JP2003534351A - アミロイドβ及びアミロイド沈着物に対する免疫応答誘導のための、アミロイドβと相同的な、合成の、免疫原性だが非アミロイド原性ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は合成の、免疫原性だが非アミロイド原性であるアミロイドβと相同なペプチドに関し、単独又は免疫刺激分子とのコンジュゲートで、アミロイドβペプチド及びアミロイド沈着物に対する免疫応答を誘導するための免疫化組成物において用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願との相互参照 本願は、2000年5月22日に出願された米国特許仮出願番号第60/016,233号から
の優先権の利益を主張し、その内容の全体は、参照により本願に組み込まれる。

【０００２】

【発明の属する技術分野】

本願は、アミロイドβペプチド、並びにアミロイドβペプチド及びアミロイド
沈着物に対する免疫応答を誘導する方法の分野に関する。

【０００３】

【従来の技術】

アルツハイマー病(AD)は、成人の晩年の痴呆のもっとも一般的な形式であり(S
oto et al., 1994)、米国においては４番目に多い死因を構成する。65歳以上の
人口の約10％がこの進行性の変性的疾患に罹患し、それは記憶の喪失、混乱及び
様々な認識不全により特徴付けられる。神経病理学的には、ADは、４つの主要な
病巣により特徴付けられる：a)ニューロン内の、神経フィブリルタングル(neuro
fibrillary tangles, NFT)の細胞質性の沈着物、b)神経炎プラーク(neuritic pl
aques)と呼ばれる実質アミロイド沈着物、c)脳血管アミロイドーシス、及びd)シ
ナプス及びニューロンの損失である。ADにおける重要な現象の１つは、不溶性繊
維塊としてのアミロイドの沈着(アミロイド新生amyloidogenesis)であり、それ
は細胞外ニューロンプラーク及び脳血管壁周辺の沈着物をもたらす。ニューロン
プラーク及びコンゴレッド親和性血管障害の主要な構成要素は、アミロイドβ(A
β)であるが、これらの沈着物はまた、グリコサミノグリカン及びアポリポタン
パク等の他のタンパクをも含む。

【０００４】 Aβは、4.1-4.3kDaの疎水性ペプチドであり、21番染色体に、ずっと長いアミ
ロイド前駆体タンパクAPPの一部として含まれる(condified)(Muller-Hill et al
., 1989)。APPはリーダー配列(シグナルペプチド)で始まり、システインに富ん
だ領域、酸に富んだドメイン、プロテアーゼ阻害剤モチーフ、推定的N-グリコシ
ル化領域、膜透過ドメイン、そして最後に小さな細胞質領域が続く。Aβ配列は
、細胞外側上の膜の近くで始まり、膜内で終わる。Aβの3分の2は、細胞外空間
に面し、他の3分の1は膜内に埋め込まれている(Kang et al., 1987及びDyrks et
al., 1988)。いくつかの証拠の組は、アミロイドが、ADの病原の初期の段階に
おいて中心的な役割を果たしうることを示唆している。

【０００５】 アミロイドがADの病原の初期において重要な役割を果たしうることの証拠は、
主に、家族性の形式のAD(FAD)又はダウン症候群に罹患した個体の研究によるも
のである。ダウン症候群の患者は、APP遺伝子の３つのコピーを有し、AD神経病
理を若年において発達させる(Wisniewski et al., 1985)。遺伝性ADを有する家
族の遺伝子分析は、21番染色体の、Aβ配列の近く又は中の変異(Forsell et al.
, 1995)と、加えてプレゼニリン1及び2遺伝子内の変異を明らかにした。さらに
、高度のヒト変異APPを発現するトランスジェニックマウスは、脳においてアミ
ロイドーシスを進行的に発達させることが報告された(Games et al., 1995)。こ
れらの知見は、ADの病因生理におけるアミロイド新生を暗示するように見られる
。さらに、Aβフィブリルはニューロン培養物において(Yankner et al., 1989)
、及びある程度は動物の脳に注入した場合(Sigurdsson et al., 1996 and 1997)
も毒性である。

【０００６】 さらに、いくつかの他の証拠は、Aβの沈着はADの病因において中心的な引き
金となる出来事であり、これが続いてNFT形成およびニューロン損失をもたらす
ことを示唆する。ADにおけるアミロイド沈着物は、プリオン関連アミロイドーシ
ス等の他の脳アミロイドーシス並びに全身性アミロイドーシスと、数多くの特性
を共有する。それらの特徴は：1)比較的不溶性；2)高度なβシート2次構造を有
し、それは凝集又は重合する傾向と関連する；3)高次構造的には、沈着物は主に
フィブリル状である；4)アミロイドPコンポネント、プロテオグリカン及びアポ
リポタンパク等、ある種のアミロイド関連タンパクの存在；5)沈着物は、コンゴ
レッド染色後偏光した光のもとで見たときに、特徴的な黄緑色の複屈折を示す。

【０００７】 AD脳中でアミロイド沈着を形成する同じペプチドが、通常ヒト体液中で循環す
る可溶形(sAβ)でも見出された(Seubert et al., 1992及びShoji et al., 1992)
。Zlokovic et al. (1994)は、血液脳関門(BBB)が循環sAβの脳血管隔離及び輸
送を制御する能力を有すること、及びBBBをわたってのsAβの輸送が、sAβがア
ポリポタンパクJ(apoJ)との複合体としてモルモットにおいて灌流されている際
に著しく増加したことを報告した。sAβ-apoJ複合体は、正常な脳脊髄液内(CSF;
Ghiso et al., 1994)に見出され、in vivo研究はsAβがapoJと、正常ヒト血漿
内の高密度リポタンパク(HDL)のコンポネントとして輸送されることを示した(Ko
udinov et al., 1994)。Zlokovic et al.(1996)により、BBBをわたってのsAβの
輸送は、apoJ受容体gp330がブロックされた際に、殆ど止められたこともまた見
出された。sAβから不溶性のフィブリルへの変換は、2-3アミノ酸分長い可溶形
のコンホメーション修飾により始まると考えられている。アミロイド形成は、最
初の不溶性の「種」がアミロイドの選択的な沈着を起こさせる核形成依存の現象
であることが示唆されている(Jarrett et al., 1993)。

【０００８】 Aβの配列1-40又は1-42を含むペプチド及びより短い誘導体は、他のタンパク
の非存在下においてアミロイド様フィブリルを形成しうる(Soto et al., 1994)
。このことは、アミロイドを形成する能力が主にAβの構造内に存在することを
示唆する。Aβの1次構造とそのアミロイド様フィブリル形成能力との間の関係を
、ペプチドの配列を変更することにより分析された。内部Aβ疎水性領域(アミノ
酸17-21)の疎水性残基の親水性残基への置換は、フィブリル形成を損なった(Hil
bich et al., 1992)。このことは、Aβの組立てが部分的には疎水性相互作用に
より促進されることを示唆する。実に、2又は3つの追加的な疎水C末端残基を含
むより大きなAβペプチド(Aβ1-42/43)は、よりアミロイド原性である(Jarrett
et al., 1993)。第２に、Aβペプチドによりとられたコンホメーションはアミロ
イド形成に決定的である。異なるpH、濃度及び溶媒でインキュベートされたAβ
ペプチドは、主にα-ヘリカル、ランダムコイル又はβシート２次構造のいずれ
かを有し得る(Barrow et al., 1992; Burdick et al., 1992及びZagorski et al
., 1992)。α-ヘリカル又はランダムコイル構造を有するAβペプチドはゆっくり
凝集し；βシートコンホメーションを有するAβは速く凝集する(Zagorski et al
., 1992; Soto et al., 1995及びSoto et al., 1996)。アミロイド形成における
疎水性及びβシート２次構造の重要性はまた、他のアミロイド原性タンパクの配
列の比較によっても示唆される。

【０００９】 濁度測定によるAβ凝集の分析は、AβのC末端ドメインの長さが、核形成の促
進により、Aβの組立ての速度に影響することを示す(Jarrett et al., 1993)。
従って、AβのC末端ドメインは、フィブリル新生を制御しうる。しかしながら、
金属カチオン(Zn、Al)(Bus et al., 1994及びExley et al., 1993)硫酸ヘパリン
プロテオグリカン、及びアポリポタンパクE(Strittmatter et al., 1993)等の、
Aβアミロイド形成のin vitroのモジュレータは、Aβの12-28領域と相互作用す
る。さらに、N末端Aβドメイン内のAPP遺伝子における変異は、フィブリル新生
性のより高い類似物をもたらす(Soto et al., 1995及びWisniewski et al., 199
1)。最後に、AβのC末端ドメインは、水溶液中において不変的にβストランド構
造に適合する一方、環境的パラメータはAβN-末端ドメインにおける他のコンホ
メーションの存在を決定する(Barrow et al., 1992; Soto et al., 1995及びBur
dick et al., 1992)。従ってN-末端には、最初のランダムコイルからβシートへ
のコンホメーション変化の阻害のための標的サイトとしての可能性がある。

【００１０】 合成ペプチドの研究から明らかになったイメージは、Aβアミロイド形成は逆
並行βシートコンホメーションを採用したAβペプチドの疎水性相互作用に依存
し、N-及びC-末端ドメインの両方がアミロイド形成に重要であるというものであ
る。フィブリル形成の基本的な単位は、ペプチドの領域10-24及び29-40/42が関
与したストランドから構成された逆並行βシートを採用するコンフォーマーであ
ると思われる(Soto et al., 1994)。アミロイド形成は、いくつかのモノマーの
βストランドの間の分子間相互作用により進行し、フィブリルβクロスコンホメ
ーションの、オリゴマーβシート構造前駆体を形成する。Wood et al., (1995)
は、凝集をブロックするプロリンをアミロイドタンパク及びペプチドへ挿入する
とそのようなタンパク及びペプチドの凝集が阻害されることを報告した。このよ
うにして、著者は、天然のタンパクの構造又は機能に影響を与えずに、それらの
産生の障壁としての凝集の問題を避けて、新規なタンパクを設計しうることを示
唆している。したがって、Wood et al.は、組換えタンパク産生の過程及び精製
の間に凝集しない新規なタンパクを産生すべく、凝集/ブロックプロリンをそれ
らの新規なペプチドに挿入することにより、探索している。

【００１１】 今日まで、患者のアミロイドの負担を減少させたりADにおけるアミロイド沈着
を防止させるための、回復法又は有効な治療法は何もない。ADの決定的な診断さ
え、顕著な特徴である神経フィブリルタングル(NFT)及びニューロンプラークに
ついての脳組織の検死解剖後にしかできない。しかしながら、アルツハイマー病
の治療のための方策について概説する刊行物の数は増加している。アミロイド関
連治療の方策は、アミロイドβ前駆体タンパク(APP)のプロセッシングに影響す
る化合物の使用を含む(Dovey et al., 2001)。それは、フィブリル形成と干渉す
るか、フィブリルの解体を促進する(Soto et al., 1998; Sigurdsson et al., 2
000;及びFindeis, 2000)。

【００１２】 硫酸ヘパリン(グリコソアミノグリカン)又は硫酸ヘパリンプロテオグリカンで
あるパールカンは、全てのアミロイドのコンポーネントとして識別されており、
炎症関連アミロイド誘導の初期段階に関係している。Kisilevsky et al.(1995)
は、炎症関連アミロイド前駆体及びADのβペプチドとの硫酸ヘパリンの相互作用
に干渉する低分子量(135-1000Da)のアニオン性のスルホネート又はスルフェート
化合物の使用を記載している。硫酸ヘパリンは特に、可溶性アミロイド前駆体(S
AA2)に影響し、アミロイドのタンパク重畳パターンに特徴的なβシート構造を増
加させる。これらのアニオン性スルホネート又はスルフェート化合物は、電子顕
微鏡でモニターすることにより、in vitroで、ヘパリンにより促進されたアルツ
ハイマー病Aβフィブリル形成を阻害すること及び予め形成されたフィブリルを
分解させることができることが示されている。さらに、比較的高い濃度(20又は5
0mM)で経口で投与された場合、これらの化合物は、ネズミの脾臓の炎症関連アミ
ロイド進行を、急性及び慢性のin vivoモデルにおいて、実質的に阻止した。し
かしながら、最も有効な化合物即ちポリ-(ビニルスルホネート)は急性毒性を有
する。

