DE69925355T2

DE69925355T2 - Hydrophobierte und sehr reine polysaccharide und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE69925355T2
Application number: DE69925355T
Authority: DE
Inventors: Junzo Kusatsu-shi SUNAMOTO; Kazunari Uji-shi AKIYOSHI; Ryuzo Tsukuba-shi HOSOTANI; Akio Kashiwa-shi HAYASHI; Hiroki Tsukuba-shi FUKUI
Original assignee: NOF Corp
Current assignee: NOF Corp
Priority date: 1998-08-31
Filing date: 1999-03-31
Publication date: 2006-01-12
Anticipated expiration: 2019-04-01
Also published as: KR100541752B1; JP3416951B2; US20020143160A1; EP1026174A1; US6566516B1; EP1026174B1; KR20010031457A; EP1026174A4; DE69925355D1; AU3054599A; WO2000012564A1; AU755283B2

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharids in hoher Reinheit.
STAND DER TECHNIK
Zu wasserlöslichen polymeren Stoffen gehören natürlich vorkommende polymere Stoffe, halbsynthetische polymere Produkte und synthetische Polymere. Natürliche polymere Stoffe sind beispielsweise Kohlenhydrate, wie Stärken und Produkte aus Meerespflanzen, Mukosubstanzen, wie Gummi arabicum und dergleichen, und Proteine, wie Leim usw. Als halbsynthetische polymere Produkte sind beispielsweise polymere celluloseähnliche Stoffe, wie Viskose usw., zu nennen. Beispiele für synthetische Polymere sind Polyvinylalkohol, Polyvinylpyridin und Polyglycerin. Einige der polymeren Derivate mit hydrophoben Gruppen, die sich von diesen wasserlöslichen polymeren Stoffen ableiten, haben inzwischen Anwendung als Materialien in der Medizin gefunden, beispielsweise als Überzugsmaterial zum Überziehen von Arzneimittelträgern, die Arzneimittel enthalten. Beispielsweise war bekannt, dass durch Überziehen von Arzneimittelträgern, beispielsweise Liposomen-Mikrokapseln, Mikrokügelchen, O/W-Emulsionen oder Erythrozytenschatten, mit einem hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharid nicht nur das spontane Austreten des Arzneimittels aus dem Arzneimittelträger supprimiert wird, sondern dass mit einem solchen Arzneimittelträger auch die zellspezifische Übertragungsrate des Arzneimittels verbessert wird.
Insbesondere wurden bereits solche Verbindungen, bei denen die wasserlöslichen polymeren Stoffe Polysaccharide sind und die hydrophoben Gruppen Sterylgruppen sind, nämlich Polysaccharid-Sterin-Derivate, als polysaccharidisches Überzugsmaterial für Liposomen (Japanische Kokai Sho 61-69801 A), als Überzugsmaterial für Fettemulsionen (Japanische Kokai Sho 63-319046 A) und als polymeres Tensid zur Verwendung bei der Herstellung einer mit Polysaccharid überzogene Emulsion (Japanische Kokai Hei 2-144140 JA) offenbart, und ein Verfahren zu deren Synthese wurde in der japanischen Kokai Sho 61-69801 A offenbart.
In den letzten Jahren wurde allgemein anerkannt, dass Liposomen und O/W-Emulsionen aussichtsreiche Arzneimittelträger sind. Es wurde beschrieben, dass die chemische und physikalische Stabilität eines derartigen Arzneimittelträgers im lebenden Körper verbessert werden, indem man den Arzneimittelträger mit Polysaccharid beschichtet, wobei sich gleichzeitig auch ein Target-Tropismus für eine spezifische Zellgruppe zeigt {Bull. Chem. Soc. Japan, 62, 791-796 (1989)}.
Zur Synthese des hierfür zu verwendenden Polysaccharid-Cholesterin-Derivats wurde bislang ein Verfahren verwendet, wie es in der Japanischen Kokai Sho 61-69801 A beschrieben ist, das die folgenden drei Verfahrensschritte umfasst, nämlich:
Umsetzung eines Polysaccharids mit Monochloressigsäure zu einem carboxymethylierten Polysaccharid (erster Verfahrensschritt),
Umsetzung des carboxymethylierten Polysaccharids mit Ethylendiamin zu N-(2-Aminoethyl)carbamoylmethyliertem Polysaccharid (zweiter Verfahrensschritt) und
anschließende Umsetzung des N-(2-Aminoethyl)carbamoylmethylierten Polysaccharids mit Cholesterylchloroformiat zu N-{2-(Cholesteryloxycarbonylaminoethyl}carbamoylmethyliertem Polysaccharid (dritter Verfahrensschritt).
Dieses in der Japanischen Kokai Sho 61-69801 offenbarte Verfahren hat jedoch den Nachteil, dass die Carboxylgruppe des Reaktanten im zweiten Verfahrensschritt leicht bis zum Ende des Verfahrens nicht umgesetzt wird, so dass der Einfluss der negativen Ladung einer solchen restlichen Carboxylgruppe auf die physikochemische Stabilität, die Zellspezifität, die Adaptierbarkeit usw. des Liposoms oder der Emulsion, die mit dem Polysaccharid überzogen werden, nicht vermieden werden kann. Ein weiteres Problem besteht darin, dass dieses Verfahren viele Verfahrensschritte erfordert.
Um diese Probleme zu lösen, wird in der Japanischen Kokai Hei 3-292301 A ein alternatives Syntheseverfahren vorgeschlagen, das im ersten Schritt die Umsetzung eines Diisocyanats mit einem Sterin zu einer Monoisocyanatverbindung umfasst, die in α-Stellung zum einen Ende des Alkans eine Sterylgruppe und in ω-Stellung zum anderen Ende eine Isocyanatgruppe aufweist, und im zweiten Schritt die Umsetzung der Monoisocyanatverbindung mit dem Polysaccharid, um auf diese Weise ein einfaches Einführen der Sterylgruppen in das Polysaccharid zu ermöglichen.
Dieses Verfahren hat jedoch insofern Nachteile, als (1) das Nebenprodukt, das im ersten Schritt durch die Umsetzung von einem Mol der Diisocyanatverbindung mit zwei Mol des Sterins gebildet wird (im Folgenden auch als Sterin-Dimer bezeichnet), durch Reinigungsverfahren wie Dialyse oder Umfällen mit Ethanol nicht vollständig entfernt werden kann, und das Sterin-Dimer in dem Polysaccharid-Sterin-Derivat-Endprodukt als Verunreinigung verbleibt, und (2) das unsubstituierte Polysaccharid, das im zweiten Schritt nicht mit der Monoisocyanatverbindung reagiert hat (gelegentlich als nicht umgesetztes Polysaccharid bezeichnet), im Polysaccharid-Sterin-Derivat-Endprodukt als Verunreinigung vorliegt.
Bei Verwendung eines Polysaccharid-Sterin-Derivats für einen Arzneimittelträger oder als Überzugsmaterial für Liposomen benötigt man ein Polysaccharid-Sterin-Derivat mit hoher Reinheit und einem geringeren Gehalt an Nebenprodukt.
Es gibt ausführliche Berichte über die oben genannten Polysaccharid-Sterin-Derivate und über amphiphile Kompositprodukte, bei denen andere hydrophobe Gruppen als Sterin an andere wasserlösliche polymere Stoffe als Polysaccharide gebunden sind, beispielsweise an Polyethylenglycoldialkylester {Dojin News Nr. 85, S. 3-11 (1997)}.
Wegen der oben erwähnten Schwierigkeiten bei der Herstellung gibt es bislang jedoch keine Berichte über hochreine wasserlösliche polymere Stoffe, die hydrophobe Gruppen enthalten.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren vorzuschlagen, das auf effiziente und einfache Weise die Herstellung eines hochreinen Polysaccharids mit hydrophoben Gruppen erlaubt, das nur einen geringen Gehalt an Verunreinigungen, wie unsubstituiertes Polysaccharid und Sterin-Dimer, aufweist.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder haben umfangreiche Untersuchungen zu den Problemen im oben genannten Stand der Technik durchgeführt und haben entdeckt, dass sich ein hochreines Polysaccharid mit hydrophoben Gruppen erhalten ließ, indem eine Kombination technischer Maßnahmen angewandt wurde, nämlich die Verwendung eines Lösungsmittels auf Ketonbasis bei dem Umfällungsprozess und die Reinigung mittels Ultrazentrifugation oder die Reinigung mit einem aprotischen polaren Lösungsmittel, was zu der vorliegenden Erfindung führte. Die vorliegende Erfindung besteht also in dem hochreinen Polysaccharid, das hydrophobe Gruppen enthält, und in dem nachfolgend angegebenen Verfahren zu seiner Herstellung:

