SE507207C2 - alpha-1,4-glukanlyas från alg, sätt att bryta ned terminala alpha-1,4-D-glukosidbindningar med sagda enzym samt nedbrytningsprodukten 1,5-anhydrofruktos och dess användning som läkemedel och som antioxidant - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 507 207 2 att närvaron av glukos och maltos bland reaktionsprodukterna skulle kunna resultera antingen från mindre aktivitet hos enzymet eller från dess kontamination medelst en eller flera konventionella amylolytiska enzymer. Baute, M-A. et al (Phyto- Chemistry 1987, 26 (5), 1391-3 resp. 1991, 30 (5), 1419-25) beskrev vidare att deras enzymatiska aktivitet nedbryter l,4-a- D-glukaner till 1,5-D-anhydrofruktos och omvandlar sedan detta socker till antibiotika mikrotecin och pentenomycin.

I den kända tekniken finns ingen beskrivning av att l,5-anhydro- fruktos skulle kunna användas som en syreradikalfângare eller ett antioxidationsmedel och som ett substitut för andra socker och deras derivat.

Beskrivning av uppfinningen Det nya enzymet isolerades från två rödalger Qracilariogsis lemaneifogmis och Qracilaria verrucosa. Den reaktion som katalyseras är klyvning av de terminala a-1,4-D-glukosidbind- ningarna hos en a-1,4-glukan, successivt från kedjans icke- reducerande ändar under frisättning av 1,5-anhydrofruktos. 1. När en linjär a-1,4-glukan, såscmimaltos, maltosackarider och amylos, används som ett substrat: Linjär a-glukan ---- --> AF + Glukos 1) Produkterna är AF och glukos. Utbytet av AF (%) = (n-1)/n x 100.

Utbytet av glukos (%) = 1/n x 100. n anger denna a-glukan: polymerisationstal. Exempelvis, om glukanen har 100 glukosen- heter, är utbytet av AF 99%, medan utbytet av glukos är 1%. 2. När en förgrenad glukan (a-lA-glukan med a-LS-förgre- ningar), såsom amylopektin och glykogen, används som ett substrat: Förgrenad glukan ---- --> AF + neo-limit dextrin 2) Produkterna är AF och ett neo-limit dextrin. Enzymet frisätter AF från de icke-reducerande ändarna och nedbrytningen hejdas när man kommer till en a-1,6-bunden glukosenhet. Därför beror 10 15 20 25 30 35 507 207 3 p, utbytet av AF på kedjelängden med icke-reducerande ändar i hela a-glukanmolekylen.

Föreslagen benämning på detta enzym är: Exo-a-1,4-glukanlyas; a-1,4-glukan-1,5-anhydrofruktoseliminas; a-1,4-glukanexolyas; systematisktnamn:a-1,4-glukan-exo-4-lyas(1,5-anhydrofruktos- bildande), (EC 4. 2. 2. X) Den föreslagna benämningen på detta enzym är i enlighet med regler som uppställts av the Enzyme Commission of the Inter- national Union of Biochemistry. Siffran X kommer att numreras av Kommissionen efter en ansökan.

Sålunda är en aspekt av uppfinningen inriktad på ett enzym som har förmåga att successivt klyva de terminala a-1,4-D-glukosid- bindningarna från de icke-reducerande ändarna hos en a-1,4- glukan, vilket enzym väljes från den grupp som består av a-l,4- glukanlyas som isolerats från en alg och enzymatiskt liknande derivat och analoger av nämnda a-1,4-glukanlyas som inte härstammar från svamp.

I en utföringsform av denna aspekt av uppfinningen är algen en rödalg, och i en föredragen utföringsform väljas rödalgen från den grupp 80111 består av och ac' a verrucgsa.

I en ytterligare föredragen utföringsform av denna aspekt av uppfinningen är enzymet i renad form. I en annan föredragen utföringsform är enzymet :i immobiliserad form. Enzymet kan immobiliseras på vilket som helst lämpligt bärarmaterial, såsom glaspärlor, fibrer och olika polymerer.

I en ytterligare detaljerad utföringsform av denna aspekt av uppfinningen har enzymet en isoelektrisk punkt av ca 3,9 och en ungefärlig molekylvikt av 111.000 genom SDS-gelelektrofores och 98.000 genom gelfiltreringskromatografi samt följande ungefär- l0 15 20 25 30 35 40 45 50 507 207 4 liga aminosyrasammansättning bestämt som aminosyrarester per molekyl genom aminosyraanalys: Asx 155, Thr 71, Ser 57, Glx 94, Pro 49, Gly 98, Ala 52, Cys 15, Val 70, Met 21, Ile 41, Leu 61, Tyr 62, Phe 52, His 16, Lys 37, Arg 48, och Trp inte bestämd.

I en ytterligare detaljerad utföringsform har enzymet en amino- syrasekvens som omfattar följande fragment: Fragment 1, (totalt 21 aminosyrarester): 1 5 10 Tyr(Val) Met Val Pro(Thr) Asn Met Tyr Tyr Glu Asn His 1s ' zo Gly Tyr Glu Pro Met Val Thr Gln Tyr Asn Fragment 2, (totalt 30 aminosyrarester): 1 5 10 Gly Leu Val Pro Gln Thr Asp Ile Thr Pro Phe Leu 15 20 Arg Asp Asn Asp Glu Gly Gln Asn Tyr Glu Val Asn 25 30 Gln Thr Leu Arg Glu Arg Fragment 3, (totalt 25 aminosyrarester): 1 5 10 Gly(Va1) Ala Ala Glu Gln Asn Gly Gly Thr Glu Thr 15 20 Ile Thr Phe Thr Asp Asn Pro Tyr Arg Tyr Val Phe 25 Gly Gly Fragment 4, (totalt 25 aminosyrarester): 1 5 Gly(Ser) Leu Asn Thr(Leu) Tyr Thr Asp Glu Phe(Asp) 10 15 20 Pro Leu Val Phe Glu Val Phe Pro Leu Gly Asn Asn 25 Arg Ala Asp(Leu) Gly 10 15 20 25 30 35 507 207 s '_ En annan aspekt av uppfinningen är inriktad på ett sätt att klyva terminala a-l,ll-D-glukosidbindningar från en a-l A-glukans icke-reducerande ändar, varvid nämnda a-1,4-glukan bringas i kontakt med ett enzym enligt uppfinningen.

I en utföringsform av denna aspekt av uppfinningen omfattar a- 1,4-glukanen förgrenade kedjor och enzymet enligt uppfinningen utökas med ett avgrenande enzym, såsom pullulanas.

I en föredragen utföringsform av denna aspekt av uppfinningen omfattar nedbrytningsprodukten 1,5-anhydrofruktos.

En ytterligare aspekt av uppfinningen är inriktad på 1,5- anhydrofruktos för användning som en syreradikalfångare eller ett antioxidationsmedel och/eller som ett substitut för andra socker och deras derivat. Ännu en annan aspekt av uppfinningen är inriktad på 'ett förfarande för framställning av ett enzym som har förmåga att successivt klyva terminala a-1,4-D-glukosidbindningar från de icke-reducerande ändarna hos en a-1,4-glukan, varigenom det isoleras från en alg genom extraktion och rening på i och för sig känt sätt, eller med användning av andra lämpliga tekniker, såsom genteknik eller kemisk syntes med användning av en nukleotidsekvens som kodar för ett a-1,4-glukanlyas hos alg eller en aminosyrasekvens som hänför sig till ett a-l,4-glukan- lyas hos alg.

Ytterligare en annan aspekt av uppfinningen är inriktad på en antikropp som binder till aminosyrasekvensen hos ett enzym enligt uppfinningen.

En ytterligare aspekt av uppfinningen är inriktad på en DNA- eller RNA-prob som känner igen en nukleotidsekvens som kodar för ett enzym enligt uppfinningen. 10 15 20 25 30 35 5Û7 2Ü7 6 De två sistnämnda aspekterna av uppfinningen är användbara vid sökning av enzymatiskt liknande derivat och analoger av det isolerade a-1,4-glukanlyaset enligt uppfinningen.

Aminosyrasekvenserna hos fragmenten 1-4 kan användas för att syntetisera DNA- eller RNA-prober. Antikroppar som binder till aminosyrasekvensen hos det isolerade a-1,4-glukanlyaset enligt uppfinningen har redan framställts.

Genom att börja från aminosyrasekvensen hos a-1,4-glukanlyaset enligt uppfinningen, vilket har isolerats från en alg, kommer det att vara möjligt att skapa och/eller hitta enzymatiskt liknande derivat och analoger. Eftersom det har beskr_ivits besläktad enzymatisk aktivitet i några svampar, har emellertid en disclaimer från skyddsomfånget använts för att fastställa att de enzymatiskt liknande "derivaten och analogerna" av a-l,4- glukanlyaset är sådana som inte härstammar från svamp.

