KR100612895B1

KR100612895B1 - 화학 물질을 이용한 생물학적 시료로부터 단백질의선택적인 제거 방법

Info

Publication number: KR100612895B1
Application number: KR1020050037427A
Authority: KR
Inventors: 이묘용; 한기웅
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2005-05-04
Filing date: 2005-05-04
Publication date: 2006-08-14
Anticipated expiration: 2025-05-04
Also published as: US20080306249A1; US7435811B2; US20060223100A1

Abstract

본 발명은 단백질을 포함하는 생물학적 시료에 하기 화학식 I의 화합물:

[화학식 I]

[식 중, R¹, R², 및 R³는 각각 독립적으로 수소원자 또는 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 6의 알킬기이며, a는 1 내지 6의 정수이다 (단, 아민은 2개 이상의 알킬기를 포함한다)] 및 단백질 핵화 물질(nucleating agent)을 첨가하는 단계; 상기 혼합물을 소수성 표면 물질로 처리하는 단계; 및 상기 단백질이 결합된 소수성 표면 물질로부터 시료를 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 시료 중의 핵산을 유지하면서 단백질을 제거하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 단백질을 포함하는 생물학적 시료로부터 단백질은 효율적으로 제거하고, 핵산은 시료 중에 존재하게 함으로써 단백질을 선택적으로 제거할 수 있다.

Description

화학 물질을 이용한 생물학적 시료로부터 단백질의 선택적인 제거 방법 {Method for the selective removal of proteins from biological samples using chemicals}

도 1은 각 시료에 따른 A₂₈₀를 나타낸 그래프이다.

도 2는 각 시료에 따른 A₂₈₀를 나타낸 그래프이다.

도 3은 TCA 및 폴리스티렌 비드를 이용하여 단백질을 제거한 후의 상층액에 존재하는 대장균 게놈 DNA의 증폭된 PCR 산물의 농도를 나타낸 것이다.

도 4는 상기 본 발명의 방법을 이용하여 베타인 농도에 따른 상층액 중에 존재하는 단백질 및 게놈 DNA의 잔존율을 나타내는 그래프이다.

도 5는 베타인 농도에 따라 증폭된 PCR 산물의 농도를 나타낸 것이다.

도 6은 베타인과 유사한 구조를 갖는 화합물을 이용하여 단백질을 제거한 후의 상층액에 존재하는 대장균 게놈 DNA의 증폭된 PCR 산물의 농도를 나타낸 것이다.

본 발명은 화학물질을 이용하여 생물학적 시료로부터 단백질을 선택적으로 제거하는 방법에 관한 것이다.

세포에서 DNA의 효율적인 추출은 많은 적용에서 필요하고, 분자학적 진단, 특히 병원균 동정 및 정량화에 본질적이다. 분자학적 진단은 일반적으로 DNA 추출 단계 후에 DNA 증폭에 의해 수행된다. DNA 증폭에는 중합효소 연쇄반응(PCR), 리가제 연쇄반응(Ligase Chain Reaction), 가닥 이동 증폭(stranded-displacement amplification), 핵산 기재 증폭, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 헬리카제 연쇄반응, QB 복제효소 증폭, 및 연결 활성화된 전사가 포함된다.

고순도 이중가닥 플라스미드 DNA, 단일가닥 파아지 DNA, 염색체 DNA 및 아가로스 겔 정제된 DNA 단편의 제조는 분자 생물학에서 매우 중요하다. 이상적으로, DNA 를 정제하는 방법은 간단하고, 신속하고, 존재하더라도 부가적인 시료 조작 단계가 거의 없어야 한다. 상기 방법에 의해 수득된 DNA 는 즉시 형질전환, 제한효소 분석, 라이게이션 또는 서열결정이 가능하다. 상기 특징의 모두를 구비한 방법은 연구 및 진단 실험실의 목적인 DNA 시료 제조의 자동화에 매우 매력적이다. 통상적으로, 알코올 침전물로부터 플라스미드 DNA 의 제조는 힘들고, 종종 CsCl 구배, 겔 여과, 이온교환 크로마토그래피, 또는 RNA 분해효소, 단백질 분해효소 K, 및 반복된 알코올 침전 단계를 이용한다. 상기 방법은 또한 CsCl 및 기타 염, EtBr 및 알코올을 제거하기 위해 상당한 후처리 단계가 필요하다. 상기 방법의 추가의 문제는 작은 음전하의 세포 성분이 DNA 와 함께 침전될 수 있다는 것이다. 그리하여, DNA 는 바람직하지 못한 수준의 오염을 가질 수 있다.