(1) Verfahren zur Herstellung eines hochreinen Polysaccarids, das hydrophobe Gruppen enthält, umfassend
– einen ersten Verfahrensschritt zur Herstellung einer eine Isocyanatgruppe enthaltenden hydrophoben Verbindung, wobei ein Mol eines eine Hydroxygruppe enthaltenden Kohlenwasserstoffs mit 12–50 Kohlenstoffatomen oder eines Sterins mit einem Diisocyanat der Formel OCN-R¹-NCO, worin R¹ ein Hydrocarbyl mit 1–50 Kohlenstoffatomen ist, umgesetzt wird, und
– einen zweiten Verfahrensschritt zur Herstellung des Polysaccharids, das hydrophobe Gruppen enthält, die aus der Kohlenwasserstoffgruppe mit 12–50 Kohlenstoffatomen oder der Sterylgruppe bestehen, wobei die im ersten Verfahrensschritt erhaltene hydrophobe Verbindung, die eine Isocyanatfgruppe enthält, mit ein oder mehreren Polysacchariden umgesetzt wird, wobei das Reaktionsprodukt des zweiten Verfahrens-schritts mit einem Lösungsmittel auf Ketonbasis gereinigt wird.
(2) Verfahren nach (1), wobei das Polysaccharid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pullulan, Amylopectin, Amylose, Dextran, Hydroxyethylcellulose, Hydroxyethyldextran, Mannan, Levan, Inulin, Chitin, Chitosan, Xyloglucan und wasserlöslicher Cellulose.
(3) Verfahren nach (1) oder (2), wobei das Lösungsmittel auf Ketonbasis ein oder mehrere Lösungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aceton, Methylethylketon, Diethylketon und Diisopropylketon umfasst.
(4) Verfahren nach irgendeinem von (1) bis (3), wobei das hydrophobe Gruppen enthaltende Polysaccharid eine durch -XH dargestellte Gruppe aufweist, in welcher X ein Sauerstoffatom oder eine durch NY dargestellte stickstoffhaltige Gruppe ist, worin Y ein Wasserstoffatom oder ein Hydrocarbyl mit 1–10 Kohlenstoffatomen ist, wobei 0,1 bis 10 -XH-Gruppen pro 100 Monosaccharideinheiten, die das Polysaccharid bilden, durch ein oder mehrere hydrophobe Gruppen, dargestellt durch die Formel (1), nämlich
ersetzt sind, wobei X die oben angegebene Bedeutung hat, R¹ ein Hydrocarbyl mit 1–50 Kohlenstoffatomen bedeutet und R² eine Kohlenwasserstoffgruppe mit 12–50 Kohlenstoffatomen oder eine Sterylgruppe bedeutet.
(5) Verfahren nach (4), wobei R² in Formel (1) eine Sterylgruppe bedeutet.
(6) Verfahren nach irgendeinem von (1) bis (5), wobei der Gehalt an dem hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharid in dem mit dem Lösungsmittel auf Ketonbasis gereinigten Produkt so hoch wie 80 Gew.-% oder mehr ist.
(7) Verfahren nach (6), wobei der Gehalt an unsubstituiertem Polysaccharid so gering wie 20 Gew.-% oder weniger ist.
(8) Verfahren nach (6) oder (7), wobei das Produkt einen Gehalt des verunreinigenden Produkts hat, in dem beide der zwei NCO-Gruppen im Diisocyanat mit dem eine Hydroxygruppe enthaltenden Kohlenwasserstoff mit 12–50 Kohlenstoffatomen oder mit dem Sterin umgesetzt sind, der so gering wie 0,05 Gew.-% oder weniger ist.
(9) Verfahren nach irgendeinem von (1) bis (8), wobei das mit einem Lösungsmittel auf Ketonbasis gereinigte Produkt einer weiteren Reinigung unterworfen wird, indem das Produkt unter Ultraschallbehandlung fein in Wasser dispergiert und anschließend durch Ultrazentrifugation abgetrennt wird.
(10) Verfahren nach (9), wobei der Gehalt des hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharids im gereinigten Produkt aus der Ultrazentrifugationsabtrennung so hoch wie 98 Gew.-% oder mehr ist.
(11) Verfahren nach (10), wobei der Gehalt an unsubstituiertem Polysaccharid so gering wie 2 Gew.-% oder weniger ist.
(12) Verfahren nach (10) oder (11), wobei der Gehalt des verunreinigenden Produkts, in dem beide der zwei NCO-Gruppen im Diisocyanat mit dem eine Hydroxygruppe enthaltenden Kohlenwasserstoff mit 12–50 Kohlenstoffatomen oder mit dem Sterin umgesetzt sind, so gering wie 0,5 Gew.-% oder weniger ist.
(13) Verfahren nach irgendeinem von (1) bis (8), wobei das mit dem Lösungsmittel auf Ketonbasis gereinigte Produkt ferner einem Reinigungsverfahren unterworfen wird, umfassend das Lösen des Produkts in einem aprotischen polaren Lösungsmittel, das Zumischen von Wasser zu der resultierenden Lösung, damit das unsubstituierte Polysaccharid in die wässrige Phase übergeht, und das Entfernen der durch Phasentrennung abgetrennten wässrigen Phase.
(14) Verfahren nach (13), wobei die weitere Reinigung des mit dem Lösungsmittel auf Ketonbasis gereinigten Produkts erfolgt, indem das Produkt in einer Menge des aprotischen polaren Lösungsmittels gelöst wird, die dem 3- bis 50-fachen des Gewicht des Produkts entspricht, und der resultierenden Lösung Wasser in einer Menge zugemischt wird, die dem wenigstens 5-fachen des Gewichts der Lösung entspricht.
(15) Verfahren nach (13) oder (14), wobei das aprotische polare Lösungsmittel ein oder mehrere Lösungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetamid und Dimethylsulfoxid umfasst.
(16) Verfahren nach irgendeinem von (13) bis (15), wobei der Gehalt des hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharids in dem mit dem aprotischen polaren Lösungsmittel gereinigten Produkt so hoch wie 98 Gew.-% oder mehr ist.
(17) Verfahren nach (16), wobei der Gehalt an unsubstituiertem Polysaccharid so gering wie 2 Gew.-% oder weniger ist.
(18) Verfahren nach (16) oder (17), wobei der Gehalt des verunreinigenden Produkts, in dem beide der zwei NCO-Gruppen im Diisocyanat mit dem eine Hydroxygruppe enthaltenden Kohlenwasserstoff mit 12–50 Kohlenstoffatomen oder mit dem Sterin umgesetzt sind, so gering wie 0,02 Gew.-% oder weniger ist.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum des in Beispiel 1-2 erhaltenen Pullulan-Cholesterin-Derivats (CHP).
2(a) zeigt das Ergebnis der Analyse einer Probe des in Beispiel 1-2 erhaltenen Pullulan-Cholesterin-Derivats (CHP) durch Größenausschlusschromatographie (SEC) vor der Ultraschallbehandlung und 2(b) zeigt das Ergebnis der SEC-Analyse einer Probe, die nach 30 Minuten Ultraschallbehandlung genommen wurde. 2(c) zeigt das Ergebnis der SEC-Analyse des Überstands einer Ultrazentrifugation und 2(d) zeigt das Ergebnis der SEC-Analyse der Lösung, die aus einer Ultraschallbehandlung der wässrigen Phase der unteren Schicht der Ultrazentrifugation resultiert, die mit Wasser wieder aufquellen gelassen wurde. In diesen Figuren stellt die y-Achse die Höhe (dimensionslos) des abgelesenen Werts des Differentialrefraktometers dar (das Gleiche gilt im Folgenden).
3 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum des in Beispiel 2-1 erhaltenen Mannan-Cholesterin-Derivats (CHM).
4 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum des in Beispiel 2-2 erhaltenen Mannan-Cholesterin-Derivats (CHM).
5 zeigt das Ergebnis der Analyse einer Probe des in Beispiel 1-2 erhaltenen Pullulan-Cholesterin-Derivats (CHP) mittels Größenausschlusschromatographie (SEC), das mit einem unpolaren Lösungsmittel gefolgt von einer Ultraschallbehandlung gereinigt wurde.
BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
Im Rahmen dieser Beschreibung wird unter "hochrein" verstanden, dass der gehalt an Dimer, das aus der Reaktion der hydrophoben Gruppe, beispielsweise der Kohlenwasserstoffgruppe oder der Sterylgruppe, mit der Diisocyanatverbindung resultiert, und an unsubstituiertem Polysaccharid gering ist.
Der eine Hydroxygruppe enthaltende Kohlenwasserstoff mit 12–50 Kohlenstoffatomen, der erfindungsgemäß eingebaut werden soll, wird als Ausgangsmaterial für die Einführung der hydrophoben Gruppe verwendet. Kohlenwasserstoffgruppen mit 12–50 Kohlenstoffatomen, die eine Hydroxygruppe enthalten und erfindungsgemäß eingeführt werden sollen, sind beispielsweise solche, die aus Alkoholen stammen, beispielsweise Laurylalkohol, Myristylalkohol, Cetylalkohol, Stearylalkohol, Arachinylalkohol, Docosanol, Pentacosanol, Hexacosanol und Octacosanol. Von diesen sind Alkohole mit 12–35 Kohlenstoffatomen, insbesondere mit 12–20 Kohlenstoffatomen, wegen ihrer leichten Verfügbarkeit bevorzugt. Die eine Hydroxygruppe enthaltende Kohlenwasserstoffgruppe mit 12–50 Kohlenstoffatomen kann entweder allein oder als Kombination aus zwei oder mehreren eingesetzt werden. Wenn eine eine Hydroxygruppe enthaltende Kohlenwasserstoffgruppe mit weniger als 12 Kohlenstoffatomen als Ausgangsmaterial zur Einführung der hydrophoben Gruppe eingesetzt wird, bildet sich die Koagulationswirkung, die auf der Hydrophobizität beruht, nur nachteilig schwierig aus. Wenn die Anzahl der Kohlenstoffatome dagegen über 50 liegt, ist ein solches Produkt schwer erhältlich und ungünstig.
Das Sterin, das erfindungsgemäß eingebaut werden soll, wird als Ausgangsmaterial für die Einführung der hydrophoben Gruppe verwendet. Sterine, die erfindungsgemäß verwendet werden, sind beispielsweise Cholesterin, Stigmasterin, β-Sitosterin, Lanosterin und Ergosterin. Unter diesen ist Cholesterin wegen seiner Verfügbarkeit usw. bevorzugt. Die Sterine können entweder allein oder als Kombination aus zwei oder mehreren eingesetzt werden. Es ist möglich, das Sterin zusammen mit der eine Hydroxygruppe enthaltenden Kohlenwasserstoffgruppe mit 12–50 Kohlenstoffatomen zu verwenden.
Die erfindungsgemäß einzubauende Diisocyanatverbindung wird durch die Formel OCN-R¹-NCO dargestellt (in der R¹ ein Hydrocarbyl mit 1–50 Kohlenstoffatomen bedeutet). Eine Anzahl an Kohlenstoffatomen, die 50 übersteigt, ist unerwünscht, da ein solches Diisocyanat schwer erhältlich ist. Konkrete Beispiele für die Diisocyanatverbindung beinhalten Ethylendiisocyanat, wobei R¹ Ethylen ist, Butylendiisocyanat, wobei R¹ Butylen ist, Hexamethylendiisocyanat, wobei R¹ Hexamethylen ist, und Diphenylmethandiisocyanat, wobei R¹ Diphenylmethan ist.
Als Polysaccharide, die erfindungsgemäß eingebaut werden sollen, können natürlich vorkommende Polysaccharide und Polysaccharide halbsynthetischen Ursprungs eingesetzt werden. Konkrete Beispiele sind ein oder mehrere, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Pullulan, Amylopectin, Amylose, Dextran, Hydroxyethylcellulose, Hydroxyethyldextran, Mannan, Levan, Inulin, Chitin, Chitosan, Xyloglucan und wasserlöslicher Cellulose. Darunter sind Pullulan, Mannan, Xyloglucan, Amylopectin, Dextran und Hydroxyethylcellulose bevorzugt. Vorteilhaft sind auch stickstoffhaltige Polysaccharide, wie Chitin, partiell deacetyliertes Chitin und Chitosan. Die Polysaccharide können entweder allein oder als Kombination aus zwei oder mehreren eingesetzt werden.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharide sind solche, bei denen 0,1 bis 10, vorzugsweise 0,1 bis 6 -XH-Gruppen pro 100 Monosaccharideinheiten, die das Polysaccharid mit ein oder mehr durch -XH dargestellten Gruppen ausmachen (wobei X ein Sauerstoffatom oder eine durch NY dargestellte stickstoffhaltige Gruppe ist, worin Y ein Wasserstoffatom oder ein Hydrocarbyl mit 1–10 Kohlenstoffatomen ist), durch die durch die angegebene Formel (1) dargestellte hydrophobe Gruppe ersetzt sind.
In der Formel (1) bedeutet R¹ eine Gruppe, die aus der oben genannten Diisocyanatverbindung hervorgegangen ist. R² stellt eine eine Hydroxygruppe enthaltende Kohlenwasserstoffgruppe mit 12–50 Kohlenstoffatomen und/oder eine von Sterin abstammende Gruppe dar. Konkrete Beispiele für die durch R² dargestellte Gruppe beinhalten Lauryl, Myristy, Cetyl, Stearyl, Cholesteryl, Stigmasteryl, β-Sitosteryl, Lanosteryl und Ergosteryl. Besonders bevorzugt sind Myristyl, Stearyl und Cholesteryl.
Bei dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren werden sowohl die Hydroxygruppe in der CH₂OH-Gruppe als auch die direkt an das Monosaccharid gebundene Hydroxygruppe durch die durch die Formel (1) dargestellte hydrophobe Gruppe ersetzt, wenn ein Polysaccharid eingesetzt wird, in dem die konstituierenden Monosaccharide gebundene CH₂OH-Gruppen haben, wie Pullulan, Mannan usw., wobei der Anteil der auf diese Weise ersetzten Guppen bei den Hydroxygruppen der CH₂OH-Gruppe weitaus größer ist als bei den Hydroxygruppen, die direkt an das Monosaccharid gebunden sind.
Wenn ein Polysaccharid eingesetzt wird, das sowohl CH₂OH-Gruppen als auch NH₂-Gruppen gebunden hat, wie Chitosan oder dergleichen, können sowohl die OH-Gruppe in CH₂OH, die NH₂-Gruppe und die direkt an das Monosaccharid gebundene OH-Gruppe durch die durch die Formel (1) dargestellte hydrophobe Gruppe ersetzt werden, wobei der Anteil der auf diese Weise ersetzten Gruppen bei den OH-Gruppen der CH₂OH- und NH₂-Gruppen weitaus größer ist als bei den OH-Gruppen, die direkt an das Monosaccharid gebunden sind.
Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren umfasst entweder die nachfolgenden Verfahrensschritte 1 bis 3 oder 1 bis 4. Obwohl sich die Beschreibung des Herstellungsverfahrens im Folgenden auf den Fall bezieht, dass Pullulan als Polysaccharid und eine Sterylgruppe als hydrophobe Gruppe verwendet werden, kann die Herstellung auf ähnliche Weise auch mit anderen erfolgen. Die von dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren umfassten Reaktionen sind in den Reaktionsschemata (I) und (II) angegeben, wobei Reaktionsschema (I) Verfahrensschritt 1 und Reaktionsschema (II) Schritt 2 entspricht.
Reaktionsschema (I)
Reaktionsschema (II)
Verfahrensschritt 1
Wie in Reaktionsschema (I) gezeigt, ist das erfindungsgemäß einzusetzende Sterylisocyanat eine durch die Formel (4) dargestellte Verbindung, die an einem Ende eines Alkans die Sterylgruppe und am anderen Ende eine Isocyanatgruppe aufweist und durch Umsetzung einer Diisocyanatverbindung der Formel (2) und eines Sterins der Formel (3) erhalten werden kann. Bei der Herstellung der Verbindung der Formel (4) wird eine Isocyanat gruppe der Diisocyanatverbindung der Formel (2) mit der Hydroxygruppe des Sterins der Formel (3) zum Sterylisocyanat der Formel (4) umgesetzt, in dem das Sterin über eine Urethanbindung an das eine Ende gebunden ist und die Isocyanatgruppe am anderen Ende nicht umgesetzt wird und als solche bestehen bleibt. Bei dieser Umsetzung wird das Sterin-Dimer der Formel (5) üblicherweise mit einem Gehalt von etwa 10 Gew.-% als Nebenprodukt gebildet.
Verfahrensschritt 2
Wie in Reaktionsschema (II) gezeigt, wird das in dem obigen Verfahrensschritt (1) erhaltene Sterylisocyanat der Formel (4) mit einem Polysaccharid (Pullulan) der Formel (6) zum Polysaccharid-Sterin-Derivat (hydrophobe Gruppen enthaltendes Polysaccharid) der Formel (7) umgesetzt. Diese Reaktion ist die Addition der Hydroxygruppe des Polysaccharids der Formel (6) an die Isocyanatgruppe des Sterylisocyanats der Formel (4) in einem organischen Lösungsmittel in Gegenwart eines basischen Katalysators.
Verfahrensschritt 3
Das in dem obigen Verfahrensschritt 2 erhaltene Reaktionsprodukt wird durch Umfällen mit einem Lösungsmittel auf Ketonbasis gereinigt (im Folgenden wird diese Reinigung als "Ketonreinigung" bezeichnet). Durch die Ketonreinigung wird hauptsächlich das Sterin-Dimer entfernt, das in Verfahrensschritt 1 als Nebenprodukt entsteht, wodurch ein hochreines Polysaccharid-Sterin-Derivat (das hydrophobe Gruppen enthaltende Polysaccharid) als Produkt erhalten werden kann. In der Beschreibung der vorliegenden Erfindung wird das Produkt, das aus der Ketonreinigung resultiert, als "ketongereinigtes Produkt" bezeichnet. Das ketongereinigte Produkt kann auch noch einer weiteren Reinigung durch Dialyse unterzogen werden, um das Reaktionslösemittel zu entfernen.
Verfahrensschritt 4

