HU226259B1 - Structure-based designed herbicide resistant products - Google Patents
Structure-based designed herbicide resistant products Download PDFInfo
- Publication number
- HU226259B1 HU226259B1 HU9900852A HUP9900852A HU226259B1 HU 226259 B1 HU226259 B1 HU 226259B1 HU 9900852 A HU9900852 A HU 9900852A HU P9900852 A HUP9900852 A HU P9900852A HU 226259 B1 HU226259 B1 HU 226259B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- ahas
- protein
- herbicide
- imidazolinone
- cell
- Prior art date
Links
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 title claims description 289
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 title claims description 198
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 241
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 170
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 107
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 100
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 92
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 83
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 80
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 75
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 73
- CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 3,5-dihydro-4H-imidazol-4-one Chemical compound O=C1CNC=N1 CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 67
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 claims description 55
- YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N sulfonylurea Chemical class OC(=N)N=S(=O)=O YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 55
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 51
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 51
- 108010042687 Pyruvate Oxidase Proteins 0.000 claims description 42
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 42
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims description 32
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 31
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 30
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 26
- WTLNOANVTIKPEE-UHFFFAOYSA-N 2-acetyloxypropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)OC(C)=O WTLNOANVTIKPEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 13
- TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-M 2-oxobutanoate Chemical compound CCC(=O)C([O-])=O TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 11
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 claims description 11
- 238000009833 condensation Methods 0.000 claims description 10
- 230000005494 condensation Effects 0.000 claims description 10
- VUQLHQFKACOHNZ-UHFFFAOYSA-N 2-Aceto-2-hydroxybutanoate Chemical compound CCC(O)(C(C)=O)C(O)=O VUQLHQFKACOHNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 claims description 8
- 102220465585 Insulin-like growth factor II_R128A_mutation Human genes 0.000 claims description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 102220547673 Sperm acrosome-associated protein 5_R128E_mutation Human genes 0.000 claims description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 4
- WNDWKKPBLAKXMI-UHFFFAOYSA-N [5-(benzenesulfonyl)-2-nitrophenyl] 4-chlorobenzoate Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(S(=O)(=O)C=2C=CC=CC=2)C=C1OC(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 WNDWKKPBLAKXMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 101000852723 Arabidopsis thaliana Acetolactate synthase small subunit 1, chloroplastic Proteins 0.000 claims 1
- 101000852721 Arabidopsis thaliana Acetolactate synthase small subunit 2, chloroplastic Proteins 0.000 claims 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 105
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 50
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 49
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 38
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 38
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 38
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 34
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 32
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 32
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 32
- 235000019162 flavin adenine dinucleotide Nutrition 0.000 description 29
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 28
- VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N flavin adenine dinucleotide Chemical compound C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]([C@H](O)[C@@H]1O)O[C@@H]1CO[P@](O)(=O)O[P@@](O)(=O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C2=NC(=O)NC(=O)C2=NC2=C1C=C(C)C(C)=C2 VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N 0.000 description 28
- 239000011714 flavin adenine dinucleotide Substances 0.000 description 28
- 229940093632 flavin-adenine dinucleotide Drugs 0.000 description 28
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 28
- 229960002363 thiamine pyrophosphate Drugs 0.000 description 24
- 235000008170 thiamine pyrophosphate Nutrition 0.000 description 24
- 239000011678 thiamine pyrophosphate Substances 0.000 description 24
- YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N thiamine(1+) diphosphate chloride Chemical compound [Cl-].CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 20
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 19
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 19
- 238000013461 design Methods 0.000 description 16
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 15
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 14
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 12
- 102220534911 Importin subunit alpha-6_R199E_mutation Human genes 0.000 description 12
- 240000004160 Capsicum annuum Species 0.000 description 11
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 11
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 11
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 11
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 11
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 10
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 10
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 10
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 10
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 9
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 9
- 241000758706 Piperaceae Species 0.000 description 9
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 9
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 9
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 8
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 7
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 7
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 7
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 7
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 7
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 7
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 6
- 240000001980 Cucurbita pepo Species 0.000 description 6
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 6
- 102220534870 Importin subunit alpha-6_M124E_mutation Human genes 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 6
- ZDXMLEQEMNLCQG-UHFFFAOYSA-N sulfometuron methyl Chemical group COC(=O)C1=CC=CC=C1S(=O)(=O)NC(=O)NC1=NC(C)=CC(C)=N1 ZDXMLEQEMNLCQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 6
- -1 triazolopyrimidine sulfonamides Chemical class 0.000 description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 5
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 5
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 5
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 5
- 240000007087 Apium graveolens Species 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 4
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XVOKUMIPKHGGTN-UHFFFAOYSA-N Imazethapyr Chemical compound OC(=O)C1=CC(CC)=CN=C1C1=NC(C)(C(C)C)C(=O)N1 XVOKUMIPKHGGTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 4
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 3
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 description 3
- 240000008574 Capsicum frutescens Species 0.000 description 3
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 3
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 description 3
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 3
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 3
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 239000000555 dodecyl gallate Substances 0.000 description 3
- 239000000174 gluconic acid Substances 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 3
- 239000000626 magnesium lactate Substances 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 description 3
- 235000012045 salad Nutrition 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- YNAGLKOBLOKHEO-VGRMVHKJSA-N (4r,5s,6s,7r)-4,5,6,7,8-pentahydroxy-2-methyloctane-3-thione Chemical compound CC(C)C(=S)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO YNAGLKOBLOKHEO-VGRMVHKJSA-N 0.000 description 2
- NUPJIGQFXCQJBK-UHFFFAOYSA-N 2-(4-isopropyl-4-methyl-5-oxo-4,5-dihydro-1H-imidazol-2-yl)-5-(methoxymethyl)nicotinic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(COC)=CN=C1C1=NC(C)(C(C)C)C(=O)N1 NUPJIGQFXCQJBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000167854 Bourreria succulenta Species 0.000 description 2
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 2
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 2
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 2
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 2
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 2
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 2
- 235000008534 Capsicum annuum var annuum Nutrition 0.000 description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N Cyanamide Chemical compound NC#N XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RXCPQSJAVKGONC-UHFFFAOYSA-N Flumetsulam Chemical compound N1=C2N=C(C)C=CN2N=C1S(=O)(=O)NC1=C(F)C=CC=C1F RXCPQSJAVKGONC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 241000209219 Hordeum Species 0.000 description 2
- 239000005566 Imazamox Substances 0.000 description 2
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 241000218982 Populus nigra Species 0.000 description 2
- 241000218976 Populus trichocarpa Species 0.000 description 2
- 244000046095 Psophocarpus tetragonolobus Species 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 2
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 2
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 2
- 229960004261 cefotaxime Drugs 0.000 description 2
- GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N cefotaxime Chemical compound N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)/C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 description 2
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- SGCKSDJIMSBTFY-UHFFFAOYSA-N n-sulfonylformamide Chemical class O=CN=S(=O)=O SGCKSDJIMSBTFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 2
- 230000000885 phytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005971 1-naphthylacetic acid Substances 0.000 description 1
