JP2020078303A

JP2020078303A - 標的ｄｎａに特異的なガイドｒｎａおよびｃａｓタンパク質コード核酸またはｃａｓタンパク質を含む、標的ｄｎａを切断するための組成物、ならびにその使用

Info

Publication number: JP2020078303A
Application number: JP2020000091A
Authority: JP
Inventors: キム，ジン−ソー; Jin-Soo Kim; ウーチョ，スン; Seung Woo Cho; キム，ソジュン; So Jung Kim; ミンキム，ジョン; Jong Min Kim; キム，ソクジョーン; Seokjoong Kim
Original assignee: Toolgen Inc
Current assignee: Toolgen Inc
Priority date: 2012-10-23
Filing date: 2020-01-06
Publication date: 2020-05-28
Also published as: EP4567111A2; KR20150101478A; KR20150101446A; JP2023166401A; CN110643600A; AU2017254854B2; EP4357457A3; CN110592089B; JP6517143B2; EP4397760A3; JP2025072369A; KR102052286B1; BR112015008708A2; EP3346003B1; CN110066775A; EP4180526A3; DE202013012610U1; SG11201503059XA; JP2016027807A; AU2025203547A1

Abstract

【課題】真核細胞または真核生物中の標的DNAを切断するための組成物を提供する。
【解決手段】真核細胞における標的デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の切断のためのタイプＩＩのクラスター化された規則的間隔の短いパリンドローム反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓシステムを含む組成物であって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが（ｉ）Ｃａｓ９ポリペプチド及び核局在化シグナルをコードする核酸、又は核局在化シグナルを有するＣａｓ９ポリペプチド、及び（ｉｉ）真核細胞中の標的ＤＮＡにハイブリダイズする合成ガイドＲＮＡ、を含み、合成ガイドＲＮＡがトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列に融合したＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列を含むキメラガイドＲＮＡであり、ｃｒＲＮＡ配列がｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して５’末端側にある、組成物。
【選択図】図１ａ

Description

本発明は、真核細胞または真核生物における標的化ゲノム編集に関する。より詳細には、本発明は、標的DNAに特異的なガイドRNAおよびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する、真核細胞または真核生物中の標的DNAを切断するための組成物、ならびにその使用に関する。

CRISPR（クラスター化された規則的間隔の短いパリンドローム反復配列、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat）は、配列決定された細菌の約40％および配列決定された古細菌の90％のゲノムにおいて見出される多数の短い直列反復配列を含む遺伝子座である。CRISPRは、原核生物の免疫系として機能し、そこでそれは、プラスミドおよびファージなどの外因性の遺伝因子に対する抵抗性を与える。CRISPRシステムは、一種の獲得免疫をもたらす。スペーサーと呼ばれる外来DNAの短いセグメントは、ゲノムのCRISPRリピートの間に組み込まれ、過去の曝露の記憶として機能する。CRISPRスペーサーは、その後、真核生物におけるRNAiと類似した方法で外因性遺伝因子を認識してサイレンシングするために用いられる。

タイプIICRISPR/Casシステムに必須のタンパク質成分であるCas9は、CRISPR RNA（crRNA）およびトランス活性化crRNA（tracrRNA）と呼ばれる２つのRNAと複合体を形成した場合、活性を有するエンドヌクレアーゼを形成し、それによって侵入したファージまたはプラスミド中の外来遺伝因子を切断して、宿主細胞を防御する。crRNAは、以前にこのような外来侵入物から捕捉された、宿主ゲノム内のCRISPRエレメントから転写される。近年、Jinekら（1）は、crRNAおよびtracrRNAの必須部分の融合によって産生された一本鎖キメラRNAがCas9/RNA複合体中の２つのRNAと置き換え可能であり、機能的なエンドヌクレアーゼを形成できることを実証した。

ヌクレオチド結合CRISPR-Casタンパク質における部位特異性は、設計および合成がより困難であり得るDNA結合タンパク質の代わりに、RNA分子に支配されているので、CRISPR/Casシステムは、ジンクフィンガーおよび転写活性化因子様エフェクターDNA結合タンパク質に対して利点を提供する。
しかし、今まで、CRISPR/Casシステムに基づくRNA誘導型エンドヌクレアーゼ（RGEN）を用いたゲノム編集法は、開発されていなかった。
一方、制限酵素断片長多型（RFLP）は、分子生物学および遺伝学においていまだに広く使用されている、最も古く、最も簡便で、最も安価な遺伝子型決定法の１つであるが、制限エンドヌクレアーゼによって認識される適切な部位の欠如によってしばしば制限される。

人工（Engineered）ヌクレアーゼ誘発性突然変異は、様々な方法によって検出され、それらは、ミスマッチ感受性のT7 エンドヌクレアーゼI（T7E1）アッセイまたはSurveyorヌクレアーゼアッセイ、RFLP、蛍光PCR産物のキャピラリー電気泳動法、ジデオキシ配列決定法、およびディープシークエンシング（deep sequencing）を含む。T7E1およびSurveyorアッセイは広く用いられるが、煩雑である。更に、突然変異配列が互いとホモ二本鎖を形成する可能性があり、ホモ接合性の二対立遺伝子突然変異体クローンと野生型細胞とを区別できないため、これらの酵素は突然変異頻度を過小評価する傾向がある。RFLPはこれらの制約がないため、好まれる方法である。実際、RFLPは、細胞および動物において人工ヌクレアーゼ仲介性突然変異を検出するための最初の方法の１つであった。しかし残念なことに、RFLPは適切な制限酵素認識部位の利用可能性によって制限される。目的とする標的部位で利用できる制限酵素認識部位がない可能性がある。

今まで、CRISPR/Casシステムに基づくRNA誘導型エンドヌクレアーゼ（RGEN）を用いたゲノム編集法および遺伝子型決定法は、開発されていなかった。
このような状況下において、本発明者らは、多くの努力を払って、CRISPR/Casシステムに基づくゲノム編集法を開発し、ついに真核細胞および真核生物において標的化してDNAを切断するプログラム可能なRNA誘導型エンドヌクレアーゼを確立した。
加えて、本発明者らは、多くの努力を払って、RFLP分析におけるRNA誘導型エンドヌクレアーゼ（RGEN）の新規使用方法を開発した。本発明者らは、RGENを用いて、癌において見出される反復突然変異ならびにRGEN自身を含む人工ヌクレアーゼによって細胞および生物に誘発された突然変異の遺伝子型決定を行い、それによって本発明を完成させた。

本発明の目的は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する、真核細胞または真核生物中の標的DNAを切断するための組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する、真核細胞または真核生物において標的化突然変異生成を誘発するための組成物を提供することである。

本発明の更に別の目的は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する、真核細胞または真核生物中の標的DNAを切断するためのキットを提供することである。
本発明の更に別の目的は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する、真核細胞または真核生物において標的化突然変異生成を誘発するためのキットを提供することである。

本発明の更に別の目的は、真核細胞または真核生物にCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質、およびガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNAを同時トランスフェクトまたは連続トランスフェクトするステップを含む、Casタンパク質ならびにガイドRNAを有する真核細胞あるいは真核生物を作製する方法を提供することである。
本発明の更に別の目的は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する真核細胞または真核生物を提供することである。

本発明の更に別の目的は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する組成物を、標的DNAを含む真核細胞または真核生物にトランスフェクトするステップを含む、真核細胞あるいは真核生物中の標的DNAを切断する方法を提供することである。
本発明の更に別の目的は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する組成物で真核細胞または真核生物を処理するステップを含む、真核細胞あるいは真核生物において標的化突然変異生成を誘発する方法を提供することである。

本発明の更に別の目的は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する組成物によって編集されたゲノムを有する胚、ゲノム改変動物、またはゲノム改変植物を提供することである。
本発明の更に別の目的は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する組成物を、動物の胚に導入するステップ；ならびにその胚を偽妊娠した代理母の卵管に移入して、ゲノム改変動物を生じさせるステップを含む、ゲノム改変動物を作製する方法を提供することである。

本発明の更に別の目的は、標的DNA配列に特異的なガイドRNAおよびCasタンパク質を含有する、単離された生体サンプル中の突然変異または多型（variations）を遺伝子型決定するための組成物を提供することである。
本発明の更に別の目的は、人工ヌクレアーゼによって細胞内に誘発された突然変異または自然発生突然変異もしくは多型を遺伝子型決定するために、RNA誘導型エンドヌクレアーゼ（RGEN）を使用する方法を提供することであり、そのRGENは、標的DNAに特異的なガイドRNAおよびCasタンパク質を含む。

本発明の更に別の目的は、人工ヌクレアーゼによって細胞内に誘発された突然変異または自然発生突然変異もしくは多型を遺伝子型決定するための、RNA誘導型エンドヌクレアーゼ（RGEN）を含むキットを提供することであり、そのRGENは、標的DNAに特異的なガイドRNAおよびCasタンパク質を含む。
本発明の目的は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する、真核細胞または真核生物中の標的DNAを切断するための組成物を提供することである。

本発明の他の目的は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する、真核細胞または真核生物において標的化突然変異生成を誘発するための組成物を提供することである。
本発明の更に別の目的は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する、真核細胞または真核生物中の標的DNAを切断するためのキットを提供することである。

本発明の更に別の目的は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する、真核細胞または真核生物において標的化突然変異生成を誘発するためのキットを提供することである。
本発明の更に別の目的は、真核細胞または真核生物にCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質、およびガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNAを同時トランスフェクトまたは連続トランスフェクトするステップを含む、Casタンパク質ならびにガイドRNAを有する真核細胞あるいは真核生物を作製する方法を提供することである。

本発明の更に別の目的は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する真核細胞または真核生物を提供することである。
本発明の更に別の目的は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する組成物を、標的DNAむ真核細胞または真核生物にトランスフェクトするステップを含む、真核細胞あるいは真核生物中の標的DNAを切断する方法を提供することである。

本発明の更に別の目的は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する組成物で真核細胞または真核生物を処理するステップを含む、真核細胞あるいは真核生物において標的化突然変異生成を誘発する方法を提供することである。
本発明の更に別の目的は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する組成物によって編集されたゲノムを有する胚、ゲノム改変動物、またはゲノム改変植物を提供することである。

本発明の更に別の目的は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する組成物を、動物の胚に導入するステップ；ならびにその胚を偽妊娠した代理母の卵管に移入して、ゲノム改変動物を生じさせるステップを含む、ゲノム改変動物を作製する方法を提供することである。
本発明の更に別の目的は、標的DNA配列に特異的なガイドRNAおよびCasタンパク質を含有する、単離された生体サンプル中の突然変異または多型を遺伝子型決定するための組成物を提供することである。

本発明の更に別の目的は、標的DNA配列に特異的なガイドRNAおよびCasタンパク質を含有する、単離された生体サンプル中の病原微生物の核酸配列を遺伝子型決定するための組成物を提供することである。
本発明の更に別の目的は、組成物、具体的にはRNA誘導型エンドヌクレアーゼ（RGEN）を含有する組成物を含む、単離された生体サンプル中の突然変異または多型を遺伝子型決定するためのキットを提供することであり、そのRGENは、標的DNAに特異的なガイドRNAおよびCasタンパク質を含む。

本発明の更に別の目的は、組成物、具体的にはRNA誘導型エンドヌクレアーゼ（RGEN）を含有する組成物を用いた、単離された生体サンプル中の突然変異または多型を遺伝子型決定するための方法を提供することであり、そのRGENは、標的DNAに特異的なガイドRNAおよびCasタンパク質を含む。

真核細胞または真核生物において標的DNAを切断するための、または標的化突然変異生成を誘発するための、標的DNAに特異的なガイドRNAおよびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する本組成物、本組成物を含むキット、ならびに標的化突然変異生成を誘発する方法は、新しい便利なゲノム編集ツールを提供する。加えて、カスタムRGENは任意のDNA配列を標的とするように設計することができるため、ほぼすべての一塩基多型または小さな挿入／欠失（indel）は、RGEN仲介性RFLPによって分析でき、従って、本発明の組成物および方法は、自然発生多型および突然変異の検出および切断に使用されうる。

