DE4422044A1 - Verfahren zur Isolierung, Reinigung und ggf. Lagerung von Nukleinsäuren - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren aus unterschiedlichen biologischen und anderen Ausgangsmaterialien. Es ist für eine Vielzahl von biologisch-, molekularbiologisch-, medizinisch-analytisch- sowie biochemisch arbeitenden Laboratorien von großer Bedeutung. Damit sind Anwendungsgebiete der Erfindung die Molekularbiologie, Biochemie, Gentechnik und Medizin.

Üblicherweise werden Nukleinsäuren aus Zellen und Geweben dadurch gewonnen, daß die Ausgangsmaterialien unter stark denaturierenden und reduzierenden Bedingungen, teilweise auch unter Verwendung von proteinabbauenden Enzymen aufgeschlossen, die austretenden Nukleinsäurefraktionen über Phenol-Chloroform- Extraktionsschritte gereinigt und die Nukleinsäuren mittels Dialyse oder Ethanolpräzipitation aus der wäßrigen Phase gewonnen werden (Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T., 1989, CSH, "MolecularCloning").

Diese "klassischen Verfahren" zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Zellen und besonders aus Geweben sind sehr zeitaufwendig (teilweise länger als 48 h), erfordern einen erheblichen apparativen Aufwand und sind darüber hinaus auch nicht unter Feldbedingungen realisierbar. Außerdem sind solche Methoden auf Grund der verwendeten Chemikalien wie Phenol und Chloroform in einem nicht geringen Maße gesundheitsgefährdend.

Verschiedene alternative Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus unterschiedlichen biologischen Ausgangsmaterialien ermöglichen, die aufwendige und gesundheitsschädigende Phenol-Chloroform-Extraktion von Nukleinsäuren zu umgehen sowie eine Reduzierung der zeitlichen Aufwendungen zu erreichen.

Alle diese Verfahren basieren auf einer von Vogelstein und Gillespie (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615-619) entwickelten Methode zur präparativen und analytischen Reinigung von DNA aus Agarosegelen.

Die Methode kombiniert die Auflösung der die zu isolierende DNA-Bande enthaltende Agarose in einer gesättigten NaJ-Lösung mit einer Bindung der DNA an Glaspartikel in Gegenwart einer gesättigten Lösung des chaotropen Salzes NaJ. Die an die Glaspartikel fixierte DNA wird anschließend mit einer Waschlösung (20 mM Tris HCl [pH 7,2]; 200 mM NaCl; 2 mM EDTA; 50% v/v Ethanol) gewaschen und abschließend von den Trägerpartikeln abgelöst.

Diese Methode erfuhr bis heute eine Reihe von Modifikationen und wird zum gegenwärtigen Zeitpunkt für unterschiedliche Verfahren der Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren aus unterschiedlichen Herkünften angewendet (Marko, M.A., Chipperfield, R. und Birnboim, H.G., 1982, Anal. Biochem., 121, 382-387).

Ein kommerziell verfügbares Verfahren zu Isolierung von Nukleinsäuren aus unterschiedlichen biologischen Herkünften ist in der Patentschrift DE 36 39 949 aufgeführt.

Das Verfahren nutzt Vorrichtungen, mit welchen die Nukleinsäuren nach erfolgtem schonenden Aufschluß der Gewebezellen, Körperzellen und Körperflüssigkeiten an einer porösen Matrix (modifiziertes Silicagel; Partikelgröße der porösen Matrix 15 bis 250 µm; Porendurchmesser 100 bis 2500 nm; Anionenaustauscher) fixiert werden, die abzutrennenden Substanzen von der Matrix mittels einer Waschlösung geringer Ionenstärke abgetrennt und die fixierten Nukleinsäuren anschließend von der Matrix mittels einer Lösung hoher Ionenstärke eluiert werden.

Ein weiteres patentiertes Verfahren (DE 40 34 036) besteht darin, daß Zellen in einer porösen Matrix immobilisiert, anschließend lysiert, die austretenden Nukleinsäuren auf der Oberfläche der Matrix fixiert und davon eluiert werden. Dabei wird eine Vorrichtung benutzt, welche aus einem Hohlkörper besteht, bei dem sich die Matrix zwischen zwei porösen Einrichtungen befindet. Die eingesetzte Matrix (ein organisches oder anorganisches Polymeres mit Ionenaustauschereigenschaften; Partikelgröße 15 bis 25 µm) weist eine Hohlraumgröße von 10 bis 50 µm auf. Die Elution der Nukleinsäuren von der Matrix erfolgt unter der Verwendung von Puffern hoher Ionenstärke bzw. alkalischer Puffer.