- BECBAQIAXDDXIE-UHFFFAOYSA-M 2-[3-[(4-amino-2-methylpyrimidin-5-yl)methyl]-2-(2-hydroxyethyl)-4-methyl-1,3-thiazol-3-ium-5-yl]ethanol;chloride Chemical compound [Cl-].CC1=C(CCO)SC(CCO)=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N BECBAQIAXDDXIE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000985517 Abroma <cicada> Species 0.000 description 1
- 240000002460 Abroma augustum Species 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000743339 Agrostis Species 0.000 description 1
- 235000015849 Apium graveolens Dulce Group Nutrition 0.000 description 1
- 235000010591 Appio Nutrition 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Chemical compound OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000003416 Asparagus officinalis Species 0.000 description 1
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 235000005781 Avena Nutrition 0.000 description 1
- 241000932522 Avena hispanica Species 0.000 description 1
- 235000002988 Avena strigosa Nutrition 0.000 description 1
- 235000021537 Beetroot Nutrition 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 235000002567 Capsicum annuum Nutrition 0.000 description 1
- 235000007862 Capsicum baccatum Nutrition 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 244000298479 Cichorium intybus Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- DSLZVSRJTYRBFB-LLEIAEIESA-N D-glucaric acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O DSLZVSRJTYRBFB-LLEIAEIESA-N 0.000 description 1
- 230000026774 DNA mediated transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000007007 Dolichos lablab Nutrition 0.000 description 1
- 241000220485 Fabaceae Species 0.000 description 1
- 101150066516 GST gene Proteins 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 240000001814 Gossypium arboreum Species 0.000 description 1
- 240000000047 Gossypium barbadense Species 0.000 description 1
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 1
- 241000448472 Gramma Species 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- 206010065042 Immune reconstitution inflammatory syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102220534916 Importin subunit alpha-6_S653N_mutation Human genes 0.000 description 1
- 235000000177 Indigofera tinctoria Nutrition 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 description 1
- 241000208822 Lactuca Species 0.000 description 1
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000006351 Leucophyllum frutescens Species 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000010654 Melissa officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000062730 Melissa officinalis Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000219000 Populus Species 0.000 description 1
- 241000168036 Populus alba Species 0.000 description 1
- 241001600128 Populus tremula x Populus alba Species 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical group C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 description 1
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 1
- 244000110218 Secale montanum Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N Thiazole Chemical compound C1=CSC=N1 FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010043652 Transketolase Proteins 0.000 description 1
- 102000014701 Transketolase Human genes 0.000 description 1
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 240000000581 Triticum monococcum Species 0.000 description 1
- 240000003834 Triticum spelta Species 0.000 description 1
- 241000256856 Vespidae Species 0.000 description 1
- 241001520823 Zoysia Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 150000005693 branched-chain amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- CURLHBZYTFVCRG-UHFFFAOYSA-N butan-2-yl n-(3-chlorophenyl)carbamate Chemical compound CCC(C)OC(=O)NC1=CC=CC(Cl)=C1 CURLHBZYTFVCRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001511 capsicum annuum Substances 0.000 description 1
- 239000001728 capsicum frutescens Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical group 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000003508 chemical denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000001447 compensatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 238000011960 computer-aided design Methods 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007418 data mining Methods 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000007688 edging Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000005562 fading Methods 0.000 description 1
- 208000015756 familial Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- 150000002306 glutamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 229940097275 indigo Drugs 0.000 description 1
- COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N indigo powder Natural products N1C2=CC=CC=C2C(=O)C1=C1C(=O)C2=CC=CC=C2N1 COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000865 liniment Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000012900 molecular simulation Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000002888 pairwise sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 229910052699 polonium Inorganic materials 0.000 description 1
- HZEBHPIOVYHPMT-UHFFFAOYSA-N polonium atom Chemical compound [Po] HZEBHPIOVYHPMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000007347 radical substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N ribitol Chemical group OC[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N 0.000 description 1
- 230000021749 root development Effects 0.000 description 1
- 230000002786 root growth Effects 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- FZMKKCQHDROFNI-UHFFFAOYSA-N sulfometuron Chemical compound CC1=CC(C)=NC(NC(=O)NS(=O)(=O)C=2C(=CC=CC=2)C(O)=O)=N1 FZMKKCQHDROFNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 235000009492 vitamin B5 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011675 vitamin B5 Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
- C12N15/8278—Sulfonylurea
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B15/00—ICT specially adapted for analysing two-dimensional or three-dimensional molecular structures, e.g. structural or functional relations or structure alignment
- G16B15/20—Protein or domain folding
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B15/00—ICT specially adapted for analysing two-dimensional or three-dimensional molecular structures, e.g. structural or functional relations or structure alignment
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Evolutionary Biology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Catching Or Destruction (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Fertilizers (AREA)
Description
(54) Szerkezeti alapon tervezett herbicidrezisztens termékek (57) Kivonat
A találmány tárgya eljárás acetohidroxisav-szintetáz (AHAS) szerkezeti alapon történő modellezésére és olyan variánsainak tervezésére, melyek rezisztensek imidazolinonokra és más herbicidekre. A találmány tárgyát képezik továbbá AHAS-t gátló herbicidekre rezisztens növények, herbicidrezisztens AHAS-variánsok, a variánsokat kódoló DNS, a variánsokat kifejező növények és gyomkezelési eljárások.
A találmány szerinti megoldás alkalmas herbicidrezisztens haszonnövények előállítására.
HU 226 259 Β1
A leírás terjedelme 52 oldal (ezen belül 26 lap ábra)
HU 226 259 Β1
A találmány tárgya eljárás acetohidroxisav-szintetáz (AHAS) szerkezeti alapon történő modellezésére és olyan variánsainak tervezésére, melyek rezisztensek imidazolinonokra és más herbicidekre. A találmány tárgyát képezik továbbá AHAS-t gátló herbicidekre rezisztens növények, herbicidrezisztens AHAS-variánsok, a variánsokat kódoló DNS, a variánsokat kifejező növények és gyomkezelési eljárások.
A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható herbicidrezisztens haszonnövények előállítására.
Az acetohidroxisav-szintetáz (AHAS) az az enzim, amely katalizálja az első lépést az izoleucin, leucin és valin bioszintézisében baktériumokban, élesztőkben és növényekben. így például a kukoricából (Zea mays) származó érett AHAS mintegy 599 aminosavból álló fehérje, amely a kloroplasztban lokalizálódik (lásd az 1. ábrát). Az enzim tiamin pirofoszfátot (TPP) és flavin adenin dinukleotidot (FAD) használ kofaktorként, és piruvátot szubsztrátumként, hogy acetolaktátot képezzen. Ez az enzim katalizálja a piruvát és 2-ketobutirát kondenzációját, acetohidroxi-butirátot képezve. Az AHAS ismeretes acetolaktát szintetázként vagy acetolaktát piruvát Házként (karboxilezés) is, enzimológiai osztályozása szerint ez az EC 4.1.3.18.-ba tartozik. Az aktív enzim valószínűleg legalább egy homodimer. Ibdah és munkatársai [Protein Science, 3, 479 (1994)] egy összefoglalóban ismertetnek egy modellt az AHAS aktív helyéről.
Igen sokféle herbicid működik azon az alapon, hogy gátolja az AHAS enzim aktivitását, ezek között megemlítjük az imdazolinon vegyületeket, például az imazetapirt (imazethapyr) (PURSUIT - American Cyanamid Company-Wayne, New Jersey), a szulfonilkarmabid-alapú vegyületeket, például a szulfometuronmetilt (sulfometuron-methyl) (OUST - E. I. du Pont de Nemours és Company Wilmington, Delaware), triazolopirimidin szulfonamidokat [Broadstrike - Dow Elanco; lásd Gerwick és munkatársai: Pestic. Sci., 29, 357-364 (1990)], szulfamoil-karbamidokat [Rodaway és munkatársai: Mechanism of Salectively ofAc 322.140 in Paddy Rice, Wheat and Bariey (Az Ac 322.140 szelektivitásának mechanizmusa rizs-, búza- és árpaföldeken), Proceedings of the Brighton Corp Protection Conference-Weeds (1993)], pirimidiloxi-benzoesavakat [STABLE - Kumiai Chemical Industry Company; E. I. du Pont de Nemours and Company; lásd: The Pesticide Manual 10. kiadás, 888-889 oldal (szerkesztő: Clive Tomiin, kiadó: British Crop Protection Council, 49 Downing Street, Farmham, Surrey G49 7PH, Egyesült Királyság)], és szulfonil-karboxamidokat (Alvarado és munkatársai; 4.883.914 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalom). Az ilyen herbicidekkel kapcsolatban lásd még az alábbi irodalmi helyeket: Chaleff és munkatársai: Science, 224, 1443 (1984); LaRossa és munkatársai: J. Bioi. Chem., 259, 8753 (1984), Ray: Plánt Physiol., 75, 827 (1984); Shanerés munkatársai: Plánt Physiol., 76, 545 (1984). Ezek a herbicidek igen hatékonyak, ugyanakkor környezeti szempontból enyhék. Alkalmazásuk a mezőgazdaságban azonban korlátozott szelektivitásuk hiánya miatt, mivel a termények éppen úgy érzékenyek ezen herbicidek fitotoxikus hatására, mint a nemkívánatos gyomok.
Bedbrook és munkatársai (5.013.659; 5.141.870 és 5.378.824 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmak) bemutatnak számos szulfonil-karbamid-rezisztens AHAS-variánst. Ezeket a variánsokat azonban vagy mutagenizált növényekből, magokból vagy sejtekből nyerték herbicidrezisztens mutánsok kiválasztásával, vagy ilyen mutánsokból származtak. Ez a megközelítés azonban kiszámíthatatlan, amennyiben ez (legalábbis kezdetben) inkább egy releváns mutáció véletlenszerű bevezetésén alapszik, mint egy ésszerűen tervezett megközelítésen, amely a célzott fehérje szerkezeti modelljén alapszik.
