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KR101748575B1 - Ins 유전자 녹아웃 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델 및 이의 제조방법 - Google Patents

Ins 유전자 녹아웃 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델 및 이의 제조방법 Download PDF

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KR101748575B1
KR101748575B1 KR1020160172849A KR20160172849A KR101748575B1 KR 101748575 B1 KR101748575 B1 KR 101748575B1 KR 1020160172849 A KR1020160172849 A KR 1020160172849A KR 20160172849 A KR20160172849 A KR 20160172849A KR 101748575 B1 KR101748575 B1 KR 101748575B1
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KR
South Korea
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diabetic
animal model
diabetes
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gene knockout
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박광욱
강정택
조범래
김수진
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주식회사 엠젠플러스
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Abstract

본 발명은 INS 유전자 녹아웃 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 sgRNA(small guide RNA)를 암호화하는 DNA 서열 및 Cas9 유전자를 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델 제작용 재조합 벡터를 이용한 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 INS 유전자의 녹아웃을 위한 특이적 sgRNA 및 CRISPR/Cas9법을 이용한 재조합 벡터는 형질전환된 동물에서 INS 유전자를 암호화하는 DNA 가닥을 전부 또는 일부를 변형시켜 당뇨병, 특히 제1형 당뇨병을 효과적으로 유도할 수 있으며 아울러 당뇨병 합병증을 수반할 수 있다. 당뇨병은 만성 질환으로, 당뇨병 환자들은 대개 합병증으로 고통으로 받고 있는바, 이에 대한 실질적인 예방 또는 치료를 위하여 장기간 연구를 가능하게 하는 본 발명에 따른 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물 모델을 이용하는 것이 매우 유용하다. 따라서 본 발명에 따른 INS 유전자 녹아웃 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델은 관련 질병의 기전의 규명, 치료물질의 탐색, 진단법의 개발 등에 다양하게 활용될 수 있다.

Description

INS 유전자 녹아웃 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델 및 이의 제조방법{INSulin gene knockout diabetes mellitus or diabetic complications animal model and a method for producing the same}
본 발명은 INS 유전자 녹아웃 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 sgRNA(small guide RNA) 및 Cas9 유전자를 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델 제작용 재조합 벡터를 이용한 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
CRISPR(무리 지어진 규칙적 공간 사이의 짧은 회문구조 반복부(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat))는 바이러스 공격을 방어하기 위한 적응성 면역계로서 박테리아에서 진화하였다. 바이러스에 노출 시, 바이러스 DNA의 짧은 세그먼트는 CRISPR 좌위 내로 통합된다. RNA는 바이러스 서열을 포함하는, CRISPR 좌위의 일부로부터 전사된다. 바이러스 게놈에 상보적인 서열을 함유하는 해당 RNA는 바이러스 게놈 내 표적 서열에 대해 Cas9 단백질의 표적화를 매개한다. Cas9 단백질은 절단되고, 이에 의해 바이러스 표적을 침묵시킨다. 즉, CRISPR/Cas 시스템에 기반하여 표적화된 유전자 조절이 가능하다.
노령화 사회로의 진입, 생활양식, 식생활, 사회문화의 변화로 인하여 고혈압, 심장병, 동맥경화증 및 당뇨병 합병증 등의 만성퇴행성 질환의 발생률이 높아지고 있다. 특히 당뇨병 합병증 환자의 수는 지난 약 20년간에 걸쳐 최고 12배 이상 급격히 증가하고 있다. 제1형 당뇨병 합병증은 전체 당뇨병 합병증의 약 10% 정도를 차지하며, 인슐린을 분비하는 췌장의 베타세포가 파괴되어 인슐린 결핍이 유발되어 고혈당, 당뇨, 조갈(polydipsia) 및 체중감소의 증상이 나타난다. 전체 당뇨병 합병증 중 약 90%를 차지하는 제2형 당뇨병 합병증에서는 인슐린 민감 세포가 정상농도의 인슐린에 반응하지 않는 인슐린 저항성을 극복하기 위해 췌장의 베타세포가 인슐린 분비를 증가시키는데, 시간이 경과함에 따라 베타세포의 과부하에 의해 기능이 악화되면서 인슐린 분비가 감소하고 그로 인해 고혈당이 나타나게 된다. 이와 같이 각각의 베타세포의 기능 감소 또는 전체 베타세포의 양의 감소로 정의되는 베타세포의 기능 장애가 당뇨병 합병증의 전형적인 특징이다.
마우스와 같은 동물들은 인간과의 디멘존, 번식, 수명 및 행동양상의 확연한 차이로 인해 보다 인간과 가까운 종을 이용한 질환동물 모델에 대한 필요성이 제기되었고, 영장류의 경우 그 희소성, 사육관리비용 및 사육관리의 어려움으로 인해 극히 제한적인 분야에서만 질환연구에 활용 가능한 제약이 있으므로, 이에 따라 비교적 저렴한 비용과 시설에서 보다 정확한 난치질환 연구를 할 수 있는 돼지를 새로운 모델 동물로서 바이오 메디컬 분야에 활용하고자 하는 요구가 증가되고 있다.
돼지는 해부 생리학적으로 인간과 유사성이 인정되어 이미 각종 질환의 병리학적 기전과 치료를 위한 연구에 이용되고 있으며, 특히 오랫동안 경제 동물로 가치가 인정되어 다른 중/대 동물을 질환모델로 사용할 때보다 윤리적인 문제점을 피해갈 수 있으며, 안정적인 사육 시스템이 구축되어 있어 실험동물 모델 개발시 유지 및 관리가 용이한 장점이 있다. 특히 돼지의 췌장은 인간의 췌장과 유사한 크기, 모양, 혈류 및 내분비 세포의 분포를 가지는 것이 널리 인정되어 있으므로 당뇨병 동물모델로서 돼지를 이용하여 인간의 당뇨병을 연구하는 것이 유용하다.
