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TWI407994B - 分離核酸的方法、試劑及套組 - Google Patents

分離核酸的方法、試劑及套組 Download PDF

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TWI407994B
TWI407994B TW098135732A TW98135732A TWI407994B TW I407994 B TWI407994 B TW I407994B TW 098135732 A TW098135732 A TW 098135732A TW 98135732 A TW98135732 A TW 98135732A TW I407994 B TWI407994 B TW I407994B
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nucleic acids
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Pei Shin Jiang
Kun Chan Wu
yu ting Su
Chia Yun Lin
Siou Cing Su
Yuh Jiuan Lin
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Ind Tech Res Inst
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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Description

分離核酸的方法、試劑及套組
本發明係有關於一種分離核酸的方法，且特別有關於一種單一步驟的核酸分離方法與核酸分離試劑。
近年來，分子診斷、藥物基因體學、轉譯醫學及刑事鑑定等興起，各種核酸分析的需求也急速增加，然而，不論要進行何種的核酸分析，首先必須要求高純度的核酸，以及方便、快速的核酸分離方法。
在進行分析時，由於待測物質在液態樣本中存在的時間非常短暫，且樣本中的雜質會影響在檢測的準確度，因此發展出一種核酸的分離技術，即利用一固相載體結合核酸，或是以管柱內壁作為固相載體，再加入微珠至管柱中，利用微珠結合核酸後再將微珠分離出來。此外，目前也發展出利用磁珠分離核酸的方法，主要是利用磁珠結合核酸，再利用磁性將結合核酸的磁珠分離出來。
隨著核酸分離的需求愈來愈頻繁，所需操作的樣本來源也愈來愈廣泛，由於磁性分離技術不需離心或抽真空等步驟，因此可節省處理時間及成本。此外，磁性分離的純化過程快速、操作方便、因此目前磁性分離已逐漸發展成為主要的核酸分離方法。
目前市面上常見之核酸分離技術主要是先處理複雜樣本將核酸釋出，再利用固相結合分離核酸，固相分離部分應用Boom Patent(美國第5234809號專利)之Chatropic Salt 將樣品中的核酸吸附至矽材料(Silica)上，經過清洗步驟之後，再使用沖提緩衝液將矽材料上的核酸沖洗下來，達到分離核酸的效果。此外，美國第6274386號專利則是應用含矽表面材料之磁性固相載體吸附核酸。
然而，不論如何，所有的核酸分離方法皆需經過溶解(lysis)、萃取、沉澱、清洗、沖提等5個步驟，其所花費的時間較長、且容易污染。因此，本發明提供一快速且方便的核酸分離方法及試劑(組成物)，可省去傳統繁複及耗時的多步驟核酸分離方法。
本發明係提供一種分離核酸的方法，包括將一分離試劑與一含有核酸的生物樣本混合後，該分離試劑會使核酸自該生物樣本中分離出來並結合至一固相載體上，不需樣本前處理即可以單步驟分離核酸，其特徵在於：使用之分離試劑包括1-40wt%的聚乙二醇(PEG)及/或大於30wt%的低分子量醇類、鹽類及介面活性劑，藉由改變核酸溶解度結合至固相載體。
本發明另提供一種分離核酸的試劑，包括1-40wt%的聚乙二醇(PEG)及/或大於30wt%的低分子量醇類、一鹽類、一界面活性劑、以及一固相載體。
本發明更提供一種分離核酸的套組，包括一分離試劑，其含有1-40wt%的聚乙二醇(PEG)及/或大於30wt%的低分子量醇類、鹽類、介面活性劑、固相載體及/或蛋白質水解酶，以及一容器。
為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作詳細說明如下：
本發明係提供一種分離及/或純化核酸的方法。在本發明之方法中，將一分離試劑與一生物樣本混合及反應後可分離出生物樣本中的核酸。
在一實施例中，本發明之分離試劑包括1-40wt%的聚乙二醇(PEG)，較佳為5-20wt%的聚乙二醇。
