JPH11262387A - 核酸結合性磁性担体およびそれを用いた核酸単離方法 - Google Patents
核酸結合性磁性担体およびそれを用いた核酸単離方法Info
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- JPH11262387A JPH11262387A JP6566298A JP6566298A JPH11262387A JP H11262387 A JPH11262387 A JP H11262387A JP 6566298 A JP6566298 A JP 6566298A JP 6566298 A JP6566298 A JP 6566298A JP H11262387 A JPH11262387 A JP H11262387A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】生物試料、特に全血検体から核酸を効率よく、
単離することが可能であり、さらに核酸単離の自動機械
化が可能な方法を提供する。 【解決手段】超常磁性金属酸化物を含む磁性シリカ粒子
である核酸結合性磁性担体であって、該磁性シリカ粒子
が少なくとも５０ｍ2 ／ｇの外部表面積を有する核酸結
合性磁性担体、該担体を含む核酸単離用試薬キットおよ
び該担体を使用する核酸単離方法。
単離することが可能であり、さらに核酸単離の自動機械
化が可能な方法を提供する。 【解決手段】超常磁性金属酸化物を含む磁性シリカ粒子
である核酸結合性磁性担体であって、該磁性シリカ粒子
が少なくとも５０ｍ2 ／ｇの外部表面積を有する核酸結
合性磁性担体、該担体を含む核酸単離用試薬キットおよ
び該担体を使用する核酸単離方法。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、核酸を含有すると
考えられる試料から核酸を単離するための核酸結合性磁
性担体および該担体を含む核酸単離用試薬キットならび
に核酸単離方法に関する。
考えられる試料から核酸を単離するための核酸結合性磁
性担体および該担体を含む核酸単離用試薬キットならび
に核酸単離方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年の遺伝子工学および分子生物学など
の分野の進歩により、感染症や遺伝子疾患などについて
ＤＮＡまたはＲＮＡレベルで分析することが可能になっ
た。特に、ＰＣＲ法（Polymerase Chain Reaction, Sci
ence 230:1350-1354, 1985) やＮＡＳＢＡ法（Nucleic
Acid Sequence Based Amplification, Nature 350:91-9
2, 1991 ）に代表される核酸増幅方法の発明により、従
来であれば、検出が非常に困難であった極微量の核酸の
検出が可能となり、遺伝子解析が飛躍的に容易なものと
なった。
の分野の進歩により、感染症や遺伝子疾患などについて
ＤＮＡまたはＲＮＡレベルで分析することが可能になっ
た。特に、ＰＣＲ法（Polymerase Chain Reaction, Sci
ence 230:1350-1354, 1985) やＮＡＳＢＡ法（Nucleic
Acid Sequence Based Amplification, Nature 350:91-9
2, 1991 ）に代表される核酸増幅方法の発明により、従
来であれば、検出が非常に困難であった極微量の核酸の
検出が可能となり、遺伝子解析が飛躍的に容易なものと
なった。
【０００３】しかし、生物試料中の核酸を必要により増
幅し、検出するためには、試料中の核酸を選択的に取り
出す必要がある。これは、通常の生物試料中には核酸以
外の夾雑物質、例えばタンパク質、脂質、糖類などが大
量に含まれており、これらが増幅や検出に悪影響を及ぼ
す可能性が少なくない。従ってあらかじめ試料中の夾雑
物質を除き、核酸を単離する操作が必要となる。
幅し、検出するためには、試料中の核酸を選択的に取り
出す必要がある。これは、通常の生物試料中には核酸以
外の夾雑物質、例えばタンパク質、脂質、糖類などが大
量に含まれており、これらが増幅や検出に悪影響を及ぼ
す可能性が少なくない。従ってあらかじめ試料中の夾雑
物質を除き、核酸を単離する操作が必要となる。
【０００４】この核酸の単離法は、古くから様々な手法
で行われてきた。代表的なものとしてはフェノール法
（Biochimica et Biophysica Acta, 72:619-629, 196
3)、アルカリ法（Nucleic Acid Research, 7:1513-152
3, 1979）などの液相で行う方法がある。これらは実験
室スケールで汎用されるが、有害で廃棄の困難なフェノ
ールやクロロホルムのような有機溶媒などのほか、危険
物である水酸化ナトリウムなどを使用するため、技術的
には熟練を要し、再現性よく実施することは容易でない
方法である。
で行われてきた。代表的なものとしてはフェノール法
（Biochimica et Biophysica Acta, 72:619-629, 196
3)、アルカリ法（Nucleic Acid Research, 7:1513-152
3, 1979）などの液相で行う方法がある。これらは実験
室スケールで汎用されるが、有害で廃棄の困難なフェノ
ールやクロロホルムのような有機溶媒などのほか、危険
物である水酸化ナトリウムなどを使用するため、技術的
には熟練を要し、再現性よく実施することは容易でない
方法である。
【０００５】また、核酸の単離に核酸結合用担体を用い
る系としては、ガラス粒子とヨウ化ナトリウムを用いる
方法(Proc. Natl. Acad. Sci.USA., 76-2:615-619, 197
9)、ハイドロキシアパタイトを用いる方法（特開昭63-2
63093 号公報）などがある。これらの方法は有害な有機
溶媒などはそれほど使用しないが、そのかわり工程中に
遠心分離操作を多く含むため多数の試料を一度に処理す
ることが困難で、核酸を単離するのに長時間かかるとい
う問題を含んでいる。
る系としては、ガラス粒子とヨウ化ナトリウムを用いる
方法(Proc. Natl. Acad. Sci.USA., 76-2:615-619, 197
9)、ハイドロキシアパタイトを用いる方法（特開昭63-2
63093 号公報）などがある。これらの方法は有害な有機
溶媒などはそれほど使用しないが、そのかわり工程中に
遠心分離操作を多く含むため多数の試料を一度に処理す
ることが困難で、核酸を単離するのに長時間かかるとい
う問題を含んでいる。
【０００６】従って、上記の核酸単離方法は有機溶媒や
アルカリなどの危険な試薬を使用すること、遠心分離操
作を必要とし、多数検体の処理が難しいことなどの難点
があるが、さらに大きな問題点が存在する。それは、抽
出工程の機械化において生じるものである。多数の検体
を再現性よく処理し、さらに人的コストを低減させるた
めには核酸単離の自動機械化は今後不可欠になりつつあ
る。
アルカリなどの危険な試薬を使用すること、遠心分離操
作を必要とし、多数検体の処理が難しいことなどの難点
があるが、さらに大きな問題点が存在する。それは、抽
出工程の機械化において生じるものである。多数の検体
を再現性よく処理し、さらに人的コストを低減させるた
めには核酸単離の自動機械化は今後不可欠になりつつあ
る。
【０００７】この自動機械化を目指したものとして、シ
リカ粒子とカオトロピックイオンを用いた方法（J. Cli