이에, 본 발명자들은 sgRNA 및 Cas9 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제작하였고, 이를 이용하여 효율적으로 INS 유전자를 녹아웃시켜 당뇨병 동물모델, 특히 제1형 당뇨병 및 당뇨병 합병증에 대한 동물모델을 제조할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
한국특허 공개번호 제10-2010-0045192호 한국특허 공개번호 제10-2013-0117165호
본 발명의 목적은 sgRNA(small guide RNA)를 암호화하는 DNA 서열 및 Cas9 유전자를 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델 제작용 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터가 도입된 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델 제작용 형질전환 세포주를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 형질전환 세포주를 탈핵된 난자에 이식하여 핵 이식란을 형성하는 단계; 및 상기 핵이식란을 대리모의 난관에 이식하는 단계;를 포함하는, INS 유전자 녹아웃 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델의 제조방법 및 상기 방법으로 생산한 INS 유전자 녹아웃 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 INS 유전자 녹아웃 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델을 이용한 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 개선 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 sgRNA(small guide RNA)를 암호화하는 서열번호 1 및 2 중 어느 하나 이상의 염기서열로 표시되는 DNA 서열; 및 Cas9 유전자;를 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델 제작용 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터가 도입된, 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델 제작용 형질전환 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환 세포주를 탈핵된 난자에 이식하여 핵 이식란을 형성하는 단계; 및 상기 핵이식란을 대리모의 난관에 이식하는 단계;를 포함하는, INS 유전자 녹아웃 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 생산한 INS 유전자 녹아웃 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 INS 유전자 녹아웃 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델에 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 개선 또는 치료제 후보물질을 투여하는 단계; 및 2) 상기 후보물질을 투여한 동물모델을 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 후보물질에 의해 혈당 수치가 감소되는 경우 이를 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 개선 또는 치료제로 판단하는 단계;를 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 개선 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 INS 유전자의 녹아웃을 위한 특이적 sgRNA 및 CRISPR/Cas9법을 이용한 재조합 벡터는 형질전환된 동물에서 INS 유전자를 암호화하는 DNA 가닥을 전부 또는 일부를 변형시켜 당뇨병, 특히 제1형 당뇨병을 효과적으로 유도할 수 있으며 아울러 당뇨병 합병증을 수반할 수 있다. 당뇨병은 만성 질환으로, 당뇨병 환자들은 대개 합병증으로 고통으로 받고 있는바, 이에 대한 실질적인 예방 또는 치료를 위하여 장기간 연구를 가능하게 하는 본 발명에 따른 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물 모델을 이용하는 것이 매우 유용하다. 따라서 본 발명에 따른 INS 유전자 녹아웃 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델은 관련 질병의 기전의 규명, 치료물질의 탐색, 진단법의 개발 등에 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 재조합 벡터가 INS 유전자 내 결실을 유도하는 염기를 나타내는 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 재조합 벡터의 개열지도를 나타내는 도이다.
도 3은 시퀀싱을 통하여 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 세포주에서 INS 유전자 녹아웃된 염기서열을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 4a는 한 대리모에서 태어난 INS 유전자 녹아웃이 이루어진 돼지에 대한 유전자형 검사를 통하여 INS 유전자 녹아웃이 이루어진 염기서열을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 4b는 두번째 대리모에서 태어난 INS 유전자 녹아웃이 이루어진 돼지에 대한 유전자형 검사를 통하여 INS 유전자 녹아웃이 이루어진 염기서열을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 4c는 세번째 대리모에서 태어난 INS 유전자 녹아웃이 이루어진 돼지에 대한 유전자형 검사를 통하여 INS 유전자 녹아웃이 이루어진 염기서열을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 5는 INS 유전자 녹아웃이 이루어진 돼지에 대한 혈당 수치 분석을 통하여 당뇨병 발병을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 6은 INS 유전자 녹아웃이 이루어진 돼지의 췌장에 대한 면역조직화학 분석을 통하여 당뇨병 발병을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 7은 INS 유전자 녹아웃이 이루어진 돼지의 췌장에 대한 인슐린 및 C-펩타이드 발현 변화 분석을 통하여 당뇨병 발병을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
본 발명은 INS 유전자 녹아웃 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델 및 이의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은 sgRNA(small guide RNA)를 암호화하는 DNA 서열; 및 Cas9 유전자;를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 포함하는 유전자 작제물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있으며, 예컨대 플라스미드, 코즈미드, 파지 입자, 바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 "재조합 벡터"는, 발현시키고자 하는 목적 폴리펩타이드의 암호화 유전자가 작동 가능하게 연결될 경우, 적절한 숙주 세포에서 상기 목적 폴리펩타이드를 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 폴리펩타이드의 발현 벡터로 사용될 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에서 발현 가능할 수 있다. 숙주 세포는 바람직하게는 진핵세포일 수 있으며, 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현 조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 sgRNA는 Cas9 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, Cas 단백질을 표적 DNA에 가져오는 RNA로서, 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 표시되는 DNA로부터 전사될 수 있다. 특히 목적하는 표적 DNA와의 결합을 위해 상기 sgRNA는 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 DNA로부터 전사되는 sgRNA를 모두 포함하는 것이 바람직하며, 이에 제한되는 것은 아니다.
Cas 유전자의 상대적으로 작은 크기(예를 들어, Cas9는 4.2 kbp)는 바이러스-매개 유전자 전달 같은 몇몇 적용 분야에서 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 조성물에 이점을 제공한다. 추가로, 이러한 sgRNA는 오프-타겟(off-target) 효과를 갖지 않고, 이에 따라 원하지 않는 돌연변이, 결실, 반전 및 중복을 야기하지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 Cas9 단백질은 CRISPR/Cas 시스템에서 필수적인 단백질 요소를 의미하고, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA (trans-activating crRNA, tracrRNA)로 불리는 두 RNA와 복합체를 형성할 때, 활성 엔도뉴클레아제 또는 니카아제(nickase)를 형성한다. Cas9 단백질을 암호화하는 유전자는 일반적으로 CRISPR-반복 스페이서 배열(CRISPR repeat-spacer array)과 관련있으며, 40개 이상의 서로 다른 Cas 단백질 패밀리가 존재한다. 대표적으로 세 종류의 CRISPR-Cas 시스템이 존재하며 그 중 Cas9 단백질을 수반하는 타입 Ⅱ CRISPR/Cas 시스템이 대표적이다.