在另一實施例中，本發明之分離試劑包括大於30wt%的低分子量醇類，較佳為40-60wt%的低分子量醇類，其中低分子量醇類的分子量為約30～100g/mol。在一實施例中，低分子量醇類為乙醇。
在另一實施例中，本發明之分離試劑可同時包括聚乙二醇及低分子量醇類。
本發明之分離試劑更包括一鹽類、一界面活性劑、一蛋白質水解酶、以及一固相載體。
本發明所述之鹽類可為任何適用於分子生物實驗之鹽類，包括一鹼金族或鹼土族及/或胺鹽，例如，Li+ 、Na+ 、K+ 、Rb+ 、Cs+ 、Fr+ 、Gu+ (guanidine)、Be2+ 、Mg2+ 、Ca2+ 、Sr2+ 、Ba2+ 、Ra2+ 及/或NH4 + 。在一實施例中，本發明之鹽類可包括一鹵族元素，特別為Cl- 。一般來說，常用之鹽類為Gu-HCl(guanidine hydrochloride)、LiCl、NaCl、Tris-HCl、Gu-SCN(guanidine thiocyanate)或其類似物。
本發明所述之界面活性劑可為離子性界面活性劑、兩性界面活性劑或非離子性之界面活性劑，其中較佳為非離子性之界面活性劑與兩性界面活性劑，非離子性界面活性劑的種類並無特別限制，較佳為聚氧化乙烯類(polyoxyethylene)之非離子性界面活性劑，如Tween 20、Triton X-100、NP40或Brij35等。非離子界面活性劑之使用量或濃度不限制，例如，可為0.01%至40%，較佳為5%至20%，兩性界面活性劑的種類並無特別限制，較佳為CHAPS(3-{(3-cholamidopropyl)dimethylammonio}-propanesulfonate)，兩性界面活性劑之使用量或濃度不限制，例如可為0.01%至20%，較佳為1%至10%。
本發明所述之蛋白質水解酶，可為任何具有水解蛋白質功效之物質，例如嗜熱菌蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、bromelain、Alcalase、Protease K、Flavorzyme或Esperase等，較佳為Protease K。
本發明所述之分離試劑可添加多醣類(polysaccharides)，包括肝醣(glycogen)、澱粉(starch)、聚寡糖(oligosaccharides)、葡聚醣(dextran)、纖維素(cellulose)、瓊脂醣(agarose)、幾丁聚醣(chitosan)、黏多醣(mucopolysaccharides)、或肽聚醣(peptidoglycan)，可增加小分子核酸與固相載體之結合能力，提高核酸產率及純度。
本發明所述之生物樣本為一種含有核酸之生物樣本。本發明之生物樣本並無特別限制，可為任何具有核酸、染色體及/或質體之樣本。在一實施例中，本發明之生物樣本可為真菌、原核生物(細菌)、病毒、動物細胞或植物細胞。在另一實施例中，本發明之生物樣本可為動物之血液、羊水、腦脊液、或皮膚、肌肉、口腔黏膜、胎盤、腸胃道或其他器官之組織液。應注意的是，本發明之生物樣本不需經由任何前處理，可直接與分離試劑反應，即可分離出所需要之核酸。
本發明所述之核酸可為任何天然或人工合成之DNA或RNA分子，包括單股DNA分子、雙股DNA分子、RNA、LNA、PNA、核酸-蛋白質複合體及/或核酸-醣類複合體等。
本發明之分離試劑與生物樣本混合後，於一適當的條件下進行一反應步驟。反應步驟的溫度可為室溫、50℃-80℃，較佳為60-70℃；pH值可為6-9，較佳為7-8，反應時間可為5-30分鐘，較佳為10-20分鐘，最佳為15分鐘。應注意的是，生物材料可直接與本發明之分離試劑反應，而不須進行任何的前處理。
加入分離試劑後，若生物樣本為含有細胞型態之複雜生物樣本或全血檢體，分離試劑可使細胞破裂釋出核酸，且樣本中的核酸會因為溶解度改變而被分離出來，不需事先進行樣本離心、細胞分離、細胞溶裂等前處理步驟。本技術領域人士可選用任何適合的方法進一步純化核酸，例如：分離之核酸可利用酒精清洗來得到更高純度的核酸。
在另一實施例中，分離之核酸可與固相載體結合後，再沖提出來。本發明之分離試劑除了會改變核酸的溶解度外，也會改變核酸的結構，使核酸更易於貼覆在固相載體上，以達到分離的目的。
本發明之固相載體可為一種磁性物質、金屬、金屬氧化物、矽化物、聚合物。固相載體的表面可以化學鍵修飾。在一較佳實施例中，固相載體的表面具有醣類(碳氫化合物)，例如，纖維素、硝化纖維素、葡聚糖或其類似物。在另一實施例中，固相載體的表面具有一疏水基團，例如，C1 -C30 烷基或C5 -C30 芳基等。在另一實施例中，固相載體的表面可具有一親水基團，例如，羥基、羰基、羧基、酯類、胺基、硫基等。