Med användning av det renade alg-enzymet enligt uppfinningen var det möjligt att komma till följande slutsatser: 1). Reaktionen från stärkelse till AF katalyserades av endast ett enzym, lyaset enligt uppfinningen, inte av flera enzymer eller ett enzymsystem som postulerats av Baute et al. (1988).

Förutom substratet och enzymet, behöver enzymreaktionen inte några andra kofaktorer eller aktivatorer. Detta enzym är hög- specifikt för a-1,4-glukosidbindningar och frisätter AF från de icke-reducerande ändarna hos ett a-glukan. Det kan inte nedbryta endo-a-1,4-glukosidbindningar, a-1,6- och a-1,3-glukosidbind- ningar eller andra typer av glukosidbindningar. 2). Produkterna (AF, neo-limit dextrin, glukos) och deras utbyten i den enzymatiska reaktionen beror på typen av substrat och dess polymerisationstal (för detaljerad beskrivning, se formlerna 1) och 2) ovan). 10 15 20 25 30 35 507 207 7 _ 3). Enzymet var en enda polypeptid med en molekylvikt av 111.000 enligt observatiruxi SDS-gelelektrofores, och 98.000 enligt gel- filtreringskromatografi på Sephacryl S-200. 4). Analys av enzymets aminosyrasammansättning visade stora mängder av Asp/Asn, Gly och Glu/Gln. 5). Enzymets isoelektriska punkt (pI) var kring 3,9, enligt isoelektrofokusering. 6). Enzymet kan nedbryta maltos, maltosackarider, amylos, stärkelse, amylopektin, glykogen och granuler av nativ floride- stärkelse. 7). Enzymet uppvisade ett vidsträckt pH-optimumomrâde från pH 12,5 till 7,0 för maltos som substrat och från pH 3,5 till 7,5 för amylopektin som substrat. 8). Den optimala temperaturen för algenzymets aktivitet var kring 50°C när maltos eller amylopektin användes som ett substrat under analysbetingelserna. Arrhenius-aktiveringsenergi- erna var 45,8 och 44,0 kJ mol4 för maltos resp. amylopektin som substrat. 9). Man fann endast en form av detta enzym i cellfria extrakt från de två rödalgerna. Dvs det har inte isoenzymer. 10) . Algenzymet inhiberades starkt av en glukosanalog deoxinoji- rimycin och sulfhydrylgrupp (-Sl-I)-blockerande medel, såsom 39612 och p-kloromerkuribensoesyra (PCMB). Enzymet inhiberades också av maltitol och av amylopektin när maltos användes som ett substrat. 11). Antikroppar har framkallats mot enzymet som renats från Qracilggiopsis lemaneiformis som insamlats i Kina. Dessa anti- kroppar korsreagerade med lyaser som renats från 10 15 20 25 30 35 507 207 8 lemaneiformis som insamlats i Venezuela och Qgacilagia verrucosa som insamlats i Venezuela. 12). Partiella aminosyrasekvenser hos a-1,4-glukanlyas med en total längd av 101 aminosyrarester erhölls. Datorsökning genom protein- och peptidsekvensdatabanker indikerade att dessa sekvenser inte tidigare rapporterats. 13). Eftersom enzymet är nytt finns det ingen rutinanalysmetod tillgänglig för kvantifiering av enzymaktiviten. Två analys- metoder har nu etablerats, varvid den ena mäter frisättning av 1,5-anhydrofruktos från maltos eller amylopektin medelst enzymet, och den andra mäter frisättning av glukos när maltos används som ett substrat. 14). 1,5-anhydrofruktos (AF) befanns vara ett socker med hög reducerande förmåga eftersom den kan reducera 3,5-dinitrosali- cylsyrareagens vid rumstemperatur. 15). Ett effektivt reningsförfarande har utvecklats för rening av enzymet. Nyckeln till framgång med reningen är att man fann att stärkelse specifikt kan absorbera enzymet. Stärkelse användes därför som ett affinitetsmaterial, och med endast ett affinitetskromatografisteg renades enzymet till mer än 90% renhet. Reningsfaktorn var 114 och âtervinningen var över 100%.

Enzymet renades vidare till homogenitet genom kromatografi på Q-Sepharos- och Sephacryl S-200-kolonner. 16). Algenzymet uppvisar ingen produktinhibering, dvs AF, neo- limit dextrin och glukos, vilka ackumulerar under enzymreaktio- nen, har försumbar effekt på enzymreaktionshastigheten, och enzymreaktionen kan fortskrida tills substratet är fullständigt nedbrutet. I en enzymkoncentration av 6 pg protein per ml, vid 30°C, var den tid som krävdes för en fullständig nedbrytning av 1% maltoslösning 1 h, för 2% maltoslösning 3 h, för 5% maltos- lösning 10-24 h, för 2% maltoheptaos 10-24 h. Detta är i skarp kontrast till många polysackariders depolymerisationsenzymer, 10 15 20 25 30 35 507 207 9 __ vars reaktion avstannar med ackumulering av produkter eller med minskning av substratstorleken.

Enkla steg för framställning av högrenat AF: A: vändnin av ös i st" els som t ial. En vattenhaltig lösning av löslig stärkelse (2%) inkuberas vid 30°C under 24 h i närvaro av 5,2 pg a-1,4-glukanlyas per ml reak- tionsblandning. Utbytet av AF är 55%. Högrenat AF kan lätt erhållas genom att låta reaktionsblandningen passera genom en Sephadex G-25-kolonn. Il denna kolonn kan AF (molekylvikt = 162,14) väl separeras från neo-limit dextrin vars molekylvikt är flera tusen eller mera.

Om i den ovan angivna reaktionsblandningen det avgrenande enzymet pullulanas tillsättes i en koncentration av 1,2 enheter per ml reaktionsblandning ökar utbytet av AF till 73%.

B: gnvändging av gmylopektin som utgångsmaterial. Amylopektin (2%) inkuberas vid 30°C under 24 h i närvaro av 5,2 pg a-1,4- glukanlyas per ml vattenhaltig reaktionsblandning. Utbytet av AF är 53%. Högrenat AF kan erhållas såsom ovan beskrivits. 1 närvaro av pullulanas i en mängd av 1,2 enheter per ml reak- tionsblandning ökar utbytet av AF till 80%.

Notera att pullulanas är ett kommersiellt tillgängligt enzym.

Det används tillsamans med ß-amylas i industrin för storskalig produktion av maltos från stärkelse. I våra experiment fann vi att vårt enzym kan fungera samverkande med pullulanas för att öka utbytet av 1,5-anhydrofruktos med 18 till 27%, beroende på om löslig stärkelse eller amylopektin används som ett substrat.

[I motsats till detta innehöll det AF-preparat som erhållits av Baute et al. (1988, sid 3403) en hel del föroreningar. De måste tillsätta jästceller för att konsumera glukosen i deras AF- preparat och sedan separera jästcellerna. AF-preparatet fick sedan passera genom en jonbytarkolonn. Eftersonnde inte hade ett förfarande för kvantifiering av AF måste de använda TLC eller 10 15 20 25 30 35 507 207 10 HPLC för att övervaka AF-toppen i kromatografin. Genom detta steg var deras renhet endast 90%. Högrenat AF erhölls genom separation på TLC-plattor. AF-fläcken extraherades sedan från silikagel. Enligt deras rapport var slutliga utbytet av AF 40-50%. Det är uppenbart att deras förfarande för framställning av AF är tidskrävande och komplicerat, och inte lämpligt för produktion av högrenat AF i pilotskala eller stor ska1a.] 17). Enzymet är mycket stabilt (vid 4°C i ett år utan synbar förlust av aktivitet) och kan lyofiliseras som torrt pulver.

Alla dessa ovannämnda egenskaper gör detta algenzynn mycket lämpligt för industriell produktion av AF och neo-limit dextrin, såsom dess vidsträckta pH-optimum, stabilitet och avsaknad av produktinhibering. Enzymet kan renas från alger, som odlas över -hela världen. Alternativt kan enzymet framställas av bakterier genom rekombinant DNA-tekniker. Som ett led i detta har hittills ca 10% av enzymets aminosyrasekvenser analyserats. Dessa sekvenser kommer att underlätta arbetet med inriktning på erhållande av enzymets hela nukleotidsekvens. z ets enl' t f' v e A. Enzymet kan användas som ett analytiskt reagens: 1). För att bestämma halterna av maltosackarider (inbegripet maltos) och amylos i prover. Principen är den att enzymreaktio- nens produkt, 1,5-anhydrofruktos (AP), kan reagera med dinitro- salicylsyrareagens och reaktionen slutföra inom nägra minuter vid rumstemperatur. Reaktionsblandningen har en absorbtionstopp vid 546 nm. Absorbansen är proportionell mot mängden närvarande AF. Denna metod ger snabbhet, enkelhet och rimlig känslighet. 2). För bestämning av polysackaridstruktur. Detta enzym är strikt när det gäller nedbrytning av a-1,4-glukosidbindning och nedbryter polysackarider från deras icke-reducerande ändar. 10 15 20 25 30 35 5Û7 207 11 B. Enzymet kan användas för framställning av AF och neo-limit dextrin: 1). För produktion av AF. AF är ett socker med hög reducerande förmåga och kan därför användas som en syreradikalfångare i läkemedel och som antioxidationsmedel i livsmedelsindustrin.