nical Microbiology, 28-3:495-503, 1990および特開平
2-289596号公報）がある。これは、核酸結合性のシリカ
粒子と試料中の核酸を遊離する能力を持つカオトロピッ
クイオンとを試料と混合し、核酸をシリカ粒子に結合さ
せ、夾雑物質を洗浄により除去した後、シリカ粒子に結
合した核酸を回収するというものである。該方法はＤＮ
Ａに加えて、より不安定であるＲＮＡの抽出にも好適で
あり、また純度の高い核酸が得られるという点で非常に
優れている。しかし、この核酸が結合した粒子の洗浄に
ついては遠心分離またはフィルターなどを使用した濾過
などを行う必要があり、機械化の際に工程が複雑となる
恐れが高い。
リカ粒子とカオトロピックイオンを用いた方法（J. Cli
nical Microbiology, 28-3:495-503, 1990および特開平
2-289596号公報）がある。これは、核酸結合性のシリカ
粒子と試料中の核酸を遊離する能力を持つカオトロピッ
クイオンとを試料と混合し、核酸をシリカ粒子に結合さ
せ、夾雑物質を洗浄により除去した後、シリカ粒子に結
合した核酸を回収するというものである。該方法はＤＮ
Ａに加えて、より不安定であるＲＮＡの抽出にも好適で
あり、また純度の高い核酸が得られるという点で非常に
優れている。しかし、この核酸が結合した粒子の洗浄に
ついては遠心分離またはフィルターなどを使用した濾過
などを行う必要があり、機械化の際に工程が複雑となる
恐れが高い。
【０００８】シリカ粒子を容易に混合あるいは洗浄する
方法として、磁性シリカ粒子を使用することは既に知ら
れており、本発明者らは特定の比表面積を有する磁性シ
リカ粒子を使用することにより、非特異的に多くの核酸
を吸着させることが可能な磁性粒子担体およびこの担体
を使用した、簡単な操作で有効に生物材料から核酸を単
離する方法（特開平9-19292 号公報）を提案した。しか
し、単に特定の比表面積を有する磁性粒子を使用するだ
けでは、試料中の夾雑物質による吸着阻害への影響など
を受け、核酸の回収効率が低下する現象が多くみられ
る。
方法として、磁性シリカ粒子を使用することは既に知ら
れており、本発明者らは特定の比表面積を有する磁性シ
リカ粒子を使用することにより、非特異的に多くの核酸
を吸着させることが可能な磁性粒子担体およびこの担体
を使用した、簡単な操作で有効に生物材料から核酸を単
離する方法（特開平9-19292 号公報）を提案した。しか
し、単に特定の比表面積を有する磁性粒子を使用するだ
けでは、試料中の夾雑物質による吸着阻害への影響など
を受け、核酸の回収効率が低下する現象が多くみられ
る。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の問題
点を解決するためになされたものであり、生物試料、特
に全血検体から核酸を効率よく、単離することが可能で
あり、さらに核酸単離の自動機械化が可能な方法を提供
することを目的とする。
点を解決するためになされたものであり、生物試料、特
に全血検体から核酸を効率よく、単離することが可能で
あり、さらに核酸単離の自動機械化が可能な方法を提供
することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
課題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、生物試料から
核酸を効率よく回収するために、該磁性シリカ粒子担体
が少なくとも５０ｍ2／ｇの外部表面積を有することが
有効であることを見い出し、本発明に到達した。
課題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、生物試料から
核酸を効率よく回収するために、該磁性シリカ粒子担体
が少なくとも５０ｍ2／ｇの外部表面積を有することが
有効であることを見い出し、本発明に到達した。
【００１１】すなわち、超常磁性金属酸化物を含む磁性
シリカ粒子である核酸結合性磁性担体であって、該磁性
シリカ粒子が少なくとも５０ｍ2 ／ｇの外部表面積を有
することを特徴とする核酸結合性磁性担体である。
シリカ粒子である核酸結合性磁性担体であって、該磁性
シリカ粒子が少なくとも５０ｍ2 ／ｇの外部表面積を有
することを特徴とする核酸結合性磁性担体である。
【００１２】また、本発明は、少なくとも上記核酸結合
性磁性担体、核酸を核酸結合性担体に吸着させるための
核酸吸着用溶液および核酸結合性担体−核酸複合体から
核酸を溶出するための溶液を含むことを特徴とする核酸
単離用試薬キットである。
性磁性担体、核酸を核酸結合性担体に吸着させるための
核酸吸着用溶液および核酸結合性担体−核酸複合体から
核酸を溶出するための溶液を含むことを特徴とする核酸
単離用試薬キットである。
【００１３】さらに、本発明は下記工程（ａ）〜（ｃ）
を含むことを特徴とする核酸単離方法である。 （ａ）上記核酸結合性磁性担体、核酸を含有する試料お
よび核酸を核酸結合性担体に吸着させるための核酸吸着
用溶液を混合して、核酸を核酸結合性担体に結合させる
工程 （ｂ）核酸が結合した核酸結合性担体を液体から分離
し、必要により洗浄する工程、および （ｃ）核酸結合性担体−核酸複合体から核酸を溶出する
工程
を含むことを特徴とする核酸単離方法である。 （ａ）上記核酸結合性磁性担体、核酸を含有する試料お
よび核酸を核酸結合性担体に吸着させるための核酸吸着
用溶液を混合して、核酸を核酸結合性担体に結合させる
工程 （ｂ）核酸が結合した核酸結合性担体を液体から分離
し、必要により洗浄する工程、および （ｃ）核酸結合性担体−核酸複合体から核酸を溶出する
工程
【００１４】
【発明の実施の形態】次に本発明において使用する言葉
を定義し、その測定法を説明する。表面積とは、担体の
全表面上の面積を示す。また、微小径粒子においては粒
子１個当たりの表面積でなく、単位重量（例えば１ｇ）
当たりの表面積で示すことが多く、これを比表面積とい
う。また、外部表面積とは、担体の表面に位置する表面
積をいう。
を定義し、その測定法を説明する。表面積とは、担体の
全表面上の面積を示す。また、微小径粒子においては粒
子１個当たりの表面積でなく、単位重量（例えば１ｇ）
当たりの表面積で示すことが多く、これを比表面積とい
う。また、外部表面積とは、担体の表面に位置する表面
積をいう。
【００１５】細孔とは、粒子表面に存在する微細な空洞
を示し、細孔容積とは、細孔により構成される空間の容
積を示す。また、表面細孔直径とは、担体上に存在する
微小な細孔の直径であり、微小径の粒子では平均の直径
がよく用いられる。粒子径とは、分散粒子の形を球形と
仮定した場合の直径を示す。これらの表面積細孔直径お
よび細孔容積は、窒素ガス吸着測定法により測定され
る。
を示し、細孔容積とは、細孔により構成される空間の容
積を示す。また、表面細孔直径とは、担体上に存在する
微小な細孔の直径であり、微小径の粒子では平均の直径
がよく用いられる。粒子径とは、分散粒子の形を球形と
仮定した場合の直径を示す。これらの表面積細孔直径お
よび細孔容積は、窒素ガス吸着測定法により測定され
る。
【００１６】これらの測定法は、ＪＩＳ Ｋ１１５０
「シリカゲル試験法」で規格化されている。その他はＢ
ＥＴ法、窒素置換（ｔ−ｐｌｏｔ）法などにより測定さ
れる。
「シリカゲル試験法」で規格化されている。その他はＢ
ＥＴ法、窒素置換（ｔ−ｐｌｏｔ）法などにより測定さ
れる。
【００１７】一般に、磁性シリカ粒子担体の表面積につ
