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JP2965131B2 - 核酸結合用磁性担体およびそれを用いる核酸単離方法 - Google Patents

核酸結合用磁性担体およびそれを用いる核酸単離方法

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JP2965131B2
JP2965131B2 JP7172481A JP17248195A JP2965131B2 JP 2965131 B2 JP2965131 B2 JP 2965131B2 JP 7172481 A JP7172481 A JP 7172481A JP 17248195 A JP17248195 A JP 17248195A JP 2965131 B2 JP2965131 B2 JP 2965131B2
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metal oxide
silica particles
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克哉 大門
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Toyobo Co Ltd
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Publication date
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸を含有する生
物材料から核酸を抽出または精製し、あるいは核酸増幅
産物を精製するために使用する、磁気応答粒子を含有す
る核酸結合用磁性担体に関する。本発明はさらに、該磁
性担体および磁界を利用する、核酸を含有する生物材料
からの核酸単離方法、ならびにそのための試薬キットに
関する。
【０００２】
【従来の技術】従来から、核酸結合用磁性担体を使用す
る核酸単離方法としては、生親和性分子（例えば核酸な
ど）が共有結合し得る重合性シラン被膜により覆われ
た、超常磁性酸化鉄核を有する、磁気応答粒子を利用す
ることが知られている（特開昭６０−１５６４号公
報）。
【０００３】また、生親和性分子が結合し得る重合性シ
ラン被膜により覆われた超常磁性酸化鉄を有する磁気応
答粒子を用意し、リゲートを含有する試料溶液、既知量
の標識リゲートおよび試料溶液中のリゲートに特異的で
あるリガンドが共有結合されている磁気応答粒子を反応
させ、磁気応答粒子上でリガンド／リゲート複合体を形
成させ、次いで磁気応答粒子を反応溶液から磁気分離
し、磁気応答粒子に結合した標識リゲートまたは溶液中
の遊離標識リゲートを測定し、そして標識量をリゲート
濃度を測定するための標準曲線に相関させるというリゲ
ート濃度の測定方法も知られている（特公平７−６９８
６号公報）。
【０００４】これらの方法では、磁気応答粒子に核酸を
結合させるために、生親和性分子（例えば核酸）と共有
結合するシラン被膜が必要である。
【０００５】さらに、磁場に対し感受性を有する物質に
結合した核酸配列を使用する分析法および装置について
も公知である（国際出願公開番号ＷＯ８６／０５８２
５）。この方法では、１本鎖核酸と結合し得る物質で被
膜された磁気または磁気可能な粒子を使用し、１本鎖核
酸を分離および検出する。具体的には、セルロース誘導
体の１種であるニトロセルロースで磁気粒子表面を被覆
し、ニトロセルロースとＤＮＡまたはＲＮＡの１本鎖核
酸を特異的に結合させる。この方法で回収された１本鎖
のＤＮＡまたはＲＮＡは、シーケンシング用に使用され
る。
【０００６】この方法では、磁性担体にＤＮＡまたはＲ
ＮＡの１本鎖核酸を特異的に結合させる必要がある。
【０００７】核酸の精製、分離、およびハイブリダイゼ
ーションのためにポリカチオン性支持体を使用するこ
と、特に汚染物を含有する核酸の精製および分離のため
にポリカチオン支持体を使用することもまた公知である
（特表平１−５０２３１９号公報）。この方法では、具
体的には、汚染物質を含む試料溶液とポリカチオン性固
体支持体（磁気反応性粒子）とを接触させ、試料溶液中
に含まれる汚染物を過度に結合させることなく、核酸を
支持体に非共有的に結合させ、核酸が結合した支持体を
溶液から分離する。ここで支持体としては、金属酸化
物、ガラス、ポリアミドなどが例示され、ポリカチオン
性磁気応答粒子としては、磁気アミンマイクロスフェア
（磁性微小球）などが使用されている。核酸と支持体と
の結合は、正電荷を有する磁気アミンマイクロスフェア
と核酸の負電荷を有する糖リン酸塩主鎖との間のイオン
結合に基づくとされている。
【０００８】さらに、内部コアポリマー粒子と、その粒
子に均一に被覆している磁気的に応答する金属酸化物／