Exempel på industrier där antioxidationsmedel används är olje- och fettindustrin, livsmedelsindustrin och kosmetika- samt läke- medelsindustrier. AF kan användas som ett substitut för andra socker och sockerderivat, såsom fruktos, sorbitol, xylitol etc. 2). För framställning av neo-limit dextrin. Neo-limit dextrin är ett specifikt substrat för a-amylasanalys. När amylopektin används som ett substrat är, förutom AF som reaktionsprodukt, en annan produkt ett neo-limit dextrin, som har endast en glukosenhet på förgreningarna, och det är därför resistent mot hydrolys av ß-amylas och a-glukosidas. a-amylasaktivitet analyseras rutinmässigt i bryggeriindustrin, agronomi och forskning. Det substrat som nu är tillgängligt på marknaden är ett ß-limit dextrin erhållet genom ß-amylas-hydrolysering av amylopektin. Emellertid finns där 1-3 glukosenheter vid förgreningspunkterna (a-1,6-bindningar) och därför är det också benäget att hydrolyseras av a-glukosidas. tal d k k e ise ' v z et 1). Stärkelse var ett kraftfullt affinitetsmedium för rening av a-1,4-glukanlyaset från rödalg, eftersom enzymaktivitetstoppen just överlappade enzymproteinets absorbanstopp'vid 280 nm. Såsom avslöjas av SDS-PAGE uppvisade enzympreparatet efter denna stärkelsekolonn ett a-1,4-glukanlyasband och ett svagt band av ett kontaminerande protein. Detta kontaminerande protein hade en molekylvikt av 97.000 och var synligt endast när provet var överbelastat. Det eliminerades genom efterföljande gelfiltre- ringskromatografi på Sephacryl S-200. a-1,4-glukanlyas renades till homogenitet genom dessa förfaranden och såsom framgick 10 15 20 25 30 35 507 207 12 genom silverfärgning. Det renade a-1,4-glukanlyasets specifika aktivitet var 93,3 U mg* protein. Utbytesmängden efter stärkel- sekolonnen var vanligen större än 100% och reningsfaktorn var 114 (Tabell I): TABELL I Rening av a-1,4-glukanlyas från Qracilariopsis lemangifogmis Fraktion Total Total Specifik Renings- Utbyte Aktivitet Protein Aktivitet faktor (%) (v) (ms) (v mqfi 1. Cell-fritt extrakt 21,2 65,8 0,322 1 100 -2. Stärkelsekolonn 24,7 0,673 36,7 114 116 3. Sephacryl S-200 16,1 0,172 93,3 290 76 Vid pH 6,6 hade a-1,4-glukanlyas en förmåga att specifikt adsorbera på stärkelsekolonnen så starkt att 1 M NaCl i buffert A (50 mn citrat-Na0H (pH 6,6)) inte kunde deadsorbera det. a- 1,4-glukanlyas kunde emellertid elueras med amylopektin, glykogen och maltoheptaos i en koncentration av 8 mg ml'1.

Pullulan, maltos och maltotetraos var mindre effektiva för eluering av enzymet från stärkelsekolonnen (Tabell II), medan glukos var helt ineffektivt. I dessa experiment uppsamlades så mycket som 5 gånger kolonnvolymen. Vid högt pH, exempelvis 50 mM bicin-NaOH (pH 8,2), var enzymets bindning på stärkelse- kolonnen lös och det eluerades med efterföljande tvättning med samma buffert. Varken ConA-Sepharose eller cykloheptaamylos- Sepharose 6B var effektiva för rening av enzymet på grund av låg återvinningsgrad. 10 15 20 25' 30 35 507 207 13 "_ Tabell II Olika glukaners (8 mg ml*) effektivet vid eluering av a-1,4- glukanlyas från stärkelsekolonn. Kolonnvolymen var 1 ml, och 5 ml eluat sammanfördes. Återvinningsgraden av a-1,4-glukanlyas som eluerats med amylopektin användes som 100%.

Glukan Elueringseffektivitet (%) .EILLLL ''''''''''''''''''''''''''''''''''''''' "o ''''''''''''' " .ZLILLL '''''''''''''''''''''''''''''''''''''' "ššfl ''''''''''' " .1;ll;l;;;;; '''''''''''''''''''''''''''''''' "ššfš ''''''''''' " QLILLLLQQ; '''''''''''''''''''''''''''''''' "šlfš ''''''''''' " 11.153; '''''''''''''''''''''''''''''''''''' "ššfš ''''''''''' " ;I;LZ,;;L '''''''''''''''''''''''''''''''''''' 1311 ''''''''''' " LLQLQELLÅI. '''''''''''''''''''''''''''''''' 'lll ''''''''''''' " 2). Molekylvikten hos rödalglyaset enligt uppfinningen Molekylvikten hos a-1,4-glukanlyaset från alg var 111.000 uppskattat genom SDS-PAGE. Dess nativa molekylvikt var 98.000 genom gelfiltrering. a-1,4-glukanlyas kan bilda dimer eller oligomer, eftersom enzymformer med högre molekylvikter obser- verats under reningen. Men monomeren av enzymet var alltid den dominerande formen. I cell-fritt extrakt observerades endast monomerformen.

För aktiv färgning med användning av I2/KI-lösning uppträdde a-1,4-glukanlyasbandet som en klar area mot gelens mörkblåa bakgrund. Efter några dagar i 5% HAC och 10 volym-% glycerol 10 15 20 25 30 35 40 45 507 207 14 bleknade gelens bakgrund och den blev klar medan markörprotei- nerna och enzymbanden blev färgade och uppträdde som gula till blå band. Känsligheten är nära den hos PhastGel Blue R. 3). Isoelektrisk punkt (pl) och aminosyrasammansättning hos rödalglyaset enligt uppfinningen a-1,4-glukanlyaset från alg hade en sur pI av ca 3,9, nära pI hos markörenzymet amyloglukosidas, som är 3,5. Analys av enzymets aminosyrasammansättning visade höga halter av Asp/Asn, Gly och Glu/Gln och en låg halt av cystein (Tabell III).

Tabell III Aminosyrasammansättning hos a-1,4-glukanlyas från alg enligt uppfinningen. En molekylvikt av 111.000 som observerats i SDS- PAGE-geler användes för normalisering av data.

Aminosyra Antal rester/molekyl Äššï'IÄš§2š;§ššš§§;§ '''''''''''''''''''''''' "Išš '''''''''''' " ššš'Išš;SšIš§ ''''''''''''''''''''''''''''''' "51 ''''''''''''' " š;š'Iš;§š;§ ''''''''''''''''''''''''''''''''' "š§ ''''''''''''' " šíšïï'Išíššš¿š;š§šš¶ '''''''''''''''''''''''' "šI ''''''''''''' '- ššS'IššSíšš¶ '''''''''''''''''''''''''''''''' 'fíš ''''''''''''' '_ šïšïšíšêššï '''''''''''''''''''''''''''''''' "šš ''''''''''''' " šïš'Iší§;š;§ '''''''''''''''''''''''''''''''' "šš ''''''''''''' " cys (cyššêšší ''''''''''''''''''''''''''' ' _ 15 š;I'Iš;II;§ ''''''''''''''''''''''''''''''''' "ï5 ''''''''''''' " š;Z'Ii;ZIššI§§ '''''''''''''''''''''''''''''' "šI ''''''''''''' '- íí;_IššSI;šEI;¶ ''''''''''''''''''''''''''''' "ZI ''''''''''''' _' L;š'IL;;2§;¶ '''''''''''''''''''''''''''''''' "51 ''''''''''''' " Ty: 10 15 20 25 30 35 40 507 207 15 nis (nisuiain) 16 Lys Arg (Arg-íšíšf ''''''''''''''''''' ' ' w ____________________________________--__-~_-_-______-_--______-_ * Asx är summan av asparaginsyra och asparagin.