단백질은 일반적으로 세포의 조성물 중 상당 부분을 차지하고 있다. 따라서, 생물학적 시료로부터 핵산을 정제하기 위해서는 세포의 상당 부분을 차지하고 있는 단백질을 효율적으로 제거해야 한다. 트리클로로아세트산(TCA)과 같은 화합물은 화합물 내의 3개의 클로로기로 인해 단백질을 침전시키는 것으로 알려져 있다(J. Prot. Chem. 1997, 16(4): 291-297). 그러나, 단백질을 침전시키는 침전제 또는 단백질을 핵화시키는 핵화 물질은 단백질외에도 핵산도 침전시키는 문제점이 있는데, 게놈 DNA도 TCA에 의하여 침전되는 것으로 알려져 있다 (J. Biol. Chem. 1945, 161:293-303). 따라서, 단백질을 포함하는 생물학적 시료로부터 단백질은 제거하고 핵산은 그대로 유지하는 방법의 필요성이 요구되고 있다.

본 발명의 발명자들은 상기와 같은 종래 기술을 바탕으로 단백질 제거 방법을 연구하던 중, 단백질 핵화 물질과 함께 베타인과 같은 특정 화합물을 첨가하고, 이를 소수성 표면 물질로 처리함으로써 단백질은 효율적으로 제거된 반면 핵산은 시료 중에 존재함을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 화학물질을 이용하여 생물학적 시료로부터 단백질을 선택적으로 제거하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

단백질을 포함하는 생물학적 시료에 하기 화학식 I의 화합물:

[화학식 I]

[식 중, R¹, R², 및 R³는 각각 독립적으로 수소원자 또는 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 6의 알킬기이며, a는 1 내지 6의 정수이다 (단, 아민은 2개 이상의 알킬기를 포함한다)];

및 단백질 핵화 물질(nucleating agent)을 첨가하는 단계;

상기 혼합물을 소수성 표면 물질로 처리하는 단계; 및

상기 단백질이 결합된 소수성 표면 물질로부터 시료를 분리하는 단계

를 포함하는 생물학적 시료 중의 핵산을 유지하면서 단백질을 제거하는 방법을 제공한다.

본 발명은 단백질을 포함하는 생물학적 시료에 상기 화학식 I의 화합물 및 단백질 핵화 물질(nucleating agent)을 첨가하는 단계를 포함한다. 단백질을 침전시키는 침전제 또는 단백질을 핵화시키는 핵화 물질은 단백질외에도 핵산도 침전시키는 문제점이 있다. 상기 문제점을 해결하기 위해 상기 화학식 I의 화합물을 첨가하는 것이다.

상기 본 발명의 화합물에서 사용되는 치환기인 알킬기는 탄소수 1 내지 20의 직쇄형 또는 분지형 라디칼을 포함하며, 바람직하게는 1 내지 약 12 탄소원자를 갖 는 직쇄형 또는 분지형 라디칼을 포함한다. 더욱 바람직한 알킬 라디칼은 1 내지 6개의 탄소원자를 갖는 저급 알킬이다. 이와 같은 라디칼의 예로서는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, t-부틸, 펜틸, iso-아밀, 헥실 등을 들 수 있다. 1 내지 3개의 탄소원자를 갖는 저급 알킬 라디칼이 더욱 더 바람직하다.

상기 화학식 I의 화합물은 바람직하게는 베타인, D-카르니틴 및 N,N-디메틸글리신 등이다. 각각의 구조는 하기와 같다.

상기 화학식 I의 화합물과 유사한 화합물로서, 하기 구조의 사코신을 예로 들 수 있다.

