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TW202028461A - 核酸構築體及使用方法 - Google Patents

核酸構築體及使用方法 Download PDF

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TW202028461A
TW202028461A TW108137784A TW108137784A TW202028461A TW 202028461 A TW202028461 A TW 202028461A TW 108137784 A TW108137784 A TW 108137784A TW 108137784 A TW108137784 A TW 108137784A TW 202028461 A TW202028461 A TW 202028461A
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TW
Taiwan
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nucleic acid
sequence
cell
polypeptide
construct
Prior art date
Application number
TW108137784A
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English (en)
Inventor
約翰 芬
黃漢任
Original Assignee
美商英特利亞醫療公司
美商再生元醫藥公司
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Publication date
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Abstract

本發明提供核酸構築體，其允許插入及/或表現諸如轉殖基因之所關注序列。亦提供用於表現例如多肽或治療劑之組成物及使用此類構築體之方法。

Description

核酸構築體及使用方法
基因療法中之基因體編輯起因於以下觀點：外源性引入遺漏或以其他方式受損之遺傳物質可矯正遺傳疾病。長期以來已認識到基因療法在醫師如何接近及治療人類疾病方面之巨大潛能。替代依賴於藥物或手術，可藉由直接靶向潛在病因來治療具有潛在遺傳因素之患者。此外，藉由靶向潛在遺傳病因，基因療法可具有有效地治癒患者之潛能。然而，現有方法之臨床應用仍需要若干態樣中之改善。
本發明提供雙向核酸構築體，其允許增強插入及表現所關注核酸序列，例如編碼治療劑（諸如多肽）之核酸序列。如本文所述，雙向構築體包含至少兩個核酸區段，其中一個區段（第一區段）包含編碼所關注藥劑的編碼序列（編碼序列在本文中可稱為「轉殖基因」或第一轉殖基因），而另一區段（第二區段）包含其中序列互補序列編碼所關注藥劑之序列或第二轉殖基因。在一些具體實例中，構築體包含至少兩個核酸區段，其中一個區段（第一區段）包含編碼所關注多肽之編碼序列，而另一區段（第二區段）包含其中序列互補序列編碼所關注多肽之序列。當與基因編輯系統組合使用時，核酸構築體之雙向性允許在目標插入位點內在任一方向插入（不限於在一個方向上插入）構築體，允許從以下中之任一者表現所關注多肽：a）一個區段之編碼序列，或2）另一（第二）區段之互補序列，由此如本文所例示增強插入及表現效率。
現將詳細參考本發明之某些具體實例，其實例在附圖中加以說明。儘管本教示內容係與多個具體實例結合描述，但並不意欲使本教示內容限制於彼等具體實例。相反，如所屬領域中具通常知識者將瞭解，本教示內容涵蓋多種替代方案、修改及等效物。
在詳細描述本教示內容之前，應瞭解，本發明不限於特定組成物或方法步驟，因而可加以改變。應注意，除非上下文另外明確規定，否則如本說明書及所附申請專利範圍中所用，單數形式「一（a/an）」及「該（the）」包括複數個所指物。因此，舉例而言，提及「一種結合物（a conjugate）」包括複數個結合物且提及「一種細胞（a cell）」包括複數個細胞及其類似物。如本文所用，術語「包括（include）」及其文法變化形式意欲具有非限制性，因此清單中之各項的敍述不排除可以取代或添加至所列項中的其他類似項。
數值範圍包括界定該範圍之數值。考慮到有效數位及與量測相關之誤差，所量測及可量測值應理解為大致的。此外，「包含（comprise/comprises/comprising）」、「含有（contain/contains/containing）」及「包括（include/includes/including）」之使用並不意欲為限制性的。應瞭解，前述一般描述與詳細描述僅為例示性及解釋性的且並不限制教示內容。
除非說明書中具體指出，否則本說明書中敍述「包含」各種組分之具體實例亦設想為「由所述組分組成」或「基本上由所述組分組成」；本說明書中敍述「由各種組分組成」之具體實例亦設想為「包含」所述組分或「基本上由所述組分組成」；且本說明書中敍述「基本上由各種組分組成」之具體實例亦設想為「由所述組分組成」或「包含」所述組分（此互換性並不適用於此等術語在申請專利範圍中之使用)。除非上下文另外明確說明，否則術語「或（or）」以包括性意義使用，亦即等於「及/或（and/or）」。術語「約（about）」在清單之前使用時修飾該清單之各成員。術語「約」或「大致（approximately）」意謂如由所屬領域中具通常知識者所測定之特定值之可接受誤差，其部分取決於如何量測或測定該值。
本文所用之章節標題僅出於組織目的而不應被視為以任何方式限制所需主題。在以引用的方式併入之任何材料與本說明書中所定義之任何術語或本說明書之任何其他表述內容相矛盾之情況下，以本說明書為準。    I.    定義
除非另有說明，否則如本文所用之以下術語及片語意欲具有以下含義：
「聚核苷酸（polynucleotide）」及「核酸（nucleic acid）」在本文中用以指包含含氮雜環鹼基或鹼基類似物沿主鏈連接在一起之核苷或核苷類似物的多聚化合物，其包括習知RNA、DNA、混合RNA-DNA及為其類似物之聚合物。核酸「主鏈（backbone）」可由多個鍵聯組成，其包括糖-磷酸二酯鍵聯、肽-核酸鍵聯（「肽核酸」或PNA；PCT第WO 95/32305號）、硫代磷酸酯鍵聯、甲基膦酸酯鍵聯或其組合中之一或多者。核酸之糖部分可為核糖、去氧核糖或具有視需要取代，例如2'甲氧基或2'鹵基取代之類似化合物。含氮鹼基可為習知鹼基（A、G、C、T、U）；其類似物（例如經修飾之尿苷，諸如5-甲氧基尿苷、假尿苷或N1-甲基假尿苷或其他）；肌核苷；嘌呤或嘧啶之衍生物（例如N4 -甲基脫氧鳥苷、去氮或氮雜嘌呤、去氮或氮雜嘧啶、在5或6位處具有取代基之嘧啶鹼基（例如5-甲基胞嘧啶）、在2、6或8位處具有取代基之嘌呤鹼基、2-胺基-6-甲胺基嘌呤、O6 -甲基鳥嘌呤、4-硫基-嘧啶、4-胺基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶及O4 -烷基-嘧啶；美國專利第5,378,825號及PCT第WO 93/13121號）。對於一般論述，參見The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams等人編, 第11版, 1992）。核酸可包括一或多個「無鹼基」殘基，其中主鏈不包括針對聚合物位置之含氮鹼基（美國專利第5,585,481號）。核酸可僅包含習知RNA或DNA糖、鹼及鍵，或可包括習知組分與取代（例如具有2'甲氧基取代基之習知核苷，或含有習知核苷酸及一或多種核苷酸類似物兩者之聚合物）。核酸包括「鎖定核酸」（locked nucleic acid，LNA）、含有一或多種LNA核苷酸單體之類似物，該等單體具有模擬糖構形之鎖定於RNA中的雙環呋喃醣單元，其會增強對互補RNA及DNA序列之雜合親和性（Vester及Wengel, 2004,Biochemistry 43(42):13233-41）。RNA及DNA具有不同糖部分且不同之處可為在RNA中存在尿嘧啶或其類似物及在DNA中存在胸腺嘧啶或其類似物。
「引導RNA」、「gRNA」及簡稱「引導物」可在本文中互換地用於指包含引導序列之引導物，例如crRNA（亦稱為CRISPR RNA）或crRNA與trRNA（亦稱為tracrRNA）組合。crRNA及trRNA可以單RNA分子（單引導RNA，sgRNA）或例如以兩個個別RNA分子（雙引導RNA，dgRNA）形式締合。「引導RNA」或「gRNA」係指各類型。trRNA可為天然產生之序列或與天然產生之序列相比具有修飾或變化之trRNA序列。引導RNA，諸如sgRNA或dgRNA，可包括如本文所述之經修飾RNA。
如本文所用，「引導序列（guide sequence）」係指引導RNA內與目標序列互補且用以藉由經RNA引導之DNA結合劑將引導RNA引導至目標序列以供結合或修飾（例如裂解）的序列。「引導序列」亦可稱為「靶向序列（targeting sequence）」或「間隔序列（spacer sequence）」。引導序列之長度可為20個鹼基對，例如在釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes) (亦即Spy Cas9)及相關Cas9同源物/直系同源物之情況下。較短或較長序列亦可用作引導物，例如長度為15、16、17、18、19、21、22、23、24或25個核苷酸。在一些具體實例中，目標序列處於例如基因中或染色體上，且與引導序列互補。在一些具體實例中，引導序列與其對應目標序列之間的互補性或一致性之程度可為至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些具體實例中，引導序列與目標區域可為100%互補或一致的。在其他具體實例中，引導序列及目標區域可含有至少一個錯配。舉例而言，引導序列及目標序列可含有1、2、3或4個錯配，其中目標序列之總長度為至少17、18、19、20個或更多個鹼基對。在一些具體實例中，引導序列及目標區域可含有1至4個錯配，其中引導序列包含至少17、18、19、20個或更多個核苷酸。在一些具體實例中，引導序列及目標區域可含有1、2、3或4個錯配，其中引導序列包含20個核苷酸。
經RNA引導之DNA結合劑之目標序列包括基因體DNA之正股與負股（亦即既定序列及序列之反向互補序列），此係因為經RNA引導之DNA結合劑之核酸受質為雙股核酸。因此，在引導序列稱為「與目標序列互補」之情況下，應瞭解，引導序列可引導引導RNA以結合至目標序列之有義股或反義股（例如反向互補序列）。因此，在一些具體實例中，在引導序列結合目標序列之反向互補序列之情況下，引導序列與目標序列（例如不包括PAM之目標序列）之某些核苷酸一致，但其中在引導序列中改用U取代T。
如本文所用，「經RNA引導之DNA結合劑（RNA-guided DNA-binding agent）」意謂具有RNA及DNA結合活性之多肽或多肽複合物，或此類複合物之DNA結合次單元，其中DNA結合活性具有序列專一性且依賴於RNA之序列。術語經RNA引導之DNA結合劑亦包括編碼此類多肽之核酸。例示性經RNA引導之DNA結合劑包括Cas裂解酶/切口酶。舉例而言，若例示性經RNA引導之DNA結合劑例如經由與FokI裂解酶域融合進行改質以允許DNA裂解，則彼等藥劑可包括其不活化形式（「dCas DNA結合劑」）。如本文所用，「Cas核酸酶（Cas nuclease）」涵蓋Cas裂解酶及Cas切口酶。Cas裂解酶及Cas切口酶包括第III型CRISPR系統之Csm或Cmr複合物、其Cas10、Csm1或Cmr2次單元、第I型CRISPR系統之級聯複合物、其Cas3次單元及第2類Cas核酸酶。如本文所用，「第2類Cas核酸酶」為具有經RNA引導之DNA結合活性的單鏈多肽。若彼等藥劑經改質以允許DNA裂解，則第2類Cas核酸酶包括第2類Cas裂解酶/切口酶（例如H840A、D10A或N863A變異體），其進一步具有經RNA引導之DNA裂解酶或切口酶活性，及第2類dCas DNA結合劑，其中裂解酶/切口酶活性未活化）。第2類Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9（例如N497A、R661A、Q695A、Q926A變異體）、HypaCas9（例如N692A、M694A、Q695A、H698A變異體）、eSPCas9(1.0)（例如K810A、K1003A、R1060A變異體）及eSPCas9(1.1)（例如K848A、K1003A、R1060A變異體）蛋白質及其變體。Cpf1蛋白質（Zetsche等人, Cell, 163: 1-13 (2015)）亦含有類RuvC核酸酶域。Zetsche之Cpf1序列以全文引用之方式併入。參見例如Zetsche，表S1及表S3。參見例如Makarova等人,Nat Rev Microbiol , 13(11): 722-36 (2015)；Shmakov等人,Molecular Cell , 60:385-397 (2015)。如本文所用，經RNA引導之DNA結合劑（例如Cas核酸酶、Cas9核酸酶或釀膿鏈球菌Cas9核酸酶）之遞送包括多肽或mRNA之遞送。
如本文所用，「核糖核蛋白」（ribonucleoprotein，RNP）或「RNP複合物（RNP complex）」係指引導RNA以及經RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas核酸酶，例如Cas裂解酶、Cas切口酶、Cas9裂解酶或Cas9切口酶。在一些具體實例中，引導RNA將諸如Cas9之經RNA引導之DNA結合劑引導至目標序列，且引導RNA與目標序列雜合且該藥劑結合至目標序列；且結合之後可進行裂解或切口。
如本文所用，若第一序列與第二序列之比對表明整個第二序列之X%或更多之位置與第一序列匹配，則第一序列視為「包含與第二序列具有至少X%一致性之序列」。舉例而言，序列AAGA包含與序列AAG具有100%一致性之序列，原因為由於第二序列之全部三個位置均存在匹配，因此比對將得到100%一致性。RNA與DNA之間的差異（一般而言，尿苷交換為胸苷或反之亦然）及核苷類似物（諸如經修飾之尿苷）的存在不會造成聚核苷酸之間一致性或互補性的差異，只要相關核苷酸（諸如胸苷、尿苷或經修飾之尿苷）具有相同互補序列（例如對於胸苷、尿苷或經修飾之尿苷全體而言，為腺苷；另一實例為胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶，兩者具有鳥苷或經修飾之鳥苷作為互補序列）。因此，舉例而言，序列5'-AXG（其中X為任何經修飾之尿苷，諸如假尿苷、N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷）視為與AUG具有100%一致性，因為兩者與同一序列（5'-CAU）完全互補。例示性比對演算法為所屬領域中熟知的史密斯-沃特曼（Smith-Waterman）及尼德曼-翁施（Needleman-Wunsch）演算法。所屬領域的技術人員將理解何種演算法選擇及參數設置適合於待比對之既定序列對；對於具有一般類似長度及針對胺基酸之＞50%預期一致性或針對核苷酸之＞75%預期一致性的序列而言，由EBI於www.ebi.ac.uk網站伺服器提供的尼德曼-翁施演算法介面之具有默認設置的尼德曼-翁施演算法通常為合適的。
如本文所用，若第一序列之X%之鹼基與第二序列鹼基配對，則第一序列視為「與第二序列X%互補」。舉例而言，第一序列5'AAGA3'與第二序列3'TTCT5'100%互補，且第二序列與第一序列100%互補。在一些具體實例中，第一序列5'AAGA3'與第二序列3'TTCTGTGA5'100%互補，然而第二序列與第一序列50%互補。
「mRNA」在本文中用以指一種聚核苷酸，其完全或主要為RNA或經修飾之RNA且包含可轉譯成多肽之開放閱讀框架（亦即可充當受質供核糖體及胺基醯化tRNA轉譯）。mRNA可包含磷酸酯-糖主鏈，其包括核糖殘基或其類似物，例如2'-甲氧基核糖殘基。在一些具體實例中，mRNA磷酸酯-糖主鏈之糖基本上由核糖殘基、2'-甲氧基核糖殘基或其組合組成。mRNA之鹼基可為諸如假尿苷、N-1-甲基-假尿苷之經修飾之鹼基或其他天然產生之鹼基或非天然產生之鹼基。
適用於本文所述之組成物及方法中之例示性引導序列示於表1中及整個申請案中。
如本文所用，「插入缺失（indel）」係指由多種核苷酸組成之插入/缺失突變，該等核苷酸在目標核酸中之雙股斷裂（double-stranded break，DSB）位點處進行插入或缺失。
如本文所用，「多肽」係指野生型蛋白質或變異型蛋白質（例如突變體、片段、融合體或其組合）。變異型多肽可具有野生型多肽之至少或約5%、10%、15%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%功能活性。在一些具體實例中，變異體與野生型多肽之序列至少70%、75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些具體實例中，變異型多肽可為高度活化變異體。在某些情況下，變異體具有野生型多肽之約80%與約120%、140%、160%、180%、200%、300%、400%、500%或更多之間的功能活性。
如本文所用，「異源基因（heterologous gene）」係指已作為外源性來源引入至宿主細胞基因體內之位點（例如在基因體基因座處，諸如安全港基因座，包括白蛋白內含子1位點）的基因。亦即，所引入之基因就其插入位點而言為異源的。自此類異源基因表現之多肽稱為「異源多肽」。異源基因可為天然產生或經工程改造的，且可為野生型或變異體。異源基因可包括除編碼異源多肽之序列（例如內部核糖體進入位點）以外之核苷酸序列。異源基因可為在宿主基因體中天然產生之基因，呈野生型或變異體（例如突變體）。舉例而言，儘管宿主細胞含有所關注之基因（呈野生型或呈變異體），但相同基因或其變異體可作為外源性來源引入以用於例如在基因座表現，該表現為高度表現。異源基因亦可為並非在宿主基因體中天然產生或表現並非在宿主基因體中天然產生之異源多肽的基因。「異源基因」、「外源性基因（exogenous gene）」及「轉殖基因（transgene）」可互換使用。在一些具體實例中，異源基因或轉殖基因包括外源性核酸序列，例如對於接受者細胞並非內源性之核酸序列。在某些具體例中，異源基因並非在接受者細胞中天然產生。舉例而言，異源基因相對於其插入位點且相對於其接受者細胞可為異源的。
如本文所用，「目標序列」係指目標基因中與gRNA之引導序列互補的核酸序列。目標序列與引導序列之相互作用引導經RNA引導之DNA結合劑結合，且在目標序列內潛在地切口或裂解（視試劑活性而定）。
如本文所用，「雙向核酸構築體」（在本文中可互換地稱為「雙向構築體」）包含至少兩個核酸區段，其中一個區段（第一區段）包含編碼所關注藥劑之編碼序列（編碼序列在本文中可稱為「轉殖基因」或第一轉殖基因），而另一區段（第二區段）包含其中序列之互補序列編碼所關注藥劑之序列或第二轉殖基因。藥劑可為諸如多肽、功能性RNA、mRNA或其類似物之治療劑。轉殖基因可編碼諸如多肽、功能性RNA或mRNA之藥劑。在一些具體實例中，雙向核酸構築體包含至少兩個核酸區段，其中一個區段（第一區段）包含編碼所關注多肽之編碼序列，而另一區段（第二區段）包含其中序列之互補序列編碼所關注多肽之序列或第二轉殖基因。亦即，至少兩個區段可編碼相同或不同多肽或相同或不同藥劑。當兩個區段編碼相同多肽時，第一區段之編碼序列無需與第二區段之序列的互補序列一致。在一些具體實例中，第二區段之序列為第一區段之編碼序列之反向互補序列。雙向構築體可為單股或雙股的。本文所揭示之雙向構築體涵蓋能夠表現任何所關注多肽之構築體。雙向構築體適用於轉殖基因序列之基因體插入，詳言之轉殖基因之靶向插入。
如本文所用，「反向互補序列」係指作為參考序列之互補序列的序列，其中互補序列以反向位向書寫。舉例而言，對於假想序列5' CTGGACCGA 3'（SEQ ID NO: 500），「完全」互補序列為3' GACCTGGCT 5'（SEQ ID NO: 501）且「完全」反向互補序列寫為5' TCGGTCCAG 3'（SEQ ID NO: 502）。反向互補序列無需為「完全」的，且仍可編碼與參考序列相同的多肽或類似的多肽。由於密碼子用法冗餘，反向互補序列可不同於編碼相同多肽之參考序列。如本文所用，「反向互補序列」亦包括與參考序列之反向互補序列例如30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之序列。
在一些具體實例中，雙向核酸構築體包含有：第一區段，其包含編碼第一多肽之編碼序列（第一轉殖基因），及第二區段，其包含其中序列之互補序列編碼第二多肽之序列（第二轉殖基因）。在一些具體實例中，第一及第二多肽至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。在一些具體實例中，第一及第二多肽包含例如在50、100、200、500、1000或更多個胺基酸殘基上至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。    II.   雙向核酸構築體
本文描述促使增強之插入（例如增強富有成效的插入）及表現所關注基因之雙向核酸構築體。簡言之，多種本文所揭示之雙向構築體包含至少兩個核酸區段，其中一個區段（第一區段）包含編碼所關注藥劑（例如異源基因）之編碼序列（編碼序列在本文中可稱為「轉殖基因」或第一轉殖基因），而另一區段（第二區段）包含其中之互補序列編碼所關注藥劑（例如異源基因）之序列或第二轉殖基因。藥劑可為諸如多肽、功能性RNA、mRNA或其類似物之治療劑。轉殖基因可編碼諸如多肽、功能性RNA、mRNA或轉錄因子之藥劑。在一些具體實例中，編碼序列編碼諸如多肽或功能性RNA之治療劑。至少兩個區段可編碼相同或不同多肽或相同或不同藥劑。在一些具體實例中，本文所揭示之雙向構築體包含至少兩個核酸區段，其中一個區段（第一區段）包含編碼所關注多肽之編碼序列，而另一區段（第二區段）包含其中序列之互補序列編碼所關注多肽之序列。
在一個具體實例中，雙向構築體包含至少兩個順式核酸區段，其中一個區段（第一區段）包含編碼序列（有時在本文中可互換地稱為「轉殖基因」），而另一區段（第二區段）包含其中序列之互補序列編碼轉殖基因之序列。第一轉殖基因及第二轉殖基因可相同或不同。雙向構築體可包含至少兩個順式核酸區段，其中一個區段（第一區段）在一個位向包含編碼異源基因之編碼序列，而另一區段（第二區段）在另一位向包含其中其互補序列編碼異源基因之序列。亦即，第一區段為第二區段之互補序列（不一定為完全互補序列）；第二區段之互補序列為第一區段之反向互補序列（不一定為完全反向互補序列，但兩者均編碼同一異源蛋白質）。雙向構築體可包含編碼與剪接受體連接之異源基因之第一編碼序列及其中互補序列在另一位向編碼異源基因、亦與剪接受體連接之第二編碼序列。
如本文所用，此類構築體有時稱為「供體構築體/模板」。在一些具體實例中，構築體為DNA構築體。設計及進行對供體構築體之多種功能/結構修飾之方法在所屬領域中已知。在一些具體實例中，構築體可包含聚腺苷酸化尾序列、聚腺苷酸化信號序列、剪接接受位或可選標記中之任何一或多者。在一些具體實例中，聚腺苷酸化尾序列在編碼序列之3'端編碼，例如作為「poly-A」鏈段。
當與如本文所描述之基因編輯系統組合使用時，核酸構築體之雙向性允許在目標插入位點內在任一方向插入（不限於在一個方向上插入）構築體，允許從以下中之任一者表現所關注多肽：a）一個區段（例如在圖1之左上方ssAAV構築體中編碼「人類F9」之左區段）之編碼序列，或b）另一區段之互補序列（例如在圖1之左上方ssAAV構築體中倒置之指定編碼「人類F9」之右區段之互補序列），由此如本文所例示增強插入及表現效率。由基因編輯系統靶向之裂解可促使構築體整合及/或轉殖基因表現。在本發明之實踐中可使用多種已知基因編輯系統，包括例如位點專一性DNA裂解系統，包括CRISPR/Cas系統；鋅指核酸酶（ZFN）系統；或類轉錄活化因子效應物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）系統。
在一些具體實例中，雙向核酸構築體不包含驅動藥劑或多肽表現之啟動子。舉例而言，多肽之表現藉由宿主細胞之啟動子（例如當轉殖基因整合至宿主細胞之白蛋白基因座中時之內源性白蛋白啟動子）驅動。
在一些具體實例中，雙向核酸構築體包含含有多肽之編碼序列的第一區段，及包含多肽之編碼序列之反向互補序列的第二區段對於非多肽藥劑，亦如此。因此，第一區段中之編碼序列能夠表現多肽，而第二區段中之反向互補序列之互補序列亦能夠表現多肽。當提及包含反向互補序列之第二區段時，如本文所使用之「編碼序列（coding sequence）」係指第二區段之互補（編碼）股（亦即第二區段中之反向互補序列之互補編碼序列）。
在一些具體實例中，第一區段中之編碼多肽A之編碼序列與亦編碼多肽A之編碼序列之反向互補序列具有少於100%互補性。亦即，在一些具體實例中，第一區段包含多肽A之編碼序列（1），且第二區段為多肽A之編碼序列（2）之反向互補序列，其中編碼序列（1）與編碼序列（2）不一致。舉例而言，編碼多肽A之編碼序列（1）及/或編碼序列（2）可利用不同密碼子。在一些具體實例中，一或兩個序列可經密碼子最佳化以使得編碼序列（1）與編碼序列（2）之反向互補序列具有100%或少於100%互補性。在一些具體實例中，第二區段之編碼序列編碼多肽，該編碼序列使用用於由第一區段中之編碼序列編碼之相同多肽之一或多個胺基酸之一或多個替代密碼子實現。如本文所用，「替代密碼子（alternative codon）」係指用於既定胺基酸之密碼子用法之變化形式，且可為或可不為用於既定表現系統之較佳或最佳密碼子（經密碼子最佳化）。較佳密碼子用法或在既定表現系統中良好容許之密碼子在所屬領域中已知。
在一些具體實例中，第二區段包含採用與第一區段之編碼序列不同之密碼子用法的反向互補序列以便減少髮夾結構形成。此類反向互補序列與少於第一區段中之編碼序列之全部核苷酸形成鹼基對，其又視需要編碼相同多肽。在此類情況下，第一區段之例如針對多肽A之編碼序列可與例如針對雙向構築體後半之多肽A之編碼序列具有同源性，但不一致。在一些具體實例中，第二區段包含未與第一區段中之編碼序列大幅互補（例如不超過70%互補）之反向互補序列。在一些具體實例中，第二區段包含與第一區段中之編碼序列高度互補（例如至少90%互補）之反向互補序列。在一些具體實例中，第二區段包含與第一區段中之編碼序列具有至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%或約99%互補性之反向互補序列。
在一些具體實例中，第二區段包含與第一區段中之編碼序列具有100%互補性之反向互補序列。亦即，第二區段中之序列為第一區段中之編碼序列之完全反向互補序列。舉例而言，第一區段包含假想序列5' CTGGACCGA 3'（SEQ ID NO: 500），且第二區段包含SEQ ID NO: 1之反向互補序列，亦即5' TCGGTCCAG 3'（SEQ ID NO: 502）。
在一些具體實例中，雙向核酸構築體包含含有多肽或藥劑（例如第一多肽）之編碼序列之第一區段及包含多肽或藥劑（例如第二多肽）之編碼序列之反向互補序列之第二區段。在一些具體實例中，如上文所述，第一多肽及第二多肽為相同的。在一些具體實例中，如上文所述，第一治療劑及第二治療劑為相同的。在一些具體實例中，第一多肽及第二多肽為不同的。在一些具體實例中，第一治療劑及第二治療劑為不同的。舉例而言，第一多肽為多肽A，而第二多肽為多肽B。作為另一實例，第一多肽為多肽A，且第二多肽為多肽A之變異體（例如片段（諸如功能片段）、突變體、融合體（包括在多肽端處添加少至一個胺基酸）或其組合）。編碼多肽之編碼序列可視需要包含一或多個額外之連結至該多肽之序列，諸如編碼胺基端或羧基端胺基酸序列之序列，諸如信號序列、標記序列（例如HiBit）或異源功能序列（例如核定位序列（NLS）或自裂解肽）。編碼多肽之編碼序列可視需要包含編碼一或多個胺基端信號肽序列之序列。此等額外序列中之各者可在構築體之第一區段及第二區段中相同或不同。
本文所描述之雙向構築體可用於根據本文所揭示之方法表現任何多肽。在一些具體實例中，多肽為經分泌之多肽。在一些具體實例中，多肽為其中其功能通常以經分泌之多肽形式實現（例如具功能活性）之多肽。如本文所使用之「經分泌之多肽（secreted polypeptide）」係指由細胞分泌及/或以可溶性細胞外蛋白質形式具功能活性之蛋白質。
在一些具體實例中，多肽為細胞內多肽。在一些具體實例中，多肽為其中其功能通常在細胞內部實現（例如具功能活性）之多肽。如本文所使用之「細胞內多肽（intracellular polypeptide）」係指包括可溶性細胞溶質多肽之不由細胞分泌之蛋白質。
在一些具體實例中，多肽為野生型多肽。
在一些具體實例中，多肽為肝蛋白質或其變異體。如本文所使用之「肝蛋白質（liver protein）」為例如在肝中內源性產生及/或在肝中具功能活性之蛋白質。在一些具體實例中，肝蛋白為由肝產生之循環蛋白質或其變異體。在一些具體實例中，肝蛋白質為在肝中具功能活性之蛋白質或其變異體。在一些具體實例中，相較於一或多種其他組織類型，肝蛋白質在肝中展現增多之表現。在一些具體實例中，多肽為非肝蛋白質。在一些具體實例中，多肽包括（但不限於）因子IX及其變異體。
在一些具體實例中，雙向核酸構築體為線性的。舉例而言，第一區段及第二區段以線性方式經由連接序列接合。在一些具體實例中，包含反向互補序列之第二區段之5'端連接至第一區段之3'端。在一些具體實例中，第一區段之5'端連接至包含反向互補序列之第二區段之3'端。在一些具體實例中，連接序列之長度為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、500、1000、1500、2000或更多個核苷酸。如所屬領域中具通常知識者所瞭解，可在第一區段與第二區段之間插入除連接序列之外或代替連接序列之其他結構元素。
本文所揭示之構築體可經修飾以視任何特定用途及/或賦予一或多種所需功能需要而包括任何適合之結構特徵。在一些具體實例中，本文所揭示之雙向核酸構築體不包含同源臂。在一些具體實例中，本文所揭示之雙向核酸構築體為非同源依賴性供體構築體。在一些具體實例中，部分由於核酸構築體之雙向功能，可將雙向構築體如本文所述以任一方向（位向）插入至基因體基因座中以允許有效地插入及/或表現所關注多肽。在一些具體實例中，雙向核酸構築體包括各自具有轉殖基因上游之剪接受體之第一區段及第二區段。在某些具體實例中，剪接受體與例如人類白蛋白基因之內含子1之剪接供體的宿主細胞之安全港位點之剪接供體序列相容。
在一些具體實例中，本文所描述之組成物包含一或多個內部核糖體入口位點（IRES）。首次鑑別為小RNA病毒（Picorna virus RNA）之特點，IRES在不存在5'帽結構之情況下引發蛋白質合成中發揮重要作用。IRES可充當唯一核糖體結合位點，或可充當多核苷酸之多個核糖體結合位點中之一者。含有超過一個功能核糖體結合位點之構築體可編碼由核糖體（「多順反子核酸分子」）獨立地轉譯之若干肽或多肽。或者，構築體可包含IRES以便表現不與內源多肽（亦即白蛋白信號肽）融合之異源蛋白質。可利用之IRES序列之實例包括（但不限於）來自以下之IRES序列：小核糖核酸病毒（例如FMDV）、有害生物病毒（CFFV）、脊髓灰質炎病毒（polio virus；PV）、腦心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus；ECMV）、口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus；FMDV）、C型肝炎病毒（hepatitis C virus；HCV）、經典豬瘟病毒（classical swine fever virus；CSFV）、鼠白血病病毒（murine leukemia virus；MLV）、猴免疫缺陷病毒（simian immune deficiency virus；SIV）或蟋蟀麻痹病毒（cricket paralysis virus；CrPV）。