특히 본 발명에 있어서 상기 Cas9 단백질을 암호화하는 Cas9 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 표시될 수 있으며, 이에 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 Cas9 단백질은 형광단백질과 결합되어 함께 발현되는 것을 특징으로 하며, 구체적으로 이를 위하여 Cas9 유전자를 링커, 예를들어 2A 펩타이드를 이용하여 형광단백질을 코딩하는 유전자와 결합시키는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 이에 따라 Cas9 단백질과 함께 형광단백질이 발현되고 발현된 형광단백질을 이용하여 유전자 편집된 세포들을 분리함으로써 유전자 편집 효율을 높일 수 있다. 상기와 같은 방법을 따라 제조된 재조합 벡터로 형질전환된 동물모델에서 당뇨병, 특히 제1형 당뇨병 및 당뇨병 합병증을 보다 효과적으로 유도할 수 있다.
상기 형광 단백질은 적색형광단백질(RFP), 녹색형광단백질(GFP), 노랑형광단백질(YFP), 청색형광단백질(CFC), DsRED, AsRED, AmCyan, ZsGreen 또는 ZsYellow일 수 있으나, GFP인 것이 바람직하며, 이에 본 발명이 제한되는 것은 아니고 상기 재조합 벡터가 형질주입(transfection)된 세포들을 보다 용이하게 검출할 수 있게 하는 것이라면 어느 것을 사용하여도 좋다.
상기 재조합 벡터 제조시 사용되는 제한효소는 EcoRI, BamHⅠ, BglⅡ, Hind Ⅲ, Pvu Ⅲ, BbsI일 수 있으며, 바람직하게는 BbsI일 수 있으며, 이에 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
상기 서열번호 1, 2 또는 3으로 표시되는 염기서열의 변이체 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명은 상기 염기서열의 등가물, 예를 들어, 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, INS 유전자 녹아웃 sgRNA 및 Cas9과 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 상기 sgRNA 및 Cas9은 각 서열번호 1, 2 또는 3의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 INS 유전자의 염기서열을 타겟으로 하여 염기서열을 변형 즉, 삽입 또는 결실시키는 것을 특징으로 하며, 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 엑손 2 및 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 엑손 3 중 어느 하나 이상을 타겟하는 염기서열에서 변형 즉, 삽입 또는 결실이 발생할 수 있다.
보다 바람직하게는 본 발명의 재조합 벡터에 의해 엑손 2의 각 대립형질(allele)에서 서열번호 6으로 표시되는 4개 염기의 결실, 서열번호 7로 표시되는 36개 염기의 결실, 서열번호 10으로 표시되는 1개 염기의 삽입 또는 서열번호 11로 표시되는 2개 염기의 결실이 발생할 수 있고, 엑손 3의 각 대립형질에서 서열번호 8로 표시되는 1개 염기의 삽입 및 서열번호 9로 표시되는 23개 염기의 결실이 발생할 수 있다. 한편, 상기 서열번호 6 내지 11의 염기서열은 단순한 예시일뿐, INS 유전자를 녹아웃하기 위한 것이라면 본 발명에 제한없이 포함된다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 재조합 벡터는 하기 도에 기재된 개열 지도를 갖는 것으로, 본 발명의 INS 유전자의 녹아웃을 달성할 수 있는 벡터의 구성이라면, 이에 제한되지 않는다.
[도]
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본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 12로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있으며, 이는 예시일 뿐 이에 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 sgRNA를 암호화하는 DNA 서열 및 Cas9 유전자를 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델 제작용 재조합 벡터가 도입된 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델 제작용 형질전환 세포주를 제공한다.
본 발명에 있어서 "세포주"는 세포를 분리해서 순수 배양하여 계대배양해 나갈때 세포계의 각 개체를 말하며, 이때 세포주는 유전적 형질에 의해 다른 세포주와 구별될 수 있으며, 계대배양에도 원 세포의 형질이 유지되는 것을 말한다.
본 발명에 있어서 상기 세포주는 난모세포주, 섬유아세포주 또는 신장세포주일 수 있으며, 바람직하게는 섬유아세포주이다. 상기 세포주는 보다 구체적으로 태아 유래 세포주를 이용할 수 있으며, 동시에 1차(primary) 세포주를 이용할 수 있는바, 본 발명의 세포주는 1차 신장세포주 또는 1차 태아섬유아세포주를 이용하는 것이 보다 바람직하고, 1차 태아섬유아세포주를 이용하는 것이 가장 바람직하나, 이에 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 "형질전환"은 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것으로, 즉 생물의 어떤 계통의 세포에서 추출된 핵산의 일종인 DNA를 다른 계통의 살아있는 세포의 주었을 때 DNA가 그 세포에 들어가서 유전형질이 변화하는 현상으로 형질변환, 형전환 또는 형변환 등이라고도 한다. 즉, "형질전환"이란 유전자를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미한다.
본 발명의 재조합 벡터를 세포주에 도입하여 형질전환하는 방법은 본 발명의 재조합 벡터를 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적인 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포 융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposem-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기 침공법(electroporation) 등의 공지 방법으로 진핵세포에 도입하여 형질전환시킬 수 있으며, 바람직하게는 미세주사 방법을 이용하여 형질전환시킬 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 형질전환 세포주는 수탁번호 KCLRF-BP-00374인 세포주일 수 있으며, 이에 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환 세포주를 탈핵된 난자에 이식하여 핵 이식란을 형성하는 단계; 및 상기 핵이식란을 대리모의 난관에 이식하는 단계;를 포함하는 INS 녹아웃 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델의 제조방법을 제공한다.
상기 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델의 제조방법은 체세포 핵이식(SCNT; somatic cell nuclear transfer)에 의한 것이며, 본 발명에 있어서 "체세포 핵이식"은 생식과정에서 일반적으로 이루어지는 감수분열 및 반수 염색체 보유 생식세포를 경유하지 않고도 자손을 탄생시킬 수 있는 유전자 조작기술로서 성체가 가진 배수체 보유 체세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 수정란을 생산하고 상기 수정란을 생체 내로 이식하여 새로운 개체를 발생시키는 방법이다.
