JP2001139593A

JP2001139593A - 粒子担体を使用する改良された核酸の抽出方法

Info

Publication number: JP2001139593A
Application number: JP32312199A
Authority: JP
Inventors: Satoko Yoshiga; 聡子吉賀; Shigeru Komai; 茂駒井; Katsuya Daimon; 克哉大門
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1999-11-12
Filing date: 1999-11-12
Publication date: 2001-05-22

Abstract

(57)【要約】【課題】核酸を含有すると考えられる材料から核酸を抽
出および単離する際に、臨床検体のような多量の夾雑物
質を含む試料から、効率よく核酸を抽出する方法を提供
する。【解決手段】核酸を含有すると考えられる材料から核酸
を抽出および単離するための方法であって、以下の工程
（ａ）〜（ｄ）を含むことを特徴とする核酸の抽出方
法。（ａ）核酸を含むと考えられる材料と該材料中に存在す
る成分を不溶化させる作用を有する試薬と接触させる工
程（ｂ）核酸を含むと考えられる材料、核酸を吸着できる
核酸結合性磁性粒子担体、及び核酸を該担体に吸着させ
るための核酸抽出溶液とを混合する工程（ｃ）核酸以外のものを、核酸と粒子担体との複合体を
洗浄することにより除去する工程（ｄ）核酸と担体との複合体より核酸を溶出し回収する
工程

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、粒子担体を使用し
て核酸を含有すると考えられる材料から核酸を抽出し単
離する方法に関する。より詳細には、材料中に存在する
成分を不溶化させる作用を有する試薬と接触させる工
程、核酸を含むと考えられる材料を水不溶性のフィルタ
に通過させる工程を含む改良された核酸の抽出方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】近年の遺伝子工学や分子生物学等の分野
の進歩により、感染症や遺伝子疾患等について、ＤＮＡ
／ＲＮＡレベルで解析することが可能になった。特に、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法；Science 230,p1350
-1354(1985)）や、核酸配列に基づく増幅法（以下、Ｎ
ＡＳＢＡ法という；Nature 350,p91-92(1991)、特許第
２６４８８０２号公報及び特許第２６５０１５９号公
報）等に代表される核酸増幅方法の発明により、従来で
あれば検出が非常に困難であった極微量の核酸の検出が
可能となり、遺伝子解析が飛躍的に容易なものとなっ
た。ただし、生物試料中の核酸を、必要であれば増幅
し、検出するためには、試料中の核酸を選択的に取り出
す必要がある。これは、通常の生物試料中には核酸以外
の夾雑物質、例えばタンパク質、脂質、糖類などが大量
に含まれており、これらが増幅や検出に悪影響を及ぼす
可能性が少なくない。そのため、予め試料中の夾雑物質
を除き、核酸を抽出し単離する操作が必要となる。

【０００３】このような核酸の単離方法は古くから様々
な手法で行われてきた。代表的なものとして、フェノー
ル／クロロホルム抽出法（Biochimica et Biophysica a
cta72, p619-629 (1963)）、アルカリＳＤＳ法（Nuclei
c Acids Research 7, p1513-1523 (1979））等の液相
で行う方法がある。これらは実験室スケールで汎用され
るが、有害で廃棄の困難なフェノールやクロロホルムの
ような有機溶剤の他、危険物である水酸化ナトリウムな
どを使用するため、技術的には熟練を要し、再現性良く
実施することは容易でない。

【０００４】また、核酸の単離に核酸結合用担体を用い
る系としては、ガラス粒子とヨウ化ナトリウム溶液を使
用する方法（Proc. Natl. Acad. Sci.USA 76-2, p615-
619(1979)）、ハイドロキシアパタイトを用いる方法
（特開昭６３−２６３０９３号公報）等がある。これら
の方法は有害な有機溶剤等は使用しないものの、工程中
に遠心分離操作を多く含むため、多数の試料を一度に処
理することが困難で、核酸を単離するのに長時間かかる
という問題を含んでいる。

【０００５】従って、上記の核酸単離方法は有機溶剤や
アルカリなどの危険な試薬を使用すること、遠心分離操
作を必要とし、多数検体の処理が難しいことなどの難点
がある。そしてさらに、抽出および単離工程の自動機械
化に際し大きな問題が生じる。多数の検体を再現性良く
処理し、更に人的コストを低減させるためには、核酸抽
出および単離法の自動化は今後不可欠になる。

【０００６】この自動機械化を目指したものとして、シ
リカ粒子とカオトロピックイオンを用いた方法（J.Clin
ical Microbiology 28-3,p495-503(1990)、特開平２−
２８９５９６号公報）がある。これは、核酸結合性のシ
リカ粒子と、試料中の核酸を遊離する能力を有するカオ
トロピックイオンとを試料と混合し、核酸をシリカ粒子
に結合させ、夾雑物質を洗浄により除去した後、シリカ
粒子に結合した核酸を回収するものである。この方法は
ＤＮＡに加えてより不安定であるＲＮＡの抽出にも好適
であり、また純度の高い核酸が得られるという点で非常
に優れている。ただしこの核酸が結合した粒子の洗浄に
ついては遠心分離またはフィルターなどを使用した濾過
などを行う必要があり、機械化の際に工程が複雑となる
恐れが高い。