図１は、in vitroでのプラスミドDNAのCas9触媒性切断を示す。（a）標的DNAおよびキメラRNA配列の模式図。赤い三角形は切断部位を示す。Cas9によって認識されるPAM配列は太字で示される。crRNAおよびtracrRNAに由来するガイドRNA中の配列は、それぞれ、囲み内および下線で示される。図１は、in vitroでのプラスミドDNAのCas9触媒性切断を示す。（b）Cas9によるプラスミドDNAのin vitroでの切断。完全な（intact）環状プラスミドまたはApaLI消化プラスミドを、Cas9およびガイドRNAとともにインキュベートした。図２は、エピソーム標的部位でのCas9誘発性突然変異生成を示す。（a）RFP-GFPレポーターを用いた細胞に基づくアッセイの概略図。GFP配列はフレームシフトしてRFP配列と融合しているため、GFPはこのレポーターから発現されない。RFP-GFP融合タンパク質は、２つの配列の間の標的部位が部位特異的ヌクレアーゼによって切断される場合のみに発現される。図２は、エピソーム標的部位でのCas9誘発性突然変異生成を示す。（b）Cas9をトランスフェクトされた細胞のフローサイトメトリー。RFP-GFP融合タンパク質を発現する細胞の割合が示される。図３は、内在性の染色体部位でのRGEN誘発性突然変異を示す。（a）CCR5遺伝子座。（上）T7E1アッセイを用いて、RGEN誘発性突然変異を検出した。矢印は、T7E1によって切断されるDNAバンドの予測される位置を示す。突然変異頻度（Indels（％））は、バンド強度の測定によって計算された。（下）CCR5およびC4BPBの野生型（WT）ならびに突然変異体クローンのDNA配列。ガイドRNAに相補的な標的配列の領域は、囲み（boc）で示される。PAM配列は太字で示される。三角形は切断部位を示す。マイクロホモロジーに相当する塩基には下線が引かれている。右側の列は、挿入または欠失した塩基数を示す。図３は、内在性の染色体部位でのRGEN誘発性突然変異を示す。（b）C4BPB遺伝子座。（上）T7E1アッセイを用いて、RGEN誘発性突然変異を検出した。矢印は、T7E1によって切断されるDNAバンドの予測される位置を示す。突然変異頻度（Indels（％））は、バンド強度の測定によって計算された。（下）CCR5およびC4BPBの野生型（WT）ならびに突然変異体クローンのDNA配列。ガイドRNAに相補的な標的配列の領域は、囲み（boc）で示される。PAM配列は太字で示される。三角形は切断部位を示す。マイクロホモロジーに相当する塩基には下線が引かれている。右側の列は、挿入または欠失した塩基数を示す。図４は、RGEN誘発性のオフターゲット突然変異が検出されないことを示す。（a）オンターゲット配列および潜在的なオフターゲット配列。潜在的なオフターゲット部位について、コンピューターを用いてヒトゲノムを検索した。４つの部位が同定され、それぞれは、CCR5オンターゲット部位と３塩基のミスマッチを有する。ミスマッチ塩基には下線が引かれている。図４は、RGEN誘発性のオフターゲット突然変異が検出されないことを示す。（b）T7E1アッセイを用いて、Cas9/RNA複合体をトランスフェクトした細胞において、これらの部位が突然変異したかどうかを調べた。突然変異はこれらの部位で検出されなかった。N/A（該当なし）、遺伝子間部位。図４は、RGEN誘発性のオフターゲット突然変異が検出されないことを示す。（c）Cas9は、オフターゲットに関連する染色体欠失を引き起こさなかった。CCR5特異的なRGENおよびZFNをヒト細胞内で発現させた。PCRを用いて、これらの細胞における15-kbの染色体欠失の誘発を検出した。図５は、マウスにおけるRGEN誘導性Foxn1遺伝子ターゲティングを示す。（a）マウスFoxn1遺伝子のエクソン2に特異的なsgRNAを表す模式図。エクソン2のPAMは赤で示され、エクソン2に相補的なsgRNA中の配列には下線が引かれている。三角形は切断部位を示す。図５は、マウスにおけるRGEN誘導性Foxn1遺伝子ターゲティングを示す。（b）細胞質内注入によって１細胞期のマウス胚に送達されたCas9 mRNAとFoxn1特異的sgRNAの遺伝子ターゲティング効率を示す代表的なT7E1アッセイ。数字は、最高用量から生じた独立のファウンダーマウスを示す。矢印は、T7E1によって切断されたバンドを示す。図５は、マウスにおけるRGEN誘導性Foxn1遺伝子ターゲティングを示す。（c）bで同定された３つのFoxn1突然変異体ファウンダーで観察された変異対立遺伝子のDNA配列。発生回数は括弧内に示される。図５は、マウスにおけるRGEN誘導性Foxn1遺伝子ターゲティングを示す。（d）Foxn1ファウンダー#108と野生型FVB/NTacとの交配から生じるF1子孫のPCR遺伝子型決定。子孫においてFoxn1ファウンダー#108で見出された変異対立遺伝子の分離を認める。図６は、Cas9 mRNAおよびFoxn1-sgRNAの細胞質内注入による、マウス胚におけるFoxn1遺伝子ターゲティングを示す。（a）最高用量を注入した後の、突然変異率を測定するT7E1アッセイの代表的結果。矢印は、T7E1によって切断されたバンドを示す。（b）T7E1アッセイ結果の要約。示されたRGEN用量の細胞質内注入後に得られたin vitro培養胚の間の突然変異率を示す。（c）T7E1陽性突然変異胚のサブセットから同定されたFoxn1変異対立遺伝子のDNA配列。野生型対立遺伝子の標的配列は、囲みで示される。図７は、組換えCas9タンパク質：Foxn1-sgRNA複合体を用いた、マウス胚におけるFoxn1遺伝子ターゲティングを示す。（a）および（b）は、代表的なT7E1アッセイ結果およびそれらの要約である。前核注入（a）または細胞質内注入（b）を受けた後、胚はin vitro培養された。赤い数字は、T7E1陽性突然変異ファウンダーマウスを示す。図７は、組換えCas9タンパク質：Foxn1-sgRNA複合体を用いた、マウス胚におけるFoxn1遺伝子ターゲティングを示す。（a）および（b）は、代表的なT7E1アッセイ結果およびそれらの要約である。前核注入（a）または細胞質内注入（b）を受けた後、胚はin vitro培養された。赤い数字は、T7E1陽性突然変異ファウンダーマウスを示す。図７は、組換えCas9タンパク質：Foxn1-sgRNA複合体を用いた、マウス胚におけるFoxn1遺伝子ターゲティングを示す。（c）組換えCas9タンパク質：Foxn1-sgRNA複合体の最高用量での前核注入によって得られ、in vitro培養された胚から同定された、Foxn1変異対立遺伝子のDNA配列。野生型対立遺伝子の標的配列は、囲みで示される。図８は、Foxn1突然変異体ファウンダー#12に見られる変異対立遺伝子の生殖細胞系列伝達を示す。（a）fPCR分析。（b）野生型FVB/NTac、ファウンダーマウス、およびそれらのF1子孫のPCR遺伝子型決定。図９は、Prkdc突然変異ファウンダーの交配によって生じた胚の遺伝子型を示す。Prkdc突然変異ファウンダー♂25と♀15とを交配し、E13.5胚を摘出した。（a）野生型、ファウンダー♂25、およびファウンダー♀15のfPCR分析。注意すべきことは、fPCR分析の技術的限界のため、これらの結果が、変異対立遺伝子の正確な配列とのわずかな違いを示したことである；例えば、配列分析からは、ファウンダー♂25および♀15において、それぞれ、Δ269/Δ61/WTおよびΔ5+1/+7/+12/WTが同定された。（b）生じた胚の遺伝子型。図１０は、Cas9タンパク質/sgRNA複合体誘発性の標的化突然変異を示す。図１０は、Cas9タンパク質/sgRNA複合体誘発性の標的化突然変異を示す。図１０は、Cas9タンパク質/sgRNA複合体誘発性の標的化突然変異を示す。図１０は、Cas9タンパク質/sgRNA複合体誘発性の標的化突然変異を示す。図１０は、Cas9タンパク質/sgRNA複合体誘発性の標的化突然変異を示す。図１１は、シロイヌナズナ（Arabidopsis）プロトプラストにおける組換えCas9タンパク質誘発性突然変異を示す。図１２は、シロイヌナズナ（Arabidopsis）BRI1遺伝子における、組換えCas9タンパク質誘発性突然変異配列を示す。図１３は、Cas9-mal-9R4LおよびsgRNA/C9R4LC複合体の処理による293細胞中の内在性CCR5遺伝子の破壊を示している、T7E1アッセイを示す。図１４（a, b）は、Fuら（2013）に報告されたRGENのオンターゲット部位およびオフターゲット部位での突然変異頻度を示す。（R）20μgのCas9をコードするプラスミドならびに、それぞれ60μgおよび120μgのin vitro転写されたGX19 crRNAおよびtracrRNAを連続的にトランスフェクトした（1×10⁶細胞）、または（D）1μgのCas9をコードするプラスミドおよび1μgのGX₁₉ sgRNA発現プラスミドを同時トランスフェクトした（2×10⁵細胞）K562細胞由来のゲノムDNAを分析したT7E1アッセイ。図１４（a, b）は、Fuら（2013）に報告されたRGENのオンターゲット部位およびオフターゲット部位での突然変異頻度を示す。（R）20μgのCas9をコードするプラスミドならびに、それぞれ60μgおよび120μgのin vitro転写されたGX19 crRNAおよびtracrRNAを連続的にトランスフェクトした（1×10⁶細胞）、または（D）1μgのCas9をコードするプラスミドおよび1μgのGX₁₉ sgRNA発現プラスミドを同時トランスフェクトした（2×10⁵細胞）K562細胞由来のゲノムDNAを分析したT7E1アッセイ。図１５（a, b）は、ガイドRNA構造の比較を示す。Fuら（2013）に報告されたRGENの突然変異頻度を、T7E1アッセイを用いてオンターゲット部位およびオフターゲット部位で測定した。Cas9をコードするプラスミドおよびGX19 sgRNAまたはGGX20 sgRNAをコードしているプラスミドを、K562細胞に同時トランスフェクトした。オフターゲット部位（OT1-3など）は、Fuら（2013）に記載されるように標識される。図１５（a, b）は、ガイドRNA構造の比較を示す。Fuら（2013）に報告されたRGENの突然変異頻度を、T7E1アッセイを用いてオンターゲット部位およびオフターゲット部位で測定した。Cas9をコードするプラスミドおよびGX19 sgRNAまたはGGX20 sgRNAをコードしているプラスミドを、K562細胞に同時トランスフェクトした。オフターゲット部位（OT1-3など）は、Fuら（2013）に記載されるように標識される。図１６は、Cas9ニッカーゼによるin vitroDNA切断を示す。（a）Cas9ヌクレアーゼおよびペアードCas9ニッカーゼの概略図。PAM配列および切断部位は、囲みで示される。図１６は、Cas9ニッカーゼによるin vitroDNA切断を示す。（b）ヒトAAVS1遺伝子座の中の標的部位。それぞれの標的部位の位置は、三角形で示される。図１６は、Cas9ニッカーゼによるin vitroDNA切断を示す。（c）DNA切断反応の概略図。FAM色素（囲みで示される）は、DNA基質の両方の5’末端に結合された。図１６は、Cas9ニッカーゼによるin vitroDNA切断を示す。（d）蛍光キャピラリー電気泳動を用いて分析されたDSBおよびSSB。蛍光標識されたDNA基質を、電気泳動前にCas9ヌクレアーゼまたはニッカーゼとともにインキュベートした。図１７は、Cas9ヌクレアーゼおよびニッカーゼの挙動の比較を示す。（a）Cas9ヌクレアーゼ（WT）、ニッカーゼ（D10A）、およびペアードニッカーゼと関連したオンターゲット突然変異頻度。5'突出部または3'突出部を生じるであろうペアードニッカーゼが示される。図１７は、Cas9ヌクレアーゼおよびニッカーゼの挙動の比較を示す。（b）Cas9ヌクレアーゼおよびペアードニッカーゼのオフターゲット作用の分析。３つのsgRNAに対する合計７つの潜在的なオフターゲット部位が分析された。図１８は、他の内在性ヒト遺伝子座で試験されたペアードCas9ニッカーゼを示す。（a）ヒトCCR5およびBRCA2遺伝子座でのsgRNA標的部位。PAM配列は赤で示される。図１８は、他の内在性ヒト遺伝子座で試験されたペアードCas9ニッカーゼを示す。（b）それぞれの標的部位でのゲノム編集活性は、T7E1アッセイによって検出された。5'突出部を生じるであろう２つのニックの修復は、3'突出部を生じるものよりはるかに高頻度でindelの形成を引き起こした。図１８は、他の内在性ヒト遺伝子座で試験されたペアードCas9ニッカーゼを示す。（c）ヒトCCR5およびBRCA2遺伝子座でのsgRNA標的部位。PAM配列は赤で示される。図１８は、他の内在性ヒト遺伝子座で試験されたペアードCas9ニッカーゼを示す。（d）それぞれの標的部位でのゲノム編集活性は、T7E1アッセイによって検出された。5'突出部を生じるであろう２つのニックの修復は、3'突出部を生じるものよりはるかに高頻度でindelの形成を引き起こした。図１９は、ペアードCas9ニッカーゼが相同組換えを仲介することを示す。（a）相同組換えを検出する方法。ドナーDNA は、２つのホモロジーアームの間にXbaI制限酵素部位を含み、内在性の標的部位はこの部位を欠いていた。PCRアッセイを用いて、相同組換えをした配列を検出した。混入しているドナーDNAの増幅を防ぐため、ゲノムDNAに特異的なプライマーを用いた。（b）相同組換えの効率。相同組換えが起こった領域のアンプリコンのみが、XbaIによって消化され；切断バンドの強度を用いて、この方法の効率を測定した。図２０は、ペアードCas9ニッカーゼによって誘発されるDNAスプライシングを示す。（a）ヒトAAVS1遺伝子座におけるペアードニッカーゼの標的部位。AS2部位と他の部位のそれぞれとの間の距離が示される。矢印はPCRプライマーを示す。図２０は、ペアードCas9ニッカーゼによって誘発されるDNAスプライシングを示す。（b）PCRを用いて検出されるゲノム欠失。アスタリスクは、欠失特異的PCR産物を示す。図２０は、ペアードCas9ニッカーゼによって誘発されるDNAスプライシングを示す。（c）AS2およびL1 sgRNAを用いて得られた欠失特異的PCR産物のDNA配列。標的部位PAM配列は囲みで示され、sgRNA対応配列は大文字で示される。完全なsgRNA対応配列には下線が引かれている。図２０は、ペアードCas9ニッカーゼによって誘発されるDNAスプライシングを示す。（d）ペアードCas9ニッカーゼ仲介性の染色体欠失の図式モデル。新たに合成されるDNA鎖は、囲みで示される。図２１は、ペアードCas9ニッカーゼが転座を引き起こさないことを示す。（a）オンターゲット部位とオフターゲット部位との間の染色体転座の概略図。図２１は、ペアードCas9ニッカーゼが転座を引き起こさないことを示す。（b）染色体転座を検出するためのPCR増幅。図２１は、ペアードCas9ニッカーゼが転座を引き起こさないことを示す。（c）転座はCas9ヌクレアーゼによって引き起こされるが、ニッカーゼペアによっては引き起こされない。図２２は、T7E1アッセイおよびRFLPアッセイの概念図を示す。（a）２倍体細胞での人工ヌクレアーゼ処理後の、４つの起こりうる状況：（A）野生型、（B）単一対立遺伝子の突然変異、（C）異なる二対立遺伝子の突然変異（ヘテロ）、および（D）同一の二対立遺伝子の突然変異（ホモ）におけるアッセイ切断反応の比較。黒線は、各対立遺伝子に由来するPCR産物を表し；破線および点描の囲みは、NHEJによって生じた挿入／欠失突然変異を示す。図２２は、T7E1アッセイおよびRFLPアッセイの概念図を示す。（b）電気泳動によって分離されるT7E1消化およびRGEN消化の予想される結果。図２３は、indelを有するC4BPB標的部位を含む線状化プラスミドのin vitro切断アッセイを示す。個々のプラスミド基質のDNA配列（上段）。PAM配列には下線が引かれている。挿入塩基は囲みで示される。矢印（下段）は、野生型特異的RGENによて切断された電気泳動後のDNAバンドの予想される位置を示す。図２４は、RGEN仲介性RFLPを用いた、人工ヌクレアーゼによって細胞に誘発された突然変異の遺伝子型決定を示す。（a）C4BPB突然変異K562細胞クローンの遺伝子型。（b）ミスマッチ感受性T7E1アッセイのRGEN仲介性RFLP分析との比較。黒い矢印は、T7E1酵素またはRGENの処理による切断生成物を示す。図２５は、RGEN-RFLP法を用いたRGEN誘発性突然変異の遺伝子型決定を示す。（a）RGEN-RFLPおよびT7E1アッセイを用いたC4BPB破壊クローンの分析。矢印は、RGENまたはT7E1によって切断されたDNAバンドの予想される位置を示す。図２５は、RGEN-RFLP法を用いたRGEN誘発性突然変異の遺伝子型決定を示す。（b）RGEN-RFLP分析のT7E1アッセイとの定量的比較。野生型およびC4BPB破壊K562細胞由来のゲノムDNAサンプルを様々な比率で混合し、PCR増幅を行った。図２５は、RGEN-RFLP法を用いたRGEN誘発性突然変異の遺伝子型決定を示す。（c）RFLPおよびT7E1分析を用いた、HeLa細胞のHLA-B遺伝子におけるRGEN誘発性突然変異の遺伝子型決定。図２６は、RGEN仲介性RFLPを用いた、人工ヌクレアーゼによって生物に誘発された突然変異の遺伝子型決定を示す。（a）Pibf1突然変異ファウンダーマウスの遺伝子型。図２６は、RGEN仲介性RFLPを用いた、人工ヌクレアーゼによって生物に誘発された突然変異の遺伝子型決定を示す。（b）ミスマッチ感受性T7E1アッセイのRGEN仲介性RFLP分析との比較。黒い矢印は、T7E1酵素またはRGENの処理による切断生成物を示す。図２７は、ZFN誘発性突然変異のRGEN仲介性遺伝子型決定を示す。ZFN標的部位は囲みで示される。黒い矢印は、T7E1によって切断されるDNAバンドを示す。図２８は、ヒトHLA-B遺伝子の領域内の多型部位を示す。RGEN標的部位の周りを囲む配列は、HeLa細胞からのPCRアンプリコンのものである。多型の位置は囲みで示される。RGEN標的部位およびPAM配列は、それぞれ、破線の囲みおよび太線の囲みで示される。プライマー配列には下線が引かれている。図２９は、RGEN-RFLP分析を用いた、発がん突然変異の遺伝子型決定を示す。（a）HCT116細胞のヒトCTNNB1遺伝子における反復突然変異（TCTのc.133-135欠失）がRGENによって検出された。HeLa細胞は陰性対照として用いられた。（b）ミスマッチガイドRNAを含むRGENを用いた、A549癌細胞株のKRAS置換突然変異（c.34 G>A）の遺伝子型決定。ミスマッチヌクレオチドは囲みで示される。HeLa細胞は陰性対照として用いられた。矢印は、RGENによって切断されたDNAバンドを示す。サンガー配列決定法によって確認されたDNA配列を示す。図３０は、RGEN-RFLP 分析を用いた、HEK293T細胞のCCR5 delta32対立遺伝子の遺伝子型決定を示す。（a）細胞株のRGEN-RFLPアッセイ。K562、SKBR3、およびHeLa細胞は、野生型対照として用いられた。矢印は、RGENによって切断されたDNAバンドを示す。図３０は、RGEN-RFLP 分析を用いた、HEK293T細胞のCCR5 delta32対立遺伝子の遺伝子型決定を示す。（b）野生型およびdelta32 CCR5対立遺伝子のDNA配列。RFLP分析に用いられるRGENのオンターゲット部位およびオフターゲット部位の両方には、下線が引かれている。２つの部位の間の単一ヌクレオチドミスマッチは、囲みで示される。PAM配列には下線が引かれている。図３０は、RGEN-RFLP 分析を用いた、HEK293T細胞のCCR5 delta32対立遺伝子の遺伝子型決定を示す。（c）野生型特異的RGENを用いた、WTまたはdel32 CCR5対立遺伝子を含むプラスミドのin vitro切断。図３０は、RGEN-RFLP 分析を用いた、HEK293T細胞のCCR5 delta32対立遺伝子の遺伝子型決定を示す。（d）CCR5遺伝子座でのCCR5-delta32特異的RGENのオフターゲット部位の存在の確認。様々な量のdel32特異的RGENを用いた、オンターゲット配列またはオフターゲット配列を含むプラスミドのin vitro切断アッセイ。図３１は、KRAS点突然変異（c.34 G>A）の遺伝子型決定を示す。（a）癌細胞株のKRAS突然変異（c.34 G>A）のRGEN-RFLP分析。HeLa細胞（野生型対照として用いられる）またはA549細胞（点突然変異についてホモ接合性である）由来のPCR産物を、野生型配列または突然変異配列に特異的な完全に一致したcrRNAを用いたRGENによって消化した。これらの細胞におけるKRAS遺伝子型は、サンガー配列決定法によって確認された。図３１は、KRAS点突然変異（c.34 G>A）の遺伝子型決定を示す。（b）野生型または突然変異KRAS配列のいずれかを含むプラスミドを、完全に一致したcrRNAまたは弱められた一塩基ミスマッチcrRNAを用いたRGENによって消化した。遺伝子型決定のために選択された弱められたcrRNAは、ゲルの上部に囲みで表示される。図３２は、PIK3CA点突然変異（c.3140 A>G）の遺伝子型決定を示す。（a）癌細胞株のPIK3CA突然変異（c.3140 A>G）のRGEN-RFLP分析。HeLa細胞（野生型対照として用いられる）またはHCT116細胞（点突然変異についてヘテロ接合性である）由来のPCR産物を、野生型配列または突然変異配列に特異的な完全に一致したcrRNAを用いたRGENによって消化した。これらの細胞におけるPIK3CA遺伝子型は、サンガー配列決定法によって確認された。図３２は、PIK3CA点突然変異（c.3140 A>G）の遺伝子型決定を示す。（b）野生型または突然変異PIK3CA配列のいずれかを含むプラスミドを、完全に一致したcrRNAまたは弱められた一塩基ミスマッチcrRNAを用いたRGENによって消化した。遺伝子型決定のために選択された弱められたcrRNAは、ゲルの上部に囲みで表示される。図３３は、癌細胞株における反復点突然変異の遺伝子型決定を示す。（a）IDH遺伝子（c.394c>T）における反復発がん点突然変異のRGEN-RFLPアッセイ。サンガー配列決定法によって確認されたそれぞれの細胞株の遺伝子型が示される。ミスマッチヌクレオチドは囲みで示される。黒い矢印は、RGENによって切断されたDNAバンドを示す。図３３は、癌細胞株における反復点突然変異の遺伝子型決定を示す。（b）PIK3CA遺伝子（c.3140A>G）における反復発がん点突然変異のRGEN-RFLPアッセイ。サンガー配列決定法によって確認されたそれぞれの細胞株の遺伝子型が示される。ミスマッチヌクレオチドは囲みで示される。黒い矢印は、RGENによって切断されたDNAバンドを示す。図３３は、癌細胞株における反復点突然変異の遺伝子型決定を示す。（c）NRAS遺伝子（c.181C>A）における反復発がん点突然変異のRGEN-RFLPアッセイ。サンガー配列決定法によって確認されたそれぞれの細胞株の遺伝子型が示される。ミスマッチヌクレオチドは囲みで示される。黒い矢印は、RGENによって切断されたDNAバンドを示す。図３３は、癌細胞株における反復点突然変異の遺伝子型決定を示す。（d）BRAF遺伝子（c.1799T>A）における反復発がん点突然変異のRGEN-RFLPアッセイ。サンガー配列決定法によって確認されたそれぞれの細胞株の遺伝子型が示される。ミスマッチヌクレオチドは囲みで示される。黒い矢印は、RGENによって切断されたDNAバンドを示す。