1) Das im obigen Verfahrensschritt 3 erhaltene ketongereinigte Produkt (einschließlich des gereinigten Produkts aus der Dialyse) wird durch Ultrazentrifugation weiter gereinigt. Durch die Reinigung durch Ultrazentrifugation wird überwiegend das unsubstituierte Polysaccharid (dasnicht umgesetzte Polysaccharid) entfernt, wodurch sich ein noch hochreineres, hydrophobe Gruppen enthaltendes Polysaccharid als Produkt erhalten lässt.
2) Bei dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren kann der obige Reinigungsprozess 1) mittels Ultrazentrifugation durch einen Reinigungsprozess mit einem aprotischen polaren Lösungsmittel ersetzt werden. Das Reinigungsverfahren mit dem aprotischen polaren Lösungsmittel besteht in den Prozessen, umfassend das Lösen des ketongereinigten Produkts (einschließlich des durch Dialyse gereinigten Produkts), das im obigen Verfahrensschritt 3 erhalten wurde, in einem hierzu gegebenen aprotischen polaren Lösungsmittel, das Zugeben von Wasser zu der resultierenden Lösung unter ausreichendem Umwälzen mit beispielsweise einem Rührer, und das Abtrennen der durch Phasentrennung gebildeten wässrigen Phase. Durch die Reinigung mit dem aprotischen polaren Lösungsmittel wird das unsubstituierte Polysaccharid (das nicht umgesetzte Polysaccharid) überwiegend entfernt, wodurch sich ein noch hochreineres, hydrophobe Gruppen enthaltendes Polysaccharid erhalten lässt. Dieses Verfahren kann beliebig wiederholt werden, und durch wenige Wiederholungen kann die Reinheit des hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharids weiter verbessert werden. Es ist ferner möglich, das hydrophobe Gruppen enthaltende Polysaccharid in einer festen pulverförmigen Form zu erhalten, indem man das aprotische polare Lösungsmittel entfernt.