いては、この粒子が多孔質であるため、その細孔部分に
由来する内部表面積と、実質的に表面として現れる外部
表面積に分かれる。そして、本発明においては、後者の
外部表面積が試料中の核酸の回収効率に影響することを
見い出したのである。
いては、この粒子が多孔質であるため、その細孔部分に
由来する内部表面積と、実質的に表面として現れる外部
表面積に分かれる。そして、本発明においては、後者の
外部表面積が試料中の核酸の回収効率に影響することを
見い出したのである。
【００１８】すなわち、本発明においては、磁性シリカ
粒子担体が少なくとも５０ｍ2 ／ｇ、好ましくは７０〜
１００ｍ2 ／ｇの外部表面積を有することが必要であ
る。外部表面積がより大きい粒子を使用することによ
り、核酸の回収量を高めることができるのである。５０
ｍ2 ／ｇ未満であると、試料中の夾雑物質が粒子表面に
結合し、核酸が吸着できないという欠点を生じる。
粒子担体が少なくとも５０ｍ2 ／ｇ、好ましくは７０〜
１００ｍ2 ／ｇの外部表面積を有することが必要であ
る。外部表面積がより大きい粒子を使用することによ
り、核酸の回収量を高めることができるのである。５０
ｍ2 ／ｇ未満であると、試料中の夾雑物質が粒子表面に
結合し、核酸が吸着できないという欠点を生じる。
【００１９】本発明において、粒子の表面積についての
解析は、ｔ法により行う。この方法では、解析される試
料と表面特性の類似した標準試料との窒素吸着等温線が
比較される。まず、非多孔性材料の吸着等温線より標準
のｔ曲線が作成される。ここでは、窒素分子の単分子層
の厚みを０．３５４ｎｍとして、標準試料の窒素ガスを
用いた吸着量の厚みｔｎｍを算出する。そして、解析試
料の窒素吸着量を、基準試料の吸着量の厚みに対してプ
ロットする。このｔプロットは、本発明で示しているマ
イクロポアをもつ吸着剤においては、図１のような形を
とる。
解析は、ｔ法により行う。この方法では、解析される試
料と表面特性の類似した標準試料との窒素吸着等温線が
比較される。まず、非多孔性材料の吸着等温線より標準
のｔ曲線が作成される。ここでは、窒素分子の単分子層
の厚みを０．３５４ｎｍとして、標準試料の窒素ガスを
用いた吸着量の厚みｔｎｍを算出する。そして、解析試
料の窒素吸着量を、基準試料の吸着量の厚みに対してプ
ロットする。このｔプロットは、本発明で示しているマ
イクロポアをもつ吸着剤においては、図１のような形を
とる。
【００２０】本発明の磁性シリカ粒子は、好ましくは比
表面積が１０〜８００ｍ2 ／ｇ、粒径が０．５〜１５μ
ｍ、特に好ましくは１．０〜１０．０μｍである。本発
明の磁性シリカ粒子は、表面細孔直径が、好ましくは
０．０１〜６０ｎｍ、特に好ましくは０．５〜１０ｎｍ
であり、そして、細孔容積が、好ましくは０．０１〜
１．５ｍｌ／ｇ、特に好ましくは０．０１〜０．５ｍｌ
／ｇである。
表面積が１０〜８００ｍ2 ／ｇ、粒径が０．５〜１５μ
ｍ、特に好ましくは１．０〜１０．０μｍである。本発
明の磁性シリカ粒子は、表面細孔直径が、好ましくは
０．０１〜６０ｎｍ、特に好ましくは０．５〜１０ｎｍ
であり、そして、細孔容積が、好ましくは０．０１〜
１．５ｍｌ／ｇ、特に好ましくは０．０１〜０．５ｍｌ
／ｇである。
【００２１】好ましい実施態様では、本発明の磁性シリ
カ粒子は、以下のような構造を有している。すなわち、
下記超常磁性金属酸化物の表面がシリカで被覆されてお
り、そして、さらに微小なシリカ粒子で構成される無機
多孔性壁物質で複合されている。この磁性シリカ粒子
は、ほぼ完全な球状である。核酸とシリカ粒子とは、シ
リカ表面の水酸基と核酸の塩基との間で生じる水素結合
により結合される。
カ粒子は、以下のような構造を有している。すなわち、
下記超常磁性金属酸化物の表面がシリカで被覆されてお
り、そして、さらに微小なシリカ粒子で構成される無機
多孔性壁物質で複合されている。この磁性シリカ粒子
は、ほぼ完全な球状である。核酸とシリカ粒子とは、シ
リカ表面の水酸基と核酸の塩基との間で生じる水素結合
により結合される。
【００２２】本発明で用いられる超常磁性金属酸化物と
は、磁場変化度に応答するが、永久磁化はされず、残留
磁化が小さい金属酸化物をいう。好ましい超常磁性金属
酸化物としては、酸化鉄が挙げられる。この酸化鉄とし
ては、四三酸化鉄（Ｆｅ3 Ｏ4 ）および四三酸化鉄を徐
々に酸化して得られるｒ型三二酸化鉄（ｒＦｅ2 Ｏ3 ）
などが用いられる。この四三酸化鉄は残留磁気が小さ
く、さらに好ましい表面構造 (ほぼ球形) を有するた
め、磁気分離および再分散のサイクルを反復することが
可能である。四三酸化鉄を含有する磁性シリカ粒子は、
弱酸性の水溶液中で安定であり、２年以上も貯蔵可能で
ある。
は、磁場変化度に応答するが、永久磁化はされず、残留
磁化が小さい金属酸化物をいう。好ましい超常磁性金属
酸化物としては、酸化鉄が挙げられる。この酸化鉄とし
ては、四三酸化鉄（Ｆｅ3 Ｏ4 ）および四三酸化鉄を徐
々に酸化して得られるｒ型三二酸化鉄（ｒＦｅ2 Ｏ3 ）
などが用いられる。この四三酸化鉄は残留磁気が小さ
く、さらに好ましい表面構造 (ほぼ球形) を有するた
め、磁気分離および再分散のサイクルを反復することが
可能である。四三酸化鉄を含有する磁性シリカ粒子は、
弱酸性の水溶液中で安定であり、２年以上も貯蔵可能で
ある。
【００２３】本発明の磁性シリカ粒子中に含まれる超常
磁性金属酸化物の重量は、磁極の強さにもよるが、１０
〜６０ｗｔ％が好ましく、さらに好ましくは２０〜４０
ｗｔ％である。この好ましい範囲内では、磁性担体は市
販の磁石を使用して迅速に分離できる。
磁性金属酸化物の重量は、磁極の強さにもよるが、１０
〜６０ｗｔ％が好ましく、さらに好ましくは２０〜４０
ｗｔ％である。この好ましい範囲内では、磁性担体は市
販の磁石を使用して迅速に分離できる。
【００２４】本発明において、シリカとは、ＳｉＯ2 結
晶および他の形態の酸化ケイ素、ＳｉＯ2 から構成され
るケイソウ植物の骨格ならびに無定形酸化ケイ素を含
む。
晶および他の形態の酸化ケイ素、ＳｉＯ2 から構成され
るケイソウ植物の骨格ならびに無定形酸化ケイ素を含
む。
【００２５】本発明の磁性シリカ粒子は下記性質を有す
るものが最も好ましい。 (1) 担体は、超常磁性酸化鉄を含む磁性シリカ粒子であ
る。 (2) 磁性シリカ粒子の外部表面積は、少なくとも５０ｍ
2 ／ｇである。 (3) 磁性シリカ粒子は、その表面がシリカで被覆されて
いる超常磁性金属酸化物を、微小なシリカ粒子で構成さ
れる無機多孔性壁物質で複合してなる。 (4) 超常磁性酸化鉄の重量は、１０〜６０ｗｔ％であ
る。 (5) 磁性シリカ粒子の比表面積は、１０〜８００ｍ2 ／
ｇである。 (6) 磁性シリカ粒子の表面細孔直径は、０．１〜６０ｎ
ｍである。 (7) 磁性シリカ粒子の細孔容積は、０．０１〜１．５ｍ
ｌ／ｇである。 (8) 磁性シリカ粒子の粒子径は、０．５〜１５μｍであ
る。
るものが最も好ましい。 (1) 担体は、超常磁性酸化鉄を含む磁性シリカ粒子であ
る。 (2) 磁性シリカ粒子の外部表面積は、少なくとも５０ｍ
2 ／ｇである。 (3) 磁性シリカ粒子は、その表面がシリカで被覆されて
いる超常磁性金属酸化物を、微小なシリカ粒子で構成さ
れる無機多孔性壁物質で複合してなる。 (4) 超常磁性酸化鉄の重量は、１０〜６０ｗｔ％であ
る。 (5) 磁性シリカ粒子の比表面積は、１０〜８００ｍ2 ／
ｇである。 (6) 磁性シリカ粒子の表面細孔直径は、０．１〜６０ｎ
ｍである。 (7) 磁性シリカ粒子の細孔容積は、０．０１〜１．５ｍ