本発明の１つの態様に従って、本発明は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する、真核細胞または真核生物中の標的DNAを切断するための組成物を提供する。加えて、本発明は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する、真核細胞または真核生物中の標的DNAを切断するための組成物の使用を提供する。
本発明では、組成物はまた、RNA誘導型エンドヌクレアーゼ（RGEN）組成物とも呼ばれる。

ZFNおよびTALENは、哺乳類細胞、モデル生物、植物、および家畜類において標的化突然変異生成を可能にするが、個々のヌクレアーゼによって得られる突然変異頻度は、それぞれ大きく異なる。更に、いくつかのZFNおよびTALENは、ゲノム編集活性を示すことができない。DNAのメチル化は、これらの人工ヌクレアーゼの標的部位への結合を制限しうる。加えて、カスタム化ヌクレアーゼを作製することは、技術的に困難であり、時間がかかる。
本発明者らは、Casタンパク質に基づく新たなRNA誘導型エンドヌクレアーゼ組成物を開発することによって、ZFNおよびTALENの欠点を克服した。

本発明より前に、Casタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性は知られていた。しかし、真核生物のゲノムの複雑さのため、Casタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性が真核細胞中で機能するかどうかは知られていなかった。更に、これまで、Casタンパク質またはCasタンパク質コード核酸および標的DNAに特異的なガイドRNAを含有する、真核細胞または真核生物中の標的DNAを切断するための組成物は、開発されていなかった。

ZFNおよびTALENと比較して、Casタンパク質に基づく本RGEN組成物は、合成ガイドRNA成分が置き換えられるだけで新たなゲノム編集ヌクレアーゼを作製できるため、より容易にカスタム化され得る。サブクローニングステップは、カスタム化RNA誘導型エンドヌクレアーゼの作製に含まれない。更に、一対のTALEN遺伝子（〜6 kbp）と比較して、比較的小さいサイズのCas遺伝子（例えば、Cas9では4.2 kbp）は、ウイルス媒介性遺伝子送達などのいくつかの適用において、このRNA誘導型エンドヌクレアーゼ組成物に利点をもたらす。更に、このRNA誘導型エンドヌクレアーゼは、オフターゲット作用を持たないため、望ましくない突然変異、欠失、逆位、および重複を引き起こさない。これらの特性は、本RNA誘導型エンドヌクレアーゼ組成物を、真核細胞および真核生物におけるゲノム工学のための拡張性のある、汎用的で便利なツールにする。加えて、RGENは、任意のDNA配列を標的とするように設計することができ、ほぼすべての一塩基多型または小さな挿入／欠失（indel）が、RGEN仲介性RFLPによって分析され得る。RGENの特異性は、最大20塩基対（bp）までの長さの標的DNA配列とハイブリダイズするRNA成分およびプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）を認識するCas9タンパク質によって決定される。RGENは、RNA成分を置き換えることによって容易に再プログラム化される。従って、RGENは、様々な配列変異に対して簡単で確実なRFLP分析を使用するための基盤をもたらす。

標的DNAは、内在性DNA、または人工DNA、好ましくは内在性DNAでありうる。
本明細書において用いられる場合、「Casタンパク質」という用語は、CRISPR/Casシステムにおいて必須のタンパク質成分を指し、CRISPR RNA（crRNA）およびトランス活性化crRNA（tracrRNA）と呼ばれる２つのRNAと複合体を形成した場合に、活性を有するエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼを形成する。
Casの遺伝子およびタンパク質に関する情報は、国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information, NCBI）のGenBankから、制限なく利用できる。

Casタンパク質をコードするCRISPR関連（cas）遺伝子はしばしば、CRISPRリピート-スペーサーアレイに関連付けられる。40を超える異なるCasタンパク質ファミリーが記載されている。これらのタンパク質ファミリーのうち、Cas1は、様々なCRISPR/Casシステムに共通して遍在していると思われる。3種類のCRISPR-Casシステムが存在する。それらのうち、Cas9タンパク質ならびにcrRNAおよびtracrRNAを含むタイプIICRISPR/Casシステムは、代表的であり、よく知られている。cas遺伝子とリピート構造の特定の組合せを用いて、８つのCRISPRサブタイプが定義されている（Ecoli、Ypest、Nmeni、Dvulg、Tneap、Hmari、Apern、およびMtube）。

Casタンパク質は、タンパク質形質導入ドメインに結合されうる。タンパク質形質導入ドメインは、ポリアルギニンまたはHIVに由来するTATタンパク質でありうるが、それに限定されない。
本組成物は、タンパク質の形態で、またはCasタンパク質をコードする核酸の形態で、Cas成分を含有しうる。
本発明では、Casタンパク質は、ガイドRNAと複合体を形成した際、それがエンドヌクレアーゼ活性またはニッカーゼ活性を有する限り、任意のCasタンパク質でありうる。
好ましくは、Casタンパク質は、Cas9タンパク質またはその変異型である。
Cas9タンパク質の変異型は、その中の触媒アスパラギン酸残基が他の任意のアミノ酸に変更されたCas9の突然変異型でありうる。好ましくは、他のアミノ酸はアラニンでありうるが、それに限定されない。

更に、Casタンパク質は、ストレプトコッカス属菌（Streptococcus sp.）、好ましくは化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogens）などの生物から単離されたもの、または組換えタンパク質でありうるが、それらに限定されない。
化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogens）に由来するCasタンパク質は、NGGトリヌクレオチドを認識しうる。Casタンパク質は、配列番号１０９のアミノ酸配列を含みうるが、それに限定されない。

「組換え」という用語は、例えば、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターに関して用いられる場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入によって、または天然の核酸もしくはタンパク質の変更によって改変されていること、あるいは細胞がそのように改変された細胞に由来することを示す。従って、例えば、組換えCasタンパク質は、ヒトコドン表を用いてCasタンパク質コード配列を再構成することによって生成されうる。

本発明において、Casタンパク質コード核酸は、CMVまたはCAGなどのプロモーターの制御下にCasコード配列を含むプラスミドなどのベクターの形態でありうる。Casタンパク質がCas9である場合、Cas9コード配列は、ストレプトコッカス属菌（Streptococcus sp.）に由来し、好ましくは化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogens）に由来しうる。例えば、Cas9コード核酸は、配列番号１のヌクレオチド配列を含みうる。更に、Cas9コード核酸は、配列番号１の配列に少なくとも50％、好ましくは配列番号１に少なくとも60、70、80、90、95、97、98、または99％の相同性を有するヌクレオチド配列を含みうるが、それに限定されない。Cas9コード核酸は、配列番号１０８、１１０、１０６、または１０７のヌクレオチド配列を含みうる。

本明細書において用いられる場合、「ガイドRNA」という用語は、標的DNAに特異的であり、Casタンパク質と複合体を形成して、Casタンパク質を標的DNAに持ってくることができるRNAを指す。
本発明では、ガイドRNAは、２つのRNA、すなわち、CRISPR RNA（crRNA）およびトランス活性化crRNA（tracrRNA）で構成され、またはcrRNAおよびtracrRNAの必須部分の融合によって作製される一本鎖RNA（sgRNA）でありうる。
ガイドRNAは、crRNAおよびtracrRNAを含むデュアルRNAでありうる。
ガイドRNAがcrRNAおよびtracrRNAの必須部分ならびに標的と相補的な部分を含むならば、任意のガイドRNAが本発明において使用されうる。

crRNAは、標的DNAにハイブリダイズしうる。
RGENは、Casタンパク質およびデュアルRNA（不変のtracrRNAおよび標的特異的crRNA）、またはCasタンパク質およびsgRNA（不変のtracrRNAおよび標的特異的crRNAの必須部分の融合）で構成され、crRNAの置き換えによって容易に再プログラム化されうる。
ガイドRNAは、更に、一本鎖ガイドRNAまたはデュアルRNAのcrRNAの5'末端に1つ以上の付加的なヌクレオチドを含む。
好ましくは、ガイドRNAは、更に、一本鎖ガイドRNAまたはデュアルRNAのcrRNAの5'末端に２つの付加的なグアニンヌクレオチドを含む。

ガイドRNAは、RNAまたはガイドRNAをコードするDNAの形態で、細胞または生物に移入されうる。ガイドRNAは、単離されたRNA、ウイルスベクター内に組み込まれたRNAの形であってもよく、またはベクターにコードされる。好ましくは、ベクターは、ウイルスベクター、プラスミドベクター、またはアグロバクテリウムベクターでありうるが、それらに限定されない。
ガイドRNAをコードするDNAは、ガイドRNAをコードする配列を含むベクターでありうる。例えば、ガイドRNAは、単離されたガイドRNA、もしくはガイドRNAおよびプロモーターをコードする配列を含むプラスミドDNAを細胞または生物にトランスフェクトすることによって、細胞または生物に移入されうる。
あるいは、ガイドRNAは、ウイルス媒介性遺伝子送達を用いて、細胞または生物に移入されうる。

ガイドRNAが単離RNAの形態で細胞または生物にトランスフェクトされる場合、ガイドRNAは、当技術分野において既知の任意のin vitro転写系を用いたin vitroでの転写によって調製されうる。ガイドRNAは、好ましくは、ガイドRNAのコード配列を含むプラスミドの形態よりもむしろ、単離RNAの形態で細胞に移入される。本明細書において用いられる場合、「単離RNA」という用語は、「裸のRNA」と置き換え可能でありうる。これは、クローニングのステップを必要としないため、コストと時間の節約になる。しかし、ガイドRNAのトランスフェクションのためのプラスミドDNAの使用またはウイルス媒介性遺伝子送達は、排除されない。

Casタンパク質またはCasタンパク質コード核酸およびガイドRNAを含有する本RGEN組成物は、標的に対するガイドRNAの特異性およびCasタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性またはニッカーゼ活性のため、標的DNAを特異的に切断し得る。
本明細書において用いられる場合、「切断」という用語は、ヌクレオチド分子の共有結合骨格の切断を指す。
本発明では、ガイドRNAは、切断されるべき任意の標的に特異的であるように調製されうる。従って、本RGEN組成物は、ガイドRNAの標的特異的部分を操作または遺伝子型決定することによって、任意の標的DNAを切断し得る。

ガイドRNAおよびCasタンパク質は、ペアとして機能しうる。本明細書において用いられる場合、「ペアードCasニッカーゼ」という用語は、ペアとして機能するガイドRNAおよびCasタンパク質を指しうる。ペアは２つのガイドRNAを含む。ガイドRNAおよびCasタンパク質はペアとして機能し、異なるDNA鎖上に２つのニックを生じさせる。２つのニックは、少なくとも100bp離れていてもよいが、それに限定されない。
実施例において、本発明者らは、ペアードCasニッカーゼがヒト細胞において標的化突然変異生成および最大1-kbpまでの染色体セグメントの大きな欠失を可能にすることを確認した。重要なことに、ペアードニッカーゼは、それらの対応するヌクレアーゼが突然変異を誘発するオフターゲット部位でindelを引き起こさなかった。更に、ヌクレアーゼとは異なり、ペアードニッカーゼは、オフターゲットDNA切断に関連した望ましくない転座を促進しなかった。原理上、ペアードニッカーゼは、Cas9仲介性突然変異生成の特異性を２倍にし、遺伝子治療および細胞療法など、正確なゲノム編集を必要とする用途において、RNA誘導型酵素の有用性を拡大する。

本発明では、組成物は、in vitroでの真核細胞または真核生物のゲノムの遺伝子型決定に使用されうる。
１つの特定の実施形態では、ガイドRNAは、配列番号１のヌクレオチド配列を含みうるが、そのヌクレオチド位置3〜22の部分は標的特異的部分であり、従ってこの部分の配列は標的に応じて変化しうる。
本明細書において用いられる場合、真核細胞または真核生物は、当技術分野において一般的に用いられる、酵母、真菌類、原生生物、植物、高等植物、ならびに昆虫、または両生類細胞、またはCHO、HeLa、HEK293、およびCOS-1などの哺乳類細胞、例えば、培養細胞（in vitro）、移植細胞および初代培養細胞（in vitroおよびex vivo）、およびin vivo細胞、ならびにヒトなどの哺乳類細胞でもありうるが、それらに限定されない。

１つの特定の実施形態では、Cas9タンパク質／一本鎖ガイドRNAは、in vitroおよび哺乳類細胞内で部位特異的DNA二本鎖切断を生じることができ、その自発的修復が、高頻度で標的化ゲノム突然変異を誘発することが見出された。
更に、Cas9タンパク質／ガイドRNA複合体またはCas9 mRNA／ガイドRNAの１細胞期胚への注入によって、遺伝子ノックアウトマウスが誘導され得ること、および生殖細胞系列に伝達可能な突然変異がCas9／ガイドRNAシステムによって生じ得ることが見出された。
Casタンパク質をコードする核酸よりもむしろCasタンパク質を用いて、標的化突然変異生成を誘発することは、外来性DNAが生物内に導入されないため、有利である。従って、Casタンパク質およびガイドRNAを含有する組成物は、治療薬または付加価値のある農作物、家畜、家禽、魚、ペットなどの開発に使用されうる。

本発明の他の態様において、本発明は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する、真核細胞または真核生物において標的化突然変異生成を誘発するための組成物を提供する。加えて、本発明は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する、真核細胞または真核生物において標的化突然変異生成を誘発するための組成物の使用を提供する。
ガイドRNA、Casタンパク質コード核酸またはCasタンパク質は、上記に記載された通りである。

本発明の他の態様において、本発明は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する、真核細胞または真核生物において標的DNAを切断するためのキット、あるいは真核細胞または真核生物において標的化突然変異生成を誘発するためのキットを提供する。
ガイドRNA、Casタンパク質コード核酸またはCasタンパク質は、上記に記載された通りである。
キットは、ガイドRNAおよびCasタンパク質コード核酸またはCasタンパク質を、個別の成分としてもしくは１つの組成物として含みうる。
本キットは、ガイドRNAおよびCas成分を細胞または生物に移入させるために必要な、いくつかの更なる成分を含みうる。例えば、キットは、DEPC処理注入バッファーのような注入バッファー、および標的DNAの突然変異の分析に必要な物質を含みうるが、それらに限定されない。

他の態様において、本発明は、真核細胞または真核生物にCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質、およびガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNAを同時トランスフェクトまたは連続トランスフェクトするステップを含む、Casタンパク質ならびにガイドRNAを有する真核細胞あるいは真核生物を作製する方法を提供する。
ガイドRNA、Casタンパク質コード核酸またはCasタンパク質は、上記に記載された通りである。

本発明では、Casタンパク質コード核酸またはCasタンパク質、およびガイドRNAまたはガイドRNAをコードするDNAは、当技術分野において公知の様々な方法、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、DEAE-デキストラン処理、リポフェクション、ナノ粒子媒介性トランスフェクション、タンパク質形質導入ドメイン媒介性形質導入、ウイルス媒介性遺伝子送達、およびプロトプラストへのPEG媒介性トランスフェクションなどによって、細胞内に移入されうるが、これらに限定されない。また、Casタンパク質コード核酸またはCasタンパク質およびガイドRNAは、注入などの遺伝子もしくはタンパク質を投与するための、当技術分野において公知の様々な方法によって、生物内に移入されうる。Casタンパク質コード核酸またはCasタンパク質は、ガイドRNAとの複合体の形態で、もしくは別々に、細胞内に移入されうる。Tatなどのタンパク質形質導入ドメインと融合されたCasタンパク質もまた、細胞内に効率的に送達され得る。
好ましくは、真核細胞または真核生物は、Cas9タンパク質およびガイドRNAを同時トランスフェクトまたは連続トランスフェクトされる。
連続トランスフェクションは、最初にCasタンパク質コード核酸によるトランスフェクション、続いて裸のガイドRNAによる第二のトランスフェクションによって行われうる。好ましくは、第二のトランスフェクションは、3、6、12、18、24時間後であるが、それらに限定されない。