ポリマーコーティングとよりなる磁性粒子を使用する、
純粋な生物材料の単離法もまた公知である（特表平２−
５０１７５３号公報）。この方法は、上記粒子に生物材
料を反応させ、磁性粒子を分離し、さらに磁性粒子を生
物材料から分離することによる。
【０００９】この方法では、ポリスチレンなどのポリマ
ーをコアとしており、内部コア粒子に金属酸化物とポリ
スチレンなどのポリマーとを均一に被覆している。
【００１０】オリゴヌクレオチドの複数分離を有する単
一分散性（粒径差は５％以下）の超常磁性粒子、および
オリゴヌクレオチドを粒子表面の官能基（ビオチニル
基）または分子に共有結合または吸着させる磁性粒子の
製法が公知であり、オリゴヌクレオチドを共有結合また
は吸着させた粒子を核酸プローブとして使用することが
公知である（国際出願公開番号ＷＯ９０／０６０４
５）。
【００１１】この方法では、ハイブリダイゼーションに
使用する核酸プローブを特異的に共有結合または吸着さ
せることが目的であり、上記粒子は非特異的に多量の核
酸を固定する担体ではない。
【００１２】以上のように、磁性粒子担体の表面上のシ
ラン被膜またはポリマー被覆を用いる方法は、担体表面
とシラン被膜またはポリマーとの結合が共有結合などの
方法で行われる。これらの方法は、磁性粒子表面に官能
基が付加される場合が多く、核酸などの特異的吸着によ
る分別および測定には有利であるが、核酸を非特異的に
多く吸着し、回収量も高くなる固相担体には不向きであ
る。
【００１３】一般的に核酸の単離を行うために、表面を
被覆した磁性粒子を固相担体として使用する場合、大き
な粒子（例えば直径が２０μｍ以上）は、弱磁場および
弱磁場変化に対し応答し得るが、迅速に沈澱し分散性が
悪い傾向にある。従って、固相吸着など均質的な状態を
要求する反応に対しては、プラスミドＤＮＡなどの小さ
い核酸を吸着固定することが難しい。また、大きな粒子
は小さな粒子に比べて重量当りの比表面積が限られてい
る。このため、これに対しては、少量の物質が結合する
のみである。
【００１４】小さな粒子（例えば直径が０．１μｍ以
下）では、比表面積および分散性においては良好である
が、沈降性に劣る。このため、磁極による磁界分離にお
いて、必要とされる磁極には、磁力の強い大きくて高価
な磁石が必要であり、磁極による分離にも長い時間を有
する。
【００１５】シリカ粒子を核酸の精製手段として用いる
方法に関しては、従来、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグ
ラフィー）装置の使用を前提とするクロマトグラフィー
でのカラム分離が使用されている。合成した核酸または
増幅した産物をカラムに通すことにより、必要な核酸が
シリカ担体表面に吸着する。このカラムに洗浄液を流す
ことで、不純物を洗浄できる。回収する際は、別にバッ
ファーを流し、必要な核酸を回収できる。この方法で
は、シリカ担体から構成されるカラムを何度も使用でき
るメリットがある。他方、生物材料の１つである全血か
らの核酸単離は、目詰まりなどの問題から実施できず、
回収できる核酸の量が少量となってしまうという不都合
があった。しかもその装置は高価である。
【００１６】シリカ粒子を固相担体として、全血、尿な
どの生物材料から核酸を分離する方法もまた公知である
（特開平２−２８９５９６号公報、特公平７−１３０７
７号公報）。
【００１７】しかし、このようなシリカ粒子を担体とし
た場合、遠心分離を何回も繰り返す煩雑な操作が必要で
ある。しかも溶液を注入後、十分に混合するためにボル
テックスミキサーなどで強い振動による混合操作が必要
であるため、振動により試料に含まれる核酸が切れ、長
鎖核酸が得られにくいという問題がある。
【００１８】以上のように、非特異的に多量の核酸を簡
便に固定するには、種々の問題がある。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明
は、核酸を非特異的に多く吸着させることが可能な磁性
粒子担体を提供することを目的とする。本発明はさら
に、この磁性担体を用いる核酸単離方法およびそのため
の試薬キットもまた提供する。
【００２０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために、鋭意検討した結果、比表面積が特定
な範囲にある磁性シリカ粒子が良好な結果を奏すること
を見いだし、本発明に到達した。
【００２１】本発明の核酸結合用磁性担体は、超常磁性
金属酸化物を含む磁性シリカ粒子であって、該磁性シリ
カ粒子が１００〜８００ｍ2／ｇの比表面積を有する。
【００２２】また、本発明の核酸単離方法は、超常磁性
金属酸化物を含む磁性シリカ粒子であって、該磁性シリ
カ粒子が１００〜８００ｍ2／ｇの比表面積を有する核
酸結合用磁性担体、核酸を含有する材料、および核酸抽
出用溶液を混合する工程、核酸が結合した磁性担体を磁