그러나, 하기 실시예에서 보는 바와 같이, 사코신은 아민에 메틸기가 한 개만 치환되어 있어, 본 발명의 목적에 적합하지 않다는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 적합한 화학식 I의 화합물은 아민이 적어도 2개 이상의 알킬기를 포함해야 하는 것이다.

베타인은 핵산의 깊은 골 (major groove)의 AT와 우선적으로 상호작용한다. 정확한 기작은 알려져 있지 않지만, 단백질을 핵화시키기 위해 단백질 핵화 물질과 베타인을 단백질을 포함하는 생물학적 시료에 첨가하면 단백질은 핵화되면서 핵산은 상층액에 그대로 남아 있게 된다. 단백질 핵화 물질은 단백질을 완전하게 침전시키지는 않고, 수개의 단백질 분자를 뭉치게 하는 물질을 말한다. 단백질 핵화는 단백질 침전제를 단백질 침전시보다 낮은 농도로 이용하여 수득한다.

본 발명은 또한 상기 혼합물을 소수성 표면 물질로 처리하는 단계를 포함한다. 상기 화학식 I의 화합물 및 단백질 핵화 물질이 포함된 생물학적 시료의 혼합물을 소수성 표면 물질로 처리하면, 핵화된 단백질은 상기 소수성 표면 물질에 결합하게 되며, 핵산은 그대로 용액 중에 존재하게 된다. 따라서, 화학식 I의 화합물의 존재로 인해 단백질을 포함하는 생물학적 시료로부터 선택적으로 단백질만 제거할 수 있게 되는 것이다.

본 발명은 또한 상기 단백질이 결합된 소수성 표면 물질로부터 시료를 분리하는 단계를 포함한다. 세포 용해액 중에 존재하는 단백질은 소수성 표면 물질에 결합되었기 때문에, 단백질이 제거되고 핵산은 존재하는 시료를 분리할 수 있는 것이다. 단백질이 제거된 상기 시료는 PCR 등의 이후 과정에 효율적으로 이용될 수 있는 것이다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 베타인의 농도는 0.15M ∼ 2M인 것이 바람직하다. 베타인의 농도가 상기 범위를 벗어나면 핵산이 침전되거나 단백질 제거율을 낮출 수 있기 때문이다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 단백질 핵화 물질은 트리클로로아세트산(TCA), 황산암모늄, 아세톤, 및 에탄올 등과 같은 유기 용매를 포함할 수 있다. 단백질 핵화 물질은 단백질을 완전하게 침전시키지는 않고, 수개의 단백질 분자를 뭉치게 하는 물질을 의미한다. 본 발명에서는 단백질을 완전히 침전시키지 않고, 핵화만 시켜도 여기에 소수성 표면 물질로 처리하면 핵화된 단백질이 소수성 표면 물질에 결합되기 때문에 고 농도의 단백질 핵화 물질이 필요하지 않게 되는 것이다. 고 농도의 단백질 핵화 물질은 단백질 제거 단계 후의 과정에서 문제를 야기할 수 있으므로, 저 농도의 단백질 핵화 물질을 사용하는 것이 유리할 수 있으며, 본 발명에서 상기 트리클로로아세트산의 농도는 0.5 ∼ 5%인 것이 바람직하다. 트리클로로아세트산의 농도가 0.5% 미만이면 단백질이 잘 핵화되지 않는 문제가 발생하며, 5%를 초과하면 이후 단계에서 문제를 야기할 수 있다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 소수성 표면 물질은 소수성 물질의 코팅 등에 의해 표면이 소수성을 띠는 고체 지지체(solid support)를 의미하고, 상기 고체 지지체는 비드, 슬라이드 글라스, 실리콘 웨이퍼, 막, 및 금속판 등을 포함할 수 있다. 세포 용해시 단백질은 대부분 변성되게 된다. 변성된 단백질은 소수성 코아, 즉 소수성 아미노산들이 단백질 표면으로 돌출되므로, 친수성 표면 물질보다 는 소수성 표면 물질에 더욱 용이하게 결합하게 된다. 따라서, 표면이 소수성인 물질은 본 발명에 제한 없이 이용이 가능하다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 단백질이 결합된 소수성 표면 물질의 제거는 원심분리, 여과, 자성으로 구성된 군으로부터 선택된 방법에 의해 수행될 수 있다. 생물학적 시료로부터 핵산을 효율적으로 정제하기 위해서는 단백질이 결합된 소수성 표면 물질은 제거되어야 한다. 단백질이 결합된 소수성 표면 물질은 원심분리, 여과, 자성 등의 방법에 의해 제거될 수 있다. 여과는 랩온어칩의 구현에 적합할 수 있다. 즉, 단백질이 결합된 소수성 표면 물질을 단지 막 필터로 제거함으로써 단백질이 제거된 세포 용해액을 이후 단계에서 이용할 수 있으며, 제조가 간단한 장점이 있는 것이다. 또한, 소수성 물질을 랩온어칩의 채널 벽에 코팅함으로써, 마이크로채널을 통해 시료가 유동될 때, 시료 중의 단백질은 채널 벽에 결합하며, 핵산은 다음 공정으로 이동할 수 있다. 본 발명의 방법이 정지(static) 상태의 단백질을 포함하는 용액으로부터 단백질을 제거하는 것도 가능하지만, 마이크로채널 내에서 유동하는 단백질을 포함하는 용액으로부터 단백질을 제거하는 것도 가능한 것이다. 이는 마이크로채널의 벽에 소수성 표면 물질을 코팅한 후, 단백질을 포함하는 용액을 통과시키면 통과하는 과정에서 단백질은 마이크로채널 벽에 결합하게 되며, 핵산은 그대로 통과하므로 핵산 정제에 유용하게 이용될 수 있는 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시 예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 폴리스티렌 비드를 이용한 단백질 제거