他の態様において、本発明は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する真核細胞または真核生物を提供する。
真核細胞または真核生物は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する組成物を細胞もしくは生物内に移入することによって作製されうる。
真核細胞は、当技術分野において一般的に用いられる、酵母、真菌類、原生生物、高等植物、ならびに昆虫、または両生類細胞、またはCHO、HeLa、HEK293、およびCOS-1などの哺乳類細胞、例えば、培養細胞（in vitro）、移植細胞および初代培養細胞（in vitroおよびex vivo）、およびin vivo細胞、ならびにヒトなどの哺乳類細胞でもありうるが、それらに限定されない。更に、生物は、酵母、真菌類、原生生物、植物、高等植物、昆虫、両生類、または哺乳類でありうる。

本発明の他の態様において、本発明は、真核細胞または真核生物において標的DNAを切断する方法あるいは標的化突然変異生成を誘発する方法を提供し、それは、標的DNAを有する細胞または生物を、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する組成物で処理するステップを含む。
細胞または生物を組成物で処理するステップは、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する本組成物を、細胞または生物内に移入することによって行われうる。
上記に記載されたように、このような移入は、マイクロインジェクション、トランスフェクション、エレクトロポレーションなどによって行われうる。

本発明の他の態様において、本発明は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する本RGEN組成物によって編集されたゲノムを有する胚を提供する。
任意の胚が本発明において使用でき、本発明のために、胚はマウスの胚でありうる。胚は、PMSG（妊馬血清性ゴナドトロピン）およびhCG（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）を4〜7週のメスのマウスに注射することによって産生され、過剰排卵したメスのマウスをオスと交配し、受精した胚を卵管から採取しうる。
胚に導入される本RGEN組成物は、Casタンパク質の作用によってガイドRNAと相補的な標的DNAを切断し、標的DNAに突然変異を引き起こすことができる。従って、本RGEN組成物が導入された胚は、編集されたゲノムを有する。

１つの特定の実施形態では、本RGEN組成物はマウスの胚において突然変異を引き起こすことができ、この突然変異は子孫に伝達され得ることが見出された。
RGEN組成物を胚に導入する方法は、マイクロインジェクション、幹細胞挿入（stem cell insertion）、レトロウイルス挿入（retrovirus insertion）などの、当技術分野において公知の任意の方法でありうる。好ましくは、マイクロインジェクション法が使用され得る。

他の態様において、本発明は、本RGEN組成物によって編集されたゲノムを有する胚を、動物の卵管に移入することによって得られるゲノム改変動物を提供する。
本発明において、「ゲノム改変動物」という用語は、そのゲノムが、胚の段階で本RGEN組成物によって改変された動物を指し、その動物の種類は限定されない。
ゲノム改変動物は、本RGEN組成物に基づく標的化突然変異生成によって生じる突然変異を有する。突然変異は、欠失、挿入、転座、逆位のうちの任意の１つでありうる。突然変異の部位は、RGEN組成物のガイドRNAの配列によって決まる。
遺伝子の突然変異を有するゲノム改変動物は、その遺伝子の機能を決定するために使用されうる。

本発明の他の態様において、本発明は、標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNAおよびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する本RGEN組成物を、動物の胚に導入するステップ；ならびにその胚を偽妊娠した代理母の卵管に移入して、ゲノム改変動物を生じさせるステップを含む、ゲノム改変動物を作製する方法を提供する。
本RGEN組成物を導入するステップは、マイクロインジェクション、幹細胞挿入、レトロウイルス挿入などの、当技術分野において既知の任意の方法によって達成されうる。

本発明の他の態様において、本発明は、RGEN組成物を含む真核細胞のための方法によって調製されたゲノム改変プロトプラストから再生された植物を提供する。
本発明の他の態様において、本発明は、標的DNA配列に特異的なガイドRNAおよびCasタンパク質を含有する、単離された生体サンプル中の突然変異または多型を遺伝子型決定するための組成物を提供する。加えて、本発明は、標的DNA配列に特異的なガイドRNAおよびCasタンパク質を含有する、単離された生体サンプル中の病原微生物の核酸配列を遺伝子型決定するための組成物を提供する。
ガイドRNA、Casタンパク質コード核酸またはCasタンパク質は、上記に記載された通りである。

本明細書において用いられる場合、「遺伝子型決定」という用語は、「制限酵素断片長多型（RFLP）アッセイ」を指す。
RFLPは、1）人工ヌクレアーゼによって誘発された細胞もしくは生物におけるindelの検出、2）細胞もしくは生物における自然発生突然変異もしくは多型の遺伝子型決定、または3）ウイルスもしくは細菌などを含む感染した病原微生物のDNAの遺伝子型決定、に使用されうる。
突然変異または多型は、人工ヌクレアーゼによって細胞内に誘発されうる。
人工ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、またはRGENでありうるが、それらに限定されない。
本明細書において用いられる場合、「生体サンプル」という用語は、組織、細胞、全血、血清（semm）、血漿、唾液、痰、脳脊髄液（cerbrospinal fluid）または尿などの分析用サンプルを含むが、それらに限定されない。

突然変異または多型は、自然発生突然変異または多型でありうる。
突然変異または多型は、病原微生物によって誘発される。すなわち、病原微生物が検出され、生体サンプルが感染したと確認される場合、突然変異または多型は、病原微生物の感染によって生じる。
病原微生物は、ウイルスまたは細菌でありうるが、それに限定されない。

人工ヌクレアーゼ誘発性突然変異は、様々な方法によって検出され、それらは、ミスマッチ感受性のSurveyorまたはT7 エンドヌクレアーゼI（T7E1）アッセイ、RFLP分析、蛍光PCR、DNA融解分析、ならびにサンガー配列決定法およびディープシークエンシング（deep sequencing）を含む。T7E1およびSurveyorアッセイは広く用いられているが、これらのアッセイは（突然変異体配列と野生型配列または２つの異なる突然変異体配列のハイブリダイゼーションによって形成される）ヘテロ二本鎖を検出し；それらは、２つの同一の突然変異体配列のハイブリダイゼーションによって形成されるホモ二本鎖を検出できないため、しばしば突然変異頻度を過小評価する。従って、これらのアッセイは、ホモ接合性の二対立遺伝子の突然変異体クローンと野生型細胞とを区別できず、またヘテロ接合性の二対立遺伝子の突然変異体とヘテロ接合性の単一対立遺伝子の突然変異体とを区別することができない（図２２）。加えて、ヌクレアーゼ標的部位の近くの配列多型は、酵素がこれらの異なる野生型対立遺伝子のハイブリダイゼーションによって形成されるヘテロ二本鎖を切断できるため、交絡した結果を生じ得る。RFLP分析はこれらの制約がないため、好まれる方法である。実際、RFLP分析は、人工ヌクレアーゼ仲介性突然変異を検出するために用いられた最初の方法の１つであった。しかし残念なことに、それは適切な制限酵素認識部位の利用可能性によって制限される。

本発明の他の態様において、本発明は、単離された生体サンプル中の突然変異または多型を遺伝子型決定するための組成物を含む、単離された生体サンプル中の突然変異または多型を遺伝子型決定するためのキットを提供する。加えて、本発明は、標的DNA配列に特異的なガイドRNAおよびCasタンパク質を含む、単離された生体サンプル中の病原微生物の核酸配列を遺伝子型決定するためのキットを提供する。
ガイドRNA、Casタンパク質コード核酸またはCasタンパク質は、上記に記載された通りである。

本発明の他の態様において、本発明は、単離された生体サンプル中の突然変異または多型を遺伝子型決定するための組成物を用いた、単離された生体サンプル中の突然変異または多型を遺伝子型決定する方法を提供する。加えて、本発明は、標的DNA配列に特異的なガイドRNAおよびCasタンパク質を含む、単離された生体サンプル中の病原微生物の核酸配列を遺伝子型決定する方法を提供する。
ガイドRNA、Casタンパク質コード核酸またはCasタンパク質は、上記に記載された通りである。

（実施例）
下記において、本発明は、実施例を参照して更に詳細に記載される。しかし、これらの実施例は例示のみを目的とし、本発明は、これらの実施例によって限定されることを意図しない。

ゲノム編集アッセイ
1-1. Cas9タンパク質のDNA切断活性
初めに、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogens）に由来するCas9のDNA切断活性をin vitroでのキメラガイドRNA の存在下または非存在下で試験した。
この目的のために、E. coliで発現され、精製された組換えCas9タンパク質を用いて、23塩基対（bp）のヒトCCR5標的配列を含む前消化されたプラスミドDNAまたは環状プラスミドDNAを切断した。Cas9標的配列は、crRNAまたはキメラガイドRNAと相補的な20-bpのDNA配列およびCas9自身によって認識されるトリヌクレオチド（5’-NGG-3’）プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）で構成される（図１ａ）。

具体的には、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogens）株M1 GAS（NC_002737.1）に由来するCas9コード配列（4,104 bp）を、ヒトコドン使用表を用いて再構成し、オリゴヌクレオチドを用いて合成した。初めに、重複する〜35-merオリゴヌクレオチドおよびPhusionポリメラーゼ（New England Biolabs）を用いて1-kb DNAセグメントを組み立て、T-ベクター（SolGent）にクローニングした。４つの1-kbp DNAセグメントを用いて、オーバーラップPCRによって、完全長Cas9配列を組み立てた。Cas9コードDNAセグメントを、pcDNA3.1（Invitrogen）に由来するp3sにサブクローニングした。このベクターにおいて、HAエピトープおよび核局在化シグナル（NLS）を含むペプチドタグ（NH2-GGSGPPKKKRKVYPYDVPDYA-COOH、配列番号２）を、Cas9のC末端に付加した。Cas9タンパク質のHEK 293T細胞における発現および核局在化を、抗HA抗体（Santa Cruz）を用いたウェスタンブロッティングによって確認した。

その後、Cas9カセットをpET28-b(+)にサブクローニングして、BL21(DE3)に形質転換した。0.5 mM IPTGを用いて25℃で4時間、Cas9の発現を誘導した。C末端にHis6-タグを有するCas9タンパク質を、Ni-NTAアガロース樹脂（Qiagen）を用いて精製し、20 mM HEPES（pH 7.5）、150 mM KCl、1 mM DTT、および10％グリセロールに対して透析した（1）。精製したCas9（50 nM）を、スーパーコイルプラスミドDNAまたは前消化プラスミドDNA（300 ng）およびキメラRNA（50 nM）とともに、20μlの反応容量のNEBバッファー3中で、37℃で1時間インキュベートした。消化されたDNAを、0.8％アガロースゲルを用いた電気泳動によって分析した。
Cas9は、合成RNAの存在下でのみ、予想された位置で効率的にプラスミドDNAを切断し、標的配列のない対照プラスミドを切断しなかった（図１ｂ）。

1-2. ヒト細胞でのCas9／ガイドRNA複合体によるDNA切断
RFP-GFPレポーターを用いて、Cas9／ガイドRNA複合体が哺乳類細胞においてRFPとGFP配列の間に組み込まれた標的配列を切断できるかどうかを調べた。
このレポーターでは、GFP配列は、フレームシフトしてRFP配列と融合している（2）。活性を有するGFPは、標的配列が部位特異的ヌクレアーゼによって切断され、エラーを起こしやすい二本鎖切断（DSB）の非相同末端結合（NHEJ）修復によって、標的配列付近にフレームシフトを起こす小さな挿入または欠失（indel）を生じた場合のみに発現する（図２）。

この研究に使用されるRFP-GFPレポータープラスミドは、以前に記載されたように構築された（2）。標的部位に対応するオリゴヌクレオチド（表１）を合成し（Macrogen）、アニールした。アニールしたオリゴヌクレオチドを、EcoRIおよびBamHIで消化したレポーターベクターにライゲーションした。
HEK 293T細胞に、Lipofectamine 2000（Invitrogen）を用い、24ウェルプレート中で、Cas9コードプラスミド（0.8μg）およびRFP-GFPレポータープラスミド（0.2μg）を同時トランスフェクトした。

一方、in vitro転写されたキメラRNAは、下記のように調製した。MEGAshortscript T7キット（Ambion）を用い、メーカーの説明書に従ったラン・オフ反応によって、RNAをin vitro転写した。RNAのin vitro転写のための鋳型は、２つの相補的な一本鎖DNAのアニーリングによって、またはPCR増幅によって生成された（表１）。転写されたRNAを8％変性尿素-PAGEゲル上で分離した。RNAを含むゲル切片を切り出し、プローブ溶出バッファーに移した。RNAをヌクレアーゼを含まない水に回収し、続いてフェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出、およびエタノール沈澱を行った。精製したRNAを分光分析によって定量した。

トランスフェクションの12時間後、in vitro転写によって調製されたキメラRNA（1μg）を、Lipofectamine 2000を用いてトランスフェクトした。
トランスフェクションの3日後、トランスフェクトされた細胞をフローサイトメトリーに供し、RFPとGFPとの両方を発現している細胞を計測した。
GFP発現細胞は、細胞が最初にCas9プラスミドによってトランスフェクトされ、その12時間後にガイドRNAによってトランスフェクトされた場合にのみ得られることが見出され（図２）、RGENが培養ヒト細胞中の標的DNA配列を認識して切断できることが実証された。このように、GFP発現細胞は、同時トランスフェクションよりもむしろCas9プラスミドおよびガイドRNAの連続トランスフェクションによって得られた。

1-3. 哺乳類細胞の内在性遺伝子のRGENによる標的破壊
RGENが哺乳類細胞の内在性遺伝子の標的破壊に使用され得るかどうかを試験するために、野生型と突然変異体DNA配列のハイブリダイゼーションによって形成されるヘテロ二本鎖を特異的に認識して切断するミスマッチ感受性エンドヌクレアーゼであるT7エンドヌクレアーゼI（T7E1）を用いて、トランスフェクトされた細胞から単離したゲノムDNAを分析した（3）。
RGENを用いて哺乳類細胞にDSBを導入するために、4D-Nucleofector, SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit, Program FF-120（Lonza）を用い、メーカーのプロトコールに従って、2×10⁶ K562細胞に20μgのCas9コードプラスミドをトランスフェクトした。この実験のために、K562（ATCC, CCL-243）細胞を、10％FBSならびにペニシリン／ストレプトマイシン混合物（それぞれ、100 U/mlおよび100μg/ml）を含むRPMI-1640中で増殖させた。

24時間後、10〜40μgのin vitro転写されたキメラRNAを、1×10⁶ K562細胞にヌクレオフェクト（nucleofected）した。in vitro転写されたキメラRNAは、実施例1-2に記載されたように調製された。
RNAトランスフェクションの2日後に細胞を回収し、ゲノムDNAを単離した。標的部位を含む領域を、表１に記載されるプライマーを用いてPCR増幅した。アンプリコンを、以前に記載されたようなT7E1アッセイに供した（3）。配列解析のために、ゲノム改変に相当するPCR産物を精製し、T-Blunt PCR Cloning Kit （SolGent）を用いてT-Bluntベクターにクローニングした。M13プライマーを用いて、クローニングされた産物を配列決定した。

突然変異は、細胞がCas9コードプラスミド、その後ガイドRNAによって連続的にトランスフェクトされた場合にのみ誘発されることが見出された（図３）。相対的なDNAバンド強度から推定される突然変異頻度（図３ａのIndels（％））は、RNA用量依存的であり、1.3％〜5.1％であった。PCRアンプリコンのDNA配列解析は、内在性部位でのRGEN仲介性突然変異の誘発を裏付けた。エラーを起こしやすいNHEJの特徴であるIndelおよびマイクロホモロジーが、標的部位で観察された。直接配列決定によって測定された突然変異頻度は、7.3％（＝7突然変異体クローン/96クローン）であり、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）によって得られるものと同程度であった。
細胞に突然変異を誘発するためには、Cas9プラスミドおよびガイドRNAの連続トランスフェクションが必要であった。しかし、ガイドRNAをコードするプラスミドの場合、連続トランスフェクションは不要であり、細胞はCas9プラスミドおよびガイドRNAコードプラスミドによって同時トランスフェクトされた。

その一方で、ZFNとTALENとの両方は、HIV感染の必須の共受容体であるGタンパク質共役ケモカイン受容体をコードする、ヒトCCR5遺伝子を破壊するための開発に成功している（3〜6）。CCR5特異的ZFNは、現在米国でAIDS治療のための臨床試験中である（7）。しかし、これらのZFNおよびTALENは、オフターゲット作用を有し、それは、その配列がオンターゲット配列と相同である部位での局所的突然変異（6、8〜10）、ならびにオンターゲット部位およびオフターゲット部位に引き起こされた２つの同時に起こるDSBの修復から生じるゲノム再配列（11〜12）の両方を含む。これらのCCR5特異的人工ヌクレアーゼと関連する最も顕著なオフターゲット部位は、CCR5の近縁ホモログであり、CCR5の15-kbp 上流に位置する、CCR2遺伝子座に存在する。CCR2遺伝子におけるオフターゲット突然変異、ならびにCCR5オンターゲット部位とCCR2オフターゲット部位との間の15-kbp染色体セグメントの望ましくない欠失、逆位、および重複を避けるため、本発明者らは、CCR2配列と明白な相同性を持たないCCR5配列内の領域を認識するように、我々のCCR5特異的RGENの標的部位を意図的に選択した。