így továbbra is szükség van a szakterületen olyan eljárásokra és kompozíciókra, amelyek a termesztett növényekben széles szelektív spektrumát nyújtják a speciális herbicidrezisztenciának. A jelen találmány feltalálói rájöttek arra, hogy az AHAS szelektív herbicidrezisztens variáns formái és az ezeket tartalmazó növények elkészíthetők az AHAS szerkezeti alapon történő modellezésével a piruvát-oxidáz (POX) ellen, azonosítva egy herbicidkötő „zseb-et vagy zsebeket az AHAS modellen, és tervezve olyan speciális mutációkat, amelyek megváltoztatják a herbicid aktivitását a kötőzsebekhez. Ezeket a variánsokat és növényeket nem gátolják vagy nem pusztítják el egy vagy több osztályba tartozó herbicidek, és megfelelő AHAS enzimaktivitás marad vissza, hogy támogassa a hasznos növény növekedését.
Az alábbiakban röviden leírjuk a mellékelt ábrákat.
Az 1. ábra egy 600 aminosavból álló szekvenciát mutat be, amely megfelel a kukoricából (Zea mays) származó acetohidroxisavszintetáz mintegy 599 tagból álló aminosavszekvenciájának. (A kukorica AHAS enzimjét alkalmazzuk példaként a növényi AHAS enzimekre). A szekvenciában nem található tranzit szekvencia, és a többlet glicin egy trombin hasítási helyből marad vissza. A Met53, Arg128 és Phe135 gyökök fel vannak tüntetve.
A 2. ábra a kukorica AHAS és a Lactobacillus planarumból származó piruvát-oxidáz (POX) szekvenciáinak egymás mellé állítását mutatja be.
A 3. ábra egy AHAS alapegység szekunder szerkezetének vázlatos bemutatása. A szabályos szekunder szerkezeti elemeket, az α-hélixeket és a β-rétegeket (sheet) körökkel, illetve ellipszisekkel ábrázoljuk, és az egy alegységben található három dómén mindegyikében külön-külön számozzuk. A hurkok és a csavarodások területeit fekete vonalak képviselik, az elemek hozzávetőleges kezdetét és végét képviselő számokkal. A kofaktor kötőhelyeket és az ismert mutációs helyeket nyolcszögek, illetve csillagok jelzik.
A 4. ábra a kukorica AHAS-nak a kötőzsebbe modellezett imazetapirhez (PURSUIT her2
HU 226 259 Β1
A találmány tárgya eljárás acetohidroxisav-szintetáz (AHAS) szerkezeti alapon történő modellezésére és olyan variánsainak tervezésére, melyek rezisztensek imidazolinonokra és más herbicidekre. A találmány tárgyát képezik továbbá AHAS-t gátló herbicidekre rezisztens növények, herbicidrezisztens AHAS-variánsok, a variánsokat kódoló DNS, a variánsokat kifejező növények és gyomkezelési eljárások.
A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható herbicidrezisztens haszonnövények előállítására.
Az acetohidroxisav-szintetáz (AHAS) az az enzim, amely katalizálja az első lépést az izoleucin, leucin és valin bioszintézisében baktériumokban, élesztőkben és növényekben. így például a kukoricából (Zea mays) származó érett AHAS mintegy 599 aminosavból álló fehérje, amely a kloroplasztban lokalizálódik (lásd az 1. ábrát). Az enzim tiamin pirofoszfátot (TPP) és flavin adenin dinukleotidot (FAD) használ kofaktorként, és piruvátot szubsztrátumként, hogy acetolaktátot képezzen. Ez az enzim katalizálja a piruvát és 2-ketobutirát kondenzációját, acetohidroxi-butirátot képezve. Az AHAS ismeretes acetolaktát szintetázként vagy acetolaktát piruvát Házként (karboxilezés) is, enzimológiai osztályozása szerint ez az EC 4.1.3.18.-ba tartozik. Az aktív enzim valószínűleg legalább egy homodimer. Ibdah és munkatársai [Protein Science, 3, 479 (1994)] egy összefoglalóban ismertetnek egy modellt az AHAS aktív helyéről.
Igen sokféle herbicid működik azon az alapon, hogy gátolja az AHAS enzim aktivitását, ezek között megemlítjük az imdazolinon vegyületeket, például az imazetapirt (imazethapyr) (PURSUIT - American Cyanamid Company-Wayne, New Jersey), a szulfonil-karmabidalapú vegyületeket, például a szulfometuron-metilt (sulfometuron-methyl) (OUST - E. I. du Pont de Nemours és Company Wilmington, Delaware), triazolopirimidin szulfonamidokat [Broadstrike - Dow Elanco; lásd Gerwick és munkatársai: Pestic. Sci., 29, 357-364 (1990)], szulfamoil-karbamidokat [Rodaway és munkatársai: Mechanism of Selectively of Ac 322.140 in Paddy Rice, Wheat and Barley (Az Ac 322.140 szelektivitásának mechanizmusa rizs-, búza- és árpaföldeken), Proceedings of the Brighton Corp Protection Conference-Weeds (1993)], pirimidiloxi-benzoesavakat [STABLE - Kumiai Chemical Industry Company; E. I. du Pont de Nemours and Company; lásd: The Pesticide Manual 10. kiadás, 888-889 oldal (szerkesztő: Clive Tomiin, kiadó: British Crop Protection Council, 49 Downing Street, Farmham, Surrey G49 7PH, Egyesült Királyság)], és szulfonil-karboxamidokat (Alvarado és munkatársai; 4.883.914 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalom). Az ilyen herbicidekkel kapcsolatban lásd még az alábbi irodalmi helyeket: Chaleff és munkatársai: Science, 224, 1443 (1984); LaRossa és munkatársai: J. Bioi. Chem., 259, 8753 (1984), Ray: Plánt Physiol., 75, 827 (1984); Shaner és munkatársai: Plánt Physiol., 76, 545 (1984). Ezek a herbicidek igen hatékonyak, ugyanakkor környezeti szempontból enyhék. Alkalmazásuk a mezőgazdaságban azonban korlátozott szelektivitásuk hiánya miatt, mivel a termények éppen úgy érzékenyek ezen herbicidek fitotoxikus hatására, mint a nemkívánatos gyomok.
Bedbrook és munkatársai (5.013.659; 5.141.870 és 5.378.824 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmak) bemutatnak számos szulfonil-karbamid-rezisztens AHAS-variánst. Ezeket a variánsokat azonban vagy mutagenizált növényekből, magokból vagy sejtekből nyerték herbicidrezisztens mutánsok kiválasztásával, vagy ilyen mutánsokból származtak. Ez a megközelítés azonban kiszámíthatatlan, amennyiben ez (legalábbis kezdetben) inkább egy releváns mutáció véletlenszerű bevezetésén alapszik, mint egy ésszerűen tervezett megközelítésen, amely a célzott fehérje szerkezeti modelljén alapszik.
így továbbra is szükség van a szakterületen olyan eljárásokra és kompozíciókra, amelyek a termesztett növényekben széles szelektív spektrumát nyújtják a speciális herbicidrezisztenciának. A jelen találmány feltalálói rájöttek arra, hogy az AHAS szelektív herbicidrezisztens variáns formái és az ezeket tartalmazó növények elkészíthetők az AHAS szerkezeti alapon történő modellezésével a piruvát-oxidáz (POX) ellen, azonosítva egy herbicidkötő „zseb-et vagy zsebeket az AHAS modellen, és tervezve olyan speciális mutációkat, amelyek megváltoztatják a herbicid aktivitását a kötőzsebekhez. Ezeket a variánsokat és növényeket nem gátolják vagy nem pusztítják el egy vagy több osztályba tartozó herbicidek, és megfelelő AHAS enzimaktivitás marad vissza, hogy támogassa a hasznos növény növekedését.
Az alábbiakban röviden leírjuk a mellékelt ábrákat.
Az 1. ábra egy 600 aminosavból álló szekvenciát mutat be, amely megfelel a kukoricából (Zea mays) származó acetohidroxisavszintetáz mintegy 599 tagból álló aminosavszekvenciájának. (A kukorica AHAS enzimjét alkalmazzuk példaként a növényi AHAS enzimekre). A szekvenciában nem található tranzit szekvencia, és a többlet glicin egy trombin hasítási helyből marad vissza. A Met53, Arg 128 és Phe135 gyökök fel vannak tüntetve.
A 2. ábra a kukorica AHAS és a Lactobacillus planarumból származó piruvát-oxidáz (POX) szekvenciáinak egymás mellé állítását mutatja be.