소수성 표면을 갖는 폴리스티렌 비드가 단백질을 효율적으로 제거할 수 있는지를 알아보기 위해, 단백질로서 변성되지 않은 BSA 및 변성된 BSA를 이용하였다. 폴리스티렌 비드는 입경이 4㎛이며, BSA는 각각 0.2mg/ml 및 0.1mg/ml 용액을 이용하고, BSA의 변성은 5분 동안 보일링하는 방법에 의해 수행하였다. 먼저, Eppendorf 튜브에 폴리스티렌 비드(2×10⁷개)를 넣고, 여기에 상기 준비한 BSA 용액 90㎕을 첨가한 후, 실온에서 5분 동안 반응시켰다. 이어서, 상층액을 취하여 280nm에서 흡광도(A₂₈₀)를 측정하였다. 도 1은 각 시료에 따른 A₂₈₀를 나타낸 그래프이다. 시료 1은 BSA 대조군으로서, 폴리스티렌 비드를 첨가하지 않고, BSA도 변성시키지 않은 것이며, 시료 2는 폴리스티렌 비드는 첨가하지 않았으나, BSA를 변성시킨 것이며, 시료 3은 BSA는 변성시키지 않았으나, 폴리스티렌 비드를 첨가한 것이며, 시료 4는 BSA를 변성시키고 폴리스티렌 비드를 첨가한 것이다.

도 1에서 보는 바와 같이, BSA 용액의 농도가 0.2mg/ml인 경우에는 이용한 폴리스티렌 비드의 양이 너무 적어 단백질 변화량이 효과적으로 나타나지 않았다. 그러나, BSA 용액의 농도가 0.1mg/ml인 경우에는 폴리스티렌 비드를 이용하지 않은 경우(시료 2)와 비교하여 폴리스티렌 비드를 이용한 경우(시료 4)에 상당량의 단백질이 상층액에서 제거되었다는 것을 알 수 있다. 이는 변성된 단백질이 폴리스티 렌 비드에 상당량 결합되었다는 것을 의미하는 것이며, 상기 결과로부터 폴리스티렌 비드가 단백질을 제거하는데 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다.