ｌ／ｇである。 (8) 磁性シリカ粒子の粒子径は、０．５〜１５μｍであ
る。
【００２６】本発明の磁性シリカ粒子は、例えば特開平
6-47273 号公報に記載の方法により製造され得る。例え
ば四三酸化鉄を、テトラエトキシシランのアルコール溶
液に添加し、超音波分散機により分散湿潤させる。これ
にテトラエトキシシランの加水分解触媒を加え、超音波
分散させながら、四三酸化鉄の表面にシリカを沈着させ
る。このようにして得られた分散液に、ケイ酸ナトリウ
ムを加え、有機溶媒おび界面活性剤 (ソルビタンモノス
テアレートのトルエン溶液) を加えて乳化し、Ｗ／Ｏ型
エマルジョンを形成させる。この乳濁液を硫酸アンモニ
ウム水溶液に添加し、十分攪拌させる。その後、濾過分
離、水洗、アルコール沈殿を行い、乾燥させることによ
り、所望の球状シリカ粒子が得られる。
6-47273 号公報に記載の方法により製造され得る。例え
ば四三酸化鉄を、テトラエトキシシランのアルコール溶
液に添加し、超音波分散機により分散湿潤させる。これ
にテトラエトキシシランの加水分解触媒を加え、超音波
分散させながら、四三酸化鉄の表面にシリカを沈着させ
る。このようにして得られた分散液に、ケイ酸ナトリウ
ムを加え、有機溶媒おび界面活性剤 (ソルビタンモノス
テアレートのトルエン溶液) を加えて乳化し、Ｗ／Ｏ型
エマルジョンを形成させる。この乳濁液を硫酸アンモニ
ウム水溶液に添加し、十分攪拌させる。その後、濾過分
離、水洗、アルコール沈殿を行い、乾燥させることによ
り、所望の球状シリカ粒子が得られる。
【００２７】本発明の核酸単離用試薬キットは、少なく
とも上記核酸結合性磁性担体、核酸を核酸結合性担体に
吸着させるための核酸吸着用溶液および核酸結合性担体
−核酸複合体から核酸を溶出するための溶液を含む。
とも上記核酸結合性磁性担体、核酸を核酸結合性担体に
吸着させるための核酸吸着用溶液および核酸結合性担体
−核酸複合体から核酸を溶出するための溶液を含む。
【００２８】本発明における核酸吸着用溶液とは、生物
試料中の核酸を含む細胞などを破壊し、核酸を露出さ
せ、そして、この核酸を磁性シリカ粒子に結合させる働
きを持つ溶液である。このような溶液としては、好まし
くは、カオトロピック物質のようなシリカ粒子表面の疎
水性を高める物質が選択され、さらに、好ましくは、グ
アニジン（イソ）チオシアン酸塩および／またはグアニ
ジン塩酸塩のような核酸分解酵素の阻害活性を有する化
合物の溶液が使用できる。
試料中の核酸を含む細胞などを破壊し、核酸を露出さ
せ、そして、この核酸を磁性シリカ粒子に結合させる働
きを持つ溶液である。このような溶液としては、好まし
くは、カオトロピック物質のようなシリカ粒子表面の疎
水性を高める物質が選択され、さらに、好ましくは、グ
アニジン（イソ）チオシアン酸塩および／またはグアニ
ジン塩酸塩のような核酸分解酵素の阻害活性を有する化
合物の溶液が使用できる。
【００２９】カオトロピック物質としては、具体的には
グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩、ヨウ化
ナトリウム、ヨウ化カリウム、過塩素酸ナトリウム、尿
素等が挙げられるが、これらのうち、ＲＮＡを分解する
リボヌクレアーゼに対する阻害効果の大きなグアニジン
チオシアン酸塩あるいはグアニジン塩酸塩の使用が好ま
しい。これらのカオトロピック物質の使用濃度は、用い
られるカオトロピック物質により異なり、通常、１〜８
Ｍ、好ましくは４〜７Ｍであり、例えばグアニジン塩酸
塩を使用する場合は、４〜７．５Ｍである。また、グア
ニジンチオシアン酸塩を使用する場合には、３〜５．５
Ｍの範囲である。
グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩、ヨウ化
ナトリウム、ヨウ化カリウム、過塩素酸ナトリウム、尿
素等が挙げられるが、これらのうち、ＲＮＡを分解する
リボヌクレアーゼに対する阻害効果の大きなグアニジン
チオシアン酸塩あるいはグアニジン塩酸塩の使用が好ま
しい。これらのカオトロピック物質の使用濃度は、用い
られるカオトロピック物質により異なり、通常、１〜８
Ｍ、好ましくは４〜７Ｍであり、例えばグアニジン塩酸
塩を使用する場合は、４〜７．５Ｍである。また、グア
ニジンチオシアン酸塩を使用する場合には、３〜５．５
Ｍの範囲である。
【００３０】本発明の吸着剤を含む核酸吸着用溶液に
は、緩衝剤を含有させることが好ましい。これは予め吸
着用溶液に含まれていても、また、細胞を溶解した後に
緩衝液として添加してもよい。この緩衝剤としては、一
般に使用されるものであれば、特に限定されないが、中
性付近、すなわち、ｐＨ５〜９において緩衝能を有する
ものが好ましい。例えば、トリス−塩酸塩、四ホウ酸ナ
トリウム−塩酸、リン酸二水素カリウム−四ホウ酸ナト
リウム緩衝液等が挙げられ、その使用濃度としては１〜
５００ｍＭ、ｐＨは７〜９の範囲が好適である。
は、緩衝剤を含有させることが好ましい。これは予め吸
着用溶液に含まれていても、また、細胞を溶解した後に
緩衝液として添加してもよい。この緩衝剤としては、一
般に使用されるものであれば、特に限定されないが、中
性付近、すなわち、ｐＨ５〜９において緩衝能を有する
ものが好ましい。例えば、トリス−塩酸塩、四ホウ酸ナ
トリウム−塩酸、リン酸二水素カリウム−四ホウ酸ナト
リウム緩衝液等が挙げられ、その使用濃度としては１〜
５００ｍＭ、ｐＨは７〜９の範囲が好適である。
【００３１】また、核酸吸着用溶液には、細胞膜の破壊
あるいは細胞中に含まれるタンパク質を変性させる目的
で界面活性剤を含有させてもよい。この界面活性剤とし
ては、一般に細胞等からの核酸抽出に使用されるもので
あれば、特に限定されないが、具体的には、トリトン系
界面活性剤およびツイーン系界面活性剤等の非イオン界
面活性剤、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム等の陰
イオン界面活性剤が挙げられる。本発明においては、特
に非イオン界面活性剤を０．１〜２％の範囲で使用する
のが好ましい。
あるいは細胞中に含まれるタンパク質を変性させる目的
で界面活性剤を含有させてもよい。この界面活性剤とし
ては、一般に細胞等からの核酸抽出に使用されるもので
あれば、特に限定されないが、具体的には、トリトン系
界面活性剤およびツイーン系界面活性剤等の非イオン界
面活性剤、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム等の陰
イオン界面活性剤が挙げられる。本発明においては、特
に非イオン界面活性剤を０．１〜２％の範囲で使用する
のが好ましい。
【００３２】さらに、核酸吸着用溶液には試料中に含ま
れるタンパク質、特にリボヌクレアーゼを変性、失活さ
せる目的で、２−メルカプトエタノールあるいはジチオ
スレイトール等の還元剤を含有させることが好ましい。
れるタンパク質、特にリボヌクレアーゼを変性、失活さ
せる目的で、２−メルカプトエタノールあるいはジチオ
スレイトール等の還元剤を含有させることが好ましい。
【００３３】本発明において必要により使用する洗浄液
とは、核酸結合性担体から核酸の溶離を促進するもので
なく、かつ、タンパク質、糖類、脂質の固相への結合を
妨げるものであれば、特に限定されない。具体的には、
４〜７．５Ｍグアニジン塩酸塩溶液あるいは４０〜８０
％エタノールで洗浄することが好ましい。また、初めに
溶解・吸着工程にて使用した吸着用溶液を洗浄液として