此外，在反應步驟後，可依序進行一清洗程序及沖提程序。
清洗程序包括加入一清洗緩衝液，以移除多餘的鹽類及蛋白質。本發明所述之清洗緩衝液可為任何適合的清洗緩衝液，其主要為移除核酸上的蛋白質、聚醣類、脂質或細胞碎片。一般來說，清洗緩衝液可包含醇類及鹽類，醇類可為乙醇或聚乙二醇。鹽類可為低於3M的氯化鈉或其類似物。一般來說，清洗緩衝液的體積及清洗次數以足以移除雜質(蛋白質、聚醣類、脂質或細胞碎片)，但不影響核酸產量為佳。
在清洗程序後可進行一沖提程序。沖提程序包括加入一沖提緩衝液將核酸由固相載體上沖提出來。沖提緩衝液可為水、TE、TAE或TBE或其類似物。
本發明之分離及/或純化核酸的方法使用單一試劑，以單一步驟完成，可快速、簡便地獲得高純度及高產量的核酸。更重要的是，生物樣本不需經由任何前處理，可直接與分離試劑反應，即可分離出所需要之核酸。
本發明另提供一種核酸的分離試劑，至少包括1-40wt%的聚乙二醇(PEG)及/或大於30wt%的低分子量醇類。
本發明之分離試劑可更包括上述之鹽類、界面活性劑、固相載體及/或蛋白質水解酶。
本發明更提供一種分離核酸的套組，包括一分離試劑，其含有1-40wt%的聚乙二醇(PEG)及/或大於30wt%的低分子量醇類、鹽類、介面活性劑及固相載體、一清洗緩衝液、一容器，以及一使用說明書。
【實施例】
1.全血的核酸分離
在此實施例中使用之分離試劑含有不同濃度之PEG(0%、5%、10%、15%、20%、30%)、鹽類為3M胍鹽酸鹽(Gu-HCl)、介面活性劑為5% Tween-20及0.5μg的磁性固相載體，並含有蛋白質水解酶及6M尿素。
取720μl之本發明分離試劑直接與200μl的人類全血混合，於56℃下，反應10分鐘後，可將核酸分離結合至磁性固相載體上，去除水溶液後，以清洗緩衝液加以洗滌，最後加入200μl無菌去離子水沖堤10分鐘後將磁性固相載體上沖提出來的核酸做分析。此實施例使用之清洗緩衝液為70% EtOH。
由表一可知，本發明之分離方法不需前處理全血樣本中的紅血球，可有效地直接將DNA由全血中分離出來，可自200μl的人類全血中分離出約1~3μg DNA，純度(A260 /A280 )約為1.3~1.6。
另外，在分離試劑中使用不同濃度之乙醇(40%、50%及60%)、鹽類為3M胍鹽酸鹽(Gu-HCl)、介面活性劑為5%Tween-20及0.5μg的磁珠作為固相載體及，並含有蛋白質水解酶及6M尿素，清洗緩衝液為70%的EtOH。可自200μl的人類全血分離出約2μg DNA，純度(A260 /A280 )約為1.3~1.6。
2.全血及血漿的核酸分離
在此實施例中使用之分離試劑含有10%的PEG、鹽類為6M胍鹽酸鹽、介面活性劑為10% Tween-20，以及0.5μg的磁性固相載體、蛋白質水解酶及6M的尿素。
取720μl之本發明分離試劑直接與200μl的人類全血或離心分離後之血漿混合，於56℃下，反應10~15分鐘後，可將核酸分離結合至磁性固相載體上，去除水溶液後，以清洗緩衝液加以洗滌，最後加入200μl無菌去離子水沖堤10分鐘後將磁性固相載體上沖提出來的核酸做分析。此實施例使用之清洗緩衝液為70%的EtOH。
實施例之對照組中，以市售的Promega公司之試劑套組作為正對照組，代表傳統的分離方法，即包括溶解(lysis)、萃取、沉澱、清洗、沖提等5個步驟。將所分離之DNA進行分析，其結果如表二所示。結果顯示本發明之分離試劑在全血樣本或經過離心前處理之血漿樣本，皆可由200μl樣本純化出DNA約5μg，純度(A260 /A280 )約為1.89，本發明之分離試劑可直接用於複雜樣本純化核酸，不需離心之樣本前處理。
在另一實施例中，使用相同之分離試劑，並以市售的Promega公司之試劑套組作為正對照組。每次實驗重複3次。
由表三結果可知，本發明之分離試劑及方法可有效地直接將DNA由全血中分離出來，且其分離效果與市售產品相當，200μl全血樣本可分離出DNA量約5μg，此以本發明分離試劑所分離的DNA具有較高的純度，且重覆誤差較小，純度(A260 /A280 )約為1.9±0.051，純化之核酸樣本可應用於聚合酶反應分析(Polymerase Chain Reaction,PCR)。
在另一個實施例中，本發明之分離試劑可在室溫下反應，可有效地直接將DNA由全血中分離出來，且200μl全血樣本可分離出DNA量約4μg，純度(A260 /A280 )約為1.7。
3.細胞的核酸分離
在此實施例中使用之分離試劑含有10%的PEG、鹽類為6M胍鹽酸鹽(Gu-HCl)、介面活性劑為10%Tween-20及0.5μg的磁性固相載體，並含有蛋白質水解酶及6M尿素。