在一些具體實例中，核酸構築體包含諸如2A序列或類2A序列之編碼自裂解肽之序列。在一些具體實例中，自裂解肽位於所關注多肽之上游。在一個具體實例中，編碼2A肽之序列可用於分離兩個或更多個所關注多肽之編碼區。在另一具體實例中，此序列可用於從構築體分離編碼序列且從內源基因座分離編碼序列（亦即內源白蛋白信號序列）。作為非限制性實例，編碼2A肽之序列可介於A區與B區之間（A-2A-B）。2A肽之存在應致使一個長蛋白質裂解成蛋白A、蛋白B及2A肽中。蛋白質A及蛋白質B可與所關注多肽相同或不同。
在一些具體實例中，第一區段及第二區段中之一或兩者包含聚腺苷酸化尾序列及/或開放閱讀框架下游之聚腺苷酸化信號序列。在一些具體實例中，聚腺苷酸化尾序列在第一區段及/或第二區段之3'端處經編碼，例如作為「poly-A」鏈段。在一些具體實例中，由於有在第一區段及/或第二區段之3'端處或附近經編碼之聚腺苷酸化信號序列，故聚腺苷酸化尾序列以共轉錄方式提供。在一些具體實例中，poly-A尾包含至少20、30、40、50、60、70、80、90或100個腺嘌呤，視需要至多300個腺嘌呤。在一些具體實例中，poly-A尾包含95、96、97、98、99或100個腺嘌呤核苷酸。設計適合之聚腺苷酸化尾序列及/或聚腺苷酸化信號序列之方法在所屬領域中熟知。本文揭示且例示適合之剪接受體序列，包括小鼠白蛋白及人類FIX剪接接受位。在一些具體實例中，聚腺苷酸化信號序列AAUAAA（SEQ ID NO: 800）通常用於哺乳動物系統中，但已鑑別變異體，諸如UAUAAA（SEQ ID NO:801）或AU/GUAAA(SEQ ID NO: 802）。參見例如NJ Proudfoot, Genes & Dev. 25(17):1770-82, 2011。在一些具體實例中，包括polyA尾序列。
在一些具體實例中，本文所揭示之構築體可為單股、雙股或部分單股及部分雙股之DNA或RNA，且可以線性或圓形（例如微型環）形式引入至宿主細胞中。參見例如美國專利公開案第2010/0047805號、第2011/0281361號及第2011/0207221號。若以線性形式引入，則可藉由所屬領域中具通常知識者已知之方法使供體序列之末端受到保護（例如免受核酸外切降解）。舉例而言，將一或多個雙去氧核苷酸殘基添加至線性分子之3'端中，及/或使自補寡核苷酸與一或兩個端接合。參見例如Chang等人(1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963；Nehls等人 (1996)Science 272:886-889。用於保護外源性聚核苷酸免受降解之額外方法包括（但不限於）添加末端胺基及使用諸如硫代磷酸酯、胺基磷酸酯及O-甲基核糖或去氧核糖殘基之經修飾之核苷酸間鍵聯。
在一些具體實例中，可插入構築體以使得其表現由插入位點處之內源啟動子（例如當將供體整合至宿主細胞之白蛋白基因座中時，為內源白蛋白啟動子）驅動。在此類情況下，轉殖基因可缺乏驅動其表現之控制元素（例如啟動子及/或增強子）（例如無啟動子構築體）。然而，顯然地，在其他情況下，構築體可包含在整合後驅動功能蛋白表現之啟動子及/或增強子，例如組成性啟動子或可誘導或組織專一性（例如肝專一性或血小板專一性）啟動子。構築體可包含處於編碼信號肽之信號序列下游且與其可操作地連接的編碼異源蛋白質之序列。
在一些具體實例中，核酸構築體在編碼異源多肽之核酸之非同源依賴性插入中起作用。在一些具體實例中，核酸構築體在例如其中NHEJ（非HR）為修復雙股DNA斷裂之初級機制之細胞的非分裂細胞中起作用。核酸可為非同源依賴性供體構築體。舉例而言，構築體可為單股或雙股DNA。在一些具體實例中，核酸可如本文所述經修飾（例如使用核苷類似物）。
在一些具體實例中，本文所揭示之構築體包含處於構築體之任一端或兩端，例如第一區段及/或第二區段中之開放閱讀框架之5'或一或兩個轉殖基因序列之5'上之剪接接受位。在一些具體實例中，剪接接受位包含NAG。在其他具體實例中，剪接接受位由NAG組成。在一些具體實例中，剪接受體為白蛋白剪接受體，例如用於將白蛋白之外顯子1及2剪接在一起之白蛋白剪接受體。在一些具體實例中，剪接受體來源於人類白蛋白基因。在一些具體實例中，剪接受體來源於小鼠白蛋白基因。在一些具體實例中，剪接受體為F9（或「FIX」）剪接受體，例如用於將F9之外顯子1及2剪接在一起之F9剪接受體。在一些具體實例中，剪接受體來源於人類F9基因。在一些具體實例中，剪接受體來源於小鼠F9基因。適用於真核生物中之包括人工剪接受體之額外適合之剪接接受位為已知的且可來源於所屬技術領域。參見例如Shapiro等人, 1987, Nucleic Acids Res., 15, 7155-7174，Burset等人, 2001, Nucleic Acids Res., 29, 255-259。
在一些具體實例中，本文所揭示之構築體可在任一端或兩端經修飾以視需要及/或賦予一或多種功能益處需要包括一或多個適合之結構特徵。舉例而言，結構修飾可視用以將本文所揭示之構築體遞送至宿主細胞中之方法而變化，例如使用病毒載體遞送或封裝於用於遞送之脂質奈米粒子中。此類修飾包含（但不限於）例如末端結構，諸如反向末端重複序列（ITR）、髮夾、環及其他結構，諸如螺環。在一些具體實例中，本文所揭示之構築體包含一個、兩個或三個ITR。在一些具體實例中，本文所揭示之構築體包含不超過兩個ITR。多種結構修飾方法在所屬領域中已知。
在一些具體實例中，可藉由所屬領域中已知之方法使構築體之一或兩個末端受到保護（例如免受核酸外切降解）。舉例而言，將一或多個雙去氧核苷酸殘基添加至線性分子之3'端中，及/或使自補寡核苷酸與一或兩個端接合。參見例如Chang等人(1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963；Nehls等人 (1996)Science 272:886-889。用於保護構築體免受降解之額外方法包括（但不限於）添加末端胺基及使用諸如硫代磷酸酯、胺基磷酸酯及O-甲基核糖或去氧核糖殘基之經修飾之核苷酸間鍵聯。
在一些具體實例中，可將本文所揭示之構築體引入至細胞中作為具有諸如複製起始序列、啟動子及編碼耐抗生素性之基因之額外序列之載體的一部分。構築體可略去病毒元素。在一些具體實例中，構築體可以裸核酸形式、以與諸如脂質體、聚合物或泊洛沙姆（poloxamer）之藥劑複合之核酸形式引入，或可藉由病毒載體（例如腺病毒、AAV、疱疹病毒、反轉錄病毒、慢病毒）來遞送。
在一些具體實例中，儘管不需要用於表現，但本文所揭示之構築體亦可包括例如啟動子、增強子、絕緣子、內部核糖體入口位點、編碼肽之序列及/或聚腺苷酸化信號之轉錄或轉譯調節序列。
在一些具體實例中，包含針對所關注多肽之編碼序列之構築體可包括以下修飾中之一或多者：密碼子優化（例如針對人類密碼子）及/或一或多個糖基化位點添加。參見例如McIntosh等人 (2013)Blood (17):3335-44。    III. 基因編輯系統
在本發明之實踐中可使用多種已知基因編輯系統，包括例如CRISPR/Cas系統；鋅指核酸酶（ZFN）系統；及類轉錄活化因子效應物核酸酶（TALEN）系統。一般而言，此等方法可涉及使用經工程改造之裂解系統以誘導目標DNA序列中之雙股斷裂（DSB）或切口（例如單股斷裂或SSB）。裂解或切口可經由使用諸如經工程改造之ZFN、TALEN之專一性核酸酶進行，或使用CRISPR/Cas系統用經工程改造之引導RNA以引導目標DNA序列之專一性裂解或切口。另外，靶向核酸酶已基於且額外核酸酶正基於Argonaute系統進行開發（例如來自T. thermophilus, 稱為『TtAgo』，參見Swarts等人 (2014) Nature 507(7491): 258-261），其亦可具有用於基因體編輯及基因療法之可能。
在一些具體實例中，CRISPR/Cas系統可用以在宿主基因體內在所需基因座產生插入位點，在該位點處可插入本文所揭示之雙向構築體以表現一或多種異所關注多肽。設計靶向用於插入之宿主基因體之任何所需基因座之適合之引導RNA之方法在所屬領域中已熟知。包含轉殖基因之雙向構築體相對於其插入位點可為異源的，例如將異源轉殖基因插入至「安全港」基因座中。包含轉殖基因之雙向構築體相對於其插入位點可為非異源的，例如將野生型轉殖基因插入至其內源性基因座中。
「安全港（safe harbor）」基因座為基因體內之基因座，其中可插入外源核酸而對例如肝細胞之宿主細胞並無顯著有害作用，例如不產生細胞凋亡、壞死及/或衰老，或不產生與對照細胞相比超過5%、10%、15%、20%、25%、30%或40%之細胞凋亡、壞死及/或衰老。參見例如Hsin等人, 「Hepatocyte death in liver inflammation, fibrosis, and tumorigenesis」, 2017。在一些具體實例中，安全港基因座允許外源性核酸（例如外源性基因）表現而對諸如肝細胞（hepatocyte）或肝臟細胞（liver cell）之宿主細胞或細胞群並無顯著有害作用，例如不產生細胞凋亡、壞死及/或衰老，或不產生與對照細胞相比超過5%、10%、15%、20%、25%、30%或40%之細胞凋亡、壞死及/或衰老。安全港可在白蛋白基因內，諸如在人類白蛋白基因內。安全港可在白蛋白內含子1區域內，例如在人類白蛋白內含子1內。安全港可為例如肝組織或肝細胞宿主細胞之人類安全港。核酸酶所靶向之安全港基因座之非限制性實例包括CCR5、HPRT、AAVS1、Rosa、白蛋白、AAVS1（PPP1 R12C）、AngptiS、ApoC3、ASGR2、FIX (F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、SERPINAl、TF及TT。參見例如美國專利第7,951,925號及第8,110,379號；美國公開案第2008/0159996號；第2010/00218264號；第2012/0017290號；第2011/0265198號；第2013/0137104號；第2013/0122591號；第2013/0177983號；第2013/0177960號；及第WO 2017093804號。如本文中所例示，在一些具體實例中，引導RNA可經設計以靶向人類或小鼠白蛋白基因座（例如內含子1）。本文中所例示之引導RNA之實例示於表5至10中。將瞭解，對於根據本發明方法插入包含轉殖基因之雙向構築體亦可靶向任何其他基因座。
在一些具體實例中，異源基因可插入至安全港基因座中且使用該安全港基因座之內源性信號序列，例如由外顯子1編碼之白蛋白信號序列。舉例而言，編碼序列可插入至人類白蛋白內含子1中以使得其位於人類白蛋白外顯子1之信號序列下游且與其融合。
在一些具體實例中，基因可包含其自身信號序列，可插入至安全港基因座中，且可進一步使用安全港基因座之內源性信號序列。舉例而言，包含其原生信號序列之編碼序列可插入至人類白蛋白內含子1中以使得其位於由外顯子1編碼之人類白蛋白之信號序列之下游且與其融合。
在一些具體實例中，基因可包含其自身信號序列及內部核糖體進入位點（internal ribosomal entry site，IRES），可插入至安全港基因座中，且可進一步使用安全港基因座之內源性信號序列。舉例而言，包含其原生信號序列及IRES序列之編碼序列可插入至人類白蛋白內含子1中以使得其位於由外顯子1編碼之人類白蛋白之信號序列之下游且與其融合。
在一些具體實例中，基因可包含其自身信號序列及IRES，可插入至安全港基因座中，且不使用安全港基因座之內源性信號序列。舉例而言，可將包含其原生信號序列及IRES序列之編碼序列插入人類白蛋白內含子1中以使得其不與由外顯子1編碼之人類白蛋白之信號序列融合。在此等具體實例中，蛋白質係從IRES位點轉譯且不為可有利地為非免疫原性或低免疫原性之嵌合蛋白（例如與異源蛋白融合之白蛋白信號肽）。在一些具體實例中，蛋白質不進行細胞外分泌及/或輸送。
在一些具體實例中，基因可插入至安全港基因座中且可包含IRES且並非不使用任何信號序列。舉例而言，包含IRES序列且不包含原生信號序列之編碼序列可插入至人類白蛋白內含子1中以使得其不與由外顯子1編碼之人類白蛋白之信號序列融合。在一些具體實例中，蛋白質在不具有任何信號序列之情況下從IRES位點轉譯。在一些具體實例中，蛋白質不進行細胞外分泌及/或輸送。
亦應瞭解，用於Cas核酸酶（諸如可用於本發明方法中之Cas9核酸酶）之引導RNA可包括多種已知變化形式及修飾（例如化學修飾）中之任一者，包括替代或外加典型A、G、C及U殘基使用之一或多種非天然及/或天然產生之組分或組態之存在。舉例而言，本文（表5至10）中所例示之引導序列中之各者可進一步包含額外核苷酸以例如自SpyCas9 CRISPR/Cas系統形成crRNA、引導RNA及/或sgRNA。舉例而言，本文（表5至10）中所例示之引導序列中之各者可進一步包含額外核苷酸以形成crRNA或sgRNA，在其3'端處之引導序列後具有以下例示性核苷酸序列：在5'至3'位向之GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG（SEQ ID NO: 200）。在sgRNA之情況下，引導序列（諸如表5至10中所列舉之引導序列）可進一步包含額外核苷酸以形成sgRNA，例如在引導序列之3'端後具有以下例示性核苷酸序列（SpyCas9引導序列）：在5'至3'位向之GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU（SEQ ID NO: 201）或GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC（SEQ ID NO: 202）。
引導RNA可視需要包含trRNA。在本文所述之各組成物及方法具體實例中，crRNA及trRNA可以單RNA（sgRNA）締合或可位於個別RNA（dgRNA）上。在sgRNA之情形下，crRNA及trRNA組分可例如經由磷酸二酯鍵或其他共價鍵共價連接。在一些具體實例中，sgRNA在核苷酸之間包含一或多個不為磷酸二酯鍵聯之鍵聯。在本文所述之組成物、用途及方法具體實例中之各者中，引導RNA可包含呈「雙引導RNA」或「dgRNA」形式之兩個RNA分子。dgRNA包含含有crRNA之第一RNA分子，該crRNA包含例如表5至10中之任一者中所示之引導序列，及包含trRNA之第二RNA分子。第一及第二RNA分子可非共價連接，但可經由crRNA與trRNA之各部分之間的鹼基配對形成RNA雙螺旋體。
在一些具體實例中，本文所揭示之引導RNA結合至前間隔序列相鄰基元（propospacer adjacent motif，PAM）上游之區域。如所屬領域中具通常知識者所理解，PAM序列出現於與含有目標序列之股相對的股上。亦即，PAM序列位於目標股之互補股（含有結合引導RNA之目標序列之股）上。在一些具體實例中，PAM選自由以下者組成之群：NGG、NNGRRT、NNGRR(N)、NNAGAAW、NNNNG(A/C)TT及NNNNRYAC。在一些具體實例中，PAM為NGG。
在一些具體實例中，本文提供之引導RNA序列與相鄰於PAM序列之序列互補。
在一些具體實例中，引導RNA序列包含與根據人類參考基因體hg38座標選自本文中各表的基因體區域內之序列互補之序列。在一些具體實例中，引導RNA序列包含與包含來自選自表5至10之基因體區域內之5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個連續核苷酸的序列互補之序列。在一些具體實例中，引導RNA序列包含與包含跨越選自表5至10之基因體區域之5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個連續核苷酸序列互補之序列。
本文所揭示之引導RNA介導產生雙股斷裂（DSB）之目標專一性切割。本文所揭示之引導RNA介導產生單股斷裂（SSB或切口）之目標專一性切割。
所屬領域中亦熟知使用多種經RNA引導之DNA結合劑（例如核酸酶，諸如Cas核酸酶，例如Cas9）之方法。儘管本文中例示使用具有CRISPR/Cas系統之雙向核酸，但將瞭解亦可使用系統之適合變化形式。將瞭解，視需要而定，經RNA引導之DNA結合劑可以核酸（例如DNA或mRNA）或以蛋白質形式提供。在一些具體實例中，可在已包含及/或表現經RNA引導之DNA結合劑之宿主細胞中實施本發明方法。
在一些具體實例中，諸如Cas9核酸酶之經RNA引導之DNA結合劑具有亦可稱為雙股核酸內切酶活性之裂解酶活性。在一些具體實例中，諸如Cas9核酸酶之經RNA引導之DNA結合劑具有亦可稱為單股核酸內切酶活性之切口酶活性。在一些具體實例中，經RNA引導之DNA結合劑包含Cas核酸酶。Cas核酸酶之實例包括釀膿鏈球菌、金黃色葡萄球菌（S . aureus ） 及其他原核生物（參見例如下一段落中之清單）之第II型CRISPR系統之Cas核酸酶及其變異或突變（例如經工程改造之、非天然產生、天然產生、或其他變異）型式。參見例如US2016/0312198 A1；US 2016/0312199 A1。
可衍生Cas核酸酶之非限制性例示性物種包括釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes ）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus ）、鏈球菌屬、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ）、無害李氏菌（Listeria innocua ）、加氏乳桿菌（Lactobacillus gasseri ）、新兇手弗朗西斯氏菌（Francisella novicida ）、產琥珀酸沃廉菌（Wolinella succinogenes ）、華德薩特菌（Sutterella wadsworthensis ）、伽馬變形菌（Gammaproteobacterium ）、奈瑟氏腦膜炎菌（Neisseria meningitidis ）、空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni ）、多殺巴斯德菌（Pasteurella multocida ）、產琥珀酸纖維桿菌（Fibrobacter succinogene ）、深紅紅螺菌（Rhodospirillum rubrum ）、達松維爾擬諾卡氏菌（Nocardiopsis dassonvillei ）、始旋鏈黴菌（Streptomyces pristinaespiralis ）、產綠色鏈黴菌（Streptomyces viridochromogenes ）、產綠色鏈黴菌、粉紅鏈孢囊菌（Streptosporangium roseum ）、粉紅鏈孢囊菌、嗜酸熱脂環桿菌（Alicyclobacillus acidocaldarius ）、假蕈狀芽孢桿菌（Bacillus pseudomycoides ）、砷還原芽孢桿菌（Bacillus selenitireducens ）、西伯利亞微小桿菌（Exiguobacterium sibiricum ）、戴白氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii ）、唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius ）、布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri ）、齒垢密螺旋體（Treponema denticola ）、海洋微顫菌（Microscilla marina ）、伯克霍爾德氏細菌（Burkholderiales bacterium ）、食萘單胞菌（Polaromonas naphthalenivorans ）、單胞菌屬（Polaromonas sp. ）、瓦氏鱷球藻（Crocosphaera watsonii ）、鱷球藻屬、銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa ）、聚球藻屬（Synechococcus sp. ）、阿拉伯糖醋桿菌（Acetohalobium arabaticum ）、根制氨菌（Ammonifex degensii ）、熱解纖維素菌（Caldicelulosiruptor becsci i）、金礦菌（Candidatus Desulforudis ）、肉毒梭菌（Clostridium botulinum ）、艱難梭菌（Clostridium difficile ）、大芬戈爾德菌（Finegoldia magna ）、嗜熱鹽鹼厭氧菌（Natranaerobius thermophilus ）、熱丙酸消化腸狀菌（Pelotomaculum thermopropionicum ）、嗜酸性喜溫硫桿菌（Acidithiobacillus caldus ）、嗜酸氧化亞鐵硫桿菌（Acidithiobacillus ferrooxidans ）、酒色異著色菌（Allochromatium vinosum ）、海桿菌屬、嗜鹽亞硝化球菌（Nitrosococcus halophilus ）、瓦氏亞硝化球菌（Nitrosococcus watsoni ）、遊海假交替單胞菌（Pseudoalteromonas haloplanktis ）、消旋纖線桿菌（Ktedonobacter racemifer ）、甲烷鹽菌（Methanohalobium evestigatum ）、 變異念珠藻（Anabaena variabilis ）、泡沫節球藻（Nodularia spumigena ）、念珠藻屬（Nostoc sp .）、極大節旋藻（Arthrospira maxima ）、鈍頂節旋藻（Arthrospira platensis ）、節旋藻屬、螺旋藻屬（Lyngbya sp. ）、原型微鞘藻（Microcoleus chthonoplastes ）、顫藻屬（Oscillatoria sp. ）、運動石袍菌（Petrotoga mobilis ）、非洲高熱桿菌（Thermosipho africanus ）、巴氏鏈球菌（Streptococcus pasteurianus ）、灰色奈瑟球菌（Neisseria cinerea ）、紅嘴鷗彎曲桿菌（Campylobacter lari ）、食清潔劑細小棒菌（Parvibaculum lavamentivorans ）、白喉棒狀桿菌（Corynebacterium diphtheria ）、胺基酸球菌屬（Acidaminococcus sp. ）、毛螺科菌（Lachnospiraceae bacterium ）ND2006及海洋無核氯菌（Acaryochloris marina ）。
在一些具體實例中，Cas核酸酶為來自釀膿鏈球菌之Cas9核酸酶。在一些具體實例中，Cas核酸酶為來自嗜熱鏈球菌之Cas9核酸酶。在一些具體實例中，Cas核酸酶為來自奈瑟氏腦膜炎菌之Cas9核酸酶。在一些具體實例中，Cas核酸酶為來自金黃色葡萄球菌之Cas9核酸酶。在一些具體實例中，Cas核酸酶為來自新兇手弗朗西斯氏菌之Cpf1核酸酶。在一些具體實例中，Cas核酸酶為來自胺基酸球菌屬之Cpf1核酸酶。在一些具體實例中，Cas核酸酶為來自毛螺科菌ND2006之Cpf1核酸酶。在其他具體實例中，Cas核酸酶為來自以下之Cpf1核酸酶：土拉熱弗朗西絲菌（Francisella tularensis ）、毛螺科菌、瘤胃溶纖維丁酸弧菌（Butyrivibrio proteoclasticus ）、佩氏細菌（Peregrinibacteria bacterium ）、帕庫氏菌（Parcubacteria bacterium ）、史密斯氏菌（Smithella ）、胺基酸球菌屬、白蟻甲烷支原體菌候選種（Candidatus Methanoplasma termitum ）、挑剔真桿菌（Eubacterium eligens ）、牛眼莫拉菌（Moraxella bovoculi ）、稻田鉤端螺旋體（ Leptospira inadai ）、狗口腔卟啉單胞菌（Porphyromonas crevioricanis ）、解糖腖普雷沃菌（Prevotella disiens ）或獼猴卟啉單胞菌（Porphyromonas macacae ）。在某些具體實例中，Cas核酸酶為來自胺基酸球菌屬或毛螺科菌之Cpf1核酸酶。
在一些具體實例中，gRNA連同經RNA引導之DNA結合劑一起稱為核糖核蛋白複合物（ribonucleoprotein complex；RNP）。在一些具體實例中，經RNA引導之DNA結合劑為Cas核酸酶。在一些具體實例中，gRNA連同Cas核酸酶一起稱為Cas RNP。在一些具體實例中，RNP包含第I型、第II型或第III型組分。在一些具體實例中，Cas核酸酶為來自第II型CRISPR/Cas系統之Cas9蛋白質。在一些具體實例中，gRNA連同Cas9一起稱作Cas9 RNP。
野生型Cas9具有兩個核酸酶域：RuvC及HNH。RuvC域裂解非目標DNA股，且HNH域裂解目標DNA股。在一些具體實例中，Cas9蛋白質包含多於一個RuvC域及/或多於一個HNH域。在一些具體實例中，Cas9蛋白質為野生型Cas9。在組成物、用途及方法具體實例中之各者中，Cas誘導目標DNA中之雙股斷裂。
在一些具體實例中，使用嵌合Cas核酸酶，其中該蛋白質之一個域或區經不同蛋白質之一部分置換。在一些具體實例中，Cas核酸酶域可經來自諸如Fok1之不同核酸酶的域置換。在一些具體實例中，Cas核酸酶可為經修飾之核酸酶。
在其他具體實例中，Cas核酸酶可來自第I型CRISPR/Cas系統。在一些具體實例中，Cas核酸酶可為第I型CRISPR/Cas系統之級聯複合物之組分。在一些具體實例中，Cas核酸酶可為Cas3蛋白質。在一些具體實例中，Cas核酸酶來自第III型CRISPR/Cas系統。在一些具體實例中，Cas核酸酶可具有RNA裂解活性。
在一些具體實例中，經RNA引導之DNA結合劑具有單股切口酶活性，亦即可切割一個DNA股以產生單股斷裂，該單股斷裂亦稱為「切口」。在一些具體實例中，經RNA引導之DNA結合劑包含Cas切口酶。切口酶為在dsDNA中產生切口，亦即切割一個股但不切割DNA雙螺旋之另一股的酶。在一些具體實例中，Cas切口酶為其中例如藉由催化域中之一或多種變化（例如點突變）使核酸內切酶活性位點不活化之Cas核酸酶（例如上文所論述之Cas核酸酶）之型式。參見例如關於Cas切口酶及例示性催化域變化之論述之美國專利第8,889,356號。在一些具體實例中，Cas切口酶，諸如Cas9切口酶具有不活化之RuvC或HNH域。
在一些具體實例中，經RNA引導之DNA結合劑經修飾而僅含有一個功能核酸酶域。舉例而言，藥劑蛋白質可經修飾以使得核酸酶域中之一者經突變或完全或部分缺失以降低其核酸裂解活性。在一些具體實例中，使用具有活性降低之RuvC域之切口酶。在一些具體實例中，使用具有非活性RuvC域之切口酶。在一些具體實例中，使用具有活性降低之HNH域之切口酶。在一些具體實例中，使用具有非活性HNH域之切口酶。
在一些具體實例中，Cas蛋白質核酸酶域中之保守胺基酸經取代以降低或改變核酸酶活性。在一些具體實例中，Cas核酸酶可在RuvC或類RuvC核酸酶域中包含胺基酸取代。RuvC或類RuvC核酸酶域中之例示性胺基酸取代包括D10A（基於釀膿鏈球菌Cas9蛋白質）。參見例如Zetsche等人 (2015)Cell 10月22:163(3): 759-771。在一些具體實例中，Cas核酸酶可包含HNH或類HNH核酸酶域中之胺基酸取代。HNH或類HNH核酸酶域中之例示性胺基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A及D986A（基於釀膿鏈球菌Cas9蛋白質）。參見例如Zetsche等人 (2015)。其他例示性胺基酸取代包括D917A、E1006A及D1255A（基於新兇手弗朗西斯氏菌U112 Cpf1（FnCpf1）序列（UniProtKB - A0Q7Q2（CPF1_FRATN））。
在一些具體實例中，以與分別與目標序列之有義股及反義股互補之一對引導RNA組合形式提供切口酶。在此具體實例中，引導RNA將切口酶引導至目標序列且藉由在目標序列之相對股上產生切口而引入DSB（亦即雙切口）。在一些具體實例中，連同目標DNA之相對股之兩個個別引導RNA使用切口酶以在目標DNA中產生雙重切口。在一些具體實例中，連同經選擇以非常接近之兩個個別引導RNA使用切口酶以在目標DNA中產生雙重切口。
在一些具體實例中，經RNA引導之DNA結合劑包含一或多個異源功能域（例如為或包含融合多肽）。
在一些具體實例中，異源功能域可促進將經RNA引導之DNA結合劑輸送至細胞核中。舉例而言，異源功能域可為核定位信號（NLS）。在一些具體實例中，經RNA引導之DNA結合劑可與1至10個NLS融合。在一些具體實例中，經RNA引導之DNA結合劑可與1至5個NLS融合。在一些具體實例中，經RNA引導之DNA結合劑可與一個NLS融合。在使用一個NLS之情況下，NLS可連接於經RNA引導之DNA結合劑序列之N端或C端處。其亦可插入經RNA引導之DNA結合劑序列內。在其他具體實例中，經RNA引導之DNA結合劑可與多於一個NLS融合。在一些具體實例中，經RNA引導之DNA結合劑可與2、3、4或5個NLS融合。在一些具體實例中，經RNA引導之DNA結合劑可與兩個NLS融合。在某些情形下，兩個NLS可相同（例如兩個SV40 NLS）或不同。在一些具體實例中，經RNA引導之DNA結合劑與連接在羧基端處之兩個SV40 NLS序列融合。在一些具體實例中，經RNA引導之DNA結合劑可與兩個NLS融合，一個NLS連接在N端處且一個連接在C端處。在一些具體實例中，經RNA引導之DNA結合劑可與3個NLS融合。在一些具體實例中，經RNA引導之DNA結合劑可不與NLS融合。在一些具體實例中，NLS可為諸如SV40 NLS、PKKKRKV（SEQ ID NO: 600）或PKKKRRV（SEQ ID NO: 601）之單聯（monopartite）序列。在一些具體實例中，NLS可為諸如核質蛋白之NLS、KRPAATKKAGQAKKKK（SEQ ID NO: 602）之雙聯序列。在一特定具體實例中，單PKKKRKV（SEQ ID NO: 600）NLS可連接在經RNA引導之DNA結合劑之C端處。一或多個連接子視需要包括在融合位點處。
如上文所指出，經RNA引導之DNA結合劑可為編碼經RNA引導之DNA結合多肽的核酸。在一些具體實例中，經RNA引導之DNA結合劑包含mRNA，其包含編碼經RNA引導之DNA結合劑，諸如如本文所述之Cas核酸酶之開放閱讀框架（open reading frame，ORF）。在一些具體實例中，提供、使用或投予mRNA，其包含編碼經RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas核酸酶之ORF。如下文所述，包含Cas核酸酶之mRNA可包含Cas9核酸酶，諸如具有裂解酶、切口酶及/或位點專一性DNA結合活性之釀膿鏈球菌Cas9核酸酶。在一些具體實例中，編碼經RNA引導之DNA核酸酶之ORF為「經修飾經RNA引導之DNA結合劑ORF」或簡稱為「經修飾之ORF」，其以簡寫用於指示ORF經修飾。
本文提供且所屬領域中已知Cas9 ORF，包括經修飾之Cas9 ORF。作為一個實例，Cas9 ORF可經密碼子最佳化，以使得編碼序列包括用於一或多個胺基酸之一或多個替代密碼子。如本文所用，「替代密碼子（alternative codon）」係指用於既定胺基酸之密碼子用法之變化形式，且可為或可不為用於既定表現系統之較佳或最佳密碼子（經密碼子最佳化）。較佳密碼子用法或在既定表現系統中良好容許之密碼子在所屬領域中已知。WO2013/176772、WO2014/065596、WO2016/106121及WO2019/067910之Cas9編碼序列、Cas9 mRNA及Cas9蛋白質序列以引用的方式併入本文中。詳言之，WO2019/067910之段落[0449]處表之ORF及Cas9胺基酸序列及WO2019/067910之段落[0214]至[0234]之Cas9 mRNA及ORF以引用的方式併入本文中。