본 발명에 있어서, "핵 이식란"은 핵 공여 세포가 도입 또는 융합된 난자를 말한다.
본 발명에 있어서 "융합"은 핵 공여 세포와 난자의 지질막 부분의 결합을 의미한다. 예를 들어, 지질막은 세포의 플라스마막 또는 핵막이 될 수 있다. 융합은 핵 공여 세포와 난자가 서로 인접하게 위치해 있는 경우 또는 핵 공여세포가 수핵 난자의 주란강(perivitelline space) 내에 위치해 있는 경우에 전기적 자극을 가함으로써 일어날 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 형질전환 세포주는 핵 공여 세포로서, 핵 수용체인 난자로 핵을 전달하는 세포 또는 세포의 핵을 말한다.
본 발명에 있어서, 난자는 바람직하게는 제2차 감수분열 중기까지 도달한 성숙난자를 말하며, 어떤 동물의 난자일 수 있으나, 바람직하게는 돼지의 난자를 말한다.
또한, 본 발명은 상기 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델의 제조방법으로 생산한 INS 유전자 녹아웃 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델을 제공한다.
본 발명에 있어서 "당뇨병"은 혈장 내 인슐린 수준의 절대적 혹은 상대적 결핍으로 인슐린 작용의 부족에 의한 만성 고혈당증을 특징으로 하면서 여러 특징적인 대사 이상을 수반하는 질환군을 의미한다. 당뇨병은 제1형 및 제2형으로 구분되는데, 제1형 당뇨병은 이전에 '소아 당뇨병'이라고 불렸으며, 인슐린을 전혀 생산하지 못하는 것이 원인이 되어 발생하는 질환이다. 인슐린이 상대적으로 부족한 제2형 당뇨병은 인슐린 저항성(insulin resistance; 혈당을 낮추는 인슐린 기능이 떨어져 세포가 포도당을 효과적으로 연소하지 못하는 것)을 특징으로 한다. 제2형 당뇨병은 식생활의 서구화에 따른 고열량, 고지방, 고단백의 식단, 운동 부족, 스트레스 등 환경적인 요인이 크게 작용하는 것으로 보이지만, 이 외에 특정 유전자의 결함에 의해서도 당뇨병이 생길 수 있으며, 췌장 수술, 감염, 약제에 의해서도 생길 수 있다. 본 발명에 있어서 상기 당뇨병은 제1형 당뇨병인 것이 바람직하나, 이에 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
한편, 상기 당뇨병은 일반적으로 당뇨병 합병증을 수반하며, 본 발명의 동물모델은 당뇨병뿐만 아니라 급성 또는 만성 당뇨병 합병증에 대한 동물모델로 사용될 수 있으며, 보다 바람직하게는 만성 당뇨병 합병증에 대한 동물모델로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 "당뇨병 합병증"은 당뇨병으로 인하여 혈당이 높은 상태에서 치료를 받지 않아 고혈당인 상태가 지속됨에 따라 발생할 수 있는 다양한 병증을 모두 포함하여, 상기 합병증은 고혈당증(hyperglycemia), 고인슐린혈증(hyperinsulinemia), 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia), 지질대사이상(dyslipidemia), 공복혈당장애(impaired fasting glucose), 내당능 이상(impaired glucose tolerance), 비만, 동맥경화증, 미세혈관병증, 신장질환, 심장질환, 족부궤양, 관절염, 골다공증, 당뇨병성 망막증 및 그 외 하나 이상의 안과질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 "동물모델"이란 사람의 질병과 아주 유사한 형태의 질병을 가진 동물을 말한다. 사람의 질병 연구에 있어 질환모델 동물이 의미를 갖는 것은 사람과 동물들 간의 생리적 또는 유전적인 유사성에 의한다. 질병 연구에 있어 생체의학 질환모델 동물은 질병의 다양한 원인과 발병과정 및 진단에 대한 연구용 재료를 제공해주고, 질환모델 동물의 연구를 통해 질병에 관련된 유전자들을 알아내고, 유전자들 간의 상호작용을 이해할 수 있게 하고, 개발된 신약후보물질의 실제 효능 및 독성 검사를 통해 실용화 가능성의 여부를 판단하는 기초 자료를 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서 "동물" 또는 "실험동물"은 인간 이외의 임의의 포유류 동물을 의미한다. 상기 동물은 배아, 태아, 신생아 및 성인을 포함하는 모든 연령의 동물을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 동물들은, 예를 들어, 상업용 소스로부터 이용할 수 있다. 이런 동물들은 실험용 동물 또는 다른 동물, 토끼, 설치류(예를 들어, 생쥐, 쥐, 햄스터, 게르빌루스 및 기니피그), 소,양, 돼지, 염소, 말, 개, 고양이, 새(예를 들어, 닭, 칠면조, 오리, 거위), 영장류(예를 들어, 침팬지, 원숭이, 붉은털원숭이)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 가장 바람직한 동물은 돼지이다.
돼지는 해부 생리학적으로 인간과 유사성이 인정되어 이미 각종 질환의 병리학적 기전과 치료를 위한 연구에 이용되고 있으며, 특히 오랫동안 경제 동물로 가치가 인정되어 다른 중/대 동물을 질환모델로 사용할 때보다 윤리적인 문제점을 피해갈 수 있으며, 안정적인 사육 시스템이 구축되어 있어 실험동물 모델 개발시 유지 및 관리가 용이한 장점이 있다.
또한, 본 발명은 1) 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델에 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 개선 또는 치료제 후보물질을 투여하는 단계; 및 2) 상기 후보물질을 투여한 동물모델을 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 후보물질에 의해 혈당 수치가 감소되는 경우 이를 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 개선 또는 치료제로 판단하는 단계;를 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 개선 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서 "후보물질"은 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 개선 및 치료제로서 테스트할 물질을 의미하며, 예컨대 추출물, 단백질, 올리고펩티드, 소형 유기 분자, 다당류, 폴리뉴클레오티드 및 광범위한 화합물 등의 임의 분자를 포함할 수 있다. 이러한 후보물질은 또한 천연물질뿐만 아니라, 합성물질도 포함한다.