界を用いて液体から分離する工程、および核酸を結合し
た磁性担体から核酸を溶離する工程を包含する。
【００２３】さらに、本発明の核酸検出方法は、超常磁
性金属酸化物を含む磁性シリカ粒子であって、該磁性シ
リカ粒子が１００〜８００ｍ2／ｇの比表面積を有する
核酸結合用磁性担体、核酸を含有する試料、および核酸
抽出用溶液を混合する工程、核酸が結合した磁性担体を
磁界を用いて液体から分離する工程、核酸を結合した磁
性担体から核酸を溶離する工程、必要により得られた核
酸を増幅する工程、および標的核酸を検出する工程を包
含する。
【００２４】さらに、本発明の核酸単離用キットは、超
常磁性金属酸化物を含む磁性シリカ粒子であって、該磁
性シリカ粒子が１００〜８００ｍ2／ｇの比表面積を有
する核酸結合用磁性担体、および核酸抽出用溶液を含
む。
【００２５】
【発明の実施の形態】本発明の核酸結合用磁性担体は、
超常磁性金属酸化物を含む磁性シリカ粒子である。本発
明の磁性シリカ粒子は、核酸を結合し、かつ磁界により
固体と液体との分離を可能とする。
【００２６】本発明の磁性シリカ粒子は、比表面積が１
００〜８００ｍ2／ｇである。この比表面積は、ＪＩＳ
Ｋ１１５０「シリカゲル試験方法」で規格化された測
定法である窒素ガス吸着法で測定される。上記磁性シリ
カ粒子の比表面積が、１００ｍ2／ｇ未満であると、核
酸吸着量が小さく、核酸回収率が悪くなる。比表面積が
８００ｍ2／ｇを越えると、製法上、細孔容量が極端に
大きくなり、溶離による回収液が減少し、核酸回収率が
悪くなる。
【００２７】好ましい実施態様では、本発明の磁性シリ
カ粒子は、以下のような構造を有している。上記超常磁
性金属酸化物が、その表面がシリカで被覆されており、
そしてさらに微小なシリカ粒子で構成される無機多孔性
壁物質で複合されている。この磁性シリカ粒子は、ほぼ
完全な球状である。核酸と磁性シリカ粒子とは、シリカ
表面の水酸基と核酸の塩基との間で生じる水素結合によ
り結合されている。
【００２８】本発明で用いられる超常磁性金属酸化物と
は磁場変化度に応答するが、永久磁化はされず、残留磁
化が小さい金属酸化物をいう。
【００２９】好ましい超常磁性金属酸化物としては、酸
化鉄が挙げられる。この酸化鉄としては、四三酸化鉄
（Ｆｅ3Ｏ4）および四三酸化鉄を徐々に酸化して得られ
るｒ型三二酸化鉄（ｒＦｅ2Ｏ3）などが用いられる。そ
の粒径は、好ましくは０．２〜０．４μｍである。この
四三酸化鉄は残留磁気が小さく、さらに好ましい表面構
造（ほぼ球形）を有するため、磁気分離および再分散の
サイクルを反復することが可能である。四三酸化鉄を含
有する磁性シリカ粒子は、弱酸性の水溶液中で安定であ
り、２年以上も貯蔵可能である。
【００３０】本発明の磁性シリカ粒子中に含まれる超常
磁性金属酸化物の量は、磁極の強さにもよるが、１０〜
６０ｗｔ％が好ましく、さらに好ましくは２０〜４０ｗ
ｔ％である。この好ましい範囲内では、磁性担体は、市
販の磁石を使用して迅速に分離できる。
【００３１】さらに、上記磁性シリカ粒子の表面細孔直
径は、０．１〜６０ｎｍ、好ましくは０．５〜１０ｎｍ
であり、そして細孔容積は、０．０１〜１．５ｍｌ／
ｇ、好ましくは０．１〜０．５ｍｌ／ｇである。これら
表面細孔直径および細孔容積は、窒素ガス吸着法により
測定される。これらの測定法は、ＪｌＳ Ｋ１１５０
「シリカゲル試験法」で規格化されている。
【００３２】表面細孔直径により、比表面積、細孔容積
は決まる。表面細孔直径が大きい方が比表面積は大き
く、細孔容積もまた大きい傾向にある。比表面積は大き
い方が核酸の吸着量は増えるが、細孔容積も大きいため
回収量が減る傾向にある。表面細孔直径および細孔容積
が上記範囲内にあれば、核酸の最終回収率は高い。
【００３３】上記磁性シリカ粒子の粒子径は、０．５〜
１５μｍ、好ましくは１〜１０μｍである。この磁性シ
リカ粒子は、上記粒子径の範囲内にあることにより、混
合による分散性に優れる。
【００３４】本発明の磁性シリカ粒子は、以下を満たす
ものが最も好ましい：超常磁性酸化鉄を含む磁性シリ
カ粒子であって、その比表面積が１００〜８００ｍ2
／ｇであり、上記酸化鉄が、シリカで被覆されてお
り、さらに微小シリカ粒子で構成される無機多孔性壁
物質で複合されており、上記酸化鉄の重量がｌ０〜６
０ｗｔ％であり、磁性シリカ粒子の表面細孔直径が
０．１〜６０ｎｍであり、磁性シリカ粒子の細孔容積
が０．０１〜１．５ｍｌ／ｇであり、そして磁性シリ
カ粒子の粒子径が０．５〜１５μｍである。
【００３５】本発明の磁性シリカ粒子は、例えば、特開
平６−４７２７３号公報に記載の方法により製造され得
る。例えば、四三酸化鉄を、テトラエトキシシランのア
ルコール溶液に添加し、超音波分散機により分散湿潤さ
せる。これにテトラエトキシシランの加水分解触媒を加
え、超音波分散させながら、四三酸化鉄の表面にシリカ
を沈着させる。このようにして得られた分散液に、ケイ