실시예 2: TCA 및 폴리스티렌 비드를 이용한 단백질 제거

소수성 표면을 갖는 폴리스티렌 비드 및 TCA가 단백질을 효율적으로 제거할 수 있는지를 알아보기 위해, 단백질로서 변성된 BSA를 이용하였다. 폴리스티렌 비드는 입경이 4㎛이며, TCA는 0.8%를 이용하고, BSA는 0.1mg/ml 용액을 이용하고, BSA의 변성은 5분 동안 보일링하는 방법에 의해 수행하였다. 먼저, Eppendorf 튜브에 폴리스티렌 비드(2×10⁷개)를 넣고, 여기에 상기 준비한 BSA 용액 99㎕을 첨가하고, TCA는 최종 농도가 0.8%가 되게 첨가한 후, 실온에서 5분 동안 반응시켰다. 이어서, 상층액을 취하여 280nm에서 흡광도(A₂₈₀)를 측정하였다. 도 2는 각 시료에 따른 A₂₈₀를 나타낸 그래프이다. 본 실험에서 BSA는 모두 변성된 것을 이용하였다. 시료 1은 BSA 대조군으로서, 폴리스티렌 비드 및 TCA를 첨가하지 않은 것이며, 시료 2는 폴리스티렌 비드는 첨가하지 않았으나, TCA를 첨가한 것이며, 시료 3은 TCA는 첨가하지 않았으나, 폴리스티렌 비드를 첨가한 것이며, 시료 4는 TCA 및 폴리스티렌 비드를 첨가한 것이다.

도 2에서 보는 바와 같이, TCA만을 이용한 경우(시료 2)에는 단백질이 적게 제거되는 반면, 폴리스티렌 비드를 이용한 경우(시료 3)에는 보다 많은 단백질이 제거되며, TCA 및 폴리스티렌 비드를 이용한 본 발명의 경우(시료 4)에는 상층액에 존재하는 거의 대부분의 단백질이 제거되는 것을 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 방법을 이용하면 세포 용해액의 상층액에 존재하는 단백질의 대부분을 제거할 수 있다는 것을 알 수 있는 것이다.

실시예 3: 베타인에 의한 핵산의 침전 저해 효과

베타인이 핵산 용액의 침전을 저해할 수 있는지, 즉, 핵산을 상층액 중에 유지할 수 있는지를 알아보기 위해, 대장균(E. coli) 게놈 DNA를 이용하였다. 폴리스티렌 비드는 입경이 4㎛이며, TCA는 0.8%를 이용하고, 대장균 게놈 DNA는 25ng/㎕를 이용하고, 베타인은 각각 0M, 0.5M, 및 1M 을 이용하였다. 먼저, 상기 각각의 농도의 베타인 용액에 대장균 게놈 DNA를 25ng/uL 농도가 되도록 첨가한 후, 이 용액 99㎕를 Eppendorf 튜브에 넣고 폴리스티렌 비드를 2×10⁷개 첨가하였다. 여기에 TCA를 최종 농도가 0.8%가 되게 첨가한 후, 실온에서 5분 동안 반응시켰다. 이어서, 최종 농도가 1×PBS가 되도록 10×PBS(Invitrogen, 미국)를 첨가하여 상기 반응물을 중화시켰다. 이어서, 5000×g에서 5분 동안 원심분리하여 폴리스티렌 비드를 침전시킨 후, 상층액을 취하여 260nm에서 흡광도(A₂₆₀)를 측정하였다. 표 1은 상층액에 존재하는 대장균 게놈 DNA의 상대적인 양을 나타낸 것이다.

	0M 베타인	0.5M 베타인	1M 베타인
대조군	100%	100%	100%
TCA	0%	68.7%	76.2%
TCA-비드	0%	61.6%	74.1%

상기 표 1에서 보여주는 바와 같이, 베타인을 첨가하지 않은 경우에는 TCA만을 첨가한 경우 및 TCA-폴리스티렌 비드를 첨가한 경우 모두 DNA가 침전되어 상층액에는 DNA가 존재하지 않는다는 것을 알 수 있다. 즉, TCA는 단백질을 효율적으로 제거하지만, 상층액 중에 존재하는 DNA도 침전시킨다는 것을 알 수 있다. 그러나, 여기에 베타인을 첨가하면 DNA가 거의 침전되지 않고, 상층액 중에 60∼70% 존재한다는 것을 알 수 있다. 즉, 베타인을 첨가함으로 인해 상층액 중에 존재하던 DNA가 TCA와 함께 침전되지 않고, 베타인의 보호하에 상층액에 존재할 수 있는 것이다.