Das Patent DE 41 19 574 beschreibt ein Verfahren zur Lagerung und zum Transport von Nukleinsäuren. Dabei werden Nukleinsäuren unter Bedingungen hoher Pufferkonzentrationen an mineralische Feststoffe der Partikelgröße von 0,1 bis 1000 µm gebunden und unter Bedingungen geringer Ionenkonzentrationen vom mineralischen Träger wieder eluiert. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß als Hochsalzpuffer 5 M NaCl verwendet wird und der Elutionspuffer 100 mM NaCl ist. Die Nukleinsäuren werden weiterhin in getrockneter Form oder in Suspension mit organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise Ethanol, gelagert.

Ein wesentlicher Nachteil der Verwendung poröser Trägermaterialien (Patent DE 36 39 949 und Patent DE 40 34 036) besteht in einer ungenügenden Reinigung der Nukleinsäuren. In diesem Zusammenhang kann z. B. eine Kontamination extrahierter DNA mit Salzen u. U. eine weitere Bearbeitung der Nukleinsäuren unmöglich werden lassen.

Die Erfindung hat das Ziel, eine Trennung, Reinigung und ggf. Lagerung von Nukleinsäuren aus unterschiedlichen biologischen und anderen Ausgangsmaterialien zu erreichen.

Dabei soll das Verfahren sehr einfach handhabbar sein, nur geringe apparative Ausrüstung benötigen, auf Phenol-Chloroform-Extraktionen sowie Ethanolpräzipitationen verzichten sowie mit geringem zeitlichen Aufwand realisierbar sein, was gestatten soll, einen großen Probenumfang zu bearbeiten.

Die isolierten Nukleinsäuren sollen einem breiten Spektrum unterschiedlicher Anwendungen, wie z. B. PCR, Hybridisierungen, Klonierungen, Sequenzierungen, zugänglich sein.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird gemäß den Ansprüchen 1-12 realisiert. Es ist dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuren enthaltenden Ausgangsmaterialien lysiert, das Lysat mit einem nichtporösen, hochdispersen SiO₂-Träger inkubiert, der Träger mit den gebundenen Nukleinsäuren abgetrennt und mit Pufferlösung gewaschen und nachfolgend die Nukleinsäuren mit einem Puffer geringer Salzkonzentration vom Träger abgelöst werden.

Die Fixierung der Nukleinsäuren erfolgt an der Oberfläche von hochdispersen und nichtporösen Feststoffpartikeln, vorzugsweise mit einem Partikeldurchmesser von 40 nm, bei einer aktiven Oberfläche von ca. 50 m²/g unter Anwesenheit chaotroper Salze hoher Ionenstärken.

Überraschenderweise ist das erfindungsgemäß eingesetzte Trägermaterial gemäß den Ansprüchen 13-14 mit diesen physikalischen Eigenschaften ideal für die Isolation und Reinigung von Nukleinsäuren geeignet.

Dieses Trägermaterial gemäß den Ansprüchen 13-14 ist wesentlich kleiner als von anderen Autoren verwendete Materialien zur Fixierung von Nukleinsäuren und besitzt in Kombination mit den verwendeten Techniken zur Isolierung von Nukleinsäuren eine Reihe entscheidender Vorteile. So setzt sich das Trägermaterial unter Einfluß der Schwerkraft nicht ab und verbleibt damit in Suspension. Dies ist von nicht unerheblichem Einfluß auf das DNA-Bindungsvermögen je Zeiteinheit.

Eine hohe Bindungskapazität sowie Rückgewinnungseffizienz fixierter Nukleinsäuren wird zudem durch die sehr große spezifische Oberfläche der Trägerpartikel erreicht. Weiterhin wirkt sich die direkte Exponierung trägerfixierter Nukleinsäuren auf der Oberfläche der SiO₂-Partikel günstig auf die Reinigung der Nukleinsäuren von Proteinen, Salzen und anderen möglichen Kontaminationen aus, was in diesem Zusammenhang auch einen wesentlichen Vorteil vor allem gegenüber verwendeten porösen Trägermaterialien bedeutet.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Bindung der zu isolierenden und zu reinigenden Nukleinsäuren an die SiO₂-Partikel in Gegenwart von 6 M Natriumjodid bzw. 5 M Guanidinthiocyanat. Dabei handelt es sich bei den an die SiO₂-Partikel zu bindenden Nukleinsäuren vorrangig um DNA, welche aus verschiedensten Quellen isoliert wird, wobei die Verfahren in modifizierter Form auch zur Isolierung von RNA eingesetzt werden können. Mit den erfindungsgemäßen Verfahren besteht die Möglichkeit der Extraktion von Nukleinsäuren aus TAE- bzw. TBE-Gelen, aus bakteriellen Lysaten, aus Zellkulturen, intakten oder gefrorenen Gewebeproben, Gewebeschnitten, Viren, Spermien, Körperflüssigkeiten, Pflanzenzellen, Hefezellen und auch aus musealen biologischen Trockenpräparaten.