본 발명에 있어서 "개선"과 "치료"는, 상기 후보물질의 투여로 상기 동물모델의 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서 "대조군"은 실험 결과가 제대로 도출되었는지 여부를 판단하기 위해 어떤 조작이나 조건도 가하지 않은 집단을 말하며, 실험의 직접적인 목적을 이루기 위해 설정된 집단인 실험군과 달리, 대조군은 실험군의 결과를 좀 더 확실하게 하기 위해 설정된 집단이다. 본 발명에서의 대조군은 바람직하게는 상기 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델에 후보물질을 처리하지 않은 집단을 말한다.
본 발명에 있어서 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델은 당뇨병 또는 당뇨병 합병증에 대한 질병 모델로서, 상기 스크리닝 방법에 의하여 얻은 물질을 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 환자에 대한 치료물질의 탐색, 부작용 확인, 진단법의 개발 등에 다양하게 활용하여 당뇨병 또는 당뇨병 합병증과 이의 합병증에 대한 개선 또는 치료제를 개발할 수 있다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 및 실험예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예 및 실험예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. CRISPR / Cas 9 시스템을 통한 INS (insulin) 유전자 녹아웃 재조합 벡터의 제조
INS 유전자를 녹아웃시키기 위한 재조합 벡터를 제조하기 위해 사용한 sgRNA(작은 가이드 RNA, small guide RNA)를 암호화하는 DNA 서열은 온라인 CRISPR 디자인 툴(http://crispr.mit.edu)을 이용하여 제조하였고, 구체적으로는 하기 표 1의 서열번호 1 및 2로 표시되는 서열을 사용하였으며, 이는 돼지의 INS 유전자를 특이적으로 인식하여 각각 INS 유전자의 엑손 2(서열번호 4) 및 엑손 3(서열번호 5)에서 DNA 가닥을 녹아웃하도록 고안된 sgRNA 서열을 암호화하는 DNA 서열이다. 굵은 색 글씨의 서열은 PAM 염기서열을 나타낸다.
염기서열
sgRNA 1 5'-GCTACACGCCCAAGGCCCGT(서열번호 1)CGG-3'
sgRNA 2 5'-GCCGCAGAAGCGTGGCATCG(서열번호 2)TGG-3'
상기 제조된 sgRNA를 BbsI 제한 효소(New England Biolabs, MA, USA)를 사용하여 px458 벡터(addgene, MA, USA)로 도입하였다. 상기 벡터는 생체 내 전사시에 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 DNA로 부터 sgRNA를, 서열번호 3의 염기서열(Addgene사(비영리기관)로부터 구매한 Cas9 서열을 사용함)로 표시되는 Cas9 DNA 서열로부터 Cas9 mRNA를 생성하는 주형으로 사용되었다. 이때 Cas9 유전자는 링커인 2A 펩타이드를 통해 GFP를 암호화하는 유전자와 연결되어 있어, 한 번에 Cas9 단백질과 GFP 단백질이 발현될 수 있다. 상기 과정을 통해 제작한 재조합 벡터가 타겟하는 INS 유전자 내 서열을 나타내는 도식도는 도 1에 나타내고, 상기 재조합 벡터의 개열지도 및 전체 염기서열은 각각 도 2 및 서열번호 12로 나타내었다.
실시예 2. 재조합 벡터를 이용한 섬유아세포의 형질전환
상기 실시예 1에서 제조한 재조합 벡터를 NucleofectorTM(LONZA, Basel, Switzerland)를 사용하여 전기천공법으로 돼지 1차(primary) 섬유아세포로 도입하였다. 이때 사용한 섬유아세포는 PWG 마이크로돼지로부터 분리한 것이며, 5% 이산화탄소 및 37℃ 조건에서 20% 소태아혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, CA, USA)이 포함된 DMEM(Biowest, Nuaille, France) 배지 내에서 유지하였다. 형질전환을 수행하고 48시간이 경과한 후, 유전적으로 변형된 세포를 풍부하게 하기 위하여 FACSAriaTM 세포 분류기(BD Biosience, CA, USA)를 사용하여 세포분류를 수행하였다. 분류된 세포를 제한 희석 방법(limiting dilution method)으로 시딩(seeding)하고 단일 세포 유래 세포주를 만들기 위해 배양하였다. 각 세포주를 48개, 24개, 6개의 웰 플레이트 및 100 mm 배양 디쉬에 연속적으로 하위 배양하였다. 단일 세포 세포주로부터 추출한 세포는 SCNT 공여 세포로 사용할 때까지 액체 질소 탱크에 얼려서 보관하였다. 상기 일련의 과정을 통해 수득한 형질전환된 세포주는 2016년 10월 12일자로 한국세포주연구재단(Korean Cell Line Bank, 서울, 한국)에 기탁하고 수탁번호 KCLRFBP00374를 부여받았다.
실시예 3. 섬유아세포에서 INS 유전자의 녹아웃 확인
상기 실시예 2에서 생산한 형질전환 세포에서 INS 유전자 녹아웃이 정상적으로 발생하였는지 여부를 확인하기 위하여 PCR을 수행하였다. 먼저, INS 유전자 녹아웃 확인을 위한 형질전환 세포의 유전체 DNA는 제작자의 메뉴얼에 따라 DNA 추출 키트(iNtRon Biotechnology, Seongnam-si, Korea)를 사용하여 추출하였다. PCR은 Pfu Plus 5x master mix(ELPIS biotech, Daejeon, Korea)를 이용하여 수행하였다. 보다 구체적으로, 첫번째 PCR은 다음과 같은 방법으로 하기 표 2에 나타낸 돼지 INS 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 30회 반복하여 수행하였다: 5분 동안 95℃에서 1차 변성을 1회 반복하였고, 후에 30초 동안 95℃에서 변성, 30초 동안 58℃에서 어닐링(annealing) 및 30초 동안 72℃에서 연장하는 단계를 30회 반복하였으며, 마지막으로 10분 동안 72℃에서 후-연장을 1회 반복하였다. 두번째 PCR은 주형으로 첫번째 PCR 산물을 희석(1:100)한 것을 사용하여 35회 반복하여 수행하였고 구체적인 35회 반복 PCR 방법은 하기 표 2에 나타낸 프라이머를 이용하여 첫번째 PCR과 동일한 조건으로 수행하였다.