실시예 4: PCR 증폭을 이용한 TCA에 의한 핵산의 침전 효과 확인

상기 실시예 3에서 수행된 실험에서 베타인을 첨가하지 않고, TCA 및 폴리스티렌 비드를 첨가한 경우에 대장균 게놈 DNA가 모두 침전되는지를 PCR로 다시 한번 확인하였다.

상기 실시예 3에서 이용된 대장균 게놈 DNA를 주형으로 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 에 이용된 프라이머는 하기와 같다: 정방향 프라이머 (서열번호 1); 및 역방향 프라이머 (서열번호 2). 이 프라이머 쌍은 16S RNA에 해당하는 부위이다. PCR 증폭은 Taq 중합효소 (Solgent, 한국)를 이용하여 40 사이클(95℃에서 1분 동안 예비변성, 95℃에서 5초 동안 변성, 60℃에서 15초 동안 어닐링 및 72℃에서 15초 동안 신장)동안 수행하였다. 증폭된 DNA 를 시판되는 DNA 500 분석 규모의 시약 세트를 이용하여 Agilent BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)에서 분석하였다.

도 3은 TCA 및 폴리스티렌 비드를 이용하여 단백질을 제거한 후의 상층액에 존재하는 대장균 게놈 DNA의 증폭된 PCR 산물의 농도를 나타낸 것이다. 막대기는 증폭된 DNA 농도(ng/㎕)를 나타낸다. PCR 산물의 양은 Agilent BioAnalyzer 2100 의 사용으로 정량화되었다. 시료 1 내지 4는 TCA 및 폴리스티렌 비드를 이용하여 단백질을 제거한 후 상층액 중에 존재하는 대장균 게놈 DNA를 PCR 한 것이고, 시료 5 및 6은 양성 대조군으로서, 정제된 주형 DNA를 이용하여 PCR을 한 것이며, 시료 7은 음성 대조군으로서 주형 DNA 없이 PCR 한 것이다. 도 3에서 보여주는 바와 같이, TCA 및 폴리스티렌 비드를 이용하면, 대장균 게놈 DNA 도 모두 침전이 되고, 상층액에는 DNA가 존재하지 않게 되어 PCR이 전혀 되지 않는다는 것을 알 수 있다.

따라서, TCA 및 폴리스티렌 비드를 이용하여 단백질을 제거하는 경우에, 상층액 중에 존재하는 핵산도 같이 침전되므로, 베타인을 함께 첨가해야 한다는 것을 알 수 있다.

실시예 5: 베타인, TCA 및 폴리스티렌 비드에 의한 단백질의 제거 효과

상기 실시예 3에서 핵산의 침전을 저해하기 위해 베타인이 반응물에 첨가되어야 한다는 것을 알 수 있었다. 본 실시예에서는, 베타인의 존재하에도 단백질이 효율적으로 제거될 수 있는지를 알아 보았다. 폴리스티렌 비드는 입경이 4㎛이며, TCA는 0.8%를 이용하고, 단백질은 변성된 BSA 0.2mg/ml을 이용하고, 베타인은 각각 0M, 0.5M, 및 1M 을 이용하였다. 먼저, 상기 각각의 농도를 갖는 베타인 용액에 변성된 BSA를 0.2mg/ml 농도가 되도록 첨가한 후, 상기 용액 99㎕를 Eppendorf 튜브에 넣고 폴리스티렌 비드를 2×10⁷개 첨가하였다. 여기에 TCA를 최종 농도가 0.8%가 되게 첨가한 후, 실온에서 5분 동안 반응시켰다. 이어서, 최종 농도가 1×PBS가 되도록 10×PBS(Invitrogen, 미국)를 첨가하여 상기 반응물을 중화시켰다. 이어서, 5000×g에서 5분 동안 원심분리하여 폴리스티렌 비드를 침전시킨 후, 상층액을 취하여 280nm에서 흡광도(A₂₈₀)를 측정하였다. 표 2는 상층액 중에 존재하는 BSA의 상대적인 양을 나타낸 것이다.