Die Möglichkeit der Extraktion von DNA-Fragmenten aus TBE-Agarosegelen kann ohne Zusatz spezieller Pufferkomponenten erfolgen, da Borat-Ionen keinen inhibierenden Einfluß auf die Fixierung der DNA an den Träger besitzen. Dies bedeutet einen erheblichen Vorteil gegenüber anderen Trägermaterialien.

Von sehr großer Bedeutung ist, daß das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolation von Nukleinsäuren aus Zellkulturen, gefrorenen oder intakten Geweben und Gewebeschnitten sowie Biopsiematerial mit einem extrem geringen zeitlichen sowie auch apparativen Aufwand realisiert wird.

Dabei werden auch nur sehr geringe Mengen an biologischen Ausgangsmaterialien benötigt.

Die Lyse der biologischen Ausgangsmaterialien, außer bei der Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterien, ist mit der Fixierung der austretenden Nukleinsäuren an den Träger kombiniert, d. h. sowohl Lyse als auch Bindungsreaktion erfolgen im selben Reaktionsgefäß unter den selben Pufferbedingungen.

Dabei besteht der verwendete Lysepuffer vorzugsweise aus 5 M Guanidinthiocyanat, 0,6% w/v Sarcosyl, 0,2 M EDTA, 0,2 mM DTT.

Es sind dadurch keine zeitaufwendige SDS-Lyse bzw. Proteinase K-Verdauung, Phenol-Chloroform-Extraktions- und aufwendige Zentrifugationsschritte notwendig. Eine solche kombinierte Methode ermöglicht es, Nukleinsäuren aus eukaryontischen Zellkulturen und auch aus Gewebematerialien in ca. 0,5-1,5 h zu isolieren. Der geringe zeitliche Aufwand von solchen Präparationsmethoden stellt für eine Vielzahl von potentiellen Anwendern von Methoden zur Isolierung von Nukleinsäuren eine enorm wichtige Größe dar und bedeutet damit einen entscheidenden Vorteil gegenüber anderen Verfahren. Die beschriebene Kombination von Lyse und Bindungsreaktion in einem Reaktionsgefäß bei nur geringen apparativen Ansprüchen gestattet es darüber hinaus, auch Nukleinsäuren aus biologischen Materialien unter Feldbedingungen (z. B. bei Expeditionen) zu isolieren, ohne zusätzliche Kühlbedingungen unter Waschpuffer zu lagern und zu transportieren und die Nukleinsäuren ohne Verlust ihrer biologischen Aktivität einer weiteren Verwendung zuzuführen.

Das erfindungsgemäße Verfahren unterscheidet sich neben der Kombination von Lyse und Bindungsreaktion auch dadurch von der zitierten Patentschrift DE 41 19 574, daß das verwendete Trägermaterial, wie schon beschrieben, andere physikalische Eigenschaften besitzt. Weiterhin wird im erfindungsgemäßen Verfahren 5 M Guanidinthiocyanat und andere Pufferzusätze als Hochsalzpuffer verwendet. Der verwendete Elutionspuffer besteht bevorzugt aus 10 mM Tris HCl und 1 mM EDTA.

Alle mit den erfindungsgemäßen Verfahren isolierten und am Träger fixierten Nukleinsäuren aus unterschiedlichen Ausgangsmaterialien werden mit einem Waschpuffer (50 mM NaCl; 10 mM Tris HCl; 1 mM EDTA; 70% v/v) mehrmals gewaschen. Der verwendete Waschpuffer unterscheidet sich von dem in der von Vogelstein und Gillespie beschriebenen Ausgangsarbeit durch eine geringere Salz- und höhere Ethanolkonzentration. Eine solche Waschpufferzusammensetzung erlaubt ein intensiveres Waschen ohne Verlust an gebundenen Nukleinsäuren.