【０００７】従って、シリカ粒子を容易に混合、洗浄す
るために、粒子に磁性を持たせ、磁気により混合および
撹拌する方法（特開平９−１９２９２号公報）が考えら
れた。この方法は、核酸を磁性シリカ粒子に結合させ、
以下洗浄後回収するもので、機械化の際の工程はより簡
便になる。ただし、単に磁性を持たせた粒子を使用する
だけでは、検体中の夾雑物質の影響などを受け、回収効
率が低下する現象が多くみられる。その理由としては、
粒子の周囲に核酸を吸着させ、不要物を洗浄して除去し
た後核酸を回収する方法において、夾雑物質が非常に多
い場合にはそれが粒子表面を覆ってしまい、核酸の吸着
効率が低下するためと推定されている。この問題を解決
するために、表面積のより大きい粒子担体を使用する方
法（特願平１０−６５６６２号）や予め粒子担体を界面
活性剤で懸濁することにより夾雑物質の吸着を抑える方
法（特願平９−３５１１０２号）が考案されている。し
かしながら、血液検体特に全血検体のような極めて夾雑
物質が多い試料については、現状では十分な抽出量を得
ることができず、磁性粒子の形状を最適化するだけでは
試料中の目的核酸の有無を判定するのが困難であった。
そこで、これらの問題点を克服した方法が必要とされて
いる。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の問題
点を解決するためになされたものであり、核酸を含有す
ると考えられる材料から核酸を抽出および単離する際
に、臨床検体のような多量の夾雑物質を含む試料から、
効率よく核酸を抽出する方法を提供する。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
課題を解決するべく鋭意研究を進めた結果、粒子担体を
使用し生物材料から核酸を抽出し単離する際、臨床検体
のような多量の共雑物質を含む試料から効率よく核酸を
抽出するためには、抽出前の処理として材料中に存在す
る成分を不溶化させる作用を有する試薬と接触させる工
程を実施することが有効であることを見出し、本発明に
到達した。すなわち、本発明は以下のような構成からな
る。（１）核酸を含有すると考えられる材料から核酸を抽出
および単離するための方法であって、以下の工程（ａ）
〜（ｄ）を含むことを特徴とする核酸の抽出方法。（ａ）核酸を含有すると考えられる材料と該材料中に存
在する成分を不溶化させる作用を有する試薬と接触させ
る工程（ｂ）核酸を含と考えられる材料、核酸を吸着できる核
酸結合性磁性粒子担体、及び核酸を該担体に吸着させる
ための核酸抽出溶液とを混合する工程（ｃ）核酸以外のものを、核酸と粒子担体との複合体を
洗浄することにより除去する工程（ｄ）核酸と担体との複合体より核酸を溶出し回収する
工程（２）核酸を含有すると考えられる材料中に存在する成
分を不溶化させる作用を有する試薬のｐＨが７未満であ
る（１）の核酸の抽出方法。（３）核酸を含有すると考えられる材料中に存在する成
分を不溶化させる作用を有する試薬が核酸抽出溶液であ
る（１）の核酸の抽出方法。（４）核酸を含有すると考えられる材料を水不溶性のフ
ィルタに通過させる工程を含むことを特徴とする（１）
の核酸の抽出方法。（５）該核酸がＤＮＡおよび／またはＲＮＡである
（１）の核酸の抽出方法。（６）該核酸を含有すると考えられる材料が生物材料で
ある（１）の核酸の抽出方法。（７）該生物材料が、血液、組織、尿、喀痰よりなる群
から選ばれたいずれかである（１）の核酸の抽出方法。（８）該核酸抽出溶液がカオトロピック物質を含有する
（１）の核酸の抽出方法。（９）該カオトロピック物質が、グアニジン塩、ヨウ化
カリウム、ヨウ化ナトリウム、（イソ）チオシアン酸塩
および尿素よりなる群から選択された少なくとも１種を
含むものである（８）の核酸の抽出方法。（１０）該カオトロピック物質が、グアニジン（イソ）
チオシアン酸塩および／またはグアニジン塩酸塩である
（９）の核酸の抽出方法。（１１）工程（ｃ）において用いられる洗浄液が、カオ
トロピック物質を含む第一の洗浄液およびアルコールを
含む第二の洗浄液を使用する（１）の核酸の抽出方法。（１２）カオトロピック物質として、グアニジンチオシ
アン酸塩、グアニジン塩酸塩および／またはチオシアン
酸ナトリウム塩を含有する第一の洗浄液を使用する（１
１）の核酸の抽出方法。（１３）４０〜１００％濃度のアルコールを含有する第
二の洗浄液を使用する（１１）の核酸の抽出方法。（１４）４０〜１００％濃度のエタノールを含有する第
二の洗浄液および６０〜１００％濃度のエタノールを含
有する第三の洗浄液を使用する（１１）の核酸の抽出方
法。