서열번호 서열(5'→3')
첫번째 PCR 13 정방향 프라이머 CTCCTCTCTCGGAGCCCTT
14 역방향 프라이머 TTATTGGGTTTTGGGGTGC
두번째 PCR(엑손 2) 15 정방향 프라이머 GTCCCCCAGGTCCTCACC
16 역방향 프라이머 CCCACCCTGGAGTGGAAG
두번째 PCR(엑손 3) 17 정방향 프라이머 GTCGGGGGAGTTTTTAAGGA
18 역방향 프라이머 GGAGCAGCAGGCGCCCTCAG
추가적으로 T7 엔도뉴클라아제 I(T7E1) 분석법을 수행하였다. 구체적으로 정제한 두번째 PCR 산물을 5분 동안 95℃에서 변성하고 -2℃/초로 85℃까지, -0.1℃/초로 25℃까지에서 리어닐링(re-anneal)하였고, 그 후 리어닐링한 산물을 37℃에서 30분 동안 T7E1(ToolGen labs) 효소로 분해하였다. 두번째 PCR 산물 및 T7E1으로 분해된 산물은 TAE 버퍼에서 2% 아가로스 겔을 사용하여 전기영동시키고, 이후 이를 UV 트랜스일루미네이터를 사용하여 시각화하였다. 또한, INS 유전자의 표적 부위에서 유전자 변형이 있어난 것으로 추측되는 두번째 PCR 산물은 시퀀싱(sequencing)으로 확인하였다. 10개의 세포주에 대하여 수행한 시퀀싱 결과는 도 3에 나타내었다. 붉은색으로 표시한 형질전환으로 추가된 염기를 나타내며, 파란색으로 표시한 염기는 형질전환으로 치환된 염기를 나타낸다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 엑손 2 또는 엑손 3 범위 내의 염기서열에서 삽입 또는 결실을 포함하는 변형이 발생하는 것을 확인하였다. 이 후 실험에서는 상기 변형이 발생한 세포주 중 세포주 #32 및 #33를 서열번호 1로 표시되는 sgRNA에 의한 INS 유전자 녹아웃 돼지의 SCNT 핵 공여 세포로 사용하였고, 세포주 #8를 서열번호 2로 표시되는 sgRNA에 의한 INS 유전자 녹아웃 돼지의 SCNT 핵 공여 세포로 사용하였다.
실시예 4. 핵 공여 세포의 체세포 핵이식 ( SCNT ; Somatic cell nuclear transfer) 및 이에 따른 INS 유전자 녹아웃 돼지의 제조
4-1. 동물 실험에 사용된 돼지
본 실험에 대리모로 사용한 돼지는 총 3마리로, MGENPLUS사(한국)의 동물실험윤리위원회(IACUC; Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인받아 사용하였고, 이하 돼지를 이용한 모든 실험 과정은 위원회의 가이드라인에 따라 수행하였다. 수술 과정은 일반적인 마취 하에 수행되었고, 최대한 동물의 고통을 줄이기 위한 방향으로 진행되었다. 일반적인 가축 사양조건에서 돼지를 사육하였다.
4-2. SCNT에 사용되는 난자의 제조
SCNT를 수행하기 위하여 핵 수여 세포가 될 난자를 제조하기 위해, 지역 도살장으로부터 수집한 돼지 난자를 25 내지 30℃에서 0.9%(W/V) NaCl 조건하의 실험실로 옮겨왔다. 난자는 동난포(antral follicle; 지름 3 내지 6 mm의 크기)로부터 얻었고, 100% 습소, 5% 이산화탄소 및 39℃ 조건 하에 성숙 배지에서 배양하였다. 44시간 경과 후, 성숙된 난자를 사이토칼라신 B(5mg/ml 스톡(stock), 10 ml 조작 배지 당 1.5 μm)로 보충한 조작된 배지에서 얇은 유리 파이펫(지름 20 μm)으로 제1 극제 및 인접 세포질을 흡입하여 탈핵화시켰다. 후에 이는 SCNT에 사용되는 핵 수여자 세포로 사용되었다.
4-3. 핵 공여 세포의 SCNT 수행
상기 실시예 3을 통하여 선별된 정상적인 INS 유전자 녹아웃 돌연변이가 일어난 세포인, 핵 공여자 세포 하나를 실시예 4-2에서 제조한 탈핵화된 난자의 위란강(perivitelline space)으로 주입하였다. 핵 공여자 세포막은 난자의 세포질막과 접촉되어 있는 상태이다. 난자 세포질-세포막 복합체는 융합되었고 전기적인 펄스(BTX, 60초 동안 두 개의 1.1 kV/cm 직류 펄스)로 활성화되었다. 재구성된 수정란을 14 내지 16시간 동안 39℃ 및 5% 이산화탄소의 조건 하에 PZM3에서 히스톤 디아세틸라제 억제제인 Scriptaid 0.5 μM와 함께 배양하였다.
4-4. INS 유전자 녹아웃 돼지의 제조
손상되지 않은 막을 가진 수정란을 발정기(estrus)가 2일 경과한 후에 수술을 통하여 대리모의 나팔관으로 주입하였다(평균 256개의 수정란). 임신이 성공적인지 여부는 수정란 이식 후 28일이 경과한 후에 초음파로 확인하였다. 약 114일이 경과한 후에, 복제된 돼지는 제왕절개(c-section)를 실시하여 대리모의 배에서 꺼냈다.
