenção e que o âmbito da presente invenção esteja limitado unicamente pela interpretação mais ampla que legalmente possa estar consoante com as reivindicações apensadas.

Todas patentes, publicações e referências aqui citadas são aqui inteiramente incorporadas como referência. No caso de conflito entre o presente relatório descritivo e as patentes, publicações e referência incorporadas, o presente relatório descritivo deve prevalecer.

Claims

1. Método para processar células de levedura, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) efetuar a autólise de células de leveduras em uma temperatura de 50oC a 65oC, para liberar paredes celulares da levedura;(b) incubar as paredes celulares de levedura com uma protease exógena em um pH de 9 a 10; e(c) incubar as paredes celulares de levedura tratadas com protease da etapa (b) com uma enzima que compreende pelo menos uma ami- lase, lipase, e uma combinação das mesmas a um pH de 4 a 6;(d) separar as paredes celulares tratadas com enzima da etapa (c) em um componente enriquecido em glucanos e um componente enriquecido em mananas.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células de levedura compreendem células da levedura dos cervejeiros.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda usar o componente enriquecido em glucanos da etapa (d) em uma ração animal.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda usar o componente enriquecido em glucanos da etapa (d) em um produto selecionado entre um suplemento alimentar, um produto farmacêutico, um cosmético e um produto nutracêutico.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda(e) ultrafiltrar o componente enriquecido em mananas da etapa (d) para formar um filtrado e um material retido no filtro.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o material retido no filtro compreende mananas, e em que pelo menos 85% em peso das mananas têm um peso molecular de pelo menos 10.000 Da.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda usar o filtrado da etapa (e) e uma ração animal.

8. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda usar o filtrado da etapa (e) em um produto5 selecionado entre um suplemento alimentar, um produto farmacêutico, um cosmético e um produto nutracêutico.