【００１０】

【発明の実施の形態】次に本発明において使用する言葉
を定義し、その測定法を説明する。核酸を含有すると考
えられる材料と材料中に存在する成分を不溶化させる作
用を有する試薬とは、材料中に添加することで上記の目
的を達成するものであれば特に限定はされない。好まし
くは試薬のｐＨが７未満、より好ましくはｐＨ３〜７、
さらに好ましくはｐＨ５〜７を有する試薬である。具体
的には、例えば、塩酸、酢酸ナトリウム、酢酸、リン酸
カリウム、硫酸ナトリウムなどを加えることにより調整
される。また、核酸抽出液中に予め前記試薬を添加し、
材料中に存在する成分を不溶化させる作用と核酸抽出作
用の両性質を有する核酸抽出液を調製し、不溶化工程と
核酸抽出工程を同時に実施しうる場合も含まれる。

【００１１】本発明において用いられる粒子担体は特に
限定されるものではないが、磁性シリカ粒子が特に好ま
しい。該磁性シリカ粒子は以下のような構造を有してい
る。すなわち、下記超常磁性金属酸化物の表面がシリカ
で被覆されており、そして、さらに微小なシリカ粒子で
構成される無機多孔性壁物質で複合されている。この磁
性シリカ粒子はほぼ完全な球状である。核酸と該磁性シ
リカ粒子とは、シリカ表面の水酸基と核酸の塩基との間
で生じる水素結合により結合される。

【００１２】超常磁性金属酸化物とは、磁場変化度に応
答するが、永久磁化はされず、残留磁化が小さい金属酸
化物をいう。好ましい超常磁性金属酸化物としては、酸
化鉄が挙げられる。この酸化鉄としては、四三酸化鉄
（Ｆｅ₃Ｏ₄）および四三酸化鉄を徐々に酸化して得られ
るｒ型三二酸化鉄（ｒＦｅ₂Ｏ₃）などが用いられる。こ
の四三酸化鉄は残留磁気が小さく、さらに好ましい表面
構造を有するため、磁気分離および再分散のサイクルを
反復することが可能である。四三酸化鉄を含有する磁性
シリカ粒子は弱酸性の水溶液中で安定であり、２年以上
も貯蔵可能である。

【００１３】上記磁性シリカ粒子中に含まれる超常磁性
漢族酸化物の重量は、磁極の強さにもよるが、１０〜６
０重量％が好ましく、さらに好ましくは２０〜４０重量
％である。この好ましい範囲内では、磁性担体は市販の
磁石を使用する場合に、特に迅速に分離できる。なお、
本発明において、シリカとはＳｉＯ₂結晶および他の形
態の酸化ケイ素、ＳｉＯ₂から構成されるケイソウ植物
の骨格ならびに無定型酸化ケイ素を含む。

【００１４】本発明磁性シリカ粒子は下記性質を有する
ものが最も好ましい。（１）担体は、超常磁性酸化鉄を含む磁性シリカ粒子で
ある。（２）磁性シリカ粒子の外部表面積は少なくとも１０ｍ
²／ｇである。（３）磁性シリカ粒子は、その表面がシリカで被覆され
ている超常磁性金属酸化物を微小なシリカ粒子で構成さ
れる無機多孔性壁物質で複合してなる。（４）超常磁性酸化鉄の重量は１０〜６０重量％であ
る。（５）磁性シリカ粒子の比表面積は１０〜８００ｍ²／
ｇである。（６）磁性シリカ粒子の表面細孔直径は５０〜５００ｎ
ｍである。（７）磁性シリカ粒子の細孔容積は２００〜５０００ｍ
ｍ³／ｇである。（８）磁性シリカ粒子の粒子径は０．５〜１５．０μｍ
である。

【００１５】上記のような磁性シリカ粒子は、例えば、
特開平６−４７２７３号公報の記載の方法により製造さ
れ得る。例えば四三酸化鉄を、テトラエトキシシランの
アルコ−ル溶液に添加し、超音波分散機により分散湿潤
させる。これにテトラエトキシシランの加水分解触媒を
加え、超音波分散させながら、四三酸化鉄の表面にシリ
カを沈着させる。このようにして得られた分散液に、ケ
イ素ナトリウムを加え、有機溶媒おび界面活性剤（ソル
ビタンモノステアレ−トのトルエン溶液）を加えて乳化
し、Ｗ／Ｏ型エマルジョンを形成させる。この乳濁液を
硫酸アンモニウム水溶液に添加し、十分攪拌させる。そ
の後、濾過分離、水洗、アルコ−ル沈殿を行い、乾燥さ
せることにより、所望の球状シリカ粒子が得られる。

【００１６】本発明における核酸抽出溶液とは、生物試
料中の核酸を含む細胞などを破壊し、核酸を露出させ、
そして、この核酸を磁性シリカ粒子に結合させる働きを
持つ溶液である。このような溶液としては、好ましくは
カオトロピック物質のようなシリカ粒子表面の疎水性を
高める物質が選択され、さらに好ましくはグアニジン
（イソ）チオシアン酸塩および／またはグアニジン塩酸
塩のような核酸分解酵素の阻害活性を有する化合物の溶
液が使用できる。また、核酸抽出溶液中に材料中に存在
する成分を不溶化させる作用を有する試薬を予め添加し
ておくことも可能である。