A 3. ábra egy AHAS alapegység szekunder szerkezetének vázlatos bemutatása. A szabályos szekunder szerkezeti elemeket, az α-hélixeket és a β-rétegeket (sheet) körökkel, illetve ellipszisekkel ábrázoljuk, és az egy alegységben található három dómén mindegyikében külön-külön számozzuk. A hurkok és a csavarodások területeit fekete vonalak képviselik, az elemek hozzávetőleges kezdetét és végét képviselő számokkal. A kofaktor kötőhelyeket és az ismert mutációs helyeket nyolcszögek, illetve csillagok jelzik.
A 4. ábra a kukorica AHAS-nak a kötőzsebbe modellezett imazetapirhez (PURSUIT herbicid) szolgáló aktív helye számítógéppel kialakított modelljének bemutatása.
HU 226 259 Β1
Az 5. ábra a különböző növényfajtákból származó AHAS aminosavszekvenciák közti homológia bemutatása. A pAC751 az a maize als 2 AHAS izoenzim, amely a pAC751 E. coli expressziós vektorból fejeződik ki, ez látható az 1. ábrában; Maizeals2 a maisé als 2 AHAS izoenzim; Maizealsl a maize als 1 AHAS izoenzim; Tobacl egy dohány izoenzim, a tobacco AHAS SuRA izoenzim; Tobac2 a tobacco AHAS SuRB izoenzim; az Athcsr12 az Arabidopsis thaliana Csr 1.2 AHAS-gén; Bnaal3 a káposztafélék közé tartozó Brassica napus AHAS lll izoenzimje; és a Bnaal2 a Brassica napus AHAS II izoenzimje.
A pAC751 és a Maizeals2 azonos gének azzal az eltéréssel, hogy a Maizeals2 a tranzit szekvencia kezdeténél indul, míg a pAC751 a vélt érett N-terminális helynél indul, egy további glicinnel az N-terminálisnál, a pGEX-2T expressziós vektorban levő trombin felismerő szekvencia miatt. Az N-terminális glicin ennél a helynél nem természetes aminosav.
Az AHAS-fehérjék aminosavszekvenciáinak egymás mellé állítását a PILEUP alakította ki. (GCG Package - Genetics Coputer Group, Inc., - University Research Park - Madison, Wisconsin). A konszenzus szekvenciát a PRETTY GCG Packageval alakítottuk ki.
A 6. ábra egy fehérjére festett SDS (nátrium-dodecil-szulfát) poliakrilamid gél fénykép illusztrációja, amely bemutatja a kukorica AHAS tisztítását. A csíkok balról jobbra az alábbiakat tartalmazzák: A: molekulatömeg markerek; B: nyers E. co//-sejtkivonat; C: glutation-agaróz affinitással tisztított készítmény; D: az affinitással tisztított készítmény trombinos emésztése; E: második passzálás glutation-agaróz oszlopon, és szefakril (Sephacryl S-100) gélszűrés.
A 7. ábra a vad típusú és mutáns AHAS-fehérjék enzimaktivitása in vitro méréseinek eredményeit mutatja be grafikusan imazetapir (PURSUIT herbicid) nélkül, illetve annak növekvő koncentrációi mellett. Az Y tengely képviseli a mutáns enzim %-os aktivitását, ahol a 100%-os érték a gátló anyag távollétében mért érték.
A 8. ábra a vad típusú és mutáns AHAS-fehérjék enzimaktivitása in vitro méréseinek eredményeit mutatja be grafikusan szulfometuron-metil (OUST herbicid) nélkül, illetve annak növekvő koncentrációi mellett. Az Y tengely képviseli a mutáns enzim %-os aktivitását, ahol a
100%-os érték a gátló anyag távollétében mért érték.
A 9. ábra a vad típusú Arabidopsis AHAS-fehérje és a Met124lle Arabidopsis AHAS-fehérje mutáns enzimaktivitása in vitro méréseinek eredményeit mutatja be grafikusan imazetapir (PURSUIT herbicid) és szulfometuron-metil (OUST herbicid) nélkül, illetve annak növekvő koncentrációi mellett. Az Y tengely képviseli a mutáns enzim %-os aktivitását, ahol a 100%-os érték a gátló anyag távollétében mért érték.
A 10. ábra a vad típusú Arabidopsis AHAS-fehérje és a Met124His Arabidopsis AHAS-fehérje mutáns enzimaktivitása in vitro méréseinek eredményét mutatja be grafikusan imazetapir (PURSUIT herbicid) és szulfometuron-metil (OUST herbicid) nélkül, illetve annak növekvő koncentrációi mellett. Az Y tengely képviseli a mutáns enzim %-os aktivitását, ahol a 100%-os érték a gátló anyag távollétében mért érték.
A 11. ábra a vad típusú Arabidopsis AHAS-fehérje és az Arg199Glu Arabidopsis AHAS-fehérje mutáns enzimaktivitása in vitro méréseinek eredményeit mutatja be grafikusan imazetapir (PURSUIT herbicid) és szulfometuron-metil (OUST herbicid) nélkül, illetve annak növekvő koncentrációi mellett. Az Y tengely képviseli a mutáns enzim %-os aktivitását, ahol a 100%-os érték a gátló anyag távollétében mért érték.
A 12. ábra a növények transzformálásához használt DNS-vektor vázlatos bemutatása. Ez a DNS-vektor tartalmazza az nptll gént (amely a kanamicinrezisztenciát kódolja) a 35S promoter szabályozása alatt, és az AHAS-gént (vad típusát vagy variánst) az Arabidopsis AHAS promoter szabályozása alatt.
A 13. ábra olyan fénykép, amely a Met124lle vagy Arg199Glu mutánsokat tartalmazó Arabidopsis AHAS-génekkel transzformált, vagy nem transzformált kontroll dohánynövények gyökérfejlődését mutatja be. A növényeket 18 napon át növesztjük a 0,25 pmol/l imazetapirt tartalmazó tápközegbe való átviteltől számítva.
A 14. ábra olyan fénykép, amely a Met124lle, Met124His vagy Arg199Glu mutánsokat tartalmazó Arabidopsis AHAS-génekkel transzformált vagy nem transzformált kontrolldohánynövényeket mutatja be, amelyek előzőleg kétszer be voltak permetezve imazetapirral 100 g/ha mennyiségben.
A 15. ábra olyan fénykép, amely a CL 299.263 herbicid (imazamox) jelenlétében végrehaj3
HU 226 259 Β1 tott csírázási vizsgálatok eredményeit mutatja be; ezeket olyan primer dohánynövény transzformánsokból aratott magokon hajtottuk végre, amelyeket a Met124lle, Met124His vagy Arg199Glu mutációt tartalmazó Arabidopsis AHASgénnel transzformáltuk.
A jelen találmány szerkezeti alapon modellezett eljárást nyújt herbicidrezisztens AHAS-variáns fehérjék előállítására. Az eljárás magában foglalja (a) egy cél AHAS-fehérje egymás alá rendezését piruvát-oxidáz templáttal vagy ennek AHAS-t modellező ekvivalensével, hogy származtassuk a cél AHAS-fehérje háromdimenziós szerkezetét;
(b) egy vagy több herbicid modellezését a háromdimenziós szerkezetbe, hogy lokalizáljunk egy herbicidkötő zsebet a cél AHAS-fehérjében;
(c) legalább egy aminosav célpont kiválasztását valamely mutációhoz a cél AHAS-fehérjében, ahol a mutáció megváltoztatja legalább egy herbicid affinitását a kötőzsebhez;
(d) a cél AHAS-fehérje kódoló DNS mutálását, hogy egy mutált DNS-t állítsunk elő, amely a mutációt tartalmazó AHAS-variánst kódolja, ahol mutáció lehet például legalább egy eltérő aminosav az adott pozíciónál; és (e) a mutált DNS kifejezését egy első sejtben olyan körülmények között, amelyek között a mutációt, például az adott pozíciónál eltérő aminosavat vagy aminosavakat tartalmazó AHAS-variáns termelődik.