Nachfolgend werden die erfindungsgemäßen Verfahrensschritte ausführlicher beschrieben.
Der Schritt zur Herstellung der Verbindung der Formel (4) in Verfahrensschritt 1 besteht in der Umsetzung der Diisocyanatverbindung der Formel (2) mit dem Sterin der Formel (3) in einem organischen Lösungsmittel in Gegenwart eines basischen Katalysators. Die Menge der eingesetzten Diisocyanatverbindung beträgt vorteilhaft 1–30 Moläquivalent, vorzugsweise 10–20 Moläquivalent, pro Mol Sterin. Als basische Katalysatoren werden vorteilhaft Amine verwendet, wodurch die Umsetzung effizient abläuft.
Organische Lösungsmittel, die bei der Umsetzung verwendet werden können, sind beispielsweise Lösungsmittel auf Basis von Ether, aprotische polare Lösungsmittel, Lösungsmittel auf Basis von Halogenverbindungen und Lösungsmittel auf Basis von aliphatischen und aromatischen Kohlenwasserstoffen. Beispiele für Lösungsmittel auf Etherbasis sind aliphatische Ether, wie Ethylether usw., und heterocyclische Ether, wie Tetrahydrofuran und dergleichen. Als aprotische polare Lösungsmittel sind beispielsweise Aceton, Dimethylformamid (DMF) und Dimethylsulfoxid (DMSO) zu nennen. Beispiele für Lösungsmittel auf Basis von Halogenverbindungen sind Methylenchlorid und Chloroform. Beispiele für Lösungsmittel auf Basis aliphatischer Kohlenwasserstoffe sind Pentan, Hexan usw. Als Lösungsmittel auf Basis aromatischer Kohlenwasserstoffe sind Benzol, Toluol usw. zu nennen. Unter diesen sind aromatische Kohlenwasserstoffe bevorzugt.
Beispiele für das Amin, das bei der Reaktion nach Reaktionsschema (I) einzusetzen ist, sind Triethylamin, Pyridin usw. Die Menge des zu verwendenden Amins kann im Bereich von 1 bis 20 Moläquivalent, vorzugsweise 1 bis 3 Moläquivalent, pro Mol Sterin liegen. Temperatur und Dauer der Reaktion können abhängig von beispielsweise der Diisocyanatverbindung und dem eingesetzten Lösungsmittel variieren und entsprechend dem Fortschreiten der Reaktion nachlassen, wobei die Reaktionstemperatur vorzugsweise im Bereich von Raumtemperatur bis 100°C liegt und die Reaktionsdauer vorzugsweise im Bereich von 3–24 Stunden liegt.
Für die Umsetzung werden vorteilhaft ein getrocknetes Lösungsmittel und ein getrockneter basischer Katalysator eingesetzt, wobei Bedingungen unter einer Inertgasatmosphäre bevorzugt sind. Als Inertgas sind beispielsweise Stickstoff, Argon und dergleichen zu nennen.
Der Schritt zur Herstellung der Verbindung der Formel (7) in Verfahrensschritt 2 besteht in der Umsetzung des Polysaccharids der Formel (6) mit der in dem obigen Verfahrensschritt 1 gebildeten Sterylisocyanatverbindung der Formel (4) in einem organischen Lösungsmittel in Gegenwart eines basischen Katalysators. Obwohl das Verhältnis der Einsatzmengen von Polysaccharid und Sterylisocyanat hier durch die gewünschte Menge der Sterylgruppe, die in das Polysaccharid eingeführt werden soll, bestimmt wird, wird ein Verhältnis im Bereich von 0,1 bis 10 Moläquivalent pro 100 Monosaccharideinheiten im Polysaccharid bevorzugt.
Als organische Lösungsmittel, die für die Umsetzung verwendet werden können, sind beispielsweise Lösungsmittel auf Basis von Ether, aprotische polare Lösungsmittel, Lösungsmittel auf Basis von Halogenverbindungen und Lösungsmittel auf Basis von aliphatischen und aromatischen Kohlenwasserstoffen zu nennen. Beispiele für Lösungsmittel auf Etherbasis sind aliphatische Ether, wie Ethylether usw., und heterocyclische Ether, wie Tetrahydrofuran und dergleichen. Als Beispiele für aprotische polare Lösungsmittel sind Aceton, Dimethylformamid (DMF) und Dimethylsulfoxid (DMSO) zu nennen. Lösungsmittel auf Basis von Halogenverbindungen sind beispielsweise Methylenchlorid und Chloroform. Lösungsmittel auf Basis von aliphatischen Kohlenwasserstoffen sind beispielsweise Pentan, Hexan usw. Als Lösungsmittel auf Basis von aromatischen Kohlenwasserstoffen sind Benzol, Toluol usw. zu nennen. Unter diesen sind aprotische polare Lösungsmittel bevorzugt.
Als basische Katalysatoren, die bei der Reaktion von Reaktionsschema (II) eingesetzt werden, sind Amine bevorzugt, und hier sind beispielsweise Triethylamin, Pyridin usw. zu nennen. Die einzusetzende Menge des Amins kann im Bereich von 1 bis 10 Moläquivalent, vorzugsweise von 1 bis 3 Moläquivalent, pro Mol Polysaccharid liegen. Temperatur und Dauer der Umsetzung können abhängig von beispielsweise dem Polysaccharid und dem verwendeten Lösungsmittel variieren und entsprechend dem Fortschreiten der Reaktion nachlassen, wobei die Reaktionstemperatur vorzugsweise im Bereich von Raumtemperatur bis 100°C und die Reaktionsdauer vorzugsweise im Bereich von 30 Minuten bis 24 Stunden liegt.
Für die Umsetzung werden vorzugsweise ein getrocknetes Lösungsmittel und ein getrockneter basischer Katalysator eingesetzt, wobei Bedingungen unter einer Inertgasatmosphäre bevorzugt sind. Als Inertgas sind beispielsweise Stickstoff, Argon und dergleichen zu nennen.
Als Lösungsmittel auf Ketonbasis, das bei der Ketonreinigung im obigen Verfahrensschritt 3 einzusetzen ist, kann wenigstens eines genannt werden, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aceton, Methylethylketon, Diethylketon, Diisopropylketon und dergleichen. Die einzusetzende Menge des Lösungsmittels auf Ketonbasis kann das 4- bis 50-fache, vorzugsweise das 8- bis 20-fache des Gewichts der in dem obigen Verfahrensschritt 2 erhaltenen Lösung betragen. Wenn das im obigen Verfahrensschritt 2 erhaltene Reaktionsprodukt zu einem Lösungsmittel auf Ketonbasis gegeben wird, fällt das Polysaccharid-Sterin-Derivat (das hydrophobe Gruppen enthaltende Polysaccharid) aus und das Sterin-Dimer, das im Verfahrensschritt 1 als Nebenprodukt gebildet wird, löst sich in dem Lösungsmittel auf Ketonbasis, so dass sich durch Abtrennen und Sammeln des Niederschlags ein hochreines Polysaccharid-Sterin-Derivat als Produkt erhalten lässt. Der Niederschlag kann durch Verfahren wie Gefriertrocknen, Vakuumtrocknen oder dergleichen getrocknet werden. Durch die Ketonreinigung lässt sich ein höherer Abtrennungsgrad des Sterin-Dimers erreichen als bei herkömmlichen Methoden wie Dialyse, Umfällung mit Alkohol, Säulenchromatographie oder dergleichen, wodurch sich auf einfache Weise ein hochreines, hydrophobe Gruppen enthaltendes Polysaccharid als Produkt erhalten lässt.
Der Gehalt an hydrophobe Gruppen enthaltendem Polysaccharid in dem ketongereinigten Produkt ist so hoch wie 80 Gew.-% oder mehr, vorzugsweise 90 Gew.-% oder mehr. Der Gehalt dan unsubstituiertem Polysaccharid ist so gering wie 20 Gew.-% oder weniger, vorzugsweise 10 Gew.-% oder weniger. Der Gehalt an Verunreinigung, die aus der Umsetzung von beiden der zwei NCO-Gruppen in der Diisocyanatverbindung mit der hydrophoben Gruppe resultieren, ist so gering wie 0,05 Gew.-% oder weniger, vorzugsweise so gering wie 0,01 Gew.-% oder weniger.
Bei dem Reinigungsverfahren mittels Ultrazentrifugation im obigen Verfahrensschritt 4-1) wird das ketongereinigte Produkt aus Verfahrensschritt 3 nach Ultraschallbehandlung des Produkts unter Zugabe von Wasser einer Ultrazentrifugation unterworfen. Hier können destilliertes Wasser, deionisiertes Wasser und dergleichen verwendet werden. Die zuzugebende Menge Wasser kann das 5- bis 100-fache, vorzugsweise das 30- bis 60-fache des Gewichts des ketongereinigten Produkts betragen. Die Ultrazentrifugation kann vorzugsweise bei einer Beschleunigung von 10.000–200.000 G, vorzugsweise von 30.000–100.000 G, über einen Zeitraum von 1–24 Stunden, vorzugsweise 3–15 Stunden, erfolgen. Durch die Ultrazentrifugation erfolgt eine Phasentrennung, wobei sich das Polysaccharid-Sterin-Derivat, das ein höheres Molekulargewicht besitzt, in der unteren Phase sammelt, und das unsubstituierte Polysaccharid, das ein niedrigeres Molekulargewicht besitzt, in die obere Phase geht, wodurch sich das hochreine Polysaccharid-Sterin-Derivat als Produkt durch Auffangen der unteren Phase erhalten lässt.
Der Gehalt an hydrophobe Gruppen enthaltendem Polysaccharid in dem gereinigten Produkt aus der Ultrazentrifugation ist so hoch wie 98 Gew.-% oder mehr, vorzugsweise 99,9 Gew.-% oder mehr. Der Gehalt an unsubstituiertem Polysaccharid ist so gering wie 2 Gew.-% oder weniger, vorzugsweise 0,1 Gew.-% oder weniger. Der Gehalt an Verunreinigung, die aus der Umsetzung von beiden der zwei NCO-Gruppen in der Diisocyanatverbindung mit der hydrophoben Gruppen resultieren, ist so gering wie 0,05 Gew.-% oder weniger, vorzugsweise 0,01 Gew.-% oder weniger. Durch die Reinigung mittels Ultrazentrifugation lässt sich sogar leicht ein hochreines Produkt mit 99,9 Gew.-% oder mehr erhalten.
Als aprotische polare Lösungsmittel, die bei der Reinigung von Verfahrensschritt 4-2), bei dem das aprotische polare Lösungsmittel verwendet wird, eingesetzt werden können, sind ein oder mehrere zu nennen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus beispielsweise N,N-Dimethylformamid (DMF), N,N-Dimethylacetamid (DMAc), 1,3-Dimethyl-2-imidazolidin (DMI), Dimethylsulfoxid (DMSO) usw. Die einzusetzende Menge des aprotischen polaren Lösungsmittels kann das 3- bis 50-fache, vorzugsweise das 5- bis 15-fache des in Verfahrensschritt 3 erhaltenen ketongereinigten Produkts betragen. Wenn die Menge weniger als das 3-fache des Gewichts beträgt, löst sie das ketongereinigte Produkt nicht ausreichend. Wenn die Menge das 50-fache des Gewichts übersteigt, erfolgt möglicherweise nach Zugabe von Wasser keine Trennung in zwei Phasen, sondern es bleibt ein mischbarer Zustand. Die Temperatur zum Lösen des ketongereinigten Produkts in dem aprotischen polaren Lösungsmittel kann im Bereich von 0–150°C liegen, vorzugsweise im Bereich von Raumtemperatur bis 100°C. Die Verwendung eines anderen Lösungsmittels als dem aprotischen polaren Lösungsmittel ist ungünstig, da sich das Polysaccharid mit den hydrophoben Gruppen und das unsubstituierte Polysaccharid darin nicht lösen.
Als Wasser, das in dem obigen Verfahrensschritt 4-2) verwendet werden kann, ist destilliertes Wasser, deionisiertes Wasser, reines Wasser usw. zu nennen. Die einzusetzende Menge Wasser kann hier wenigstens das 5-fache, vorzugsweise das 10- bis 100-fache des Gewichts der Lösung betragen, die durch Lösen des ketongereinigten Produkts in dem aprotischen polaren Lösungsmittel erhalten wurde. Wenn die Menge unter dem 5-fachen des Gewichts liegt, erfolgt möglicherweise keine Phasentrennung und die Mischung bleibt in einem mischbaren Zustand. Wenn die Menge Wasser dagegen das 100-fache des Gewichts übersteigt, ist keine deutliche Zunahme in der Effizienz der Entfernung des unsubstituierten Polysaccharids zu erwarten. Vorzugsweise wird eine vorbestimmte Menge Wasser auf einmal zu der Lösung gegeben und anschließend beispielsweise mit einem Rührer mechanisch gerührt. Eine Zugabe unter gleichzeitigem mechanischen Rühren ist nicht bevorzugt, da dadurch einer Phasentrennung in zwei Phasen wegen der Bildung eines mischbaren Mischung entgegengewirkt wird. Der Vorgang der Phasentrennung kann dadurch erfolgen, dass man die Mischung stehen lässt, oder durch forcierte Phasentrennung, beispielsweise durch Zentrifugation.