** Glx är summan av glutaminsyra och glutamin. 4). pH-optimum a-1,4-glukanlyaset hade ett vidsträckt pH-optimumområde, från pH 2,5 till 7,0, när maltos användes som ett substrat. Enzym- aktiviteten minskade dramatiskt vid pH-värden under 2,5 och högre än 7,0, och. till minimum vid pH 1,9 och 8,9. I det optimala pH-omrâdet uppvisade a-1,4-glukanlyaset liknande aktivitet i glycin-HCl (1,9-3,4), HAc-NaAc (3,7-5,9), Mops-NaOH (6,1-8,0), och bicin-Na0H (7,2-8,9), och något lägre aktivitet i citrat-NaOH '(5,1-8,6). När amylopektin användes som ett substrat var pH-optimumområdet 3,5 till 7,5, uppvisande en alkalisk förskjutning jämfört med det fallet när maltos användes som ett substrat. Även ifråga om amylopektin minskade enzym- aktiviteten gradvis med sjunkande pH i glycin-HCl, vilket är i skarp kontrast till det fall när maltos användes. 5). Optimal temperatur och stabilitet Den optimala temperaturen för a-1,4-glukanlyas var kring 50°C när maltos eller amylopektin användes som ett substrat. Enzym- aktiviteten var som lägst vid 3,5°C. Ifråga om amylopektin minskade enzymaktiviteten med 50% vid 33°C och 65'C. Vid 70'C uppvisade enzymet fortfarande viss restaktivitet. När enzymet upphettades till 70°C i frånvaro av substrat gick aktiviteten fullständigt förlorad efter 5 min. Dessa fakta pekar mot en viss grad av skyddande effekt hos substratet mot värmedenaturering av enzymet. De beräknade Arrhenius-aktiveringsenergierna (Ba) var 45,8 och 44,0 kJ mol4 för maltos respektive amylopektin. 10 15 20 25 30 35 507 207 16 Temperaturkoefficienterna (Qw) från 30 till 40°C var 1,84 för maltos och 1,79 för amylopektin. 6). Enzym renat från andra rödalger Gracilariopsis lemaneiformis (GLV) och §. verrucosa (GVv) insamlade från Araya a-1,4-glukanlyasaktivitet detekterades i Peninsula, Venezuela. a-1,4-glukanlyaser renades från två arter från Venezuela med användning av samma förfarande som utvecklats för Qracilariopsis lemaneiformis (GLc) som insamlats från Qingdao, Kina. Lyaserna som renats från GLv och GVv delade följande egenskaper med lyaserna från GLc: 1. Lyaserna från GLv och GVV uppvisar samma molekylmassa mätt både under denaturerade betingelser på SDS-PAGE och icke- denaturerande betingelser på nativt PAGE med användning av geler med en gradient av 8-25%. 2. Antikroppar framkallade mot lyaset från GLc korsreagerade med lyaserna som renats från GLv och GVv, vilket indikerar att lyaserna från de olika arter har gemensamma antigendeterminan- I 3. Lyaserna som renats från GLv och GVv nedbröt också a-glukaner och frisatte AF i likhet med lyaset från GLc. 4. Såsom var fallet med lyaset från GLc var lyaserna från GLv och GVv stabila vid 0-4°C. 5. Lyaserna från GLv och Gvv hade också förmåga att adsorberas på en stärkelsekolonn och eluerades senare med dextriner.

Lyaserna från GLv och GVV renades med hög effektivitet och höga återvinningsgrader med användning av de reningsmetoder som utvecklats för GLc.

De ovan uppräknade resultaten indikerar att lyaserna från de tre rödalgerna antingen kodas av samma gen eller olika gener med hög l0 15 20 25 30 35 507 207 17 "i homologi dem emellan. Om de kodas av olika gener kan skillnader- na bland dessa gener vara triviala eller små, så att primära aminosyrasekvenser bland lyaserna också är mycket lika. Konser- vativt utbyte av'vissa aminosyrarester, mindre uteslutningar och insättningar kan uppträda i lyasernas primära aminosyrasekven- ser, men de påverkar inte nämnvärt enzymets konformation och funktion. 7). Substratspecificitet och reaktionssätt När amylopektin användes som ett substrat nådde reaktiviteten maximum 8 mg ml* och sjönk sedan något vid 20 mg ml*. Samma resultat erhölls med löslig stärkelse och maltoheptaos. När maltotrios och maltos användes som substrat nådde aktiveteten maximum vid 2 mg ml* respektive 6 mg ml*. Substratinhibering blev tydlig vid högre koncentrationer, särskilt ifråga om maltotrios. I likhet med maltotrios och maltos uppvisade malto- tetraos, maltopentaos och maltohexaos alla substratinhibering.

I allmänhet minskade inhibitionsgraden med ökning av DP-talet (DP = polymerisationsgrad). När aktiviteten som mätts vid 10 mg ml* jämfördes vid 2 mg ml* och 4 mg ml* kunde substratin- hibering tydligt ses bland maltosackariderna med DP 3-5. I maltohexaos var substratinhiberingen mycket låg och var ingen i maltoheptaos. Bland maltosackariderna var maltotetraos och maltopentaos de sämsta substraten. a-1,4-glukanlyas undersöktes med hänsyn till dess förmåga att nedbryta en mångfald olika substrat (Tabell IV). a-l,4-glukan- lyas nedbröt maltoheptaos vid liknande takt som de som erhölls med amylopektin, amylos och löslig stärkelse; men det var mindre aktivt med ß-limit dextrin, glykogen och floridestärkelse. Med PNPGI (p-nitrofenyl-a-D-glukosid), det artificiella substratet för a-glukosidas, var reaktionshastigheten den lägsta. Ingen 1,5-anhydrofruktos och glukos frisattes enligt kontroll genom TLC på silikagel 60 efter 24 h inkubation med isomaltos (a-D- Glc-[1~6]-a-D-Glc), trehalos (a-D-Glc-[1-1]-a-D-Glc), cellobios (ß-D-Glc-[1-4]-ß-D-Glc), sackaros (a-D-Glc-[l~2]-ß-D-Fru), 10 15 20 25 30 35 40 07 207 18 laktos (ß-D-Gal-[l-4]-ß-D-Glc), melibios (a-D-Gal-[1~6]-a-D- glukos), metyl-a-D-glukosid och cyklohexaamylos (Tabell V).

Cyklohexaamylos och metyl-a-glukosid uppvisade ej heller någon inhiberande effekt på enzymaktiviteten vid en koncentration av 4 mM respektive 12 mM, när maltos eller löslig stärkelse användes som ett substrat. Att enzymaktiviteten ökade med substratetsstorlekifrågaxmnmetyl-a-D-glukosid,PNPGl,maltos, PNPG2 (p-nitrofenyl-a-D-maltosid) och PNPG7 (p-nitrofenyl-a-D- maltoheptaosid) från noll till maximum antyder att enzymet kräver en viss substratstorlek för bindning innan katalys kan utövas. a-1,4-glukanlyaset från alg uppvisade ej heller någon detekterbar aktivet med pullulan och sulfaterad galaktan. Vid sådan långtidsinkubation vid 30°C hade emellertid u-l,4-glukan- lyas förmåga att nedbryta nigeros (a-D-Glc-[1-3]-a-D-Glc), och panos (a-D-Glc-[l~6]-a-D-Glc-[1-4]-n-D-Glc). Endast mycket låg nedbrytningshastighet observerades med BPNPG7 (blockerad p- nitrofenyl-a-D-maltoheptaosid) (Tabell V). Emellertid måste reaktionshastigheterna som ges i Tabell V anses vara triviala i förhållande till dem i Tabell IV.

Tabell IV. u at ecificitet hos -1 4- k nl as. Kon- centrationen av olika substrat i reaktionsblandningen var 10 mg ml* med undantag för PNPG1, PNPG2, PNPG7, som var 2 mn. Inkuba- tionstiden var 15 min. Maltoheptaosets nedbrytningsgrad var 84 umol min'1'mg'1 proten .

Substrat Aktivitet (8 Maltoheptaos) ššïššš ''''''''''''''''''''''''''''''''' 'ššfš ''''''''''''''' " åšïšššššš; ''''''''''''''''''''''''''''' 'ššfï ''''''''''''''' " išíšššåšššš; ''''''''''''''''''''''''''' 'ššIš ''''''''''''''' " ššíššßššlåš; ''''''''''''''''''''''''''' 'S212 '''''''''''''''' " šåïšššëššš; ''''''''''''''''''''''''''' "ššfš ''''''''''''''' " Maltoheptaos 100,0 10 15 20 25 30 35 40 45 50 507 207 19 šÉi1;šZ'EZ§I§É; '''''''''''''''''''''''' 'EEÛÉ ________________ '- šI§šS§;š ''''''''''''''''''''''''''''''' 'ïíïfš '''''''''''''''' '- Ä;§IS§;iZI§ '''''''''''''''''''''''''''' 'liíff '''''''''''''''' '- Ä;§IS; '''''''''''''''''''''''''''''''' _Tü&5ÃE '''''''''''''''' __ iššII;'ššš§i;íš; '''''''''''''''''''''' 'ïfläšflš '''''''''''''''' '- šiššlååššššiëíšå ''''''''''''''''''''''' _1if§š '''''''''''''''' '_ ššššï ''''''''''''''''''''''''''''''''''' 'ïšfífš '''''''''''''' _' ššššš '''''''''''''''''''''''''''''''''' 'EEÉB '''''''''''''''' '- ššššš ''''''''''''''''''''''''''''''''' 'EBBÛB '''''''''''''''' '- Tabell V. Eogtsättning av Tabell IV. För BPNPG7 innehöll reaktionsblandningen 4,91 pg enzym och för de övriga 1,64 pg enzym. Inkubationstiden var 24 h.