실시예 5. 유전형질 분석( genotyping assay)을 통한 INS 유전자 녹아웃 돼지의 녹아웃 확인
SCNT를 통한 INS 유전자 녹아웃이 정상적으로 이루어졌는지 여부를 확인하기 위하여 돼지가 태어난 날에 각 돼지에 대하여 유전체 DNA 추출 및 유전자형 검사를 위해 꼬리 생체검사(tale biopsy)수행하였다. 먼저, 태어난 산자의 꼬리로부터 유전체 DNA 추출 시료를 얻었고, 각 유전체 DNA는 제작자의 메뉴얼에 따라 DNA 추출 키트(iNtRon Biotechnology, Seongnam-si, Korea)를 사용하여 추출하였다. 이 후 실시예 3에서 수행한 방법과 동일한 방법으로 꼬리 생체검사를 수행하였다. 유전자형 검사 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 실시예 4에서 형질전환된 세포, 즉 핵 공여자 세포에서 발견된 돌연변이와 동일한 돌연변이가 제조된 INS 유전자 녹아웃 돼지에서 나타남을 확인하였다. 이는 상기에서 제조한 CRISPR/Cas9 법으로 생산한 태아 섬유아세포에 SCNT를 수행하여도 그 성질이 변하지 않은 상태로 난자로 함입되어 하나의 개체로서 돼지가 생산되는 것을 의미한다.
또한, 본 발명에 따른 INS 유전자 녹아웃은 실험에 사용한 대리모에 따라 다양하게 확인되었다. 보다 구체적으로 도 4a에서 확인할 수 있는 바와 같이, 한 대리모에서는 ⅰ) 엑손 2의 각 대립형질(allele)에서 서열번호 6으로 표시되는 4개 염기의 결실 및 서열번호 7로 표시되는 36개 염기의 결실, ⅱ) 엑손 3의 각 대립형질에서 서열번호 8로 표시되는 1개 염기의 삽입 및 서열번호 9로 표시되는 23개 염기의 결실을 확인하였다. 도 4b에서 확인할 수 있는 바와 같이 두번째 대리모에서는 엑손 2의 각 대립형질에서 서열번호 10으로 표시되는 1개 염기의 삽입 및 서열번호 11으로 표시되는 2개 염기의 결실이 확인되었다. 마지막으로 도 4c에서 확인할 수 있는 바와 같이 세번째 대리모에서는 ⅰ) 엑손 3의 각 대립형질에서 서열번호 8로 표시되는 1개 염기의 삽입 및 서열번호 9로 표시되는 23개 염기의 결실, ⅱ) 엑손 3의 각 대립형질에서 한 가닥의 DNA 가닥에서 서열번호 9로 표시되는 23개 염기 결실을 확인하였다. 종합적으로 엑손 2에서 1개 염기의 삽입 또는 2개, 4개, 또는 36개의 결실이 발생하였고, 엑손 3에서는 1개의 염기 삽입 또는 23개의 염기 결실이 발생하였음을 확인할 수 있었다. 이를 통해 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 엑손 2 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 엑손 3의 범위에서 변형이 발생함을 확인할 수 있고, 이는 본 발명에 따른 sgRNA에 의하여 상기 해당되는 염기에서 삽입 또는 결실이 발생하여 당뇨병 또는 당뇨병 합병증이 발병한 동물모델을 제작할 수 있음을 나타낸다.
실시예 6. 표현학적 분석( phenotyping assay)을 통한 INS 유전자 녹아웃 돼지의 당뇨병 확인
6-1. 혈당 수치 분석
실시예 4에서 제조한 INS 유전자 녹아웃 돼지에서 INS 유전자의 녹아웃이 잘 이루어졌는지 확인하기 위하여 혈당 수치를 분석하여 INS 녹아웃 돼지의 당뇨병 발병을 확인하였다. 상기 혈당 수치는 ACCU-CHEK? 혈당 미터 및 시험 스트립(Roche, IN, USA)을 이용하여 확인하였고, 채혈 후 복제 돼지가 죽을 때까지 4시간에 한 번씩 상기 혈당 수치를 확인하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다. 정상 범주의 혈당은 약 200 mg/dl 내외이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, INS 유전자 녹아웃 돼지는 높은 혈당 수치를 나타내었고, 이는 INS 유전자 녹아웃이 정상적으로 이루어져 상기 INS 유전자 녹아웃 돼지가 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물 모델로 사용될 수 있음을 나타낸다.
6-2. 면역조직화학(IHC; immunohistochemistry ) 분석
실시예 4에서 제조한 INS 유전자 녹아웃 돼지에서 INS 유전자의 녹아웃이 잘 이루어졌는지 확인하기 위하여 돼지 췌장의 β-세포에 면역조직화학을 수행하여 INS 녹아웃 돼지의 당뇨병 발병을 확인하였다. 먼저, INS 유전자 녹아웃 돼지로부터 췌장을 분리하여 10% 중성 버퍼된 포르말린에서 고정하였다. 고정된 조직을 파라핀에 넣고 보관하다가 이 후에 조각으로 나눈 조직을 두 그룹으로 나눈 뒤 인슐린의 발현 여부를 분석하기 위해 두 그룹 중 한 그룹은 제작자의 메뉴얼에 따라 일반적인 H&E 염색 키트를 사용하여 H&E로 염색하고, 나머지 한 그룹에는 마우스 항-돼지 인슐린(AbD Serotec, Kidlington, UK)을 첨가하였다. 이를 현미경으로 관찰하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. INS 유전자를 녹아웃시키지 않은 동일한 연령대의 야생형 돼지는 양성 대조군으로 사용하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 세 마리의 돼지 중 두 마리의 돼지는 췌장에서 인슐린의 발현을 나타내지 않았고, 나머지 한 마리의 돼지는 양성 대조군인 돼지와 비교할 때 매우 약한 정도의 인슐린 발현을 나타내었다. 이는 INS 유전자 녹아웃이 정상적으로 이루어져 상기 INS 유전자 녹아웃 돼지를 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물 모델로 사용될 수 있음을 나타낸다.