Wenn zu der Lösung des ketongereinigten Produkts in dem aprotischen polaren Lösungsmittel Wasser gegeben wird und die resultierende Mischung gerührt wird, um eine Phasentrennung in zwei Phasen zu bewirken, nämlich eine wässrige Phase und eine Phase des aprotischen polaren Lösungsmittels, geht das unsubstituierte Polysaccharid in die wässrige Phase und das gewünschte Polysaccharid mit hydrophoben Gruppen bleibt in der Phase des aprotischen polaren Lösungsmittels gelöst, so dass das unsubstituierte Polysaccharid durch Abtrennen der wässrigen Phase entfernt werden kann. Durch Entfernen des aprotischen polaren Lösungsmittels aus der Lösungsmittelphase, die nach Abtrennung der wässrigen Phase verbleibt, lässt sich das hydrophobe Gruppen enthaltende Polysaccharid als hochreines Produkt erhalten. Zum Entfernen des aprotischen polaren Lösungsmittels können Verfahren wie Chromatographie, Gefriertrocknen und Umfällung verwendet werden. Bei der Umfällung wird insbesondere die Verwendung eines Lösungsmittels auf Ketonbasis oder Alkoholbasis als Antisolvent bevorzugt, beispielsweise Aceton, Methylethylketon, Methanol, Ethanol usw. Die Menge des Antisolvent kann das 4- bis 50-fache, vorzugsweise das 8- bis 20-fache, des Gewichts der Lösung betragen, die umgefällt werden soll. Der resultierende Niederschlag kann mit Verfahren wie Gefriertrocknen und Vakuumtrocknen getrocknet werden.
Die Reinigung mit einem aprotischen polaren Lösungsmittel lässt sich bequemer und effizienter durchführen als das Reinigungsverfahren mittels Ultrazentrifugation des obigen Verfahrensschritts 4-1). Dadurch wird eine Produktion des hochreinen Produkts, des hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharids, das zur Verwendung im lebenden Körper, beispielsweise für ein Medikament, vorgesehen ist, in größerem Maßstab möglich.
Der Gehalt an hydrophobe Gruppen enthaltendem Polysaccharid im gereinigten Produkt, das aus dem Verfahren mit einem aprotischen polaren Lösungsmittel resultiert, kann so hoch wie 98 Gew.-% oder höher sein, vorzugsweise so hoch wie 99,9 Gew.-% oder höher. Der Gehalt an unsubstituiertem Polysaccharid ist so gering wie 2 Gew.-% oder weniger, vorzugsweise so gering wie 0,1 Gew.-% oder weniger. Der Gehalt an Verunreinigungen, die aus der Nebenreaktion resultieren, bei der beide NCO-Gruppen der Diisocyanatverbindung mit der hydrophoben Gruppe reagiert haben, beträgt höchstens 0,02 Gew.-%, vorzugsweise höchstens 0,01 Gew.-%. Durch die Reinigung mit einem aprotischen polaren Lösungsmittel lässt sich leicht ein hochreines Produkt mit 99,9 Gew.-% oder mehr erhalten.
Durch das oben beschriebene erfindungsgemäße Verfahren wird es möglich gemacht, das als Nebenprodukt gebildete Sterin-Dimer zu entfernen, das im Endprodukt verbleibt und dessen vollständige Entfernung bislang mit den Verfahren des Standes der Technik auf bequeme und effiziente Weise ziemlich schwierig war, wodurch sich die Herstellung eines hochreinen, hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharids realisieren lässt.
Das hochreine Polysaccharid mit hydrophoben Gruppen, das nach dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wird, dessen hydrophobe Gruppe durch die oben angegebene Formel (1) dargestellt ist, hat eine Reinheit so hoch wie 80 oder mehr, vorzugsweise so hoch wie 90% oder mehr. Das hochreine Polysaccharid, das durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt wird, kann wegen seiner als Folge der hydrophoben Gruppe der Formel (1) kohäsiven Natur eine feindisperse kolloide Lösung bilden und besitzt daher die Fähigkeit, Polymermizellen mit Kern-Schale-Struktur zu bilden.
Das hochreine Polysaccharid mit hydrophoben Gruppen, das durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt wird, kann als Überzugsmaterial zum Überziehen von Arzneimittelträgern verwendet werden, die ein darin verkapseltes Arzneimittel aufweisen. Es kann als Überzugsmaterial zur Überziehen von Arzneimittelträgern, wie Liposomen-Mikrokapseln, Mikrokügelchen, O/W-Emulsionen und Erythrozytenschatten, verwendet werden. Die Verwen dung des hochreinen Polysaccharids mit hydrophoben Gruppen für solche medizinischen Materialien ist sicher, da es nur einen geringen Gehalt an Nebenprodukten und an unsubstituiertem Polysaccharid aufweist und hochrein ist.
Wie oben beschrieben, erlaubt es das Verfahren zur Herstellung des hochreinen Polysaccharids mit hydrophoben Gruppen, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wird, in einfacher und effizienter Weise, ein hochreines Polysaccharid mit hydrophoben Gruppen als Produkt herzustellen, das nur einen geringen Gehalt an Verunreinigungen, wie unsubstituiertes Polysaccharid und Sterin-Dimer, aufweist, da es einen Reinigungsschritt unter Verwendung eines Lösungsmittels auf Ketonbasis umfasst. Ein noch hochreineres Polysaccharidprodukt mit hydrophoben Gruppen lässt sich herstellen, indem man hiermit eine Reinigung durch Ultrazentrifugation oder eine Reinigung mit einem aprotischen polaren Lösungsmittel kombiniert.
Das hochreine Polysaccharid, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wird, besitzt wegen des oben beschriebenen Verfahrens zu seiner Herstellung eine hohe Reinheit, so dass es sicher als medizinisches Material verwendet werden kann.
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung mit Hilfe von Beispielen konkreter beschrieben.
BEISPIEL 1-1
[Synthese eines N-(6-Isocyanatohexyl)cholesterylcarbamats]
In einem Auberginenkolben mit 1 1 Fassungsvermögen wurden 25 g (0,065 mol) Cholesterin vorgelegt und hierzu wurden 300 ml Toluol zum Lösen gegeben, wozu 17 ml (0,12 mol) Triethylamin gegeben wurden. Zu dieser Mischung wurden 161 g (0,96 mol, 14,8 Äq.) Hexamethylendiisocyanat gelöst in 300 ml Toluol gegeben, und die resultierende Mischung wurde bei 80°C unter Stickstoffatmosphäre etwa 6 Stunden lang umgesetzt. Nach Beendigung der Reaktion wurden Toluol und überschüssiges Hexamethylendiisocyanat unter reduziertem Druck entfernt. Durch Stehenlassen des resultierenden gelblichen öligen Rückstands bei Raumtemperatur über Nacht bildeten sich schwachgelbe Kristalle. Die Kristalle wurden entnommen und in etwa 1 l Hexan gegeben, und die Mischung wurde kräftig geschüttelt und dann wurde der Überstand abdekantiert. Dieses Waschverfahren wurde viermal wiederholt, worauf das Produkt unter reduziertem Druck 3 Stunden bei Raumtemperatur getrocknet wurde, wodurch ein weißer Feststoff (Kristalle) erhalten wurde. Ausbeute: 18,25 g (50,9%).
Die Ergebnisse der Analyse dieses Produkts mittels ¹H-NMR und IR waren wie nachfolgend angegeben.
¹H-NMR: δ ppm, in CDCl₃, TMS
0,68–2,35 (m, 43H)
1,34–1,55 (m, 8H)
3,14–3,18 (m, 2H)
3,27–3,32 (t, J = 6,6 Hz, 2H)
4,4–4, 6 (m, 2H)
5,38 (m, 1H)
IR (KBr, cm^–1): 3260, 2320, 1680, 1130
Durch diese Daten wurde bestätigt, dass das erhaltene Produkt N-(6-Isocyanatohexyl)cholesterylcarbamat der folgenden Formel (4a) ist:
Daneben wurden die erhaltenen weißen Kristalle mittels Dünnschichtchromatographie durch Entwicklung mit "Preparative TLC" (bezogen von Merck AG, Silikagel 60 F₂₅₄, Entwickler: Hexan/Ethylacetat = 2/1) untersucht, wodurch die Anwesenheit des als Nebenprodukt gebildeten Cholesterin-Dimers (Rf = 0,65) der folgenden Formel (5a) bestätigt wurde. Die Bande für das Cholesterin-Dimer auf der TLC wurde mit Aceton extrahiert und der Extrakt wurde analysiert, wodurch bestätigt wurde, dass das Cholesterin-Dimer in dem weißen kristallinen Produkt in einer Menge von 8 Gew.-% enthalten war.
BEISPIEL 1-2
[Synthese eines Pullulan-Cholesterin-Derivats (CHP)]
In einem Auberginenkolben mit 1 l Fassungsvermögen wurden 40 g (248 mmol als wasserfreie Glucose) Pullulan (mittleres Molekulargewicht: 108.000) vorgelegt, es wurden 420 ml Dimethylsulfoxid (manchmal mit DMSO abgekürzt) zugegeben, und die Mischung wurde zum Lösen bei 80°C unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Zu dieser Mischung wurde eine Lösung von 1,78 g (3,21 mmol) des in BEISPIEL 1-1 synthetisierten N-(6-Isocyanatohexyl)cholesterylcarbamats gelöst in 31,6 g (0,40 mol) Pyridin gegeben und die Mischung wurde 3 Stunden bei 90°C umgesetzt.
Nach Beendigung der Reaktion wurde das Dimethylsulfoxid abdestilliert und der resultierende ölige Rückstand wurde zur Reinigung des Produkts unter Bildung eines Niederschlags in 6 l Aceton getropft. Nach Entfernen des Überstands wurden dem resultierenden Niederschlag 4 l Aceton zugegeben und die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt und unter reduziertem Druck getrocknet. Die so erhaltenen Feststoffe wurden in Dimethylsulfoxid gelöst und die Lösung wurde in einen Dialysesack gegeben (Spectra/Por3, ein Produkt der Firma Spectropor, mit einem Ausschlussmolekulargewicht von 3500) und eine Woche gegen destilliertes Wasser dialysiert. 1,5 l der resultierenden Polymerlösung wurden auf übliche Weise gefriergetrocknet, wodurch ein weißes festes Material (im Folgenden gelegentlich als "acetongereinigtes Produkt" bezeichnet) erhalten wurde. Ausbeute: 31,7 g (76,2%).
Die Ergebnisse der Analyse dieses acetongereinigten Produkts mittels ¹H-NMR und IR waren wie nachfolgend angegeben.
¹H-NMR: δ ppm, DMSO-d₆/D₂O = 20/1, Vol.
0,68–2,40
2,60–4,60
4,70–5,30
IR (KBr, cm^–1): 1680, 1180–900
Durch diese Daten wurde bestätigt, dass das erhaltene Produkt ein Pullulan/Cholesterin-Derivat (im Folgenden manchmal mit CHP abgekürzt) der folgenden Formel (7a) ist:
Daneben wurde das obige mit Aceton gereinigte Produkt durch Dünnschichtchromatographie mit "Preparative TLC" {bezogen von Merck AG, Silikagel 60 F₂₅₄, Entwickler: Hexan/Ethylacetat (2/1)} analysiert, wobei kein Cholesterin-Dimer (Rf = 0,65) der Formel (5a) als Nebenprodukt erkannt wurde. Außerdem wurde das acetongereinigte Produkt mittels ¹H-NMR analysiert und der Gehalt an Cholesterin-Dimer wurde aus dem Protonenverhältnis berechnet. Das Ergebnis ließ kein Cholesterin-Dimer erkennen. Daher ist der Gehalt des Cholesterin-Dimers der Formel (5a) in dem acetongereinigten Produkt 0 Gew.-%.
Die Acetonphase, die zur Reinigung verwendet wurde, wurde gesammelt und die Menge des darin enthaltenen Cholesterin-Dimers berechnet. Es wurde gefunden, dass die Menge an Cholesterin-Dimer, die in der Acetonphase enthalten war, 0,140 g betrug. Da die Menge an Cholesterin-Dimer, die im Ausgangsmaterial von 1,78 g (3,21 mmol) N-(6-Isocyanatohexyl)cholesterylcarbamat zu 0,142 g berechnet wird (es wurde bestätigt, dass der Gehalt an Cholesterin-Dimer in dem Produkt von BEISPIEL 1-1 8 Gew.-% war), wird der Abtrennungsgrad des Cholesterin-Dimers aus diesen Daten berechnet. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 gezeigt.
Das ¹H-NMR-Spektrum der resultierenden Zielverbindung, nämlich des Pullulan-Cholesterin-Derivats der Formel (7a) ist in 1 gezeigt. Aus dem Wert für die Integration über die Peakfläche dieses ¹H-NMR-Spektrums wird der Anteil des Einbaus der Cholesteringruppen in das Pullulan des Pullulan-Cholesterin-Derivats nach der folgenden Gleichung (A) berechnet: (100 + 2x)/51x = b/a (A)in der die Symbole bedeuten:

a:: Peakfläche der Cholesteringruppe (δ = 0,68 – 2,40)
b:: Peakfläche von Pullulan (δ = 4,70 – 5,30)
x:: Anteil der Substitution mit Cholesteringruppen pro 100 Monosaccharideinheiten.

Bei der Berechnung wurde gefunden, dass der Anteil der Substitution mit Cholesteringruppen in dem Pullulan-Cholesterin-Derivat der obigen Formel (7a) 1,1 Gruppen pro 100 Monosaccharideinheiten beträgt.
VERGLEICHSBEISPIEL 1
[Umfällungsversuch mit Ethanol]
Ein Pullulan-Cholesterin-Derivat wurde nach dem gleichen Verfahren wie in BEISPIEL 1-2 synthetisiert. Nach Beendigung der Reaktion erfolgte die Reinigung durch Umfällung mit Ethanol, wodurch ein Pullulan-Cholesterin-Derivat erhalten wurde.
Die Analyse des mit Ethanol gereinigten Produkts erfolgte mit "Preparative TLC" in gleicher Weise wie in BEISPIEL 1-2. Durch das Ergebnis wurde die Anwesenheit des Cholesterin-Dimers (Rf = 0,65) der Formel (5a) bestätigt. Der Gehalt des Cholesterin-Dimers in dem mit Ethanol gereinigten Produkts wurde wie in BEISPIEL 1-2 aus der ¹H-NMR-Analyse berechnet. Das Ergebnis zeigte, dass das Cholesterin-Dimer in dem Produkt in einer Menge von 0,4 Gew.-% enthalten ist.
Die zur Reinigung verwendete Ethanolphase wurde gesammelt und die Menge des darin enthaltenen Cholesterin-Dimers berechnet, was zeigte, dass der Gehalt 0,016 g betrug. Daraus wurde der Abtrennungsgrad des Cholesterin-Dimers in gleicher Weise wie in BEISPIEL 1-2 berechnet. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Durch Tabelle 1 wird bestätigt, dass das Cholesterin-Dimer durch Reinigen des Produkts durch Umfällung mit Aceton als Lösungsmittel für die Umfällung nahezu vollständig entfernt werden kann.
BEISPIEL 1–3
[Reinigung eines Pullulan-Cholesterin-Derivats (CHP)]
Zu 40 mg des in BEISPIEL 1-2 synthetisierten Pullulan-Cholesterin-Derivats wurden 20 ml reines Wasser gegeben und die Mischung wurde mit einem Ultraschallgerät mit Prüfkopf (TOMY, Gerät der Firma URP, mit 5 mm äußerem Prüfkopfdurchmesser) 30 Minuten bei 40 W ultraschallbehandelt. Bei der Beschallung wurde die Temperatur der wässrigen Mischung durch Kühlen des Gefäßes von außen mit Eiswasser bei 4°C gehalten.
Proben der ultraschallbehandelten wässrigen Mischung von jeweils 10 ml wurden in Zentrifugenröhrchen gesammelt und bei 55.000 G 10 Stunden bei 25°C zentrifugiert. Dies führte zu einer Phasentrennung, wobei sich das unsubstituierte Pullulan (nicht umgesetztes Pullulan) im Überstand sammelte und sich das Pullulan-Cholesterin-Derivat (CHP) in die untere Phase abtrennte.

Die vor bzw. nach der Ultraschallbehandlung gesammelten Proben wurden mittels SEC (Größenausschlusschromatographie) analysiert. Die Bedingungen für die SEC waren wie nachfolgend angegeben. Die Ergebnisse sind in 2(a) bzw. 2(b) gezeigt.

Verwendetes Gerät:	TOSOH HPSEC SYSTEM (Marke der Tosoh K.K.)
Säule:	TSK-Gel G4000SWXL (Marke der Tosoh K.K.)
Elutionsmittel:	0,02% NaN₃ in deionisiertem Wasser
Durchflussgeschwindigkeit:	0,5 ml/min
Temperatur:	35°C
Detektor:	RI (Differentialrefraktometer)

Bei der Berechnung der Peakfläche von 2(b) wird gefunden, dass das Pullulan mit niedrigerem Molekulargewicht (nicht umgesetztes Pullulan) in dem mit Aceton gereinigten Produkt in einer Menge von etwa 5 Gew.-% enthalten ist. Der Überstand der Ultrazentrifugation wurde mittels SEC analysiert. Das Ergebnis ist in 2(c) gezeigt. Die gelierte Masse (Niederschlag) in der unteren Phase der Zentrifugation wurde mit Wasser wieder quellen gelassen und dann in gleicher Weise wie oben mit Ultraschall behandelt, worauf die auf diese Weise ultraschallbehandelte Lösung mittels SEC analysiert wurde. Das Ergebnis ist in 2(d) gezeigt. Durch diese Ergebnisse wird bestätigt, dass in dem Überstand der Ultrazentrifugation nahezu 100 Gew.-% des Pullulans mit niedrigerem Molekulargewicht (nicht umgesetztes Pullulan) als Verunreinigung entfernt wurden und dass der Niederschlag keinen Gehalt an Pullulan mit niedrigerem Molekulargewicht mehr aufweist.
Durch die obigen Ergebnisse wird bestätigt, dass das Pullulan-Cholesterin-Derivat (CHP) der Formel (7a) in hoher Reinheit erhalten wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Tabelle 2
BEISPIEL 2-1
[Synthese 1 eines Mannan-Cholesterin-Derivats (CHM)]
Nach dem gleichen Verfahren wie für die Umsetzung in BEISPIEL 1–2 wurden ein handelsübliches Mannanprodukt (ein Produkt der Firma Sigma) und N-(6-isocyanatohexyl)cholesterylcarbamat zur Reaktion gebracht. Die eingesetzte Menge eines jeden Ausgangsmaterials war wie nachfolgend angegeben:

1) Mannan (Mw = 85.000): 26,2 g (162 mmol als wasserfreie Mannose)
2) N-(6-Isocyanatohexyl)cholesterylcarbamat: 1,08 g (1,95 mmol)
3) Pyridin: 19,2 g (243 mmol)
4) Dimethylsulfoxid: 32 ml

Nach Beendigung der Reaktion erfolgte die Reinigung durch Umfällung mit Aceton als Lösungsmittel. Dann wurde das Produkt dialysiert und anschließend gefriergetrocknet, wodurch 21,5 g (Ausbeute = 79,5%) eines weißen Feststoffs erhalten wurden.
Die Ergebnisse der Analyse des obigen acetongereinigten Produkts mittels ¹H-NMR und IR sind nachfolgend angegeben:
¹H-NMR: δ ppm, DMSO-d₆/D₂O = 20/1, Vol.
0,68–2,40
2,60–4,60
4,60–5,40
IR (KBr, cm^–1): 1680, 1180–900
Durch diese Daten wurde bestätigt, dass das erhaltene Produkt ein Mannan/Cholesterin-Derivat (CHM) der folgenden Formel (7b) ist:
Daneben wurde das obige mit Aceton gereinigte Produkt mit "Preparative TLC" in gleicher Weise wie in BEISPIEL 1-2 analysiert, wobei kein Cholesterin-Dimer (Rf = 0,65) der Formel (5a) erkannt wurde. Außerdem wurde das acetongereinigte Produkt mittels ¹H-NMR analysiert, und der Gehalt an Cholesterin-Dimer wurde aus dem Protonenverhältnis berechnet. Das Ergebnis ließ kein Cholesterin-Dimer erkennen. Daher ist der Gehalt des Cholesterin-Dimers der Formel (5a) in dem acetongereinigten Produkt 0 Gew.-%.
Das ¹H-NMR-Spektrum der auf die oben beschriebene Weise erhaltenen Verbindung der obigen Formel (7b) ist in 3 gezeigt. Der Anteil des Einbaus der Cholesterylgruppe in das Mannan in dem Mannan-Cholesterin-Derivat wird in gleicher Weise wie in BEISPIEL 1-2 berechnet. Aus dem Ergebnis ergibt sich, dass der Anteil der Substitution mit Cholesterylgruppen 1,1 Gruppen pro 100 Monosaccharideinheiten beträgt.
Dann wurde das oben erhaltene acetongereinigte Produkt durch Ultrazentrifugation in gleicher Weise wie in BEISPIEL 1–3 weiter gereinigt, um das Mannan mit niedrigerem Molekulargewicht (unsubstituiertes Mannan) zu entfernen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
BEISPIEL 2-2
[Synthese 2 eines Mannan-Cholesterin-Derivats (CHM)]
Nach dem gleichen Verfahren wie für die Umsetzung in BEISPIEL 1-2 wurden ein handelsübliches Mannanprodukt (ein Produkt der Firma Sigma) und N-(6-Isocyanatohexyl)cholesterylcarbamat zur Reaktion gebracht. Die eingesetzten Mengen eines jeden Ausgangsmaterials waren wie nachfolgend angegeben:

1) Mannan (Mw = 85.000): 5 g (31 mmol als wasserfreie Mannose)
2) N-(6-Isocyanatohexyl)cholesterylcarbamat: 138 mg (0,25 mmol)
3) Pyridin: 3,7 g (47 mmol)
4) Dimethylsulfoxid: 75 ml

Nach Beendigung der Reaktion erfolgte die Reinigung durch Umfällung mit Aceton als Lösungsmittel. Dann wurde das Produkt dialysiert und anschließend gefriergetrocknet, wodurch 4,05 g (Ausbeute = 78,8%) eines weißen Feststoffs erhalten wurden.
Die Ergebnisse der Analyse des obigen acetongereinigten Produkts mittels ¹H-NMR und IR sind nachfolgend angegeben:
¹H-NMR: δ ppm, DMSO-d₆/D₂O = 20/1, Vol.
0,68–2,40
2,60–4,60
4,60–5,40
IR (KBr, cm^–1): 1680, 1180–900
Durch diese Daten wurde bestätigt, dass das erhaltene Produkt ein Mannan/Cholesterin-Derivat (CHM) der obigen Formel (7b) ist.
Daneben wurde das obige mit Aceton gereinigte Produkt mittels "Preparative TLC" in gleicher Weise wie in BEISPIEL 1-2 analysiert, wobei sich kein Cholesterin-Dimer (Rf = 0,65) der Formel (5a) erkennen ließ. Außerdem wurde das acetongereinigte Produkt mittels ¹H-NMR analysiert und der Gehalt an Cholesterin-Dimer wurde aus dem Protonenverhältnis berechnet. Das Ergebnis ließ kein Cholesterin-Dimer erkennen. Daher ist der Gehalt an Cholesterin-Dimer der Formel (5a) in dem acetongereinigten Produkt 0 Gew.-%.
Das ¹H-NMR-Spektrum des auf die oben beschriebene Weise erhaltenen Mannan-Cholesterin-Derivats (CHM) ist in 4 gezeigt. Der Anteil des Einbaus von Cholesterylgruppen in das Mannan in dieser Verbindung wird in gleicher Weise wie in BEISPIEL 1-2 berechnet. Aus dem Ergebnis ergibt sich, dass der Anteil der Substitution mit Cholesterylgruppen 0,8 Gruppen pro 100 Monosaccharideinheiten beträgt.
Dann wurde das oben erhaltene acetongereinigte Produkt durch Ultrazentrifugation in gleicher Weise wie in BEISPIEL 1-3 weiter gereinigt, um das Mannan mit niedrigerem Molekulargewicht (unsubstituiertes Mannan) zu entfernen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4
BEISPIELE 3 bis 6
[Herstellung eines hochreinen Polysaccharids, das Sterylgruppen enthält]
Unter Verwendung jeweils eines Polysaccharids natürlichen Ursprungs, nämlich Xyloglucan (BEISPIEL 3), Amylose (BEISPIEL 4), Dextran (BEISPIEL 5), und eines synthetischen Polysaccharids, nämlich Hydroxyethylcellulose (BEISPIEL 6), wurde ähnlich den Umsetzungen in den BEISPIELEN 1-2 und 1-3 jeweils ein hochreines Polysaccharid-Cholesterin-Derivat erhalten.
Der Anteil des Einbaus von Cholesterylgruppen, die Abtrennungsrate für das Cholesterin-Dimer (Gew.-%) und dessen Gehalt (Gew.-%) wurden mit entsprechenden analytischen Methoden bestimmt. Der Gehalt des unsubstituierten Polysaccharids wurde auch jeweils vor und nach der Ultrazentrifugation bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefasst.
Aus Tabelle 5 sieht man, dass Cholesterylgruppen in ähnlicher Weise in andere Polysaccharide als Pullulan und Mannan eingeführt werden können.
BEISPIEL 7-1
[Synthese eines N-(6-Isocyanatohexyl)stearylcarbamats (Synthese von Stearylpullulan)]
In einem Auberginenkolben mit 1 l Fassungsvermögen wurden 3,48 g (12,9 mmol) Stearylalkohol vorgelegt und hierzu wurden 50 ml Toluol zum Lösen gegeben, wozu außerdem noch 2,04 g (25,8 mmol) Pyridin gegeben wurden. Zu dieser Mischung wurden 30 g (178 mmol, 14,8 Äq.) Hexamethylendiisocyanat gelöst in 50 ml Toluol gegeben, und dann wurde die resultierende Mischung etwa 3 Stunden bei 80°C unter Stickstoffatmosphäre umgesetzt. Nach Beendigung der Reaktion wurden Toluol und überschüssiges Hexamethylendiisocyanat unter reduziertem Druck entfernt, wodurch sich schwachgelbe Kristalle bildeten. Die Kristalle wurden entnommen und in etwa 1 l Hexan gegeben, und die Mischung kräftig geschüttelt und dann wurde der Überstand abdekantiert. Dieses Waschverfahren wurde viermal wiederholt, wonach das Produkt unter reduziertem Druck 3 Stunden bei Raumtemperatur getrocknet wurde, wodurch 2,75 g eines weißen Feststoffs (Kristalle) erhalten wurden (Ausbeute: 48,7%).
Das Ergebnis der Analyse dieses Produkts mittels ¹H-NMR ist nachfolgend angegeben.
¹H-NMR: δ ppm, in CDCl₃, TMS
0,88 (t, d = 6,8 Hz, 3H)
1,10–1,65 (m, 40H)
3,14–3,18 (m, 2H)
3,29 (t, J = 6,6 Hz, 2H)
4,01–4,06 (m, 2H)
4,61 (m, 1H)
Durch diese Daten wird bestätigt, dass das erhaltene Produkt N-(6-Isocyanatohexyl)stearylcarbamat der folgenden Formel (8) ist:
Daneben wurde das obige mit Aceton gereinigte Produkt mit "Preparative TLC" in gleicher Weise wie in BEISPIEL 1-1 analysiert, wobei die Anwesenheit eines Stearyldimers (Rf = 0,68) der folgenden Formel (9) erkannt wurde. Außerdem wurde die Bande für das Stearyl-Dimer auf der TLC mit Aceton extrahiert und quantitativ analysiert, wodurch bestätigt wurde, dass das Stearyl-Dimer in den weißen Kristallen in einer Menge von 3 Gew.-% vorlag.
BEISPIEL 7-2
[Synthese eines Stearyl-Pullulan-Derivats (STP)]
In einem Auberginenkolben mit 100 ml Fassungsvermögen wurden 2,0 g (12,3 mmol als wasserfreie Glucose) Pullulan (Mw = 108.000) vorgelegt. Hierzu wurden 30 ml Dimethylsulfoxid gegeben und die resultierende Mischung wurde zum Lösen bei 80°C unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Zu dieser Mischung wurde eine Lösung von 70 mg (0,148 mmol) des in BEISPIEL 7-1 synthetisierten N-(6-Isocyanatohexyl)stearylcarbamats in 1,47 g (14,6 mmol, 1,2 Äq.) Pyridin gegeben, und die Mischung wurde 2 Stunden bei 90°C umgesetzt.
Nach Beendigung der Reaktion wurde das Dimethylsulfoxid unter reduziertem Druck abdestilliert und der resultierende ölige Rückstand wurde zur Reinigung des Produkts unter Bildung eines Niederschlags in 300 ml Aceton getropft. Nach Entfernung des Überstands wurden dem resultierenden Niederschlag 200 ml Aceton zugegeben und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt und unter reduziertem Druck getrocknet. Die auf diese Weise erhaltenen Feststoffe wurden in Dimethylsulfoxid gelöst und die Lösung wurde in einen Dialysesack gegeben (Spectra/Por3, ein Produkt der Firma Spectropor, mit einem Ausschlussmolekulargewicht von 3500) und 1 Woche gegen destilliertes Wasser dialysiert. 150 ml der resultierenden Polymerlösung wurden auf übliche Weise gefriergetrocknet, wodurch 1,60 g eines weißen Feststoffs (im Folgenden gelegentlich als "acetongereinigtes Produkt" bezeichnet) erhalten wurden (Ausbeute 79,2%).
Die Ergebnisse der Analyse dieses acetongereinigten Produkts mittels ¹H-NMR und IR waren wie nachfolgend angegeben.
¹H-NMR: δ ppm, DMSO-d₆/D₂O = 20/1, vol.
0,86–1,70
2,60–4,60
4,60–5,30
IR (KBr, cm^–1): 1680, 1180–900
Durch diese Daten wurde bestätigt, dass das erhaltene Produkt ein Stearyl-Pullulan-Derivat (nachfolgend manchmal mit STP abgekürzt) der folgenden Formel (10) ist:
Daneben wurde das obige mit Aceton gereinigte Produkt mit "Preparative TLC" in gleicher Weise wie in BEISPIEL 1-2 analysiert, wobei kein Stearyl-Dimer der Formel (9) zu erkennen war.
Außerdem wurde das acetongereinigte Produkt mittels ¹H-NMR analysiert und der Gehalt des Stearyl-Dimers wurde aus dem Protonenverhältnis berechnet. Das Ergebnis ließ kein Stearyl-Dimer erkennen. Daher ist der Gehalt an Stearyl-Dimer der Formel (9) in dem acetongereinigten Produkt 0 Gew.-%.
Aus dem Wert für die Integration über die Peakfläche des ¹H-NMR-Spektrums wird der Anteil des Einbaus der Stearylgruppen in das Pullulan nach der folgenden Gleichung (B) berechnet: (100 + 2x)/43x = b/a (B)in der die Symbole bedeuten:

a:: Peakfläche der Stearylgruppe (δ = 0,86 – 1,70)
b:: Peakfläche von Pullulan (δ = 4,60 – 5,30)
x:: Anteil der Substitution mit Stearylgruppen pro 100 Monosaccharideinheiten.