【００１７】カオトロピック物質としては、具体的には
グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩、ヨウ化
ナトリウム、ヨウ化カリウム、過塩素酸ナトリウム、尿
素等が挙げられるが、なかでも、ＲＮＡを分解するリボ
ヌクレアーゼに対する阻害効果の大きなグアニジンチオ
シアン酸塩あるいはグアニジン塩酸塩の使用が好まし
い。これらのカオトロピック物質の使用濃度は、用いら
れるカオトロピック物質により異なり、通常１．０〜
８．０Ｍ、好ましくは４．０〜７．０Ｍであり、例えば
グアニジン塩酸塩を使用する場合は、４．０〜７．５Ｍ
が好ましい。また、グアニジンチオシアン酸塩を使用す
る場合には、３．０〜５．５Ｍが好ましい。核酸抽出溶
液中に添加する不溶化作用を有する試薬と予め混合して
おく場合は塩酸、酢酸ナトリウムなど単独もしくは複数
を用いるで結果として溶液のｐＨを低下させることが可
能となる試薬を選択するのが好ましい。

【００１８】本発明の吸着剤を含む核酸抽出溶液には、
緩衝剤を含有させることが好ましい。これは予め抽出溶
液に含まれていても、また、細胞を溶解した後に緩衝液
として添加してもよい。この緩衝剤としては、一般に使
用されるものであれば、特に限定されないが、中性付
近、すなわちｐＨ５．０〜９．０において緩衝能を有す
るものが好ましい。例えば、トリス−塩酸塩、四ホウ酸
ナトリウム−塩酸、リン酸二水素カリウム−四ホウ酸ナ
トリウム緩衝液等が挙げられる。その濃度としては１〜
５００ｍＭ、ｐＨは６．０〜９．０の範囲が好適であ
る。

【００１９】また、核酸抽出溶液には、細胞膜の破壊あ
るいは細胞中に含まれるタンパク質を変性させる目的で
界面活性剤を含有させてもよい。この界面活性剤として
は、一般に細胞等からの核酸抽出に使用されるものであ
れば特に限定されないが、具体的には、トリトン系界面
活性剤およびツイーン系界面活性剤等の非イオン界面活
性剤、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム等の陰イオ
ン界面活性剤が挙げられる。本発明においては、特に非
イオン界面活性剤を０．１〜２．０％の範囲で使用する
のが好ましい。さらに、核酸抽出溶液には試料中に含ま
れるタンパク質、特にリボヌクレアーゼを変性、失活さ
せる目的で、２−メルカプトエタノールあるいはジチオ
スレイトール等の還元剤を含有させることが好ましい。

【００２０】本発明において必要により使用する洗浄液
とは、核酸結合性担体から核酸の溶離を促進することな
く、かつタンパク質、糖類、脂質の固相への結合を妨げ
るものであれば特に限定されない。具体的には、４．０
〜７．５Ｍグアニジン塩酸塩溶液あるいは４０〜１００
％エタノールで洗浄することが好ましい。また、初めに
溶解・吸着工程にて使用した抽出溶液を洗浄液として使
用すると、ゲノムＤＮＡとタンパク質の除去に有効であ
る。特に、カオトロピック物質を含む第一の洗浄液と、
アルコールを含む第二の洗浄液を併用するのが好まし
い。この場合のカオトロピック物質としては、グアニジ
ンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩、チオシアン酸ナ
トリウム塩などが挙げられる。また、アルコールとして
は、エタノール、イソアミルアルコール、２−プロパノ
ール、ブタノールなどが挙げられる。４０〜１００％、
好ましくは６０〜１００％濃度のエタノールを含む溶液
で洗浄することが特に好ましい。さらには、４０〜８０
％、より好ましくは７０％程度の濃度のエタノールを含
む第二の洗浄液と、６０〜１００％、より好ましくは９
９％程度の濃度のエタノールを含む第三洗浄液とを用い
るのが効果的である。

【００２１】本発明における核酸の結合した核酸結合性
担体から核酸を溶出する核酸溶出液とは、核酸結合性担
体から核酸の溶離を促進するものであれば、特に限定さ
れない。具体的には、水あるいはＴＥ緩衝液（１０ｍＭ
トリス−塩酸塩、１．０ｍＭＥＤＴＡ；ｐＨ８．０）が
好ましい。

【００２２】本発明において不溶性のフィルタとは、試
料を通過させる際に不純物を内部又は表面に保持するか
または通過の際に以後の操作に影響を及ぼさない程度に
物理的な切断または破砕する性質を有するものであれば
特に限定はされない。素材に関しても、通常用いられて
いるものであれば、特に限定されることなく使用するこ
とができる。このような性質を有するフィルタとして
は、具体的には、例えばすでに市販されているQIAGEN社
製の各種核酸精製用フィルタなどが挙げられる。