Az eljárás továbbá magában foglalhatja:
(f) egy vad típusú AHAS-t kódoló DNS kifejezését párhuzamosan egy második sejtben;
(g) a sejtekből a vad típusú és a variáns AHAS-fehérjék tisztítását;
(h) a vad típusú és a variáns AHAS-fehérjék vizsgálatát katalitikus aktivitásra a piruvátnak acetolaktáttá való átalakításában vagy piruvát és a 2-ketobutirát kondenzálásában acetohidroxi-butiráttá a herbicid nélkül vagy annak jelenlétében; és (i) a (c)-(h) lépések ismétlését, ahol az (e) lépés AHAS-variánsát kódoló DNS-t használjuk úgy, mint az AHAS-t kódoló DNS-t a (c) lépésben, amíg az első olyan herbicid rezisztens AHASvariáns fehérjét nem azonosítjuk, amely rendelkezik (i) legalább egy herbicid távollétében (a) katalitikus aktivitással egyedül is, amely elegendő egy sejt életképességének fenntartására, amelyben ez kifejeződik, vagy (b) katalitikus aktivitással bármely herbicidrezisztens AHAS-variáns fehérjével kombinálva, amely szintén e sejtben fejeződik ki, és amely lehet azonos vagy különböző, mint az első AHAS-variáns fehérje, ahol az aktivitás elegendő egy olyan sejt életképességének felmutatására, amelyben kifejeződik;
ahol a sejt az életképességhez AHAS-aktivitást igényel; és (ii) katalitikus aktivitással, amely ellenállóbb legalább egy herbicidre, mint a vad típusú
AHAS-é.
A találmány szolgáltat egy másik szerkezeti alapú modellezési eljárást is herbicidrezisztens AHAS-variáns fehérjék előállítására. Ez az eljárás magában foglalja:
(a) egy cél AHAS-fehérje egymás alá rendezését egy első AHAS templáttal, amely az 1. ábra szekvenciájával bíró polipeptidből származik, vagy ennek funkcionális ekvivalensén, hogy származtassuk a cél AHAS-fehérje háromdimenziós szerkezetét;
(b) egy vagy több herbicid modellezését a háromdimenziós szerkezetbe, hogy lokalizáljunk egy herbicidkötő zsebet a cél AHAS-fehérjében;
(c) legalább egy aminosav célpont kiválasztását valamely mutációhoz a cél AHAS-fehérjében, ahol a mutáció megváltoztatja legalább egy herbicid affinitását a kötőzsebhez;
(d) a cél AHAS-fehérjét kódoló DNS mutálását, hogy egy mutált DNS-t állítsunk elő, amely az adott pozíciónál levő mutációt tartalmazó AHAS-variánst kódolja; és (e) a mutált DNS kifejezését egy első sejtben olyan körülmények között, amelyek között az adott pozíciónál levő mutációt tartalmazó AHAS-variáns termelődik.
Az eljárás továbbá magában foglalhatja:
(f) egy vad típusú AHAS-t kódoló DNS kifejezését párhuzamosan egy második sejtben;
(g) a sejtekből a vad típusú és a variáns AHAS-fehérjék tisztítását;
(h) a vad típusú és a variáns AHAS-fehérjék vizsgálatát katalitikus aktivitásra a piruvátnak acetolaktáttá való átalakításában vagy piruvát és a 2-ketobutirát kondenzálásában acetohidroxi-butiráttá a herbicid nélkül vagy annak jelenlétében; és (i) a (c)-(h) lépések ismétlését, ahol az (e) lépés AHAS-variánsát kódoló DNS-t használjuk úgy, mint az AHAS-t kódoló DNS-t a (c) lépésben, amíg az első olyan herbicid rezisztens AHAS-variáns fehérjét nem azonosítjuk, amely rendelkezik (i) legalább egy herbicid távollétében (a) katalitikus aktivitással egyedül is, amely elegendő egy sejt életképességének fenntartására, amelyben ez kifejeződik, vagy (b) katalitikus aktivitással bármely herbicidrezisztens AHAS-variáns fehérjével kombinálva, amely szintén e sejtben fejeződik ki, és amely lehet azonos vagy különböző, mint az első AHAS-variáns fehérje, ahol az aktivitás elegendő egy olyan sejt életképességének felmutatására, amelyben kifejeződik;
ahol a sejt az életképességhez AHAS-aktivitást igényel; és
HU 226 259 Β1 (ii) katalitikus aktivitással, amely ellenállóbb legalább egy herbicidre, mint a vad típusú AHAS-é.
Egy további kiviteli módban az eljárás magában foglalja:
(a) egy cél AHAS-fehérje egymás alá rendezését egy első AHAS templáttal, amely rendelkezik egy azonosított herbicidkötő zsebbel és szekvenciája az 1. ábra szekvenciájának felel meg, vagy ennek funkcionális ekvivalense, hogy származtassuk a cél AHAS-fehérje háromdimenziós szerkezetét;
(b) legalább egy aminosav célpont kiválasztását valamely mutációhoz a cél AHAS-fehérjében, ahol a mutáció megváltoztatja legalább egy herbicid affinitását a kötőzsebhez;
(c) a cél AHAS-fehérjét kódoló DNS mutálását, hogy egy mutált DNS-t állítsunk elő, amely az adott pozíciónál levő mutációt tartalmazó AHAS-variánst kódolja; és (d) a mutált DNS kifejezését egy első sejtben olyan körülmények között, amelyek között az adott pozíciónál levő mutációt tartalmazó AHAS-variáns termelődik.
Az eljárás továbbá magában foglalja (e) egy vad típusú AHAS-t kódoló DNS kifejezését párhuzamosan egy második sejtben;
(f) a sejtekből a vad típusú és a variáns AHAS-fehérjók tisztítását;
(g) a vad típusú és a variáns AHAS-fehérjék vizsgálatát katalitikus aktivitásra a piruvátnak acetolaktáttá való átalakításában vagy piruvát és a 2-ketobutirát kondenzálásában acetohidroxi-butiráttá a herbicid nélkül vagy annak jelenlétében; és (h) a (b)—(g) lépések ismétlését, ahol a (d) lépés AHAS-variánsát kódoló DNS-t használjuk úgy, mint az AHAS-t kódoló DNS-t a (b) lépésben, amíg az első olyan herbicidrezisztens AHAS-variáns fehérjét nem azonosítjuk, amely rendelkezik (i) legalább egy herbicid távollétében (a) katalitikus aktivitással egyedül is, amely elegendő egy sejt életképességének fenntartására, amelyben ez kifejeződik, vagy (b) katalitikus aktivitással bármely herblcidrezisztens AHAS-variáns fehérjével kombinálva, amely szintén e sejtben fejeződik ki, és amely lehet azonos vagy különböző, mint az első AHAS-variáns fehérje, ahol az aktivitás elegendő egy olyan sejt életképességének felmutatására, amelyben kifejeződik;
ahol a sejt az életképességhez AHAS-aktivitást Igényel; és (ii) katalitikus aktivitással, amely ellenállóbb legalább egy herbicidre, mint a vad típusú AHAS-é.
A fenti eljárásnak előnyös kiviteli módjaiban a katalitikus aktivitás a herbicid távollétében legalább mintegy 5%-a és legelőnyösebben több, mint mintegy 20%-a a vad típusú AHAS katalitikus aktivitásának. Amikor a herbicid egy imidazolinon herbicid, a herbicidrezisztens AHAS-variáns fehérje előnyösen rendelkezik:
(i) katalitikus aktivitással a herbicid távollétében, amely több, mint a vad típusú AHAS katalitikus aktivitásának mintegy 20%-a;
(ii) katalitikus aktivitással, amely viszonylag ellenállóbb az imidazolinon herbicidek jelenlétére a vad típusú AHAS-hoz hasonlítva; és (iii) katalitikus aktivitással, amely viszonylag érzékenyebb szulfonil-karbamid herbicidek jelenlétére az imidazolinon herblcidhez hasonlítva.