在一些具體實例中，經修飾之ORF可包含至少在一個、複數個或所有尿苷位置包含經修飾之尿苷。在一些具體實例中，經修飾之尿苷為在5位處，例如用鹵素、甲基或乙基修飾之尿苷。在一些具體實例中，經修飾之尿苷為在1位處，例如用鹵素、甲基或乙基修飾之假尿苷。經修飾之尿苷可為例如假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲氧基尿苷、5-碘尿苷或其組合。在一些具體實例中，經修飾之尿苷為5-甲氧基尿苷。在一些具體實例中，經修飾之尿苷為5-碘尿苷。在一些具體實例中，經修飾之尿苷為假尿苷。在一些具體實例中，經修飾之尿苷為N1-甲基-假尿苷。在一些具體實例中，經修飾之尿苷為假尿苷及N1-甲基假尿苷之組合。在一些具體實例中，經修飾之尿苷為假尿苷及5-甲氧基尿苷之組合。在一些具體實例中，經修飾之尿苷為N1-甲基假尿苷及5-甲氧基尿苷之組合。在一些具體實例中，經修飾之尿苷為5-碘尿苷及N1-甲基假尿苷之組合。在一些具體實例中，經修飾之尿苷為假尿苷及5-碘尿苷之組合。在一些具體實例中，經修飾之尿苷為5-碘尿苷及5-甲氧基尿苷之組合。
在一些具體實例中，本文所揭示之mRNA包含5'帽，諸如Cap0、Cap1或Cap2。5'帽通常為經由5'-三磷酸連接至mRNA之5'對3'鏈之第一核苷酸之5'位的7-甲基鳥嘌呤核糖核苷酸（其可進一步修飾，如下文例如相對於ARCA所論述），亦即第一帽近端核苷酸。在Cap0中，mRNA之第一與第二帽近端核苷酸之核糖包含2'-羥基。在Cap1中，mRNA之第一及第二轉錄核苷酸之核糖分別包含2'-甲氧基及2'-羥基。在Cap2中，mRNA之第一與第二帽近端核苷酸之核糖包含2'-甲氧基。參見例如Katibah等人 (2014) Proc Natl Acad Sci USA 111(33):12025-30；Abbas等人 (2017)Proc Natl Acad Sci USA 114(11):E2106-E2115。大多數內源性高等真核生物mRNA，包括哺乳動物mRNA（諸如人類mRNA）包含Cap1或Cap2。由於根據諸如IFIT-1及IFIT-5之先天性免疫系統之組分辨識為「非自體」，故Cap0及與Cap1及Cap2不同之其他帽結構在諸如人類之哺乳動物中可具免疫原性，此可致使包括第I型干擾素之細胞介素量升高。先天免疫系統之組分，諸如IFIT-1及IFIT-5亦可與eIF4E競爭以結合具有除Cap1或Cap2外之帽的mRNA，此可能會抑制mRNA之轉譯。
帽可以共轉錄方式包括在內。舉例而言，ARCA（抗反向帽類似物；Thermo Fisher Scientific目錄號AM8045）為包含連接至鳥嘌呤核糖核苷酸之5'位的7-甲基鳥嘌呤3'-甲氧基-5'-三磷酸的帽類似物，其可在一開始時試管內併入至轉錄物中。ARCA產生Cap0帽，其中第一個帽近端核苷酸之2'位為羥基。參見例如Stepinski等人, (2001) 「Synthesis and properties of mRNAs containing the novel 『anti-reverse』 cap analogs 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'deoxy)GpppG」,RNA 7: 1486-1495。ARCA結構展示如下。
Figure 02_image001
CleanCapTM AG（m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG；TriLink Biotechnologies目錄號N-7113）或CleanCapTM GG（m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG；TriLink Biotechnologies目錄號N-7133）可用於以共轉錄方式提供Cap1結構。CleanCapTM AG及CleanCapTM GG之3'-O-甲基化形式亦可分別以目錄號N-7413及N-7433購自TriLink Biotechnologies。CleanCapTM AG結構展示如下。
Figure 02_image003
或者，可以轉錄後方式將帽添加至RNA。舉例而言，牛痘加帽酶可為市售的（New England Biolabs目錄號M2080S），且具有由其D1次單位提供之RNA三磷酸酶及鳥苷醯基轉移酶活性及由其D12次單位提供之鳥嘌呤甲基轉移酶。因此，在S-腺苷甲硫胺酸及GTP存在下，可將7-甲基鳥嘌呤添加至RNA，以產生Cap0。參見例如Guo, P.及Moss, B. (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4023-4027；Mao, X.及Shuman, S. (1994)J. Biol. Chem . 269, 24472-24479。
在一些具體實例中，mRNA進一步包含聚腺苷酸化（poly-A）尾。在一些具體實例中，poly-A尾包含至少20、30、40、50、60、70、80、90或100個腺嘌呤，視需要至多300個腺嘌呤。在一些具體實例中，poly-A尾包含95、96、97、98、99或100個腺嘌呤核苷酸。    IV.  遞送方法
本文所揭示之核酸構築體可使用所屬領域中可獲得之多種已知且適合之方法活體內或活體外遞送至宿主細胞或個體。核酸構築體可連同如本文所述之適合基因編輯系統之組分（例如經RNA引導之DNA結合劑，諸如具有其對應引導RNA之Cas核酸酶）一起遞送。
習知基於病毒及非病毒之基因遞送方法可用以將本文所揭示之構築體及基因編輯系統之組分引入至細胞（例如哺乳動物細胞）及目標組織中。如本文所進一步提供，非病毒載體遞送系統包括核酸，諸如非病毒載體、質體載體及例如與諸如脂質體、脂質奈米粒子（LNP）或泊洛沙姆之遞送媒劑複合之核酸。病毒載體遞送系統包括DNA病毒及RNA病毒。
用於非病毒遞送核酸之方法及組成物包括電穿孔、脂質體轉染、顯微注射、基因槍、病毒顆粒、脂質體、免疫脂質體、LNP、聚陽離子或脂質：核酸結合物、裸核酸（例如裸DNA/RNA）、人工病毒粒子及經藥劑增強之DNA攝取。使用例如Sonitron 2000系統（Rich-Mar）進行之聲致穿孔亦可用於遞送核酸。
額外例示性核酸遞送系統包括由AmaxaBiosystems（Cologne, Germany）、Maxcyte公司.（Rockville, Md.）、BTX Molecular Delivery Systems（Holliston, Ma.）及Copernicus Therapeutics公司提供之核酸遞送系統（參見例如美國專利第6,008,336號）。脂質體轉染描述於例如美國專利第5,049,386號；第4,946,787號；及第4,897,355號中，且脂質體轉染試劑為市售的（例如Transfectam™及Lipofectin™）。包括靶向脂質體（諸如免疫脂質複合物）之脂質:核酸複合物之製備在所屬領域中熟知且如本文所描述。
亦可將多種含有雙向構築體及/或基因編輯組分（例如引導RNA及Cas）之遞送系統（例如載體、脂質體、LNP）投予至生物體以活體內遞送至細胞中或活體外投予細胞或細胞培養物。投予係藉由常用於引入分子以最終與血液、流體或細胞接觸之途徑中之任一者來進行，該等途徑包含（但不限於）注射、輸注、局部施用及電穿孔。投予此類核酸之適合方法為可獲得的且為所屬領域中具通常知識者熟知。
在某些具體實例中，本發明提供包含本文所揭示之雙向核酸構築體之載體以用於遞送至宿主細胞。在某些具體實例中，基因編輯系統之組分（例如經RNA引導之DNA結合劑及引導RNA）亦作為載體之一部分遞送至宿主細胞。在某些具體實例中，病毒載體可用以向宿主細胞中遞送雙向核酸構築體、引導RNA及/或經RNA引導之DNA結合劑中之任何一或多者。
在一些具體實例中，本文提供用於向宿主細胞或個體中遞送本文所揭示之雙向核酸構築體之組成物及方法，其中該構築體為如本文所述之載體系統之一部分。在一些具體實例中，載體系統包含額外組分，諸如基因編輯系統之組分（例如引導RNA及/或經RNA引導之DNA結合劑）。
在一些具體實例中，提供包含本文所揭示之雙向核酸構築體之載體組成物。在一些具體實例中，組成物進一步包含基因編輯系統之組分（例如引導RNA及/或經RNA引導之DNA結合劑）。
在一些具體實例中，載體可為圓形的。在其他具體實例中，載體可為線性的。在一些具體實例中，載體可經由脂質奈米粒子、脂質體、非脂質奈米粒子或病毒衣殼遞送。非限制性例示性載體包括質體、噬質體、黏質體、人工染色體、袖珍染色體、轉座子、病毒載體及表現載體。
在一些具體實例中，載體系統可能夠在細胞中驅動一或多種核酸酶組分之表現。在一些具體實例中，視需要作為載體系統之一部分之雙向構築體可包含能夠在細胞中驅動編碼序列表現之啟動子。在一些具體實例中，細胞可為諸如酵母、植物、昆蟲或哺乳動物細胞之真核細胞。在一些具體實例中，真核細胞可為哺乳動物細胞。在一些具體實例中，真核細胞可為嚙齒動物細胞。在一些具體實例中，真核細胞可為人類細胞。驅動不同類型細胞中之表現的適合啟動子為所屬領域中已知的。在一些具體實例中，啟動子可為野生型的。在其他具體實例中，啟動子可經修飾以供更高效或更有效地表現。在又其他具體實例中，啟動子可經截短但仍保留其功能。舉例而言，啟動子可具有正常尺寸或適用於將載體適當封裝於病毒中的減小之尺寸。在一些具體實例中，載體不包含驅動一或多個編碼序列在細胞中之表現的啟動子（例如編碼序列一旦插入至目標內源性基因座中，則編碼序列之表現則藉由內源性啟動子驅動）。
在一些具體實例中，載體可為病毒載體。在一些具體實例中，病毒載體可由其野生型對應物遺傳修飾。舉例而言，病毒載體可包含一或多種核苷酸之插入、缺失或取代以促使選殖或使得載體之一或多個特性發生變化。此類特性可包括封裝容量、轉導效率、免疫原性、基因體整合、複製、轉錄及轉譯。在一些具體實例中，可缺失病毒基因體之一部分以使得病毒能夠封裝具有較大尺寸之外源性序列。在一些具體實例中，病毒載體可具有經增強之轉導效率。在一些具體實例中，宿主中藉由病毒誘發之免疫反應可有所減少。在一些具體實例中，促進將病毒序列整合至宿主基因體中之病毒基因（諸如整合酶）可經突變以使得病毒變成非整合的。在一些具體實例中，病毒載體可為複製缺陷型的。在一些具體實例中，病毒載體可包含外源性轉錄或轉譯控制序列以驅動載體上之編碼序列之表現。在一些具體實例中，病毒可為輔助依賴型的。舉例而言，病毒可需要一或多種輔助病毒來供給所需病毒組分（諸如病毒蛋白）以擴增載體且將載體封裝於病毒粒子中。在此類情況下，可將包括一或多種編碼病毒組分之載體之一或多種輔助組分引入至宿主細胞以及本文所述之載體系統中。在其他具體實例中，病毒可不含輔助病毒。舉例而言，病毒可能夠在無輔助病毒之情況下擴增及封裝載體。在一些具體實例中，本文所述之載體系統亦可編碼病毒擴增及封裝所需的病毒組分。
使用基於RNA或DNA病毒之系統遞送核酸利用將病毒靶向體內之專一性細胞及運輸病毒負載至細胞核之高度進化過程。病毒載體可直接投予至個體（活體內）或其可用以試管內治療細胞。在一些具體實例中，將試管內修飾之細胞投予至個體（例如以來源於個體或來源於供體來源之細胞的活體外操作）。非限制性例示性病毒載體包括腺相關病毒（AAV）載體、慢病毒載體、腺病毒載體、輔助依賴型腺病毒載體（HDAd）、單純疱疹病毒（HSV-1）載體、噬菌體T4、桿狀病毒載體及反轉錄病毒載體。在例如反轉錄病毒、慢病毒及腺相關病毒基因轉移方法下，可在宿主基因體中整合，通常致使插入之轉殖基因長期表現。另外，已在許多不同的細胞類型及目標組織中觀測到高轉導效率。
反轉錄病毒之趨向性可藉由併入外來包膜蛋白、擴增目標細胞之可能目標群體來改變。慢病毒載體為能夠轉導或感染非分裂細胞且典型地產生較高病毒力價之反轉錄病毒載體。反轉錄病毒基因轉移系統之選擇視目標組織而定。反轉錄病毒載體包含順式作用長末端重複序列，其具有封裝至多6-10 kb外來序列的能力。最小順式作用LTR足以用於載體之複製及封裝，其接著用於將包含轉殖基因之雙向構築體整合至目標細胞中以提供永久性轉殖基因表現。廣泛使用之反轉錄病毒載體包括基於鼠類白血病病毒（MuLV）、長臂猿白血病病毒（GaLV）、猿猴免疫缺乏病毒（SIV）、人類免疫不全病毒（HIV）及其組合之彼等載體（參見例如Buchscher等人,J. Virol. 66:2731-2739 (1992)；Johann等人,J. Virol . 66:1635-1640 (1992)；Sommerfelt等人,Virol. 176:58-59 (1990)；Wilson等人,J. Virol. 63:2374-2378 (1989)；Miller等人,J. Virol. 65:2220-2224 (1991)；PCT/US94/05700）。
在一些具體實例中，可使用基於腺病毒之系統。基於腺病毒之載體在許多細胞類型中能夠具極高轉導效率，且並不需要細胞分裂。在此類載體下，已獲得高力價及高表現量。可在相對簡單系統中大量產生此載體。複製缺陷型重組腺病毒載體可以高力價產生且容易感染多種不同細胞類型。大部分腺病毒載體經工程改造以使得轉殖基因置換Ad E1a、E1b及/或E3基因；隨後複製缺陷型載體在反式提供缺失之基因功能的人類293細胞中傳播。Ad載體可活體內轉導多個類型之組織，包括非分裂經分化細胞，諸如肝、腎及肌肉中所見之彼等細胞。習知Ad載體具有較大攜載容量。在臨床試驗中使用Ad載體之實例涉及具有肌肉內注射之用於抗腫瘤免疫接種之聚核苷酸療法（Sterman等人,Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)）。在臨床試驗中將腺病毒載體用於基因轉移之額外實例包括Rosenecker等人,Infection 24:1 5-10 (1996)；Sterman等人,Hum. Gene Ther. 9:7 1083-1089 (1998)；Welsh等人,Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995)；Alvarez等人,Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997)；Topf等人,Gene Ther. 5:507-513 01998)；Sterman等人,Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998)。
在一些具體實例中，腺相關病毒（AAV）載體用於遞送本文提供之雙向核酸構築體。AAV載體已熟知且已用以轉導具有目標核酸之細胞，例如用於試管內產生核酸及肽及活體內及活體外基因療法程序（參見例如West等人,Virology 160:38-47 (1987)；美國專利第4,797,368號；WO 93/24641；Kotin,Human Gene Therapy 5:793-801 (1994)；Muzyczka,J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)。重組AAV載體之構築描述於多個公開案中，包括美國專利第5,173,414號；Tratschin等人,Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985)；Tratschin等人,Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984)；Hermonat及Muzyczka,PNAS 81:6466-6470 (1984)；及Samulski等人,J. Virol. 63:03822-3828 (1989)。在一些具體實例中，病毒載體可為AAV載體。在一些具體實例中，AAV載體為例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAVrh.64R1、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.32.33、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV2/8、AAVrh10或AAVLK03以及，亦可根據本發明使用任何新穎AAV血清型。AAV載體重組腺相關病毒載體為有前景替代核酸遞送系統，例如基於缺陷型及非病原細小病毒腺相關之第2型病毒之彼等病毒載體。
如本文所用，「AAV」係指全部血清型、亞型及天然產生之AAV以及重組AAV。「AAV」可用於指病毒自身或其衍生物。術語「AAV」包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAVrh.64R1、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.32.33、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV2/8、AAVrh10、AAVLK03、AV10、AAV11、AAV12、rh10及其雜合體、禽類AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、靈長類動物AAV、非靈長類動物AAV及綿羊AAV。各種血清型之AAV的基因體序列，以及自然末端重複序列（TR）、Rep蛋白質及衣殼次單位之序列為此項技術中已知的。此類序列可見於文獻中或諸如GenBank之公共資料庫中。如本文所用之「AAV載體（AAV vector）」係指包含不具有AAV起源之異源序列（亦即與AAV異源之核酸序列），典型地包含編碼所關注異源多肽之序列的AAV載體。構築體可包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAVrh.64R1、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.32.33、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV2/8、AAVrh10、AAVLK03、AV10、AAV11、AAV12、rh10及其雜合體、禽類AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、靈長類動物AAV、非靈長類動物AAV及綿羊AAV衣殼序列。一般而言，異源核酸序列（轉殖基因）係藉由至少一個且一般藉由兩個AAV反向末端重複序列（inverted terminal repeat sequence；ITR）來側接。AAV載體可為單股的（ssAAV）或自補的（scAAV）。
在其他具體實例中，病毒載體可為慢病毒載體。在一些具體實例中，慢病毒可為非整合的。在一些具體實例中，病毒載體可為腺病毒載體。在一些具體實例中，腺病毒可為高選殖容量或「無腸」腺病毒，其中除5'及3'反向末端重複序列（ITR）及封裝信號（『I』）外之所有病毒編碼區從病毒中刪除以增加其封裝容量。在其他具體實例中，病毒載體可為HSV-1載體。在一些具體實例中，基於HSV-1之載體為輔助依賴型的，且在其他具體實例中，其為非輔助依賴型的。舉例而言，僅保留封裝序列之擴增子載體需要具有結構性組分之輔助病毒用於封裝，而移除非必需病毒功能的缺失30kb之HSV-1載體不需要輔助病毒。在其他具體實例中，病毒載體可為噬菌體T4。在一些具體實例中，當清空病毒頭時，噬菌體T4可能夠封裝任何線性或環狀DNA或RNA分子。在其他具體實例中，病毒載體可為桿狀病毒載體。在又其他具體實例中，病毒載體可為反轉錄病毒載體。在使用具有較小選殖容量之AAV或慢病毒載體之具體實例中，可能需要使用多於一個載體以遞送如本文所揭示之載體系統的全部組分。舉例而言，一個AAV載體可含有編碼諸如Cas蛋白（例如Cas9）之經RNA引導之DNA結合劑之序列，而第二AAV載體可含有一或多個引導序列。
封裝細胞用於形成能夠感染宿主細胞之病毒粒子。此類細胞包括可封裝腺病毒及AAV之293細胞及可封裝反轉錄病毒之ψ2細胞或PA317細胞。基因療法中所用之病毒載體通常由將核酸載體封裝於病毒顆粒中之生產細胞系產生。載體典型地含有封裝所需之最小病毒序列，由編碼待表現蛋白質之序列置換之其他病毒序列。遺漏病毒功能係由封裝細胞系反式提供。舉例而言，基因療法中所用之AAV載體典型地僅具有來自封裝所需AAV基因體之反向末端重複（ITR）序列。將病毒DNA封裝於含有編碼其他AAV基因（亦即rep及cap）但缺乏ITR序列之輔助質體之細胞系中。細胞系亦可感染腺病毒作為輔助病毒。輔助病毒促進AAV載體複製及由輔助質體進行之AAV基因表現。
基因療法載體可藉由向個別患者投予，典型地藉由全身投予（例如靜脈內、腹膜內、肌肉內、皮下或顱內輸注）或局部施用而活體內遞送，如下文所述。或者，載體可活體外遞送至細胞，諸如自個別患者外植之細胞（例如淋巴球、骨髓抽出物、組織生物檢體）或通用供體造血幹細胞，之後通常在針對已併入載體之細胞選擇之後將細胞再植入患者中。
在一些具體實例中，除本文所揭示之雙向核酸構築體以外，載體系統可進一步包含編碼核酸酶之核酸。在一些具體實例中，除本文所揭示之雙向核酸構築體以外，載體系統可進一步包含編碼引導RNA之核酸及/或編碼經RNA引導之DNA結合劑（其可為Cas蛋白質，諸如Cas9）之核酸。在一些具體實例中，編碼引導RNA之核酸及/或編碼經RNA引導之DNA結合劑或核酸酶之核酸各自或兩者皆位於來自包含本文所揭示之雙向構築體之載體的個別載體上。在具體實例中之任一者中，載體可包括其他序列，該等序列包括（但不限於）如本文所述之啟動子、增強子、調節序列。在一些具體實例中，載體系統內之啟動子不驅動雙向構築體之轉殖基因之表現。在一些具體實例中，載體包含一或多個編碼crRNA、trRNA或crRNA及trRNA之核苷酸序列。在一些具體實例中，載體包含一或多個編碼sgRNA及mRNA之核苷酸序列，該mRNA為編碼經RNA引導之DNA核酸酶（其可為Cas核酸酶，例如Cas9）之mRNA。在一些具體實例中，載體系統包含一或多個編碼crRNA、trRNA及mRNA之核苷酸序列，該mRNA為編碼經RNA引導之DNA核酸酶（其可為Cas核酸酶，諸如Cas9）之mRNA。在一些具體實例中，Cas9來自釀膿鏈球菌（亦即Spy Cas9）。在一些具體實例中，編碼crRNA、trRNA或crRNA及trRNA（其可為sgRNA）之核苷酸序列包含或由以下組成：藉由來自天然產生之CRISPR/Cas系統的重複序列之全部或一部分側接的引導序列。載體系統可包含含有或由crRNA、trRNA或crRNA及trRNA組成之核酸，其中該載體序列包含或由以下組成：不會與crRNA、trRNA或crRNA及trRNA一起經天然發現的核酸。本文所述之載體中之任一者可藉由脂質體、奈米粒子、胞外體、微泡及/或脂質奈米粒子（LNP）遞送。一或多個引導RNA、結合RNA之DNA結合劑（例如mRNA）或包含編碼異源蛋白質之序列之供體構築體可個別或以任何組合藉由脂質體、奈米粒子、胞外體或微泡來遞送。一或多個引導RNA、結合RNA之DNA結合劑（例如mRNA）或包含編碼異源蛋白質之序列之供體構築體可個別或以任何組合藉由LNP來遞送。本文所述之LNP及LNP調配物中之任一者均適用於引導物之遞送。
脂質奈米粒子（LNP）為用於遞送核苷酸及蛋白質貨物之熟知手段，且可用於遞送本文所揭示之雙向核酸構築體。在一些具體實例中，LNP可用於遞送基因編輯系統之組分。在一些具體實例中，LNP遞送核酸（例如DNA或RNA）、蛋白質（例如經RNA引導之DNA結合劑）或核酸以及蛋白質。
在一些具體實例中，本文提供一種將本文所揭示之雙向核酸構築體遞送至宿主細胞或個體之方法，其中該構築體經由LNP遞送。在一些具體實例中，本文提供一種將本文所揭示之雙向核酸構築體遞送至宿主細胞或個體中之方法，其中基因編輯系統（諸如CRISPR/Cas核酸酶系統）之一或多種組分經由LNP遞送。在一些具體實例中，LNP包含雙向構築體及/或基因編輯系統之一或多種組分（例如引導RNA及/或經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑之mRNA）。
在一些具體實例中，本文提供一種包含本文所揭示之雙向核酸構築體及LNP之組成物。在一些具體實例中，組成物進一步包含基因編輯系統之組分（例如引導RNA及/或經RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas9或能夠編碼其之載體系統）。在一些具體實例中，本文提供一種組成物，其包含本文所揭示之雙向核酸構築體及包含引導RNA及/或編碼經RNA引導之DNA結合劑（諸如Cas9）之mRNA的LNP。
在一些具體實例中，LNP包含生物可降解之可電離脂質。在一些具體實例中，LNP包含十八-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯（亦稱為(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯)）或另一可離子化脂質。參見例如PCT/US2018/053559（2018年9月28日申請）、WO/2017/173054、WO2015/095340及WO2014/136086以及其中所提供之參考文獻之脂質。在一些具體實例中，在LNP脂質之情形下，術語陽離子及可離子化可互換，例如其中可離子化脂質視pH而定為陽離子的。
電穿孔為遞送貨物之熟知手段，且任何電穿孔方法均可用於遞送本文所揭示之雙向構築體。在一些具體實例中，電穿孔可用於遞送本文所揭示之雙向構築體，視需要與藉由相同或不同手段遞送之引導RNA及/或經RNA引導之DNA結合劑（例如Cas9）或編碼經RNA引導之DNA結合劑（例如Cas9）之mRNA一起遞送。
在一些具體實例中，本發明包括一種將本文所揭示之雙向構築體試管內遞送至細胞之方法，其中該雙向構築體經由LNP遞送。在一些具體實例中，雙向構築體藉由非LNP手段，諸如經由AAV系統遞送，而引導RNA及/或經RNA引導之DNA結合劑（例如Cas9）或編碼經RNA引導之DNA結合劑（例如Cas9）之mRNA藉由LNP遞送。
在一些具體實例中，本文所述之雙向構築體單獨或作為載體之一部分調配於脂質奈米粒子中或經由脂質奈米粒子投予；參見例如WO/2017/173054，其內容以全文引用的方式併入本文中。
本文所述之載體中之任一者可藉由LNP遞送。本文所述之LNP及LNP調配物中之任一者適用於遞送gRNA、Cas核酸酶或編碼Cas核酸酶之mRNA、其組合及/或本文所揭示之雙向構築體。在一些具體實例中，涵蓋包含以下之LNP組成物：RNA組分及脂質組分，其中脂質組分包含諸如生物可降解之可離子化脂質之胺脂質；且其中RNA組分包含引導RNA及/或編碼Cas核酸酶之mRNA。
在一些情況下，脂質組分包含生物可降解之可離子化脂質、膽固醇、DSPC及PEG-DMG。
基因編輯系統之組分（例如引導RNA及/或經RNA引導之DNA結合劑）及雙向構築體顯然可使用相同或不同系統遞送。舉例而言，引導RNA、經RNA引導之DNA結合劑序列及雙向構築體可藉由相同載體（例如AAV載體）載送或調配於一或多種LNP組成物中。或者，經RNA引導之DNA結合劑（呈蛋白質或mRNA形式）及/或gRNA可藉由LNP載送或與LNP締合，而雙向構築體可藉由載體載送，或反之亦然。此外，不同遞送系統可藉由相同或不同途徑來投予。
不同遞送系統可在試管內或活體內同時或以任何次序相繼遞送。在一些具體實例中，雙向構築體、引導RNA及經RNA引導之DNA結合劑可例如於一個載體、兩個載體、個別載體、一個LNP、兩個LNP、個別LNP或其組合中在試管內或活體內同時遞送。在一些具體實例中，雙向構築體可在引導RNA及/或經RNA引導之DNA結合劑以載體形式及/或與LNP單獨地或一起以核糖核蛋白（RNP）形式締合遞送（例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天）之前，以載體形式及/或與LNP締合活體內或試管內遞送。在一些具體實例中，供體構築體可以例如每天、每兩天、每三天、每四天、每週、每兩週、每三週或每四週之多次投予遞送。在一些具體實例中，供體構築體可以一週間隔，例如在第1週、第2週及第3週等遞送。作為另一實例，在雙向構築體以載體形式及/或與LNP締合遞送（例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天）之前，引導RNA及/或經RNA引導之DNA結合劑可以載體形式及/或與LNP單獨地或一起以核糖核蛋白（RNP）形式締合活體內或試管內遞送。在一些具體實例中，白蛋白引導RNA可以例如每天、每兩天、每三天、每四天、每週、每兩週、每三週或每四週之多次投予遞送。在一些具體實例中，白蛋白引導RNA可以一週間隔，例如在第1週、第2週及第3週等遞送。在一些具體實例中，Cas核酸酶可以多次投予遞送，例如可每天、每兩天、每三天、每四天、每週、每兩週、每三週或每四週遞送。在一些具體實例中，Cas核酸酶可以一週間隔，例如在第1週、第2週及第3週等遞送。    V.    使用方法
本發明提供在多種應用中使用本文所述之雙向核酸構築體之方法。在一些具體實例中，在多種應用中使用本文所述之雙向核酸構築體之方法包括使用如本文所述之諸如CRISPR/Cas系統之基因編輯系統。
在一些具體實例中，本文提供一種修飾目標基因座（例如在基因座內之靶點處插入轉殖基因）之試管內或活體內方法，其包含向宿主細胞中投予或遞送本文所述之雙向核酸構築體、引導RNA及如本文所述之經RNA引導之DNA結合劑（例如Cas核酸酶，諸如Cas9）在一些具體實例中，本文提供一種修飾目標基因座之試管內或活體內方法，其包含裂解宿主細胞中之目標序列及插入本文所述之雙向核酸構築體，視需要利用供裂解步驟用之引導RNA及如本文所述之經RNA引導之DNA結合劑（例如Cas核酸酶，諸如Cas9）。
在一些具體實例中，本文提供一種將構築體引入至宿主細胞中之試管內或活體內方法，其包含向宿主細胞投予或遞送本文所述之雙向核酸構築體、引導RNA及如本文所述之經RNA引導之DNA結合劑（例如Cas核酸酶，諸如Cas9）。在一些具體實例中，本文提供一種將構築體引入至宿主細胞中之試管內或活體內方法，其包含向宿主細胞中投予或遞送本文所述之雙向核酸構築體及基因編輯系統，諸如ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9系統。
在一些具體實例中，本文提供一種增加多肽在宿主細胞中之表現之試管內或活體內方法，其包含向宿主細胞中投予或遞送本文所述之雙向核酸構築體、引導RNA及如本文所述之經RNA引導之DNA結合劑（例如Cas核酸酶，諸如Cas9）。在一些具體實例中，本文提供一種增加多肽在宿主細胞中之表現之試管內或活體內方法，其包含向宿主細胞中投予或遞送本文所述之雙向核酸構築體及基因編輯系統，諸如ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9系統。多肽可為細胞外多肽。
雙向構築體可經由諸如核酸載體之載體投予。引導RNA及經RNA引導之DNA結合劑可個別或以任何組合，例如經由包含引導RNA及編碼經RNA引導之DNA結合劑之mRNA的LNP投予。向宿主細胞中投予及遞送可由本文所述之遞送方法中之任一者實現。
在一些具體實例中，本文提供一種在目標基因座表現由轉殖基因編碼之多肽之試管內或活體內方法，其包含向宿主細胞中投予或遞送本文所述之雙向核酸構築體、引導RNA及如本文所述之經RNA引導之DNA結合劑（例如Cas核酸酶，諸如Cas9）。在一些具體實例中，本文提供一種在目標基因座表現由轉殖基因編碼之多肽之試管內或活體內方法，其包含向宿主細胞中投予或遞送本文所述之雙向核酸構築體及基因編輯系統，諸如ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9系統。在一些具體實例中，使宿主細胞表現多肽之方法，包含向宿主細胞中投予或遞送本文所述之雙向核酸構築體及基因編輯系統，諸如ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9系統。