本発明者らは、CCR5特異的RGENがオフターゲット作用を有するかどうかを調べた。この目的のために、我々は、対象とする23-bpの標的配列とほぼ相同な部位を同定することによって、ヒトゲノム内の潜在的なオフターゲット部位を検索した。予想された通り、このような部位はCCR2遺伝子中には見出されなかった。代わりに、それぞれがオンターゲット部位と3塩基のミスマッチを有する４つの部位が見出された（図４ａ）。T7E1アッセイは、これらの部位で突然変異が検出されなかったことを示し（アッセイ感度、〜0.5％）、RGENの優れた特異性を実証した（図４ｂ）。更に、PCRを用いて、CCR5に特異的なZFNおよびRGENをコードするプラスミドで別々にトランスフェクトされた細胞での染色体欠失の誘発を検出した。ZFNは欠失を誘発したが、RGENは誘発しなかった（図４ｃ）。

次に、CCR5特異的ガイドRNAを、転写因子C4b結合タンパク質のβ鎖をコードするヒトC4BPB遺伝子を標的とするように設計された新たな合成RNAに置き換えることによって、RGENを再プログラム化した。このRGENは、K562細胞の染色体標的部位に高頻度で突然変異を誘発した（図３ｂ）。T7E1アッセイおよび直接配列決定によって測定された突然変異頻度は、それぞれ14％および8.3％（＝4突然変異体クローン/48クローン）であった。４つの突然変異体配列のうち、２つのクローンは、正確に切断部位に1塩基または2塩基の挿入を含んでおり、CCR5標的部位でも観察されたパターンであった。これらの結果は、RGENが細胞内の予想される位置で染色体の標的DNAを切断することを示す。

タンパク質性のRGENによって仲介されるゲノム編集
RGENは、多くの異なる形態で細胞内に送達され得る。RGENは、Cas9タンパク質、crRNA、およびtracrRNAで構成される。２つのRNAは、一本鎖ガイドRNA（sgRNA）を形成するように融合され得る。CMVまたはCAGなどのプロモーターの制御下でCas9をコードするプラスミドは、細胞内にトランスフェクトされ得る。crRNA、tracrRNA、またはsgRNAはまた、これらのRNAをコードするプラスミドを用いて細胞内で発現され得る。しかし、プラスミドの使用は、しばしば、プラスミド全体または一部の宿主ゲノムへの組込みを引き起こす。プラスミドDNAに組み込まれた細菌の配列は、in vivoでの望ましくない免疫反応を引き起こし得る。細胞療法のためにプラスミドをトランスフェクトされた細胞またはDNAトランスフェクト細胞に由来する動物および植物は、ほとんどの先進国において販売承認の前に、コストがかかり長期にわたる規制手続を通過しなくてはならない。更に、プラスミドDNAは、トランスフェクション後数日間細胞内に残存し、RGENのオフターゲット作用を悪化させ得る。

ここで、我々は、in vitro転写されたガイドRNAと複合体を形成した組換えCas9タンパク質を用いて、ヒト細胞の内在性遺伝子の標的破壊を誘発した。ヘキサヒスチジンタグと融合された組換えCas9タンパク質を、E. coli内で発現させ、標準的なNiイオンアフィニティークロマトグラフィーおよびゲルろ過を用いて精製した。精製された組換えCas9タンパク質を、保存バッファー（20 mM HEPES pH 7.5、150 mM KCl、1 mM DTT、および10％グリセロール）中で濃縮した。Cas9タンパク質/sgRNA複合体を、ヌクレオフェクション（nucleofection）によってK562細胞に直接導入した。すなわち、4D-Nucleofector, SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit, Program FF-120（Lonza）を用い、メーカーのプロトコールに従って、100μlの溶液中の、100μg（29μM）のin vitro転写されたsgRNA（またはcrRNA 40μgおよびtracrRNA 80μg）と混合された22.5〜225（1.4〜14μM）のCas9タンパク質を1×10⁶ K562細胞にトランスフェクトした。ヌクレオフェクション後、細胞を6ウェルプレート中の増殖培地に入れ、48時間インキュベートした。2×10⁵ K562細胞を1/5にスケールダウンした方法でトランスフェクトした場合は、6〜60μgのin vitro転写されたsgRNA（またはcrRNA 8μgおよびtracrRNA 16μg）と混合された4.5〜45μgのCas9タンパク質を用いて、20μlの溶液中でヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクトされた細胞を、その後、48ウェルプレート中の増殖培地に入れた。48時間後、細胞を回収し、ゲノムDNAを単離した。標的部位にわたるゲノムDNA領域をPCR増幅し、T7E1アッセイに供した。

図１０に示すように、Cas9タンパク質/sgRNA複合体は、sgRNAまたはCas9タンパク質の用量依存的に4.8〜38％の頻度でCCR5遺伝子座に標的化突然変異を誘発し、これはCas9プラスミドのトランスフェクションによって得られる頻度（45％）と同程度であった。Cas9タンパク質/crRNA/tracrRNA複合体は、9.4％の頻度で突然変異を誘発することができた。Cas9タンパク質単独では、突然変異を誘発できなかった。2×10⁵細胞を1/5にスケールダウンした用量のCas9タンパク質およびsgRNAでトランスフェクトした場合、CCR5遺伝子座での突然変異頻度は、用量依存的に2.7〜57％に及び、Cas9プラスミドおよびsgRNAプラスミドの同時トランスフェクションによって得られた頻度（32％）より高かった。

我々はまた、ABCC11遺伝子を標的とするCas9タンパク質/sgRNA複合体をも試験し、この複合体が35％の頻度でindelを誘発することを見出し、この方法の汎用性を実証した。

マウスにおけるRNA誘導型ゲノム編集
前核（PN）期のマウス胚におけるRGENの遺伝子ターゲティング能力を検討するために、胸腺の発達およびケラチノサイトの分化に重要である（Nehlsら、1996）フォークヘッドボックスN1（Foxn1）遺伝子、ならびにDNA DSB修復および組み換えに重要な酵素をコードする（Taccioliら、1998）プロテインキナーゼ、DNA活性化、触媒ポリペプチド（protein kinase, DNA activated, catalytic polypeptide）（Prkdc）遺伝子を用いた。
Foxn1-RGENのゲノム編集活性を評価するために、我々は、PN期のマウス胚の細胞質内に様々な用量のsgRNAとともにCas9 mRNA（10-ng/μl溶液）を注入し（図５ａ）、in vitro培養した胚から得られたゲノムDNAを用いてT7エンドヌクレアーゼI（T7E1）アッセイ（Kimら2009）を行った（図６ａ）。

別法として、我々は、2倍モル過剰のFoxn1特異的sgRNA（0.14〜14 ng/μl）と複合体を形成した組換えCas9タンパク質（0.3〜30 ng/μl）の形で1細胞マウス胚の細胞質または前核にRGENを直接注入し、in vitro培養した胚を用いてFoxn1遺伝子の突然変異を分析した（図７）。
具体的には、Cas9 mRNAおよびsgRNAを、それぞれmMESSAGE mMACHINE T7 Ultra kit（Ambion）およびMEGAshortscript T7 kit（Ambion）を用い、メーカーの説明書に従って、線状DNA鋳型からin vitroで合成し、適切な量のジエチルピロカルボナート（DEPC, Sigma）処理注入バッファー（0.25 mM EDTA、10 mM Tris、pH 7.4）で希釈した。sgRNA合成のための鋳型は、表３に記載されるオリゴヌクレオチドを用いて生成された。組換えCas9タンパク質は、ToolGen, Inc.から入手した。

すべての動物実験は、韓国食品医薬品安全庁（KFDA）ガイドラインに従って行われた。プロトコールは、Yonsei Universityの実験動物研究施設の動物実験委員会（IACUC）によって検討され、承認された（許可番号：2013-0099）。すべてのマウスは、Yonsei実験動物研究施設の特定病原体不在の施設において維持された。FVB/NTac（Taconic）およびICRマウス系統を、それぞれ、胚ドナーおよび代理母として使用した。48時間間隔での5 IUの妊馬血清性ゴナドトロピン（PMSG, Sigma）および5 IUのヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG, Sigma）の腹腔内注射によって、メスのFVB/NTacマウス（7〜8週齢）を、過剰排卵させた。過剰排卵させたメスのマウスをFVB/NTacの種オスと交配し、受精した胚を卵管から回収した。
Piezo駆動型マイクロマニピュレーター（Piezo-driven micromanipulator（Prime Tech））を用いて、M2培地（Sigma）中のCas9 mRNAおよびsgRNAを、よく認識される前核を有する受精卵の細胞質内に注入した。

組換えCas9タンパク質の注入の場合には、組換えCas9タンパク質：Foxn1-sgRNA複合体をDEPC処理注入バッファー（0.25 mM EDTA、10 mM Tris、pH 7.4）で希釈し、TransferMan NK2マイクロマニピュレーターおよびFemtoJet マイクロインジェクター（Eppendorf）を用いて、雄性前核内に注入した。
操作した胚を、偽妊娠した代理母の卵管に移入して、生きた動物を作製し、または更なる分析のためにin vitroで培養した。

RGEN誘発性突然変異を有するF0マウスおよびin vitro培養マウス胚をスクリーニングするために、以前に記載されたように尾生検および全胚の溶解物由来のゲノムDNAサンプルを用いてT7E1アッセイを行った（Choら、2013）。
簡潔には、RGEN標的部位を含むゲノム領域をPCR増幅し、融解し、再アニーリングすることによって、ヘテロ二本鎖DNAを形成し、それをT7エンドヌクレアーゼ1（New England Biolabs）で処理し、その後、アガロースゲル電気泳動によって分析した。bowtie 0.12.9を用いた検索によって潜在的なオフターゲット部位が同定され、それもまたT7E1アッセイによって同様に検査された。これらのアッセイに用いたプライマー対を表４および５に記載した。

T7E1アッセイによって同定された突然変異体ファウンダーを更にfPCRによって分析した。ゲノムDNAの適切な領域を、以前に記載されたように配列決定した（Sung ら、2013）。F1子孫の通常の PCR遺伝子型決定のために、下記のプライマー対を、野生型対立遺伝子および突然変異体対立遺伝子の両方に使用した。すなわち、Foxn1遺伝子に対しては、5'-CTACTCCCTCCGCAGTCTGA-3'（配列番号６９）および5'-CCAGGCCTAGGTTCCAGGTA-3'（配列番号７０）、Prkdc遺伝子に対しては、5'-CCCCAGCATTGCAGATTTCC-3'（配列番号７１）および5'-AGGGCTTCTTCTCTACAATCACG-3'（配列番号７２）であった。

Cas9 mRNAの注入の場合、突然変異体の割合（突然変異胚の数／すべての胚の数）は用量依存的であり、33％（1 ng/μl sgRNA）〜91％（100 ng/μl）に及んだ（図６ｂ）。配列解析は、Foxn1遺伝子における突然変異を確認したが、ほとんどの突然変異は小さな欠失であって（図６ｃ）、ZFNおよびTALENによって誘発される突然変異と同様であった（Kimら、2013）。
Cas9タンパク質の注入の場合、これらの注入用量および注入方法は、マウス胚のin vitroでの生存および発生にあまり影響を及ぼさず、70％を上回るRGEN注入胚が、両実験において正常に孵化した。また、Cas9タンパク質注入によって得られた突然変異体の割合は用量依存的であり、前核注入による最高用量で88％にまで達し、細胞質内注入によって71％に達した（図７ａおよび７ｂ）。Cas9 mRNAとsgRNAによって誘発された突然変異パターンと同様に（図６ｃ）、Cas9タンパク質-sgRNA複合体によって誘発された突然変異は、主に小さな欠失であった（図７ｃ）。これらの結果は、RGENがマウス胚において高い遺伝子ターゲティング活性を有することを明示する。

RGENによって誘発される高い突然変異頻度および低い細胞毒性に後押しされ、我々は、マウス胚を偽妊娠した代理母の卵管に移入することによって、生きた動物を作製した。
注目すべきことに、出生率は非常に高く、58％〜73％に及び、Foxn1-sgRNAの用量の増加による影響を受けなかった（表６）。

147匹の新生仔のうち、我々は、99匹の突然変異体ファウンダーマウスを得た。培養胚において観察された結果と一致して（図６ｂ）、突然変異体の割合は、Foxn1-sgRNAの用量に比例し、最大で93％（100 ng/μl Foxn1-sgRNA）にまで達した（表６および７、図５ｂ）。

Prkdc標的化マウスを作製するために、我々は、漸増する用量のPrkdc-sgRNA（50、100、および250 ng/μl）とともに、5倍高い濃度のCas9 mRNA（50 ng/μl）を適用した。先と同様に、出生率は非常に高く、51％〜60％に及び、解析のために十分な数の新生仔を生じた（表６）。突然変異体の割合は、最大用量のPrkdc-sgRNAで57％（37匹の新生仔のうち21匹の突然変異体ファウンダー）であった。RGENによって得られたこれらの出生率は、我々の以前の研究（Sungら、2013）で報告されたTALENによる出生率よりも約2〜10倍高かった。これらの結果は、RGENが最小限の毒性で強力な遺伝子ターゲティング試薬であることを示す。

変異対立遺伝子の生殖細胞系列伝達を試験するために、我々は、４つの異なる対立遺伝子を有するモザイクである（図５ｃ、および表８）Foxn1突然変異体ファウンダー#108を、野生型マウスと交配し、F1子孫の遺伝子型を観察した。

予想される通り、すべての子孫は、野生型対立遺伝子および変異対立遺伝子の１つを有するヘテロ接合突然変異体であった（図５ｄ）。我々はまた、Foxn1（図８）およびPrkdc（図９）の独立のファウンダーマウスにおいて生殖細胞系列伝達を確認した。我々が知る限りでは、これらの結果は、RGEN誘発性の変異対立遺伝子が動物のF1子孫に安定的に伝達されることの最初の証拠を提供する。

植物におけるRNA誘導型ゲノム編集
4-1. Cas9タンパク質の産生
化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogens）株M1 GAS（NC_002737.1）に由来するCas9コード配列（4,104 bp）を、pET28-b(+)プラスミドにクローニングした。核標的化配列（NLS）をタンパク質のN末端に含めることによって、タンパク質の核への局在を確実にした。Cas9 ORFを含むpET28-b(+)プラスミドをBL21(DE3)に形質転換した。その後、0.2mM IPTGを用いて18℃で16時間Cas9を誘導し、メーカーの説明書に従いNi-NTAアガロースビーズ（Qiagen）を用いて精製した。Ultracel-100K（Millipore）を用いて、精製されたCas9タンパク質を濃縮した。

4-2. ガイドRNAの産生
Cas9標的化に必要とされるエクソン内のNGGモチーフ、いわゆるプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）の存在について、BRI1をコードしているシロイヌナズナ（Arabidopsis）遺伝子のゲノム配列をスクリーニングした。シロイヌナズナのBRI1遺伝子を破壊するために、我々は、NGGモチーフを含むエクソン内の２つのRGEN標的部位を同定した。鋳型DNAを用いてin vitroでsgRNAを作製した。それぞれの鋳型DNAは、２つの部分的に重複したオリゴヌクレオチド（Macrogen、表X1）およびPhusionポリメラーゼ（Thermo Scientific）を用いた伸長反応によって、下記の条件、すなわち98℃30秒（98℃10秒、54℃20秒、72℃2分）×20、72℃5分、を用いて作製した。

伸長されたDNAを精製し、MEGAshortscript T7 kit（Life Technologies）を用いたガイドRNAのin vitroでの産生のための鋳型として使用した。その後、ガイドRNAを、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱によって精製した。Cas9/sgRNA複合体を調製するために、10μlの精製Cas9タンパク質（12μg/μl）およびそれぞれ4μlの２つのsgRNA（11μg/μl）を、20μl NEB3バッファー（New England Biolabs）中で混合し、37℃で10分間インキュベートした。

4-3. Cas9/sgRNA複合体のプロトプラストへのトランスフェクション
ペトリ皿で無菌栽培された4週齢のシロイヌナズナ（Arabidopsis）実生の葉を、酵素溶液（1％セルラーゼ(cellulose)R10、0.5％マセロザイムR10、450 mMマンニトール、20mM MES pH 5.7およびCPW塩）中、25℃で8〜16時間、暗下40 rpmで振とうしながら消化した。酵素／プロトプラスト溶液をろ過し、100×gで3〜5分間遠心分離した。顕微鏡（×100）下で血球計を用いて細胞を数えた後、プロトプラストをCPW溶液に再懸濁した。最終的に、プロトプラストをMMG溶液（4mM HEPES pH 5.7、400 mMマンニトールおよび15 mM MgCl₂）中で1×10⁶ /mlに再懸濁した。プロトプラストにCas9/sgRNA複合体をトランスフェクトするために、200μL（200,000プロトプラスト）のプロトプラスト懸濁液を、3.3または10μLのCas9/sgRNA複合体[Cas9タンパク質（6μg/μL）および２つのsgRNA（それぞれ2.2μg/μL）]ならびに200μlの40％ポリエチレングリコールトランスフェクションバッファー（40％PEG4000、200 mMマンニトールおよび100 mM CaCl₂）とともに、2 mlのチューブ内で穏やかに混合した。室温で5〜20分間インキュベートした後、W5溶液（2 mM MES pH 5.7、154 mM NaCl、125 mM CaCl₂および5 mM KCl）を含む洗浄バッファーを添加することによって、トランスフェクションを停止させた。その後、100×gで5分間の遠心分離によってプロトプラストを回収し、1 mlのW5溶液で洗浄し、もう一度100×gで5分間遠心分離した。プロトプラストの密度を1×10⁵ /mlに調整し、それらを400 mMグルコースを含む改変KM 8p液体培地中で培養した。