A jelen találmány továbbá acetohidroxisav-szintetáz (AHAS) variáns fehérjét kódoló izolált DNS-eket nyújt; a variáns fehérjék olyan AHAS-fehérjét tartalmaznak, amely módosítva van (i) legalább egy eltérő aminosavgyök behelyettesítésével az 1. ábra szekvenciájának valamely aminosavgyökénél, amely gyök az alábbi csoport valamelyik gyöke:
P48, G49, S52, M53, E54, A84, A95, T96, S97, G98, P99, G100, A101, V125, R127, R128, M129, 1130, G131, T132, D133, F135, Q136, D186, 1187, T259, T260, L261, M262, G263, R276, M277, L278, G279, H281, G282, T283, V284, G300, V301, R302, F303, D304, R306, V307, T308, G309, K310, 1311, E312, A313, F314, A315, S316, R317, A318, K319, I320, E329, I330, K332, N333, K334, Q335, T404, G413, V414, G415, Q416, H417, Q418, M419, W420, A421, A422, L434, S435, S436, A437, G438, L439, G440, A441, M442, G443, D467, G468, S469, L471, N473, L477, M479, Q495, H496, L497, G498, M499, V501, Q502, Q504, D505, R506, Y508, K509, A510, N511, R512, A513, H514, T515, S524, H572, Q573, E574, H575, V576, L577, P578, M579, I580, P581, G583, G584, továbbá az előzőek bármelyikének funkcionális ekvivalensei, és az előzőek bármelyikének bármilyen kombinációja;
(ii) maximum 5 aminosavgyök kiiktatásával az
1. ábra szekvenciájának legalább egy aminosavgyöke előtt vagy maximum 5 aminosavgyök kiiktatásával az 1. ábra szekvenciájának legalább egy aminosavgyöke után, amely gyök az alábbi csoportok valamelyik gyöke:
P48, G49, S52, M53, E54, A84, A95, T96, S97, G98, P99, G100, A101, V125, R127, R128, M129, 1130, G131, T132, D133, F135, Q136, D186, 1187, T259, T260, L261, M262, G263, R276, M277, L278, G279, H281, G282, T283, V284, G300, V301, R302, F303, D304, R306, V307, T308, G309, K310, 1311, E312, A313, F314, A315, S316, R317, A318, K319, I320, E329, I330, K332, N333, K334, Q335, T404, G413, V414, G415, Q416, H417, Q418, M419, W420, A421, A422, L434, S435, S436, A437, G438, L439, G440, A441, M442, G443, D467, G468, S469, L471, N473, L477, M479, Q495, H496, L497, G498, M499, V501, Q502, Q504, D505, R506, Y508, K509, A510, N511, R512, A513, H514, T515, S524, H572, Q573, E574,
HU 226 259 Β1
H575, V576, L577, P578, M579, I580, P581, G583, G584, továbbá az előzőek bármelyikének funkcionális ekvivalensei, és az előzőek bármelyikének bármilyen kombinációja;
(iii) legalább egy aminosavgyök vagy funkcionális ekvivalense kialakításával az 1. ábra szekvenciájának Q124 és H150 gyökei között;
(iv) legalább egy aminosavgyök vagy funkcionális ekvivalense hozzáadásával az 1. ábra szekvenciájának Q124 és H150 gyökei között;
(v) legalább egy aminosavgyök vagy funkcionális ekvivalense kiiktatásával az 1. ábra szekvenciájának G300 és D324 gyökei között;
(vi) legalább egy aminosavgyök vagy funkcionális ekvivalense hozzáadásával az 1. ábra szekvenciájának G300 és D324 gyökei között; vagy (vii) az előzőek bármelyikének kombinációjával. Ebben a számozási rendszerben a #2 gyök felel meg az érett fehérje vélt aminoterminálisának, azaz ez egy kloroplaszt célzó peptid eltávolítása utáni helyzet.
A fenti módosítások arra irányulnak, hogy megváltoztassuk a herbicidek, elsősorban az imidazollnonalapú herbicidek azon képességét, hogy gátolják a fehérje enzimaktivitását. Egy előnyös kiviteli módban az izolált DNS az AHAS-nak herbicidrezisztens variánsát kódolja. A találmány biztosítja az ezen AHAS-variánsokat kódoló DNS-t tartalmazó DNS-vektorokat, a variáns AHAS-fehérjéket magukat, és a sejteket, amelyek vagy in vivő, vagy sejttenyészetben nőnek, és kifejezik az AHAS-variánsokat vagy tartalmazzák ezeket a vektorokat.
Egy másik szempontja szerint a jelen találmány eljárást nyújt herbicidrezisztencia kialakítására sejtben vagy sejtekben és különösen növényi sejtben vagy sejtekben, például valamely magban. Egy AHAS-gént, előnyösen az Arabidopsis thaliana AHAS-génjét úgy mutáljuk, hogy megváltozik egy adott herbicidnek az a képessége, hogy az AHAS enzimaktivitást gátolja. A mutáns gént valamely kompatibilis expressziós vektorba klónozzuk és a gént valamely herbicidérzékeny sejtbe transzformáljuk olyan körülmények között, amelyben ez megfelelő szinten kifejeződik, hogy herbicidrezisztenciát alakítson ki a sejtben.
Ugyancsak a találmány tárgyát képezi egy eljárás gyomok visszaszorítására, amely szerint egy találmány szerinti herbicidrezisztens AHAS-gént hordozó haszonnövényeket tartalmazó termőföldet egy herbicidnek a gyom leküzdésére hatásos mennyiségével kezelünk.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy szerkezeti alapú modellezési eljárás egy első herbicid előállítására, amely gátolja az AHAS-aktlvitást. Az eljárás magában foglalja:
(a) egy cél AHAS-fehérje egymás alá rendezését piruvát-oxidáz templáttal vagy ennek AHAS-t modellező funkcionális ekvivalensével, hogy származtassuk a cél AHAS-fehérje háromdimenziós szerkezetét;
(b) egy AHAS gátló aktivitással bíró második herbicid modellezését a háromdimenziós szerkezetbe, hogy a cél AHAS-fehérjében egy herbicidkötő zseb elhelyezkedését, szerkezetét vagy ezek kombinációját származtassuk; és (c) egy nem peptid jellegű első herbicid tervezését, amely kölcsönhatásban van a kötőzseb AHASaktivitást gátló hatékony részével és előnyösen kötődik is ahhoz, ahol az első herbicid olyan hatékonyan gátolja az AHAS-aktivitást, hogy elpusztítsa valamely olyan sejt életképességét, amely az életképességhez AHAS-aktivitást igényel.
A találmány tárgya egy másik szerkezeti alapon való modellezési eljárás is egy első herbicid előállítására, amely gátolja az AHAS-aktivitást. Az eljárás magában foglalja:
(a) egy cél AHAS-fehérje egymás alá rendezését első AHAS templáttal, amely az 1. ábra szekvenciájával bíró polipeptidből származik, hogy származtassuk a cél AHAS-fehérje háromdimenziós szerkezetét;
(b) egy AHAS gátló aktivitással bíró második herbicid modellezését a háromdimenziós szerkezetbe, hogy a cél AHAS-fehérjében egy herbicidkötő zseb elhelyezkedését, szerkezetét vagy ezek kombinációját származtassuk; és (c) egy nem peptid jellegű első herbicid tervezését, amely kölcsönhatásban van a kötőzseb AHASaktivitást gátló hatékony részével és előnyösen kötődik is ahhoz, ahol az első herbicid olyan hatékonyan gátolja az AHAS-aktivitást, hogy elpusztítsa valamely olyan sejt életképességét, amely az életképességhez AHAS-aktivitást igényel.
Bármelyik eljárásban az az előnyös, ha az első herbicid tartalmaz legalább egy olyan funkcionális csoportot, amely kölcsönhatásban van a kötőzseb valamely funkcionális csoportjával.
A találmány felöleli az AHAS enzim és az AHAS-t gátló herbicidek módosított változatainak ésszerű tervezését vagy szerkezeti alapon való molekuláris modellezését. Ezek a módosított enzimek (AHAS-variáns fehérjék) ellenállók a herbicidek tevékenységére. A jelen találmány felöleli azokat a DNS-eket is, amelyek ezeket a variánsokat kódolják, a vektorokat, amelyek magukban foglalják ezeket a DNS-eket, az AHAS-variáns fehérjéket és azokat a sejteket, amelyek kifejezik ezeket a variánsokat. Ezenkívül a találmány eljárásokat nyújt herbicidrezisztencia kialakítására növényekben ezeket a variánsokat kifejezve, és gyomirtási eljárásokat nyújt. A jelen találmány szerinti DNS-eket és az AHAS-variánsokat olyan tanulmányok során fejlesztettük ki, amelyek az AHAS szerkezetének molekuláris modellezésén alapulnak.