【００１３】 アントラサイクリンである4'-ヨード-4'-デオキシ-ドキソルビシン(IDOX)は、
免疫グロブリン軽鎖アミロイドーシス(AL)患者においてアミロイド再吸収を誘導
することが臨床的に観察されている。Merlini et al.(1995)は、その作用のメカ
ニズムを解明した。IDOXは、5つの異なる試験されたアミロイドフィブリルにお
いて、２つの区別しうる結合サイトへの疎水性相互作用を介して強力に結合し(
スキャッチャード分析)、フィブリル新生及びそれに続くアミロイド沈着物の形
成をin vitroで阻害することが見出された。IDOXとアミロイド増強因子(AEF)と
のプレインキュベーションもまた、アミロイド沈着物の形成を減少させる。in v
ivoのアミロイド沈着物へのIDOXの特異的ターゲッティングが急性ネズミモデル
において確認された。この結合は、抽出されたアミロイドフィブリルからのヘパ
リナーゼを用いたグリコサミノグリカンの除去がIDOX結合を変化させない点にお
いて、硫酸ヘパリン結合とは区別しうるものである。全てのアミロイド共通の構
造上の特徴は、βひだ状のシートコンホメーションである。しかしながら、IDOX
は天然アミロイド前駆体軽鎖に結合せず、このことはβひだ状のシートの骨格の
みではIDOX結合に最適な構造を形成するのに十分でないこと、及び最大のIDOX結
合に必要なのはフィブリル交差βシート四次構造であることを示唆する。脾臓か
ら抽出されたIDOXの量がアミロイド負荷と相関し、循環血清前駆体アミロイド量
とは相関しないことが見出された。しかしながらIDOXは、毒性が非常に高い。

【００１４】 APP調節タンパクのリン酸化の阻害又は調節を介したアミロイド前駆体タンパ
ク(APP)の制御及びプロセッシングは、米国特許明細書第5835915号及びWO942760
3号においてもまた調べられている。APPをAD核形成型にするタンパク分解プロセ
ッシングの調節は、AU9338358号及びEP569777号においてもまた調べられている
。WO95046477号は担体とカップリングされた化合物X-X-N-X(配列番号:69)(ここ
でXはカチオン性アミノ酸でありNは中性アミノ酸である)である合成ペプチドを
開示し、これはAβのグリコソアミノグリカンへの結合を阻害する。α-1-アンチ
キモトリプシン及びAβのカップリングを阻害するアルツハイマーのAβ配列を含
むペプチドが、WO9203474に開示されている。

【００１５】 本願発明者の研究室で行なわれた実験から、WO96/39834は、Aβ等のアミロイ
ド様沈着形成に関与するタンパク又はペプチドの疎水性部分と相互作用可能なペ
プチドを、そのようなタンパク及びペプチドをアミロイド又はアミロイド様沈着
物とする異常な重畳を阻害し構造的にブロックするのに用い得ることを開示する
。Aβが異常に重畳しアミロイド沈着物となるのをブロックするペプチドは、シ
ートを破るアミノ酸残基、例えばプロリンを含む疎水部分を有し、ペプチドがβ
シートコンホメーションをとる傾向を減少させる。その後の報告において、本願
発明者の研究室は、Aβと配列相同性を有する非アミロイド新生ペプチドであるL
euProPhePheAsp(配列番号:14)がフィブリル形成をブロックし(Soto et al., 199
8)、フィブリルAβ沈着のin vivo分解を誘導する(Sigurdsson et al., 2000)こ
とを示した。

【００１６】 最近、Aβ結合認識配列及び6量体リシン凝集分裂要素を有する抗βシートペプ
チド又はAβフィブリル新生阻害剤の設計において、ペプチドへのリシン残基の
カップリングがPallitto et al. (1999)により提案された。

【００１７】 in vitroの研究により、AβのN-末端領域に対して惹起されたモノクローナル
抗体が、Aβフィブリルの凝集を解離させ、Aβの可溶性を維持し、細胞培養物内
でのAβ毒性を防ぎうることが示された(Solomon et al., 1996及び1997)。

【００１８】 WO96/25435は、Aβ1-42ペプチドの遊離C末端について末端特異的だがAβ1-43
ペプチドについてはそうでないモノクローナル抗体使用についての、Aβ1-42の
凝集の妨害の可能性を開示する。そのようなAβ末端特異的モノクローナル抗体
の投与は、Aβ1-42の遊離C末端残基と相互作用し、それによりそれと干渉し、AD
において病原性となりうる凝集を分裂させることがさらに開示される。

【００１９】 WO98/44955は、薬理的な剤の繰返し投与に関連する問題回避への異なるアプロ
ーチをとり、アミロイドβペプチドの末端に特異的な組換え抗体の脳における安
定した異所性の発現を通じて、アルツハイマー病の発生を防ぐ、又はアルツハイ
マー病の進行を阻害する方法を開示する。

【００２０】 最近、Schenk et al. (1999)は、アミロイドβ沈着及びアルツハイマー病様神
経病理の動物モデルとして使われるPDAPPトランスジェニックマウスのアルツハ
イマー病様病理を、アミロイドβでの免疫化が弱めることを示した。彼らは、ア
ルツハイマー病様神経病理の発生に先立っての若い動物の免疫化は、βアミロイ
ドプラークの形成、ニューロンジストロフィー及びアストログリオーシスの発達
を本質的に妨げ、一方アルツハイマー病様神経病理の発生後の、より高齢の動物
処置ではこれらの神経病理の程度及び進行が減少することが観察されたことを報
告した。この効果は、抗体により媒介されると考えられる。なぜならば末梢的に
投与されたAβに対する抗体は脳実質アミロイドの負担を減少させることが示さ
れたからである(Bard et al.,2000)。さらに、新たに可溶化させたAβ1-40での
鼻腔内免疫化は、脳アミロイド負担を減少させる(Weiner et al., 2000)。2つの
最近の研究は、ワクチン接種により誘導された脳アミロイド沈着物の減少が認識
の改善をもたらしたことを示した(Morgan et al., 2000; Janus et al., 2000)
。

【００２１】 Schenk et al.により報告された結果は、アルツハイマー病を治療するための
一般的なアプローチとして免疫調節を用いることの裏づけを提供するが、Schenk
et al.による無傷のアミロイドβでの免疫化は、それをヒトでの使用を不適切
にするという問題点を提示する。第1に、Shenk et alの実験は、トランスジェニ
ックマウスであって、彼らに対し異物でありマウスにおいて何の生理的機能も持
たない変異ヒトタンパクを発現するものを用いた(マウス及びヒトAβペプチド配
列は顕著に異なる)。しかしながらヒトにおいては、前駆体タンパク(βAPP)は正
常な機能を有する内因性タンパクである。従って、ヒトAβペプチドで、このア
プローチをヒトに用いることは自己免疫疾患又は事態を好転させず悪化させうる
疾患の発達をもたらしうる。第2に、B. Zlokovic (1997)及び本願発明者らは、A
βペプチドであるAβ1-42及びAβ1-40が実験動物において血液脳関門を通ること
を示す結果を得ている。従って、ヒトにおいて、Schenk et al.において免疫化
に用いられるAβ1-42は、血液脳関門を通過し、既存のアミロイドプラークのい
ずれかと共に沈着し、増加した毒性をもたらし、実際にはプラーク形成を促進し
うることが予期される。このことはPDAPPトランスジェニックマウスADモデルに
おいては問題とはなっていなかった。なぜならばヒトAβ1-42はマウスに対して
は低毒性であり；たとえヒトAβ1-42の巨大な沈着があっても、顕著なニューロ
ン損失を示すトランスジェニックマウスはいないからである。第3に、Schenk et
al.は免疫応答を誘導するのに毒性のアジュバントを用いている。

【００２２】 ここでのいずれの文献の引用も、それらの文献が直接関係ある従来技術又は本
願の請求項の特許性について考慮されうる材料であることの容認として意図され
るものではない。いずれの文献の内容又は日付についての叙述も、出願時に出願
人が利用可能な情報に基いており、それらの叙述の正確さについての容認を構成
するものではない。

【００２３】発明の要約 本発明は、アミロイドβと相同的で、免疫原性だがアミロイド新生的でなく、
アミロイドβペプチド及びアミロイド沈着物に対する免疫応答の誘導に用いるこ
とができ、従来技術で見られた合併症及び問題点を克服又は回避しうる合成のペ
プチドを提供する。

【００２４】 アミロイドβと相同的で、免疫原性だがアミロイド新生的でない合成のペプチ
ドは、Aβ1-42の第1の30アミノ酸残基(配列番号:1)を含み、ここで残基17〜21の
0、1つ又は2つはLys、Asp、又はGluで置換され、好ましくは4-10Lys又はAsp残基
のN末端及び/又はC末端セグメントを含む。

【００２５】 本発明はまた、ペプチドが免疫刺激性ポリマー分子に架橋されたコンジュゲー
トを提供する。

【００２６】 本発明の他の特徴は、免疫に有効な量の、アミロイドβと相同的な、アミロイ
ド原性でないが免疫原性の合成ペプチド又はそのコンジュゲートを含む免疫化組
成物/ワクチンに対するものである。

【００２７】 本発明のさらなる特徴は、アミロイドβペプチド及びアミロイド沈着物に対す
る免疫応答を誘導する免疫療法の方法に対するものである。

【００２８】 本発明のさらなる特徴は、本発明のアミロイド原性でないが免疫原性の合成ペ
プチドに対して惹起された抗体の免疫原結合部分を含む分子に対するものである
。このペプチド結合分子を含む薬剤組成物及びアミロイドフィブリル及び沈着物
の形成を減少させる方法もまた提供される。

【００２９】

【発明の実施の形態】

本発明者らは、アミロイドβ(Aβ)と相同的な、合成の非アミロイド原生ペプ
チドであって、免疫原としてのβシートコンホメーションをとる能力が少ないの
みならず、ヒトに毒性の効果を導くいずれのリスクもとても少ないものを設計し
た。免疫化組成物において、これらの合成非アミロイド原生ペプチド又はこれら
のコンジュゲートを用いることにより、本発明は、Aβペプチド及びアミロイド
沈着物を免疫系のターゲットとする手段を提供する。したがって本発明の重要な
目的は、注入されたAβペプチドに関連する毒性を最小限とする一方、Aβペプチ
ド及びアミロイド沈着物に対する免疫応答を最大化した、免疫化する方法を提供
することにある。

【００３０】 Aβと相同的で合成の、非アミロイド原生だが免疫原生の本発明のペプチドは
、減少したフィブリル原性能を有する一方、Jameson et al.(1988)の免疫原性指
標及び本発明者らの研究室の結果/観察に基けばAβペプチドの2つの主要な免疫
原性サイトであるAβ1-42の残基1-11及び22-28が維持されるよう設計される。し
たがって、本発明者らは、Aβ1-42の第1の30アミノ酸残基(配列番号1)であって
、配列番号1の位置17-21の1又は2の疎水性残基が荷電された残基Lys、Asp又はGl
uで置換されたものに基いて合成の非アミロイド原性ペプチドの設計を行なった
。Aβの第1の30残基は、Aβ1-42の疎水性のC末端を欠いているが、配列番号1の
残基1-11及び22-28に対応する、2つの免疫原性サイトを保持している。

【００３１】 Aβ1-30(配列番号1)の17-21位の1又は2つの残基を、βシートコンホメーショ
ンをとる可能性が低い親水性残基であるLys、Asp又はGluで修飾することにより
、ペプチドのフィブリル原性能力が大きく減少する。配列番号12及び13は、その
ような修飾Aβ1-30の例である。さらに、本発明の合成ペプチドのN-末端及び/又
はC-末端における一連のLys又はAsp残基の存在は、免疫原性をさらに増強し(Wer
delin, 1981)、且つ合成ペプチドがβシートコンホメーションをとりアミロイド
フィブリル/沈着物を形成する傾向を減少させる。抗βシートペプチド又はAβフ
ィブリル新生阻害剤の設計において、Aβペプチドへの、長さ4〜8残基のリシン
残基のカップリングが、Pallittoら(1999)により最近提案されているが、Pallit
toのペプチドの免疫原としての使用は全く提案されていない。ポリカチオンアミ
ノ酸は、これまでに、エンドサイトーシス/食作用の過程により細胞へのタンパ
ク輸送を増強するのに用いられている(Martinez-Fong et al., 1994; Wang et a
l., 1989; Shen et al., 1985; Peterson et al., 1984; Deierkauf et al., 19
77; DiNicola et al., 2000)。Buschle et al., (1997)は、ポリカチオン性アミ
ノ酸は、免疫原が存在する細胞によるペプチドのとりこみを増強し、それにより
免疫応答を開始することを報告している。彼らはまた、ポリリシンにより媒介さ
れたペプチドのとりこみは少なくとも一過性の細胞膜透過性によるものと思われ
る一方、ポリアルギニンの存在下でのペプチドの送達はエンドサイトーシスの過
程に依存するかもしれないと報告している。