4-4. シロイヌナズナ（Arabidopsis）プロトプラストおよび植物における突然変異の検出トランスフェクションの24時間後または72時間後、プロトプラストを回収して、ゲノムDNAを単離した。２つの標的部位にわたるゲノムDNA領域をPCR増幅して、T7E1アッセイに供した。図１１に示すように、50％〜70％に及ぶ高頻度で、RGENによってindelが誘発された。意外にも、突然変異は、トランスフェクションの24時間後に誘発された。Cas9タンパク質は、トランスフェクション後直ちに機能するようである。PCR産物を精製し、T-Blunt PCR Cloning Kit（Solgent）にクローニングした。プラスミドを精製し、M13Fプライマーを用いたサンガー配列決定法に供した。１つの突然変異体配列は、１つの部位に7-bp欠失を有していた（図１２）。他の３つの突然変異体配列は、２つのRGEN部位の間に〜220-bpのDNA断片の欠失を有していた。

細胞透過性ペプチドまたはタンパク質形質導入ドメインを用いたCas9タンパク質形質導入5-1. His-Cas9コードプラスミドの構築
C末端にシステインを有するCas9を、鋳型として以前に記載されたCas9プラスミド（Cho, 2013 #166）を用いたPCR増幅によって調製し、N末端にHisタグを含むpET28-(a)ベクター（Novagen, Merk Millipore, Germany）にクローニングした。

5-2. 細胞培養
293T（ヒト胎児腎臓細胞株）ならびにHeLa（ヒト卵巣癌細胞株）を、10％FBSならびに1％ペニシリンおよびストレプトマイシンを追加したDMEM（GIBCO-BRL Rockville）中で培養した。

5-3. Cas9タンパク質の発現および精製
Cas9タンパク質を発現させるために、E. coli BL21細胞を、Cas9をコードしているpET28-(a)ベクターで形質転換し、50μg/mLカナマイシン（Amresco, Solon, OH）を含有するLuria-Bertani（LB）寒天培地上に接種した。翌日、単一コロニーを摘出し、50μg/mLカナマイシンを含有するLB培養液中で一晩37℃で培養した。翌日、この種培養物を、0.1 OD600で50μg/mLカナマイシンを含有するLuria培養液に植菌し、OD600が0.6〜0.8に達するまで、37℃で2時間インキュベートした。Cas9タンパク質発現を誘導するために、0.5mMの最終濃度までイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）（Promega, Madison, WI）を添加した後、細胞を30℃で一晩培養した。

細胞を4000 rpmで15〜20分間の遠心分離によって回収し、溶解バッファー（20mM Tris-Cl pH8.0、300mM NaCl、20mMイミダゾール、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル、1 mg/mlリゾチーム）に再懸濁し、超音波処理によって溶解した（40％duty、10秒間パルス、30秒間停止、氷上で10分間）。可溶性画分を、15,000 rpmで20分間、4℃での遠心分離後の上清として分離した。Ni-NTAアガロース樹脂（QIAGEN）を含むカラムおよびAKTA prime機器（AKTA prime, GE Healthcare, UK）を用いて、Cas9タンパク質を4℃で精製した。このクロマトグラフィーの間、可溶性タンパク質画分をNi-NTAアガロース樹脂カラム（GE Healthcare, UK）に1 mL/分の流速で添加した。カラムを洗浄バッファー（20mM Tris-Cl pH8.0、300mM NaCl、20mMイミダゾール、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル）で洗浄し、結合したタンパク質を溶出バッファー（20mM Tris-Cl pH8.0、300mM NaCl、250mMイミダゾール、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル）を用いて0.5 ml/分の流速で溶出した。プールした溶出画分を濃縮し、保存バッファー（50 mM Tris-HCl、pH8.0、200 mM KCl、0.1 mM EDTA、1 mM DTT、0.5 mM PMSF、20％グリセロール）に対して透析した。タンパク濃度をBradfordアッセイ（Biorad, Hercules, CA）によって定量し、対照としてウシ血清アルブミンを用いたSDS-PAGEによって純度を分析した。

5-4. Cas9の9R4Lとのコンジュゲート形成
PBS中で1mg/mLの濃度に希釈した1mgのCas9タンパク質および25μL DW中の50μgのマレイミド-9R4Lペプチド（Peptron, Korea）を、ローターを用いて室温で2時間および4℃で一晩、穏やかに混合した。非コンジュゲートマレイミド-9R4Lを除去するために、50kDa分子量カットオフ膜を用いて、DPBS（pH 7.4）に対して4℃で24時間、サンプルを透析した。Cas9-9R4Lタンパク質を透析膜から回収し、Bradfordアッセイを用いてタンパク質量を測定した。

5-5. sgRNA-9R4Lの調製
sgRNA（1μg）を、100μlのDPBS（pH 7.4）中の様々な量のC9R4LCペプチド（1〜40の重量比にわたる）に穏やかに添加した。この混合物を室温で30分間インキュベートし、RNAseを含まない脱イオン水を用いて10倍に希釈した。動的光散乱法（Zetasizer-nano analyzer ZS; Malvern instruments, Worcestershire, UK）を用いて、形成されたナノ粒子の流体力学直径およびゼータ電位を測定した。

5-6. Cas9タンパク質およびsgRNA処理
Cas9-9R4LおよびsgRNA-C9R4LCを下記のように細胞に処理した。すなわち、1μgのsgRNAおよび15μgのC9R4LCペプチドを250 mLのOPTIMEM培地に添加し、室温で30分間インキュベートした。播種24時間後に、細胞をOPTIMEM培地で洗浄し、37℃で4時間sgRNA-C9R4LC複合体によって処理した。細胞を再度OPTIMEM培地で洗浄し、37℃で2時間Cas9-9R4Lによって処理した。処理後、培地を血清含有完全培地に交換し、次の処理の前に37℃で24時間インキュベートした。Cas9およびsgRNAの多重処理のために、同一の手順を3日連続で行った。

5-7. Cas9-9R4LおよびsgRNA-9R4Lは、更なる送達手段を使用せずに、培養哺乳類細胞の内在性遺伝子を編集できる
Cas9-9R4LおよびsgRNA-9R4Lが、更なる送達手段を使用せずに培養哺乳類細胞の内在性遺伝子を編集できるかどうかを決定するために、我々は、293細胞を、Cas9-9R4LおよびCCR5遺伝子を標的とするsgRNA-9R4Lで処理し、そのゲノムDNAを分析した。T7E1アッセイは、9％のCCR5遺伝子がCas9-9R4LとsgRNA-9R4Lとの両方で処理された細胞において破壊され、未処理、またはCas9-9RもしくはsgRNA-9R4Lのいずれかで処理された、または修飾されていないCas-9とsgRNAとの両方で処理されたものを含む対照細胞では、CCR5遺伝子破壊が観察されなかったことを示し（図１３）、修飾されていないCas-9およびsgRNAではなく、 Cas9-9R4Lタンパク質および9R4LをコンジュゲートされたsgRNAによる処理が、哺乳類細胞において効率的なゲノム編集を引き起こし得ることを示唆した。

ガイドRNA構造によるオフターゲット突然変異の制御
最近、３つのグループが、RGENがヒト細胞においてオフターゲット作用を有することを報告した。驚いたことに、RGENは、オンターゲット部位と3〜5ヌクレオチドが異なるオフターゲット部位に効率的に突然変異を誘発した。しかし、我々は、我々のRGENと他のグループによって用いられたRGENとの間にいくつかの違いがあることに気付いた。第一に、我々は、crRNAおよびtracrRNAの必須部分で構成される一本鎖ガイドRNA（sgRNA）ではなくcrRNAとtracrRNAのデュアルRNAを用いた。第二に、我々は、crRNAをコードするプラスミドではなく合成crRNAを用いてK562細胞（HeLa細胞ではなく）をトランスフェクトした。HeLa細胞は、crRNAコードプラスミドでトランスフェクトした。他のグループは、sgRNAコードプラスミドを用いた。第三に、我々のガイドRNAは、5’末端に２つの付加的なグアニンヌクレオチドを有し、それはT7ポリメラーゼによるin vitroでの効率的な転写に必要とされる。このような付加的なヌクレオチドは、他のグループによって用いられたsgRNAには含まれていなかった。従って、我々のガイドRNAのRNA配列は、5’-GGX₂₀と示され得るが、一方、5’-GX₁₉は、他のグループによって用いられた配列を表し、X₂₀またはGX₁₉は20-bp標的配列に相当する。最初のグアニンヌクレオチドは、細胞でのRNAポリメラーゼによる転写に必要とされる。オフターゲットRGEN効果がこれらの違いに起因し得るかどうかを試験するために、我々は、ヒト細胞において高頻度でオフターゲット突然変異を誘発する４つのRGENを選択した（13）。第一に、我々は、K562細胞において、in vitroで転写されたデュアルRNAを用いる我々の方法を、sgRNAコードプラスミドをトランスフェクトする方法と比較して、T7E1アッセイによってオンターゲット部位およびオフターゲット部位での突然変異頻度を測定した。３つのRGENは、ガイドRNAの構成にかかわらず、オンターゲット部位およびオフターゲット部位で同等の突然変異頻度を示した。興味深いことに、１つのRGEN（VEFGA部位1）は、合成デュアルRNAを用いた場合、オンターゲット部位と3ヌクレオチドが異なる（図１４、OT1-11と呼ばれる）１つの有効なオフターゲット部位でindelを誘発しなかった。しかし、合成デュアルRNAは、オンターゲット部位と2ヌクレオチドが異なる他の有効なオフターゲット部位（OT1-3）を識別しなかった。

次に、我々は、sgRNAの5’末端への２つのグアニンヌクレオチドの付加が、RGENをより特異的にすることができるかどうかを、5’-GGX₂₀（または5’-GGGX₁₉）sgRNAと5’-GX₁₉ sgRNAとの比較によって試験した。Cas9と複合体を形成した４つのGX₁₉ sgRNAは、オンターゲット部位およびオフターゲット部位で同等に効率的にindelを誘発し、最大4ヌクレオチドミスマッチまで許容した。明らかに対照的に、GGX₂₀ sgRNAは、効果的にオフターゲット部位を識別した。実際、我々が４つのGGX₂₀sgRNAを使用した場合、T7E1アッセイは、７つの有効なオフターゲット部位のうち６つで、RGEN誘発性のindelをほとんど検出しなかった（図１５）。しかし、我々は、２つのGGX₂₀ sgRNA（VEGFA部位1および3）が対応するGX₁₉sgRNAよりオンターゲット部位で活性が低いことに気付いた。これらの結果は、5’末端への追加のヌクレオチドが、おそらくガイドRNAの安定性、濃度、または二次構造を変化させることによって、オンターゲット部位およびオフターゲット部位での突然変異頻度に影響を及ぼし得ることを示す。
これらの結果は、３つの要因、すなわち、ガイドRNAコードプラスミドではなく合成ガイドRNAの使用、sgRNAではなくデュアルRNAの使用、およびGX₁₉ sgRNAではなくGGX₂₀sgRNAの使用が、オフターゲット部位の識別に対して累積効果を有することを示唆する。

ペアードCas9ニッカーゼ
原理上、一本鎖切断（SSB）は、エラーを起こしやすいNHEJによって修復されることはできないが、忠実度の高い相同組換え修復（HDR）または塩基除去修復を引き起こす。しかし、HDRによるニッカーゼ誘発性の標的化突然変異生成は、ヌクレアーゼ誘発性の突然変異生成よりずっと効率が低い。我々は、ペアードCas9ニッカーゼが、NHEJまたはHDRによるDNA修復の引き金となる複合的なDSBを生じ、効率的な突然変異生成を引き起こすであろうと推論した（図１６ａ）。更に、ペアードニッカーゼは、Cas9によるゲノム編集の特異性を2倍にするであろう。

我々は、まず、AAVS1遺伝子座（図１６ｂ）の標的部位に対して設計されたいくつかのCas9ヌクレアーゼおよびニッカーゼをin vitroで蛍光キャピラリー電気泳動によって試験した。DNA基質の両方の鎖を切断したCas9ヌクレアーゼとは異なり、ガイドRNAおよび触媒アスパラギン酸残基がアラニンに変更されたCas9の突然変異型（D10A Cas9）で構成されるCas9ニッカーゼは、一方の鎖のみを切断し、部位特異的なニックを生じた（図１６ｃ、ｄ）。しかし、興味深いことに、いくつかのニッカーゼ（図１７ａのAS1、AS2、AS3、およびS6）は、ヒト細胞において標的部位にindelを誘発し、ニックがin vivo において非効率的ではあるがDSBに変化し得ることを示唆した。向かい合うDNA鎖上に２つの隣接したニックを作るペアードCas9ニッカーゼは、ペアードヌクレアーゼの効果に匹敵する14％〜91％の頻度でindelを生じた（図１７ａ）。5’突出部を生じる２つのニックの修復は、３つのゲノム遺伝子座で3’突出部を生じるニックよりはるかに高頻度でindelの形成を引き起こした（図１７ａおよび図１８）。加えて、ペアードニッカーゼは、単一ニッカーゼより効率的に相同組換え修復による標的化ゲノム編集を可能にした（図１９）。

我々は、次に、ペアードニッカーゼおよびヌクレアーゼのオフターゲット部位での突然変異頻度を、ディープシークエンシング（deep sequencing）を用いて測定した。３つのsgRNAと複合体を形成したCas9ヌクレアーゼは、それらの対応するオンターゲット部位と1または2ヌクレオチドが異なる６つの部位で、0.5％〜10％にわたる頻度でオフターゲット突然変異を誘発した（図１７ｂ）。対照的に、ペアードCas9ニッカーゼは、６つのオフターゲット部位のいずれにおいても0.1％の検出限界を上回るindelを生じなかった。PAM 中の最初の位置（すなわち、NGG中のN）で、そのオンターゲット部位と1ヌクレオチドが異なるS2 Off-1部位は、もう一つのオンターゲット部位と見なされ得る。予想された通り、S2 sgRNAと複合体を形成したCas9ヌクレアーゼは、この部位およびオンターゲット部位で同様に有効であった。明らかに対照的に、S2 sgRNAおよびAS2 sgRNAと複合体を形成したD10A Cas9は、この部位をオンターゲット部位と270倍の差で識別した。このペアードニッカーゼはまた、AS2オフターゲット部位（図１７ｂのOff-1およびOff-9）をオンターゲット部位と、それぞれ160倍および990倍の差で識別した。

ペアードCas9ニッカーゼによって誘発される染色体DNAスプライシング
ZFNおよびTALENなどの人工ヌクレアーゼによって生じる２つの同時に起こるDSBは、介在する染色体セグメントの大きな欠失を促進し得ることが報告されている。我々は、ペアードCas9ニッカーゼによって引き起こされる２つのSSBもまたヒト細胞において欠失を生じ得るかどうかを試験した。我々は、PCRを用いて欠失事象を検出し、７つのペアードニッカーゼが、ペアードCas9ヌクレアーゼと同様に効率的に最大1.1-kbpまでの染色体セグメントの欠失を誘発することを見出した（図２０ａ、ｂ）。PCR産物のDNA配列によって、欠失事象が確認された（図２０ｃ）。興味深いことに、sgRNAと一致する配列は、７つの欠失特異的PCRアンプリコンのうち２つで完全に保たれた（図２０ｃの下線部）。対照的に、Cas9ヌクレアーゼペアは、完全な標的部位を含む配列を生じなかった。この知見は、２つの離れたニックが２つの独立したDSBに変換されて、介在する染色体セグメントの欠失を促進したのではないことを示唆する。加えて、その融解温度は非常に高いため、100 bpを超えて離れた２つのニックが、生理条件下で大きな突出部を有する複合的なDSBを生じ得るとは考えにくい。

我々は、２つの離れたニックが、頭を付き合わせた方向での鎖置換によって修復され、中央でDSBの形成を引き起こし、NHEJによるその修復が小さな欠失を引き起こすことを提唱する（図２０ｄ）。このプロセスの間、２つの標的部位は完全に保たれるため、ニッカーゼは再度SSBを生じ、標的部位が削除されるまで繰り返しこの周期を引き起こす。この機構は、なぜ、3’突出部を生じるニックではなく、5’突出部を生じる２つのオフセット（offset）ニックが、３つの遺伝子座で効率的にindelを誘発したのかを説明する。

我々は、その後、Cas9ヌクレアーゼおよびニッカーゼが、オンターゲットDNA切断およびオフターゲットDNA切断のNHEJ修復に起因する望ましくない染色体転座を誘発し得るかどうかを調べた（図２１ａ）。我々は、Cas9ヌクレアーゼによって誘発された転座を、PCRを用いて検出することができた（図２１ｂ、ｃ）。このようなPCR産物は、AS2＋S3 Cas9ニッカーゼペアをコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞から単離されたゲノムDNAを用いては、増幅されなかった。この結果は、AS2ニッカーゼとS3ニッカーゼの両方が、それらの対応するヌクレアーゼとは異なり、オフターゲット部位でindelを誘発しなかったという事実と一致する（図１７ｂ）。