酸ナトリウムを加え、有機溶媒および界面活性剤（ソル
ビタンモノステアレートのトルエン溶液）を加えて乳化
し、Ｗ／Ｏ型エマルジョンを形成させる。この乳濁液を
硫酸アンモニウム水溶液に添加し、充分攪拌させる。そ
の後、濾過分離、水洗、アルコール沈殿を行い、乾燥さ
せることにより、所望の球状シリカ粒子が得られる。
【００３６】本発明の磁性シリカ粒子は、一般の磁性粒
子に比較して、比表面積が非常に大きいため、多量の核
酸を非特異的に吸着させることができる。さらに分散性
もよいため、核酸を含有する材料および核酸抽出液との
混合が簡単であり、溶離液による核酸の回収量が高い。
【００３７】本発明の磁性シリカ粒子を用いる核酸単離
方法は、超常磁性金属酸化物を含む磁性シリカ粒子であ
って、該磁性シリカ粒子が１００〜８００ｍ2／ｇの比
表面積を有する核酸結合用磁性担体、核酸を含有する材
料、および核酸抽出用溶液を混合し、核酸が結合した磁
性担体を磁界を用いて液体から分離し、そして核酸を結
合した磁性担体から核酸を溶離することを包含する。
【００３８】核酸結合用磁性担体、核酸を含有する試
料、および核酸抽出用溶液を混合する工程は、例えば市
販のボルテックスミキサーを用いて行われ得る。この工
程は、チューブを軽く転倒攪拌あるいは振盪することに
よっても十分に行われ得る。
【００３９】核酸が結合した担体を磁界を用いて液体か
ら分離する工程は、磁石を用いて行われ得る。この磁石
は、例えば、磁束密度が約３００ガウスの磁石が用いら
れ得る。具体的には、核酸結合磁性担体、核酸を含有す
る試料、および核酸抽出用溶液を含むチューブの側壁に
磁石を近づけ、核酸結合担体をチューブ側壁に集め、核
酸抽出用溶液などの溶液と分離する方法がある。
【００４０】核酸を結合する担体から核酸を溶離する工
程は、核酸が結合した磁性担体を、例えば約７０％エタ
ノールで数回洗浄した後、磁性担体を乾燥し、その後、
滅菌水やＴＥ緩衝液などの低イオン濃度の溶液を添加す
ることにより、磁性担体に結合した核酸を低イオン濃度
の溶液から溶離し得る。
【００４１】本発明の核酸単離法では、磁性担体にＤＮ
ＡまたはＲＮＡの１本鎖核酸を特異的に結合させる必要
はない。
【００４２】本発明方法に使用する核酸を含有する材料
は、蛋白質、膜、ＤＮＡまたはＲＮＡ、低分子量核酸な
どを含む生物材料である。このような生物材料として
は、蛋白質、膜、ＤＮＡまたはＲＮＡ、低分子量核酸な
どを含むバクテリオファージ、ウイルス、細菌あるいは
これらの組み合わせが例示される。また、精製する目的
のために、この核酸が、プラスミドまたは増幅産物中の
核酸であってもよい。
【００４３】本発明で使用される核酸抽出用溶液として
は、カオトロピック物質、ＥＤＴＡ、トリス塩酸などを
含有する緩衝液が挙げられる。カオトロピック物質とし
ては、グアニジン塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウ
ム、（イソ）チオシアン酸ナトリウム、尿素などが例示
される。それらは組合せて使用してもよい。その濃度
は、約１〜１０モル／ｌ程度が好ましい。
【００４４】本発明における好ましい核酸抽出用溶液に
は、例えば、グアニジンチオシアン酸塩、Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００、トリス／塩酸緩衝液が含まれる。
【００４５】核酸を最終的に溶離し回収するために、Ｔ
Ｅ緩衝液、滅菌水などの溶離用緩衝液が用いられ得る。
【００４６】本発明の磁性シリカ粒子を固相担体として
使用する核酸単離方法では、多孔質ガラスまたは磁気微
小球を使用する場合に比べて、固相担体の比表面積が数
倍大きくなり、このため、核酸の回収率もまた高い。
【００４７】本発明の核酸単離方法によると、核酸抽出
後の支持体への結合を高濃度の塩溶液中で行うことがで
きる。また、溶出は、イオン強度が低い滅菌水またはＴ
Ｅ緩衝液中で行うことができる。
【００４８】本発明の核酸単離方法の一例として、以下
の手順が挙げられる。
【００４９】（１）エッペンドルフチューブに、核酸抽
出用溶液を入れ、次に全血サンプルを注入し、混合す
る。
【００５０】（２）その後、磁性シリカ粒子溶液を加え
る。
【００５１】（３）適当な時間間隔をあけて混合しなが
ら、静置する。
【００５２】（４）エッペンドルフチューブの形状に合
った磁極スタンドに、上記チューブを設置することで、
磁性シリカ粒子を磁極側のチューブ側壁に集める。
【００５３】（５）フィルターチップで溶液を吸引し排
出する。
【００５４】上記溶液はデカンテーション（磁極スタン
ドに設置したまま、スタンドを逆さにする）により排出
する方法もあるが、廃液の飛散によるコンタミネーショ
ンの問題があるため、フィルターチップで吸い出すこと
が好ましい。
【００５５】（６）チューブを磁極スタンドより取り出
し、グアニジンチオシアン酸塩を含む洗浄液を注入す