【００２３】この核酸−磁性シリカ粒子複合体を形成す
る際、夾雑物を多量に含む生物試料、例えば血液のよう
な検体を処理する場合、核試料由来の物質が磁性シリカ
粒子の周囲に付着し、核酸の結合を妨げる傾向にある。
実際、夾雑物が多い試料ほど核酸の回収能力が低下す
る。この問題を解決するため、本発明においては、細孔
直径および細孔容積がより大きい粒子を使用することに
より、上記試料由来の夾雑物質が粒子に付着しても、核
酸の結合に影響が出にくく、従って高い回収率を維持す
ることが可能となる。

【００２４】本発明では、このような磁性シリカ粒子
を、核酸を含有すると考えられる試料とともに核酸吸着
用溶液中に添加し、磁性シリカ粒子−核酸複合体を形成
する。本発明の核酸の抽出方法は、具体的には下記工程
（ａ）〜（ｄ）を含む。（ａ）核酸を含有すると考えら
れる材料と材料中に存在する成分を不溶化させる作用を
有する試薬と接触させる工程(前処理工程)、（ｂ）核酸
を含有すると考えられる材料と、核酸を吸着できる核酸
結合性磁性粒子担体と、核酸を該担体に吸着させるため
の核酸抽出溶液とを混合する工程(吸着工程)、（ｃ）核
酸以外のものを、核酸と担体との複合体より洗浄するこ
とで除去する工程(分離工程)、（ｄ）核酸と担体との複
合体より核酸を溶出し回収する工程(溶出工程)。

【００２５】核酸を含有すると考えられる材料とは特に
限定されるものではないが、全血、血清、血漿、尿、唾
液、体液などの動物由来の生物材料、その他、植物、微
生物などの動物以外の生物材料を包含する。また、これ
らの生物から分離した細胞および培養細胞を含む。さら
に、部分精製された核酸も包含する。

【００２６】核酸とは、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味す
る。ＤＮＡとしては、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、プ
ラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡなどを含む。
また、ＲＮＡとしては、ウイルス、細菌あるいは真菌等
の外来性寄生生物由来のＲＮＡに加えて、これらの生物
材料を産する生物に由来する内在性のＲＮＡを含み、ｔ
ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡなどを含む。

【００２７】本発明において、前処理工程（ａ）では、
核酸を含有すると考えられる材料と材料中に存在する成
分を不溶化させる作用を有する試薬と接触させる。接触
方法は、予め核酸抽出液を添加した材料に塩酸や酢酸ナ
トリウムなど材料中の成分を不溶化させる試薬を加えボ
ルテックスなどにより良く撹拌した後、卓上遠心機によ
り２分程度の遠心を行い、不溶化した成分を沈殿させ、
上清のみを回収する。吸着工程（ｂ）では、核酸結合性
担体、核酸を含有すると考えららえる試料および核酸抽
出溶液を混合し、核酸を核酸結合性担体に吸着させる。
混合方法は、ボルテックスによる攪拌、転倒混和、磁気
による攪拌などがあり、混合時間は約１〜６０分間であ
る。これらの物質を混合することにより、試料中の核
酸、タンパク質、糖類などが核酸結合性担体に物理的に
吸着する。分離工程（ｃ）における液相と核酸結合性担
体との分離手段としては、粒子内の超常磁性金属酸化物
を使用することによる、磁石等を用いた簡便な磁気分離
法が可能である。分離工程（ｃ）では、必要により洗浄
を行い、不要なタンパク質、糖類、脂質などを溶離す
る。洗浄は１回または２回以上行う。溶出工程（ｄ）
は、上記分離工程（ｃ）における核酸が吸着した核酸結
合性担体から該核酸を溶出する工程である。このとき回
収した核酸は、透析やエタノール沈殿法等の脱塩、濃縮
操作を施すことなく、制限酵素やＤＮＡポリメラーゼ等
を使用する酵素反応に直接使用することができる。ま
た、必要により増幅した後、核酸プローブ試薬を使用し
て目的核酸を検出することもできる。

【００２８】

【実施例】以下に実施例を挙げることにより、本発明の
効果をより一層明瞭なものとする。ただし、これらの実
施例によって本発明の範囲は限定されるものではない。
ここで、核酸配列（β２．７）を利用したサイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）核酸の増幅ならびに検出用試薬キッ
トおよびこれらの試薬を用いてＣＭＶを簡便かつ迅速に
増幅し、検出する方法を例示する。

【００２９】実施例１（抽出前処理を実施した試料中の
核酸の抽出）磁性シリカ粒子は、細孔直径が１〜２００ｎｍ、細孔容
積が４０〜２２００ｍｍ³／ｇ、平均粒子径の範囲が
１．０〜５．０μｍ、四三酸化鉄粒子の含有量がグラム
重量あたり３０％である粒子を準備した。また、抽出に
は自動核酸抽出装置であるMAGFREX(東洋紡績製)を用い
た。まず、０．１ｍｇ／ｍｌ濃度になるように５．０Ｍ
ＮａＣｌ溶液に懸濁した磁性シリカ粒子を準備した。
被験試料としては、ＣＭＶ核酸を保有する全血検体の希
釈物(サンプル１，２)、競合ＲＮＡ(サンプル３，４)を
使用した。