	0M 베타인	0.5M 베타인	1M 베타인
대조군	100%	100%	100%
TCA	94.2%	100%	95.5%
TCA-비드	32.7%	37.4%	50%

상기 표 2에서 보여주는 바와 같이, TCA 단독에 베타인을 첨가한 경우에는 단백질의 제거 효율이 낮지만, TCA 및 폴리스티렌 비드에 베타인을 첨가한 본 발명의 경우에는 단백질 제거 효율이 매우 높다는 것을 알 수 있다.

따라서, TCA, 폴리스티렌 비드 및 베타인을 이용하여 단백질을 제거하는 본 발명은 핵산은 상층액에 유지하면서 단백질만 선택적으로 제거할 수 있음을 보여준다.

도 4는 상기 본 발명의 방법을 이용하여 베타인 농도에 따른 상층액 중에 존재하는 단백질 및 게놈 DNA의 잔존율을 나타내는 그래프이다. 도 4에서 보여주는 바와 같이, 베타인의 농도가 0M인 경우에는 게놈 DNA 모두가 침전되어 상층액에는 전혀 게놈 DNA가 존재하지 않으나, 베타인 농도를 증가시킬수록 상층액 중에 존재하는 게놈 DNA의 잔존율이 증가한다는 것을 알 수 있다. 물론, 베타인의 농도가 증가할수록 상층액 중에 존재하는 단백질의 농도도 약간은 증가함을 알 수 있다. 상기 결과로부터 단백질은 최대한 침전시키고, 핵산은 최소한으로 침전시키는 베타인의 최적 농도를 수득할 수 있을 것이다.

실시예 6: PCR 증폭을 이용한 베타인 농도별 핵산의 잔존 효과 확인

베타인의 농도에 따른 대장균 세포 용해액 중에 존재하는 핵산의 잔존율을 PCR 증폭을 통해 알아보았다.

폴리스티렌 비드는 입경이 4㎛이며, TCA는 0.8%를 이용하고, 베타인은 0.1M 내지 1M 을 이용하였다. 먼저, 대장균(E. coli) 세포 용해액 99㎕에 베타인을 상기 각각의 농도가 되도록 첨가하고, TCA는 최종 농도가 0.8%가 되게 첨가한 후, 폴리스티렌 비드(2×10⁷개)를 넣고 실온에서 5분 동안 반응시켰다. 이어서, 최종 농도가 1×PBS가 되도록 10×PBS(Invitrogen, 미국)를 첨가하여 상기 반응물을 중화시킨 후, 상층액에서 10㎕를 취하여 PCR을 수행하였다. PCR 에 이용된 프라이머는 하기와 같다: 정방향 프라이머 (서열번호 1); 및 역방향 프라이머 (서열번호 2). 이 프라이머 쌍은 16S RNA에 해당하는 부위이다. PCR 증폭은 Taq 중합효소 (Solgent, 한국)를 이용하여 40 사이클(95℃에서 1분 동안 예비변성, 95℃에서 5초 동안 변성, 60℃에서 15초 동안 어닐링 및 72℃에서 15초 동안 신장)동안 수행하였다. 증폭된 DNA 를 시판되는 DNA 500 분석 규모의 시약 세트를 이용하여 Agilent BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)에서 분석하였다.

도 5는 베타인 농도에 따라 증폭된 PCR 산물의 농도를 나타낸 것이다. 막대기는 증폭된 DNA 농도(ng/㎕)를 나타낸다. PCR 산물의 양은 Agilent BioAnalyzer 2100 의 사용으로 정량화되었다. PTC는 양성 대조군으로서, 정제된 주형 DNA를 이용하여 PCR을 한 것이며, NTC 는 음성 대조군으로서 주형 DNA 없이 PCR 한 것이다. 도 5에서 보여주는 바와 같이, 대체로 베타인의 농도가 높을수록 PCR 산물의 농도가 증가하나, 일정 농도 이상, 예를 들면, 0.5M 이상에서는 큰 차이가 없음을 알 수 있다.