使用すると、ゲノムＤＮＡとタンパク質の除去に有効で
ある。このとき、続いて４０〜８０％エタノールで洗浄
することが好ましい。
とは、核酸結合性担体から核酸の溶離を促進するもので
なく、かつ、タンパク質、糖類、脂質の固相への結合を
妨げるものであれば、特に限定されない。具体的には、
４〜７．５Ｍグアニジン塩酸塩溶液あるいは４０〜８０
％エタノールで洗浄することが好ましい。また、初めに
溶解・吸着工程にて使用した吸着用溶液を洗浄液として
使用すると、ゲノムＤＮＡとタンパク質の除去に有効で
ある。このとき、続いて４０〜８０％エタノールで洗浄
することが好ましい。
【００３４】本発明における核酸の結合した核酸結合性
担体から核酸を溶出する核酸抽出液とは、核酸結合性担
体から核酸の溶離を促進するものであれば、特に限定さ
れない。具体的には、水あるいはＴＥバッファー（１０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ：ｐＨ８．
０）が好ましい。この核酸−磁性シリカ粒子複合体を形
成する際、夾雑物を多量に含む生物試料、例えば血液の
ような検体を処理する場合、該試料由来の物質が磁性シ
リカ粒子の周囲に付着し、核酸の結合を妨げる傾向にあ
る。実際、夾雑物が多い試料ほど核酸の回収能力が低下
する。この問題を解決するため、本発明においては、外
部表面積がより大きい粒子を使用することにより、上記
試料由来の夾雑物質が粒子に付着しても、核酸の結合に
影響が出にくく、従って、高い回収効率を維持すること
が可能となる。
担体から核酸を溶出する核酸抽出液とは、核酸結合性担
体から核酸の溶離を促進するものであれば、特に限定さ
れない。具体的には、水あるいはＴＥバッファー（１０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ：ｐＨ８．
０）が好ましい。この核酸−磁性シリカ粒子複合体を形
成する際、夾雑物を多量に含む生物試料、例えば血液の
ような検体を処理する場合、該試料由来の物質が磁性シ
リカ粒子の周囲に付着し、核酸の結合を妨げる傾向にあ
る。実際、夾雑物が多い試料ほど核酸の回収能力が低下
する。この問題を解決するため、本発明においては、外
部表面積がより大きい粒子を使用することにより、上記
試料由来の夾雑物質が粒子に付着しても、核酸の結合に
影響が出にくく、従って、高い回収効率を維持すること
が可能となる。
【００３５】本発明の核酸単離用試薬キットは、（１）
超常磁性金属酸化物を含む磁性シリカ粒子である核酸結
合性磁性担体であって、該該磁性シリカ粒子が少なくと
も５０ｍ2 ／ｇの外部表面積を有する核酸結合性磁性担
体、（２）核酸を該粒子に吸着させるための溶液および
（３）核酸を溶出するための溶液とを少なくとも含む。
その組成比は、使用目的に応じて種々に選択されるが、
その一例としては、（１）約２０〜２００μｌ、（２）
約１００〜１０，０００μｌおよび（３）約２０〜２０
０μｌがある。
超常磁性金属酸化物を含む磁性シリカ粒子である核酸結
合性磁性担体であって、該該磁性シリカ粒子が少なくと
も５０ｍ2 ／ｇの外部表面積を有する核酸結合性磁性担
体、（２）核酸を該粒子に吸着させるための溶液および
（３）核酸を溶出するための溶液とを少なくとも含む。
その組成比は、使用目的に応じて種々に選択されるが、
その一例としては、（１）約２０〜２００μｌ、（２）
約１００〜１０，０００μｌおよび（３）約２０〜２０
０μｌがある。
【００３６】本発明では、このような磁性シリカ粒子
を、核酸を含有する試料とともに核酸吸着用溶液中に添
加し、磁性シリカ粒子−核酸複合体を形成する。本発明
の核酸単離方法は、具体的には下記工程を含む。 （ａ）核酸結合性担体、核酸を含有する試料および核酸
を核酸結合性担体に吸着させるための核酸吸着用溶液を
混合して、核酸を核酸結合性担体に結合させる工程（吸
着工程） （ｂ）核酸が結合した核酸結合性担体を液体から分離
し、必要により洗浄する工程（分離工程） および （ｃ）核酸結合性担体−核酸複合体から核酸を溶出する
工程（溶出工程）
を、核酸を含有する試料とともに核酸吸着用溶液中に添
加し、磁性シリカ粒子−核酸複合体を形成する。本発明
の核酸単離方法は、具体的には下記工程を含む。 （ａ）核酸結合性担体、核酸を含有する試料および核酸
を核酸結合性担体に吸着させるための核酸吸着用溶液を
混合して、核酸を核酸結合性担体に結合させる工程（吸
着工程） （ｂ）核酸が結合した核酸結合性担体を液体から分離
し、必要により洗浄する工程（分離工程） および （ｃ）核酸結合性担体−核酸複合体から核酸を溶出する
工程（溶出工程）
【００３７】ここで、核酸を含有する試料とは、全血、
血清、血漿、尿、唾液、体液などの動物由来の生物材
料、その他、植物、微生物などの動物以外の生物材料を
包含する。また、これらの生物から分離した細胞および
培養細胞を含む。さらに、部分精製された核酸も包含す
る。核酸とは、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味し、ＤＮＡと
しては、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、プラスミドＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡなどを含む。また、ＲＮＡ
としては、ウイルス、細菌あるいは真菌等の外来性寄生
生物由来のＲＮＡに加えて、これらの生物材料を産する
生物に由来する内在性のＲＮＡを含み、ｔ−ＲＮＡ、ｍ
−ＲＮＡ、ｒ−ＲＮＡなどを含む。
血清、血漿、尿、唾液、体液などの動物由来の生物材
料、その他、植物、微生物などの動物以外の生物材料を
包含する。また、これらの生物から分離した細胞および
培養細胞を含む。さらに、部分精製された核酸も包含す
る。核酸とは、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味し、ＤＮＡと
しては、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、プラスミドＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡなどを含む。また、ＲＮＡ
としては、ウイルス、細菌あるいは真菌等の外来性寄生
生物由来のＲＮＡに加えて、これらの生物材料を産する
生物に由来する内在性のＲＮＡを含み、ｔ−ＲＮＡ、ｍ
−ＲＮＡ、ｒ−ＲＮＡなどを含む。
【００３８】本発明の（ａ）吸着工程では、核酸結合性
担体、核酸を含有する試料および核酸吸着用溶液を混合
し、核酸を核酸結合性担体に吸着させる。混合方法は、
ボルテックスによる攪拌、転倒混和、磁気攪拌などがあ
り、混合時間は約５〜６０分間である。これらの物質を
混合することにより、試料中の核酸、タンパク質、糖類
などが核酸結合性担体に物理的に吸着する。
担体、核酸を含有する試料および核酸吸着用溶液を混合
し、核酸を核酸結合性担体に吸着させる。混合方法は、
ボルテックスによる攪拌、転倒混和、磁気攪拌などがあ
り、混合時間は約５〜６０分間である。これらの物質を
混合することにより、試料中の核酸、タンパク質、糖類
などが核酸結合性担体に物理的に吸着する。
【００３９】（ｂ）分離工程における液相と核酸結合性
担体との分離手段としては、粒子内の超常磁性金属酸化
物を使用するから、磁石等を用いた簡便な磁気分離法が
可能である。（ｂ）分離工程では、必要により洗浄を行
い、不要なタンパク質、糖類、脂質などを溶離する。洗