【００３０】また、核酸抽出用溶液としては、以下の組
成のものを使用した。５０ｍＭトリス−ＨＣｌ５．０Ｍグアニジンチオシアン酸塩２０ｍＭＥＤＴＡ１．２％ Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl
Ether

【００３１】本実施例の具体的な操作は次の通りであ
る。（１）１．５ｍｌ容のエッペンドルフチューブに、上記
の組成を持つ核酸抽出用試薬０．９ｍｌを入れ、次に核
酸を含有すると考えられる生物試料０．１ｍｌを添加
し、よく混合した。（２）次に、良く混合した試料に、１Ｎ塩酸を、０μ
ｌ(条件Ａ)、１５μｌ(条件Ｂ)、２０μｌ(条件Ｃ)添加
した。その後、所定の方法により抽出前処理を実施し
た。 (３)次に、５．０ＭＮａＣｌ溶液に懸濁した磁性シリ
カ粒子担体３５．０μｌを加え、よく混合した試料を自
動核酸抽出装置MAGFREXに設置し室温で１０分間撹拌し
反応させた。 (４)磁気分離機構により粒子をチューブ底部に厚め、溶
液層を静かに吸引は移出した。 (５)次に、洗浄液として５．０Ｍチオシアン酸ナトリウ
ム塩を含むトリス−塩酸緩衝液０．９ｍｌを加え、混合
した後、上記(４)と同様にして磁気分離、吸引排出を実
施した。 (６)洗浄液による洗浄操作をもう一度繰り返した。 (７)０．９ｍｌの７０％エタノール溶液により上記(５)
と同様に、核酸の吸着したシリカ粒子を洗浄し、高濃度
の塩溶液を除去した。 (８)再度０．９ｍｌの７０％エタノール溶液で洗浄した
後、０．９ｍｌの９９％エタノールで同様に洗浄した。 (９)５６．０℃に上記の試料を加温し、約３０分間静置
することにより、チューブ内およびシリカ粒子中のエタ
ノールを完全に蒸発させて除去した。 (１０)０．９ｍｌのトリス−ＮａＣｌ洗浄液（１０．０
ｍＭトリス−ＨＣｌ,１５．０ｍＭＮａＣｌ）を加え、
同様に洗浄した。(１０)０．１ｍｌの滅菌水を加え、５
６．０℃に上記試料を加温し１０分間反応させた。 (１１)MAGFREX磁気分離機構により溶出された核酸を新
しいチューブに回収した。 (１２)１２０００rpmで約５分間遠心分離することによ
り残存した粒子をチューブ底部に集め、別の新しいチュ
ーブに回収した。回収液量は通常６０〜７０μｌ程度で
ある。

【００３２】実施例２（サイトメガロウイルス核酸の増
幅）次にこの回収した核酸をＮＡＳＢＡ法（Nature 350,91
-92(1991)、特許第２６４８８０２号公報及び特許第２
６５０１５９号公報）により増幅した。増幅反応はサイ
トメガロウイルスの核酸配列中より最適な配列を有する
増幅用プライマーを使用した。５'側プライマーの塩基
配列が、5'-TCCTTTCCTT AATCTCGGAT TATCA-3'（配列番
号１）、３'側プライマーの塩基配列が、5'-AATTCTAATA
CGACTCACTA TAGGGAGGAG GGAATCGTCG ACTTTGAATT CTTCG
A -3'（配列番号２；Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモ
ーター配列を含む）である。これらのプライマー配列は
特開平９−２８９９００号公報に開示されたものであ
る。またＮＡＳＢＡ法は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
逆転写酵素およびＲＮａｓｅＨ（一重鎖もしくは二重鎖
ＲＮＡまたはＤＮＡを加水分解することなくＲＮＡ−Ｄ
ＮＡハイブリッドのＲＮＡを加水分解するリボヌクレア
ーゼ）を用いた。ＮＡＳＢＡ法による高濃度核酸配列の
調製は、まず下記に示すような増幅反応液２０．０μｌ
に、実施例１の方法により抽出、単離したＣＭＶ遺伝子
核酸溶液１５．０μｌを加え、６５℃で５分間静置し
た。そして４１℃に反応温度を下げ、その後下記の酵素
溶液５．０μｌを加えた。その後、４１℃で９０分間静
置した。こうして得られた増幅核酸溶液を核酸評価のた
め検出に用いた。

【００３３】増幅反応液の組成は以下に示す通りであ
る。４０．０ｍＭトリス−ＨＣｌ１２．０ｍＭＭｇＣｌ₂ ７０．０ｍＭＫＣｌ５．０ｍＭＤＴＴ１５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ１．０ｍＭｄＮＴＰ２．０ｍＭｒＮＴＰ０．２μＭプライマー×２

【００３４】酵素液の組成は以下に示す通りである。０．０１ＵＲＮａｓｅＨ（東洋紡績（株）製；Thermus
thermophilus由来）２０．０ＵＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコＢＲＬ
製）７．５Ｕ逆転写酵素（生化学工業（株）製）２．１μｇＢＳＡ