Das erfindungsgemäße Verfahren benötigt keine Ethanolpräzipitation. Die Elution der Nukleinsäuren erfolgt in einem Elutionspuffer (10 mM Tris HCl; 1 mM EDTA) bei einer Temperatur von vorzugsweise 52°C innerhalb von 5 Minuten.

Die isolierten Nukleinsäuren sind für eine Vielzahl weiterer molekularbiologischer bzw. biochemischer Methoden verfügbar, wie z. B. Spaltung mit Restriktionsendonukleasen, Klonierungen, Sequenzierungen, Polymerase Kettenreaktion, in vitro-Transkription, radioaktiven Markierungen, Hybridisierungsverfahren u. a..

Die Erfindung soll im folgenden durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.

Beispiel 1

Die Präparation von Plasmid-DNA aus bakteriellen Lysaten geschieht wie folgt:
1,5 ml einer E.coli-Übernachtkultur werden in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß (1,5 ml) für 1 Minute zentrifugiert und der Überstand verworfen. Anschließend erfolgt die Zugabe von 100 µl Lösung I (50 mM Glukose, 25 mM Tris HCl [pH 8,0], 10 mM EDTA) und ein kurzes vortexen.

Nach Zugabe von 200 µl Lösung II (0,2 N NaOH, 1,0% SDS) und einer Inkubation für 5 Minuten auf Eis werden 150 µl Lösung III zugegeben und der Ansatz erneut für 5 Minuten auf Eis inkubiert. Durch eine sich anschließende 3minütige Zentrifugation erhält man einen klaren plasmidhaltigen Überstand, welcher in ein neues Eppendorf- Reaktionsgefäß überführt wird. Zu diesem Überstand werden 550 µl Natriumjodidlösung (6 M), 30 µl Trägersuspension sowie 4 ml RNase A (10 mg/ml) zugegeben und das Reaktionsgefäß nach einem kurzen Mixen für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der Träger mit den gebundenen Nukleinsäuren wird nachfolgend durch ein kurzes Zentrifugieren pelletiert und der Überstand verworfen. Es erfolgt dann ein dreimaliges Waschen mit jeweils 1 ml Waschpuffer (50 mM NaCl; 10 mM Tris HCl; 1 mM EDTA; 70% v/v), wobei jeder Waschvorgang ein kräftiges Vortexen einschließt. Nach durchgeführtem letzten Waschschritt wird soviel wie möglich Überstand vom Pellet entfernt und das geöffnete Reaktionsgefäß für 2 bis 5 Minuten in einem Wasserbad bei 52°C zum Entfernen von Ethanol aufbewahrt. Die Elution der Plasmid-DNA erfolgt durch Zugabe von 35 bis 70 µl Elutionspuffer (10 mM Tris HCl; 1 mM EDTA) für 5 Minuten bei 52°C, wobei das Pellet durch kurzes Vortexen im Elutionspuffer suspensiert wird. Nach einem abschließenden Zentrifugieren für 2 Minuten zur Pelletierung der Trägerpartikel wird der plasmidhaltige Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und steht nun einer weiteren Verwendung (Sequenzierung; Restriktionsenzymspaltung; Ligation u. a.) zur Verfügung.

Beispiel 2

Die Extraktion von DNA aus TBE- und TAE-Agarosegelen sowie aus wäßrigen Lösungen geschieht wie folgt:
Zu einer DNA-Probe in wäßriger Lösung werden 3 Volumen Natriumjodidlösung (6 M) sowie 5 µl Trägersuspension zugegeben. Soll DNA aus Agarosegelen isoliert werden, wird als erstes die interessierende DNA-Bande herausgeschnitten und das Gewicht des Gelstückchens bestimmt. Nach Zugabe von 3 Volumen Natriumjodidlösung wird die Agarose bei 52°C innerhalb von ca. 5 Minuten aufgelöst. Danach erfolgt ebenfalls die Zugabe von 5 µl Trägersuspension. Nach einem kurzen Mixen wird der Ansatz für 3 Minuten auf Eis inkubiert und anschließend für 30 Sekunden zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wird wie unter Beispiel 1 beschrieben weiter aufgearbeitet, wobei die Elution in der Regel in einem Volumen von 20 µl erfolgt.