雙向構築體、引導RNA及經RNA引導之DNA結合劑例如可如本文所述個別或以任何組合投予。在一些具體實例中，雙向構築體、引導RNA及經RNA引導之DNA結合劑可例如於一個載體、兩個載體、個別載體、一個LNP、兩個LNP、個別LNP或其組合中同時或相繼遞送。向宿主細胞中投予及遞送可由本文所述之遞送方法中之任一者實現。
另外，在一些具體實例中，該等方法涉及例如使用包含選自表5、6、7、8、9及10中之任一者之序列的引導RNA插入至白蛋白基因座中，諸如白蛋白內含子1。在涉及插入白蛋白基因座中之某些具體實例中，個體之循環白蛋白含量為正常的。該方法可包含將個體之循環白蛋白含量維持在正常循環白蛋白含量之± 5%、± 10%、± 15%、± 20%或± 50%內。在某些具體實例中，個體之白蛋白含量相較於未經治療之個體之白蛋白含量而言無變化至少4週、8週、12週或20週。在某些具體實例中，個體之白蛋白含量瞬時下降，接著返回至正常含量。詳言之，該等方法可包含未偵測到血漿白蛋白含量中之顯著變化。
在一些具體實例中，本發明包含一種修飾諸如人類白蛋白基因之白蛋白基因（例如在其中產生雙股斷裂）之方法或用途，其包含向宿主細胞或宿主細胞群體中投予或遞送本文所述之gRNA、供體構築體（例如包含編碼AAT之序列之雙向構築體）及經RNA引導之DNA結合劑（例如Cas核酸酶）中之任何一或多者。在一些具體實例中，本發明包含修飾諸如人類白蛋白內含子1之白蛋白內含子1區（例如在其中產生雙股斷裂）之方法或用途，其包含向宿主細胞或宿主細胞群中投予或遞送本文所述之gRNA、供體構築體（例如包含編碼異源多肽之核酸之雙向構築體）及經RNA引導之DNA結合劑（例如Cas核酸酶或編碼Cas核酸酶之核酸）中之任何一或多者。在一些具體實例中，本發明包含一種修飾諸如肝組織或肝細胞宿主細胞之人類安全港（例如在其中產生雙股斷裂）之方法或用途，其包含向宿主細胞或宿主細胞群中投予或遞送本文所述之gRNA、供體構築體（例如包含編碼異源多肽之序列之雙向構築體）及經RNA引導之DNA結合劑（例如Cas核酸酶或編碼Cas核酸酶之核酸）中之任何一或多者。
轉殖基因之插入及/或表現可處於如本文所述之其同源基因座處（例如向內源性基因座中插入野生型轉殖基因）或非同源基因座中（例如安全港基因座，諸如白蛋白）。
在一些具體實例中，宿主細胞為非分裂細胞類型。如本文所使用之「非分裂細胞（non-dividing cell）」係指經末端分化且不分裂之細胞以及不分裂但保留再進入細胞分裂及增殖之能力之靜態細胞。舉例而言，肝臟細胞保留分裂之能力（例如當受傷或切除時），但典型地並不分裂。在有絲細胞分裂期間，同源重組為保護基因體及修復雙股斷裂之機制。在一些具體實例中，「非分裂」細胞係指例如與對照分裂細胞相比，同源重組（homologous recombination，HR）不為修復細胞中雙股DNA斷裂之主要機制的細胞。在一些具體實例中，「非分裂」細胞係指例如與對照分裂細胞相比，非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）為修復細胞中雙股DNA斷裂之主要機制的細胞。非分裂細胞類型已例如藉由有效NHEJ雙股DNA斷裂修復機制描述於文獻中。參見例如Iyama, DNA Repair (Amst.) 2013, 12(8): 620-636。在一些具體實例中，宿主細胞包括（但不限於）肝臟細胞、肌肉細胞或神經元細胞。在一些具體實例中，宿主細胞為肝細胞，諸如小鼠、食蟹獼猴或人類肝細胞。在一些具體實例中，宿主細胞為肌細胞，諸如小鼠、食蟹獼猴或人類肌細胞。在一些具體實例中，本文提供一種上文所述之宿主細胞，其包含本文所揭示之雙向構築體。在一些具體實例中，宿主細胞表現由本文所揭示之雙向構築體編碼之轉殖基因多肽。在一些具體實例中，本文提供一種由本文所揭示之方法製得之宿主細胞。在某些具體例中，宿主細胞藉由向宿主細胞中投予或遞送本文所述之雙向核酸構築體及基因編輯系統（諸如ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9系統）製得。
亦提供一種自本文所述之雙向構築體表現多肽之方法。類似地，包含本文所述之雙向構築體之宿主細胞可表現由構築體編碼之多肽。在一些具體實例中，多肽為經分泌之多肽。在一些具體實例中，多肽為其中其功能通常以經分泌之多肽形式實現（例如具功能活性）之多肽。如本文所用之「經分泌之多肽」係指由細胞分泌之蛋白質。在一些具體實例中，多肽為細胞內多肽。在一些具體實例中，多肽為其中其功能通常在細胞內部實現（例如具功能活性）之多肽。如本文所使用之「細胞內多肽」係指包括可溶性細胞溶質多肽之不由細胞分泌之蛋白質。在一些具體實例中，多肽為野生型多肽。在一些具體實例中，多肽為變異型多肽（例如野生型多肽之高度活化突變體）。在一些具體實例中，多肽為肝蛋白質。在一些具體實例中，多肽為非肝蛋白質。在一些具體實例中，多肽包括（但不限於）因子IX及其變異體。在一些具體實例中，肝多肽為例如用以解決肝病症之多肽，該肝病症為諸如（但不限於）酪胺酸血症、威爾森氏病（Wilson's disease）、泰-薩克斯病（Tay-Sachs disease）、高膽紅素血症（克果納傑氏症（Crigler-Najjar））、急性間歇性卟啉症、第1型瓜胺酸血症、進行症家族性肝內膽汁淤積或楓糖漿尿病。
在一些具體實例中，該方法進一步包含達成例如至少1個月、2個月、6個月、1年或2年功效之持久功效。在一些具體實例中，該方法進一步包含以持久且持續之方式達成例如至少1個月、2個月、6個月、1年或2年功效之治療功效。在一些具體實例中，異源多肽活性及/或含量之水準穩定至少1個月、2個月、6個月、1年或更長。在一些具體實例中，多肽之穩態活性及/或含量達成至少7天、至少14天或至少28天。在其他具體實例中，該方法包含在單次劑量之雙向構築體之後將異源多肽活性及/或蛋白質含量維持至少1、2、4或6個月或至少1、2、3、4或5年。
在一些具體實例中，由宿主細胞進行之多肽之表現（不論試管內或活體內）相對於由不投予包含轉殖基因之構築體之宿主細胞對照所表現之量增加至少2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或更多。在一些具體實例中，由宿主細胞進行之多肽之表現（不論試管內或活體內）增加至已知正常量（例如健康個體中之多肽表現量）之至少2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或更多。在一些具體實例中，由宿主細胞進行之多肽之表現由宿主細胞進行之多肽之表現增加至至少約1 μg/ml、2 μg/ml、3 μg/ml、4 μg/ml、5 μg/ml、6 μg/ml、7 μg/ml、8 μg/ml、9 μg/ml、10 μg/ml、15 μg/ml、20 μg/ml、25 μg/ml、30 μg/ml、35 μg/ml、40 μg/ml、45 μg/ml、50 μg/ml、55 μg/ml、60 μg/ml、65 μg/ml、70 μg/ml、75 μg/ml、80 μg/ml、85 μg/ml、90 μg/ml、95 μg/ml、100 μg/ml、120 μg/ml、140 μg/ml、160 μg/ml、180 μg/ml、200 μg/ml、225 μg/ml、250 μg/ml、275 μg/ml、300 μg/ml、325 μg/ml、350 μg/ml、400 μg/ml、450 μg/ml、500 μg/ml、550 μg/ml、600 μg/ml、650 μg/ml、700 μg/ml、750 μg/ml、800 μg/ml、850 μg/ml、900 μg/ml、1000 μg/ml、1100 μg/ml、1200 μg/ml、1300 μg/ml、1400 μg/ml、1500 μg/ml、1600 μg/ml、1700 μg/ml、1800 μg/ml、1900 μg/ml、2000 μg/ml或更多，如例如個體之細胞、血漿及/或血清中所確定。
在一些具體實例中，本文提供一種根據本文所述方法治療肝臟相關病症之方法。如本文所使用之「肝相關病症（liver-associated disease）」係指對肝組織直接造成損傷之病症、由對肝組織之損傷導致之病症及/或由肝中之缺陷導致之非肝器官或組織病症。
在一些具體實例中，雙向構築體、及經RNA引導之DNA結合劑個別地或以任何組合形式局部或全身性（例如靜脈內）投予。在一些具體實例中，將雙向構築體、引導RNA及經RNA引導之DNA結合劑個別地或以任何組合形式投予至肝循環中。
在一些具體實例中，宿主或個體為哺乳動物。在一些具體實例中，宿主或個體為人類。在一些具體實例中，宿主或個體為靈長類動物。在一些具體實例中，宿主或個體為嚙齒動物（例如小鼠、大鼠）、母牛、豬、猴、綿羊、狗、貓、魚或家禽。
本說明書及例示性具體實例不應視為限制性的。出於本說明書及所附申請專利範圍之目的，除非另外指明，否則表示量、百分比或比例之所有數目及說明書及申請專利範圍中使用之其他數值應理解為在所有情況下藉由術語「約」修飾，程度為其尚未如此修飾。因此，除非有相反指示，否則以下說明書及所附申請專利範圍中所闡述之數值參數為可視設法獲得之所需特性而變化的近似值。至少，且不試圖將均等論之應用限於申請專利範圍之範疇，各數值參數至少應根據所報導之有效數位的數目且藉由應用普通捨位技術來解釋。    實施例
提供以下實施例以說明某些所揭示之具體實例且不應視為以任何方式限制本發明之範疇。實施例 1 - 材料及方法 選殖及質體製備
由商業供應商合成側接ITR之雙向插入構築體且選殖至pUC57-Kan中。所得構築體（P00147）用作用於其他載體之親本選殖載體。亦以商業方式合成其他插入構築體（無ITR）且選殖至pUC57中。用BglII限制酶（New England BioLabs，目錄號R0144S）消化經純化之質體，且將插入構築體選殖至親本載體中。在Stbl3TM 化學上勝任型大腸桿菌（Thermo Fisher，目錄號C737303）中繁殖質體。 AAV 產生
於HEK293細胞中之三重轉染用於用所關注之構築體封裝基因體以進行AAV8及AAVDJ生產，且經由碘克沙醇梯度超速離心方法由經溶解之細胞及培養基兩者純化所得載體（參見例如Lock等人, Hum Gene Ther. 2010年10月;21(10):1259-71）。用於含有基因體及所關注之構築體之三重轉染中之質體係在實施例中藉由「PXXXX」編號提及，亦參見例如表11。在儲存緩衝液（具有0.001% Pluronic F68之PBS）中透析經分離之AAV。藉由qPCR使用位於ITR區內之引子/探針測定AAV力價。 核酸酶 mRNA 之試管內轉錄 ( 「 IVT 」 )
使用線性化質體DNA模板及T7 RNA聚合酶藉由試管內轉錄產生含有N1-甲基假-U之加帽及聚腺苷酸化釀膿鏈球菌（「Spy」）Cas9 mRNA。一般而言，含有T7啟動子及100 nt聚（A/T）區之質體DNA係藉由在37℃下與XbaI一起培育以完成消化，之後在65℃下對XbaI進行熱不活化而加以線性化。由酶及緩衝鹽純化經線性化之質體。將用以生成經Cas9修飾之mRNA之IVT反應物在37℃下在以下條件下培育4小時：50 ng/µL經線性化之質體；各2 mM之GTP、ATP、CTP及N1-甲基假-UTP（Trilink）；10 mM ARCA（Trilink）；5 U/µL T7 RNA聚合酶（NEB）；1 U/µL鼠RNA酶抑制劑（NEB）；0.004 U/µL無機大腸桿菌焦磷酸酶（NEB）；及1×反應緩衝液。添加TURBO DNA酶（ThermoFisher）至0.01 U/µL之最終濃度，且將反應物再培育30分鐘以移除DNA模板。根據製造商之方案（ThermoFisher）使用MegaClear轉錄清除套組純化Cas9 mRNA。或者，使用LiCl沈澱、乙酸銨沈澱及乙酸鈉沈澱或使用LiCl沈澱方法純化Cas9 mRNA，之後藉由切向流過濾進行進一步純化。藉由量測260 nm處之光吸收（Nanodrop）測定轉錄物濃度，且藉由以Bioanlayzer （Agilent）進行毛細電泳法而分析轉錄物。
下文Cas9 mRNA包含Cas9 ORF SEQ ID NO: 703或SEQ ID NO: 704或PCT/US2019/053423（其以引用之方式併入本文中）之表24之序列。 用於遞送 Cas9 mRNA 及 gRNA 之 脂質調配物
利用包含可離子化脂質（十八-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯，亦稱為3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸酯)）、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG之脂質調配物將Cas9 mRNA及gRNA遞送至細胞及動物中。
對於利用預混合脂質調配物（在本文中稱為「脂質封包」）之實驗，如本文進一步描述，在100%乙醇中以50:38:9:3之可離子化脂質:膽固醇:DSPC:PEG2k-DMG莫耳比復原組分，之後與RNA貨物（例如Cas9 mRNA及gRNA）以約6.0之脂質胺:RNA磷酸酯（N:P）莫耳比混合。
對於利用調配為脂質奈米粒子（LNP）之組分之實驗，以各種莫耳比將組分溶解於100%乙醇中。將RNA貨物（例如Cas9 mRNA及gRNA）溶解於25 mM檸檬酸鹽、100 mM NaCl（pH 5.0）中，產生大致0.45 mg/mL之RNA貨物濃度。
對於實施例2中所描述之實驗，藉由根據製造商方案使用Precision Nanosystems NanoAssemblrTM Benchtop儀器，將脂質與RNA溶液微流混合來形成LNP。在混合期間利用差分流動速率量維持水相與有機溶劑之2:1比率。混合之後，收集LNP，用水稀釋（大致1:1 v/v），在室溫下保持1小時，且進一步用水稀釋(大致1:1 v/v)，之後進行最終緩衝液更換。用PD-10去鹽管柱（GE）來完成將最終緩衝液更換為50 mM Tris、45 mM NaCl、5% (w/v)蔗糖，pH 7.5（TSS）。必要時，用Amicon 100 kDa離心過濾器（Millipore）藉由離心濃縮調配物。所得混合物接著使用0.2 μm無菌過濾器過濾。將最終LNP儲存於-80℃下直至進一步使用。以45:44:9:2之可離子化脂質:膽固醇:DSPC:PEG2k-DMG莫耳比及約4.5之脂質胺與RNA磷酸酯（N:P）莫耳比以及1:1之gRNA與mRNA重量比調配LNP。
對於其他實施例所描述之實驗，使用交叉流技術，利用於乙醇中之脂質與兩個體積之RNA溶液及一個體積之水之衝擊噴流混合製備LNP。經由混合十字管使於乙醇中之脂質與兩個體積之RNA溶液混合。經由線內T形件使第四水流與十字管之輸出流混合（參見WO2016010840圖2）。將LNP在室溫下保持1小時且進一步用水稀釋（大致1:1 v/v）。在平板濾筒（Sartorius，100 kD MWCO）上，使用切向流過濾來濃縮經稀釋之LNP，且接著藉由透濾將緩衝液更換為50 mM Tris、45 mM NaCl、5%（w/v）蔗糖pH 7.5（TSS）。或者，用PD-10去鹽管柱（GE）來完成將最終緩衝液更換為TSS。必要時，用Amicon 100 kDa離心過濾器（Millipore）藉由離心濃縮調配物。所得混合物接著使用0.2 μm無菌過濾器過濾。最終LNP在4℃或-80℃下儲存直至進一步使用。以50:38:9:3之可離子化脂質:膽固醇:DSPC:PEG2k-DMG莫耳比及約6.0之脂質胺與RNA磷酸酯（N:P）莫耳比以及1:1之gRNA與mRNA重量比調配LNP。 細胞培養及試管內遞送 Cas9 mRNA 、 gRNA 及插入構築體 Hepa1-6 細胞
將Hepa 1-6細胞以10,000個細胞/孔之密度接種於96孔盤中。24小時之後，用LNP及AAV治療細胞。在治療之前，從孔中抽吸出培養基。將LNP用DMEM + 10% FBS培養基稀釋至4 ng/μl，且用10% FBS（於DMEM中）進一步稀釋至2 ng/μl，且在37℃下培育10 min（在5% FBS之最終濃度下）。AAV之目標MOI為1e6，用DMEM + 10% FBS培養基稀釋。向細胞中添加50 μl上文經稀釋之在2 ng/μl下之LNP（遞送總計100 ng之RNA貨物），之後添加50 μl AAV。LNP及AAV治療相隔數分鐘。細胞中之培養基之總體積為100 μl。在治療後72小時及治療後30天之後，從此等經治療之細胞中收集上清液以進行如下文所描述之人類FIX ELISA分析。初級肝細胞
將初級小鼠肝細胞（primary mouse hepatocyte；PMH）、初級食蟹獼猴肝細胞（primary cyno hepatocyte；PCH）及初級人類肝細胞（primary human hepatocyte；PHH）解凍且再懸浮於具有補充劑（ThermoFisher）之肝細胞解凍培養基中，之後進行離心。丟棄上清液，且將所集結之細胞再懸浮於肝細胞平板培養基加補充劑包（ThermoFisher）中。對細胞進行計數，且將其對於PHH以33,000個細胞/孔且對於PCH以50,000個細胞/孔且對於PMH以15,000個細胞/孔之密度接種於經Bio-coat膠原蛋白I塗佈之96孔盤上。使所接種之細胞在組織培養恆溫箱中在37℃及5% CO2 氛圍下靜置且黏附持續5小時。培育之後，檢查細胞之單層形成，且在事先維持肝細胞之情況下將該等細胞洗滌三次，且在37℃下培育。
對於利用脂質封包遞送之實驗，將Cas9 mRNA及gRNA各自用維持培養基個別稀釋至2 mg/ml，且將各2.9 μl添加至含有12.5 μl之50 mM檸檬酸鈉、200 mM氯化鈉（pH 5）及6.9 μl水之孔（於96孔Eppendorf盤中）中。接著添加12.5 μl脂質封包調配物，之後添加12.5 μl水及150 μl TSS。各孔使用肝細胞維持培養基稀釋至20 ng/μl（相對於總RNA含量），且接著用6%新鮮小鼠血清稀釋至10 ng/μl（相對於總RNA含量）。自細胞中抽吸培養基，之後進行轉染，且將40 μl脂質封包/RNA混合物添加至細胞中，之後添加MOI為1e5之AAV（用維持培養基稀釋）。如本文所描述，治療後72小時收集培養基以進行分析，且採集細胞以進行進一步分析。 螢光素酶分析
對於涉及於細胞培養基中之NanoLuc偵測之實驗，將一個體積之Nano-Glo®螢光素酶分析受質與50體積之Nano-Glo®螢光素酶分析緩衝液組合。經Promega Glomax轉盤以0.5 sec整合時間使用1:10稀釋之樣品（50 μl試劑+ 40 μl水+ 10 μl細胞培養基）運作分析。
對於涉及偵測於細胞培養基中之HiBit標籤之實驗，將LgBiT蛋白質及Nano-GloR HiBiT細胞外受質在室溫Nano-GloR HiBiT細胞外緩衝液中分別以1:100及1:50稀釋。經Promega Glomax轉盤以1.0 sec整合時間使用1:10稀釋之樣品（50 μl試劑+ 40 μl水+ 10 μl細胞培養基）運作分析。 活體內遞送 LNP 及 / 或 AAV
經由側尾部靜脈給藥小鼠以AAV、LNP、AAV與LNP、或媒劑（PBS + 0.001% Pluronic（對於AAV媒劑），TSS（對於LNP媒劑））。以0.1 mL/隻動物之體積及如本文所描述之量（載體基因體/小鼠，「vg/ms」）投予AAV。LNP用TSS稀釋且以如本文所指示之量、以約5微升/公克體重投予。典型地，若適用，則首先對小鼠注射AAV且接著注射LNP。如下文進一步描述，在治療後各個時間點，收集血清及/或肝組織以進行某些分析。 人類因子 IX （ hFIX ） ELISA 分析
對於試管內研究，根據製造商之方案使用人類因子IX ELISA套組（Abcam，目錄號ab188393）測定細胞培養基中分泌之總人類因子IX含量。經分泌之hFIX含量係使用4參數對數擬合偏離標準曲線來定量且表示為ng/ml培養基。
對於活體內研究，如所指示收集血液且分離血清。根據製造商之方案使用人類因子IX ELISA套組（Abcam，目錄號ab188393）測定總人類因子IX含量。血清hFIX含量係使用4參數對數擬合偏離標準曲線來定量且表示為μg/mL血清。 對中靶裂解效率之下一代定序 （ 「 NGS 」 ） 及分析
利用深度定序法以識別例如在白蛋白之內含子1內藉由基因編輯引入之插入及缺失之存在。在靶點周圍設計PCR引子且擴增所關注之基因體區域。按領域標準進行引子序列設計。
根據製造商之方案（Illumina）執行額外PCR以添加化學物質以進行定序。擴增子經Illumina MiSeq儀器定序。在消除具有低品質評分之讀段之後，將讀段與參考基因體進行比對。將含有該等讀段之所得檔案映射至參考基因體（BAM檔案），其中選擇重疊所關注之目標區之讀段，且計算野生型讀段之數目相對於含有插入或缺失（「插入缺失」）之讀段之數目。
編輯百分比（例如「編輯效率」或「編輯%」）定義為具有插入或缺失（「插入缺失」）之序列讀段之總數目除以包括野生型之序列讀段之總數目。原位雜合分析
BaseScope（ACDbio，Newark，CA）為可提供例如含有插入轉殖基因（hFIX）及來自插入位點（白蛋白之外顯子1）之編碼序列之雜合mRNA轉錄物中之外顯子接合點之專一性偵測的專用RNA原位雜合技術。BaseScope用於量測表現雜合mRNA之肝臟細胞之百分比。
為偵測雜合mRNA，由ACDbio（Newark，CA）設計可在插入雙向構築體之後產生之針對雜合mRNA之兩個探針。探針中之一者經設計以偵測由在一個位向插入構築體產生之雜合mRNA，而另一探針經設計以偵測由在另一位向插入構築體產生之雜合mRNA。收集來自不同小鼠組之肝且進行新鮮冷凍切片。根據製造商之方案執行使用單個探針或合併探針進行之BaseScope分析。藉由HALO軟體掃描且分析載玻片。此分析之本底（生理鹽水治療組）為0.58%。實施例 2 - 試管內測試具有及不具有同源臂之插入模板
在此實施例中，例如如實施例1中（n=3）所描述，培養Hepa1-6細胞，且在存在或不存在遞送Cas9 mRNA及G000551之LNP之情況下用具有各種形式之插入模板（例如具有單股基因體（「ssAAV」）抑或自補基因體（「scAAV」））的AAV對其進行治療。如實施例1中所描述來製備AAV及LNP。在治療後，收集培養基以用於如實施例1中所述之轉殖基因表現（例如人類因子IX含量）。
Hepa1-6細胞為繼續在培養物中分裂之永生化小鼠肝臟細胞系。如圖2中所示（處理時間點後72小時），僅包含200 bp同源性臂之載體（來源於質體P00204之scAAV）引起可偵測的hFIX表現。在此實驗中，來源於P00123之AAV載體（缺乏同源臂之scAAV）及來源於P00147之AAV載體（缺乏同源臂之ssAAV雙向構築體）之使用不引起可偵測的hFIX表現。將細胞保持在培養物中，且當在治療後低30天進行再分析時確認此等結果（資料未示出）。實施例 3 - 活體內測試具有及不具有同源臂之插入模板
在此實施例中，如實施例2中試管內測試，用來源於相同質體（P00123、P00204及P00147）之AAV治療小鼠。如實施例1中所描述製備且給藥給藥材料。給藥（對於各組，n=5）C57Bl/6小鼠以各3e11之載體基因體（vg/ms），之後為劑量為4 mg/kg（相對於總RNA貨物含量）之包含G000551（「G551」）之LNP。給藥後四週，使動物安樂死，且收集肝組織及血清以分別用於編輯及轉殖基因（例如hFIX）表現。
如圖3A及表12中所示，在經包含靶向鼠類白蛋白之內含子1之gRNA的LNP治療之各動物組中偵測到約60%之肝編輯量。然而，不管各治療組中之穩固且一致之編輯量如何，接受不具有同源臂之ssAAV載體（來源於P00147之ssAAV載體）與LNP組合治療之動物在血清中引起最高hFIX表現量（圖3B及表13）。表 12 ： 插入缺失 %
模板 平均插入缺失（%） 插入缺失標準差（%）
scAAV鈍化型 (P00123) 66.72 4.09
ssAAV鈍化型 (P00147) 68.10 2.27
ssAAV HR (P00204) 70.16 3.68
僅LNP 68.24 6.47
媒劑 0.28 0.08
表 13 ： 因子 IX 含量
模板 平均因子IX（μg/mL） 因子IX標準差（μg/mL）
scAAV鈍化型 (P00123) 0.75 0.28
ssAAV鈍化型 (P00147) 2.92 1.04
ssAAV HR (P00204) 0.96 0.35
僅LNP 0 0
媒劑 0 0
實施例 4 - 活體內測試具有及不具有同源臂之 ssAAV 插入模板
此實施例中所描述之實驗檢驗將同源臂活體內併入ssAAV載體中之功效。
如實施例1中所描述製備且給藥用於此實驗中之給藥材料。給藥（對於各組，n=5）C57Bl/6小鼠以3e11 vg/ms，接著為劑量為0.5 mg/kg（相對於總RNA貨物含量）之包含G000666（「G666」）或G000551（「G551」）之LNP。給藥後四週，收集動物血清以用於轉殖基因（例如hFIX）表現。
如圖4A及表14中所示，使用具有不對稱同源臂之ssAAV載體（對於來源於質體P00350、P00356及P00362之載體，分別為300/600個bp臂、300/2000個bp臂及300/1500個bp臂）以插入由G551靶向之位點中致使循環hFIX含量低於分析之偵測下限。然而，使用不具有同源臂且在雙向位向具有兩個hFIX開放閱讀框（ORF）之ssAAV載體（來源於P00147）在各動物中引起可偵測的循環hFIX含量。
類似地，相較於使用不具有同源臂之雙向載體（來源於P00147），使用具有對稱同源臂（對於來源於質體P00353及P00354之載體分別為500bp臂及800bp臂）之ssAAV載體以插入由G666靶向之位點引起較低但可偵測的含量（參見圖4B及表15）。表 14 ： 血清 FIX 量
AAV 平均血清FIX（μg/mL） 血清FIX標準差（μg/mL）
P00147 5.13 1.31
P00350 -0.22 0.08
P00356 -0.23 0.04
P00362 -0.09 0.16
表 15 ： 血清 FIX 含量
AAV 平均血清FIX（μg/mL） 血清FIX標準差（μg/mL）
P00147 7.72 4.67
P00353 0.20 0.23
P00354 0.46 0.26
實施例 5 - 在 初級小鼠肝細胞中在靶點上試管內篩選雙向構築體
已表明，缺乏同源臂之雙向構築體勝過具有其他組態之載體，此實施例中所描述之實驗檢驗改變雙向構築體（此處為ORF及剪接受體）之模組，及改變用於靶向CRISPR/Cas9介導之插入之gRNA的功效。在一組靶點上利用20個不同之靶向初級小鼠肝細胞（PMH）中之鼠類白蛋白之內含子1之gRNA測試此等不同的雙向構築體。
如實施例1中所述製備在此實施例中測試之ssAAV及脂質封包遞送材料且遞送至PMH中，其中AAV之MOI為1e5。在治療後，收集分離之基因體DNA及細胞培養基以分別用於編輯及轉殖基因表現分析。載體中之各者包含可如實施例1中所描述經由基於螢光素酶之螢光偵測來量測之報導體，在圖5C中繪製為相對螢光素酶單位（「relative luciferase unit；RLU」）。舉例而言，包含hFIX ORF之AAV載體含有融合在其3'端處之HiBit肽，且僅包含報導基因之AAV載體包含NanoLuc ORF（除GFP之外）。所測試之載體中之各者之示意圖提供於圖5A中。所測試之gRNA示於圖5B及圖5C中，對於表4中所列舉之gRNA，使用縮短編號（例如其中略去前導零（leading zero），例如其中在表4中「G551」對應於「G000551」）。
如圖5B及表16中所示，在整個所測試之各組合上偵測治療組中之各者之一致但變化之編輯量。使用模板與引導RNA之多種組合進行之轉殖基因表現示於圖5C及表17中。如圖5D中所示，相當大之插入缺失形成量不一定引起更高效之轉殖基因表現。當不包括具有少於10%編輯之引導物時，使用P00411源性模板及P00418源性模板，R2 值分別為0.54及0.37。小鼠白蛋白剪接受體及人類FIX剪接受體各自引起有效之轉殖基因表現。有趣的是，儘管存在不同ORF及剪接受體，但如以RLU所量測之相對表現量在三種測試載體之間一致，從而表明雙向構築體系統之穩固性、再現性及模塊性（參見圖5C）。表 16 ： 插入缺失 %
引導物ID P00411 P00418 P00415
平均插入缺失（%） 插入缺失標準差（%） 平均插入缺失（%） 插入缺失標準差（%） 平均插入缺失（%） 插入缺失標準差（%）
G000551 67.4 1.42 70.67 2.29 66.73 4.90
G000552 90.93 0.15 91.10 2.43 90.37 1.01
G000553 77.80 3.83 77.47 1.87 80.50 0.85
G000554 72.37 6.49 70.53 3.16 70.60 2.91
G000555 35.37 2.63 35.77 9.34 40.47 4.75
G000666 62.47 3.87 50.90 19.41 65.90 3.99
G000667 30.57 2.73 25.30 3.67 31.67 2.29
G000668 63.60 2.02 66.65 4.60 68.30 4.90
G000669 19.10 2.51 19.33 1.53 18.70 1.25
G000670 47.80 3.27 49.10 4.42 51.97 2.06
G011722 4.20 0.72 4.27 1.20 4.20 0.26
G011723 5.63 1.27 6.07 0.15 5.93 0.15
G011724 6.10 1.28 8.50 2.69 7.13 1.27
G011725 1.93 0.29 2.60 0.79 2.53 0.65
G011726 10.73 1.46 11.70 0.50 12.43 1.33
G011727 14.20 1.56 14.80 2.36 16.20 2.69
G011728 10.55 1.20 13.65 0.92 15.50 1.56
G011729 5.00 0.10 5.63 0.25 6.00 1.01
G011730 7.83 0.97 9.13 0.59 7.33 0.59
G011731 23.70 0.66 25.27 1.21 24.87 1.01
僅AAV 0.15 0.07 0.05 0.07 0.10 0.00
表 17 ：螢光素酶含量
引導物ID P00411 P00418 P00415
平均螢光素酶（RLU） 螢光素酶標準差（RLU） 平均螢光素酶（RLU） 螢光素酶標準差（RLU） 平均螢光素酶（RLU） 螢光素酶標準差（RLU）
G000551 58000.00 4331.28 41800.00 2165.64 78633.33 20274.70
G000552 95700.00 10573.08 80866.67 27911.35 205333.33 30664.86
G000553 205333.33 52993.71 177333.33 32929.22 471666.67 134001.00
G000554 125333.33 55949.38 91933.33 19194.10 232666.67 67002.49
G000555 59933.33 11566.04 77733.33 11061.80 155666.67 15947.83
G000666 88500.00 28735.87 93266.67 30861.19 313000.00 15394.80
G000667 75333.33 22653.11 68966.67 27222.11 153000.00 30805.84
G000668 164000.00 56320.51 133400.00 65111.29 429000.00 120751.80
G000669 28933.33 11636.29 22033.33 2413.16 46466.67 6543.19