Bei der Berechnung findet man, dass der Anteil der Substitution mit Stearylgruppen in dem Stearyl-Pullulan-Derivat 0,8 Gruppen pro 100 Monosaccharideinheiten beträgt.
Das oben erhaltene acetongereinigte Produkt wurde wie in BEISPIEL 1-3 durch Ultrazentrifugation weiter gereinigt, um das Pullulan mit niedrigerem Molekulargewicht (nicht umgesetztes Pullulan) zu entfernen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt.
Tabelle 6
BEISPIEL 8-1
[Reinigung mit aprotischem polarem Lösungsmittel]
10 g des in BEISPIEL 1-2 erhaltenen Pullulan-Cholesterin-Derivats wurden in 70 g Dimethylsulfoxid (DMSO) als aprotischem polarem Lösungsmittel gelöst. Dazu wurden 1400 g Wasser gegeben und die Mischung wurde mit einem Magnetrührer 10 Minuten lang gerührt. Nach dem Rühren wurde die Mischung als solche 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen. Der Überstand wurde abdekantiert, worauf dem Rückstand die gleiche Menge Wasser wie extrahiert zugegeben wurde, und die resultierende Mischung wurde 10 Minuten mit einem Magnetrührer gerührt, gefolgt von einer einstündigen Pause mit Stehenlassen. Dieses Vorgehen wurde zur Reinigung zweimal wiederholt. Dann wurde die untere Phase mit 1000 g Wasser gemischt, worauf die Mischung 2 Tage lang gefriergetrocknet wurde. Als Ergebis wurden 7,5 g eines weißen Feststoffs erhalten (Ausbeute = 75%). Die Ergebnisse sind in den Tabellen 7 und 8 zusammengefasst.

Durch Zugabe von Wasser zu dem resultierenden weißen Feststoff wurde eine 0,2 Gew.-%ige wässrige Lösung hergestellt, die mit einem Ultraschallgerät mit Prüfkopf (TOMY der Firma URP mit 5 mm äußerem Prüfkopfdurchmesser) 15 Minuten bei 40 W einer Ultraschallbehandlung unterzogen wurde. Eine nach der Ultraschallbehandlung genommene Probe wurde mittels Größenausschlusschromatographie (SEC) unter den oben angegebenen Bedingungen untersucht. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt. In 5 findet sich kein Peak, und daher sieht man, dass ein Pullulan-Cholesterin-Derivat mit hoher Reinheit erhalten wurde, aus dem unsubstituiertes Pullulan entfernt worden war. Bedingungen für die SEC-Analyse:

BEISPIELE 8-2 bis 8-6
Die Reinigung eines jeden Produkts erfolgte mit jedem der hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharide und mit den in den Tabellen 7 und 8 angegebenen aprotischen polaren Lösungsmitteln unter den in den Tabellen 7 und 6 angebenen Reinigungsbedingungen nach der gleichen Vorgehensweise wie in BEISPIEL 8-1. Bei allen Reinigungsvorgängen wurde das Verfahren zur Phasentrennung in zwei Phasen zweimal wiederholt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 7 und 8 zusammengefasst.
Bei der SEC-Analyse wurde in allen Beispielen bei keinem der Polysaccharide mit hydrophoben Gruppen ein Peak für das unsubstituierte Polysaccharid gefunden, und daher wurde bestätigt, dass alle Polysaccharidprodukte mit hydrophoben Gruppen auf nahezu 100 Gew.-% Reinheit aufgereinigt worden waren.
Bei der Reinigung mit einem aprotischen polaren Lösungsmittel konnte ein Reinigungsdurchsatz von 10 g in etwa 5 Stunden erreicht werden, und die Ausbeute war ebenfalls besser, da sie 65 Gew.-% oder höher war. Die Reinigung eines jeden Produkts dauerte etwa 2 Stunden. Im Prinzip unterliegt die zu reinigende Menge keiner Beschränkung, und es lässt sich leicht eine Massenreinigung realisieren. Wenn man dies berücksichtigt sieht man, dass die Reinigung mit einem aprotischen polaren Lösungsmittel für eine großtechnische Massenproduktion sehr effektiv ist.
GEWERBLICHE ANWENDBARKEIT
Das nach dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren erhaltene Polysaccharidprodukt, das hydrophobe Gruppen enthält, kann als Überzugsmaterial zum Überziehen von Arzneimittelträgern mit darin verkapselten Arzneimitteln verwendet werden. Beispielsweise kann das Produkt als Üerzugsmaterial verwendet werden, um Arzneimittelträger wie Liposomen-Mikrokapseln, Mikrokügelchen, O/W-Emulsionen und Erythrozytenschatten zu überziehen. In diesem Fall kann das hochreine, hydrophobe Gruppen enthaltende Polysaccharid, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurde, sicher als medizinisches Material verwendet werden, da es als hochreines Produkt vorliegt, das nur geringe Mengen an Nebenprodukten und an unsubstituiertem Polysaccharid enthält.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines hochreinen Polysaccarids, das hydrophobe Gruppen enthält, umfassend – einen ersten Verfahrensschritt zur Herstellung einer eine Isocyanatgruppe enthaltenden hydrophoben Verbindung, wobei ein Mol eines eine Hydroxygruppe enthaltenden Kohlenwasserstoffs mit 12–50 Kohlenstoffatomen oder eines Sterins mit einem Diisocyanat der Formel OCN-R¹-NCO, worin R¹ ein Hydrocarbyl mit 1–50 Kohlenstoffatomen ist, umgesetzt wird, und – einen zweiten Verfahrensschritt zur Herstellung des Polysaccharids, das hydrophobe Gruppen enthält, die aus der Kohlenwasserstoffgruppe mit 12–50 Kohlenstoffatomen oder der Sterylgruppe bestehen, wobei die im ersten Verfahrensschritt erhaltene hydrophobe Verbindung, die eine Isocyanatfgruppe enthält, mit ein oder mehreren Polysacchariden umgesetzt wird, wobei das Reaktionsprodukt des zweiten Verfahrens-schritts mit einem Lösungsmittel auf Ketonbasis gereinigt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polysaccharid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pullulan, Amylopectin, Amylose, Dextran, Hydroxyethylcellulose, Hydroxyethyldextran, Mannan, Levan, Inulin, Chitin, Chitosan, Xyloglucan und wasserlöslicher Cellulose.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Lösungsmittel auf Ketonbasis ein oder mehrere Lösungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aceton, Methylethylketon, Diethylketon und Diiso-propylketon umfasst.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das hydrophobe Gruppen enthaltende Polysaccharid eine durch -XH dargestellte Gruppe aufweist, in welcher X ein Sauerstoffatom oder eine durch NY dargestellte stickstoffhaltige Gruppe ist, worin Y ein Wasserstoffatom oder ein Hydrocarbyl mit 1–10 Kohlenstoffatomen ist, wobei 0,1 bis 10 -XH-Gruppen pro 100 Monosaccharideinheiten, die das Polysaccharid bilden, durch ein oder mehrere hydrophobe Gruppen, dargestellt durch die Formel (1), nämlich
ersetzt sind, wobei X die oben angegebene Bedeutung hat, R¹ ein Hydrocarbyl mit 1–50 Kohlenstoffatomen bedeutet und R² eine Kohlenwasserstoffgruppe mit 12–50 Kohlenstoffatomen oder eine Sterylgruppe bedeutet.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei R² in Formel (1) eine Sterylgruppe bedeutet.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Gehalt an dem hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharid in dem mit dem Lösungsmittel auf Ketonbasis gereinigten Produkt so hoch wie 80 Gew.-% oder mehr ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Gehalt an unsubstituiertem Polysaccharid so gering wie 20 Gew.-% oder weniger ist.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei das Produkt einen Gehalt des verunreinigenden Produkts hat, in dem beide der zwei NCO-Gruppen im Diisocyanat mit dem eine Hydroxygruppe enthaltenden Kohlenwasserstoff mit 12–50 Kohlenstoffatomen oder mit dem Sterin umgesetzt sind, der so gering wie 0,05 Gew.-% oder weniger ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das mit einem Lösungsmittel auf Ketonbasis gereinigte Produkt einer weiteren Reinigung unterworfen wird, indem das Produkt unter Ultraschallbehandlung fein in Wasser dispergiert und anschließend durch Ultrazentrifugation abgetrennt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Gehalt des hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharids im gereinigten Produkt aus der Ultrazentrifugationsabtrennung so hoch wie 98 Gew.-% oder mehr ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Gehalt an unsubstituiertem Polysaccharid so gering wie 2 Gew.-% oder weniger ist.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei der Gehalt des verunreinigenden Produkts, in dem beide der zwei NCO-Gruppen im Diisocyanat mit dem eine Hydroxygruppe enthaltenden Kohlenwasserstoff mit 12–50 Kohlenstoffatomen oder mit dem Sterin umgesetzt sind, so gering wie 0,5 Gew.-% oder weniger ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das mit dem Lösungsmittel auf Ketonbasis gereinigte Produkt ferner einem Reinigungsverfahren unterworfen wird, umfassend das Lösen des Produkts in einem aprotischen polaren Lösungsmittel, das Zumischen von Wasser zu der resultierenden Lösung, damit das unsubstituierte Polysaccharid in die wässrige Phase übergeht, und das Entfernen der durch Phasentrennung abgetrennten wässrigen Phase.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die weitere Reinigung des mit dem Lösungsmittel auf Ketonbasis gereinigten Produkts erfolgt, indem das Produkt in einer Menge des aprotischen polaren Lösungsmittels gelöst wird, die dem 3- bis 50-fachen des Gewicht des Produkts entspricht, und der resul tierenden Lösung Wasser in einer Menge zugemischt wird, die dem wenigstens 5-fachen des Gewichts der Lösung entspricht.
Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei das aprotische polare Lösungsmittel ein oder mehrere Lösungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetamid und Dimethylsulfoxid umfasst.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 13 bis 15, wobei der Gehalt des hydrophobe Gruppen enthaltenden Polysaccharids in dem mit dem aprotischen polaren Lösungsmittel gereinigten Produkt so hoch wie 98 Gew.-% oder mehr ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Gehalt an unsubstituiertem Polysaccharid so gering wie 2 Gew.-% oder weniger ist.
Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei der Gehalt des verunreinigenden Produkts, in dem beide der zwei NCO-Gruppen im Diisocyanat mit dem eine Hydroxygruppe enthaltenden Kohlenwasserstoff mit 12–50 Kohlenstoffatomen oder mit dem Sterin umgesetzt sind, so gering wie 0,02 Gew.-% oder weniger ist.