る。
【００５６】（７）磁性シリカ粒子と十分混合した後、
磁極スタンドに設置し、上記と同様にして溶液を廃棄す
る。
【００５７】（８）洗浄操作を再度、繰り返す。
【００５８】（９）適当な有機溶媒、例えば約７０％エ
タノールで上記と同様な方法により、核酸の吸着した磁
性シリカ粒子を洗浄し、高濃度のグアニジンチオシアン
酸塩を取り除く。
【００５９】（１０）再度、適当な有機溶媒、例えば約
７０％エタノールおよびアセトンで洗浄する。
【００６０】（１ｌ）適温（約５６℃）のヒートブロッ
クに上記チューブを設置し、放置してチューブ内および
磁性シリカ粒子内の上記の有機溶媒を完全に蒸発させて
除く。 （１２）滅菌水を加え、適温（約５６℃）のヒートブロ
ックに上記チューブを設置し、（３）の操作を繰り返
す。
【００６１】（１３）磁極スタンドに設置し、回収する
溶液をフィルターチップで吸引し、別の新しいチューブ
に移す。
【００６２】（１４）保存する場合は、適温（−７０
℃）で行なう。
【００６３】本発明の核酸単離法にて単離された核酸
は、さらに必要により核酸増幅法によって増幅し、検出
プローブにて検出することができる。
【００６４】核酸増幅法には、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法
などが適用され得る。核酸の増幅法としては、例えば下
記工程Ａ〜Ｄを包含する方法が挙げられる。
【００６５】Ａ．必要により標的核酸を変性して、１本
鎖核酸とする工程 Ｂ．上記１本鎖核酸と、標的核酸に相補的な塩基配列を
有する正方向および逆方向のプライマーおよび４種のｄ
ＮＴＰとを熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む緩衝液中
で反応させて、１本鎖核酸に上記プライマーをアニール
させ、プライマー伸長反応を行う工程 Ｃ．プライマー伸長物を分離して、１本鎖とする工程、
および Ｄ．上記工程ＢおよびＣを繰り返す工程。
【００６６】本発明では、必要により上記増幅反応によ
り生成した増幅産物に、例えば標識プローブをハイブリ
ダイズさせることにより、標的核酸を検出する。
【００６７】標識プローブとしては、標的核酸に相補的
な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、標識物
質または標識結合物質を結合するものが使用され得る。
【００６８】標識物質としては、例えば、アルカリホス
ファターゼ、ペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼなど
の酵素、蛍光物質、および放射性物質が挙げられる。標
識結合物質としては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが
例示される。標識物質は、ビオチン、ジゴキシゲニン、
あるいはアビジンを介して結合され得る。
【００６９】これらの標識をプローブに導入する方法に
は、例えば、これらの標識物質または標識結合物質を結
合するｄＮＴＰを使用して合成する方法が含まれる。
【００７０】標識プローブと結合した核酸の検出方法と
しては、従来公知の方法、例えばサザンハイブリダイゼ
ーション法およびノーザンハイブリダイゼーション法が
挙げられる。
【００７１】標識の検出において、例えば標識物質とし
てアルカリホスファターゼを使用した場合、化学発光基
質、例えば１，２−ジオキセタン化合物（ＰＰＤ）を反
応させると、ハイブリッドを形成した核酸のみが発光す
る。これをＸ線フィルムに感光することにより、標的核
酸の大きさおよび電気泳動上での位置を確かめることが
できる。
【００７２】本発明の核酸単離用試薬キットは、超常磁
性金属酸化物を含む磁性シリカ粒子であって、該磁性シ
リカ粒子が１００〜８００ｍ2／ｇの比表面積を有する
核酸結合用磁性担体、および核酸抽出用溶液を含む。
【００７３】上記試薬キットに含まれる磁性担体および
核酸抽出用溶液は、上記記載の通りである。
【００７４】本発明の磁性シリカ粒子は、一般の磁性粒
子に比較して、比表面積が非常に大きいため、多量の核
酸を非特異的に吸着させることができる。さらに分散性
もよいため、核酸を含有する材料および核酸抽出液との
混合が簡単であり、溶離液による核酸の回収量が高い。
従って、これを用いることにより、核酸の回収量に優れ
た核酸の単離および検出方法、および核酸単離用試薬キ
ットが提供される。
【００７５】
【実施例】以下に、本発明を実施例により具体的に説明
する。
【００７６】本発明の実施例は、以下の磁性シリカ粒子
を用いて行った。
【００７７】磁性シリカ粒子としては、粒径の範囲が１
〜ｌ０μｍ、四三酸化鉄粒子の含有量が３０ｗｔ％、比
表面積が４００ｍ2／ｇ、細孔容積が０．１５ｍｌ／
ｇ、表面細孔直径が約１．２０ｎｍであるもの（鈴木油
脂製）を使用した。
【００７８】磁性シリカ粒子の粒径、比表面積、細孔容