Beispiel 3

Die Isolierung von genomischer DNA aus HeLa-Zellen (Monolayer-Zellkultur; 1 × 10⁵ Zellen) geschieht wie folgt:
Die Zellen werden mit 1× PBS zweimal kurz gespült und aus der Kulturflasche bzw. Platte mit einem "Scrapper" geerntet und in ein 1,5-ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Die Lyse der Zellen erfolgt durch Zugabe von 1 ml Lysepuffer (5 M Guanidinthiocyanat, 0,6% w/v Sarcosyl, 0,2 M EDTA, 0,2 mM DTT) innerhalb von 5-10 Minuten. In das gleiche Reaktionsgefäß werden anschließend 30 µl Trägersuspension zugegeben, kurz gemixt, der Ansatz für 5 Minuten auf Eis inkubiert und anschließend für 1 Minute zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstandes wird das Pellet viermal wie unter Beispiel 1 beschrieben gewaschen und abschließend in einem Volumen von 50 bis 200 µl Elutionspuffer eluiert.

Die isolierte DNA kann sofort für PCR oder Sothern-Untersuchungen verwendet werden.

Beispiel 4

Die Isolierung genomischer DNA aus 15 µg Hamsterleber geschieht wie folgt: Das Gewebe wird mittels eines Scalpells oder anderer Verfahren mechanisch zerkleinert, in einem 1,5-ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß mit 500 µl Lysepufer (5 M Guanidinthiocyanat, 0,6% w/v Sarcosyl, 0,2 M EDTA, 0,2 mM DTT) versetzt und unter zeitweiligem kurzen Vortexen für ca. 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach erfolgter sichtbarer Lyse des Gewebematerials werden in das gleiche Reaktionsgefäß 30 µl Trägersuspension zugegeben und der Ansatz für 5 Minuten auf Eis inkubiert. Nach einer kurzen Zentrifugation wird das Pellet wiederum viermal wie unter Beispiel 1 beschrieben gewaschen und die DNA abschließend in einem Volumen von 100 µl Elutionspuffer aufgenommen. Die isolierte DNA ist wiederum sofort für weitere Verwendungen zugänglich.

Claims (14)

1. Verfahren zur Isolierung, Reinigung und ggf. Lagerung von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß Nukleinsäuren enthaltende Materialien lysiert, das Lysat mit einem nichtporösen, hochdispersen SiO₂-Träger inkubiert, der Träger mit den gebundenen Nukleinsäuren abgetrennt und mit Pufferlösung gewaschen wird und nachfolgend die Nukleinsäuren mit einem Puffer geringer Salzkonzentration vom Träger abgelöst werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lyse des Materials und die Bindung der Nukleinsäuren an das Trägermaterial in einem Reaktionsgefäß durchgeführt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Lyse des Materials und die Bindung der Nukleinsäuren mit Puffern, welche chaotrope Salze hoher Ionenstärke enthalten, durchgeführt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Ionenstärke < 5 molar ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß als chaotropes Salz Guanidinthiocyanat oder Natriumjodid eingesetzt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die trägerfixierten Nukleinsäuren mit einem Waschpuffer, vorzugsweise bestehend aus 50 mM NaCl, 10 mM Tris HCl und 1 mM EDTA sowie 70% v/v Ethanol, gewaschen werden.

7. Verfahren nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß die trägerfixierten Nukleinsäuren vorzugsweise mit einem Puffer niedriger Ionenstärke (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA) bei einer Temperatur von 48-56°C, vorzugsweise 52°C, eluiert werden.

8. Verfahren nach Anspruch 1-7 dadurch gekennzeichnet, daß es als batch-Verfahren durchgeführt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß es als chromatographisches Verfahren durchgeführt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß Nukleinsäuren enthaltene TBE- und TAE-Agarosegele als Material eingesetzt werden und mit einer 6 M Natriumjodidlösung bei einer Temperatur von 50-56°C, vorzugsweise 52°C lysiert werden.

11. Verfahren nach Anspruch 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß Bakterien als Material eingesetzt werden, unter alkalischen Bedingungen lysiert werden und die Bindung von Plasmid-DNA in Anwesenheit einer 6 M Natriumjodidlösung erfolgt.

12. Verfahren nach Anspruch 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß eukaryontische Zellen, intakte oder gefrorene Gewebeproben, Gewebeschnitte und museale biologische Trockenpräparate als Material eingesetzt werden und mit einem Puffer, weicher 5 M Guanidinthiocyanat und andere Pufferkomponenten enthält, lysiert werden.

13. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß es aus hochdispersen, nichtporösen SiO₂-Partikeln mit einer Korngröße von 7-40 nm, vorzugsweise 40 nm, bei einer spezifischen Oberfläche von 50-300 m²/g, vorzugsweise 50 m²/g, besteht.

14. Mittel zur Trennung von Nukleinsäuren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es an unterschiedlichen Klebe- bzw. Chromatographiematerialien fixiert ist.