Substratkonc Frisatt produkt (nmol) ššZšš1;l72;7};2IL ''''''' '2f;@f;5?f ''''''''''''''' 'Éššfiš ''''' " floridestärkelse 10 mg ml* l323,2 šššåššš ''''''''''''''''' 'Z°;;';5Éf ''''''''''''''' "IšZššfš_°"' ššššš ''''''''''''''''''' '2';¿f}5Éf ''''''''''''''' '131ššÉš'_"' ššíšššší '''''''''''''''' '}';@f;5Éï ''''''''''''''' 'ÉBEÛÉ ''''' " šššššš ''''''''''''''''' "š';; ''''''''''''''''''' "šfIš ''''' °' šššåšíššš '''''''''''''' "Z°;;°;I3 ''''''''''''''' "5 '''''''' °° ššëššíšš '''''''''''''''' 'I5';;'¿í3 ''''''''''''''' 'B '''''''' " Eåíïššššš '''''''''''''' "Z'¿;';ï3 ''''''''''''''' "5 '''''''' " šššiššåš '''''''''''''''' 'I5';;';í3 ''''''''''''''' 'B '''''''' " šššššš '''''''''''''''''' 'I6';;';I3 '''''''''''''' "5 '''''''' '_ šëíššlšš '''''''''''''''' 'í5'¿;';13 '''''''''''''' "5 '''''''' '° Metyl-a-D-glukosid 10 mM 0 10 15 20 25 30 35 40 507 2Û7 20 EEEIEEEQÄÄEEIEE '''''''' "EE';E '''''''''''''''''' "E ________ " EEIIEIÄE ''''''''''''''' 'ÜEÄEEÄEI-'I ''''''''''''''' "E ________ " EEIEÄZÄEÄEÄEÄIÄÃEÄÄ '''''''''''''''''''''''''''''''''''''''' " från Qracilaria sordida 10 mg ml* 0 EEEEÄE ''''''''''''''''' "HE '''''''''''''''''''' 'E '''''''' " EEEEÄI '''''''''''''''''' 'EEE ''''''''''''''''''' "E '''''''' " EEEEEEÉEEEEÄE ''''''''''' 'IEEE ''''''''''''''''''' 'E '''''''' " ÃEEÉEIEEEE '''''''''''''' 'šÜEE ''''''''''''''''''' "E '''''''' " EEEÉEIEEEà ''''''''''''' "EEEÄEE ''''''''''''''''' "E '''''''' " Oförmågan hos a-1,4-glukanlyas från alg att nedbryta cyklohexa- amylos och pullulan (som är en lineär polymer vilken innehåller upprepade enheter xnaltotrios bundna genom a-1,6-bindningar) tyder på att det har liten eller ingen endo-klyvningsaktivitet.

Alglyaset börjar tydligen sin lytiska verkan på en a-l,4- glukankedja från den icke-reducerande änden, eftersom det upp- visar liten eller ingen aktivitet gentemot panos, BPNPG7 och pullulan. (BPNPG7 är en nitrofenylmaltoheptaos som är blockerad vid icke-reducerande ände och är ett substrat som är särskilt utformat för' bestämning av endoamylolytisk aktivitet). Den mycket låga aktiviteten med BPNPG7 beror inte på närvaron av nitrofenylgrupp bunden vid de reducerande ändarna, eftersom ifråga om PNPG7 en aktivitet som var lika hög som maltoheptaos observerades.

Ur Tabellerna IV och V kan man också dra den slutsatsen att alg- lyaset är högspecifikt för en a-1,4-glukosidbindning, och upp- visar ingen aktivitet gentemot andra analoger av a-glukosider, såsom PNPGman (p-introfenyl-a-D-mannosid) och PNPGal (p-nitro- fenyl-a-D-galaktosid), vilka är modifierade genom inversion av hydroxyler hos C-2 (mannos) respektive C-4 (galaktos). 10 15 20 25 30 35 507 207 21 "i a-1,4-glukanlyaset från alg kan lätt nedbryta värmedenaturerad floridestärkelse som isolerats från samma växt, från vilken enzymet renades (Tabell IV). Hastigheten var emellertid lägre än för löslig stärkelse och amylopektin. Detta kan bero på den höga viskositeten hos floridestärkelselösning jämfört med löslig stärkelse. Den reaktionsblandning som innehöll kokad floride- stärkelse var vitare än de av kokad löslig stärkelse eller andra substrat.

Algenzymet uppvisar inte någon produktinhibering, dvs AF, neo- limit dextrin och glukos, som ackumulerar'under'enzymreaktionen, har negligerbar effekt på enzymreaktionshastigheten, och enzym- reaktionen kan fortskrida tills substratet är fullständigt ned- brutet. Vid en enzymkoncentration av 6 pg protein per ml, vid 30°C, är den tid som krävs för en fullständig nedbrytning av 1% maltoslösning 1 h, för 2% maltoslösning 3 h, för 5% maltoslös- ning 10-24 h, för 2% maltoheptaos 10-24 h. Detta är i skarp kontrast mot många polysackariders depolymerisationsenzymer, vilkas reaktion avstannar med ackumulering av produkterna eller med minskningen av substratstorlek.

Alglyaset avlägsnar glukosenhet som 1,5-anhydrofruktos succes- sivt från de icke-reducerande ändarna av a-glukanmolekyler tills den sista glukosenheten kvarstår (ifråga om en lineär glukan) eller tills det stöter på en förgreningspunkt där glukosenheten är bunden genom andra bindningar än a-1,4. Det kan inte omvandla monosackarider, såsom fruktos, glukos, galaktos och mannos till 1,5-anhydrofruktos. När maltoheptaos användes som ett substrat är slutprodukterna 1,5-anhydrofruktos och glukos och deras för- hållande är 6:1. Mellanprodukterna är en blandning av malto- sackarider med ett DP-tal mellan 2-6 under reaktionsprocessen.

Med ökande reaktionstid.minskade DP-talet för maltosackariderna och slutligen försvann alla maltosackarider. När maltos användes sonxett substrat var förhållandet 1,5-anhydrofruktos till glukos 1:1. Med ökning av DP-talet minskade utbytet av glukos, medan utbytet av 1,5-anhydrofruktos ökade. När en lineär kedja av en 10 15 20 25 30 35 5 Û7 207 22 a-1,4-glukan är tillräckligt lång kan utbytet av 1,5-anhydro- fruktos vara nästan 100%.

När förgrenade glukaner användes som substrat är förutom 1,5- anhydrofruktos en annan enzymreaktionsprodukt limit dextrin, som preliminärt kallas neo-limit dextrin. Utbytet av l,5-anhydro- fruktos och neo-limit dextrin beror på procentsatsen av längden hos lineär kedja som börjar från de icke-reducerande ändarna hos en makro-glukanmolekyl. Neo-limit dextrin kännetecknas av att det har endast en glukosenhet på a-1,6-bindningspunkten och är därför resistent mot hydrolys medelst a-glukosidas. Så det är mera idealiskt som ett substrat för den specifika analysen av a-amylas än ß-limit dextrin, som produceras av ß-amylashydro- lysering av amylopektin och som har' marknadsförts. ß-limit dextrin kan ha 2-3 glukosenheter på sidokedjan som är bunden -genom a-1,6-bindningar till huvudkedjan och är därför benägen att hydrolyseras medelst a-1,4-glukanlyas (Tabell IV) samt a- glukosidas. 8). Specificitet hos kanin-anti-a-l,4-glukanlyasserum.

Reaktion mellan a-IA-glukanlyas och dess imunserum kontrollera- des genom dubbeldiffusion i agarplattor, genom neutralisering av enzymaktivitet, och genom Western-blotting. a-1,4-glukan- lyaset (3,9 pg protein) gav ett enda, vitt precipitin-band när det testades mot en 1:64 spädning av immunserumet. Precipitin- banden observerades också när a-1,4-glukanlyas som renats från lsmanaimrmis, eller Qgacilgria ggggugggg testades. insamlat från Venezuela, När a-1,4-glukanlyas mättes i närvaro av immunserumet, uppträdde 50% inhibering av enzymaktiviteten vid en nivå av 2 ul respekti- ve 3 pl immunserum, när amylopektin eller maltos användes som ett substrat, och 94% inhibering uppträdde i närvaro av 8 ul immunserum ifråga om både maltos och amylopektin. Resultaten från Western-blotting bekräftade vidare antikropparnas specifi- 10 15 20 25 30 35 507 207 23 " citet, eftersom endast ett band i det cellfria extraktet, som motsvarade lyaset, kändes igen av antikropparna. 9). Inhibitionsstudier A. Socker och sockeranaloger 1) Deoxinojirimycin, en glukosanalog, inhiberade fullständigt enzymaktiviteten vid en koncentration av 2 mM oberoende av om maltos eller amylopektin användes som substrat. Ytterligare experiment visade att till och med 0,165 mM av inhibitorn hade förmåga att inhibera aktiviteten fullständigt när maltos användes som substrat. 2) Mgltitol, en maltosanalog, inhiberade vid en koncentration av 0,1 M enzymaktiviteten med ca 47% och 27% när maltos respektive amylopektin användes som substrat. Det visades vidare att inhiberingen av maltitol till maltos som substrat var typiskt kompetitiv. Det vill säga inhibitorn maltitol tävlar med substratet maltos om samma bindningsställen i enzymet. 3) glukos, inhiberade enzymaktiviteten. med ca 22% vid en koncentration av 0,1 M när maltos användes som ett substrat. medan det vid sådan koncentration inte uppvisade någon inhibe- ring när amylopektin användes som ett substrat. 4) Angra_§ggkg;, vid en koncentration av 0,1 M, uppvisade ingen inhibering vare sig när maltos eller amylopektin användes som ett substrat. Dessa socker inbegriper: glycerol, xylos, arabinos, fruktos, mannos, galaktos, sackaros, laktos, melibios, trehalos, inositol och sorbitol.