これらの結果は、ペアードCas9ニッカーゼがヒト細胞において標的化突然変異形成および最大1-kbpまでの染色体セグメントの大きな欠失を可能にすることを示唆する。重要なことに、ペアードニッカーゼは、それらの対応するヌクレアーゼが突然変異を誘発するオフターゲット部位でindelを引き起こさなかった。更に、ヌクレアーゼとは異なり、ペアードニッカーゼは、オフターゲットDNA切断に関連した望ましくない転座を促進しなかった。原理上、ペアードニッカーゼは、Cas9仲介性突然変異生成の特異性を２倍にし、遺伝子治療および細胞療法など、正確なゲノム編集を必要とする用途において、RNA誘導型酵素の有用性を拡大する。このアプローチで１つ注意すべきは、効率的なニッカーゼペアを作製するために２つの高い活性を有するsgRNAが必要とされ、標的設定可能な部位を限定していることである。本研究および他の研究において示されるように、すべてのsgRNAが同様に活性を有するわけではない。細胞の集団ではなく単一クローンが更なる研究または用途に用いられる場合、ゲノムにおいて特有の配列を示すガイドRNAの選択および最適化したガイドRNAの使用は、Cas9ヌクレアーゼに関連したオフターゲット突然変異を避けるために十分であろう。我々は、Cas9ヌクレアーゼとペアードニッカーゼとの両方が、細胞および生物における正確なゲノム編集を促進する強力な選択肢であることを提唱する。

CRISPR/Casに由来するRNA誘導型エンドヌクレアーゼを用いた遺伝子型決定
次に、我々は、RGENが、従来の制限酵素に代わって、制限酵素断片長多型（RFLP）分析に使用され得ると推論した。RGENを含む人工ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼによってもたらされたDSBがエラーを起こしやすい非相同末端結合（NHEJ）システムによって修復される際、標的部位にindelを誘発する。標的配列を認識するように設計されているRGENは、indelを有する突然変異体配列を切断できないが、野生型標的配列を効果的に切断するであろう。

9-1. RGEN成分
MEGAshortcript T7 kit（Ambion）を用い、メーカーの説明書に従ったin vitro転写によって、crRNAおよびtracrRNAを調製した。転写されたRNAを8％変性尿素-PAGEゲル上で分離した。RNAを含むゲル切片を切り出し、溶出バッファーに移した。RNAをヌクレアーゼが含まれていない水に回収し、続いてフェノール：クロロホルム抽出、クロロホルム抽出、およびエタノール沈澱を行った。精製されたRNAを分光分析によって定量した。crRNAのための鋳型は、その配列が5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGX₂₀GTTTTAGAGCTATGCTGTTTTG-3’（配列番号７６）（X₂₀は標的配列である）として示されるオリゴヌクレオチド、およびその相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって調製した。tracrRNAのための鋳型は、Phusionポリメラーゼ（New England Biolabs）を用いた、フォワードおよびリバースオリゴヌクレオチド
（5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGAACCATTCAAAACAGCATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG-3’（配列番号７７）および
5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATG-3’（配列番号７８））の伸長によって合成した。

9-2. 組換えCas9タンパク質の精製
我々の前実施例において用いられた、C 末端でHis6-タグと融合されたCas9をコードするCas9 DNA構築物を、pET-28a発現ベクターに挿入した。組換えCas9タンパク質を、LB 培地で培養されるE. coli株BL21(DE3)中で、1 mM IPTGによる誘導後25℃で4時間発現させた。細胞を回収し、20 mM Tris PH 8.0、500 mM NaCl、5 mMイミダゾール、および1 mM PMSFを含有するバッファーに再懸濁した。細胞を液体窒素中で凍結させ、4℃で解凍し、超音波処理した。遠心分離後、溶解物中のCas9タンパク質をNi-NTAアガロース樹脂（Qiagen）に結合させ、20 mM Tris pH 8.0、500 mM NaCl、および20 mMイミダゾールを含有するバッファーで洗浄し、20 mM Tris pH 8.0、500 mM NaCl、および250 mMイミダゾールを含有するバッファーで溶出した。精製されたCas9タンパク質を20 mM HEPES (pH 7.5)、150 mM KCl、1 mM DTT、および10％グリセロールに対して透析し、SDS-PAGEによって分析した。

9-3. T7 エンドヌクレアーゼIアッセイ
下記のようにT7E1アッセイを行った。簡潔には、ゲノムDNAを用いて増幅したPCR産物を95℃で変性し、16℃で再アニーリングし、5ユニットのT7エンドヌクレアーゼI（New England BioLabs）とともに37℃で20分間インキュベートした。反応生成物を2〜2.5％アガロースゲル電気泳動を用いて分離した。

9-4. RGEN-RFLPアッセイ
PCR産物（100〜150 ng）を、37℃で60分間、最適化濃度（表１０）のCas9タンパク質、tracrRNA、crRNAとともに10μlのNEBバッファー3（1×）中でインキュベートした。切断反応後、RNase A（4 μg）を添加し、反応混合物を37℃で30分間インキュベートしてRNAを除去した。30％グリセロール、1.2％SDS、および100 mM EDTAを含有する6×停止液バッファーによって反応を停止させた。生成物を1〜2.5％アガロースゲル電気泳動によって分離し、EtBr染色によって可視化した。

9-5. プラスミド切断アッセイ
制限酵素処理された線状化プラスミド（100 ng）を、37℃で60分間、Cas9タンパク質（0.1μg）、tracrRNA（60 ng）、およびcrRNA（25 ng）とともに10μlのNEB 3バッファー（1×）中でインキュベートした。30％グリセロール、1.2％SDS、および100 mM EDTAを含有する6×停止液によって反応を停止させた。生成物を1％アガロースゲル電気泳動によって分離し、EtBr染色によって可視化した。

9-6. RFLPの戦略
望ましいDNA特異性を有する新たなRGENは、crRNAを置き換えることによって容易に作製されることができ、一度組換えCas9タンパク質が得られると、カスタムタンパク質のde novo精製は必要とされない。RGENを含む人工ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼによって引き起こされるDSBがエラーを起こしやすい非相同末端結合（NHEJ）によって修復される際に、標的部位に小さな挿入または欠失（indel）を誘発する。標的配列を認識するように設計されたRGENは、野生型配列を効率的に切断するが、indelを有する突然変異体配列を切断できない（図２２）。

我々は、まず、RGENが野生型または切断部位に1〜3塩基のindelを有する改変されたC4BPB標的配列を含むプラスミドを差別的に切断できるかどうかを試験した。これらのindelを有する６つのプラスミドはいずれも、標的特異的crRNA、tracrRNA、および組換え Cas9タンパク質で構成されるC4BPB特異的RGEN5によって切断されなかった（図２３）。対照的に、完全な標的配列を有するプラスミドは、このRGENによって効率的に切断された。

9-7. RGEN仲介性RFLPを用いた、同一のRGENによって誘発された突然変異の検出
次に、同一のRGENによって誘発された突然変異の検出のためのRGEN仲介性RFLPの実現可能性を試験するために、我々は、C4BPB遺伝子を標的とするRGENを用いて確立された遺伝子改変K562ヒト癌細胞クローンを用いた（表１２）。

本研究に用いられたC4BPB突然変異体クローンは、94 bpの欠失から67 bpの挿入まで様々な突然変異を有する（図２４ａ）。重要なことに、突然変異体クローンに生じたすべての突然変異は、RGEN標的部位の欠如をもたらした。分析された６つのC4BPBクローンの中で、４つのクローンは野生型と変異対立遺伝子との両方を有し（+/-）、２つのクローンは変異対立遺伝子のみを有する（-/-）。

野生型K562ゲノムDNAから増幅されたRGEN標的部位にわたるPCR産物は、標的特異的crRNA、tracrRNA、およびE. coliで発現され、精製された組換えCas9タンパク質で構成されるRGENによって完全に消化された（図２４ｂ/レーン1）。C4BPB突然変異体クローンがRGENを用いたRFLP分析を受けた場合、野生型対立遺伝子と変異対立遺伝子との両方を持っている+/-クローンのPCRアンプリコンは一部が消化され、野生型対立遺伝子を持っていない-/-クローンのアンプリコンは全く消化されず、野生型配列に対応する切断生成物を生じなかった（図２４ｂ）。標的部位での一塩基挿入であっても、増幅された変異対立遺伝子のC4BPB RGENによる消化を妨げ（＃12および＃28クローン）、RGEN仲介性RFLPの高い特異性を示した。我々は、同時に、PCRアンプリコンをミスマッチ感受性T7E1アッセイに供した（図２４ｂ）。注目すべきことに、T7E1アッセイは-/-クローンを+/-クローンと区別することができなかった。更に悪いことに、同じ突然変異体配列のアニーリングはホモ二本鎖を形成するため、T7E1アッセイは、同じ突然変異体配列を有するホモ接合性突然変異体クローンを野生型クローンと区別することができない。従って、RGEN仲介性RFLPは、ZFN、TALEN、およびRGENなどの人工ヌクレアーゼによって誘発される突然変異体クローンの分析において、従来のミスマッチ感受性ヌクレアーゼアッセイを超える重要な利点を有する。

9-8. RGEN-RFLP分析の定量的アッセイ
我々はまた、RGEN-RFLP分析が定量的な方法であるかどうかを調べた。C4BPBヌルクローンおよび野生型細胞から単離されたゲノムDNAサンプルを様々な比率で混合し、PCR増幅に用いた。そのPCR産物を、同時にRGEN遺伝子型決定およびT7E1アッセイに供した（図２５ｂ）。予想された通り、RGENによるDNA切断は、野生型と突然変異体との比率に比例した。対照的に、T7E1アッセイの結果は、比率から推定される突然変異頻度とほとんど相関せず、特に、相補的な突然変異体配列が互いにハイブリダイズしてホモ二本鎖を形成し得る状況である高い突然変異体％で、不正確であった。

9-9. RGEN仲介性RFLP遺伝子型決定を用いた突然変異体マウスファウンダーの分析
我々はまた、マウス1細胞胚へのTALENの注入によって樹立された突然変異体マウスファウンダーの分析に、RGEN仲介性RFLP遺伝子型決定（略してRGEN遺伝子型決定）を適用した（図２６ａ）。我々は、Pibf1遺伝子中のTALEN標的部位を認識するRGENを設計して用いた（表１０）。ゲノムDNAを野生型マウスおよび突然変異体マウスから単離し、PCR増幅後、RGEN遺伝子型決定に供した。RGEN遺伝子型決定は、1〜27-bpの欠失に及ぶ様々な突然変異を検出することに成功した（図２６ｂ）。T7E1アッセイとは異なり、RGEN遺伝子型決定は、＋/-および-/-ファウンダーの識別検出を可能にした。

9-10. CCR5特異的ZFNによってヒト細胞に誘発された突然変異のRGENを用いた検出
加えて、我々はRGENを用いて、更に別の種類の人工ヌクレアーゼであるCCR5特異的ZFNによってヒト細胞に誘発された突然変異を検出した（図２７）。これらの結果は、RGENがRGEN自身以外のヌクレアーゼによって誘発された突然変異を検出できることを示す。実際、我々は、RGENが、すべてではないがほとんどの人工ヌクレアーゼによって誘発された突然変異を検出するように設計され得ると予想する。RGEN遺伝子型決定アッセイの設計における唯一の制約は、Cas9タンパク質によって認識されるPAM配列中のGGまたはAG（相補鎖ではCCまたはCT）ジヌクレオチドの必要性だけであり、これは平均して4 bpに1回出現する。crRNAおよびPAMヌクレオチド中の数塩基のシード領域内のどこかに誘発されるIndelは、RGEN触媒性DNA切断を妨げると予想される。実際、我々は、ZFN部位およびTALEN部位のほとんど（98％）において少なくとも１つのRGEN部位を確認した。

9-11. RGENを用いた多型または多様性の検出
次に、我々は、高度に多型性のある遺伝子座である、ヒト白血球抗原B（別名MHCクラスIタンパク質）をコードするHLA-Bを標的とする新たなRGENを設計し、試験した（図２８）。HeLa細胞にRGENプラスミドをトランスフェクトして、ゲノムDNAを同時にT7E1アッセイおよびRGEN-RFLP分析に供した。T7E1は、標的部位に近接した配列多型に起因する偽陽性バンドを生じた（図２５ｃ）。しかし、予想された通り、遺伝子破壊に用いられた同一のRGENは、野生型細胞由来のPCR産物を完全に切断したが、RGEN-トランスフェクト細胞由来のPCR産物を部分的に切断し、標的部位でのRGEN誘発性indelの存在を示した。この結果は、特に、標的遺伝子が対象の細胞において多型または多様性を有するかどうか不明な場合、RGEN-RFLP分析がT7E1アッセイを上回る明らかな利点を有することを示す。

9-12.癌において見られる反復性突然変異および自然発生多型のRGEN-RFLP分析による検出 RGEN-RFLP分析は、人工ヌクレアーゼ誘発性突然変異の遺伝子型決定の域を超えた用途を有する。我々は、RGEN遺伝子型決定を用いて、癌において見られる反復性突然変異および自然発生多型を検出しようとした。我々は、β-カテニンをコードする発がんCTNNB1遺伝子に機能獲得型3-bp欠失を有するヒト大腸癌細胞株HCT116を選択した。HCT116ゲノムDNAから増幅されたPCR産物は、HCT116細胞におけるヘテロ接合性の遺伝子型と一致して、野生型特異的RGENと突然変異特異的RGENとの両方によって部分的に切断された（図２９ａ）。明らかに対照的に、野生型対立遺伝子のみを有するHeLa細胞由来のDNAから増幅されたPCR産物は、野生型特異的RGENによって完全に消化され、突然変異特異的RGENによっては全く切断されなかった。

我々はまた、HEK293細胞が、HIV感染に必須の共受容体をコードするCCR5遺伝子に32-bpの欠失（del32）を有し、ホモ接合型del32 CCR5保因者はHIV感染に対して免疫があることに注目した。我々は、del32対立遺伝子に特異的な１つのRGENおよび野生型対立遺伝子に対する他のRGENを設計した。予想された通り、野生型特異的RGENは、K562、SKBR3、またはHeLa細胞から得られたPCR産物（野生型対照として用いられた）を完全に切断したが、HEK293細胞由来のPCR産物を部分的に切断し（図３０ａ）、HEK293細胞における切断できないdel32対立遺伝子の存在を確認した。しかし、予想外に、del32特異的RGENは、野生型細胞由来のPCR産物をHEK293細胞由来のPCR産物と同様に効率的に切断した。興味深いことに、このRGENは、オンターゲット部位のすぐ下流に一塩基ミスマッチを伴うオフターゲット部位を持っていた（図３０）。これらの結果は、RGENが自然発生indelを検出し得るが、それらのオフターゲット作用のため、一塩基多型または点突然変異を有する配列を区別できないことを示唆する。

RGENを用いて発がん性単一ヌクレオチド変異を遺伝子型決定するために、我々は、完全に一致したRNAの代わりに一塩基ミスマッチガイドRNAを用いることによって、RGEN活性を弱めた。野生型配列または突然変異体配列に特異的な完全に一致したガイドRNAを含むRGENは、両方の配列を切断した（図３１ａおよび３２ａ）。対照的に、一塩基ミスマッチガイドRNAを含むRGENは２つの配列を区別し、ヒト癌細胞株におけるKRAS、PIK3CA、およびIDH1遺伝子中の３つの反復性発がん性点突然変異の遺伝子型決定を可能にした（図２９ｂおよび図３３ａ、ｂ）。加えて、我々は、NAG PAM配列を認識するRGENを用いてBRAFおよびNRAS遺伝子中の点突然変異を検出することができた（図３３ｃ、ｄ）。我々は、RGEN-RFLPを用いることによって、ヒトおよび他のゲノム内の、すべてではないがほとんどあらゆる突然変異または多型を遺伝子型決定することができると考える。

上記のデータは、様々な配列変異に対して簡単で確実なRFLP分析を使用するための基盤を提供するものとしてRGENを提案する。標的配列を再プログラム化する際の高い柔軟性によって、RGENは、疾患関連反復性突然変異、患者の薬物反応に関連する遺伝子型および細胞において人工ヌクレアーゼによって誘発された突然変異などの、様々な遺伝的変異（一塩基変異、小さな挿入／欠失、構造変異）を検出するために使用され得る。本明細書において、我々は、RGEN遺伝子型決定を用いて、細胞および動物において人工ヌクレアーゼによって誘発された突然変異を検出した。原理上、自然発生多型および突然変異を特異的に検出および切断するRGENを使用することもあり得る。

以上の記載に基づき、下記の特許請求の範囲に定義されるような本発明の技術的着想または本質的な特徴から逸脱することなく、本明細書に記載された本発明の実施形態への様々な代替手段が、本発明の実施に用いられうることは、当業者によって理解されるはずである。これに関して、上述の実施例は説明のみを目的とし、本発明はこれらの実施例によって限定されることを意図しない。本発明の範囲は、下記の特許請求の範囲もしくはその等価な概念の意図および範囲から派生する変更または変形態様のすべてを含むと理解されるべきである。