【００３２】 本発明の、Aβと相同的で、合成の、免疫原性だが非アミロイド原性のペプチ
ドは、Aβフィブリル新生のペプチド阻害剤とは考えられていないが、下記式に
より示される

【００３３】 (A)m-(N-Xaa₁Xaa₂Xaa₃Xaa₄Xaa₅-C)n-(B)p

【００３４】 ここで：mは0、4、5、6、7、8、9、又は10であり; pは0、4、5、6、7、8、9、又は10であり; AはLys又はAspであり;; BはLys又はAspであり;; nは1又は2であり; Nは配列番号1の残基1-16であり; Cは配列番号1の残基22-30であり; Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃、Xaa₄、及びXaa₅はそれぞれLeu、Val、Phe、Phe、及びAla
であり、Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃、Xaa₄、及びXaa₅の0個、1個又は2個の残基はLys、As
p、又はGluで置換され; 0個の残基が置換された場合、m又はpのいずれか又は両方は0ではない。

【００３５】 上記式で示されるペプチドのアミノ酸配列は、配列番号2〜5により示され識別
される。

【００３６】 0個、1個又は2個の残基17-21が置換された基本的な30アミノ酸配列(Aβ1-30)
は、上記式N-Xaa₁Xaa₂Xaa₃Xaa₄Xaa₅-Cにより示される。この30アミノ酸残基セグ
メントは、本発明の合成ペプチドにおいて繰返すことができる(nが2)。好ましく
は、4〜10残基のポリリシン又はポリアスパルテートセグメントが、ペプチドのN
末端及び/又はC末端に存在する。Aβ1-30の残基17-21においてどの残基も置換さ
れない場合、ペプチドは4〜10残基のポリリシン又はポリアスパルテートセグメ
ントをN末端及び/又はC末端に有する。ポリリシン又はポリアスパルテートセグ
メントがC末端に存在しない場合、好ましい実施態様である配列番号6によって例
示される通り、C末端は好ましくはアミド化される。配列番号11は、C末端に4〜1
0残基のポリリシン又はポリアスパルテートセグメントを有する非置換Aβ1-30ペ
プチドの態様である。

【００３７】 さらに、mが0の場合、4〜10残基のN末端ポリリシン又はポリアスパルテートセ
グメントは存在しないので、ペプチドのC末端がアミド化されペプチドのC末端電
荷がAβの残基22-28領域の免疫原性を減少させる可能性を減少させるか、又は4
〜10残基のポリリシン又はポリアスパルテートセグメントがC末端に存在するこ
とが好ましい。本発明のペプチドの他の好ましい実施態様は下記の通りである：

【００３８】 mが0でない場合、pが0; pが0でない場合、mが0;且つ Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃、Xaa₄、及びXaa₅はそれぞれLeu、Val、Phe、Phe、及びAla
であり、1個又は2個の残基Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃、Xaa₄、及びXaa₅がLys、Asp、又は
Gluで置換される(配列番号2-5)。

【００３９】 ペプチド結合が非ペプチド結合で置換された、本発明の合成ペプチドのペプチ
ド模倣物(peptidomimetics)もまた用いることができることを、当業者は認識す
るであろう。

【００４０】 当該分野においてよく知られている通り、本発明の合成ペプチドについての減
少されたフィブリル新生能は、ペプチドのβシートコンホメーションを円二色測
光、FT-IR、及びペプチド懸濁液の電子顕微鏡観察等の慣用の技術で測定するこ
とにより容易に決定しうる。

【００４１】 免疫原は、主要組織適合性(MHC)クラスII抗原と関連して処方し、効率的な抗
体応答を起こさなければならないこともまたよく知られている。抗原提供細胞(A
PC)により産生されたMHCクラスII抗原は、配列特異的な様式で免疫原中に存在す
るT細胞エピトーフに結合する。このMHCクラスII免疫原複合体はCD4⁺リンパ球(T_h 細胞)により認識され、提供された免疫原からのB細胞エピトーフを認識しうる
特異的B細胞の増殖、及びそのようなB細胞によるB細胞エピトーフ特異的抗体の
産生を起こす。本発明の合成ペプチドの免疫原性をさらに増加させるための追加
のアプローチは、ヒトワクチンにおける使用について現在認可されているマンナ
ン(マンノースのポリマー)、グルカン(β1-2グルコースのポリマー)、トリパル
ミトイル-S-グリセリン システイン、及びペプチド等の免疫刺激性ポリマー分子
とのコンジュゲートを形成させることである。ワクチンにおいて使用が認可され
ているそのようなペプチドは、破傷風毒、百日咳毒、麻疹ウイルスFタンパク、
及び肝炎Bウイルス表面抗原(HBsAg)等の有効な免疫原からの強力なTヘルパー細
胞(T_h)エピトーフを提供する。合成ペプチドとコンジュゲートするよう選択され
るT_hエピトーフは、好ましくは、様々なMHCハプロタイプを発現する多くの個体
においてTヘルパー細胞応答を引き出す能力を有する。これらのエピトーフは、
異種集団の多くの異なる個体において機能し、乱雑なT_hエピトーフであると考え
られる。乱雑なT_hエピトーフは、遺伝的に多様な集団の多くの構成員において有
効な抗体応答を引き出す利点を提供する。

【００４２】 さらに、本発明の合成ペプチドとコンジュゲート/架橋したTヘルパー細胞エピ
トーフはまた、ある集団の多くの構成員において免疫応答を起こす能力のためだ
けでなく記憶/想起応答を起こす能力のためにも有利に選択される。哺乳類がヒ
トである場合、本発明の合成ペプチドで免疫治療を受けるヒト被験者/患者の大
多数は小児ワクチン(麻疹＋おたふく＋風疹及びジフテリア＋百日咳＋破傷風ワ
クチン)免疫化されたことがある可能性が高く、B型肝炎ワクチンで免疫化された
可能性もある。したがってこれらの患者は小児ワクチンに存在する少なくとも１
つのT_hエピトーフに前もって晒されている。標準的なワクチンを用いた免疫化に
よりT_hエピトーフに先だって晒されると、T_h細胞クローンが確立されるはずであ
り、これは合成ペプチドが投与されると直ちに増殖し(即ち想起応答)、それによ
りAβペプチド及びアミロイド沈着物に対する迅速なB細胞応答を刺激する。

【００４３】 本発明の合成ペプチドとのコンジュゲートに用いられ得るT_hエピトーフは、乱
雑なものであり、普遍的なものではない。この特徴は、T_hエピトーフは異なるMH
C抗原を発現する異系交配集団の大きなセグメントにおいて反応性である(集団の
50〜90％において反応性である)が、その集団の全ての構成員に対しては反応性
でないことを意味する。本発明の合成非アミロイド原性ペプチドについて包括的
で、普遍的に近い免疫反応性を提供するためには、合成ペプチドに架橋された異
なるT_hエピトーフを有するコンジュゲートの混合物を調製することができる。例
えば、破傷風及び百日咳毒、麻疹ウイルスFタンパクおよびHBsAgからの乱雑なT_h エピトーフの4つのコンジュゲートの組み合わせが、より有効なものとなりうる
。

【００４４】 本発明の合成非アミロイド原性ペプチドに架橋された免疫刺激ペプチド中のT_h エピトーフは、肝炎B表面抗原Tヘルパー細胞エピトーフ、百日咳毒Tヘルパー細
胞エピトーフ、破傷風毒Tヘルパー細胞エピトーフ、麻疹ウイルスFタンパクTヘ
ルパー細胞エピトーフ、Chlamydia trachomitis主要外膜タンパクTヘルパー細胞
エピトーフ、ジフテリア毒Tヘルパー細胞エピトーフ、Plasmodium falciparum
スポロゾイト周囲物 Tヘルパー細胞エピトーフ、Schistosoma mansoniトリオー
スホスフェートイソメラーゼTヘルパー細胞エピトーフ、Escherichia coli TraT
Tヘルパー細胞エピトーフを含み、米国特許第5843446号明細書に開示され、こ
の全体の開示は参照によりここに組み込まれる。

【００４５】 本発明のペプチドについて用いられる用語「合成」は、化学的に合成されるこ
と又はホスト生物体がその天然の状態からペプチドを産生するよう遺伝的に形質
転換された場合のみに生物体内で産生されることを意味することが当業者により
認識される。本発明の合成ペプチドは、当該分野において通常の知識を持つ者に
よく知られている合成化学方法によりつくることができる。したがって合成ペプ
チドは、Applied Biosystemsペプチド合成機等のペプチド合成機において、自動
化された、t-Boc又はF-mocの化学的性質を用いたメリフィールドの固相合成技術
を用いて合成できる。

【００４６】 または、より長いペプチドを、よく知られた組換えDNA技術により合成するこ
とができる。DNA技術についてのいずれの標準的なマニュアルも、本発明の合成
ペプチドを産生するためのプロトコルの詳細を提供する。本発明の合成ペプチド
をエンコードするヌクレオチド配列を構成するため、アミノ酸配列は核酸配列に
逆転写され、好ましくはペプチドが発現される生物体について最適化されたコド
ンの使用を用いる。次に、典型的にはペプチド及び必要であればいずれかの調節
要素をエンコードする、オーバーラップするオリゴヌクレオチドを合成すること
により、合成遺伝子が作られる。合成遺伝子が適切なクローニングベクターに挿
入され、組換えクローンが得られ特徴付けられる。続いて本発明の合成ペプチド
が、選択された発現系及びホストにとって適切な条件下で発現され、標準的な方
法により所望のペプチドが精製され特徴づけられる。

【００４７】 本発明の合成非アミロイド原性ペプチドと架橋されうる免疫刺激性のペプチド
はまた、Yersinia種の侵襲タンパク(invasin protein)から入手可能である。病
原微生物Yersinia種の侵襲タンパクは、哺乳類細胞へのバクテリアの進入を媒介
する外膜タンパクである(Isberg et al., 1990)。微生物による、培養された哺
乳類細胞への侵襲は、Yersinia侵襲分子と、培養細胞上に存在するいくつかの種
類のβ1ファミリーのインテグリンとの相互作用を必要とすることが示されてい
る(Tran Van Nhieu et al., 1991)。Tリンパ球はβ1インテグリン(特に活性化さ
れた免疫化又は記憶T細胞)に富むため、ヒトT細胞への侵襲の効果が調べられて
いる(Brett et al., 1993)。インテグリンは、フィブロネクチン、ラミニン及び
コラーゲンを含む細胞外マトリクスタンパクとのそれらの相互作用を通じ、免疫
T細胞が血管から結合管を通り抗原に攻撃されたサイトへ移動するのを容易とす
ると考えられている。侵襲分子のカルボキシ末端は非特異的マイトジェンである
抗CD3抗体の存在下においてナイーブなヒトCD4⁺Tについて共刺激性であり、サイ
トカインの著明な増殖及び発現を起こすことが見出された。β1インテグリンと
相互作用しこの刺激を起こす特異的な侵襲ドメインもまた識別されている(Brett
et al., 1993)。このドメインと関連する、示されたT細胞共刺激性ペプチドの
ため、それは本発明の合成ペプチドと架橋し、免疫原性を増強することができる
。

【００４８】 多くの他のグラム陰性微生物の外膜タンパクは、脂質で修飾され非常に免疫原
性である。共有結合的な脂質の結合と免疫原性との明らかな相関から、微生物膜
タンパク質に共通して見られる脂質であるトリパルミトイル-S-グリセリン シス
テイン(Pam₃Cys)を、コンジュゲートにおいて合成ペプチドとカップリングし、
免疫原性を増強することができる。

【００４９】 免疫原性はさらに、合成ペプチドがアジュバントと共投与された場合、著明に
改善することができる。アジュバントは抗原の免疫原性を増強するが、それ自身
は必ずしも免疫原性ではない。アジュバントは抗原を投与サイトの近くの局所に
保持し、デポ効果をもたらすよう働くことができ、それにより抗原が、遅く持続
して免疫系細胞へ放出されることを助ける。アジュバントはまた、免疫系の細胞
を抗原デポに誘引し、そのような細胞を刺激し免疫応答を引き出すことができる
。