積、および表面細孔直径は、ＪｌＳＫ１１５０「シリカ
ゲル試験法」で規格化されている測定法に従って測定し
たものである。
【００７９】この磁性シリカ粒子は、粉末では水溶液中
に直ちに溶解しないため、粉末状で使用する場合、操作
性において煩雑になる。よって、０．５ｇ／ｃｃになる
よう滅菌水に溶解したものを準備した。
【００８０】（実施例１ 生物材料からの核酸の単離方
法）生物材科としては、ＭＲＳＡ（メチシリン耐性黄色
ブドウ球菌）陽性の全血サンプルを用い、核酸抽出用溶
液としては５Ｍグアニジンチオシアン酸塩およびＴｒｉ
ｔｏｎ Ｘ−１００を含むトリス／塩酸緩衝液を使用し
た。洗浄液も５Ｍグアニジンチオシアン酸塩を含むトリ
ス／塩酸緩衝液を使用した。高濃度の塩を除去するため
に７０％エタノール溶液およびアセトン溶液を使用し、
固相担体には結合した核酸を回収するための溶離液とし
て滅菌水を使用した。
【００８１】本発明の具体的な操作としては （１）１．５ｃｃ用エッペンドルフチューブに、核酸抽
出用溶液９００μｌを入れ、次に全血サンプルｌ００μ
ｌを注入し、混合した。
【００８２】（２）その後、磁性シリカ粒子溶液１４０
μｌを加えた。
【００８３】（３）約２分毎に混合しながら、室温でｌ
０分間置いた。
【００８４】（４）１．５ｃｃ用エッペンドルフチュー
ブの形状に合った磁極スタンドに、上記チューブを設置
することにより、磁性シリカ粒子が磁極側のチューブ側
壁に集めた。
【００８５】（５）フィルターチップで溶液を吸引し排
出した。
【００８６】（６）チューブを磁極スタンドより取り出
し、グアニジンチオシアン酸塩を含む洗浄液を１ｃｃ注
入した。
【００８７】（７）磁性シリカ粒子と十分混合した後、
同様に磁極スタンドに設置し上記と同様にして溶液を廃
棄した。
【００８８】（８）洗浄操作を再度繰り返した。
【００８９】（９）１ｃｃの７０％エタノールで上記と
同様の方法により、核酸の吸着した磁性シリカ粒子を洗
浄し、高濃度のグアニジンチオシアン酸塩を取り除い
た。
【００９０】（１０）再度、１ｃｃの７０％エタノール
および１ｃｃアセトンで洗浄した。
【００９１】（１１）約５６℃のヒートブロックに上記
チューブを設置し、約１０分放置してチューブ内、およ
び磁性シリカ粒子内のアセトンを完全に蒸発させ除い
た。
【００９２】（１２）１００μｌの滅菌水を加え、約５
６℃のヒートブロックに上記チューブを設置し、２分毎
に混合操作をしながら１０分間置いた。
【００９３】（１３）磁極スタンドに設置し、回収する
溶液をフィルターチップで吸引し、別の新しいチューブ
に移した。通常回収量は７０μｌ程度である。
【００９４】（１４）保存する場合は、−７０℃で行っ
た。
【００９５】上記方法により回収された核酸は、吸光度
計によりその吸光度（ＯＤ ２６０ｎｍ）を測定して、
核酸の濃度を求めた。回収量はこれに回収容量をかけて
求めた。
【００９６】（比較例１）比較のために、市販の核酸抽
出用キットＩｓｏｑｕｉｃｋ（マイクロプローブ製）を
使用した。この比較の試薬キットでは、次のようにして
核酸の抽出を行った。まずカオロピック物質で細胞膜の
破壊およびヌクレアーゼ活性の阻害を行い、次に抽出溶
液により核酸を水相に、その他の物質を有機相に残すよ
うに分離し、そしてアルコール沈殿などで水相から核酸
を取り出した。
【００９７】上記方法により回収された核酸は、実施例
１と同様にして、核酸濃度および回収量を求めた。
【００９８】実施例１および比較例１の結果を以下の表
１に示す。
【００９９】
【表１】
【０１００】表１から明らかなように、実施例１（本発
明方法）では核酸の回収量が高かった。
【０１０１】（実施例２ ＭＲＳＡ既知濃度核酸サンプ
ルによる添加回収試験）実施例１と同じ磁性シリカ粒子
を用いた核酸単離方法での抽出効率を見るために、メチ
シリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を培養後、濃度
（菌数）を算出しておき、菌体をＡＰＧＣ（アシッドグ
アニジウムチオシアネートフェノール・クロロホルム）
法で抽出した核酸を全血に添加したものを、サンプルと
して準備した。
【０１０２】（サンプル）１０4個／ｌ００μｌまたは
ｌ０5個／１００μｌの核酸溶液を各ｌ００μｌずつ全
血に添加したもの。
【０１０３】（核酸抽出法）実施例１の単離方法と同様
にして行った。
【０１０４】（増幅法）ｍｅｃＡ遺伝子配列から最適な
２種のプライマー（配列番号１および２）を使用し、Ｐ
ＣＲ法を実施した。条件としては９４℃で１分間、５５
℃で１分間、および７５℃で１分間を、３０サイクル繰
り返した。
【０１０５】（検出法）核酸の検出には、以下のような
ドットブロット法を用いた。ｍｅｃＡ遺伝子配列からプ
ローブ（配列番号３）を作製した。プローブをアルカリ
ホスファターゼ標識し、増幅後のサンプルをこのプロー