取720μl之本發明分離試劑直接與200μl的CT26小鼠大腸癌細胞株混合，細胞總數約為8×105 cells/ml，於56℃下，反應10分鐘後，可將核酸分離結合至磁性固相載體上，去除水溶液後，以清洗緩衝液加以洗滌，最後加入200μl的無菌去離子水沖堤10分鐘後，分析由磁性固相載體上所沖提出來的核酸。此實施例使用之清洗緩衝液為70%的EtOH。其結果如表四所示。在此實施例中，以市售的Promega公司之試劑套組作為正對照組。
由結果可知，本發明之分離試劑及方法可有效地直接將DNA由細胞中分離出來，約可由105 細胞純化出約7μg的DNA，純度(A260 /A280 )高於1.8。
將上述由細胞所萃取的核酸樣本直接進行DNA瓊膠電泳分析，其結果如第1圖所示。本發明之試劑與皆顯示高分子量的DNA亮帶(泳道1：由MegaZorb萃取出的核酸；泳道2-3：由本發明之試劑萃取出的核酸；泳道4：1 Kb DNA marker)。由電泳結果可知本發明之分離試劑及方法可直接分離細胞中的DNA，且其分離DNA具有高產率及高純度。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
第1圖為DNA瓊膠電泳分析。

Claims (47)

  1. 一種分離核酸的方法，包括：將一分離試劑與一含有核酸的生物樣本混合後，該分離試劑會使核酸自該生物樣本中分離出來並結合至一固相載體上，其中該分離試劑包括1-40 wt%的聚乙二醇(PEG)及/或大於30 wt%的低分子量醇類、一鹽類及一介面活性劑，其藉由改變核酸的溶解度使核酸結合至該固相載體。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之分離核酸的方法，其中該低分子量醇類的分子量為30~100 g/mol。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之分離核酸的方法，其中該低分子量醇類為乙醇。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之分離核酸的方法，其中該低分子量醇類的重量濃度為40~60%。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之分離核酸的方法，其中該聚乙二醇的重量濃度為5~20%。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之分離核酸的方法，其中該固相載體包括磁性物質、金屬、金屬氧化物、矽化物或聚合物。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之分離核酸的方法，其中該鹽類包括鹼金族、鹼土族及/或銨鹽鹵化物。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之分離核酸的方法，其中該界面活性劑包括Tween-20、Triton X-100、NP40、Brij35或CHAPS。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之分離核酸的方法，其 中該試劑更包括一蛋白質水解酶。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之分離核酸的方法，其中該試劑更包括一醣類。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之分離核酸的方法，其中該試劑包括一多醣類或多醣類衍生物。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之分離核酸的方法，其中該多醣類包括肝醣(glycogen)、澱粉(starch)、聚寡糖(oligosaccharides)、葡聚醣(dextran)、纖維素(cellulose)、瓊脂醣(agarose)、幾丁聚醣(chitosan)、黏多醣(mucopolysaccharides)、肽聚醣(peptidoglycan)。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之分離核酸的方法，其中該試劑與生物樣本的混合反應溫度為約50℃-80℃。
  14. 如申請專利範圍第1項所述之分離核酸的方法，其中該生物樣本與試劑的混合酸鹼值為pH 6-9。
  15. 如申請專利範圍第1項所述之分離核酸的方法，其中該生物樣本包括含有一或複數個核酸。
  16. 如申請專利範圍第1項所述之分離核酸的方法，其中該生物樣本包含有細胞物質。
  17. 如申請專利範圍第1項所述之分離核酸的方法，其中該生物樣本包括真菌、病毒、微生物、細胞、血液、羊水、腦脊液、或來自皮膚、肌肉、結膜、胎盤或腸胃道之組織及其組織液。