浄は１回または２回以上行う。
担体との分離手段としては、粒子内の超常磁性金属酸化
物を使用するから、磁石等を用いた簡便な磁気分離法が
可能である。（ｂ）分離工程では、必要により洗浄を行
い、不要なタンパク質、糖類、脂質などを溶離する。洗
浄は１回または２回以上行う。
【００４０】（ｃ）溶出工程は、上記（ｂ）工程におけ
る核酸が吸着した核酸結合性担体から該核酸を溶出する
工程である。このとき回収した核酸は、透析やエタノー
ル沈殿法等の脱塩、濃縮操作を施すことなく、制限酵素
やＤＮＡポリメラーゼ等を使用する酵素反応に直接使用
することができる。また、必要により増幅した後、核酸
プローブ試薬を使用して目的核酸を検出することもでき
る。
る核酸が吸着した核酸結合性担体から該核酸を溶出する
工程である。このとき回収した核酸は、透析やエタノー
ル沈殿法等の脱塩、濃縮操作を施すことなく、制限酵素
やＤＮＡポリメラーゼ等を使用する酵素反応に直接使用
することができる。また、必要により増幅した後、核酸
プローブ試薬を使用して目的核酸を検出することもでき
る。
【００４１】
【実施例】次に、実施例を挙げることにより、本発明の
効果をより一層、明瞭なものとする。ただし、これらの
実施例によって本発明の範囲は限定されるものではな
い。 実施例１ 磁性シリカ粒子は、平均粒子径の範囲が１〜１０μｍ、
四三酸化鉄粒子の含有量がグラム重量あたり、３０％、
比表面積が５０〜５００ｍ2 ／ｇであるもの（鈴木油脂
工業社製）を使用した（表１参照）。
効果をより一層、明瞭なものとする。ただし、これらの
実施例によって本発明の範囲は限定されるものではな
い。 実施例１ 磁性シリカ粒子は、平均粒子径の範囲が１〜１０μｍ、
四三酸化鉄粒子の含有量がグラム重量あたり、３０％、
比表面積が５０〜５００ｍ2 ／ｇであるもの（鈴木油脂
工業社製）を使用した（表１参照）。
【００４２】まず、０．５ｇ／ｍｌ濃度になるように滅
菌水中に懸濁した上記磁性シリカ粒子を準備した。ま
た、これらの条件で、外部表面積が１０〜７０ｍ2 ／ｇ
程度まで、異なる磁性シリカ粒子を数種類用意した。各
Ｌｏｔ中の磁性シリカ粒子のそれぞれの性質を、表１に
示す。
菌水中に懸濁した上記磁性シリカ粒子を準備した。ま
た、これらの条件で、外部表面積が１０〜７０ｍ2 ／ｇ
程度まで、異なる磁性シリカ粒子を数種類用意した。各
Ｌｏｔ中の磁性シリカ粒子のそれぞれの性質を、表１に
示す。
【００４３】生物試料としては、メチシリン耐性の黄色
ブドウ球菌（以下、ＭＲＳＡと示す）陽性の全血検体を
用いた。また、核酸抽出用溶液としては、５ｍｏｌ／ｌ
グアニジンチオシアン酸塩、１．０％トリトンＸ−１０
０および２０ｍｍｏｌ／ｌエチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）を含むトリス／塩酸緩衝液を使用した。そし
て、洗浄液としては、５ｍｏｌ／ｌグアニジンチオシア
ン酸塩を含むトリス／塩酸緩衝液を使用した。また、こ
れらに含まれる高濃度の塩を除去するために、７０％エ
タノール水溶液およびアセトンを使用し、粒子担体に結
合した核酸を回収するための溶離液としては、滅菌水を
使用した。
ブドウ球菌（以下、ＭＲＳＡと示す）陽性の全血検体を
用いた。また、核酸抽出用溶液としては、５ｍｏｌ／ｌ
グアニジンチオシアン酸塩、１．０％トリトンＸ−１０
０および２０ｍｍｏｌ／ｌエチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）を含むトリス／塩酸緩衝液を使用した。そし
て、洗浄液としては、５ｍｏｌ／ｌグアニジンチオシア
ン酸塩を含むトリス／塩酸緩衝液を使用した。また、こ
れらに含まれる高濃度の塩を除去するために、７０％エ
タノール水溶液およびアセトンを使用し、粒子担体に結
合した核酸を回収するための溶離液としては、滅菌水を
使用した。
【００４４】具体的な操作としては、下記（１）〜（１
３）の工程を実施した。 （１）１．５ｍｌ容のエッペンドルフチューブに、核酸
抽出用溶液０．９ｍｌを入れ、次に全血サンプル０．１
ｍｌを添加し、よく混合した。 （２）次に、滅菌水に懸濁した磁性シリカ粒子０．１ｍ
ｌを加えた。 （３）よく混合し、室温で１０分間放置した。 （４）１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブ専用の磁極
スタンドに、上記のチューブを設置することにより、粒
子を磁極側のチューブ壁面に移動させた。 （５）フィルターチップまたはディスポーザブルスポイ
トを用いて、溶液相を吸引排出した。 （６）チューブを磁極スタンドから取り出し、洗浄液と
して、５ｍｏｌ／ｌのグアニジンチオシアン酸塩を含む
トリス／塩酸緩衝液１．０ｍｌを加えた。 （７）十分混合した後、専用の磁極スタンドに設置し、
上記と同様にして溶液を排出した。 （８）洗浄液による洗浄操作をもう一度繰り返した。 （９）１．０ｍｌの７０％エタノール溶液により、上記
と同様に核酸の吸着した磁性シリカ粒子を洗浄し、高濃
度の塩を除去した。 （１０）再度、１．０ｍｌの７０％エタノール溶液で洗
浄した後、１．０ｍｌのアセトンで同様に洗浄した。 （１１）約５６℃のヒートブロック上に上記のチューブ
を設置し、約１０分間放置することにより、チューブ内
および磁性シリカ粒子中のアセトンを完全に蒸発させて
除去した。 （１２）０．１ｍｌの滅菌水を加え、約５６℃のヒート
ブロック上に上記チューブを設置し、１０分間放置し
た。 （１３）磁極スタンドに設置し、溶液相をフィルターチ
ップで吸引し、別の新しいチューブに回収した。回収量
は通常、６０〜７０μｌ程度である。
３）の工程を実施した。 （１）１．５ｍｌ容のエッペンドルフチューブに、核酸
抽出用溶液０．９ｍｌを入れ、次に全血サンプル０．１
ｍｌを添加し、よく混合した。 （２）次に、滅菌水に懸濁した磁性シリカ粒子０．１ｍ
ｌを加えた。 （３）よく混合し、室温で１０分間放置した。 （４）１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブ専用の磁極
スタンドに、上記のチューブを設置することにより、粒
子を磁極側のチューブ壁面に移動させた。 （５）フィルターチップまたはディスポーザブルスポイ
トを用いて、溶液相を吸引排出した。 （６）チューブを磁極スタンドから取り出し、洗浄液と
して、５ｍｏｌ／ｌのグアニジンチオシアン酸塩を含む
トリス／塩酸緩衝液１．０ｍｌを加えた。 （７）十分混合した後、専用の磁極スタンドに設置し、
上記と同様にして溶液を排出した。 （８）洗浄液による洗浄操作をもう一度繰り返した。 （９）１．０ｍｌの７０％エタノール溶液により、上記
と同様に核酸の吸着した磁性シリカ粒子を洗浄し、高濃
度の塩を除去した。 （１０）再度、１．０ｍｌの７０％エタノール溶液で洗
浄した後、１．０ｍｌのアセトンで同様に洗浄した。 （１１）約５６℃のヒートブロック上に上記のチューブ
を設置し、約１０分間放置することにより、チューブ内
および磁性シリカ粒子中のアセトンを完全に蒸発させて
除去した。 （１２）０．１ｍｌの滅菌水を加え、約５６℃のヒート
ブロック上に上記チューブを設置し、１０分間放置し
た。 （１３）磁極スタンドに設置し、溶液相をフィルターチ
ップで吸引し、別の新しいチューブに回収した。回収量
は通常、６０〜７０μｌ程度である。
【００４５】次に、この回収した核酸溶液をＮＡＳＢＡ
法（Nature 350: 91-92 、1991、特許第2648802 号公報
および特許第2650159号公報）により増幅した。すなわ