ブとサンドイッチハイブリダイゼーションし、発光基質
である１，２−ジオキセタン化合物（ＰＰＤ）を添加
後、発光量を検出した。
【０１０６】（添加回収効率）発光量より、添加回収量
を計算により求めた。その結果を表２に示す。
【０１０７】（比較例２）市販の核酸抽出キット、Ｉｓ
ｏｑｕｉｃｋ（マイクロプローブ社製）を用いて核酸抽
出を行った。核酸抽出は、比較例１と同様に行い、核酸
の添加回収量を求めた。
【０１０８】実施例２および比較例２の結果を以下の表
２に示す。
【０１０９】
【表２】
【０１１０】表２から明らかなように、実施例２（本発
明方法）は、核酸の添加回収率が高かった。
【０１１１】（実施例３ 直鎖状のＤＮＡ断片の添加回
収実験）生物材料としては、健康人の全血サンプルを用
い、このサンプルに下記直鎖状のＤＮＡ断片を添加し
て、上記ＤＮＡ断片を単離した。生物材料からの核酸の
単離方法は、実施例１と同様に行った。
【０１１２】（直鎖状ＤＮＡ断片）１０ｎｇ／μｌ ｐ
ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ／ＳｃａＩ断片（２．９６ｋ
ｂｐ）または４０ｎｇ／μｌ γ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化
物。
【０１１３】（検出）実施例２と同様にして、回収した
サンプルをドットプロット法にて検出した。色差計での
定量、回収液量から、回収率を求めた。その結果を表３
および表４に示す。
【０１１４】（比較例３）比較のために、生物試料を専
用抽出溶液で抽出した後、核酸をシリカレジンで吸着
し、シリカレジンをフィルターカップに集めた後、洗浄
を行い最後にその核酸を滅菌数または低濃度のＴＥ緩衝
液で溶出させ、ＣｌｅａｒＣｕｔ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ
Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）を使用した。この操
作は以下の通りに行った。
【０１１５】（１）専用チューブに１００μｌのサンプ
ル、１００μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ３および１０μｌの
シリカ懸濁液を入れた。
【０１１６】（２）混合後、スピンカラムで粒子を集
め、上清を除去した。
【０１１７】（３）５００μｌ洗浄液で２回洗浄した。
【０１１８】（４）１００μｌＴＥ緩衝液を加え、上清
を回収した。
【０１１９】実施例３および比較例３の結果を以下の表
３および表４に示す。
【０１２０】サンプル：１０ｎｇ／μｌ ｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ ＩＩ／Ｓｃａｌ
【０１２１】
【表３】
【０１２２】サンプル：４０ｎｇ／μｌ γ／Ｈｉｎｄ
ＩＩｌ
【０１２３】
【表４】
【０１２４】表３および４から明らかなように、直鎖Ｄ
ＮＡ断片を含むサンプルでも本発明方法は、ＤＮＡ断片
の回収率が高かった。
【０１２５】
【発明の効果】本発明の磁性シリカ粒子を使用した核酸
単離方法は、非特異的に多量の核酸を吸着でき、回収効
率に優れる。本発明は、操作性にも優れるため、研究用
途、多量の検体を短時間で処理する必要な臨床検体の前
処理などに使用できる。ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを
効率よく抽出できるため、本発明は、各種核酸増幅法の
前処理としても使用できる。本発明は、磁界による分離
のため、自動化しやすいという利点も有する。
【０１２６】
【配列表】
【０１２７】
【配列番号：１】 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：Ｓ 他の情報：ブドウ球菌の配列と相補的な配列を有する。
【０１２８】 配列 GAACCTCTGC TCAACAAGTT 20
【０１２９】
【配列番号：２】 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：Ｓ 他の情報：ブドウ球菌の配列と相補的な配列を有する。
【０１３０】 配列 AAATTTGAAA AAGGCATGAA 20
【０１３１】
【配列番号：３】 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 拝謁の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..27 特徴を決定した方法：Ｓ 他の情報：ブドウ球菌の配列と相補的な配列を有する。
【０１３２】 配列 TAGAATCATC AGATAACATT TTCTTTG 27
【０１３３】