B. Polysackarider Nedbrytningen av maltos medelst enzymlyaset inhiberades med ca 67% och 47% i närvaro av 3 mg/ml amylopektin respektive glykogen. Ytterligare experiment visade att inhiberingen av nedbrytningen av maltos medelst amylopektin var av en blandad 10 15 20 25 30 35 24 kompetetiv/icke-kompetetiv typ. Pullulan inhiberade inte aktiviteten.

C. Sulfhydrylgrupp (-SH)-blockerande medel p-Kloromerkuribensoesyra (PCMB) vid en koncentration av 2 mM inhiberade enzymaktiviteten med ca 90% när maltos eller amylo- pektin användes son\ett substrat. Liknande inhibering observera- des i närvaro av HgCl2 vid en koncentration av 10 mM. Dessa experiment indikerade att sulfhydrylgrupp(er) är väsentliga för enzymaktiviteten.

D. Saltjoner KCl, CaCl2, MnCl2, MgCl2, uppvisade alla ingen inhibering av .enzymet vid en koncentration av 50 mM, vare sig maltos eller amylopektin användes som ett substrat. 10). Reducerande förmåga hos 1,5-anhydrofruktos (AF) Tabell VI visar den tidsmässiga reduktionen av 3,5-dinitrosali- cylsyra (DNS)-reagens medelst AF vilket övervakats genom absorbans vid 546 nm. Det framgår att reaktionen fullbordades på mindre än 10 min. Detta står i skarp kontrast till andra reducerande socker, såsom glukos och maltos, vilkas reaktion med DNS-reagens fullbordas vid l00°C på 5 min ((Steup, M. (1990) Methods in Plant Biochemistry (Dey, P.M. and Harborne, J.B., eds.), Vol.3, pp. 103-127, Academic Press, London).

Tabell VI. Tidsmässig reaktion mellan AF och DNS-reagens vid rumstemperatur. Absorbansen vid 546 nm som mått på reaktions- hastighet registrerades strax efter tillsättning av 300 pl DNS- reagens till 300 pl provlösning som innehöll varierande mängder AF. 10 15 20 25 30 35 40 45 507 207 25 ššåššššššššä '''''''''''''''' "ÄšIš;íš"I;;šI§ '''''''''''''' '° (min) ------------------------------------ -- 0,55 1,26 2,36 2,84 "5 ''''''''''''''' "5 ''''''' "5 '''''''' 'B '''''''' 'S '''''''' " "ï ''''''''''''''' "'5f5šš '''' 'šfšïš '''' '5fZšš°°"'6fššš '''' '_ '_š '''''''''''''''' °6fïš5 '''' 'öfššš '''' 'šfššš '''' 'ífššš '''' " "š '''''''''''''''' 'šfššš '''' 'šfššš '''' 'ífššï '''' 'Ifššš""' '-2 '''''''''''''''' 'šfšZí'_"'5fššš '''' _1fší5 '''' 'Ifššš""' "š '''''''''''''''' 'öfiššš '''' 'šfššš '''' 'ífšší '''' 'šf855""' _'š '''''''''''''''' 'šfšíš '''' 'šfššš '''' 'ífššš '''' 'šfIšš""' "3 ''''''''''''''' °"5fZšI '''' 'šfššš '''' 'ïfššš '''' 'šÉššš""' ''''''''''''''''''' 'šfZZ6"'°'Ifš5š"""IIšš5""°šfš3š""' "š '''''''''''''''' 'BÉZZZ '''' 'ïfššl '''' 'ífššš '''' 'šfššš ____ " 'IB '''''''''''''''' 'šfššš '''' 'ïfššš '''' 'Ifššš '''' 'šfšïï '''' '- ll). Metoder som etablerats för analys av enzymet Eftersom detta a-1,4-glukanlyas är ett nytt enzym saknas rutin- analys för aktiviteten. Två lnetoder utvecklades därför för bestämning av a-1,4-glukanlyasaktivitet. to - etoden : a-lA-glukanlyas bryter ner stärkelse-liknande molekyler för att ge 1,5-anhydrofruktos (AF), som är värmestabil och har reduce- rande förmåga. Reaktionen mellan AF och 3,5-dinitrosalicylsyra- reagens utfördes vid rumstemperatur och var fullbordad inom 10 min (Tabell VI). Ett lineärt förhållande existerar för AF mellan absorbansen 0,1-2,3 vid 546 nm och AF-halten som sträcker sig från 0,3-2,7 pmol eller 50-440 pg i 300 ul prov (Tabell VII).

Närvaron av substratnivåer av maltos, amylopektin och de övriga enzymreaktionsprodukterna neo-limit dextrin samt glukos störde inte reaktionen under de beskrivna betingelserna. Denna metod 507 207 26 är tillämpbar på både det minsta substratet som maltos och det största substratet som amylopektin.

Tabell VII. Korrelationen mellan AF-halt och absorbans.

Absorbansen mättes 10 min efter tillsättning av 300 pl DNS- reagens till 300 pl provlösning som innehöll olika mängder AF såsom anges.

AF-halt (pmol) Absorbans (546 nm) ''''' '5"°"""'_"'°""'°'_"“"'"""'Bf""""'_""""' '''' '5fššZ""'°"_"""""°"""""'?§fIIš_""""°”"'_"' '''' '5ÉšZB""""""""""""""'_'1§ÃñšI'°"""""""' '''' 'šfššš""""""'°_'_"'"°"°"'°"í5fIšš""""'_"""° '''' '6fššš""'"""""'_'°"_""'""'1¶Éšiš""'""""""" '''' 'šfšZš"_"""""""""""""°1i§{š{""""""_"" '''' 'šfššš""""""""""'-°"""'1šfššš""""""°"" '''' '5fššš"""""""'°"""-"""'1íEšíí'"""""""_" '''' 'šfš5š""'°"'°"""'_""""""íí§ååI"""""""'“° '''' '5fššš"'"""""""""'°"°""'1L}ššš""""""'°"_' '''' 'ífššš"""°"'°""°"""'°"""ííÉ{I6""""”"""" '''' 'IfIZš""""""""'°'_""°""'1íÚš5_"""'""°"_'- '''' "1fIšI""°"°'"""""'_"""""íí§åå5"°""""""" '''' 'IfšZI"""""""""""""_"'Ü{f5šš""""""""' '''' 'ïfšIZ"°"""'°"""""""'°""{IIIš""""""""- '''' 'Ifššš"""""'""'_"""""'°°"{fšš6""""""""' '''' 'ïIššš"'°"""°""""""""'°"IfšIš"""°"""_"' '''' '1fššš""""'°"""""""""_"{fš5š"""""_""" '''' 'Ifš1š"""""""""""""""'{fJ5š""""""""' ____ 'šf8šI"""""_""""“"""""fffšš5"""'"'_""_-_ 10 15 20 25 30 35 40 27 '''' -šflššm'm'_mm"mm""""ífššš"""""""'" "mšfššï ''''''''''''''''''''''''''''' "ffíšï ''''''''''''''' '- '''' 'šfššï""""""""""""'"'°'Ifšíš"""""'""" '''' 'Efššš'"m"'"'"m"""""""šfššš'"""""""" '''' 'šfšší'_m"""""""""""""ífššš""""""m" Metod 2 (den enzymatiska metoden): a-1,4-glukan-lyasets aktivitet kan analyseras genom kvantifie- ring av frisatt glukos. Detta baseras på den observationen att AF och glukos produceras på ekvimolär basis när maltos används som ett substrat. Frisatt glukos (området 10-100 nmol i 300 pl reaktionssystem) bestämdes enzymatiskt antingen genom övervak- ning av reduktionen av NADP vid 340 nm i närvaro av hexokinas och g1ukos-6-fosfatdehydrogenas eller med glukosoxidasperoxidas- systemet. Närvaron av AF, maltos interfererade inte med kvanti- fieringen av glukos. Dessa enzymatiska metoder var ungefär 6-10 gånger känsligare än direktmätningen av AF, men de är inte tillämpbara på stora glukanmolekyler som substrat. 12). AF kan användas som ett substitut för andra socker och sockerderivat. AF kan inte metaboliseras genom hexokinas- och glukos-6-fosfatdehydrogenasreaktionsväg och ej heller av glukosperoxidas. AF kan därför betraktas som ett icke-metabo1i- serbart socker i levande organismer som saknar denna nya stärkelselglykogennedbrytningsreaktionsväg vilken katalyseras av a-1,4-glukanlyas. Det kan sättas till livsmedel (inbegripet sötsaker/karameller) för att minska deras kaloriinnehåll. 13). Partiella aminosyrasekvenser hos enzymet Efter hydrolysering av enzymet med proteinas, separerades de hydrolytiska fragmenten av enzymet på HPLC såsom beskrivs nedan under Material och Metoder, och användes för att erhålla inre N-terminala sekvenser. Fyra sekvenser med totalt 101 aminosyra- 10 15 20 25 30 35 40 45 50 507 207 28 rester erhölls. Var och en av de erhållna sekvenserna jämfördes med totalt 65.342 kända protein- sökning av databankerna PIR 32 och Swiss-Prot 22. och peptidsekvenser genom Resultatet från sökningarna indikerade att dessa sekvenser hos det nya enzymet inte tidigare rapporterats. Nedan ges resultaten från dessa sekvensanalyser.