【００５０】 免疫刺激剤又はアジュバントは、ホストの免疫応答を改善するために、例えば
ワクチンに長年用いられている。リポ多糖類等の内因性のアジュバントは、通常
はワクチンとして用いられる殺された又は弱められた微生物の成分である。外因
性のアジュバントは、典型的には抗原に非共有結合的に結合した免疫調節物であ
り、ホスト免疫応答を増強するために製剤化される。したがって、アジュバント
は抗原に対する免疫応答を増強する、非経口的に送達されるものと識別されてき
た。しかしながらこれらのアジュバントのいくつかは、毒性であり、不所望な副
作用を起こすことがあり、ヒト及び多くの動物においての使用が不適切となる。
実に、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム（合わせて共通にアルムと呼
ばれる）のみが、ヒト及び動物用ワクチンにおいてルーチン的にアジュバントと
して用いられる。ジフテリア及び破傷風トキソイドに対する抗体応答の増加にお
けるアルムの効力はよく確立されており、HBsAgワクチンもまたアルムでアジュ
バント化されている。

【００５１】 幅広い外因性アジュバントが、抗原に対する有効な免疫応答を引き起こしうる
。これらは、膜タンパク抗原と複合化されたサポニン(免疫刺激複合体)、鉱油を
伴なうプルロニックポリマー、鉱油中の殺されたミコバクテリア、Freundの完全
アジュバント、ムラミルジペプチド及びリポ多糖類(LPS)等の細菌産生物、並び
に脂質A、及びリポソームを含む。ヒト免疫応答(HIR)及び細胞媒介免疫性(CMI)
を効率的に誘導するために、免疫原はアジュバント中に乳化される。多くのアジ
ュバントが毒性であり、肉芽種、急性及び慢性の炎症(Freundの完全アジュバン
ト、FCA)、細胞溶解(サポニン及びプルロニックポリマー)及び発熱原性、関節炎
及び前部ブドウ膜炎(LPS及びMDP)を誘導する。FCAは優れたアジュバントであり
研究において広く用いられているが、その毒性のため、ヒト及び動物用ワクチン
における使用には許可されていない。

【００５２】 米国特許第4855283号明細書は、免疫調節因子又はアジュバントとしての、N-
グリコシルアミド、N-グリコシル尿素及びN-グリコシルカルバメートを含む糖脂
質類を教示する。これらは糖残基がアミノ酸で置換されたものである。米国特許
第4258029号明細書は、オクタデシルチロシンヒドロクロリド(OTH)が、破傷風ト
キソイド及びホルマリン不活化タイプI、II及びIIIのポリオウイルスワクチンと
複合化された際、アジュバントとして機能することを教示する。また、Nixon-Ge
orge et al., 1990は組換え肝炎B表面抗原と複合化した芳香族アミノ酸のオクタ
デシルエステルは、B型肝炎ウイルスについてのホストの免疫応答を増強するこ
とを報告している。

【００５３】 Aβペプチド及びアミロイド沈着物に対する免疫応答を最大化させる、外因性
アジュバント/乳化剤製剤の添加が好ましい。適切なアジュバント及び担体は、
以下のものである：(1)ヒト第I相試験において成功裡に用いられているもの；(2
)前臨床安全性研究におけるそれらの反応原性の欠如に基いて、ヒトにおける使
用のために認可される可能性があるもの；又は(3)食品及び愛玩動物における使
用において認可されているもの。現在臨床試験中のアジュバントのいくつかは、
Aguado et al.,(1999)において報告されている。

【００５４】 最少回数の用量、好ましくは１用量の投与に続いて最大の免疫応答をもたらす
免疫療法のやり方が、非常に望ましい。この結果は、免疫原を微小粒子にとり込
むことによりアプローチされうる。例えば、吸収性の縫合糸材料であるポリ(ラ
クチド-co-グリコリド)コポリマーを、微小粒子含有免疫原の様式にすることが
できる。経口又は非経口の投与に続いて、微小粒子のin vivo加水分解が、非毒
性の副生物である乳酸及びグリコール酸を産生し、とり込み過程において殆ど変
化しなかった免疫原を放出する。微小粒子崩壊及びとり込まれた免疫原放出の速
度は、(1)粒子形成に用いられるポリマーの割合(高いコ−グリコリド濃度を有す
る粒子ほど迅速に崩壊する)；粒子サイズ(小さい粒子は大きいものより迅速に崩
壊する)；及び、(3)とり込み効率(取り込まれた免疫原濃度が高い粒子は負荷が
低い粒子より迅速に崩壊する)を含むいくつかのパラメーターにより制御するこ
とができる。微小粒子製剤はまた、異なる放出速度を有する免疫原取り込み微小
粒子を混合することにより、単一投与による一次的及びそれに続くブースター免
疫化を提供しうる。１週間未満から６ヶ月を超える範囲にわたって抗原を放出し
うる単一用量製剤を、容易に得ることができる。さらに微小粒子にとり込まれた
本発明の合成ペプチドの送達はまた、微小粒子免疫原が外因性アジュバント/乳
化製剤と混合された場合、改善された効力を提供する。

【００５５】 合成ペプチドの効力は、アルム中に製剤化された合成ペプチドを、動物、例え
ばマウス又はラットに注射し、続いてアミロイドβペプチドに対する免疫応答を
フォローすることにより、確立され分析されうる。

【００５６】 本発明の他の特徴は、免疫化有効量の、１以上の本発明の合成ペプチド又はそ
のコンジュゲート及び薬剤学的に許容しうる担体、賦形剤、希釈剤又はアジュバ
ントを含む添加剤を含む免疫化組成物を提供する。従って、合成ペプチド又はそ
のコンジュゲートは、アジュバント、薬剤学的に許容しうる担体、賦形剤、希釈
剤、添加剤又は免疫化組成物にルーチン的に提供される他の成分を用いた免疫化
組成物として製剤化することができる。そのような製剤は、当業者が容易に決め
ることができ、即時放出及び持続放出のための製剤、例えばマイクロカプセル化
物を含む。本発明の免疫化組成物はいずれの便利なルートでも投与することがで
きる。そのようなルートは皮下、経口、筋肉内又は他の非経口又は内用のルート
を含む。同様に、ワクチンは、単一用量として又は複数用量に分けて投与しうる
。免疫化スケジュールは当業者により容易に決定しうる。例えば、本発明におい
て用いうるアジュバント又は乳化物は、アルム、不完全Freundアジュバント、リ
ポシン、サポニン、スクアレン、L121、エマルシゲン及びISA720を含む。好まし
い実施態様において、アジュバント/乳化剤はアルム、不完全Freundアジュバン
ト、リポシンとサポニンとの組み合わせ、スクアレンとL121との組み合わせ、又
はエマルシゲンとサポニンとの組み合わせである。

【００５７】 本発明の免疫化組成物は、免疫化有効量の１以上の合成ペプチド又はそのコン
ジュゲート及び薬剤学的に許容しうる担体を含む。用量単位剤型のそのような組
成物は、kg体重あたり約0.5μg〜約1mgの各ペプチド又はコンジュゲートを含む
ことができる。複数用量で送達する場合、用量単位剤型は適切な用量当りの量に
便利に分割される。

【００５８】 ２以上の合成ペプチド又はそのコンジュゲートのカクテルを含む本発明の免疫
化組成物は、免疫化効力を幅広い集団において増強し、したがってアミロイドβ
ペプチド及びアミロイド沈着物に対するよりよい免疫応答を提供する。他の免疫
刺激合成ペプチド免疫原は、有効なワクチンについての組み込まれたアジュバン
ト性を提供するリポペプチドへの修飾により達成される。本発明の合成ペプチド
免疫原に対する免疫応答は、O'Hagan et al (1991)により記載されるタイプの生
分解性微小粒子の中又は上への取り込みによる送達により改善されうる。免疫原
はPam₃Cys等の共有結合的に付けられた脂質部分を含み、アジュバントを伴なっ
て又は伴なわずにカプセル化することができ、そのような微小粒子はFreundの不
完全アジュバント又はアルム等の免疫刺激性のアジュバントと共に投与すること
ができる。微小粒子は免疫原に対する免疫応答を強化するよう機能し、経口投与
及び局所投与のための、持続的又は周期的な応答のための時間制御された放出を
提供する(O'Hagan et al., 1991)。

【００５９】 本発明のさらなる特徴は、本発明の合成ペプチド又はそのコンジュゲートで免
疫化するための方法である。本発明によるこの方法は、その必要のある哺乳類好
ましくはヒトに、合成ペプチド又はそのコンジュゲートを含む免疫化組成物を投
与することを含む。効力は、Schenk et al.(1999)で用いられたマウスモデル又
は他の公に又は商業的に利用可能なADトランスジェニックマウスモデル等の、AD
のトランスジェニックマウスモデルにおいてまず試験される。

【００６０】 本発明のさらに他の特徴は、本発明の免疫原性ペプチドに対して惹起させた抗
体、及びそのような抗体の抗原結合部分を含む分子を提供する。

【００６１】 用語「抗体」が本発明の抗体の態様について用いられる場合、ポリクローナル
抗体又はモノクローナル抗体(mAbs)等の固有(intact)抗体、及びそのタンパク分
解フラグメント、例えばFab又はF(ab')₂フラグメント等を含むことが意図される
ことが理解される。さらに、抗体の可変領域をエンコードするDNAを他の抗体に
挿入し、キメラ抗体を産生することができ(例えば米国特許第4816567号明細書参
照)、又はT細胞受容体に挿入し、同じ幅広い特異性を有するT細胞を産生するこ
とができる(Eschhar, et al., (1990) 及びGross et al., (1989)参照)。単一鎖
抗体もまた産生し用いることができる。単一鎖抗体は、抗原結合能を有し、免疫
グロブリン軽鎖及び重鎖の可変領域(リンクしたV_H-V_L又は単一鎖F_V)と相同的又
は類似の一対のアミノ酸配列を含む単一鎖複合ポリペプチドとすることができる
。V_HとV_Lの両方は、天然のモノクローナル抗体配列をコピーすることができ、又
は１つ又は両方の鎖が米国特許第5091513号明細書に記載されるタイプのCDR-FR
構造を含むことができる(その内容全体は、参照により本願に組み込まれる)。軽
鎖及び重鎖の可変領域に類似した、分割したポリペプチドは、ポリペプチドリン
カーによってつなげることができる。そのような単一鎖抗体の製造方法、特にV_H 及びV_L鎖のポリペプチド構造をエンコードしたDNAが知られている場合の方法は
、既知であり、例えば米国特許第4946778号、5091513号及び5096815号明細書に
記載される方法にしたがって達成することができ、それらの内容全体は参照によ
りここに組み込まれる。

【００６２】 抗体は、分子と特異的に反応しその分子が抗体と結合する能力を有する場合、
その分子に「結合能を有する」といわれる。用語「エピトーフ」は、抗体による
結合能を有するいずれかの分子の部分であって、それもまたその抗体により認識
されうるものを示すものを意味する。エピトーフ又は「抗原決定基」は通常、ア
ミノ酸又は糖側鎖等の、分子の化学的に活性な表面の分子グループから構成され
、特異的３次元構造的特徴ならびに特異的荷電的特徴を有する。

【００６３】 ポリクローナル抗体は、抗原で免疫化された動物の血清から誘導された抗体分
子の不均質な集まりである。

【００６４】 モノクローナル抗体(mAbs)は、実質的に均質な、特定の抗原に対する抗体の集
まりである。mAbsは、当業者に知られる方法により得ることができる。例えば、
Kohler et al., (1975); 米国特許第4376110号明細書; Harlow et al., (1988);
及びColligan et al., (1993)を参照。これらの文献の内容全体は参照により本
願に組み込まれる。そのような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、及びこれらのサブ
クラスを含むいずれの免疫グロブリンクラスでもよい。本発明のmAbsを産生する
ハイブリドーマは、in vitro又はin vivoで培養することができる。高力価のmAb
sは、個体ハイブリドーマからの細胞をプリスタン感作Balb/cマウス腹腔内に注
入し、高濃度の所望mAbsを含む腹水液を産生するin vivo産生により得ることが
できる。イソタイプIgM又はIgGのmAbsは、そのような腹水液から、又は組織培養
物から、当業者によく知られるカラムクロマトグラフィーの方法を用いて精製す
ることができる。