G000670 162666.67 32959.57 200000.00 33867.39 424666.67 36473.73
G011722 16766.67 3384.28 8583.33 4103.10 24000.00 8915.16
G011723 22733.33 7252.82 17133.33 4905.44 26100.00 8109.87
G011724 17300.00 2400.00 28033.33 9091.94 30933.33 3365.02
G011725 8253.33 1163.20 8890.00 1429.27 20366.67 13955.05
G011726 12223.33 3742.54 11610.00 2490.44 14950.00 8176.03
G011727 35600.00 8128.35 36300.00 12301.22 86700.00 5023.94
G011728 14900.00 5011.99 22466.67 7130.45 38166.67 13829.08
G011729 10460.00 2543.95 11223.33 2220.28 26966.67 16085.50
G011730 14833.33 2307.24 21700.00 8681.59 41233.33 25687.03
G011731 16433.33 3274.65 22566.67 2205.30 20756.67 13096.20
僅AAV 217.00 15.56 215.00 15.56 207.00 1.41
實施例 6 - 在靶點上活體內篩選雙向構築體
如實施例1中所描述製備在此實施例中測試之ssAAV及LNP且遞送至C57B1/6小鼠中以評定活體內靶點上之雙向構築體之效能。給藥後四週，使動物安樂死，且收集肝組織及血清以分別用於編輯及轉殖基因（例如hFIX）表現。
在初始實驗中，將含有10種不同靶向白蛋白之內含子1之gRNA之10種不同LNP調配物以及來源於P00147之ssAAV遞送至小鼠。分別以3e11 vg/ms及4 mg/kg（相對於總RNA貨物含量）遞送AAV及LNP。在此實驗中測試之gRNA示於圖6及表18中。如圖6中所示且如試管內所觀測，相當大之插入缺失形成量不預測轉殖基因之插入或表現。
在個別實驗中，活體內測試在實施例5中試管內測試之一整組靶向20個不同靶點之20個gRNA。為此目的，將含有20個靶向白蛋白之內含子1之gRNA之20種LNP調配物以及來源於P00147之ssAAV遞送至小鼠。分別以3e11 vg/ms及1 mg/kg（相對於總RNA貨物含量）遞送AAV及LNP。對於表4中所列舉之此實驗中之所測試之gRNA，gRNA使用縮短編號示於圖7A及7B及表19及20中。
如圖7A中所示，在各測試LNP/載體組合上，偵測治療組中之各者之不同編輯量。然而，如圖7B中所示且與實施例5中所描述之試管內數據一致，較高編輯量並不一定引起較高之活體內轉殖基因表現量，從而指示雙向構築體之編輯與插入/表現之間缺乏相關性。實際上，所達成之編輯之量與如在圖7D中所提供之曲線圖中所觀察到之轉殖基因（hFIX）表現之量之間存在極少相關性。詳言之，當從分析中移除達成少於10%編輯之彼等gRNA時，在此實驗之編輯數據集與表現數據集之間計算出僅0.34之R2 值。有趣的是，如圖7C中所示，提供比較如自實施例5之試管內實驗以RLU所量測之表現量與在此實驗中偵測到之活體內轉殖基因表現量的相關性曲線圖，其中R2 值為0.70，表明初級細胞篩選與活體內治療之間的正相關。
為以細胞含量評定雙向構築體之插入，例如如實施例1中所描述，使用原位雜合法（BaseScope）分析來自經治療之動物之肝組織。此分析利用可偵測hFIX轉殖基因與小鼠白蛋白外顯子1序列之間的接合點之探針作為雜合轉錄物。如圖8A中所示，在接受AAV與LNP之動物中偵測到對雜合轉錄物呈陽性之細胞。特定言之，當單獨投予AAV時，少於1.0%之細胞對雜合轉錄物呈陽性。在投予包含G011723、G000551或G000666之LNP之情況下，4.9%、19.8%或52.3%之細胞對雜合轉錄物呈陽性。另外，如圖8B及表14中所示，循環hFIX含量與對於雜合轉錄物呈陽性之細胞的數目相關。最後，分析利用可偵測任一位向之雙向構築體之插入的合併探針。然而，當使用僅偵測單一位向之單一探針時，對雜合轉錄物呈陽性之細胞之量為使用合併探針偵測到之量的約一半（在一個實施例中，4.46%相對於9.68%），表明雙向構築體實際上能夠在任一位向插入，從而產生與蛋白質水準之轉殖基因表現之量相關的經表現之雜合轉錄物。表 18 ： 因子 IX 含量及插入缺失 %
引導物 平均插入缺失（%） 插入缺失標準差（%） 平均螢光素酶（RLU） 螢光素酶標準差（RLU）
G000551 75.02 1.27 3.82 3.38
G000555 51.18 1.19 32.56 9.05
G000553 62.78 2.64 25.07 4.04
G000667 52.96 4.96 32.03 6.74
G000554 55.24 2.28 29.48 7.34
G000552 67.56 1.73 14.79 5.34
G000668 43.14 5.78 26.72 7.97
G000669 50.68 2.97 10.70 4.43
G000666 64.62 1.34 26.19 5.56
G000670 55.90 1.30 30.96 8.44
表 19 ：肝編輯 %
引導物 平均肝編輯（%） 肝編輯標準差（%）
G000551 59.48 4.02
G000555 58.72 3.65
G000553 51.26 2.81
G000554 33.04 8.76
G000555 12.72 4.46
G000666 53.60 4.92
G000667 26.74 4.98
G000668 39.22 3.04
G000669 33.34 4.77
G000670 47.50 5.58
G011722 10.34 1.68
G011723 4.02 0.84
G011724 2.46 0.64
G011725 8.26 1.24
G011726 6.90 1.01
G011727 13.33 6.43
G011728 35.78 9.34
G011729 4.62 1.46
G011730 12.68 3.14
G011731 26.70 1.86
表 20 ： FIX 含量
引導物 第1週 第2週 第4週
平均FIX（μg/mL） FIX標準差（μg/mL） 平均FIX（μg/mL） FIX標準差（μg/mL） 平均FIX（μg/mL） FIX標準差（μg/mL）
G000551 10.88 2.74 10.25 2.51 9.39 3.48
G000555 13.34 2.09 12.00 2.75 12.43 2.57
G000553 17.64 4.34 20.27 6.35 15.31 2.43
G000554 12.79 4.99 14.29 6.09 12.74 4.93
G000555 11.94 5.79 11.99 5.76 8.61 4.02
G000666 21.63 1.32 20.65 1.55 17.23 0.62
G000667 16.77 2.86 12.35 2.85 12.57 5.60
G000668 21.35 1.51 18.20 3.18 17.72 2.25
G000669 5.76 2.10 6.72 2.93 3.39 0.78
G000670 18.18 2.17 19.16 3.05 15.49 3.61
G011722 8.07 1.74 7.74 2.41 8.07 1.74
G011723 2.11 0.28 1.65 0.28 2.11 0.28
G011724 0.92 0.43 0.60 0.30 0.92 0.43
G011725 1.75 0.77 1.14 0.67 1.75 0.77
G011726 0.59 0.30 1.01 0.64 0.59 0.30
G011727 6.71 2.80 6.90 3.68 6.71 2.80
G011728 11.77 3.12 12.29 3.43 11.77 3.12
G011729 0.94 0.35 0.89 0.29 0.94 0.35
G011730 5.93 1.77 6.33 1.73 5.93 1.77
G011731 3.56 0.87 3.78 0.50 3.56 0.87
僅AAV 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
媒劑 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
人類血清 3.63 0.32 3.61 0.35 3.28 0.03
實施例 7 - 活體內 hFIX 表現之持久性
在此實施例中評定經治療之動物中hFIX表現隨時間推移之持久性。為此目的，給藥後在經治療之動物之血清中量測hFIX作為一年持久性研究之一部分。
如實施例1中所述製備在此實施例中測試之ssAAV及LNP且遞送至C57Bl/6小鼠中。LNP調配物含有G000551，且ssAAV來源於P00147。以3e11 vg/ms遞送AAV，且以0.25或1.0 mg/kg遞送LNP（相對於總RNA貨物含量）（對於各組，n=5）。
如圖9及表21及22中所示，對於兩個組，在各評定時間點持續hFIX表現至41週。咸信在8週時觀測到之量下降係歸因於ELISA分析之變化性。在第2週及第41週藉由ELISA量測血清白蛋白含量，顯示在整個研究中循環白蛋白含量得以維持。表 21 ： hFIX 含量
週 劑量
0.25 mpk LNP 1 mpk LNP
平均hFIX（μg/mL） hFIX標準差（μg/mL） 平均hFIX（μg/mL） hFIX標準差（μg/mL）
2 0.48 0.21 2.24 1.12
4 0.55 0.18 2.82 1.67
8 0.40 0.17 1.72 0.77
12 0.48 0.20 2.85 1.34
20 0.48 0.27 2.45 1.26
41 0.79 0.49 4.63 0.95
表 22 ： hFIX 含量
週 劑量
0.25 mpk LNP 1 mpk LNP
平均hFIX（μg/mL） hFIX標準差（μg/mL） 平均hFIX（μg/mL） hFIX標準差（μg/mL）
2 0.87 0.15 4.02 1.75
4 0.99 0.15 4.11 1.41
8 0.93 0.14 4.15 1.35
12 0.83 0.22 4.27 1.54
20 0.83 0.37 4.76 1.62
41 0.82 0.25 4.72 1.54
實施例 8 - 變化劑量之 AAV 及 LNP 調節活體內 hFIX 表現之作用
在此實施例中，在C57Bl/6小鼠中評定改變AAV與LNP之劑量來調節hFIX表現之作用。
如實施例1中所述製備在此實施例中測試之ssAAV及LNP且遞送至小鼠中。LNP調配物含有G000553，且ssAAV來源於P00147。以1e11、3e11、1e12或3e12 vg/ms遞送AAV，且以0.1、0.3或1.0 mg/kg遞送LNP（相對於總RNA貨物含量）（對於各組，n=5）。給藥後兩週，使動物安樂死。在兩個時間點收集血清以進行hFIX表現分析。
如圖10A（1週）、圖10B（2週）及表23中所示，改變AAV或LNP之劑量可調節活體內hFIX表現之量。 表 23 ： 血清 hFIX
時間點 RNP 劑量（mg/kg ） AAV 劑量（MOI ） 平均FIX （ng/ml ） SD N
第1週 0.1 1E+11 0.08 0.02 2
3E+11 0.11 0.04 5
1E+12 0.41 0.15 5
3E+12 0.61 0.17 5
0.3 1E+11 0.36 0.14 5
3E+11 0.67 0.26 5
1E+12 1.76 0.14 5
3E+12 4.70 2.40 5
1.0 1E+11 3.71 0.31 4
3E+11 8.00 0.51 5
1E+12 14.17 1.38 5
3E+12 20.70 2.79 5
人類血清1:1000 6.62 - 1
第2週 0.1 1E+11 0.12 0.01 2
3E+11 0.26 0.07 5
1E+12 0.83 0.24 5
3E+12 1.48 0.35 5
0.3 1E+11 0.70 0.26 4
3E+11 1.42 0.37 5
1E+12 3.53 0.49 5
3E+12 8.94 4.39 5
1.0 1E+11 5.40 0.47 4
3E+11 12.31 2.45 5
1E+12 17.89 1.95 5
3E+12 25.52 3.62 5
人類血清1:1000 4.47 - 1
實施例 9 - 在 初級食蟹獼猴及初級人類肝細胞中在靶點上試管內篩選雙向構築體
在此實施例中，在一組靶點上利用分別靶向食蟹獼猴（「cynomolgus；cyno」）之內含子1及初級食蟹獼猴（PCH）以及初級人類肝細胞（PHH）中之人類白蛋白之gRNA測試包含雙向構築體之ssAAV載體。
如實施例1中所述製備在此實施例中測試之ssAAV及脂質封包遞送材料且遞送至PCH及PHH中。在治療後，收集分離之基因體DNA及細胞培養基以分別用於編輯及轉殖基因表現分析。載體中之各者包含可如實施例1中所述經由基於螢光素酶之螢光偵測來量測之報導體（來源於質體P00415），在圖11B及12B中繪製為相對螢光素酶單位（「RLU」）。舉例而言，AAV載體含有NanoLuc ORF（除GFP之外）。圖11B及12B中提供所測試之載體之示意圖。對於表1及表7中所列舉之所測試之gRNA，gRNA係使用縮短編號示於圖中之各者中。
如針對PCH之圖11A及針對PHH之圖12A中所示，偵測到所測試之組合中之各者之不同編輯量（由於用於基於擴增子之定序的某些引子對失效，故在PCH實驗中測試之一些組合之編輯數據並不報導於圖11A及表1中）。以圖形方式示於圖11A及12A中之編輯數據在以下表1及表2中數值上再生。然而，如圖11B、11C及圖12B及12C中所示，相當大之插入缺失形成量不預測轉殖基因之插入或表現，從而指示分別PCH及PHH中之雙向構築體之編輯與插入/表現之間的相關性極小。作為一個量度，圖11C中所計算之R2 值為0.13，且圖12D之R2 值為0.22。表 1 ： 遞送至初級食蟹獼猴肝細胞之 sgRNA 之 白蛋白內含子 1 編輯及轉殖基因表現數據
引導物ID 平均編輯% 編輯% 標準差 平均RLU RLU 標準差
G009867 25.05 0.21 10650.67 1455.97
G009866 18.7 3.96 75556.67 12182.98
G009876 14.85 4.88 27463.33 10833.53
G009875 12.85 2.33 51660.00 6362.36
G009874 28.25 6.01 270433.30 133734.10
G009873 42.65 5.59 178600.00 87607.25
G009865 59.15 0.21 301666.70 18610.03
G009872 48.15 3.46 320233.30 63517.43
G009871 46.5 5.23 211966.70 65852.44
G009864 33.2 8.34 210033.30 61201.33
G009863 54.8 12.45 69853.33 15216.92
G009862 44.6 7.21 508666.70 119876.30
G009861 28.65 0.21 178666.70 15821.93
G009860 33.2 7.07 571333.30 52728.87
G009859 0.05 0.07 258333.30 79052.73
G009858 14.65 1.77 402333.30 25579.94
G009857 23 0.99 312333.30 73036.52
G009856 14.8 0.99 95900.00 21128.42
G009851 1.5 0.42 105766.70 27048.91
G009868 12.15 2.47 43033.33 9141.85
G009850 63.45 13.93 228200.00 101542.10
G009849 57.55 8.27 225400.00 46001.30
G009848 33 5.37 156333.30 20647.84
G009847 66.75 7 100866.70 22159.72
G009846 61.85 5.02 31766.67 10107.59
G009845 54.4 7.5 43020.00 11582.23
G009844 47.15 2.05 110466.70 32031.44
表 2 ： 遞送至初級人類肝細胞之 sgRNA 之 白蛋白內含子 1 編輯及轉殖基因表現數據
引導物ID 平均編輯% 編輯% 標準差 平均 RLU RLU 標準差
G009844 19.07 2.07 268333.30 80432.17
G009851 0.43 0.35 18033.33 2145.54
G009852 47.20 3.96 18400.00 2251.67
G009857 0.10 0.14 71100.00 14609.24
G009858 8.63 9.16 32000.00 18366.55
G009859 3.07 3.50 59500.00 16014.99
G009860 18.80 4.90 190333.30 54307.76
G009861 10.27 2.51 62233.33 9865.26
G009866 13.60 13.55 96200.00 46573.81
G009867 12.97 3.04 3916.67 1682.03
G009868 0.63 0.32 10176.67 2037.80
G009874 49.13 0.60 318000.00 114118.40
G012747 3.83 0.23 51000.00 6161.17
G012748 1.30 0.35 17433.33 2709.86
G012749 9.77 1.50 75066.67 11809.04
G012750 42.73 4.58 5346.67 2977.35
G012751 7.77 1.16 32066.67 18537.62
G012752 32.93 2.27 402000.00 83144.45
G012753 21.20 2.95 71800.00 32055.73
G012754 0.60 0.10 16933.33 4254.80
G012755 1.10 0.10 13833.33 3685.56
G012756 2.17 0.40 35600.00 6055.58
G012757 1.07 0.25 13993.33 6745.08
G012758 0.90 0.10 34900.00 15308.82
G012759 2.60 0.35 30566.67 15287.36
G012760 39.10 6.58 6596.67 2133.13
G012761 36.17 2.43 467666.70 210965.20
G012762 8.50 0.57 217000.00 13000.00
G012763 47.07 3.07 142333.30 37581.02
G012764 44.57 5.83 1423333.00 261023.60
G012765 19.90 1.68 179666.70 57011.69
G012766 8.50 0.28 243333.30 17473.79
另外，在一組靶點上利用靶向初級人類肝細胞（PHH）中之人類白蛋白之內含子1之單引導RNA測試包含雙向構築體之ssAAV載體。
如實施例1中所述製備ssAAV及LNP材料且遞送至PHH中。在治療後，收集分離之基因體DNA及細胞培養基以分別用於編輯及轉殖基因表現分析。如上，載體中之各者包含可如實施例1中所述經由基於螢光素酶之螢光偵測來量測之報導體（來源於質體P00415），在圖12C中繪製為且在表23中顯示為相對螢光素酶單位（「RLU」）。舉例而言，AAV載體含有NanoLuc ORF（除GFP之外）。圖11B及12B中提供所測試之載體之示意圖。對於表1及表7中所列舉之所測試之gRNA，gRNA係使用縮短編號示於圖12C中。表 23 ： 遞送至初級人類肝細胞之 sgRNA 之 白蛋白內含子 1 轉殖基因表現數據
引導物 平均螢光素酶（RLU） 螢光素酶標準差（RLU）
G009844 3,700,000 509,117
G009852 281,000 69,296
G009857 1,550,000 127,279
G009858 551,000 108,894
G009859 1,425,000 77,782
G009860 2,240,000 183,848
G009861 663,500 238,295
G009866 274,000 11,314
G009867 44,700 566
G009874 2,865,000 431,335
G012747 651,000 59,397
G012749 867,000 93,338
G012752 4,130,000 268,701
G012753 1,145,000 162,635
G012757 579,000 257,387
G012760 129,000 36,770
G012761 4,045,000 728,320
G012762 2,220,000 127,279
G012763 1,155,000 205,061
G012764 11,900,000 1,555,635
G012765 1,935,000 134,350
G012766 2,050,000 169,706
LNP 8,430 212
實施例 10 - 活體內測試自替代安全港基因座進行之因子 IX 表現
在此實施例中，評估在替代安全港基因座處之包含雙向hFIX構築體之ssAAV插入。為測試向替代安全港基因座中之插入，如上文所述製備AAV。使小鼠投予劑量為3e11 vg/隻小鼠之AAV，緊隨著投予劑量為0.3 mg/kg之調配有Cas9 mRNA及引導RNA之LNP。在給藥後4週將動物處死，且收集肝及血液樣品。藉由NGS測定肝樣品中之編輯。藉由ELISA測定血清中之人類hFIX含量。NGS及ELISA數據顯示在替代安全港基因座內之有效hFIX插入及表現。 實施例 11 - 活體內測試非人類靈長類動物中之人類因子 IX 基因插入
在此實施例中，經由投予腺相關病毒（AAV）及/或具有多種引導物之脂質奈米粒子（LNP）執行評估食蟹獼猴中之人類因子IX基因插入及hFIX蛋白表現之8週研究。此研究係用如上文所述製備之LNP調配物及AAV調配物來進行。各LNP調配物含有Cas9 mRNA及引導RNA（gRNA），其中mRNA:gRNA重量比為2:1。ssAAV係來源於P00147。
在n=3之同屬性群中治療雄性食蟹獼猴。藉由以表3中所描述之劑量進行慢推注注射或輸注來給藥動物以AAV。在AAV治療之後，藉由慢推注或輸注使動物接受如表3中所描述之緩衝液或LNP。
給藥後兩週，經由經單超音波引導之經皮生物檢體收集肝樣本。將各生物檢體樣本在液氮中急驟冷凍且儲存於-86℃至-60℃下。藉由如先前所述之NGS定序法執行肝樣本之編輯分析。
對於因子IX ELISA分析，在給藥後第7天、第14天、第28天及第56天從動物收集血液樣品。收集血液樣品且在血液抽取之後加工成血漿，且儲存於-86℃至-60℃下直至進行分析。
藉由ELISA由血漿樣品測定總人類因子IX含量。簡言之，使Reacti-Bind 96微定量盤（VWR目錄號PI15041）塗佈有濃度為1 µg/ml之捕捉抗體（針對人類因子IX抗體之小鼠mAB（HTI，目錄號AHIX-5041）），接著使用1× PBS及5%牛血清白蛋白阻斷。接著，在個別孔中培育用食蟹獼猴血漿稀釋之經純化之人類因子IX蛋白質之測試樣品或標準物（ERL，目錄號HFIX 1009，批號HFIX4840）。吸附濃度為100 ng/ml之偵測抗體（綿羊抗人類因子9多株抗體，Abcam，目錄號ab128048）。使用100 ng/mL之二級抗體（具有HRP之驢抗綿羊IgG pAb，Abcam，目錄號ab97125）。使用TMB受質試劑組（BD OptEIA目錄號555214）發展盤。經微定量盤讀取器（Molecular Devices i3系統）以分光光度法評定450 nm之光密度，且使用SoftMax pro 6.4對其進行分析。
偵測到插入缺失形成，確認編輯發生。NGS數據顯示有效之插入缺失形成。NHP中自白蛋白基因座進行之hFIX表現係藉由ELISA來量測且描繪於表4及圖13中。血漿hFIX含量達到先前描述為治療上有效之含量（George,等人, NEJM 377(23), 2215-27, 2017）。
如所量測，循環hFIX蛋白含量持續貫穿八週研究（參見圖13，顯示分別約135、約140、約150及約110 ng/mL之第7天、第14天、第28天及第56天平均含量），達成約75 ng/mL至約250 ng/mL範圍內之蛋白質含量。使用R338L功能亢進hFIX變異體之高約8倍比活性計算血漿hFIX含量（Simioni等人, NEJM 361(17), 1671-75, 2009）（其報導390 ± 28 U/毫克之hFIX-R338L之蛋白質比活性，及45 ± 2.4 U/毫克之野生型因子IX之蛋白質比活性）。計算在此實施例中測試之功能亢進因子IX變異體之功能上標準化因子IX活性，實驗在8週研究內達成對應於野生型因子IX活性之約20%-40%之於NHP中之穩定人類因子IX蛋白含量（範圍跨越野生型因子IX活性之12%-67%）。表 3 ：肝編輯
動物ID 引導物ID F9-AAV（vg/kg） F9-AAV體積（mL/kg） LNP（mg/kg） LNP體積（mL/kg）
4001 G009860 3E+13 1 3 2
4002 G009860 3E+13 1 3 2
4003 G009860 3E+13 1 3 2
5001 TSS 3E+13 1 0 0
5002 TSS 3E+13 1 0 0
5003 TSS 3E+13 1 0 0
6001 G009862 0 0 3 2
6002 G009862 0 0 3 2
6003 G009862 0 0 3 2
表 4 ： hFIX 表現
動物ID 第7 天 因子IX （ng/mL ） 第14 天 因子IX （ng/mL ） 第28 天 因子IX （ng/mL ） 第56 天 因子IX （ng/mL ）
4001 122.84/+-2.85 94.93/+- 0.56 105.65/+- 1.94 97.31/+- 1.49
4002 149.77/+-13.5 222.92/+- 9.61 252.49/+- 6.46 152.05/+- 7.46
4003 134.06/+-6.17 107.04/+- 6.46 95.30/+- 3.18 74.23/+- 3.53
5001 ND ND ND ND
5002 ND ND ND ND
5003 ND ND ND ND
6001 ND ND ND ND
6002 ND ND ND ND
6003 ND ND ND ND
實施例 12 - 活體內測試非人類靈長類動物中之因子 IX 插入
在此實施例中，在投予來源於P00147之ssAAV及/或具有包括G009860之多種引導物及多種LNP組分之CRISPR/Cas9脂質奈米粒子（LNP）後執行評估食蟹獼猴中之因子IX基因插入及hFIX蛋白質表現之研究。
藉由NGS量測插入缺失形成，確認編輯發生。如實施例11中所描述，藉由ELISA使用針對人類因子IX抗體之小鼠mAB（HTI，目錄號AHIX-5041）、綿羊抗人類因子9多株抗體（Abcam，目錄號ab128048）及具有HRP之驢抗綿羊IgG pAb（Abcam，目錄號ab97125）由血漿樣品測定總人類因子IX含量。比在實施例13之實驗中達成之人類FIX蛋白含量高＞3倍之人類FIX蛋白含量係使用替代CRISPR/Cas9 LNP自雙向模板獲得。在研究中，ELISA分析結果指示，在至少第14天及第28天時間點使用於NHP中之G009860達成等於或高於正常人類FIX含量範圍（3-5 μg/mL；Amiral等人, Clin. Chem., 30(9), 1512-16, 1984）之循環hFIX蛋白含量。最初數據指示在單次給藥之後第14天循環人類FIX蛋白質含量為約3至4 μg/ml，且含量持續貫穿研究之前28天（約3至5 μg/ml）。
藉由ELISA量測循環白蛋白含量，指示在28天時維持基線白蛋白含量。在研究中，未經治療之動物中之所測試之白蛋白含量變化±約15%。在經治療之動物中，循環白蛋白含量最低限度地變化且不下降超出正常範圍，且含量在一個月內恢復至基線。
亦藉由夾心免疫分析以較高動態範圍測定循環人類FIX蛋白質含量。簡言之，用1% ECL阻斷劑（Sigma，GERPN2125）阻斷MSD GOLD 96孔抗生蛋白鏈菌素SECTOR盤（Meso Scale Diagnostics，目錄L15SA-1）。在阻斷溶液流光之後，將經生物素標記之捕捉抗體（Sino Biological，11503-R044）固定在盤上。使用重組人類FIX蛋白質（Enzyme Research Laboratories，HFIX 1009）在0.5% ECL阻斷劑中製備校準標準物。在洗滌之後，將校準標準物及血漿樣品添加至盤中且培育。在洗滌之後，將結合有磺基標籤標記之偵測抗體（Haematologic Technologies，AHIX-5041）添加至孔中且培育。在洗滌掉任何未結合之偵測抗體之後，將讀取緩衝液T施用至孔。在不進行任何額外培育之情況下，用MSD Quick Plex SQ120儀器使盤成像，且用Discovery Workbench 4.0套裝軟體（Meso Scale Discovery）分析數據。濃度以μg/m為單位表示為平均計算濃度。對於樣品，除非由星號指示（在此情況下N=2），否則N=3。如藉由MSD ELISA所量測之經治療之研究組中自白蛋白基因座進行之hFIX表現描繪於表24中。表 24 ：血清人類因子 IX 蛋白質含量
   平均計算濃度（μg/mL）
   3001 3002 3003
第7天 7.85 5.63 11.20
第14天 8.65 11.06 14.70
第28天 9.14 14.12 10.85
第42天 9.03 33.12* 13.22
第56天 10.24 16.72 33.84*
實施例 13 - 白蛋白人類引導物之脫靶分析
使用生物化學方法（參見例如Cameron等人,Nature Methods . 6, 600-606; 2017）測定由靶向白蛋白之Cas9裂解之潛在偏離目標基因體位點。在此實驗中，使用分離之HEK293基因體DNA篩選13個靶向人類白蛋白之sgRNA及兩個具有已知脫靶特徵之對照引導物。在生物化學分析中使用16 nM引導物濃度偵測到之潛在脫靶位點之數目示於表26中。該分析鑑別用於所測試之sgRNA之潛在脫靶位點。表 25 ：脫靶分析
gRNA ID 目標 引導序列（SEQ ID NO:） 脫靶點計數
G012753 白蛋白 GACUGAAACUUCACAGAAUA (SEQ ID NO: 20) 62
G012761 白蛋白 AGUGCAAUGGAUAGGUCUUU (SEQ ID NO: 28) 75
G012752 白蛋白 UGACUGAAACUUCACAGAAU (SEQ ID NO: 19) 223
G012764 白蛋白 CCUCACUCUUGUCUGGGCAA (SEQ ID NO: 31) 3985
G012763 白蛋白 UGGGCAAGGGAAGAAAAAAA (SEQ ID NO: 30) 5443
G009857 白蛋白 AUUUAUGAGAUCAACAGCAC (SEQ ID NO: 5) 131