AHAS-variánsok és AHAS gátló herbicidek ésszerű, szerkezeti alapon történő tervezése Az AHAS jelen találmány szerinti herbicidrezisztens variánsai használhatók herbicidrezisztencia átvitelére növényekbe, és tervezhetők a POX modellel, az AHAS modellel, vagy ezek funkcionális ekvivalenseivel, ilye6
HU 226 259 Β1 nek például a transzketolázok, karboligázok, piruvát dekarboxiláz, fehérjék, amelyek kofaktorként FAD-hoz és/vagy TPP-hez kötődnek, vagy bármilyen fehétje, amelynek szerkezeti vonásai hasonlóak a POX-hoz és/vagy AHAS-hoz; tervezhetők továbbá valamely AHAS modellel, például az 1. ábra szekvenciája bíró modellel, vagy egy 1. ábra szekvenciájának funkcionális ekvivalensének megfelelő modellel, ideértve egy korábbi modellből modellezett variánst is. Az alkalmazható fehérjék közt lehet bármely fehérje, amelyben a fentebb felsorolt molekulához viszonyítva Ca-szenükben a szórás négyzetes középértéke kevesebb mint 3,5 angström. Az AHAS-ra irányuló herbicideket hasonlóképpen lehet modellezni ezekből a templátokból kiindulva. Az AHAS aminosavszekvencia funkcionális ekvivalense egy olyan szekvencia, amelynek jelentős, azaz 60-70% homológiája van elsősorban a megőrzött területekben, például egy vélt kötőzsebben. A homológra mértéke egyszerű egymás alá rendezéssel határozható meg, amely a szakterületen ismert programokon alapszik, ilyenek például a GCG által szolgáltatott GAP és PILEUP. A homológia azonos aminosavakat vagy konzervatív helyettesítéseket jelent. Egy adott aminosavgyök funkcionális ekvivalense az 1. ábra AHAS-fehérjéjében egy másik AHAS-fehérje aminosavgyöke, amely, amikor a szakterületen ismert valamely programmal, például a GCG által szolgáltatott GAP vagy PILEUP programmal egymás alá rendezik az 1. ábra szekvenciájával, azonos helyen van, mint az
1. ábra aminosavgyöke.
A racionális tervezési lépések tipikusan magukban foglalják:
(1) egy cél AHAS-fehérje egymás alá rendezését egy POX gerinccel vagy szerkezettel, vagy egy AHAS gerinccel vagy szerkezettel; (2) adott esetben, és ha az AHAS gerincnek van azonosított herbicidkötő zsebe, egy vagy több herbicid modellezése a háromdimenziós szerkezetbe, hogy lokalizáljunk egy herbicidkötő zsebet a cél fehérjében; (3) egy mutáció kiválasztását a modellre alapozva; (4) helyspecifikus mutagenezist; és (5) a variánsok kifejezését és tisztítását. A további lépések között találjuk az enzimes tulajdonságok mérését (6) és az alkalmas variánsok értékelését összehasonlítva a vad típusú AHAS tulajdonságaival. A későbbiekben minden lépést külön-külön megtárgyalunk.
1. Molekuláris modellezés A molekuláris modellezési (és elsősorban a fehérje homológia modellezési) technikák egy adott fehérje szerkezetének és aktivitásának megértéséhez szolgálhatnak. Egy fehérje szerkezeti modellje közvetlenül meghatározható kísérleti adatokból, például röntgensugár krisztallográfiából, közvetve pedig homológiamodellezésből vagy hasonlókból, illetve ezek kombinációiból [lásd White és munkatársai: Annu. Rév. Biophys. Biomol. Struct. 23, 349 (1994)]. Az AHAS háromdimenziós szerkezetének helyes értelmezése alapot szolgáltat egy ésszerű munkamenet kifejlesztéséhez az AHAS-on belül adott aminosavgyökök mutációjához, amelyek herbicidrezisztenciát adnak át a polipeptidnek.
A Zea mays (kukorica) AHAS szerkezetének molekuláris modellezése, templátként a Lactobacillus plantarumból származó rokon piruvát-oxidáz ismert röntgensugár kristályszerkezetét alkalmazva, az AHAS szerkezet háromdimenziós szerkezetét szolgáltatja, amely alkalmas herbicidrezisztens AHAS-variánsok vagy AHAS-t gátló herbicidek tervezéséhez. Ez a modellezési munkamenet kihasználja annak a ténynek az előnyeit, hogy az AHAS és a POX osztoznak egy sor biokémiai jellemzőben és valószínűleg egy közös ősgénből származnak [Chang és munkatársai: J. Bacteriol. 170, 3937 (1988)].
Az AHAS-ban levő fajtaközi homológia nagy mértéke miatt az itt leírt modellezett AHAS vagy funkcionális ekvivalensei szintén alkalmazhatók templátként az AHAS-variáns fehérjék tervezéshez.
Az alábbiakban részletesen is leírjuk egy modell levezetését az interaktív molekuláris grafikát és egymás alá rendezést alkalmazva. A háromdimenziós AHAS szerkezet, amelyet ez a munkamenet eredményez, felbecsüli az enzim aktív helyének és az inhibitorok, például herbicidek (ideértve az imidazolinon herbicideket, de nemcsak ezekre korlátozva) hozzávetőleges térbeli szerveződését. A modellt azután finomítjuk és újra értékeljük olyan biokémiai tanulmányokra alapozva, amelyeket a későbbiekben szintén leírunk.
A fehérje homológia modellezése a fehérje primer szekvenciájának egymás alá rendezését igényli egy tanulmány során egy olyan második fehérjével, amelynek kristályszerkezete ismert. A piruvát-oxidázt (POX) választjuk az AHAS homológia modellezéséhez, mivel a POX és az AHAS osztoznak egy sor biokémiai jellemzőben. így például az AHAS és a POX az enzim reakciómechanizmus számos szempontjában közösek, valamint a kofaktor- és fémigényekben is. Mindkét enzimben tiamin pirofoszfát (TPP), flavin adenin dinukleotid (FAD) és kétértékű kation szükséges az enzimaktivitáshoz. A FAD közvetít egy redox reakciót a katalízis során a POX-ba, de valószínűleg csak szerkezeti funkciója van az AHAS-ban, amely bizonyára csak csökevényes maradéka az AHAS evolúciójának a POX-ból. Mindkét enzim hasznosít piruvátot mint szubsztrátumot és képez hidroxi-etil-tiamin pirofoszfátot, mint stabil köztes reakcióterméket [Schloss J. V. és munkatársai, in: Biosynthesis of branched Chain amino acids, szerkesztők: Barak Z. J. M; Chipman D. M. és Schloss J. V.; kiadó: VCH Publishers, Weinheim, Németország (1990)].
Ezenkívül az AHAS-aktivitás jelen van a kiméra POX-AHAS-fehérjében, amelyek tartalmazzák a POX N-terminális felét és az AHAS C-terminális felét, és a POX maga is mutat kismértékű AHAS-aktivitást. Az AHAS és a POX hasonló tulajdonságokat mutat oldatban is. [Risse B, és munkatársai: Protein Sci. 1: 1699 és 1710, (1992); Singh Β. K. és Schmitt G. K., FEBS Letters, 258, 113 (1989); Singh Β. K. és munkatársai, in: Prospects fór Amino Acid Biosynthesis Inhibitors in Crop Protection and Pharmaceutical Chemistry (Az aminosav bioszíntézis inhibitorainak távlatai a növényvédelemben és a gyógyszerkémiában), szerkesz7
HU 226 259 Β1 tők: Lopping L. G. és munkatársai, BCPC Monograph, 87. oldal (1989)]. Növekvő fehérjekoncentrációval mind a POX, mind az AHAS lépésről lépésre átalakuláson megy át monomerekből dimerekké és tetramerekké. A FAD-koncentráció növelése szintén indukálja az alapegységek összeállásának magasabb fokozatait. Mindkét fehérje tetramer formája a legstabilabb a melegítésre és a kémiai denaturálásra.
A Lactobacillus plantarumból való POX kristályszerkezetét Muller és munkatársai tárták fel [Science 259, 965 (1993)]. A jelen találmány feltalálói arra jöttek rá, hogy részben az AHAS és a POX közötti fizikai, biokémiai és genetikai homológja mértékére alapozva, a POX röntgensugár kristályszerkezete használható kiindulási pontként az AHAS szerkezet homológia modellezéséhez.
Az AHAS és a L. plantarum POX szekvenciái azonban nem elég hasonlók egy teljesen számítógépesített egymás alá rendezéshez. Összességében az aminosavaknak csak 20%-a azonos, míg a gyökök mintegy 50%-a azonos osztályba tartozik (például savanyú, bázisos, aromás stb.). Ha azonban a szekvenciát a hidrofil és hidrofób gyök osztályozás szempontjai szerint hasonlítjuk össze, a 600 aminosavból több mint 500 összeillik. Az AHAS szekunder szekvencia számításai [Holley és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 152 (1989)] erős hasonlóságot tárnak föl a POX tényleges szekunder szerkezetével. A gyökök közel 70%-ánál a számított alapján vélt AHAS szekunder szerkezet illeszkedik a POX szekunder szerkezetéhez.