参考文献
1. M. Jinek et al., Science 337, 816 (Aug 17, 2012).
2. H. Kim, E. Um, S. R. Cho, C. Jung, J. S. Kim, Nat Methods 8, 941 (Nov, 2011).3. H. J. Kim, H. J. Lee, H. Kim, S. W. Cho, J. S. Kim, Genome Res 19, 1279 (Jul, 2009).
4. E. E. Perez et al., Nat Biotechnol 26, 808 (Jul, 2008).
5. J. C. Miller et al., Nat Biotechnol 29, 143 (Feb, 2011).
6. C. Mussolino et al., Nucleic Acids Res 39, 9283 (Nov, 2011).
7. J. Cohen, Science 332, 784 (May 13, 2011).
8. V. Pattanayak, C. L. Ramirez, J. K. Joung, D. R. Liu, Nat Methods 8, 765 (Sep, 2011).
9. R. Gabriel et al., Nat Biotechnol 29, 816 (Sep, 2011).
10. E. Kim et al., Genome Res, (Apr 20, 2012).
11. H. J. Lee, J. Kweon, E. Kim, S. Kim, J. S. Kim, Genome Res 22, 539 (Mar, 2012).
12. H. J. Lee, E. Kim, J. S. Kim, Genome Res 20, 81 (Jan, 2010).
13. Fu Y, Foden JA, Khayter C, Maeder ML, Reyon D, Joung JK, Sander JD. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotech advance online publication (2013)

参考文献
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13. Fu Y, Foden JA, Khayter C, Maeder ML, Reyon D, Joung JK, Sander JD. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotech advance online publication (2013)
本開示は以下の実施形態を包含する。
[１] 標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する、真核細胞または真核生物中の標的DNAを切断するための組成物。
[２] 標的DNAが内在性の標的DNAである、実施形態１に記載の組成物。
[３] ガイドRNAがcrRNAおよびtracrRNAを含むデュアルRNAである、実施形態１に記載の組成物。
[４] ガイドRNAが一本鎖ガイドRNA（sgRNA）である、実施形態１に記載の組成物。
[５] 一本鎖ガイドRNAがcrRNAおよびtracrRNAの一部を含む、実施形態４に記載の組成物。
[６] ガイドRNAが、更に、一本鎖ガイドRNA、またはデュアルRNAのcrRNAの5'末端に1つ以上の付加的なヌクレオチドを含む、実施形態１に記載の組成物。
[７] ガイドRNAが、更に、一本鎖ガイドRNA、またはデュアルRNAのcrRNAの5'末端に２つの付加的なグアニンヌクレオチドを含む、実施形態１に記載の組成物。
[８] 真核細胞または真核生物において標的化突然変異生成を誘発する、実施形態１に記載の組成物。
[９] in vitroにおいて真核細胞または真核生物のゲノムの遺伝子型決定に使用するための、実施形態１に記載の組成物。
[１０] ガイドRNAおよびCasタンパク質がペアとして機能し、前記ペアが異なる鎖上に２つのニックを生じさせる２つのガイドRNAを含む、実施形態１に記載の組成物。
[１１] ガイドRNAが、単離されたRNAの形態であるか、またはベクターにコードされ、前記ベクターがウイルスベクター、プラスミドベクター、もしくはアグロバクテリウムベクターである、実施形態１に記載の組成物。
[１２] 標的DNAに特異的なガイドRNAおよびCas9タンパク質を含有する、実施形態１に記載の組成物。
[１３] ex vivoもしくはin vivoにおいて真核細胞または真核生物中の標的DNAを切断するための、実施形態１に記載の組成物。
[１４] Casタンパク質コード核酸またはCasタンパク質がストレプトコッカス属菌（Streptococcus sp.）に由来する、実施形態１に記載の組成物。
[１５] 前記ストレプトコッカス属菌（Streptococcus sp.）が化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogens）である、実施形態１４に記載の組成物。
[１６] Casタンパク質がNGGトリヌクレオチドを認識する、実施形態１５に記載の組成物。
[１７] Casタンパク質がCas9タンパク質またはその変異型である、実施形態１に記載の組成物。
[１８] Casタンパク質がタンパク質形質導入ドメインに結合される、実施形態１に記載の組成物。
[１９] Cas9タンパク質の変異型が、その中の触媒アスパラギン酸残基が他の任意のアミノ酸に変更されたCas9の突然変異型である、実施形態１７に記載の組成物。
[２０] 前記アミノ酸がアラニンである、実施形態１９に記載の組成物。
[２１] Casタンパク質コード核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列、または配列番号１と少なくとも50％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１に記載の組成物。
[２２] 真核細胞または真核生物における標的化突然変異生成のための、実施形態１〜２１のいずれかに記載の組成物の使用。
[２３] 実施形態１〜２１のいずれかに記載の組成物を含む、真核細胞または真核生物中の標的DNAを切断するためのキット。
[２４] 真核細胞または真核生物にCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質、およびガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNAを同時トランスフェクトまたは連続トランスフェクトするステップを含む、Casタンパク質およびガイドRNAを有する真核細胞あるいは真核生物を作製する方法。
[２５] ガイドRNAがcrRNAおよびtracrRNAを含むデュアルRNAである、実施形態２４に記載の方法。
[２６] ガイドRNAが一本鎖ガイドRNAである、実施形態２４に記載の方法。
[２７] 一本鎖ガイドRNAがcrRNAおよびtracrRNAの一部を含む、実施形態２６に記載の方法。
[２８] ガイドRNAが、更に、一本鎖ガイドRNA、またはデュアルRNAのcrRNAの5'末端に1つ以上の付加的なヌクレオチドを含む、実施形態２４に記載の方法。
[２９] ガイドRNAが、更に、一本鎖ガイドRNA、またはデュアルRNAのcrRNAの5'末端に２つの付加的なグアニンヌクレオチドを含む、実施形態２４に記載の方法。
[３０] 真核細胞または真核生物が、Cas9タンパク質およびガイドRNAによって同時トランスフェクトまたは連続トランスフェクトされる、実施形態２４に記載の方法。
[３１] 連続トランスフェクションが、最初にCasタンパク質コード核酸によるトランスフェクション、続いて裸のガイドRNAによる第二のトランスフェクションによって行われる、実施形態２４に記載の方法。
[３２] Casタンパク質がCas9タンパク質またはその変異型である、実施形態２４に記載の方法。
[３３] Casタンパク質コード核酸またはCasタンパク質がストレプトコッカス属菌（Streptococcus sp.）に由来する、実施形態２４に記載の方法。
[３４] 前記ストレプトコッカス属菌（Streptococcus sp.）が化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogens）である、実施形態３３に記載の方法。
[３５] Cas9タンパク質の変異型が、その中の触媒アスパラギン酸残基が他の任意のアミノ酸に変更されたCas9の突然変異型である、実施形態３２に記載の方法。
[３６] 前記アミノ酸がアラニンである、実施形態３５に記載の方法。
[３７] ガイドRNAおよびCasタンパク質がペアとして機能し、前記ペアが異なるDNA鎖上に２つのニックを生じさせる２つのガイドRNAを含む、実施形態２４に記載の方法。
[３８] ２つのニックが少なくとも100bp離れている、実施形態３７に記載の方法。
[３９] トランスフェクションが、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、DEAE-デキストラン処理、リポフェクション、ナノ粒子媒介性トランスフェクション、タンパク質形質導入ドメイン媒介性形質導入、ウイルス媒介性遺伝子送達、およびプロトプラストへのPEG媒介性トランスフェクションからなる群より選択される方法によって行われる、実施形態２４に記載の方法。
[４０] 実施形態２４〜３９のいずれかに記載の方法によって作製される、Casタンパク質およびガイドRNAを含有する真核細胞または真核生物。
[４１] 標的DNAを有する真核細胞または真核生物に実施形態１〜２１のいずれかに記載の組成物をトランスフェクトするステップを含む、真核細胞または真核生物中の標的DNAを切断する方法。
[４２] 真核生物が哺乳類または植物である、実施形態４１に記載の方法。
[４３] ガイドRNAおよびCasタンパク質がペアとして機能し、前記ペアが異なるDNA鎖上に２つのニックを生じさせる２つのガイドRNAを含む、実施形態４１に記載の方法。
[４４] ２つのニックが少なくとも100bp離れている、実施形態４３に記載の方法。
[４５] トランスフェクションが同時トランスフェクションまたは連続トランスフェクションである、実施形態４１に記載の方法。
[４６] 連続トランスフェクションが、最初にCasタンパク質コード核酸によるトランスフェクション、続いて裸のガイドRNAによる第二のトランスフェクションによって行われる、実施形態４５に記載の方法。
[４７] 切断のパターンを分析するステップを更に含み、前記パターンがゲノム内の突然変異または多型（variation）の検出を示す、実施形態４１に記載の方法。
[４８] 実施形態１〜２１のいずれかに記載の組成物によって編集されたゲノムを有する胚。
[４９] 実施形態４８に記載の胚を卵管に移入することによって得られるゲノム改変動物。
[５０] 実施形態２４〜３９のいずれかに記載の方法によって作製されたゲノム改変プロトプラストから再生された植物。
[５１] 実施形態１〜２１のいずれかに記載の組成物を動物の胚に導入するステップ；およびその胚を偽妊娠した代理母の卵管に移入して、ゲノム改変動物を生じさせるステップ、を含む、ゲノム改変動物を作製する方法。
[５２] 標的DNA配列に特異的なガイドRNAおよびCasタンパク質を含有する、単離された生体サンプル中の突然変異または多型を遺伝子型決定するための組成物。
[５３] 突然変異または多型が人工ヌクレアーゼによって細胞内に誘発される、実施形態５２に記載の組成物。
[５４] 突然変異または多型が自然発生突然変異または多型である、実施形態５２に記載の組成物。
[５５] 標的DNA配列に特異的なガイドRNAおよびCasタンパク質を含有する、単離された生体サンプル中の病原微生物の核酸配列を遺伝子型決定するための組成物。
[５６] 実施形態５２〜５５のいずれかに記載の組成物を含む、単離された生体サンプル中の突然変異または多型を遺伝子型決定するためのキット。
[５７] 実施形態５２〜５５のいずれかに記載の組成物を用いて、単離された生体サンプル中の突然変異または多型を遺伝子型決定する方法。

Claims

標的DNAに特異的なガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNA、およびCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質を含有する、真核細胞または真核生物中の標的DNAを切断するための組成物。
標的DNAが内在性の標的DNAである、請求項１に記載の組成物。
ガイドRNAがcrRNAおよびtracrRNAを含むデュアルRNAである、請求項１に記載の組成物。
ガイドRNAが一本鎖ガイドRNA（sgRNA）である、請求項１に記載の組成物。
一本鎖ガイドRNAがcrRNAおよびtracrRNAの一部を含む、請求項４に記載の組成物。
ガイドRNAが、更に、一本鎖ガイドRNA、またはデュアルRNAのcrRNAの5'末端に1つ以上の付加的なヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
ガイドRNAが、更に、一本鎖ガイドRNA、またはデュアルRNAのcrRNAの5'末端に２つの付加的なグアニンヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
真核細胞または真核生物において標的化突然変異生成を誘発する、請求項１に記載の組成物。
in vitroにおいて真核細胞または真核生物のゲノムの遺伝子型決定に使用するための、請求項１に記載の組成物。
ガイドRNAおよびCasタンパク質がペアとして機能し、前記ペアが異なる鎖上に２つのニックを生じさせる２つのガイドRNAを含む、請求項１に記載の組成物。
ガイドRNAが、単離されたRNAの形態であるか、またはベクターにコードされ、前記ベクターがウイルスベクター、プラスミドベクター、もしくはアグロバクテリウムベクターである、請求項１に記載の組成物。
標的DNAに特異的なガイドRNAおよびCas9タンパク質を含有する、請求項１に記載の組成物。
ex vivoもしくはin vivoにおいて真核細胞または真核生物中の標的DNAを切断するための、請求項１に記載の組成物。
Casタンパク質コード核酸またはCasタンパク質がストレプトコッカス属菌（Streptococcus sp.）に由来する、請求項１に記載の組成物。
前記ストレプトコッカス属菌（Streptococcus sp.）が化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogens）である、請求項１４に記載の組成物。
Casタンパク質がNGGトリヌクレオチドを認識する、請求項１５に記載の組成物。
Casタンパク質がCas9タンパク質またはその変異型である、請求項１に記載の組成物。
Casタンパク質がタンパク質形質導入ドメインに結合される、請求項１に記載の組成物。
Cas9タンパク質の変異型が、その中の触媒アスパラギン酸残基が他の任意のアミノ酸に変更されたCas9の突然変異型である、請求項１７に記載の組成物。
前記アミノ酸がアラニンである、請求項１９に記載の組成物。
Casタンパク質コード核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列、または配列番号１と少なくとも50％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の組成物。
真核細胞または真核生物における標的化突然変異生成のための、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物の使用。
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物を含む、真核細胞または真核生物中の標的DNAを切断するためのキット。
真核細胞または真核生物にCasタンパク質コード核酸もしくはCasタンパク質、およびガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするDNAを同時トランスフェクトまたは連続トランスフェクトするステップを含む、Casタンパク質およびガイドRNAを有する真核細胞あるいは真核生物を作製する方法。
ガイドRNAがcrRNAおよびtracrRNAを含むデュアルRNAである、請求項２４に記載の方法。
ガイドRNAが一本鎖ガイドRNAである、請求項２４に記載の方法。
一本鎖ガイドRNAがcrRNAおよびtracrRNAの一部を含む、請求項２６に記載の方法。
ガイドRNAが、更に、一本鎖ガイドRNA、またはデュアルRNAのcrRNAの5'末端に1つ以上の付加的なヌクレオチドを含む、請求項２４に記載の方法。
ガイドRNAが、更に、一本鎖ガイドRNA、またはデュアルRNAのcrRNAの5'末端に２つの付加的なグアニンヌクレオチドを含む、請求項２４に記載の方法。
真核細胞または真核生物が、Cas9タンパク質およびガイドRNAによって同時トランスフェクトまたは連続トランスフェクトされる、請求項２４に記載の方法。
連続トランスフェクションが、最初にCasタンパク質コード核酸によるトランスフェクション、続いて裸のガイドRNAによる第二のトランスフェクションによって行われる、請求項２４に記載の方法。
Casタンパク質がCas9タンパク質またはその変異型である、請求項２４に記載の方法。
Casタンパク質コード核酸またはCasタンパク質がストレプトコッカス属菌（Streptococcus sp.）に由来する、請求項２４に記載の方法。
前記ストレプトコッカス属菌（Streptococcus sp.）が化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogens）である、請求項３３に記載の方法。
Cas9タンパク質の変異型が、その中の触媒アスパラギン酸残基が他の任意のアミノ酸に変更されたCas9の突然変異型である、請求項３２に記載の方法。
前記アミノ酸がアラニンである、請求項３５に記載の方法。
ガイドRNAおよびCasタンパク質がペアとして機能し、前記ペアが異なるDNA鎖上に２つのニックを生じさせる２つのガイドRNAを含む、請求項２４に記載の方法。
２つのニックが少なくとも100bp離れている、請求項３７に記載の方法。
トランスフェクションが、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、DEAE-デキストラン処理、リポフェクション、ナノ粒子媒介性トランスフェクション、タンパク質形質導入ドメイン媒介性形質導入、ウイルス媒介性遺伝子送達、およびプロトプラストへのPEG媒介性トランスフェクションからなる群より選択される方法によって行われる、請求項２４に記載の方法。
請求項２４〜３９のいずれか１項に記載の方法によって作製される、Casタンパク質およびガイドRNAを含有する真核細胞または真核生物。
標的DNAを有する真核細胞または真核生物に請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物をトランスフェクトするステップを含む、真核細胞または真核生物中の標的DNAを切断する方法。
真核生物が哺乳類または植物である、請求項４１に記載の方法。
ガイドRNAおよびCasタンパク質がペアとして機能し、前記ペアが異なるDNA鎖上に２つのニックを生じさせる２つのガイドRNAを含む、請求項４１に記載の方法。
２つのニックが少なくとも100bp離れている、請求項４３に記載の方法。
トランスフェクションが同時トランスフェクションまたは連続トランスフェクションである、請求項４１に記載の方法。
連続トランスフェクションが、最初にCasタンパク質コード核酸によるトランスフェクション、続いて裸のガイドRNAによる第二のトランスフェクションによって行われる、請求項４５に記載の方法。
切断のパターンを分析するステップを更に含み、前記パターンがゲノム内の突然変異または多型（variation）の検出を示す、請求項４１に記載の方法。
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物によって編集されたゲノムを有する胚。
請求項４８に記載の胚を卵管に移入することによって得られるゲノム改変動物。
請求項２４〜３９のいずれか１項に記載の方法によって作製されたゲノム改変プロトプラストから再生された植物。
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物を動物の胚に導入するステップ；およびその胚を偽妊娠した代理母の卵管に移入して、ゲノム改変動物を生じさせるステップ、を含む、ゲノム改変動物を作製する方法。
標的DNA配列に特異的なガイドRNAおよびCasタンパク質を含有する、単離された生体サンプル中の突然変異または多型を遺伝子型決定するための組成物。
突然変異または多型が人工ヌクレアーゼによって細胞内に誘発される、請求項５２に記載の組成物。
突然変異または多型が自然発生突然変異または多型である、請求項５２に記載の組成物。
標的DNA配列に特異的なガイドRNAおよびCasタンパク質を含有する、単離された生体サンプル中の病原微生物の核酸配列を遺伝子型決定するための組成物。
請求項５２〜５５のいずれか１項に記載の組成物を含む、単離された生体サンプル中の突然変異または多型を遺伝子型決定するためのキット。
請求項５２〜５５のいずれか１項に記載の組成物を用いて、単離された生体サンプル中の突然変異または多型を遺伝子型決定する方法。