【００３５】実施例３(増幅した核酸溶液の検出) 核酸のサンドイッチハイブリダイゼーション法により、
サイトメガロウイルス核酸配列の検出を行った。〔サイトメガロウイルス遺伝子検出用捕捉プローブおよ
び標識プローブの合成〕捕捉プローブおよび標識プロー
ブは、ＤＮＡシンセサイザー３９１型（アプライドバイ
オシステムズ社製）を用いて、ホスホアミダイト法によ
り合成した。捕捉プローブの塩基配列は、5'-TTCCCTCTC
C TACCTACCAC GAA-3'（配列番号３）、標識プローブの
塩基配列は、5'-CGCAGATGAT AAACAAGAGG GTAA -3'（配
列番号４）である。標識プローブの配列中Ｘは、５'位
にリンカーアームを有するウリジンを示す。これらのプ
ローブは特開平９−２８９９００号公報に開示されたも
のである。

【００３６】〔標識プローブの酵素（アルカリフォスフ
ァターゼ）標識〕合成標識プローブと、そのリンカーア
ームを介してのアルカリフォスファターゼとの結合を、
文献（Nucleic Acids Research,14,6155,1986）に従っ
て行った。

【００３７】〔捕捉プローブ−固相の調製法〕固相はポ
リスチレン製のマイクロタイタープレート（マイクロラ
イト２、ダイナテック社製）を用い、上記方法で得られ
た捕捉プローブを、マイクロタイタープレートのウェル
に１００μｌずつ分注し、２５℃で一夜インキュベート
し、捕捉プローブをプレートに結合させた後、デオキシ
リボヌクレオチド三リン酸によりブロックを行った。

【００３８】〔サンドイッチハイブリダイゼーション法
による核酸の検出〕以上の方法で調製した試薬および試
料を用いて、核酸溶液の検出を以下に述べる方法で行っ
た。得られた核酸溶液を、水酸化ナトリウム溶液で処理
して変性させた。そして上記プレートに、変性させた試
料を２．０μｌ、ハイブリダイゼーション緩衝液を５
０．０μｌ、アルカリフォスファターゼ標識プローブ溶
液を５０．０μｌ加え、５０℃で３０分間ハイブリダイ
ゼーションを行った。ウェルから液を除き、１．０％ラ
ウリル硫酸ナトリウムを含む洗浄液１を２００μｌ加
え、５０℃で５分間洗浄し、次に０．５％ Polyethylen
e Glycol Mono-p-isooctylphenyl Etherを含む洗浄液２
を２００μｌ加え室温で５分間洗浄、さらに１×ＳＳＣ
溶液２００μｌで洗浄した。そして、アルカリフォスフ
ァターゼの基質であるLumiphos 480（和光純薬工業
製）を１００μｌ加え、３７℃で１５分間酵素反応を行
った後、発光量をマイクロライト１０００（ダイナテッ
ク社製）で測定した。実施例１〜３の結果を表1に示
す。

【００３９】

【表１】

【００４０】表１から明白なように、核酸抽出前の前処
理として１ＮＨＣｌでの処理を実施することで、核酸
の回収効率は飛躍的に向上した。

【００４１】実施例４(核酸抽出液のｐＨの調製による
抽出感度の比較) 上記と同様の粒子を使用し、酢酸ナトリウム溶液を添加
し、予めｐＨを７．０以下とした核酸抽出液を用いて不
溶化成分の除去と核酸の抽出作用を同時に実施した。そ
の後実施例２，３の方法で検出量を測定した。被験試料
としては、競合合成ＲＮＡ(１０²〜１０⁵コピー)を使用
した。核酸抽出液のｐＨを６．４（条件Ａ）、６．１
(条件Ｂ)、５．６（条件Ｃ）とし、対照として酢酸ナト
リウム溶液を添加しない通常の核酸抽出液（条件Ｄ）を
実施した。実施例４の結果を、表２に示す。

【００４２】

【表２】

【００４３】表２から明白なように核酸抽出液のｐＨを
変化させ、材料中の成分の不溶化と核酸抽出作用を同時
に実施した場合も通常の中性付近の核酸抽出液を用いた
場合と比べて検出感度の上昇が認められた。

【００４４】実施例５(不溶化作用を有する試薬とフィ
ルタ処理の併用) 上記と同様粒子を使用し、次に、混合した試料を市販の
核酸前処理フィルタ、QIAshredder(QIAGEN社製)を準備
し、セットされている回収用チューブ内に予め１ＮＨ
Ｃｌを１０μｌ添加した後、所定の方法により抽出前処
理を実施した(条件Ａ)。また、１ＮＨＣｌを添加せ
ず、フィルタ処理のみを実施 (条件Ｂ)、１ＮＨＣｌ
のみ添加 (条件Ｃ)、抽出前処理は全く実施せず直接抽出
操作を実施(条件Ｄ)の４条件で抽出を実施した。その後
実施例２，３の方法で検出量を測定した。被験試料とし
ては、ＣＭＶを保有する全血検体の希釈物を使用した。
実施例５の結果を表３に示す。