실시예 7: 베타인과 유사 구조를 갖는 화합물에 의한 핵산의 침전 저해 효과

베타인과 유사한 구조를 갖는 화합물이 핵산 용액의 침전을 저해할 수 있는지, 즉, 핵산을 상층액 중에 유지할 수 있는지를 알아보기 위해, 베타인과 유사 구조를 갖는 화합물인 D-카르니틴, 사코신, 및 N,N-디메틸글리신을 이용하였다. 각각의 화합물의 농도를 1M 을 이용한 것을 제외하고는 상기 실시예 6과 유사하게 실험을 수행하였다.

도 6은 베타인과 유사한 구조를 갖는 화합물을 이용하여 단백질을 제거한 후의 상층액에 존재하는 대장균 게놈 DNA의 증폭된 PCR 산물의 농도를 나타낸 것이다. 막대기는 증폭된 DNA 농도(ng/㎕)를 나타낸다. PCR 산물의 양은 Agilent BioAnalyzer 2100 의 사용으로 정량화되었다. 시료 1은 TCA 만을 이용하여 단백질을 제거한 후 상층액 중에 존재하는 대장균 게놈 DNA를 PCR 한 것이고, 시료 2는 카르니틴을 이용한 것이며, 시료 3은 사코신을 이용한 것이며, 시료 4는 N,N-디메틸글리신을 이용한 것이며, 시료 5는 양성 대조군으로서, 정제된 주형 DNA를 이용하여 PCR을 한 것이며, 시료 6은 음성 대조군으로서 주형 DNA 없이 PCR 한 것이다. 도 6에서 보여주는 바와 같이, TCA 만을 이용하면, 대장균 게놈 DNA 도 모두 침전이 되고, 상층액에는 DNA가 존재하지 않게 되어 PCR이 전혀 되지 않는다는 것을 알 수 있다. 반면에, 4차 암모늄인 카르니틴은 DNA 보호(shielding) 효과가 가장 커서 DNA가 침전되는 것으로부터 보호되어 PCR 산물의 농도가 높다는 것을 알 수 있으며, 아미노기의 수소가 메틸기로 모두 치환된 N,N-디메틸글리신의 경우에도 어느 정도 DNA 보호 효과를 보인다는 것을 알 수 있다. 그러나, 아미노기의 수소가 한 개만 메틸기로 치환된 사코신의 경우에는 DNA 보호 효과가 없음을 알 수 있다. 따라서, 상기 결과로부터 아미노기의 수소가 2개 이상 알킬기로 치환되어야 DNA 보호 효과가 있음을 알 수 있었다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 단백질을 포함하는 생물학적 시료로부터 단백질은 효율적으로 제거하고, 핵산은 시료 중에 존재하게 함으로써 단백질을 선택적으로 제거할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

단백질을 포함하는 생물학적 시료에 하기 화학식 I의 화합물:

[화학식 I]

[식 중, R¹, R², 및 R³는 각각 독립적으로 수소원자 또는 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 6의 알킬기이며, a는 1 내지 6의 정수이다 (단, 아민은 2개 이상의 알킬기를 포함한다)];

및 단백질 핵화 물질(nucleating agent)을 첨가하는 단계;

상기 혼합물을 소수성 표면 물질로 처리하는 단계; 및

상기 단백질이 결합된 소수성 표면 물질로부터 시료를 분리하는 단계

를 포함하는 생물학적 시료 중의 핵산을 유지하면서 단백질을 제거하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물은 베타인, 카르니틴, 및 N,N-디메틸글리신으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물의 농도는 0.15M ∼ 2M인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단백질 핵화 물질은 트리클로로아세트산(TCA), 황산암모늄, 아세톤, 및 에탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 트리클로로아세트산의 농도는 0.5 ∼ 5%인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 소수성 표면 물질은 표면이 소수성을 띠는 고체 지지체(solid support)로서, 상기 고체 지지체는 비드, 슬라이드 글라스, 실리콘 웨이퍼, 막, 및 금속판으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단백질이 결합된 소수성 표면 물질로부터 시료의 분리는 원심분리, 여과, 및 자성으로 구성된 군으로부터 선택된 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단백질이 결합된 소수성 표면 물질로부터 시료의 분리는 마이크로채널에 소수성 물질이 코팅된 미세유동장치를 통과하는 시료의 유동 에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.