【００６５】 キメラ抗体は、異なる動物種から誘導された異なる部分がある分子であり、例
えばネズミmAbから誘導された可変領域及びヒト免疫グロブリン定常領域を有す
る。キメラ抗体は一次的に、適用時の免疫原性を減少させ産生の収率を増加させ
るのに用いられる。例えば、ネズミmAbsはハイブリドーマからの高い収率を有す
るがヒトにおいて高い免疫原性を有するので、ヒト/ネズミキメラ即ちヒト化mAb
sが用いられる。キメラ及びヒト化抗体及びそれらの製造方法は、当該分野にお
いてよく知られている。例えば、Cabilly et al., 1984; Morrison et al., 198
4; Boulianne et al., 1984; Cabilly et al., 1984; Neuberger et al.,1985;
Taniguchi et al., 1985; Morrison et al., 1986; Neuberger et al., 1986; K
udo et al., 1986; Morrison et al., 1986; Sahagan et al., 1986; Robinson
et al., 1987; Liu et al., 1987; Sun et al., 1987; Better et al., 1988;
及びHarlow et al., 1988。これらの文献は参照によりここに組み込まれる。

【００６６】 「抗体の抗原結合部分を含む分子」は、いずれかのイソタイプの固有免疫グロ
ブリン分子でいずれかの動物細胞系又は微生物で産生されたものだけでなく、そ
れらの抗原結合反応性フラクションをも含むことを意図する。そのようなフラク
ションは、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')₂フラグメント、それら
の重鎖及び/又は軽鎖可変部分、及びそのような反応性フラクションを組み込ん
だキメラ又は単一鎖抗体、並びにそのような抗体反応性フラクションが物理的に
挿入されたいずれかの他のタイプの分子又は細胞、例えばキメラT細胞受容体又
はそのような受容体を有するT細胞、又はそのような反応性フラクションを含む
分子の一部の手段により治療的部分を送達するよう開発された分子を含むがこれ
らに限定されない。そのような分子は、酵素的切断、ペプチド合成又は組換え技
術を含むがこれらに限定されない、いずれの既知の技術によっても提供すること
ができる。

【００６７】 本発明はまた、本発明のペプチドに対して惹起した抗体の抗原結合部分を含む
分子、及び薬剤学的に許容しうる担体、希釈剤、賦形剤及び添加剤を含む薬剤組
成物を提供する。薬剤組成物の製剤であって、当該製剤が当該分野の高度な技術
を有する者により慣用的に用いられる製剤であり、当該組成物がその意図された
アミロイドフィブリル及び沈着物の形成を減少させる治療剤としての使用に適切
な組成物であるものは、当業者によりルーチンの実験のみにより開発することが
できる。

【００６８】 本発明によれば、本発明の免疫原性ペプチドに対して惹起された抗体の抗原結
合部分を含む分子を、それが必要な被験者に投与し、アミロイドフィブリル及び
沈着物の形成を減少させることができる。投与部位、用量、及び投与スケジュー
ルは、当業者により用いられる、よく確立された手順にしたがって決定される。

【００６９】 本発明を一般的に説明してきたが、本発明は、説明のために提供される、以下
の実施例を参照することにより容易に理解されるが、本発明はこれらにより限定
されることを意図するものではない。

【００７０】実施例１ この実施例における実験は、トランスジェニックAPPマウス(Tg2576)の、非ア
ミロイド原性、非毒性Aβ相同ペプチドでの7ヶ月間の免疫化が、皮質及び海馬の
脳アミロイド負担をそれぞれ89％(p=0.0002)及び81％(p=0.0001)に減少させたこ
とを示す。同時に、脳中可溶Aβ1-42レベルが、57％減少した(p=0.0019)。Aβプ
ラークと関連してインターロイキン-1βを発現する分枝した微小グリアは免疫化
されたマウスに存在しなかった。このことは、これらの動物において炎症が減少
されたことを示す。この実施例における実験に用いられた材料及び方法並びに実
験結果を以下に示す。

【００７１】材料及び方法 ペプチド 用いられたペプチド(Aβ1-40、Aβ1-42、Aβ1-30-NH₂(配列番号1)、及びK6Aβ
1-30-NH₂(配列番号6))は、Keck Foundation(Yale University, New Haven, CT)
で、従来記載された通りに(Sigurdsson et al., 2000)合成された。本発明の非
アミロイド原性ペプチドは、固相tBOC(N-tert-butyloxycarbonyl)を用いた化学
的方法により合成され、HPLCにより精製され、HPLC及びレーザー脱着質量分光に
より特徴付けられた。

【００７２】 免疫化に用いられたペプチドであるK6Aβ1-30-NH₂は、Aβペプチドの2つの主
要な免疫原サイトを維持する。それらは、Jameson et al. (1998)の抗原インデ
ックス及び本発明者らの研究室において予め得られた結果によればAβ1-42の1-1
1及び22-28残基である。Aβ1-30-NH₂及びK6Aβ1-30-NH₂ペプチドは、C末端でア
ミド化しそれらの免疫原性をさらに保存したものである。

【００７３】２次構造研究 ペプチドの２次構造(αヘリクス、βシート及びランダムコイル)を、従来記載
される(Soto et al., 1998及びSoto et al., 1996)通りの円二色法(CD)により評
価した。結果は、deg cm² dmol^-1の単位のモル楕円率で表現し、データはLincom
b及びCCAアルゴリズムにより分析し(Perczel et al., 1992)、異なるタイプの２
次構造の百分率を得た。

【００７４】 合成ペプチドの２次構造は円二色法(CD)により評価された一方、それはまたAu
couturier et al.(1999)から公表されたプロトコルを用いた、フーリエ変換赤外
分光法(FTIR)によっても評価しうる。CDはバックボーンコンホメーションについ
て感受性であり、FTIRは(構造に依存する)アミド基の水素結合の度及び強さにつ
いて感受性であるが、これらの２つの技術は究極的には同様の情報を与える：異
なる２次構造モチーフ即ちαヘリクス、βシート、βターン及びランダムコイル
の百分率である(Surewicz et al., 1993)。CDは溶液中のタンパク及びペプチド
の２次構造を研究するための非常によく確立された技術であり、異なる構造モチ
ーフの内容のかなり正確な見積りを与える。構造の特徴づけのためのFTIR分光法
の主要な利点は、試料の物理的状態についての依存性がないことである。試料は
水性又は有機性の溶液、水和フィルム、不均一分散物、凝集材料又は固体状態の
タンパクとしてでも試験することができる。したがって、CD及びFTIRはペプチド
の２次構造の研究において相補的である。

【００７５】 円二色法の実験的手順は、Golabek et al.,(1996)及びSoto et al.(1996及び1
998)にしたがって、以下の通りに実行される：合成ペプチドを含む溶液(10mMリ
ン酸ナトリウムpH7.2 300μl中1-5μM)のCD分光を、Jasco J-720分光偏光計中で
25℃において0.1cm光路長セルを用い二重蒸留脱イオン水及びTFE(分光測定級)を
溶媒として用い記録する。機器の較正は、d-(+)-10-カンフルスルホン酸の水溶
液で行なう。分光は、1nmインターバルで波長範囲180〜260nmで記録し、同一の
条件で得られた緩衝液の分光を差し引く。

【００７６】 Aucouturier et al.(1999)にしたがったフーリエ変換赤外分光法の実験手順は
以下の通りである：可溶又は凝集した合成ペプチドを含む溶液又は懸濁液(5-10m
g/ml)を、中性pHのH₂O及びD₂O緩衝液中で調製し、10μlをCaF₂プレート及び6μm
光路長スペーサーを有する赤外セルに載せる。分光を、Perkin Elmer model 200
0 FTIR分光測光計で25℃において、記載される通り(Aucouturier et al., 1999;
Soto et al., 1995)に記録する。それぞれのスペクトラムについて、シングル
ビームモードにおいて2cm^-1分離能で1cm^-1インターバルで4000から1000cm^-1まで
、1000スキャンを集める。平滑化とフーリエ自己デコンボリューションをアミド
I領域(1700-1600cm^-1)の分光分離能を増加させるために適用し、Lorentzian線形
への反復適合化を実行し、それぞれの２次構造要素の割合を見積る。

【００７７】in vitroアミロイドフィブリル形成の研究 in vitroのアミロイドフィブリル形成の研究を、本発明者らの研究室から公表
されたプロトコルを用い行なうことができる(Castano et al., 1995; Wisniewsk
i et al., 1991; Wisniewski et al., 1993及びWisniewski et al., 1994)。0.1
MトリスpH7.4中に調製された、25〜250μMの間の濃度範囲の合成ペプチドのアリ
コートを、異なる時間にわたりインキュベートし、それらのフィブリル形成をA
β1-28、Aβ1-40及びAβ1-42のそれと対比することができる。この実施例におい
ては、0.1MトリスpH7.4中で調製されたペプチドのアリコートは、異なる時間イ
ンキュベートされ、それらのフィブリル形成はAβ1-30-NH₂及びAβ1-42のそれと
対比した。in vitroフィブリル新生を、本発明者の研究室により従来記載される
通り(Soto et al., 1998及びJameson et al., 1998)、チオフラビンTによる蛍光
放出に基く蛍光測定アッセイで評価した。チオフラビンTはアミロイドに特異的
に結合し、その結合は形成されたアミロイド量に比例した、その放出スペクトラ
ムのシフト及び蛍光増強を促進する(Le Vine et al. 1993)。

【００７８】 この実施例では実行されなかったが、in vitroフィブリル新生は、３つの他の
異なる方法によっても評価することができる。

【００７９】 (A)コンゴレッドとアミロイドフィブリルとの特異的相互作用に基く分光測光
アッセイ。インキュベーション期間後、2μlのコンゴレッド(1.5mg/ml)を各試料
に添加し、暗所で1時間インキュベートした。続いて試料を15000rpmで10分間遠
心し、上澄みの吸光を490nmで測定した。形成されたアミロイド量は上澄み吸光
の減少に正比例する(Castano et al., 1986)。

【００８０】 (B)記載される通りの沈降アッセイが用いられる(Soto et al., 1995)。簡単に
述べると、試料を15000rpmで10分間遠心して可溶の又は凝集したペプチドを分離
する。溶液中の物質の量を逆相Vydac C4カラム及び直線濃度勾配3-70％アセトニ
トリルを用いた細孔(microbore)HPLCで分析する。凝集したペプチドの百分率は
、それぞれのインキュベートされた試料中の対応する可溶ペプチドのピーク面積
を、非インキュベート試料の同一の対照と比較することにより見積られる。

【００８１】 (C)フィブリル新生の追加の特徴付けはコンゴレッド染色及びその後の陰性染
色の電子顕微鏡観察により行なわれる(Castano et al., 1995; Wisniewsi et al
., 1991; Wisniewski et al., 1993及びWisniewski et al., 1994)。電子顕微鏡
観察のために、インキュベートされたペプチドの試料を、炭素formar被覆300メ
ッシュニッケルグリッド上に置き、2％グルタルアルデヒド蒸気下で、2％酢酸ウ
ラニルで60秒間染色する。グリッドを、Zeiss EM 10電子顕微鏡上で80kVで見る
。コンゴレッド染色のため、インキュベートしたペプチドをゼラチン被覆ガラス
顕微鏡スライド上に置き、37℃で風乾する。続いて切片をNaClを飽和させた80％
エタノール水溶液に溶解した0.2％コンゴレッドに60分間室温で浸漬し、水で３
回洗浄し、偏光光学顕微鏡で見る。

【００８２】神経毒性 K6Aβ1-30-NH₂(1-100μM)の神経毒性の程度を、ヒト神経芽腫細胞系(SK-N-SH)
において、製造者(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)により記
載される通りの標準MTTアッセイを用いて、2及び6日において評価した。Aβ1-30
-NH₂、Aβ1-40及びAβ1-42を、対照ペプチドとして用いた。簡単に述べると、細
胞を、平底96ウェルマイクロタイタープレート中の各ウェルあたり、10000細胞/
100μl培地で培養した。細胞をインキュベーター中で一晩でプレートに付着させ
(37℃、5.0%CO₂)、それから10μlの新たに調製したペプチド溶液(Nanopure H₂O
中)を添加した。Aβ1-42は100μMにおいて部分的にしか可溶でなく、したがって
、この濃度では懸濁液として添加した。続く工程はアッセイプロトコルに記載さ
れる通りとした。