【配列番号：４】 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 拝謁の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..25 特徴を決定した方法：Ｓ 他の情報：ブドウ球菌の配列と相補的な配列を有する。
【０１３４】 配列 TAGAGTAGCA CTCGAATTAG GCAGT ２５
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ (56)参考文献 特開 平４−52202（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−289596（ＪＰ，Ａ) 特表 平４−501959（ＪＰ，Ａ) 特表 平５−502940（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/10 - 15/11 B03C 1/00 - 1/32 C01B 33/12 - 33/193 C07H 1/06 C07H 21/04 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ／Ｌ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 超常磁性金属酸化物を含む磁性シリカ粒
    子である核酸結合用磁性担体であって、該磁性シリカ粒
    子が１００〜８００ｍ2／ｇの比表面積を有する、核酸
    結合用磁性担体。
  2. 【請求項２】 前記磁性シリカ粒子が、その表面がシリ
    カで被覆されている超常磁性金属酸化物を、微小なシリ
    カ粒子で構成される無機多孔性壁物質で複合してなり、
    そしてほぼ完全な球状である、請求項１に記載の核酸結
    合用磁性担体。
  3. 【請求項３】 前記超常磁性金属酸化物が酸化鉄であ
    る、請求項１に記載の核酸結合用磁性担体。
  4. 【請求項４】 前記超常磁性金属酸化物が１０〜６０ｗ
    ｔ％で含まれる、請求項１に記載の核酸結合用磁性担
    体。
  5. 【請求項５】 前記磁性シリカ粒子の表面細孔直径が
    ０．１〜６０ｎｍであり、かつ細孔容積が０．０１〜
    １．５ｍｌ／ｇである、請求項１から４のいずれかに記
    載の核酸結合用磁性担体。
  6. 【請求項６】 前記磁性シリカ粒子の粒子径が０．５〜
    １５μｍである、請求項１から５のいずれかに記載の核
    酸結合用磁性担体。
  7. 【請求項７】 核酸の単離方法であって、該方法は、超
    常磁性金属酸化物を含む磁性シリカ粒子であって、該磁
    性シリカ粒子が１００〜８００ｍ2／ｇの比表面積を有
    する核酸結合用磁性担体、核酸を含有する材料、および
    核酸抽出用溶液を混合する工程；核酸が結合した該磁性
    担体を磁界を用いて液体から分離する工程；および核酸
    を結合した該磁性担体から該核酸を溶離する工程を包含
    する、核酸単離方法。
  8. 【請求項８】 前記核酸が、プラスミドまたは増幅産物
    中の核酸である、請求項７に記載の核酸単離方法。
  9. 【請求項９】 前記核酸抽出溶液がカオトロピック物質
    を含有する、請求項７に記載の核酸単離方法。
  10. 【請求項１０】 前記カオトロピック物質が、グアニジ
    ン塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、（イソ）チ
    オシアン酸ナトリウム、尿素、またはこれらの組合せで
    ある、請求項９に記載の核酸単離方法。
  11. 【請求項１１】 前記溶離工程において、溶離用緩衝液
    が用いられる、請求項７に記載の核酸単離方法。
  12. 【請求項１２】 前記溶離用緩衝液が、ＴＥ緩衝液また
    は滅菌水である、請求項１１に記載の核酸単離方法。
  13. 【請求項１３】 核酸の検出方法であって、該方法は、
    超常磁性結晶である金属酸化物を含む磁性シリカ粒子で
    あって、該磁性シリカ粒子が１００〜８００ｍ2／ｇの
    比表面積を有する核酸結合用磁性担体、核酸を含有する
    試料、および核酸抽出用溶液を混合する工程；核酸が結
    合した該磁性担体を磁界を用いて液体から分離する工
    程；核酸を結合した該磁性担体から該核酸を溶離する工
    程；必要により得られた該核酸を増幅する工程；および
    標的核酸を検出する工程を包含する、核酸検出方法。
  14. 【請求項１４】 核酸単離用試薬キットであって、該キ
    ットは、超常磁性金属酸化物を含む磁性シリカ粒子であ
    って、該磁性シリカ粒子が１００〜８００ｍ2／ｇの比
    表面積を有する核酸結合用磁性担体、および核酸抽出用
    溶液を含む、核酸単離用試薬キット。
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