ち、増幅はｍｅｃＡ遺伝子の配列中より最適な配列を有
するプライマー２種（配列番号１および２）を使用し、
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素およびＲＮａｓｅ
Ｈ（一重鎖または二重鎖ＲＮＡまたはＤＮＡを加水分解
することなく、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを
加水分解するリボヌクレアーゼ）を用いて、４１℃で９
０分間、増幅反応を行った。
法（Nature 350: 91-92 、1991、特許第2648802 号公報
および特許第2650159号公報）により増幅した。すなわ
ち、増幅はｍｅｃＡ遺伝子の配列中より最適な配列を有
するプライマー２種（配列番号１および２）を使用し、
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素およびＲＮａｓｅ
Ｈ（一重鎖または二重鎖ＲＮＡまたはＤＮＡを加水分解
することなく、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを
加水分解するリボヌクレアーゼ）を用いて、４１℃で９
０分間、増幅反応を行った。
【００４６】そして、核酸の検出は、固相としてナイロ
ン膜を使用したドットブロットハイブリダイゼーション
により行った。上記の増幅反応によって得られた核酸溶
液を滅菌水で１０倍濃度に希釈し、あらかじめ５×ＳＳ
Ｃ（0.075mol/l Na-Citrate、pH 7.0、0.75mol/l NaCl
混合液）で洗浄したナイロン膜上に、１．０μｌをブロ
ットした。乾燥後、この膜をハイブリバッグ（ＢＲＬ社
製）に入れ、アルカリホスファターゼ標識した検出プロ
ーブ（配列番号３）を含むハイブリダイゼーション緩衝
液１．０ｍｌを加え、振とうさせながら、５０℃で３０
分間ハイブリダイゼーションを行った。その後、膜をハ
イブリバッグから取り出し、洗浄液１（５×ＳＳＣ、
１．０％ラウリル硫酸ナトリウム）を入れたバットに移
し、５０℃で１０分間洗浄した。次に洗浄液２（５×Ｓ
ＳＣ、0.5 ％トリトンＸ−１００）のバットに移し振と
うさせながら、室温で１０分間洗浄した。洗浄が終了し
た膜を新しいハイブリバッグに入れ、ニトロブルーテト
ラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リルリン酸を含むアルカリホスファターゼの基質溶液を
加えてシールし、３７℃で６０分間静置することで発色
反応させた。発色後、膜を蒸留水で洗浄して乾燥させ、
発色を色彩色差計ＣＲ−２２１（ミノルタカメラ社製）
により測定した。測定には△Ｅモードを用いた。
ン膜を使用したドットブロットハイブリダイゼーション
により行った。上記の増幅反応によって得られた核酸溶
液を滅菌水で１０倍濃度に希釈し、あらかじめ５×ＳＳ
Ｃ（0.075mol/l Na-Citrate、pH 7.0、0.75mol/l NaCl
混合液）で洗浄したナイロン膜上に、１．０μｌをブロ
ットした。乾燥後、この膜をハイブリバッグ（ＢＲＬ社
製）に入れ、アルカリホスファターゼ標識した検出プロ
ーブ（配列番号３）を含むハイブリダイゼーション緩衝
液１．０ｍｌを加え、振とうさせながら、５０℃で３０
分間ハイブリダイゼーションを行った。その後、膜をハ
イブリバッグから取り出し、洗浄液１（５×ＳＳＣ、
１．０％ラウリル硫酸ナトリウム）を入れたバットに移
し、５０℃で１０分間洗浄した。次に洗浄液２（５×Ｓ
ＳＣ、0.5 ％トリトンＸ−１００）のバットに移し振と
うさせながら、室温で１０分間洗浄した。洗浄が終了し
た膜を新しいハイブリバッグに入れ、ニトロブルーテト
ラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リルリン酸を含むアルカリホスファターゼの基質溶液を
加えてシールし、３７℃で６０分間静置することで発色
反応させた。発色後、膜を蒸留水で洗浄して乾燥させ、
発色を色彩色差計ＣＲ−２２１（ミノルタカメラ社製）
により測定した。測定には△Ｅモードを用いた。
【００４７】下記表１から明らかなように、本発明の５
０ｍ2 ／ｇ以上の外部表面積をもつ磁性シリカ粒子（表
１中のLotA）を核酸の抽出、単離に使用する場合は、外
部表面積の小さい磁性粒子（表１のLotD,G,H）を使用し
た場合よりも、明らかに高い検出値を示した。これは核
酸抽出効率が上昇したことを示している。
０ｍ2 ／ｇ以上の外部表面積をもつ磁性シリカ粒子（表
１中のLotA）を核酸の抽出、単離に使用する場合は、外
部表面積の小さい磁性粒子（表１のLotD,G,H）を使用し
た場合よりも、明らかに高い検出値を示した。これは核
酸抽出効率が上昇したことを示している。
【００４８】
【表１】
【００４９】
【発明の効果】少なくとも５０ｍ2 ／ｇの外部表面積を
有する磁性シリカ粒子を担体として核酸の抽出、単離に
使用する本発明は、核酸の回収量に優れている。特に、
夾雑物質を多量に含む試料、例えば血液検体の処理にお
いて、その回収量に優れている。
有する磁性シリカ粒子を担体として核酸の抽出、単離に
使用する本発明は、核酸の回収量に優れている。特に、
夾雑物質を多量に含む試料、例えば血液検体の処理にお
いて、その回収量に優れている。
【００５０】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：21 配列の形：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１..21 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：黄色ブドウ球菌のｍｅｃＡ遺伝子の1332番目
から1352番目のヌクレオチド配列と相同的な配列を有す
る。 配列 CGTTACAAGA TATGAAGTGG T 21
から1352番目のヌクレオチド配列と相同的な配列を有す
る。 配列 CGTTACAAGA TATGAAGTGG T 21
【００５１】配列番号：２ 配列の長さ：47 配列の形：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１..47 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：黄色ブドウ球菌のｍｅｃＡ遺伝子の1552番目
から1571番目のヌクレオチド配列と相補的な配列を有す
る。またＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を
持つ。 配列 AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGCCT TGTCCGTAAC CTGAATC 47
から1571番目のヌクレオチド配列と相補的な配列を有す
る。またＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を
持つ。 配列 AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGCCT TGTCCGTAAC CTGAATC 47
【００５２】配列番号：３ 配列の長さ：25 配列の形：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１..25 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：黄色ブドウ球菌のｍｅｃＡ遺伝子の1410番目