【００８３】動物 ワクチン接種は、Karen Hsiao et al. (1996)により開発されたTg2576APPマウ
スモデルにおいて行なった。これらのマウスは、Aβプラークを、11-13月齢の早
い段階で発達させる。このモデルは、二重Tg APP/PS1モデル(Holcomb et al., 1
998)よりもよいものとして選択された。その理由は、単独Tg APPマウスにおいて
Aβ沈着が開始及び進行する齢が、よりADのそれと似ていたからである。齢を合
わせた、担体により処理されたTgマウス及びK6Aβ1-30-NH₂を受容した非Tgの同
腹子を対照として用い、動物は最初の注射を11-13月に受容し、その時点でいく
つかのプラークが既に存在していた筈である。各群マウスは４匹であった。動物
は12時間の明暗サイクルに維持され、食餌及び水の自由摂取のアクセスを有した
。動物の扱いは制度上のガイドラインに従った。

【００８４】ワクチン投与 ：K6Aβ1-30-NH₂は、トリフルオロ酢酸(TFA)塩として供給された。
免疫化手順は、注射前にペプチドを37℃で一晩インキュベートしなかったことを
除いて、Schenk et al. (1999)により従来記載される通りに行なった。簡単に述
べると、ペプチドをPBSに濃度2mg/mlで溶解し、続いてアジュバント又はPBSと1:
1(v/v)に混合した。完全Freundアジュバントを第1の注射に用い、不完全Freund
アジュバントを続く3回の注射に用いた。5回目以降はPBSを用いた。マウスは混
合物100μl(即ち100μg/100μl)の皮下注射を受容し、続いて第2の注射を2週間
後に受容し、それから後は月ごとに行なった。

【００８５】抗体力価 ：抗体力価は、血清の連続希釈物により、ELISAアッセイを用い、従来
記載される通り(Jimenez-Huete et al., 1998)に決定した。Aβ又はその誘導体
を、マイクロタイターウェル上に被覆する。最大シグナルの50%を得る希釈度と
して規定される力価を、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したヤギ抗マウスIg
G(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)により検出し、テトラメチル
ベンジジン(Pierce, Rockford, IL)を基質とした。

【００８６】組織学 ：マウスをペントバルビタールナトリウム(150mg/kg, i.p.)で麻酔し、大
動脈を通してリン酸塩緩衝液で灌流し、従来記載される通り(Sigurdsson et al.
, 1996)脳を処理した。右半球を過ヨウ素酸-リシン-パラホルムアルデヒド中で
浸漬固定し、一方左半球を急速冷凍し、確立されたELISA法(Mehta et al., 1998
及びMehta et al., 2000)を用いたAβレベル測定に供した。連続的な冠状切片(4
0μm)を切り、0.2mmインターバルの５つの連続切片を、1)6E10、2)コンゴレッド
、3)インターロイキン1β/OX42/トマトレシチン、4)GFAP、及び5)クレジルバイ
オレット染色切片による組織学的分析のため保存した。6E10はAβを認識し、プ
レアミロイド及びAβのプラークの両方を染色する(Kim et al., 1990)。コンゴ
レッド染色は、これらの動物におけるアミロイド病巣を識別するため行なわれる
。GFAPは、細胞骨格の一部を形成するグリア中間フィラメントの成分であり、星
状細胞に多く見出される。微小グリアはCNSにおけるインターロイキン-1(IL-1)
の主要な供給源と見られており(Schobitz et al., 1994)、OX-42はヒトC3bi受容
体のラット相当物である、微小グリア上のCD11bを認識する(Robinson et al., 1
986)。トマトレシチンは、ポリ-Nアセチルラクトサミン残基と結合し、神経組織
において微小グリア細胞特異的親和性を有する(Acarin et al., 1994)。星状細
胞及び微小グリアは、両方ともAβ沈着物と関連する。免疫化がこれらの動物中
で神経収縮及び/又は細胞損失をもたらしていたかどうかを決定するために、ク
レジルバイオレットでの染色を行なった。切片作成に続いて、連続した切片を凍
結防止剤エチレングリコール中に置いて、使用するまで-20℃で保存した。

【００８７】クレジルバイオレットとコンゴレッド： 載置された切片をキシレンで脱脂し、エ
チルアルコールと水の一連の勾配で水和させた。染色を、従来記載される通り(S
igurdsson et al., 1996及び1997ならびにSoto et al., 1998)行なった。

【００８８】6E10, GFAP、IL-1β及びOX-42： 染色を、従来記載される通りに(Sigurdsson et
al., 1996及びSoto et al., 1998)行なった。簡単に述べると、切片を、ヒトAβ
に選択的に結合する1次抗体6E10(Richard Kascsak, Institute for Basic Resea
rchより提供) 1:1000希釈で中でインキュベートした。マウス免疫検出キット(Ve
ctor Laboratories, Burlingame, CA)上のマウスを用い、抗マウスIgG2次抗体を
1:2000希釈で用いた。GFAP(1:500; Dako, Denmark)、IL-1β(1:250; Endogen, R
ockford, IL)及びOX-42(1:250; Biosource Int., Camarillo, CA)染色を、2次抗
体を1:1300に希釈したこと以外は6E10染色と同様に行なった。切片を3,3'-ジア
ミノベンジジン テトラヒドロクロリド(DAB)中で、ニッケル硫酸アンモニウム(N
i)増強の存在下又は非存在下で反応させた。IL-1βおよびAβプラークの二重ラ
ベリングのため、切片をまず、IL-1β(DAB/Ni;黒)で、ペルオキシダーゼを酵素
として染色した。プラーク(6E10)を続いて、Vector Red Alkaline Phosphatase
Substrate Kit I (Vector)を用いて染色した。

【００８９】トマトレシチン： 凍結防止剤から出した切片を、PBS、0.3%Triton-X-100含有PBS
(PBS-Tx)中で洗浄し、続いて0.3%過酸化水素含有PBS中で30分間インキュベート
し、内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチした。トマトレシチンでの2時間の
インキュベート(10μg/ml PBS; Vector)の後、切片をPBS-Tx中で洗浄し、続いて
アビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ(Vector)と1時間反応させた。続いての工
程は、抗体染色について用いられるものと同様であった。

【００９０】画像解析： 組織切片の免疫組織化学的性質をBioquant画像解析システムで定量し、不偏サン
プリングを用いた(West et al., 1999)。全ての手順は、研究の実験条件を知ら
ない個人により行なった。解析された皮質領域は右半球の、背内側の帯状皮質か
ら、腹側外側に延長された嗅脳溝にわたった。グリッドの面積は800×800μm²で
あり、アミロイド負荷は、マウスあたり、ランダムに選択された10フレーム(そ
れぞれ640×480μm²)において測定された。海馬の測定は、海馬全体において、
皮質の解析と同様の様式により行なった。Aβ負荷は、測定されたフィールド中
の反応生成物により占められた面積の百分率と定義される。

【００９１】可溶AβレベルについてのサンドイッチELISAアッセイ： 脳組織からのAβの抽出
に先立ち、10%(w/v)ホモジネートを、組織ホモジネーション緩衝液(20mMトリスp
H7.4、250mMショ糖、1mM EDTA、1mM EGTA)中に調製した。使用直前に、1/100容
量の100mMフェニルメチルスルホニル フルオリド ストック溶液(エタノール中)
及び1/1000容量のLAP(N-N-ジメチルホルムアミドml当りそれぞれ5mgのロイペプ
チン、アンチパイン及びペプスタチンAβ)をホモジナイズ化緩衝液に添加した。
ホモジネートを、続いて等容量の0.4%ジエチルアミン/100mM NaClに完全に混合
し、135000×gで1時間4℃で回転させ、続いて1/10容量の0.5MトリスpH6.8で中性
化した。続いて試料を分け、ドライアイスで急速冷凍し、プレートに載せるまで
-80℃で保存した。左半球において、可溶Aβレベルを、モノクローナル抗体6E10
(Aβの1-16アミノ酸残基上に存在するエピトーフに特異的)、ウサギ抗血清R162(
Aβ40に特異的)及びウサギ抗血清165(Aβ42に特異的)を用いて、従来記載される
通りの二重抗体サンドイッチELISA(Mehta et al., 1998及び2000)において測定
した。光学密度(OD)を450nmにおいて、microELISAリーダーで測定した。ODとAβ
40又はAβ42濃度との関係を、4パラメーターのロジスティックlog関数により決
定した。非線形曲線適合を、KlinetCalcプログラム(Biotek Instruments, Inc.
Winooski, VT)で行ない、血漿のODを濃度の見積に変換した。全ての試料をコー
ド化し、調査員は、レベルが測定され記録されるまで盲検的にグループ割り当て
された。アッセイの検出限界は、Aβ40及びAβ42について、10pg/mlである。変
分の%係数は、通常8〜14％(アッセイ間)及び10〜18％(アッセイ内)にわたる。

【００９２】データ解析 ：細胞培養データを、一元配置分散分析、及び続いてこの後の解析の
ためのDunnettの試験により解析した(GraphPad Prism 3.0)。不偏の立体解析画
像分析システム(Bioquant, R & M Biometrics Inc., Nashville, TN)を、6E10染
色脳切片中のアミロイド負荷を決定するために用いた。脳内のアミロイド負荷及
び可溶Aβのレベルについてのデータを、両側のStudentのt-検定で解析した。

【００９３】結果 ワクチン接種研究を開始する前に、プロトタイプペプチドであるKKKKKK-Aβ1-
30-NH₂が実際に、Aβ1-42より少ないβシート構造及び減少したフィブリル新生
能を有し、且つ神経培養物中で非毒性であることを確認することが必要であった
。これらのペプチドの2次構造は、円二色法(CD)により決定され、それらのアミ
ロイドフィブリル形成能はチオフラビンT蛍光測定アッセイによって決定した。
追加の対照ペプチドはAβ1-30-NH₂であった。

【００９４】CDアッセイ： 高いβシート含有割合を有する化合物は、βシート含有割合が低い
化合物に比べて、より毒性が高くよりフィブリルを形成しやすい(Pike et al.,
1991)。N末端にポリリシンを有するペプチドは、アミド化されたAβ1-30又はAβ
1-42よりずっと少ないβシート含有割合を有していた(表１)。

【００９５】 (K)₆-Aβ1-30-NH₂ペプチドはまた、37℃で少なくとも15日間のインキュベーシ
ョンの後にも、フィブリルを形成しない。このデータは、N末端へのポリリシン
の追加が、βシート含有割合をAβ1-42又はAβ1-30よりずっと低くするようペプ
チドを変化させることを明らかに示す。さらに、(K)₆-Aβ1-30-NH₂ペプチドのβ
シート含有割合は、時間経過で増加しない。Aβ1-42のβシート含有割合は96時
間後に55％に増加した一方、(K)₆-Aβ1-30-NH₂のそれは16-18%にとどまった。

【００９６】

【表１】

【００９７】チオフラビンTアッセイ： Aβ1-42は、t=0の時点で既にフィブリル状であった一
方、Aβ1-30-NH₂は時間経過につれて段々とフィブリルを形成した(図1)。6日後
の、Aβ1-42に比べて比較的高度なAβ1-30-NH₂のチオフラビンT染色は、既知の
、Aβペプチドフィブリル形成の、バッチからバッチへの変異性(Soto et al., 1
995)及び延長されたインキュベーションをしたAβ1-42によるいくらかのペレッ
ト形成を反映している。K6Aβ1-30-NH₂は、37℃で少なくとも15日間のインキュ
ベーションの後でもフィブリルを形成しなかった。

【００９８】神経毒性： このワクチン接種アプローチの安全性をさらに評価するため、K6Aβ1
-30-NH₂の神経毒性を測定した。MTTアッセイにより測定したところ、担体群と比
べて、K6Aβ1-30-NH₂は細胞生存能に、2日間何の作用も有さず、6日目において
僅かに栄養的であった(p<0.05)一方、Aβ1-40及びAβ1-42はヒト神経芽腫細胞(S
K-N-SH)に対し毒性であった(p<0.05-0.001)(図2A及びB)。インキュベーション期
間の間、Aβ1-42を含む(10-100μM)培養ウェルにおいてのみ、凝集物が顕微鏡下
で見えた。