Aminosyror (angivna med trebokstavssymboler): Fragment 1, (totalt 2l aminosyrarester): 1 5 10 Tyr(Val) Met Val Pro(Thr) Asn Met Tyr Tyr Glu Asn His 15 20 Gly Tyr Glu Pro Met Val Thr Gln Tyr Asn Fragment 2, (totalt 30 aminosyrarester): V 1 5 10 “ Gly Leu Val Pro Gln Thr Asp Ile Thr Pro Phe Leu 15 20 Arg Asp Asn Asp Glu Gly Gln Asn Tyr Glu Val Asn 25 30 Gln Thr Leu Arg Glu Arg Fragment 3, (totalt 25 aminosyrarester): 1 5 10 Gly(Val) Ala Ala Glu Gln Asn Gly Gly Thr Glu Thr 15 20 Ile Thr Phe Thr Asp Asn Pro Tyr Arg Tyr Val Phe 25 Gly Gly Fragment 4, (totalt 25 aminosyrarester): 1 5 Gly(Ser) Leu Asn Thr(Leu) Tyr Thr Asp Glu Phe(Asp) 10 15 20 Pro Leu Val Phe Glu Val Phe Pro Leu Gly Asn Asn 25 Arg Ala Asp(Leu) Gly 10 15 20 25 30 35 507 207 29 '_ Material och metoder som använts för rening och karakteri- sering av enzymet Material Qracilariopsis lemaneiformis (Bory) Dawson, Acleto et Foldvik (Qracilaria lemaneiformis (Bory) Weber-van Bosse) och Qracilaria verrucosa (Huds.) Papenf. insamlades från Araya Peninsula, Sucre,'Venezuela,i.September'1990. Qracilariogsis lemaneiformis insamlades också från Zhan Shan Bay, Qingdao, Kina, i Mars, 1990. Alltsedan dess har dessa växter odlats i en enartskultur i laboratorium. Glykogen (kaninlever), amylopektin (potatis), och maltosackarider var från Sigma Chemical Co., löslig stärkelse från E. Merck och alla övriga kemikalier från Pharmacia LKB Biotec. AB.

Metoder Isolering och rening av a-1,4-glukanlyas (ursprungligen insamlat från Kina), 30 g, prov togs direkt från odlingscylindern och sköljdes kort med avjoniserat vatten samt torkades genonn uppsugning med pappersservett. Följande operationer utfördes vid 0-4°C. Thalli klipptes i tátar med sax och pulveriserades under flytande kväve. Till 1 g algpulver sattes 3 volymer buffert A (50 mM citrat-NaOH, pH 6,6), varpå det hela filtrerades genom två- skiktstyg och centrifugerades vid 36.600xg under 10 min. Super- natanten (cellfritt extrakt) sattes på en stärkelsekolonn (4,1 x 1,5 cm) som förjämviktsinställts med buffert A. Därpå tvättades kolonnen rikligt med 4 volymer av buffert A, 2 volymer av buffert A som innehöll 1 M NaC1, 1 volym buffert A, l volym buffert B (50 mn imidazol-HC1, pH 6,6) vid en flödeshastighet av 24 ml h*. a-1,4-glukanlyaset eluerades med buffert B som innehöll 10 mg ml* amylopektin i en fraktionsstorlek av 3,5 ml.

För att separera a-1,4-glukanlyaset från amylopektinet samman- fördes de aktiva fraktionerna av eluatet och sattes därpå på en Q-Sepharose-kolonn (2,6 x 5 cm). Kolonnen förjämviktsinställdes och senare tvättades med buffert B. a-1,4-glukanlyas eluerades 10 15 20 25 30 35 507 207 30 med buffert B som innehöll 0,7 M NaCl. Aktiva fraktioner samman- fördes och koncentrerades på en Centriprep CP30 (Amicon, USA) med en molekylviktsspärr av 30.000 och sattes på en Sephacryl S-200-kolonn (2,6 x 80 cm) som förjämviktsinställts och eluerats med buffert A som innehöll 0,2 M NaCl. Flödeshastigheten var 60 ml h* med en fraktionsstorlek av 3,5 ml per rör. Aktiva fraktioner uppsamlades och koncentrerades igen med användning av centriprep CP30. En sammanfattning av reningen ges i Tabell I ovan.

Sephacryl S-200-kolonnen (2,6 x 80 cm) kalibrerades med gel- filtreringsproteinmarkörer ribonukleas A (13.700), chymotryp- sinogen A (25.000), ovalbumin (43.000), albumin (67.000), aldolas (158.000), katalas (232.000), ferritin (440.000), och thyroglobulin (669.000) såsom beskrivits i Plant. Physiol. och -.Biochem. 29, 341-347 av Yu, S., och Pedersén M.(l99l). a-l,4- glukanlyasets molekylvikt uppskattades från dess fördelnings- koefficient, i förhållande till markörproteinerna. Affinitets- mediet cykloheptaamylos-Sepharose 6B framställdes genom koppling av cykloheptaamylos med Epoxi-aktiverad Sepharose 68 enligt Vretblad såsom beskrivits av Preiss, J. Okita, T.W. och Green- berg, E. (1980) Plant Physiol. 66: 864-869.

Analys av a-1,4-glukanlyas.

Reaktionsblandningen för analys av a-1,4-glukanlyas bestod av 240 pl 62,5 mM Mops-Na0H som innehöll 6 mg löslig stärkelse (pH 6,2), enzympreparatet och destillerat vatten till en slutvolym av 300 pl. Reaktionen utfördes vid 30'C under 10-30 min. Frisatt 1,5-anhydrofruktos bestämdes genom övervakning av absorbans vid 546rm\efter tillsättning av.3,5-dinitrosalicylsyrareagens. Lös- lig stärkelse i reaktionsblandningen kan ersättas med andra substrat och den slutliga substratkoncentrationen kan varieras såsom anges i texten. Reaktionstiden och enzymkoncentrationen som används vid enzymaktivitetsanalys har valts för att säker- ställa reaktionshastighetens linearitet. En.enhet a-l,4-glukan- 10 15 20 25 30 35 _07 (11 (3 <1 r 31 lyasaktivitet definieras som den mängd enzym som frisätter 1 pmol 1,5-anhydrofruktos min* under de ovan beskrivna betingelserna.

Elektrofores.

Både SDS- och nativ gradientgelelektrofores samt isoelektro- fokusering och efterföljande färgning med PhastGel Blue R och silver utfördes med användning av Phastsystemm (Pharmacia LKB Biotec. AB, Bromma, Sverige) samt förgjutna geler med en gel- gradient av 8-25% i enlighet med tillverkarens instruktioner.

Buffertsystemet bestod av 0,112 M acetat-0,112 M Tris, pH 6,4 i gelen, och 0,2 M tricin-0,2 M Tris, pH 7,5 som innehöll 0,55% SDS i buffertremsor (elektrodbuffert) för SDS-gelelektrofores eller 0,88 M L-alanin-0,25 M Tris, pH 8,8 för nativ gelelektro- fores. De proteinmarkörer som användes för uppskattningen av a- 1,4-glukanlyasets molekylvikt i SDS-PAGE var: myosin (212.000), az-makroglobulin (l70.000), ß-galaktosidas (116.000), trans- ferrin (76.000), och glutamat-dehydrogenas (53.000), i nativ gradient-PAGE var: tyroglobulin (669.000), ferritin (440.000), katalas (232.000), laktat-dehydrogenas (140.000) och albumin (67.000).