G009859 白蛋白 UUAAAUAAAGCAUAGUGCAA (SEQ ID NO: 7) 91
G009860 白蛋白 UAAAGCAUAGUGCAAUGGAU (SEQ ID NO: 8) 133
G012762 白蛋白 UGAUUCCUACAGAAAAACUC (SEQ ID NO: 29) 68
G009844 白蛋白 GAGCAACCUCACUCUUGUCU (SEQ ID NO: 2) 107
G012765 白蛋白 ACCUCACUCUUGUCUGGGCA (SEQ ID NO: 32) 41
G012766 白蛋白 UGAGCAACCUCACUCUUGUC (SEQ ID NO: 33) 78
G009874 白蛋白 UAAUAAAAUUCAAACAUCCU (SEQ ID NO: 13) 53
G000644 EMX1 GAGUCCGAGCAGAAGAAGAA    304
G000645 VEGFA GACCCCCUCCACCCCGCCUC    1641
在諸如上文所用之生物化學方法之已知脫靶偵測分析中，典型地藉由設計來恢復大量潛在脫靶位點以便為可在其他情形下，例如在所關注之初級細胞中驗證之潛在位點「廣泛撒網」。舉例而言，當分析利用不含細胞環境之經純化之高分子量基因體DNA且視所使用之Cas9 RNP之劑量而定時，生物化學方法典型地過度展示潛在脫靶點（off-target site）之數目。因此，藉由此等方法識別之潛在脫靶點可使用所識別之潛在脫靶點之靶向定序來驗證。實施例 14 - 構築用於表現分泌性或非分泌性蛋白質之構築體
諸如雙向構築體之構築體可經設計以使得其表現分泌性或非分泌性蛋白質。對於分泌性蛋白質生產，構築體可包含有助於將多肽易位至ER內腔之信號序列。或者，構築體可利用宿主細胞之內源性信號序列（例如當將轉殖基因整合至宿主細胞之白蛋白基因座中時之內源性白蛋白信號序列）。
相比之下，用於表現非分泌性蛋白質之構築體可經設計以使得其不包含信號序列且使得其不利用宿主細胞之內源性信號序列。可達成此種情況之一些方法包括在構築體中併入內部核糖體入口位點（IRES）序列。諸如EMCV IRES之IRES序列允許啟動自mRNA內之任何位置進行之轉譯，緊接著自IRES定位處之下游進行之轉譯。此允許自上游含有信號序列之插入位點表現缺乏宿主細胞之內源性信號序列之蛋白質（例如在白蛋白基因座之外顯子1中找到之信號序列不包括於經表現之蛋白質中）。在不存在信號序列之情況下，不分泌蛋白質。構築體中可用之IRES序列之實例包括來自以下之IRES序列：小核糖核酸病毒（例如FMDV）、有害生物病毒（CFFV）、脊髓灰質炎病毒（polio virus；PV）、腦心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus；ECMV）、口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus；FMDV）、C型肝炎病毒（hepatitis C virus；HCV）、經典豬瘟病毒（classical swine fever virus；CSFV）、鼠類白血病病毒（murine leukemia virus；MLV）、猴免疫缺陷病毒（simian immune deficiency virus；SIV）或蟋蟀麻痹病毒（cricket paralysis virus；CrPV）。
用於表現非分泌性蛋白質之替代方法為包括構築體中之所關注多肽上游之一或多個自裂解肽。諸如2A序列或類2A序列之自裂解肽充當核糖體跳躍信號以由單mRNA轉錄物產生多個單獨蛋白質。如以來自表11之質體ID P00415所示，可使用自裂解肽（例如P2A）生成表現兩個轉殖基因（例如奈米螢光素酶及GFP）之雙順反子載體。或者，可使用自裂解肽來表現缺乏宿主細胞之內源性信號序列之蛋白質（例如位於所關注蛋白質上游之2A序列在內源性白蛋白信號序列與所關注之蛋白質之間引起裂解）。可利用之代表性2A肽示於表12中。另外，可將（GSG）殘基添加至肽之5'端中以改良如表12中所示之裂解效率。
表26 ：用於構築體中之自裂解肽
肽 胺基酸序列
T2A（SEQ ID NO:） EGRGSLLTCGDVEENPGP
P2A（SEQ ID NO:） ATNFSLLKQAGDVEENPGP
E2A（SEQ ID NO:） QCTNYALLKLAGDVESNPGP
F2A（SEQ ID NO:） VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
具有GSG殘基之T2A（SEQ ID NO:） GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP
具有GSG殘基之P2A（SEQ ID NO:） GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
具有GSG殘基之E2A（SEQ ID NO:） GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP
具有GSG殘基之F2A（SEQ ID NO:） GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
表 5 ：人類引導 RNA 序列
引導物ID 引導序列 基因體座標 SEQ ID NO:
G009844 GAGCAACCUCACUCUUGUCU chr4:73405113-73405133 2
G009851 AUGCAUUUGUUUCAAAAUAU chr4:73405000-73405020 3
G009852 UGCAUUUGUUUCAAAAUAUU chr4:73404999-73405019 4
G009857 AUUUAUGAGAUCAACAGCAC chr4:73404761-73404781 5
G009858 GAUCAACAGCACAGGUUUUG chr4:73404753-73404773 6
G009859 UUAAAUAAAGCAUAGUGCAA chr4:73404727-73404747 7
G009860 UAAAGCAUAGUGCAAUGGAU chr4:73404722-73404742 8
G009861 UAGUGCAAUGGAUAGGUCUU chr4:73404715-73404735 9
G009866 UACUAAAACUUUAUUUUACU chr4:73404452-73404472 10
G009867 AAAGUUGAACAAUAGAAAAA chr4:73404418-73404438 11
G009868 AAUGCAUAAUCUAAGUCAAA chr4:73405013-73405033 12
G009874 UAAUAAAAUUCAAACAUCCU chr4:73404561-73404581 13
G012747 GCAUCUUUAAAGAAUUAUUU chr4:73404478-73404498 14
G012748 UUUGGCAUUUAUUUCUAAAA chr4:73404496-73404516 15
G012749 UGUAUUUGUGAAGUCUUACA chr4:73404529-73404549 16
G012750 UCCUAGGUAAAAAAAAAAAA chr4:73404577-73404597 17
G012751 UAAUUUUCUUUUGCGCACUA chr4:73404620-73404640 18
G012752 UGACUGAAACUUCACAGAAU chr4:73404664-73404684 19
G012753 GACUGAAACUUCACAGAAUA chr4:73404665-73404685 20
G012754 UUCAUUUUAGUCUGUCUUCU chr4:73404803-73404823 21
G012755 AUUAUCUAAGUUUGAAUAUA chr4:73404859-73404879 22
G012756 AAUUUUUAAAAUAGUAUUCU chr4:73404897-73404917 23
G012757 UGAAUUAUUCUUCUGUUUAA chr4:73404924-73404944 24
G012758 AUCAUCCUGAGUUUUUCUGU chr4:73404965-73404985 25
G012759 UUACUAAAACUUUAUUUUAC chr4:73404453-73404473 26
G012760 ACCUUUUUUUUUUUUUACCU chr4:73404581-73404601 27
G012761 AGUGCAAUGGAUAGGUCUUU chr4:73404714-73404734 28
G012762 UGAUUCCUACAGAAAAACUC chr4:73404973-73404993 29
G012763 UGGGCAAGGGAAGAAAAAAA chr4:73405094-73405114 30
G012764 CCUCACUCUUGUCUGGGCAA chr4:73405107-73405127 31
G012765 ACCUCACUCUUGUCUGGGCA chr4:73405108-73405128 32
G012766 UGAGCAACCUCACUCUUGUC chr4:73405114-73405134 33
表 6. 小鼠引導 RNA 序列
引導物ID 引導序列 基因體座標 SEQ ID NO:
G000551 AUUUGCAUCUGAGAACCCUU chr5:90461148-90461168 98
G000552 AUCGGGAACUGGCAUCUUCA chr5:90461590-90461610 99
G000553 GUUACAGGAAAAUCUGAAGG chr5:90461569-90461589 100
G000554 GAUCGGGAACUGGCAUCUUC chr5:90461589-90461609 101
G000555 UGCAUCUGAGAACCCUUAGG chr5:90461151-90461171 102
G000666 CACUCUUGUCUGUGGAAACA chr5:90461709-90461729 103
G000667 AUCGUUACAGGAAAAUCUGA chr5:90461572-90461592 104
G000668 GCAUCUUCAGGGAGUAGCUU chr5:90461601-90461621 105
G000669 CAAUCUUUAAAUAUGUUGUG chr5:90461674-90461694 106
G000670 UCACUCUUGUCUGUGGAAAC chr5:90461710-90461730 107
G011722 UGCUUGUAUUUUUCUAGUAA chr5:90461039-90461059 108
G011723 GUAAAUAUCUACUAAGACAA chr5:90461425-90461445 109
G011724 UUUUUCUAGUAAUGGAAGCC chr5:90461047-90461067 110
G011725 UUAUAUUAUUGAUAUAUUUU chr5:90461174-90461194 111
G011726 GCACAGAUAUAAACACUUAA chr5:90461480-90461500 112
G011727 CACAGAUAUAAACACUUAAC chr5:90461481-90461501 113
G011728 GGUUUUAAAAAUAAUAAUGU chr5:90461502-90461522 114
G011729 UCAGAUUUUCCUGUAACGAU chr5:90461572-90461592 115
G011730 CAGAUUUUCCUGUAACGAUC chr5:90461573-90461593 116
G011731 CAAUGGUAAAUAAGAAAUAA chr5:90461408-90461428 117
G013018 GGAAAAUCUGAAGGUGGCAA chr5:90461563-90461583 118
G013019 GGCGAUCUCACUCUUGUCUG chr5:90461717-90461737 119
表 7 ：食蟹獼猴引導 RNA 序列
引導物ID 引導序列 基因體座標 SEQ ID NO:
G009844 GAGCAACCUCACUCUUGUCU chr5:61198711-61198731 164
G009845 AGCAACCUCACUCUUGUCUG chr5:61198712-61198732 165
G009846 ACCUCACUCUUGUCUGGGGA chr5:61198716-61198736 166
G009847 CCUCACUCUUGUCUGGGGAA chr5:61198717-61198737 167
G009848 CUCACUCUUGUCUGGGGAAG chr5:61198718-61198738 168
G009849 GGGGAAGGGGAGAAAAAAAA chr5:61198731-61198751 169
G009850 GGGAAGGGGAGAAAAAAAAA chr5:61198732-61198752 170
G009851 AUGCAUUUGUUUCAAAAUAU chr5:61198825-61198845 171
G009852 UGCAUUUGUUUCAAAAUAUU chr5:61198826-61198846 172
G009853 UGAUUCCUACAGAAAAAGUC chr5:61198852-61198872 173
G009854 UACAGAAAAAGUCAGGAUAA chr5:61198859-61198879 174
G009855 UUUCUUCUGCCUUUAAACAG chr5:61198889-61198909 175
G009856 UUAUAGUUUUAUAUUCAAAC chr5:61198957-61198977 176
G009857 AUUUAUGAGAUCAACAGCAC chr5:61199062-61199082 177
G009858 GAUCAACAGCACAGGUUUUG chr5:61199070-61199090 178
G009859 UUAAAUAAAGCAUAGUGCAA chr5:61199096-61199116 179
G009860 UAAAGCAUAGUGCAAUGGAU chr5:61199101-61199121 180
G009861 UAGUGCAAUGGAUAGGUCUU chr5:61199108-61199128 181
G009862 AGUGCAAUGGAUAGGUCUUA chr5:61199109-61199129 182
G009863 UUACUUUGCACUUUCCUUAG chr5:61199186-61199206 183
G009864 UACUUUGCACUUUCCUUAGU chr5:61199187-61199207 184
G009865 UCUGACCUUUUAUUUUACCU chr5:61199238-61199258 185
G009866 UACUAAAACUUUAUUUUACU chr5:61199367-61199387 186
G009867 AAAGUUGAACAAUAGAAAAA chr5:61199401-61199421 187
G009868 AAUGCAUAAUCUAAGUCAAA chr5:61198812-61198832 188
G009869 AUUAUCCUGACUUUUUCUGU chr5:61198860-61198880 189
G009870 UGAAUUAUUCCUCUGUUUAA chr5:61198901-61198921 190
G009871 UAAUUUUCUUUUGCCCACUA chr5:61199203-61199223 191
G009872 AAAAGGUCAGAAUUGUUUAG chr5:61199229-61199249 192
G009873 AACAUCCUAGGUAAAAUAAA chr5:61199246-61199266 193
G009874 UAAUAAAAUUCAAACAUCCU chr5:61199258-61199278 194
G009875 UUGUCAUGUAUUUCUAAAAU chr5:61199322-61199342 195
G009876 UUUGUCAUGUAUUUCUAAAA chr5:61199323-61199343 196
表 8. 人類白蛋白 sgRNA 及修飾模式
引導物ID 完全序列 SEQ ID NO: 經修飾之完全序列 SEQ ID NO:
G009844 GAGCAACCUCACUCUUGUCUGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 34 mG*mA*mG*CAACCUCACUCUUGUCUGU UUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUm AmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCC GUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAm AmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUm CmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 66
G009851 AUGCAUUUGUUUCAAAAUAUGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 35    mA*mU*mG*CAUUUGUUUCAAAAUAUG UUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUm AmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG UUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAm GmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCm GmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 67
G009852 UGCAUUUGUUUCAAAAUAUUGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 36 mU*mG*mC*AUUUGUUUCAAAAUAUUGU UUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAm GmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUA UCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 68
G009857 AUUUAUGAGAUCAACAGCACGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 37 mA*mU*mU*UAUGAGAUCAACAGCACGU UUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAm GmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUA UCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGm UmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 69
G009858 GAUCAACAGCACAGGUUUUGGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 38 mG*mA*mU*CAACAGCACAGGUUUUGGU UUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAm GmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUA UCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGm UmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGm GmUmGmCmU*mU*mU*mU 70
G009859 UUAAAUAAAGCAUAGUGCAAGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 39 mU*mU*mA*AAUAAAGCAUAGUGCAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 71
G009860 UAAAGCAUAGUGCAAUGGAUGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 40 mU*mA*mA*AGCAUAGUGCAAUGGAUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 72
G009861 UAGUGCAAUGGAUAGGUCUUGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 41 mU*mA*mG*UGCAAUGGAUAGGUCUUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 73
G009866 UACUAAAACUUUAUUUUACUGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 42 mU*mA*mC*UAAAACUUUAUUUUACUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 74
G009867 AAAGUUGAACAAUAGAAAAAGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 43 mA*mA*mA*GUUGAACAAUAGAAAAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 75
G009868 AAUGCAUAAUCUAAGUCAAAGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 44 mA*mA*mU*GCAUAAUCUAAGUCAAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 76
G009874 UAAUAAAAUUCAAACAUCCUGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 45 mU*mA*mA*UAAAAUUCAAACAUCCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 77
G012747 GCAUCUUUAAAGAAUUAUUUGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 46 mG*mC*mA*UCUUUAAAGAAUUAUUUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 78
G012748 UUUGGCAUUUAUUUCUAAAAGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 47 mU*mU*mU*GGCAUUUAUUUCUAAAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 79
G012749 UGUAUUUGUGAAGUCUUACAGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 48 mU*mG*mU*AUUUGUGAAGUCUUACAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 80
G012750 UCCUAGGUAAAAAAAAAAAAGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 49 mU*mC*mC*UAGGUAAAAAAAAAAAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 81
G012751 UAAUUUUCUUUUGCGCACUAGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 50 mU*mA*mA*UUUUCUUUUGCGCACUAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 82
G012752 UGACUGAAACUUCACAGAAUGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 51 mU*mG*mA*CUGAAACUUCACAGAAUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 83
G012753 GACUGAAACUUCACAGAAUAGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 52 mG*mA*mC*UGAAACUUCACAGAAUAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 84
G012754 UUCAUUUUAGUCUGUCUUCUGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 53 mU*mU*mC*AUUUUAGUCUGUCUUCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 85
G012755 AUUAUCUAAGUUUGAAUAUAGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 54 mA*mU*mU*AUCUAAGUUUGAAUAUAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 86
G012756 AAUUUUUAAAAUAGUAUUCUGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 55 mA*mA*mU*UUUUAAAAUAGUAUUCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 87
G012757 UGAAUUAUUCUUCUGUUUAAGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 56 mU*mG*mA*AUUAUUCUUCUGUUUAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 88
G012758 AUCAUCCUGAGUUUUUCUGUGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 57 mA*mU*mC*AUCCUGAGUUUUUCUGUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 89
G012759 UUACUAAAACUUUAUUUUACGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 58 mU*mU*mA*CUAAAACUUUAUUUUACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 90
G012760 ACCUUUUUUUUUUUUUACCUGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 59 mA*mC*mC*UUUUUUUUUUUUUACCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 91
G012761 AGUGCAAUGGAUAGGUCUUUGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 60 mA*mG*mU*GCAAUGGAUAGGUCUUUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 92
G012762 UGAUUCCUACAGAAAAACUCGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 61 mU*mG*mA*UUCCUACAGAAAAACUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 93
G012763 UGGGCAAGGGAAGAAAAAAAGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 62 mU*mG*mG*GCAAGGGAAGAAAAAAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 94
G012764 CCUCACUCUUGUCUGGGCAAGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 63 mC*mC*mU*CACUCUUGUCUGGGCAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 95
G012765 ACCUCACUCUUGUCUGGGCAGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 64 mA*mC*mC*UCACUCUUGUCUGGGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 96
G012766 UGAGCAACCUCACUCUUGUCGUUUU AGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAA AAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 65 mU*mG*mA*GCAACCUCACUCUUGUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 97
表 9. 小鼠白蛋白引導 sgRNA 及修飾模式
引導物ID 完全序列 SEQ ID NO: 經修飾之完全序列 SEQ ID NO:
G000551 AUUUGCAUCUGAGAACCCUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 120 mA*mU*mU*UGCAUCUGAGAACCCUUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 142
G000552 AUCGGGAACUGGCAUCUUCA GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 121 mA*mU*mC*GGGAACUGGCAUCUUCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 143
G000553 GUUACAGGAAAAUCUGAAGG GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 122 mG*mU*mU*ACAGGAAAAUCUGAAGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 144
G000554 GAUCGGGAACUGGCAUCUUC GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 123 mG*mA*mU*CGGGAACUGGCAUCUUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 145
G000555 UGCAUCUGAGAACCCUUAGG GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 124 mU*mG*mC*AUCUGAGAACCCUUAGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 146
G000666 CACUCUUGUCUGUGGAAACA GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 125 mC*mA*mC*UCUUGUCUGUGGAAACAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 147
G000667 AUCGUUACAGGAAAAUCUGA GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 126 mA*mU*mC*GUUACAGGAAAAUCUGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 148
G000668 GCAUCUUCAGGGAGUAGCUU GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 127 mG*mC*mA*UCUUCAGGGAGUAGCUUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 149
G000669 CAAUCUUUAAAUAUGUUGUG GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 128 mC*mA*mA*UCUUUAAAUAUGUUGUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 150
G000670 UCACUCUUGUCUGUGGAAAC GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 129 mU*mC*mA*CUCUUGUCUGUGGAAACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 151
G011722 UGCUUGUAUUUUUCUAGUAA GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 130 mU*mG*mC*UUGUAUUUUUCUAGUAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 152
G011723 GUAAAUAUCUACUAAGACAA GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 131 mG*mU*mA*AAUAUCUACUAAGACAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 153
G011724 UUUUUCUAGUAAUGGAAGCC GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 132 mU*mU*mU*UUCUAGUAAUGGAAGCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 154
G011725 UUAUAUUAUUGAUAUAUUUU GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 133 mU*mU*mA*UAUUAUUGAUAUAUUUUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 155
G011726 GCACAGAUAUAAACACUUAA GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 134 mG*mC*mA*CAGAUAUAAACACUUAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 156
G011727 CACAGAUAUAAACACUUAAC GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 135 mC*mA*mC*AGAUAUAAACACUUAACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 157
G011728 GGUUUUAAAAAUAAUAAUGU GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 136 mG*mG*mU*UUUAAAAAUAAUAAUGUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 158
G011729 UCAGAUUUUCCUGUAACGAU GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 137 mU*mC*mA*GAUUUUCCUGUAACGAUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 159
G011730 CAGAUUUUCCUGUAACGAUC GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 138 mC*mA*mG*AUUUUCCUGUAACGAUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 160
G011731 CAAUGGUAAAUAAGAAAUAA GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 139 mC*mA*mA*UGGUAAAUAAGAAAUAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 161
G013018 GGAAAAUCUGAAGGUGGCAA GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 140 mG*mG*mA*AAAUCUGAAGGUGGCAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 162
G013019 GGCGAUCUCACUCUUGUCUG GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 141 mG*mG*mC*GAUCUCACUCUUGUCUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 163
表 10 ：食蟹獼猴 sgRNA 及修飾模式
引導物ID 完全序列 SEQ ID NO: 經修飾之完全序列 SEQ ID NO:
G009844 GAGCAACCUCACUCUUGUCU GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 197 mG*mA*mG*CAACCUCACUCUUGUCUGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUA AAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUm GmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGm AmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 230
G009845 AGCAACCUCACUCUUGUCUG GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 198 mA*mG*mC*AACCUCACUCUUGUCUGGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUA AAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUm GmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGm AmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 231
G009846 ACCUCACUCUUGUCUGGGGA GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 199 mA*mC*mC*UCACUCUUGUCUGGGGAGUUUU AGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAA GUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCm UmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCm CmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 232
G009847 CCUCACUCUUGUCUGGGGAA GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 200 mC*mC*mU*CACUCUUGUCUGGGGAAGUUUUA GAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGU UAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUm UmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCm GmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 233
G009848 CUCACUCUUGUCUGGGGAAG GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 201 mC*mU*mC*ACUCUUGUCUGGGGAAGGUUUU AGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAA GUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCm UmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCm CmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 234
G009849 GGGGAAGGGGAGAAAAAAAA GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 202 mG*mG*mG*GAAGGGGAGAAAAAAAAGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGm UmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 235
G009850 GGGAAGGGGAGAAAAAAAAA GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 203 mG*mG*mG*AAGGGGAGAAAAAAAAAGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGm UmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 236
G009851 AUGCAUUUGUUUCAAAAUAU GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 204 mA*mU*mG*CAUUUGUUUCAAAAUAUGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGm UmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 237
G009852 UGCAUUUGUUUCAAAAUAUU GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 205 mU*mG*mC*AUUUGUUUCAAAAUAUUGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGm UmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 238
G009853 UGAUUCCUACAGAAAAAGUC GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 206 mU*mG*mA*UUCCUACAGAAAAAGUCGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGm UmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 239
G009854 UACAGAAAAAGUCAGGAUAA GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 207 mU*mA*mC*AGAAAAAGUCAGGAUAAGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGm UmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 240
G009855 UUUCUUCUGCCUUUAAACAG GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 208 mU*mU*mU*CUUCUGCCUUUAAACAGGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGm UmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 241
G009856 UUAUAGUUUUAUAUUCAAAC GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 209 mU*mU*mA*UAGUUUUAUAUUCAAACGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGm UmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 242
G009857 AUUUAUGAGAUCAACAGCAC GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 210 mA*mU*mU*UAUGAGAUCAACAGCACGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGm UmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 243
G009858 GAUCAACAGCACAGGUUUUG GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 211 mG*mA*mU*CAACAGCACAGGUUUUGGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGm UmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 244
G009859 UUAAAUAAAGCAUAGUGCAA GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 212 mU*mU*mA*AAUAAAGCAUAGUGCAAGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGm UmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 245
G009860 UAAAGCAUAGUGCAAUGGAU GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 213 mU*mA*mA*AGCAUAGUGCAAUGGAUGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGm UmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 246
G009861 UAGUGCAAUGGAUAGGUCUU GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 214 mU*mA*mG*UGCAAUGGAUAGGUCUUGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGm UmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 247
G009862 AGUGCAAUGGAUAGGUCUUA GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 215 mA*mG*mU*GCAAUGGAUAGGUCUUAGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGm UmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 248
G009863 UUACUUUGCACUUUCCUUAG GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 216 mU*mU*mA*CUUUGCACUUUCCUUAGGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGm UmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 249
G009864 UACUUUGCACUUUCCUUAGU GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 217 mU*mA*mC*UUUGCACUUUCCUUAGUGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGm UmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 250
G009865 UCUGACCUUUUAUUUUACCU GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 218 mU*mC*mU*GACCUUUUAUUUUACCUGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGm UmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 251
G009866 UACUAAAACUUUAUUUUACU GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 219 mU*mA*mC*UAAAACUUUAUUUUACUGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGm UmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 252
G009867 AAAGUUGAACAAUAGAAAAA GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 220 mA*mA*mA*GUUGAACAAUAGAAAAAGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGm UmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 253
G009868 AAUGCAUAAUCUAAGUCAAA GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 221 mA*mA*mU*GCAUAAUCUAAGUCAAAGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGm UmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 254
G009869 AUUAUCCUGACUUUUUCUGU GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 222 mA*mU*mU*AUCCUGACUUUUUCUGUGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGm UmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 255
G009870 UGAAUUAUUCCUCUGUUUAA GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 223 mU*mG*mA*AUUAUUCCUCUGUUUAAGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGm UmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 256
G009871 UAAUUUUCUUUUGCCCACUA GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 224 mU*mA*mA*UUUUCUUUUGCCCACUAGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUm GmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGm AmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 257
G009872 AAAAGGUCAGAAUUGUUUAG GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 225 mA*mA*mA*AGGUCAGAAUUGUUUAGGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGm UmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 258
G009873 AACAUCCUAGGUAAAAUAAA GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 226 mA*mA*mC*AUCCUAGGUAAAAUAAAGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGm UmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 259
G009874 UAAUAAAAUUCAAACAUCCU GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 227 mU*mA*mA*UAAAAUUCAAACAUCCUGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGm UmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 260
G009875 UUGUCAUGUAUUUCUAAAAU GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 228 mU*mU*mG*UCAUGUAUUUCUAAAAUGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGm UmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 261
G009876 UUUGUCAUGUAUUUCUAAAA GUUUUAGAGCUAGAAAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGU GGCACCGAGUCGGUGCUUUU 229 mU*mU*mU*GUCAUGUAUUUCUAAAAGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGm UmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 262
表 11 ：載體組分及序列
質體ID 5' ITR 剪接受體（第1位向） 轉殖基因（第1位向） Poly-A（第1位向） Poly-A（第2位向） 轉殖基因（第2位向） 剪接受體（第2位向） 3' ITR
P00147 （SEQ ID NO: 263） 小鼠白蛋白剪接受體（SEQ ID NO: 264） 人類因子IX（R338L）（SEQ ID NO: 264） SEQ ID NO: 266 SEQ ID NO: 267 人類因子IX（R338L）（SEQ ID NO: 268） 小鼠白蛋白剪接受體（SEQ ID NO: 269） （SEQ ID NO: 270）
P00411 （SEQ ID NO: 263） 人類因子IX剪接受體（SEQ ID NO: 271） 人類因子IX（R338L）-HiBit（SEQ ID NO: 272） SEQ ID NO: 266 SEQ ID NO: 267 人類因子IX（R338L）-HiBit（SEQ ID NO: 273） 人類因子IX剪接受體（SEQ ID NO: 274） （SEQ ID NO: 270）
P00415 （SEQ ID NO: 263） 小鼠白蛋白剪接受體（SEQ ID NO: 264） Nluc-P2A-GFP（SEQ ID NO: 275） SEQ ID NO: 266 SEQ ID NO: 267 Nluc-P2A-GFP（SEQ ID NO: 276） 小鼠白蛋白剪接受體（SEQ ID NO: 269） （SEQ ID NO: 270）
P00418 （SEQ ID NO: 263） 小鼠白蛋白剪接受體（SEQ ID NO: 264） 人類因子IX（R338L）-HiBit（SEQ ID NO: 272） SEQ ID NO: 266 SEQ ID NO: 267 人類因子IX（R338L）-HiBit（SEQ ID NO: 273） 小鼠白蛋白剪接受體（SEQ ID NO: 269） （SEQ ID NO: 270）