【００９９】抗体力価 ：Tg2576及びそれらの非Tg同腹子を、K6Aβ1-30-NH₂又は担体でワクチ
ン接種した。ほとんど全てのマウスは、免疫原(K6Aβ1-30-NH₂)に対する抗体を
産生し、それはAβ1-40及びAβ1-42と交差反応した。最大シグナルの50％を与え
る希釈度として定義される力価は、数百から数千にわたった(データ示さず)。ア
ジュバント及びPBSを注射された担体処理動物は、これらの3ペプチドに対する抗
体を産生しなかった(データ示さず)。非トランスジェニックマウスは概して、全
3ペプチドに対して、より高い力価を有しており、ポリクローナル抗体が、Aβ1-
40及びAβ1-42に比べてより高い、免疫原に対する結合能を有していた。これら
の知見は、予想されたものである。何故ならば、免疫原はマウスAβとは3アミノ
酸が異なるヒトAβ配列に基き(Johnstone et al., 1991)、免疫応答を引き出すK
6Aβ1-30-NH₂は、固有Aβペプチドより多く抗体に対する結合モチーフを有する
筈だからである。

【０１００】アミロイド負荷及び関連する組織病理： マウスを、7月の処置後18-20月齢で屠殺
し、それらの右半球を記載される通り(Sigurdsson et al., 1996)に組織学的に
処理した。脳切片をクレジルバイオレット、コンゴレッド、トマトレシチン並び
に1)ヒトAβ(6E10); 微小グリア(OX-42; IL-1β); 及びGFAP(抗GFAP)に対する抗
体で染色した。Tgマウスにおいて、K6Aβ1-30-NH₂ワクチン接種に続いて、皮質
及び海馬のアミロイド負荷は、それぞれ89％及び81％減少した(図3A、3B; 4A、4
B)と、立体的技術により決定された。コンゴレッド陽性アミロイド沈着物の総数
は免疫化された動物において減少したが、コンゴレッド陽性のAβ免疫反応性病
巣のパーセンテージは、非免疫化Tgマウスのそれと同一にとどまったように観察
された。アミロイド沈着物のクリアランスは他の脳領域と同様であると観察され
た。高いアミロイド負荷を有する対照マウス及び減少したアミロイド負荷を有す
る免疫化マウスからの、選択された脳切片を、いくつかの免疫化及び対照マウス
からの血清で染色したところ、抗体力価は0から3000にわたった。期待された通
り、力価が増加するとより多くのプラークが染色されパターンは両方のマウスで
同様であった(データ示さず)。クレジルバイオレット染色において、Tg処置群の
間で明らかな違いはなかった。全てのアミロイドプラークに関連する反応性星状
細胞が観察された。担体処置Tgマウスがより高いプラーク負荷を有していたので
、それらは免疫化Tgマウスより多くの星状細胞のクラスターを有していた。微小
グリアのOX-42染色では食細胞性(アメーバ様)のものより分枝したものが優勢に
、プラークと関連して観察された。この微小グリア食細胞の欠如がOX-42の結合
モチーフであるCD11b受容体(Robinson et al., 1986)のダウンレギュレーション
によるものではないことを確かめるため、全ての治療群からの切片がトマトレシ
チンで染色された。この特定のレシチンは、内皮及び上衣細胞に加え、分枝及び
食細胞状の微小グリア細胞において優勢に見出されるポリ-N-アセチルラクトサ
ミン残基と結合する(Acarin et al., 1994)。これら前2者の細胞タイプは、全て
のマウスにおいて染色される。微小グリアレクチン染色は、OX-42染色と似てい
た。換言すると、免疫化及び対照Tg群の両方において、微小グリアは食細胞的な
形態を有せず、またプラーク当りの分枝微小グリアの変化の数は免疫化及び非免
疫化マウスにおいて同様であるように観察された(データ示さず)。一方、分枝微
小グリア細胞のIL-1β染色は、対照TgマウスにおいてAβプラークを囲んで顕著
であった(図3C)一方、免疫化されたマウスにおいてはIL-1β染色は実質的に全く
観察されなかった(図3D)。顕著なことに、K6Aβ1-30-NH₂処置マウスからのヘモ
トキシリン/エオシン染色腎切片において糸球体腎炎の徴候は何もなかった。こ
のことは、これらのマウスが自己免疫疾患を進行させていなかったことを示唆す
る。

【０１０１】ELISAによる可溶性Aβ： 可溶性Aβレベルの測定は、右半球を組織学的試験に用
いたマウスの左半球において行なった。可溶性Aβ1-42は、K6Aβ1-30-NH₂での7
ヶ月のワクチン接種後、対照群に比べて57％減少した(p=0.0019)(図4C)。K6Aβ1
-30治療群における可溶性総Aβ及びAβ1-40のレベル減少の傾向があったが、そ
の値は担体群に比べて有意には違わなかった。

【０１０２】 全体的に、非アミロイド原性/非毒性(低βシート含量)Aβ相同性ペプチドでの
、Tg APPマウスにおける免疫化は、Schenk et al.(1999)により観察された(そこ
で彼らはフィブリル性/毒性(高βシート含量)のAβ1-42を用いていた)のと同様
のアミロイド負荷の減少という結果となった。

【０１０３】考察 これらの知見は、Aβ凝集体/フィブリルが、Aβプラークのクリアランスをも
たらす免疫応答を十分に引き出すのには必要でないことを示す。K6Aβ1-30-NH₂
等の非フィブリル/非毒性Aβ相同ペプチドの使用は、ヒトにとって、より安全な
ワクチン接種アプローチである。

【０１０４】 脳アミロイド負荷の減少がワクチン接種により誘導される機構は、十分には理
解されていない。しかしながら、Bard et al.(2000)による受動的ワクチン接種
研究に基けば、抗体が中枢的な役割を有すると見られる。興味深いことにより、
それらは、抗体の効力と可溶Aβへの親和性又は凝集した合成Aβペプチドへの結
合との間に相関がないことを示していた。しかしながら有効な抗体は、固定して
いない脳切片において、プラークに結合することができた。Schenk et al.(1999
)と同じプロトコルを用いたJanus et al.(2000)は、Aβ免疫化マウスからの血清
が、拡散したAβ沈着物ではなく密な核プラークを優勢に染色することを観察し
た。このことは、抗体が、βシートAβについてより高い親和性を有しうること
を示唆する。これらの幾分矛盾する知見に基き、抗体媒介Aβクリアランスの機
構への洞察を与えうる、Aβ抗体相互作用についてのより多くの研究が必要であ
る。これらの抗体がAβの産生に影響することはありそうもない。なぜならば、
これらはAPPを認識しないからである(Weiner et al., 2000)。抗体は、抗体のA
βプラークへの結合に続く微小グリア活性化を通じてAβのクリアランスを増強
している可能性の方が高い(Schenk et al., 1999及びBard et al., 2000)。これ
らの効果はまた、部分的には、沈着Aβ対可溶Aβの平衡を変化させる、脳内での
可溶Aβへの結合によるものかもしれない。Aβが二方向的に血液脳関門をわたり
うるを示す数多くの報告があることからして(Zlokovic et al., 1993; Maness e
t al., 1994; Martel et al., 1996; Poduslo et al., 1997及び1999、Mackic e
t al., 1998; Shibata et al., 2000及びJi et al., 2001)、ワクチン接種の効
果は、部分的に、周辺流体中における、抗体の可溶Aβへの結合を通じて媒介さ
れているかもしれない。続いての周辺Aβレベルの減少は、CNSの中及び外で見出
されるAβ間の平衡を変化させうる。これはAβのCNS外への流出をもたらしうる
。最近の報告はTg2576マウスにおいて、血漿Aβレベルは脳プラーク負荷が増加
するにつれて減少することを示している(Kawarabayashi et al., 2001)。このこ
とは、これら２つのコンパートメント間の相互作用を示唆しており、これは操作
ができるものである。

【０１０５】 興味深いことに、Morgan et al.(2000)による挙動的ワクチン接種研究におい
て、彼らはAPP/PS1マウスにおいて、免疫組織化学的に測定された脳アミロイド
負荷が有意に減少していなかったのに、部分的な認識欠陥が反転したことを観察
している。Morgan et al.(2000)により指摘される通り、可溶AβはAPP Tgマウス
においてシナプス損失を起こすことが提案されている。これは、いくつかのTg系
が、歯状回においてAβ沈着を伴なわないシナプトフィシン染色の減少を有する
ことによる(Mucke et al., 2000)。したがって、プラーク負荷減少のない免疫化
マウスの認識改善についてなしうる説明は、可溶性Aβの減少であったが、この
ある可能性のある関係は彼らの研究において測定されなかった(Morgan et al.,
2000)。本発明者らの研究室で得られた結果は、7ヶ月の処置のあと、アミロイド
プラークの81-89%の減少は脳内の可溶Aβ1-42の57%の減少と関連する一方、可溶
総Aβ及びAβ1-40は、対照群とは有意には異ならなかったことを示す。換言すれ
ば、可溶AβはプラークAβより少なく減少する。しかしながら、可溶及びプラー
クAβ間の平衡におけるさらなる変化を決定するためには、詳細な時間を追った
研究が行なわれなければならない。これらの知見は間接的にはプラーク維持につ
いてのAβ1-42の重要性を示す。全体的に、動物モデル及び免疫化に用いられた
ペプチドの特性に応じて、いくつかの異なる機構が脳アミロイド負荷の減少とい
う結果となるように思われる。

【０１０６】 アミロイド沈着が脳内炎症カスケードを活性化させること、例えば脳損傷及び
死と関連するIL-1産生を増加させることを、数多くの研究が示唆している(Sigur
dsson et al., 1996及びAkiyama et al., 2000)。我々のAβ相同ペプチドでの免
疫化はまた、アミロイド減少と共に、そのようなネガティブな炎症経路を刺激す
る可能性がある。しかしながら、OX-42免疫反応又はトマトレシチン結合により
識別された通り、我々の免疫化動物において観察された食細胞微小グリアは、わ
ずかだった。これは驚くべきことではない。なぜならば7ヶ月の処置後、多くの
プラークは消滅したからである。さらに、免疫化群マウスにおいて、微小グリア
IL-1β染色は実質的にはなく、一方多くの分枝IL-1β陽性微小グリアが対照Tg群
においてプラークと関連した。本発明者らの研究室はこれまで、βシート破壊ペ
プチドによる処置後の脳アミロイドーシスラットモデルにおいて、IL-1β染色の
同様の欠如を報告している(Sigurdssone et al., 2000)。しかしながら、この急
性の研究(16日間)において、この効力は食細胞OX-42染色の広範な増加と関連し
ていた。このことは食細胞はIL-1βを発現しないことを示す。本実施例における
実験からの現在の観察は、免疫化の重要な効果が脳内の炎症を減少させることを
示唆しうる。

【０１０７】実施例２ 材料及び方法 ペプチド 用いられたペプチド(Aβ1-40、Aβ1-42、Aβ1-30-NH₂、K6Aβ1-30-NH₂、Aβ1-
30-K6(配列番号11)、Aβ1-30-NH₂(EE_18,19)(配列番号12)、Aβ1-30-NH₂(DD_18,19 )(配列番号13))は、Keck Foundation(Yale University, New Haven, CY)で、従
来記載された通りに(Sigurdsson et al., 2000)合成された。Aβ相同ペプチドは
、Aβペプチドの2つの主要な免疫原サイト(Aβ1-42の残基1-11及び22-28、James
on et al.(1998)による抗原インデックス及び本発明者らの研究室で予め得られ
た結果に基く)を維持しており、一方非フィブリル性で非毒性である。

【０１０８】 in vitroにおけるアミロイドフィブリル形成及び神経毒性の研究 この実験は実施例1に記載される通りに行なった。

【０１０９】 データ解析データ解析 ：細胞培養データは一元配置分散分析により解析し、続いてこの後の
解析のためのNewman Keuls'試験を行なった(GraphPad Prism 3.0)。

【０１１０】結果 チオフラビンTアッセイ： Aβ1-42はt=0の時点で既にフィブリル状であった一方
、Aβ1-30-NH₂及びAβ1-40は時間経過につれて段々とフィブリルを形成した(図5
)。Aβ1-30K6は僅かにフィブリル原性であったが、Aβ1-30-NH₂(EE_18,19)及びA
β1-30-NH₂(DD_18,19)は37℃で少なくとも15日間のインキュベーションの後でも
フィブリルを形成しなかった。