【００４５】

【表３】

【００４６】表３から明白なように、１ＮＨＣｌによ
る処理とフィルタ処理との併用により、核酸の回収効率
は飛躍的に向上した。フィルタによる前処理のみでの効
果も大きいことが判明しているが、ｐＨ調整による不純
物の除去を組み合わせることでより高い回収効率が得ら
れることが確認された。

【００４７】

【発明の効果】上述したように、本発明の方法は、核酸
を含むと考えられる材料と材料中に存在する成分を不溶
化させる作用を有する試薬を使用することで、生物材料
から高い回収率で核酸を抽出および単離することが可能
となる。特に、全血試料のような夾雑物質を多量に含む
材料からの核酸抽出においては、従来前処理を実施しな
い条件と比べて飛躍的な効果が得られるという利点を有
する。

【００４８】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：25 配列の形：他の核酸合成ＤＮＡトポロジー：一本鎖配列の特徴：サイトメガロウイルスのｍＲＮＡに相同な配列を有する。配列 TCCTTTCCTT AATCTCGGAT TATCA 25

【００４９】配列番号：２配列の長さ：56 配列の形：他の核酸合成ＤＮＡトポロジー：一本鎖配列の特徴：サイトメガロウイルスのｍＲＮＡに相補的な配列を有する。またＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を持つ。配列 AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGGAG GGAATCGTCG ACTTTGAATT CTTCGA 56

【００５０】配列番号：３配列の長さ：23 配列の形：他の核酸合成ＤＮＡトポロジー：一本鎖配列の特徴：サイトメガロウイルスのｍＲＮＡに相同な配列を有する。配列 TTCCCTCTCC TACCTACCAC GAA 23

【００５１】配列番号：４配列の長さ：24 配列の型：他の核酸合成ＤＮＡトポロジー：一本鎖配列の特徴：サイトメガロウイルスのｍＲＮＡに相同な配列を有する。配列 CGCAGATGAT AAACAAGAGG GTAA 24

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】核酸を含有すると考えられる材料から核
酸を抽出および単離するための方法であって、以下の工
程（ａ）〜（ｄ）を含むことを特徴とする核酸の抽出方
法。（ａ）核酸を含有すると考えられる材料と該材料中に存
在する成分を不溶化させる作用を有する試薬と接触させ
る工程（ｂ）核酸を含有すると考えられる材料、核酸を吸着で
きる核酸結合性磁性粒子担体、及び核酸を該担体に吸着
させるための核酸抽出溶液とを混合する工程（ｃ）核酸以外のものを、核酸と粒子担体との複合体を
洗浄することにより除去する工程（ｄ）核酸と担体との複合体より核酸を溶出し回収する
工程
【請求項２】核酸を含有すると考えられる材料中に存
在する成分を不溶化させる作用を有する試薬のｐＨが７
未満である請求項１記載の核酸の抽出方法。
【請求項３】核酸を含有すると考えられる材料中に存
在する成分を不溶化させる作用を有する試薬が核酸抽出
溶液である請求項１記載の核酸の抽出方法。
【請求項４】核酸を含有すると考えられる材料を水不
溶性のフィルタに通過させる工程を含むことを特徴とす
る請求項１記載の核酸の抽出方法。
【請求項５】該核酸がＤＮＡおよび／またはＲＮＡで
ある請求項１記載の核酸の抽出方法。
【請求項６】該核酸を含有すると考えられる材料が生
物材料である請求項１記載の核酸の抽出方法。
【請求項７】該生物材料が、血液、組織、尿、喀痰よ
りなる群から選ばれたいずれかである請求項１記載の核
酸の抽出方法。
【請求項８】該核酸抽出溶液がカオトロピック物質を
含有する請求項１記載の核酸の抽出方法。
【請求項９】該カオトロピック物質が、グアニジン
塩、ヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウム、（イソ）チオ
シアン酸塩および尿素よりなる群から選択された少なく
とも１種を含むものである請求項８記載の核酸の抽出方
法。
【請求項１０】該カオトロピック物質が、グアニジン
（イソ）チオシアン酸塩および／またはグアニジン塩酸
塩である請求項９記載の核酸の抽出方法。
【請求項１１】工程（ｃ）において用いられる洗浄液
が、カオトロピック物質を含む第一の洗浄液およびアル
コールを含む第二の洗浄液を使用する請求項１記載の核
酸の抽出方法。
【請求項１２】カオトロピック物質として、グアニジ
ンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩および／またはチ
オシアン酸ナトリウム塩を含有する第一の洗浄液を使用
する請求項１１記載の核酸の抽出方法。
【請求項１３】４０〜１００％濃度のアルコールを含
有する第二の洗浄液を使用する請求項１１記載の核酸の
抽出方法。
【請求項１４】４０〜１００％濃度のエタノールを含
有する第二の洗浄液および６０〜１００％濃度のエタノ
ールを含有する第三の洗浄液を使用する請求項１１記載
の核酸の抽出方法。