Förgjutna geler med en pH-gradient av 3-9 användes för iso- elektrofokusering. pl hos a-1,4-glukanlyas uppskattades från kalibreringskurvan för pI-värdena hos markörproteinerna mot deras rnigreringsavstånd från katoden. i mm. För aktivitets- färgning utfördes elektrofores vid 6°C. Vid slutet av elektro- foresen placerades gelen direkt i 0,1 M citrat-Na0H-buffert (pH 6,0) som innehöll 20 mg ml* löslig stärkelse och inkuberades vid 30'C över natten. Gelen sköljdes sedan i destillerat vatten och färgades med I2/KI-lösning (lagrad vid 4°C) i en koncentra- tion av 10 respektive 14 mM. Gelen lagrades i 5% HAc och 10% glycerol vid rumstemperatur i mörker. a-1,4-glukanlyasbandet observerades som en klar area mot mörkblå bakgrund omedelbart efter färgning. Proteinband sågs efter några dagar som gula till blå band i kontrast till bleknad bakgrund. 10 15 20 25 30 35 507 207 32 Western-blotting.

Western-blotting utfördes med användning av halvtorr elektro- foretisk överföringsenhet PhastTransferT" (Pharmacia, Sverige) i enlighet med tillverkarens instruktioner. Proteiner från geler efter SOS-PAGE överfördes elektroforetiskt på nitrocellulosa- membran. Membranerna inkuberades sedan med kanin-antialglyas- serum (1:100) över natten vid rumstemperatur, följt av inkube- ring med de sekundära antikropparna get-antikanin IgG-konjugerat pepparrotsperoxidas (1:1000). Lyasband visualiserades med användning av 4-kloro-1-naftol och peroxid som substrat för peroxidaset.

Analys av a-lA-glukanlyasets aminosyrasammansättning.

Aminosyraanalys utfördes på en LKB Modell 4151 aminosyraanalysa- tor. Norleucin användes som en intern standard. Enzymproverna hydrolyserades i förseglade, evakuerade rör med 6 N HCl under 24 och 72 h. Cystein- och metioninhalterna bestämdes som cystein- respektive metioninsulfon, efter permyrsyraoxidation i enlighet med förfarandet enligt Moore, S. ((1963) J. Biol.

Chem. 238, 235-237). Protein bestämdes i enlighet med Bradforcl- metoden som modifierats av Peterson, G.L. ((1983) Methods Enzymol. 91, 95-119), och BSA användes som en standard.

Analys av partiella aminosyrasekvenser.

Rödalgslyaset löstes i 60 pl 6 M guanidinklorid. Till 20 pl av detta prov sattes 40 pl 0,2 M Tris-HCI (pH 8,2) och 1 pl proteinas I från Aghromobacter lyticus (specifik för Lys-X, Wako Pure Chemical Industries LTD, Osaka, Japan). Digerering utfördes vid 37°C över natten. Reduktion av de producerade polypeptiderna utfördes vid 56°C under 15 min i närvaro av 0,1% 2-merkapto- etanol. Polypeptiderna derivatiserades vidare med användning av 0,3% ll-vinylpyridin i mörker under 30 min vid rumstemperatur och separerades sedan på HPLC (betingelser: buffert A, H20: TFA = 10 5Û7 207 33 100: 0,1; buffert b, acetonitrilfl¶O:TFA = 90: 10: 0,1). Poly- peptidtopparna övervakades vid 214 nm, uppsamlades och lagrades vid -20°C innan de sattes på en gasfassekvenserare (Applied Biosystem, model 470A) som var utrustad med ett on-line HPLC detektionssystem.

Rening av a-1,4-glukanlyas och framställning av antikroppar.

Det renade enzymet 1,2 mg i 370 pl 0,85% NaCl och 0,1% NaN3 användes som ett antigen. Immunisering av kaniner utfördes av DAKO A/S (Danmark) i enlighet med det förfarande som beskrivits i detalj av Harboe and Ingild (Scand. J. Immunol. 17, Suppl. 10, 345-351, 1983).

Claims (16)

10 15 20 25 30 507 207 34 PATENTKRAV

1. Enzym som har förmåga att successivt klyva terrninala a-1,4-D-glukosid- bindningar från de icke-reducerande ändama hos en a-1,4-glukan, vilket enzym är valt från den grupp som består av a-1,4-glukanlyas som isolerats från en alg och enzymatiskt liknande derivat och analoger därav som erhållits genom utnyttjande av en nukleotidsekvens som kodar för ett a-1,4-glukanlyas från alg eller en aminosyrasekvens som hänför sig till ett or-1,4-glukanlyas från alg."

2. Enzym enligt kravet 1, vari nämnda alg är en rödalg.

3. Enzym enligt kravet 2, vari nämnda rödalg är vald från den grupp som består av Gracilariopsis lemaneiforrnis och Gracilaria verrucosa.

4. Enzym enligt något av kraven 1-3, vari nämnda enzym är i renad form.

5. Enzym enligt något av kraven 1-4, vari nämnda enzym är i immobiliserad form.

6. Enzym enligt något av kraven 1-5, vari nämnda enzym har en isoelektrisk punkt av ungefär 3,9 och en ungefärlig molekylvikt av 111.000 genom SDS- gelelektrofores och 98.000 genom gelfiltreringskromatografi samt har följande ungefärliga aminosyrasamman-sättning bestämt som aminosyrarester per molekyl genom amino-syraanalys: Asx 155, Thr 71, Ser 57, Glx 94, Pro 49, Gly 98, Ala 52, Cys 15, Val 70, Met 21, lle 41, Leu 61, Tyr 62, Phe 52, His 16, Lys 37, Arg 48, och Trp icke bestämt. 10 15 20 25 30 35 40 45 (71 C) '\J l\) C J \.'l 55

7. Enzym enligt kravet 6, vari enzymet har en aminosyrasekvens som omfattar följande fragment: Fragment 1, (totalt 21 aminosyrarester): 1 5 10 Tyr(Va|) Met Val Pro(T hr) Asn Met Tyr Tyr Glu Asn His 15 20 Gly Tyr Glu Pro Met Val Thr Gln Tyr Asn Fragment 2, (totalt 30 aminosyrarester): 1 5 10 Gly Leu Val Pro Gln Thr Asp lle Thr Pro Phe Leu 15 20 Arg Asp Asn Asp Glu Gly Gln Asn Tyr Glu Val Asn 25 30 Gln Thr Leu Arg Glu Arg Fragment 3, (totalt 25 aminosyrarester): 1 5 10 Gly(Val) Ala Ala Glu Gln Asn Gly Gly Thr Glu Thr 1 5 20 lle Thr Phe Thr Asp Asn Pro Tyr Arg Tyr Val Phe 25 Gly Gly Fragment 4, (totalt 25 aminosyrarester): 1 5 Gly(Ser) Leu Asn Thr(Leu) Tyr Thr Asp Glu Phe(Asp) 10 15 20 Pro Leu Val Phe Glu Val Phe Pro Leu Gly Asn Asn 25 Arg Ala Asp(Leu) Gly 10 15 20 25 30 507 207 56

8. Sätt att klyva terrninala a-1,4-D-g|ukosidbindningar från de icke-reducerande ändama hos en a-1,4-glukan, k ä n n e t e c k n a t därav, att a-1,4-glukanet bringas i kontakt med ett enzym enligt något av kraven 1-7.

9. Sätt enligt kravet 8, vari a-1 ,4-g|ukanet omfattar förgrenade kedjor och enzymet används tillsammans med ett avgrenande enzym.

10. Sätt enligt kravet 8 eller 9, vari nedbrytningsprodukten omfattar 1,5- anhydrofruktos.

11. Användning av 1,5-anhydrofruktos som en syreradikalfångare eller ett antioxidationsmedel, vilken användning inte inbegriper läkemedel.

12. Förfarande för framställning av ett enzym som har förmåga att successivt klyva terrninala a-1 .4-D-glukosidbindningar frán de icke-reducerande ändarna hos en a-1,4-glukan, k ä n n e t e c k n a t därav, att det isoleras från en alg genom extraktion och rening på i och för sig känt sätt, eller det framställs med användning av andra lämpliga tekniker, såsom genteknik eller kemisk syntes med utnyttjande av en nukleotid-sekvens som kodar för ett a-1,4-glukanlyas från alg eller en aminosyrasekvens som hänför sig till ett a-1,4-glukan|yas från alg.

13. Antikropp som binder till aminosyrasekvensen hos ett enzym enligt något av kraven 1-7.

14. DNA- eller RNA-prob som känner igen en nukleotidsekvens som kodar för ett enzym enligt något av kraven 1-7.

15. 1,5-anhydrofruktos för användning som läkemedel.

16. Användning av 1,5-anhydrofruktos för framställning av läkemedelsbered- ningar där 1,5-anhydrofruktos används som syreradikalfångare.