から1434番目のヌクレオチド配列と相同的な配列を有す
る。 配列 TAGAGTAGCA CTCGAATTAG GCAGT 25
から1434番目のヌクレオチド配列と相同的な配列を有す
る。 配列 TAGAGTAGCA CTCGAATTAG GCAGT 25
【図１】 ｔ−ｐｌｏｔを示す図である。
Claims (9)
- 【請求項１】 超常磁性金属酸化物を含む磁性シリカ粒
子である核酸結合性磁性担体であって、該磁性シリカ粒
子が少なくとも５０ｍ2 ／ｇの外部表面積を有すること
を特徴とする核酸結合性磁性担体。 - 【請求項２】 磁性シリカ粒子担体が、７０〜１００ｍ
2 ／ｇの外部表面積を有する請求項１記載の核酸結合性
磁性担体。 - 【請求項３】 磁性シリカ粒子が、その表面がシリカで
被覆されている超常磁性金属酸化物を、微小なシリカ粒
子で構成される無機多孔性壁物質で複合してなる請求項
１記載の核酸結合性担体。 - 【請求項４】 磁性シリカ粒子が、１０〜８００ｍ2 ／
ｇの比表面積を有する請求項１記載の核酸結合性磁性担
体。 - 【請求項５】 磁性シリカ粒子が、０．５〜１５μｍの
粒子径を有する請求項１記載の核酸結合性磁性担体。 - 【請求項６】 磁性シリカ粒子が、１．０〜１０．０μ
ｍの粒子径を有する請求項１記載の核酸結合性磁性担
体。 - 【請求項７】 下記性質(1) 〜(7) を有する核酸結合性
磁性担体。 (1) 担体は、超常磁性酸化鉄を含む磁性シリカ粒子であ
る。 (2) 磁性シリカ粒子の外部表面積は、少なくとも５０ｍ
2 ／ｇである。 (3) 磁性シリカ粒子は、その表面がシリカで被覆されて
いる超常磁性金属酸化物を、微小なシリカ粒子で構成さ
れる無機多孔性壁物質で複合してなる。 (4) 超常磁性酸化鉄の重量は、１０〜６０ｗｔ％であ
る。 (5) 磁性シリカ粒子の比表面積は、１０〜８００ｍ2 ／
ｇである。 (6) 磁性シリカ粒子の表面細孔直径は、０．１〜６０ｎ
ｍである。 (7) 磁性シリカ粒子の細孔容積は、０．０１〜１．５ｍ
ｌ／ｇである。 (8) 磁性シリカ粒子の粒子径は、０．５〜１５μｍであ
る。 - 【請求項８】 少なくとも請求項１〜７のいずれか１項
に記載される核酸結合性磁性担体、核酸を核酸結合性担
体に吸着させるための核酸吸着用溶液および核酸結合性
担体−核酸複合体から核酸を溶出するための溶液を含む
ことを特徴とする核酸単離用試薬キット。 - 【請求項９】 下記工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特
徴とする核酸単離方法。 （ａ）請求項１〜７のいずれか１項記載の核酸結合性磁
性担体、核酸を含有する試料および核酸を核酸結合性担
体に吸着させるための核酸吸着用溶液を混合して、核酸
を核酸結合性担体に結合させる工程 （ｂ）核酸が結合した核酸結合性担体を液体から分離
し、必要により洗浄する工程、および （ｃ）核酸結合性担体−核酸複合体から核酸を溶出する
工程
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6566298A JPH11262387A (ja) | 1998-03-16 | 1998-03-16 | 核酸結合性磁性担体およびそれを用いた核酸単離方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6566298A JPH11262387A (ja) | 1998-03-16 | 1998-03-16 | 核酸結合性磁性担体およびそれを用いた核酸単離方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11262387A true JPH11262387A (ja) | 1999-09-28 |
Family
ID=13293439
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6566298A Pending JPH11262387A (ja) | 1998-03-16 | 1998-03-16 | 核酸結合性磁性担体およびそれを用いた核酸単離方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11262387A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003528455A (ja) * | 2000-03-24 | 2003-09-24 | キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 分子の単離のための多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子 |
| JP2004500067A (ja) * | 1999-12-22 | 2004-01-08 | アボット・ラボラトリーズ | 核酸の単離方法およびキット |
| JP2007224323A (ja) * | 2006-02-21 | 2007-09-06 | Hitachi Metals Ltd | 磁性シリカ粒子およびその製造方法 |
| WO2015054768A1 (pt) * | 2013-10-15 | 2015-04-23 | Fundação Universidade Federal De São Carlos | Micropartículas magnéticas de sílica porosa e processo de síntese |
| EP4254441A1 (en) | 2022-03-29 | 2023-10-04 | Seiko Epson Corporation | Magnetic bead and magnetic bead dispersion liquid |
-
1998
- 1998-03-16 JP JP6566298A patent/JPH11262387A/ja active Pending
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JP2004500067A (ja) * | 1999-12-22 | 2004-01-08 | アボット・ラボラトリーズ | 核酸の単離方法およびキット |
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| JP2016198093A (ja) * | 1999-12-22 | 2016-12-01 | アボツト・モレキユラー・インコーポレイテツド | 核酸の単離方法およびキット |
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| EP4254441A1 (en) | 2022-03-29 | 2023-10-04 | Seiko Epson Corporation | Magnetic bead and magnetic bead dispersion liquid |
| US12260976B2 (en) | 2022-03-29 | 2025-03-25 | Seiko Epson Corporation | Magnetic bead and magnetic bead dispersion |
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