  18. 如申請專利範圍第1項所述之分離核酸的方法，更包括在該生物樣本與該試劑混合後，進行一清洗程序。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之分離核酸的方法， 更包括在該清洗程序後，進行一沖提程序。
  20. 一種分離核酸的試劑，包括1-40 wt%的聚乙二醇(PEG)及/或大於30 wt%的低分子量醇類、一鹽類、一界面活性劑、以及一固相載體。
  21. 如申請專利範圍第20項所述之分離核酸的試劑，其中該低分子量醇類的分子量為30~100 g/mol。
  22. 如申請專利範圍第20項所述之分離核酸的試劑，其中該低分子量醇類為乙醇。
  23. 如申請專利範圍第20項所述之分離核酸的試劑，其中該低分子量醇類的重量濃度為40~60 wt%。
  24. 如申請專利範圍第20項所述之分離核酸的試劑，其中該聚乙二醇的重量濃度為5~20 wt%。
  25. 如申請專利範圍第20項所述之分離核酸的試劑，其中該鹽類包括鹼金族、鹼土族及/或銨鹽鹵化物。
  26. 如申請專利範圍第20項所述之分離核酸的試劑，其中該界面活性劑包括Tween-20、Triton X-100、NP40、Brij35或CHAPS。
  27. 如申請專利範圍第20項所述之分離核酸的試劑，其中該固相載體包括磁性物質、金屬金屬氧化物、矽化物或聚合物。
  28. 如申請專利範圍第20項所述之分離核酸的試劑，其中該試劑更包括一蛋白質水解酶。
  29. 如申請專利範圍第20項所述之分離核酸的試劑，其中該試劑更包括一醣類。
  30. 如申請專利範圍第29項所述之分離核酸的試劑， 其中該試劑包括一多醣類或多醣類衍生物。
  31. 如申請專利範圍第30項所述之分離核酸的試劑，其中該多醣類包括肝醣(glycogen)、澱粉(starch)、聚寡糖(oligosaccharides)、葡聚醣(dextran)、纖維素(cellulose)、瓊脂醣(agarose)、幾丁聚醣(chitosan)、黏多醣(mucopolysaccharides)、或肽聚醣(peptidoglycan)。
  32. 一種分離核酸的套組，包括：一試劑，包括1-40 wt%的聚乙二醇(PEG)及/或大於30 wt%的低分子量醇類、一鹽類、一界面活性劑、一固相載體及/或蛋白質水解酶，以及一容器。
  33. 如申請專利範圍第32項所述之分離核酸的套組，其中該低分子量醇類的分子量為30~100 g/mol。
  34. 如申請專利範圍第32項所述之分離核酸的套組，其中該低分子量醇類為乙醇。
  35. 如申請專利範圍第32項所述之分離核酸的套組，其中該低分子量醇類的重量濃度為40~60wt%。
  36. 如申請專利範圍第32項所述之分離核酸的套組，其中該聚乙二醇的重量濃度為5~20wt%。
  37. 如申請專利範圍第32項所述之分離核酸的套組，其中該鹽類包括鹼金族、鹼土族及/或銨鹽鹵化物。
  38. 如申請專利範圍第32項所述之分離核酸的套組，其中該界面活性劑包括Tween-20、Triton X-100、NP40、Brij35或CHAPS。
  39. 如申請專利範圍第32項所述之分離核酸的套組， 其中該固相載體包括磁性物質、金屬氧化物、矽化物或聚合物。
  40. 如申請專利範圍第32項所述之分離核酸的套組，其中該試劑更包括一蛋白質水解酶。
  41. 如申請專利範圍第32項所述之分離核酸的套組，其中該試劑更包括一醣類。
  42. 如申請專利範圍第41項所述之分離核酸的套組，其中該試劑包括一多醣類或多醣類衍生物。
  43. 如申請專利範圍第42項所述之分離核酸的套組，其中該多醣類包括肝醣(glycogen)、澱粉(starch)、聚寡糖(oligosaccharides)、葡聚醣(dextran)、纖維素(cellulose)、瓊脂醣(agarose)、幾丁聚醣(chitosan)、黏多醣(mucopolysaccharides)、或肽聚醣(peptidoglycan)。
  44. 如申請專利範圍第32項所述之分離核酸的套組，其中該套組更包括一清洗緩衝液及/或一沖提緩衝液。
  45. 如申請專利範圍第44項所述之分離核酸的套組，其中該清洗緩衝液可去除鹽類及蛋白質。
  46. 如申請專利範圍第44項所述之分離核酸的套組，其中該沖提緩衝液可將核酸由該固相載體上沖洗下來。
  47. 如申請專利範圍第32項所述之分離核酸的套組，其中該容器用於盛裝分離試劑。
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