5' ITR序列（SEQ ID NO: 263）： TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 小鼠白蛋白剪接受體（第1位向）（SEQ ID NO: 264）： TAGGTCAGTGAAGAGAAGAACAAAAAGCAGCATATTACAGTTAGTTGTCTTCATCAATCTTTAAATATGTTGTGTGGTTTTTCTCTCCCTGTTTCCACAG 人類因子IX（R338L），第1位向（SEQ ID NO: 265）： TTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCAAAGAGGTATAATTCAGGTAAATTGGAAGAGTTTGTTCAAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAAGTGTAGTTTTGAAGAAGCACGAGAAGTTTTTGAAAACACTGAAAGAACAACTGAATTTTGGAAGCAGTATGTTGATGGAGATCAGTGTGAGTCCAATCCATGTTTAAATGGCGGCAGTTGCAAGGATGACATTAATTCCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAAGGAAAGAACTGTGAATTAGATGTAACATGTAACATTAAGAATGGCAGATGCGAGCAGTTTTGTAAAAATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTGCTCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAACCAGAAGTCCTGTGAACCAGCAGTGCCATTTCCATGTGGAAGAGTTTCTGTTTCACAAACTTCTAAGCTCACCCGTGCTGAGACTGTTTTTCCTGATGTGGACTATGTAAATTCTACTGAAGCTGAAACCATTTTGGATAACATCACTCAAAGCACCCAATCATTTAATGACTTCACTCGGGTTGTTGGTGGAGAAGATGCCAAACCAGGTCAATTCCCTTGGCAGGTTGTTTTGAATGGTAAAGTTGATGCATTCTGTGGAGGCTCTATCGTTAATGAAAAATGGATTGTAACTGCTGCCCACTGTGTTGAAACTGGTGTTAAAATTACAGTTGTCGCAGGTGAACATAATATTGAGGAGACAGAACATACAGAGCAAAAGCGAAATGTGATTCGAATTATTCCTCACCACAACTACAATGCAGCTATTAATAAGTACAACCATGACATTGCCCTTCTGGAACTGGACGAACCCTTAGTGCTAAACAGCTACGTTACACCTATTTGCATTGCTGACAAGGAATACACGAACATCTTCCTCAAATTTGGATCTGGCTATGTAAGTGGCTGGGGAAGAGTCTTCCACAAAGGGAGATCAGCTTTAGTTCTTCAGTACCTTAGAGTTCCACTTGTTGACCGAGCCACATGTCTTCTATCTACAAAGTTCACCATCTATAACAACATGTTCTGTGCTGGCTTCCATGAAGGAGGTAGAGATTCATGTCAAGGAGATAGTGGGGGACCCCATGTTACTGAAGTGGAAGGGACCAGTTTCTTAACTGGAATTATTAGCTGGGGTGAAGAGTGTGCAATGAAAGGCAAATATGGAATATATACCAAGGTATCCCGGTATGTCAACTGGATTAAGGAAAAAACAAAGCTCACTTAA Poly-A（第1位向）（SEQ ID NO: 266）： CCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCC Poly-A（第2位向）（SEQ ID NO: 267）： AAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTG 人類因子IX（R338L），第2位向（SEQ ID NO: 268）： 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小鼠白蛋白剪接受體（第2位向）（SEQ ID NO: 269）： CTGTGGAAACAGGGAGAGAAAAACCACACAACATATTTAAAGATTGATGAAGACAACTAACTGTAATATGCTGCTTTTTGTTCTTCTCTTCACTGACCTA 3'ITR序列（SEQ ID NO: 270）： AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA 人類因子IX剪接受體（第1位向）（SEQ ID NO: 271）： GATTATTTGGATTAAAAACAAAGACTTTCTTAAGAGATGTAAAATTTTCATGATGTTTTCTTTTTTGCTAAAACTAAAGAATTATTCTTTTACATTTCAG 人類因子IX（R338L）-HiBit（第1位向）（SEQ ID NO: 272）： 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人類因子IX（R338L）-HiBit（第2位向）（SEQ ID NO: 273）： TTAGGAAATCTTCTTAAACAGCCGCCAGCCGCTCACGGTGAGCTTAGTCTTTTCTTTTATCCAATTCACGTAGCGAGAGACCTTCGTATAGATGCCATATTTCCCCTTCATCGCACATTCCTCCCCCCAACTTATTATCCCGGTCAAGAAACTTGTTCCTTCGACTTCAGTGACGTGTGGTCCACCTGAATCACCTTGGCATGAGTCGCGACCGCCCTCGTGAAACCCAGCACAAAACATGTTATTGTAAATCGTAAATTTCGTGGACAGAAGACAGGTCGCTCTATCGACCAACGGGACGCGCAAATATTGCAGAACGAGGGCTGATCGACCTTTGTGGAAGACCCGCCCCCACCCACTCACATATCCGCTCCCAAATTTCAAGAAGATATTTGTATATTCTTTATCGGCTATACAAATCGGGGTAACATAGGAGTTAAGTACGAGTGGCTCGTCCAGCTCCAGGAGGGCTATATCATGGTTGTACTTGTTTATAGCGGCATTATAATTGTGATGGGGTATGATCCTGATAACATTCCTTTTCTGTTCAGTATGCTCAGTTTCTTCAATGTTGTGTTCGCCAGCCACGACCGTAATCTTAACCCCCGTCTCGACACAGTGTGCGGCCGTTACAATCCACTTTTCATTGACTATGGAGCCCCCACAAAACGCGTCGACTTTTCCGTTGAGCACCACCTGCCATGGAAATTGGCCAGGTTTAGCGTCCTCGCCCCCGACAACCCTAGTAAAGTCATTAAATGACTGTGTGGATTGTGTTATATTATCAAGAATCGTTTCGGCTTCAGTAGAGTTAACGTAGTCCACATCGGGAAAAACTGTCTCGGCCCTTGTCAACTTTGATGTCTGGGACACACTTACCCGACCGCACGGGAAGGGCACCGCCGGTTCACAGCTCTTTTGATTCTCAGCGAGCCGGTAGCCCTCAGTGCAACTACACACAACTTTGTTGTCGGCGGAATTTTTACAGAATTGCTCGCATCGTCCATTTTTAATGTTGCAGGTGACGTCCAACTCGCAGTTTTTTCCTTCAAAACCAAAAGGGCACCAACACTCGTAGGAATTTATATCGTCTTTACAACTCCCCCCATTCAGACATGGATTAGATTCGCATTGGTCCCCATCGACATATTGCTTCCAGAACTCAGTGGTCCGTTCTGTATTCTCAAACACCTCGCGCGCTTCTTCAAAACTGCATTTTTCCTCCATACACTCTCGCTCCAAGTTCCCTTGCACGAATTCTTCAAGCTTTCCTGAGTTATACCTTTTAGGCCGGTTAAGTATCTTATTCGCGTTTTCGTGGTCCAGAAA 人類因子IX剪接受體（第2位向）（SEQ ID NO: 274）： CTGAAATGTAAAAGAATAATTCTTTAGTTTTAGCAAAAAAGAAAACATCATGAAAATTTTACATCTCTTAAGAAAGTCTTTGTTTTTAATCCAAATAATC Nluc-P2A-GFP（第1位向）（SEQ ID NO: 275）： 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Nluc-P2A-GFP（第2位向）（SEQ ID NO: 276）： 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TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTAGATCTAAGTATATTAGAGCGAGTCTTTCTGCACACAGATCACCTTTCCTATCAACCCCACTAGCCTCTGGCAAAATGAAGTGGGTAACCTTTCTCCTCCTCCTCTTCGTCTCCGGCTCTGCTTTTTCCAGGGGTGTGTTTCGCCGAGAAGCACGTAAGAGTTTTATGTTTTTTCATCTCTGCTTGTATTTTTCTAGTAATGGAAGCCTGGTATTTTAAAATAGTTAAATTTTCCTTTAGTGCTGATTTCTAGATTATTATTACTGTTGTTGTTGTTATTATTGTCATTATTTGCATCTGAGAACCTTTTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCAAAGAGGTATAATTCAGGTAAATTGGAAGAGTTTGTTCAAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAAGTGTAGTTTTGAAGAAGCACGAGAAGTTTTTGAAAACACTGAAAGAACAACTGAATTTTGGAAGCAGTATGTTGATGGAGATCAGTGTGAGTCCAATCCATGTTTAAATGGCGGCAGTTGCAAGGATGACATTAATTCCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAAGGAAAGAACTGTGAATTAGATGTAACATGTAACATTAAGAATGGCAGATGCGAGCAGTTTTGTAAAAATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTGCTCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAACCAGAAGTCCTGTGAACCAGCAGTGCCATTTCCATGTGGAAGAGTTTCTGTTTCACAAACTTCTAAGCTCACCCGTGCTGAGACTGTTTTTCCTGATGTGGACTATGTAAATTCTACTGAAGCTGAAACCATTTTGGATAACATCACTCAAAGCACCCAATCATTTAATGACTTCACTCGGGTTGTTGGTGGAGAAGATGCCAAACCAGGTCAATTCCCTTGGCAGGTTGTTTTGAATGGTAAAGTTGATGCATTCTGTGGAGGCTCTATCGTTAATGAAAAATGGATTGTAACTGCTGCCCACTGTGTTGAAACTGGTGTTAAAATTACAGTTGTCGCAGGTGAACATAATATTGAGGAGACAGAACATACAGAGCAAAAGCGAAATGTGATTCGAATTATTCCTCACCACAACTACAATGCAGCTATTAATAAGTACAACCATGACATTGCCCTTCTGGAACTGGACGAACCCTTAGTGCTAAACAGCTACGTTACACCTATTTGCATTGCTGACAAGGAATACACGAACATCTTCCTCAAATTTGGATCTGGCTATGTAAGTGGCTGGGGAAGAGTCTTCCACAAAGGGAGATCAGCTTTAGTTCTTCAGTACCTTAGAGTTCCACTTGTTGACCGAGCCACATGTCTTCTATCTACAAAGTTCACCATCTATAACAACATGTTCTGTGCTGGCTTCCATGAAGGAGGTAGAGATTCATGTCAAGGAGATAGTGGGGGACCCCATGTTACTGAAGTGGAAGGGACCAGTTTCTTAACTGGAATTATTAGCTGGGGTGAAGAGTGTGCAATGAAAGGCAAATATGGAATATATACCAAGGTATCCCGGTATGTCAACTGGATTAAGGAAAAAACAAAGCTCACTTAACCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCCTTAGGTGGTTATATTATTGATATATTTTTGGTATCTTTGATGACAATAATGGGGGATTTTGAAAGCTTAGCTTTAAATTTCTTTTAATTAAAAAAAAATGCTAGGCAGAATGACTCAAATTACGTTGGATACAGTTGAATTTATTACGGTCTCATAGGGCCTGCCTGCTCGACCATGCTATACTAAAAATTAAAAGTGTGTGTTACTAATTTTATAAATGGAGTTTCCATTTATATTTACCTTTATTTCTTATTTACCATTGTCTTAGTAGATATTTACAAACATGACAGAAACACTAAATCTTGAGTTTGAATGCACAGATATAAACACTTAACGGGTTTTAAAAATAATAATGTTGGTGAAAAAATATAACTTTGAGTGTAGCAGAGAGGAACCATTGCCACCTTCAGATTTTCCTGTAACGATCGGGAACTGGCATCTTCAGGGAGTAGCTTAGGTCAGTGAAGAGAAGAACAAAAAGCAGCATATTACAGTTAGTTGTCTTCATCAATCTTTAAATATGTTGTGTGGTTTTTCTCTCCCTGTTTCCACAGACAAGAGTGAGATCGCCCATCGGTATAATGATTTGGGAGAACAACATTTCAAAGGCCTGTAAGTTATAATGCTGAAAGCCCACTTAATATTTCTGGTAGTATTAGTTAAAGTTTTAAAACACCTTTTTCCACCTTGAGTGTGAGAATTGTAGAGCAGTGCTGTCCAGTAGAAATGTGTGCATTGACAGAAAGACTGTGGATCTGTGCTGAGCAATGTGGCAGCCAGAGATCACAAGGCTATCAAGCACTTTGCACATGGCAAGTGTAACTGAGAAGCACACATTCAAATAATAGTTAATTTTAATTGAATGTATCTAGCCATGTGTGGCTAGTAGCTCCTTTCCTGGAGAGAGAATCTGGAGCCCACATCTAACTTGTTAAGTCTGGAATCTTATTTTTTATTTCTGGAAAGGTCTATGAACTATAGTTTTGGGGGCAGCTCACTTACTAACTTTTAATGCAATAAGATCCATGGTATCTTGAGAACATTATTTTGTCTCTTTGTAGTACTGAAACCTTATACATGTGAAGTAAGGGGTCTATACTTAAGTCACATCTCCAACCTTAGTAATGTTTTAATGTAGTAAAAAAATGAGTAATTAATTTATTTTTAGAAGGTCAATAGTATCATGTATTCCAAATAACAGAGGTATATGGTTAGAAAAGAAACAATTCAAAGGACTTATATAATATCTAGCCTTGACAATGAATAAATTTAGAGAGTAGTTTGCCTGTTTGCCTCATGTTCATAAATCTATTGACACATATGTGCATCTGCACTTCAGCATGGTAGAAGTCCATATTCCTTTGCTTGGAAAGGCAGGTGTTCCCATTACGCCTCAGAGAATAGCTGACGGGAAGAGGCTTTCTAGATAGTTGTATGAAAGATATACAAAATCTCGCAGGTATACACAGGCATGATTTGCTGGTTGGGAGAGCCACTTGCCTCATACTGAGGTTTTTGTGTCTGCTTTTCAGAGTCCTGATTGCCTTTTCCCAGTATCTCCAGAAATGCTCATACGATGAGCATGCCAAATTAGTGCAGGAAGTAACAGACTTTGCAAAGACGTGTGTTGCCGATGAGTCTGCCGCCAACTGTGACAAATCCCTTGTGAGTACCTTCTGATTTTGTGGATCTACTTTCCTGCTTTCTGGAACTCTGTTTCAAAGCCAATCATGACTCCATCACTTAAGGCCCCGGGAACACTGTGGCAGAGGGCAGCAGAGAGATTGATAAAGCCAGGGTGATGGGAATTTTCTGTGGGACTCCATTTCATAGTAATTGCAGAAGCTACAATACACTCAAAAAGTCTCACCACATGACTGCCCAAATGGGAGCTTGACAGTGACAGTGACAGTAGATATGCCAAAGTGGATGAGGGAAAGACCACAAGAGCTAAACCCTGTAAAAAGAACTGTAGGCAACTAAGGAATGCAGAGAGAAAGATCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA 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Cas9 ORF（SEQ ID NO: 703） 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無
圖1展示如AAV基因體中所表示之構築體形式。SA =剪接受體；pA = polyA信號序列；HA =同源臂；LHA =左同源臂；RHA =右同源臂。 圖2展示不具有同源臂之載體在永生化肝臟細胞系（Hepa1-6）中無效。來源於質體P00204之包含200 bp同源臂之scAAV引起此細胞系中之可偵測的hFIX表現。來源於P00123之AAV載體（缺乏同源臂之scAAV）及來源於P00147之AAV載體（缺乏同源臂之ssAAV雙向構築體）之使用不引起可偵測的hFIX表現。 圖3A及3B展示使用來源於P00123、P00147或P00204之載體插入具有或不具有同源臂之模板之活體內測試之結果。圖3A展示在經包含CRISPR/Cas9系統組分之LNP治療之各動物組中偵測到如藉由約60%插入缺失形成所量測之肝編輯量。圖3B展示接受不具有同源臂之ssAAV載體（來源於P00147）與LNP組合治療之動物在血清中引起最高hFIX表現量。 圖4A及4B展示具有或不具有同源臂之ssAAV插入模板之活體內測試之結果。圖4A比較用來源於質體P00350、P00356、P00362之載體（具有如所示之不對稱同源臂）及來源於質體P00147之載體（如圖4B中所示之雙向構築體）進行之靶向插入。圖4B比較向用來源於質體P00353之載體、來源於質體P00354之載體（具有如所示之對稱同源臂）及來源於質體P00147之載體靶向之第二位點中的插入。 圖5A至5D展示在初級小鼠肝細胞中在20個靶點（target site）上之三個雙向構築體之靶向插入的結果。圖5A展示所測試之載體中之各者之示意圖。圖5B展示在所測試之各組合上治療組中之各者之如藉由插入缺失形成所量測之編輯。圖5C及圖5D展示相當大編輯量（在特定靶點上）並不一定致使轉殖基因更有效插入或表現。在此靶向插入研究中，所測試構築體有效致使轉殖基因表現。hSA =人類F9剪接受體；mSA =小鼠白蛋白剪接受體；HiBit =用於基於螢光素酶之偵測之標籤；pA = polyA信號序列；Nluc =奈米螢光素酶報導體；GFP =綠色螢光報導體。 圖6展示使用來源於P00147之ssAAV進行之在10個目標位點上之用雙向構築體進行之靶向插入之活體內篩選的結果。如所示，相當大編輯量並不一定引起高轉殖基因表現量。 圖7A至7D展示使用來源於P00147之ssAAV進行之在20個靶點上之雙向構築體之活體內篩選的結果。圖7A展示偵測到各所測試LNP/載體組合之治療組中之各者之編輯。圖7B提供對應之靶向插入數據。結果展示雙向構築體之編輯與插入/表現之間相關性不良（圖7B及圖7D）且試管內與活體內結果之間正相關（圖7C）。 圖8A及8B展示使用原位雜合方法使用可偵測hFIX轉殖基因與小鼠白蛋白外顯子1序列之間的接合點之探針進行之在細胞水準下之雙向構築體插入（圖8A）。循環hFIX含量與對於雜合轉錄物呈陽性之細胞的數目相關（圖8B）。 圖9A展示活體內hFIX表現之持久性。圖9B表明自白蛋白之內含子1之表現持續。 圖10A至10B展示不同AAV或LNP劑量可活體內調節自白蛋白基因之內含子1之hFIX表現之量。 圖11A至11C展示在初級食蟹獼猴肝細胞中在靶點上篩選雙向構築體之結果。圖11A展示偵測到樣品中之各者之如藉由插入缺失形成所量測之變化之編輯量。圖11B及圖11C展示相當大之插入缺失形成量不預測雙向構築體向白蛋白之內含子1中之插入或表現。 圖12A至12C展示在初級人類肝細胞中在靶點上篩選雙向構築體之結果。圖12A展示偵測到樣品中之各者之如藉由插入缺失形成所量測之編輯。圖12B、圖12C及圖12D展示相當大之插入缺失形成量不預測雙向構築體向白蛋白基因之內含子1中之插入或表現。 圖13展示其中非人類靈長類動物給藥LNP以及雙向hFIX插入模板（來源於P00147）之活體內研究之結果。僅在經LNP與AAV治療之動物中達成全身性hFIX含量，其中單獨使用AAV或LNP不可偵測到hFIX。

Claims (81)

  1. 一種雙向核酸構築體，其包含： a）包含諸如多肽之藥劑之編碼序列的第一區段；及 b）包含該藥劑之編碼序列之反向互補序列的第二區段， 其中該構築體不包含驅動諸如多肽之該藥劑表現之啟動子。
  2. 一種雙向核酸構築體，其包含： a）包含諸如第一多肽之第一藥劑之編碼序列的第一區段；及 b）包含諸如第二多肽之第二藥劑之編碼序列之反向互補序列的第二區段， 其中該構築體不包含驅動所述藥劑表現之啟動子。
  3. 如請求項1或2所述之雙向核酸構築體，其中該第二區段處於該第一區段之3'。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之雙向核酸構築體，其中該第二區段中之反向互補序列之編碼序列採用與該第一區段之第一編碼序列不同的密碼子用法。
  5. 如請求項1至4中任一項所述之雙向核酸構築體，其中該第二區段包含與該第一區段中之編碼序列具有至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%或約99%互補性之核苷酸序列。
  6. 如請求項1至5中任一項所述之雙向核酸構築體，其中該第二區段之編碼序列使用該第一區段中之編碼序列編碼之一或多個胺基酸的一或多個替代密碼子來編碼該多肽。
  7. 如請求項1至6中任一項所述之雙向核酸構築體，其中該第二區段包含該第一區段之編碼序列之反向互補序列或其片段。
  8. 如請求項7所述之雙向核酸構築體，其中該反向互補序列： a.   未與該第一區段之編碼序列大幅互補； b.   未與該第一區段之編碼序列之片段大幅互補； c.   與該第一區段之編碼序列高度互補； d.   與該第一區段之編碼序列之片段高度互補； e.   與該第一區段之編碼序列之反向互補序列至少60%一致； f.   與該第一區段之編碼序列之反向互補序列至少70%一致； f.   與該第一區段之編碼序列之反向互補序列至少90%一致； g.   與該第一區段之編碼序列之反向互補序列50至80%一致；及/或 h    與該第一區段之編碼序列之反向互補序列60至100%一致。
  9. 如請求項1至8中任一項所述之雙向核酸構築體，其中該構築體不包含同源臂。
  10. 如請求項1至9中任一項所述之雙向核酸構築體，其中該第一區段藉由連接子連接至該第二區段。
  11. 如請求項10所述之雙向核酸構築體，其中該連接子之長度為5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、500、1000、1500、2000個核苷酸。
  12. 如請求項1至11中任一項所述之雙向核酸構築體，其中該第一及第二區段中之各者包含聚腺苷酸化序列，諸如聚腺苷酸化信號序列或聚腺苷酸化尾序列。
  13. 如請求項1至12中任一項所述之雙向核酸構築體，其中該構築體包含剪接接受位。
  14. 如請求項13所述之雙向核酸構築體，其中該構築體包含該第一區段之第一剪接接受位5'及該第二區段之第二剪接接受位3'。
  15. 如請求項1至14中任一項所述之雙向核酸構築體，其中該構築體為雙股的，視需要為雙股DNA。
  16. 如請求項1至15中任一項所述之雙向核酸構築體，其中該構築體為單股的，視需要為單股DNA。
  17. 如請求項1至16中任一項所述之雙向核酸構築體，其中編碼該多肽之序列經密碼子最佳化。
  18. 如請求項1至17中任一項所述之雙向核酸構築體，其中該構築體包含以下末端結構中之一或多者：髮夾、環、反向末端重複序列（ITR）或螺環（toroid）。
  19. 如請求項1至18中任一項所述之雙向核酸構築體，其中該構築體包含一、二或三個反向末端重複序列（ITR）。
  20. 如請求項1至19中任一項所述之雙向核酸構築體，其中該構築體包含不超過兩個ITR。
  21. 如請求項1至20中任一項所述之雙向核酸構築體，其中該多肽為經分泌之多肽。
  22. 如請求項1至20中任一項所述之雙向核酸構築體，其中該多肽y為細胞內多肽。
  23. 如請求項2至22中任一項所述之雙向核酸構築體，其中該第一多肽及該第二多肽不同。
  24. 如請求項1至23中任一項所述之雙向核酸構築體，其中該多肽為變異型多肽。
  25. 如請求項1至24中任一項所述之雙向核酸構築體，其中該多肽為肝蛋白質。
  26. 如請求項1至24中任一項所述之雙向核酸構築體，其中該多肽為非肝蛋白質。
  27. 如請求項1至26中任一項所述之雙向核酸構築體，其中該構築體為非同源依賴性構築體。
  28. 如請求項1至27中任一項所述之雙向核酸構築體，其中該多肽在表現時包含異源信號肽。
  29. 如請求項1至28中任一項所述之雙向核酸構築體，其中該核酸編碼異源信號肽。
  30. 如請求項1至27中任一項所述之雙向核酸構築體，其中該核酸不編碼信號肽。
  31. 如請求項1至27中任一項所述之雙向核酸構築體，其中該多肽在表現時包含其自身信號肽。
  32. 如請求項1至31中任一項所述之雙向核酸構築體，其中該核酸編碼異源肽。
  33. 如請求項32所述之雙向核酸構築體，其中該異源肽為2A。
  34. 一種載體，其包含如請求項1至33中任一項所述之構築體。
  35. 如請求項34所述之載體，其中該載體為腺相關病毒（AAV）載體。
  36. 如請求項34或35所述之載體，其中該AAV包含單股基因體（ssAAV）或自補基因體（scAAV）。
  37. 如請求項34或35所述之載體，其中該AAV載體選自由以下者組成之群：AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAVrh.64R1、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.32.33、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV2/8、AAVrh10、AAVLK03、AV10、AAV11、AAV12、rh10及其雜合體。
  38. 一種病毒載體，其包含含有編碼多肽之核苷酸序列的自補（或雙股）核酸構築體，其中該載體不包含驅動該多肽表現之啟動子。
  39. 如請求項38所述之載體，其中該載體不包含同源臂。
  40. 一種脂質奈米粒子，其包含如請求項1至33中任一項所述之構築體。
  41. 一種宿主細胞，其包含如請求項1至33中任一項所述之構築體。
  42. 如請求項41所述之宿主細胞，其中該宿主細胞為肝臟細胞（liver cell）、肌肉細胞或神經元細胞。
  43. 如請求項41所述之宿主細胞，其中該宿主細胞為非分裂細胞類型。
  44. 如請求項41至43中任一項所述之宿主細胞，其中該宿主細胞表現由該構築體編碼之多肽。
  45. 如請求項41至44中任一項所述之宿主細胞，其中該宿主細胞為肝細胞（hepatocyte）。
  46. 一種修飾目標基因座之方法，其包含向細胞提供如請求項1至33中任一項所述之構築體、如請求項34至39中任一項所述之載體或如請求項40所述之LNP。
  47. 一種將構築體引入至細胞中之方法，其包含向該細胞提供如請求項1至33中任一項所述之構築體、如請求項34至39中任一項所述之載體或如請求項40所述之LNP。
  48. 一種在細胞中表現多肽之方法，其包含向該細胞提供如請求項1至33中任一項所述之構築體、如請求項34至39中任一項所述之載體或如請求項40所述之LNP。
  49. 一種增加多肽在細胞中之表現之方法，其包含向該細胞提供如請求項1至33中任一項所述之構築體、如請求項34至39中任一項所述之載體或如請求項40所述之LNP。
  50. 如請求項46至49中任一項所述之方法，其中該構築體、載體或LNP以活體內提供。
  51. 如請求項46至49中任一項所述之方法，其中該構築體、載體或LNP以試管內提供。
  52. 一種修飾目標基因座之活體外方法，其包含向細胞提供如請求項1至33中任一項所述之構築體、如請求項34至39中任一項所述之載體或如請求項40所述之LNP。
  53. 如請求項46至52中任一項所述之方法，其中該細胞為非分裂細胞類型。
  54. 如請求項46至53中任一項所述之方法，其進一步包含向該細胞提供核酸酶，其中該核酸酶能夠引入位點專一性ssDNA或dsDNA斷裂。
  55. 如請求項46至54中任一項所述之方法，其包含向該細胞提供經RNA引導之DNA結合劑及引導RNA（gRNA）。
  56. 如請求項55所述之方法，其中該gRNA為單gRNA（sgRNA）。
  57. 如請求項55或56所述之方法，其中向該細胞同時提供該構築體、經RNA引導之DNA結合劑及該gRNA。
  58. 如請求項55或56所述之方法，其中向該細胞以任何次序相繼提供該構築體、經RNA引導之DNA結合劑及該gRNA。
  59. 如請求項58所述之方法，其中在提供該gRNA及經RNA引導之DNA結合劑之前，向該細胞提供該構築體。
  60. 如請求項58所述之方法，其中在提供該構築體之前，向該細胞提供該經RNA引導之DNA結合劑或組合之經RNA引導之DNA結合劑及gRNA。
  61. 如請求項54至60中任一項所述之方法，其中該構築體於載體中提供。
  62. 如請求項54至60中任一項所述之方法，其中該構築體於脂質奈米粒子中提供。
  63. 如請求項54至62中任一項所述之方法，其中該經RNA引導之DNA結合劑以編碼經RNA引導之DNA結合劑之核酸提供。
  64. 如請求項54至62中任一項所述之方法，其中該經RNA引導之DNA結合劑以Cas酶或編碼經RNA引導之DNA結合劑之mRNA提供。
  65. 如請求項54至62中任一項所述之方法，其中該經RNA引導之DNA結合劑為Cas核酸酶，諸如Cas9核酸酶。
  66. 如請求項65所述之方法，其中該Cas核酸酶為第2類Cas核酸酶或其變異體。
  67. 如請求項54至66中任一項所述之方法，其中該Cas核酸酶為釀膿鏈球菌（S. pyogenes ）Cas9或其變異體。
  68. 如請求項54至67中任一項所述之方法，其中該Cas核酸酶為切口酶（nickase）。
  69. 如請求項54至68中任一項所述之方法，其中該基因座為白蛋白基因座。
  70. 如請求項54至69中任一項所述之方法，其中該細胞為非分裂細胞類型。
  71. 如請求項54至70中任一項所述之方法，其中該細胞為肝臟細胞、神經元細胞或肌肉細胞。
  72. 一種細胞，其藉由如請求項46至71中任一項所述之方法製得。
  73. 如請求項72所述之細胞，其中該細胞為宿主細胞。
  74. 如請求項73所述之宿主細胞，其中該宿主細胞為肝臟細胞、肌肉細胞或神經元細胞。
  75. 如請求項72至74中任一項所述之細胞，其中該宿主細胞為非分裂細胞類型。
  76. 如請求項72至75中任一項所述之細胞，其中該宿主細胞表現由該構築體編碼之多肽。
  77. 如請求項72至76中任一項所述之細胞，其中該宿主細胞為肝細胞。
  78. 如請求項1至33中任一項所述之雙向核酸構築體，其中該藥劑為治療劑。
  79. 如請求項1至33中任一項所述之雙向核酸構築體，其中該藥劑為功能性RNA、mRNA或多肽中之任何一或多者。
  80. 如請求項1至33中任一項所述之雙向核酸構築體，其中該藥劑為多肽。
  81. 如請求項1至33中任一項所述之雙向核酸構築體，其中該藥劑為治療性多肽。
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