6-3. 혈청에서 인슐린 및 C- 펩타이드 수치 분석
실시예 4에서 제조한 INS 유전자 녹아웃 돼지에서 INS 유전자의 녹아웃이 잘 이루어졌는지 확인하기 위하여 혈청 내 인슐린 및 C-펩타이드 농도를 효소결합 면역흡수 분석법으로 측정하여 INS 녹아웃 돼지의 당뇨병 발병을 확인하였다. 사용된 혈청은 원심분리를 이용하여 각 돼지(사산된 돼지 제외)의 전체 혈액으로부터 분리하였다. INS 유전자 녹아웃 돼지에서 인슐린 및 C-펩타이드 수치는 제조자의 메뉴얼에 따라 돼지 인슐린 및 C-펩타이드 키트(Mercodia, Uppsala, Sweden)을 이용하여 확인하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다. INS 유전자를 녹아웃시키지 않은 동일한 연령대의 야생형 돼지는 양성 대조군으로 사용하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 양성 대조군으로 사용한 돼지는 먹이를 준 후 혈장에서 인슐린 및 C-펩타이드 농도의 증가를 나타낸 반면, INS 유전자 녹아웃이 일어난 돼지는 먹이를 준 후에도 먹이를 주기 전과 비슷한 수준의 인슐린 및 C-펩타이드 농도를 나타내었다. 이는 INS 유전자 녹아웃이 정상적으로 이루어져 상기 INS 유전자 녹아웃 돼지를 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물 모델로 사용될 수 있음을 나타낸다.
종합적으로, 이상의 실험 결과를 통해 본 발명에 따른 INS 유전자의 녹아웃을 위한 특이적 sgRNA 및 CRISPR/Cas9법을 이용한 재조합 벡터는 형질전환된 동물에서 INS 유전자를 암호화하는 DNA 가닥을 전부 또는 일부를 녹아웃시켜 당뇨병을 효과적으로 유도할 수 있음을 확인하였다. 당뇨병은 만성 질환으로, 당뇨병 환자들은 대개 합병증으로 고통으로 받고 있는바, 이에 대한 실질적인 예방 또는 치료를 위하여 장기간 연구를 가능하게 하는 본 발명에 따른 당뇨병 동물 모델을 이용하는 것이 매우 유용하다. 따라서 본 발명에 따른 INS 유전자 녹아웃 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델은 관련 질병의 기전의 규명, 치료물질의 탐색, 진단법의 개발 등에 다양하게 활용될 수 있다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.
한국세포주연구재단 KCLRFBP00374 20161012
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cgtgaccgct acacttgcca 6840 gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct 6900 ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc 6960 acctcgaccc caaaaaactt gatttgggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat 7020 agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc 7080 aaactggaac aacactcaac cctatctcgg gctattcttt tgatttataa gggattttgc 7140 cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta 7200 acaaaatatt aacgtttaca attttatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg 7260 catagttaag ccagccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc 7320 tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga 7380 ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt 7440 tataggttaa tgtcatgata ataatggttt cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa 7500 atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca 7560 tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc 7620 aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc 7680 acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt 7740 acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt 7800 ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg 7860 ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact 7920 caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg 7980 ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga 8040 aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg 8100 aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa 8160 tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac 8220 aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc 8280 cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtggaagc cgcggtatca 8340 ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga 8400 gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta 8460 agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc 8520 atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc 8580 cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt 8640 cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac 8700 cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct 8760 tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact 8820 tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg 8880 ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata 8940 aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga 9000 cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag 9060 ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg 9120 agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac 9180 ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca 9240 acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg t 9291 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR <400> 13 ctcctctctc ggagccctt 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR <400> 14 ttattgggtt ttggggtgc 19 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR <400> 15 gtcccccagg tcctcacc 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR <400> 16 cccaccctgg agtggaag 18 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR <400> 17 gtcgggggag tttttaagga 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR <400> 18 ggagcagcag gcgccctcag 20

Claims (18)

  1. 서열번호 12로 표시되는 염기서열로 이루어진, 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델 제작용 재조합 벡터.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 서열번호 2의 sgRNA를 암호화하는 염기서열 및; 서열번호 3의 Cas9 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 Cas9 유전자와 형광단백질을 코딩하는 유전자가 결합되어 있는 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 하기 도에 기재된 개열 지도를 가지는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
    [도]
    Figure 112017040085616-pat00002

  7. 삭제
  8. 제1항 내지 제3항 및 제6항 중 어느 한 항의 재조합 벡터가 도입된, 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델 제작용 형질전환 세포주.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 세포주는 난모세포주, 섬유아세포주 또는 신장세포주인 것을 특징으로 하는, 형질전환 세포주.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 형질전환 세포주는 수탁번호 KCLRF-BP-00374인 것을 특징으로 하는, 형질전환 세포주.
  11. 제8항의 형질전환 세포주를 인간을 제외한 동물로부터 수득한 탈핵된 난자에 이식하여 핵 이식란을 형성하는 단계; 및
    상기 핵이식란을 인간을 제외한 동물인 대리모의 난관에 이식하는 단계;를 포함하는, INS 유전자 녹아웃 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델의 제조방법.
  12. 제11항의 방법으로 생산한 INS 유전자 녹아웃 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 동물모델은 돼지인 것을 특징으로 하는, INS 유전자 녹아웃 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제12항에 있어서,
    상기 당뇨병은 제1형 당뇨병인 것을 특징으로 하는, INS 유전자 녹아웃 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델.
  17. 제12항에 있어서,
    상기 당뇨병 합병증은 고혈당증, 고인슐린혈증, 고중성지방혈증, 지질대사이상, 공복혈당장애, 내당능 이상, 비만, 동맥경화증, 미세혈관병증, 신장질환, 심장질환, 족부궤양, 관절염, 골다공증 및 당뇨병성 망막증으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는, INS 유전자 녹아웃 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델.
  18. 1) 제12항의 INS 유전자 녹아웃 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델에 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 개선 또는 치료제 후보물질을 투여하는 단계; 및
    2) 상기 후보물질을 투여한 동물모델을 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 후보물질에 의해 혈당 수치가 감소되는 경우 이를 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 개선 또는 치료제로 판단하는 단계;를 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 개선 또는 치료제의 스크리닝 방법.
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