【０１１１】神経毒性： このワクチン接種アプローチの安全性をさらに評価するため、ペプチ
ドの神経毒性を測定した(図6A及び6B)。治療効果は2及び6日の両方において観察
された(p<0.0001)。MTTアッセイにより測定したところ、対照ペプチドAβ1-40及
びAβ1-42は、担体群と比べると、ヒト神経芽腫細胞(SK-N-SH)に対して毒性であ
った(p<0.01-0.001)。K6Aβ-30-NH₂は、2日目における細胞生存能について何の
効果も示さず、6日目において僅かに栄養的であった(p<0.001)。高用量(100μM)
のAβ1-30K6は2日間処理後には僅かに毒性であったが6日後にはそうではなかっ
た。インキュベーション期間の間、Aβ1-42を含む(10-100μM)培養ウェルにおい
てのみ、凝集物が顕微鏡下で見えた。本発明によるこれらのAβ相同ペプチドは
ヒト神経培養物中においてフィブリルを形成せず非毒性である。全体的に、この
アプローチはAβ1-40/42の使用に比べて、ヒトにおいて毒性作用をもたらす危険
がずっと少ない。

【０１１２】 本発明を十分に説明してきたが、本発明は、発明の精神及び範囲から逸脱する
ことなく、過度の実験を伴なわずに、幅広い範囲の均等なパラメーター、濃度、
及び条件内において行いうることが当業者により認識される。

【０１１３】 本発明をその特定の実施態様と関連して記載してきたが、更なる修正をしうる
ことが理解される。この適用は、一般的に本発明の原理にしたがって、本発明の
いずれの変更、使用又は適合をもカバーすることが意図され、本発明が関係する
技術において知られたまたは慣習的に行なわれるものに入るものとしての、及び
前述の本質的な特徴に適用されうるものとしての、下記に添付された請求項の範
囲における本発明からの逸脱を含む。

【０１１４】 雑誌の記事又は要約、発行された又は対応する米国又は外国の特許出願、発行
された米国又は外国の特許、又は他のいずれの文献をも含むここで引用された全
ての文献は、参照文献に提示された全てのデータ、表、図及び文書を含むその全
体が参照によりここに組み込まれる。さらに、ここに引用された文献内に引用さ
れた文献の全体の内容もまた、その全体が参照により組み込まれる。

【０１１５】 既知の方法の工程、慣用の方法の工程を参照して、既知の方法又は慣用の方法
は、本発明のいずれかの観点、記載又は実施態様が関連技術において開示、教示
又は示唆されたことを、いかなる意味においても容認するものでない。

【０１１６】 前記の特定の実施態様の記載は、本発明の一般的な性質を十分に開示している
ので、当業者の能力の範囲内の知識(ここに参照される文献の内容を含む)を適用
することにより、他者は、過度の実験なしに、本発明の一般的な概念から逸脱す
ることなしに、そのような特定の実施態様を様々な応用のため容易に修正及び/
又は適合できる。したがって、そのような適合及び修正は、ここで提示される教
示及びガイダンスに基き、開示された実施態様の均等物の意味及び範囲内である
ことが意図される。ここでの表現又は用語は、記述のためのものであり限定のた
めのものではないことが理解され、したがって、本明細書の用語及び表現は、当
業者により、ここに提示される教示及びガイダンスに照らし、当該分野の通常の
能力を有する者の知識と組み合わせて解釈される。

【０１１７】文献

【化１】

【０１１８】

【化２】

【０１１９】

【化３】

【０１２０】

【化４】

【０１２１】

【化５】

【０１２２】配列表

【化６】

【０１２３】

【化７】

【０１２４】

【化８】

【０１２５】

【化９】

【０１２６】

【化１０】

【０１２７】

【化１１】

【０１２８】

【化１２】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、チオフラビンT蛍光測定アッセイの結果を示す。Aβ1-42、Aβ1-30-NH₂ 、及びK6Aβ1-30-NH₂(配列番号6)のフィブリル形成が、37℃でのインキュベー
ションに続いてin vitroで測定された。K6Aβ1-30-NH₂は、いずれの時点におい
てもフィブリルを形成しない唯一のペプチドであった。

【図２】 図2A及び2Bは、MTTアッセイによる測定で、Aβ40及びAβ42が培養物内のヒト
神経芽腫細胞(SK-N-SH)に対し毒性であり、一方K6Aβ30-NH₂は2日目において何
の効果も示さず(図2A)、6日目には僅かに栄養的であった(図2B)ことを示す。VEH
群に対し*p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001(一元配置分散分析)。

【図３】 図3A〜3Dは、Tg対照(図3A)、及びK6Aβ1-30処理(図3B)Tgマウスにおいての海
馬及び皮質にわたる、Aβに対し6E10で染色した冠状切断切片(x50;もとの倍率)
を示す。図3C及び3Dは、小グリア及びAβを認識する、インターロイキン-1につ
いての二重染色がされた、隣接する切片(x100)である。対照マウス(図3A、3C)と
比べて、免疫化されたマウスにおけるアミロイド負担の減少(図3B)、及び同じマ
ウスにおいてのAβプラークを囲む分枝した小グリアの欠損(図3D)に注意。図3A
及び3Cにおける線は100μmである。略語：hip=海馬;cx=皮質;、cc=脳梁。

【図４】 図4A〜4Cは、K6Aβ1-30-NH₂での7ヶ月の処置の後の皮質(図4A)及び海馬(図4B)
のアミロイド負担(6E10)の減少を示す。皮質アミロイド負担の89%の減少 (*p=0.
0002; t-test; 群あたりn=4)及び海馬アミロイド負担の81%の減少(*p=0.0001)が
あった。可溶性Aβ1-42レベル（図4C）は、ワクチン接種したマウス脳内で57%減
少した(*p=0.0019)。

【図５】 図5は、チオフラビンT蛍光測定アッセイの結果を示す。Aβ1-42、Aβ1-40、A
β1-30-NH₂、Aβ1-30K6、Aβ1-30-NH₂(EE_18,19)及びAβ1-30-NH₂(DD_18,19)のフ
ィブリル形成が、37℃でのインキュベーションの後in vitroで測定された。

【図６】 図6A及び6Bは、MTT細胞毒性アッセイの結果を示す。Aβ1-42、Aβ1-40、Aβ1-
30-NH₂、K6Aβ1-30-NH₂、Aβ1-30K6、Aβ1-30-NH₂(EE_18,19)及びAβ1-30-NH₂(DD_18,19 )の神経毒性を、ヒト神経芽腫細胞(SK-N-SH)の2日(図6A)及び6日(図6B)の
処置の後決定した。VEH群と対比して*p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001(一元配置
分散分析)。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ Ａ６１Ｐ 25/28 Ａ６１Ｐ 25/28 37/04 37/04 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｋ 16/18 19/00 19/00 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ウィスニュースキー，トーマス アメリカ合衆国ノース・キャロライナ州 10304，スタテン・アイランド，ワード・ アヴェニュー・86 (72)発明者 シガードソン，アイナー・エム アメリカ合衆国ニュー・ヨーク州10002， ニュー・ヨーク，サフォーク・ストリー ト・120，アパートメント・２ビー Ｆターム(参考） 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA01 4C085 AA03 AA13 AA14 BB11 BB41 BB43 BB44 CC02 CC07 CC08 CC21 CC31 CC32 DD23 DD62 DD63 EE01 FF02 FF12 FF13 FF14 FF19 4H045 AA10 AA11 AA30 BA19 BA40 BA41 BA53 CA45 DA75 DA76 DA86 EA21 EA31 FA34 FA72

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式： (A)m-(N-Xaa₁Xaa₂Xaa₃Xaa₄Xaa₅-C)n-(B)p （式中：mは0、4、5、6、7、8、9、又は10; pは0、4、5、6、7、8、9、10; AはLys又はAsp; BはLys又はAsp; nは1又は2; Nは配列番号1の残基1-16; Cは配列番号1の残基22-30; Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃、Xaa₄、及びXaa₅はそれぞれLeu、Val、Phe、Phe、及
   びAlaであり、0、1又は2の残基Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃、Xaa₄、及びXaa₅はLys、Asp、
   又はGluで置換され; 置換される残基が0の場合、m又はpのいずれか又は両方が0ではない）に
   より表わされる、単離されたペプチド(配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列
   番号5、配列番号7、配列番号8、配列番号9、及び配列番号10)。
2. 【請求項２】 mが0でない場合、pが0であり; pが0でない場合、mが0であり;且つ Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃、Xaa₄、及びXaa₅はそれぞれLeu、Val、Phe、Phe、及びAla
   であり、1又は2の残基Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃、Xaa₄、及びXaa₅はLys、Asp、又はGlu
   で置換される 請求項１記載のペプチド(配列番号2〜5)。
3. 【請求項３】 pが0である、請求項２記載のペプチド。
4. 【請求項４】 前記ペプチドのC末端がアミド化されている請求項３記載の
   ペプチド。
5. 【請求項５】 AがLysである、請求項３記載のペプチド。
6. 【請求項６】 AがAspである、請求項３記載のペプチド。
7. 【請求項７】 前記ペプチドのアミノ酸配列が配列番号２である請求項３記
   載のペプチド。
8. 【請求項８】 前記ペプチドのアミノ酸配列が配列番号３である請求項３記
   載のペプチド。
9. 【請求項９】 mが0である、請求項２記載のペプチド。
10. 【請求項１０】 BがLysである、請求項９記載のペプチド。
11. 【請求項１１】 BがAspである、請求項９記載のペプチド。
12. 【請求項１２】 前記ペプチドのアミノ酸配列が配列番号４である請求項９
    記載のペプチド。
13. 【請求項１３】 前記ペプチドのアミノ酸配列が配列番号５である請求項９
    記載のペプチド。
14. 【請求項１４】 mが0でなくpが0でない請求項１記載のペプチド。
15. 【請求項１５】 前記ペプチドのアミノ酸配列が配列番号７であり、C末端
    残基がアミド化されていてもよい請求項１記載のペプチド。
16. 【請求項１６】 前記ペプチドのアミノ酸配列が配列番号６であり、C末端
    残基がアミド化されていてもよい請求項１記載のペプチド。
17. 【請求項１７】 前記ペプチドのアミノ酸配列が配列番号８である請求項１
    記載のペプチド。
18. 【請求項１８】 前記ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号９及び配列番号
    １０からなる群より選択される請求項１記載のペプチド。
19. 【請求項１９】 前記ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１１、配列番号
    １２、及び配列番号１３からなる群より選択される請求項１記載のペプチド。
20. 【請求項２０】 ポリマー分子と架橋した請求項１又は２のペプチドのコン
    ジュゲート。
21. 【請求項２１】 前記ポリマー分子が、乱雑Tヘルパー細胞エピトーフを含
    むペプチドである請求項２０記載のコンジュゲート。
22. 【請求項２２】 前記ペプチドが破傷風毒、百日咳毒、ジフテリア毒、麻疹
    ウイルス、B型肝炎ウィルス表面抗原、Chlamydia trachomititis主要外膜タンパ
    ク、Plasmodium falciparumスポロゾイト周囲物、Schistosoma mansoniトリオー
    スホスフェートイソメラーゼ、又はEscherichia coli TraTの乱雑Tヘルパー細胞
    エピトーフを含むペプチドである請求項２１記載のコンジュゲート。
23. 【請求項２３】 前記ポリマーがマンナン、グルカン、トリパルミトイル-5
    -グリセリン システイン、ポリ(ラクチド-co-グリコリド)からなる群より選択さ
    れる請求項２０記載のコンジュゲート。
24. 【請求項２４】 免疫化有効量の請求項１又は２記載の単離されたペプチド
    又はそのコンジュゲートと、薬剤学的に許容しうる担体、賦形剤、希釈剤又は添
    加剤を含む免疫化組成物。
25. 【請求項２５】 前記薬剤学的に許容しうる添加剤がアジュバントである、
    請求項２４記載の免疫化組成物。
26. 【請求項２６】 前記アジュバントがアルムである請求項２５記載の免疫化
    組成物。
27. 【請求項２７】 アミロイドβペプチド及びアミロイド沈着物に対する免疫
    応答を誘導する方法であって、その必要のある被験者に、請求項２４記載の免疫
    化組成物を投与することを含む方法。
28. 【請求項２８】 前記被験者がヒトである請求項２７記載の方法。
29. 【請求項２９】 請求項１又は２記載のペプチドに対して惹起された抗体の
    抗原結合部分を含む分子。
30. 【請求項３０】 前記分子がモノクローナル抗体である請求項２９記載の分
    子。
31. 【請求項３１】 前記分子がキメラ化又はヒト化された抗体である請求項２
    ９記載の分子。
32. 【請求項３２】 請求項２９記載の分子及び薬剤学的に許容しうる担体、希
    釈剤、賦形剤又は添加剤を含む薬剤組成物。
33. 【請求項３３】 アミロイドフィブリル及び沈着物の形成を減少させる方法
    であって、請求項２９記載の分子をその必要がある被験者に投与することを含む
    方法。