A POX monomerek három doménből állnak, mindegyiknek van egy központi, párhuzamos β-rétege áthidalásokkal, amelyek α-hélixekből és hosszú huzalakból állnak [Muller és munkatársai: Science 259, 965 (1993)]. A lapok topológiája eltér a domének között, például az első és harmadik dómén között a szálak β-réteghez a 2-1-3-4-6-5 szekvenciában vannak összeillesztve, míg a másik dómén β-rétegében a szekvencia olvasata 3-2-1-4-5-6.
A számítógéppel kialakított egymás alá rendezés a szekunder szerkezeti számításon és a szekvenciahomológián alapul. A hagyományos páronkénti szekvencia egymás alá rendezést alkalmazzuk, amelyet Needleman és Wunch, írt le [J. Mól. Bioi. 48, 443 (1970)]. Két szekvenciát állítunk sorba, hogy legjobban határozzuk meg az egymás alá rendezési pontszámot. Az egymás alá rendezési pontszám (homológia-pontszám) a pontszámok összege az egymás alá rendezett gyökök mindegyik párjából, és egy fakultatív büntetés beszámításával hézagok kialakulásáért az egymás alá rendezés során. A gyökök egy párjának egymás alá rendezésénél kapott pontszám egy táblázatba foglalt egész, számú érték. A homológiapontszám-fendszer a gyökök egy adott párja közötti eltérés gyakoriságának megfigyelésén alapul [Dayhoff Μ. O., Schwartz R. M. és Orcutt B. C: „Atlas of Protein Sequence and Structure” (A fehérjeszekvencia és -szerkezet atlasza), 5. kötet 3. melléklete, 345-362. oldal (1978)].
A egymás alá rendezést tovább finomítjuk a hézagok újra elhelyezésével úgy, hogy a folyamatos szabályos szekunder szerkezetek megőrződjenek. A valószínű egymás alá rendezési sémák értékelésével kialakított aminosavhelyettesitéseket összehasonlítjuk egy interaktív molekuláris grafika segítségével. Az egymás alá rendezésnek azt a módját választjuk, amely a legkonzervatívabb helyettesítésekkel számol, tekintetbe véve egy adott helyen belül az aminosavak adott funkcionalitását. A végső egymás alá rendezést mind a POX-ra, min az AHAS-ra a 2. ábrában mutatjuk be. A gyökök megőrzött csoportjait azonosítjuk, különösen a TPP kötőhelyeket és a FAD kötőhely részeit. A egymás alá rendezés nagy hasonlóságot tár fel az AHAS és a POX között az első doménben, a második dómén legtöbb részében, és a harmadik dómén mintegy felében. A legtöbb terület, amely csak szerény mértékben állítható sorba és különbözőképpen hajtogatódhat a POX-ban és az AHAS-ban, vélhetően a fehérje felületénél van és nem érintett a kofaktor vagy az inhibitor kötésben. A mutációs helyek kiszámítását jelentősen nem befolyásolják a kis eltolódások a egymás alá rendezésben.
A TPP kötő gyökök legtöbbje nagymértékben megőrzött a POX és az AHAS között (például P48-G49G50). Bizonyos esetekben azok a gyökök, amelyek közel vannak a TPP-hez, különböznek a POX és az AHAS között, de egy olyan területen belül maradnak, amely nagymértékben megőrzött, (például 90-110 gyökök). Másrészt viszont a FAD kötő helyek kevésbé megőrzöttnek tűnnek. Bár bizonyos FAD kötőhelyek erősen megőrzöttek (például D325-I326-D327-P328), mások határozottan eltérnek az AHAS és a POX között (így például az 278 és 285 helyek közti hurokban a gyökök nem homológok). Egy részletesebb elemzés feltárja, hogy legalább néhány kevésbé megőrzött érintkezési helynél a kölcsönhatásokat inkább közvetíti a polipeptid gerince, mint az oldalláncok. Ennek megfelelően a megőrzés csak a polipeptid hajtogatáshoz szükséges, és nem szükséges az aminosavszekvenciához (így például a 258-263 gyökök gerince köti meg a FAD ribitol láncát.) Az adenin egyik felét és az izoalloxazinnak a kötőhelyei világosan különböznek.
Miután egymás alá rendeztük a primer szerkezetet, homológia modellt építsünk fel olyan módon, hogy az AHAS aminosavszekvenciát hozzárendezzük a POX templát szerkezethez. Hiányzó koordinátákat építünk fel lépésenként az aminosavgyökök templátjait használva, hogy kiegészítsük a meg nem határozott oldalláncokat. Adatbankkutatást és a molekula kis részeinek energiaminimalizálását használjuk fel, hogy elvégezzük a meg nem határozott hurokterületek konformációinak meghatározását. A TPP és FAD kofaktorokat bemodellezzük kötőzsebeikbe. Ezt a modellt azután alávetjük egy teljes, 5000 ciklusos energiaminimalizálásnak. Minden számítógépes modellezést a Silicon Graphics Co.-tól beszerzett IRIS Indigó Elán R4000 Workstation munkaállomással hajtunk végre. Az interaktív molekula modellezést és energiaminimalizálást a Molecular Simulations Inc.-től beszerzett Quanta/CHARMm 4.0 program alkalmazásával végezzük. Ennek a lépésnek során a konformáció stabil,
HU 226 259 Β1 jelezve, hogy erősen ellenzett kölcsönhatások, például közeli van dér Waals-kapcsolatok, nem fordulnak elő. Az eredményeket vázlatosan a 3. ábrán mutatjuk be.
A kiszámított AHAS szerkezet jellemzői
A fentebb leírt modellezett AHAS szerkezet áttekintése feltárja, hogy a fehérjék többsége olyan gerinccel hajtogatódik, amely energetikailag ésszerű, ahol a legtöbb hidrofil oldallánc hozzáférhető az oldószer számára. A β-rétegek felülete sima és hozzáigazodik a keresztezés! (cross-over) területekhez, amelyek hozzájuk vannak rögzítve.
Dimer AHAS-hoz alakítunk ki modellt az energiaminimalizált monomer AHAS koordinátáinak megduplázásával és a két kópiát ráhelyezve két POX alapegységre a Ca koordináták párjait alkalmazva, amint ezt meghatároztuk az egymás alá rendezési munkamenetben. Az AHAS-polipeptid lánca három hasonlóan hajtogatott doménba hajtogatódik, amelyek egy hatszálú párhuzamos β-réteg-magból állnak, amelyet hosszú „hurkok” és α-hélixek vesznek körül. Két alegység úgy van összeillesztve, hogy egy alegység első doménje szoros szomszédságban van a másik alapegység 2. és 3. kofaktorkötő doménjaival. Egy oldószerrel töltött tér marad az alapegységek között ennél a helynél. Ez a zseb, amelyet a három dómén összeérése határoz meg, a szubsztrátum javasolt belépési helye. Ez a javasolt kötőhelye a herbicideknek is.
A kötőzseb belső felületét a kofaktorok írják körül. A TPP tiazolja a zseb fenekén helyezkedik le. A 3. dómén a zseb belső felületéhez egy rövid α-hélixszel járul, amely tengelyét a TPP pirofoszfát felé irányítja, dipólusmomentumával kompenzálva a foszfáttöltéseket. Ez a kritikus hélix, amely a G498-cal kezdődik, egy „forduló” (tűm) gyökkel szoros kapcsolatban a TPP-vel, és amely az F507-tel végződik, három ismert restrikciós helyet tartalmaz a szulfonil-karbamid-rezisztenciához: a V500-at, W503-at és F507-et (lásd az 5.013.659; 5.141.870 és 5.378.824 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentéseket). Az 1. doménben a P48-S52-nél meghatározott hurok (a 2. β-szál és a 2. α-hélix között) szembenéz a W503-mal, ez olyan mutáció, amelyben a rezisztencia adódik át imidazolinonokra. Az Y47 és G50 közti gyökök szintén kapcsolatban vannak a TPP-vel. Ez a hurok szomszédos a P184-Q189-cel, egy másik fordulóval, amely összekapcsolja az 1. dómén β-rétegének utolsó szálát egy olyan β-szállal, amely kapcsolódik a
2. doménhez. A zseben belül, bejáratához közel van az 1. doménnek egy olyan területe, amely kölcsönhatásban van a 2. dómén komplementer megnyúlásával (stretch). Az 1. dómén 125-129 és 133-137 gyökei és a 2. dómén 304-313 gyökei a zseb felületénél vannak. A T96-G100 közti területet tartalmazó forduló a 125-129 hurok és a TPP között van. A 3. dómén további megnyúlása és a 2. dómén két területe, amelyek betöltik a kötőzsebet, a zseb ellenkező sarkánál vannak. A 3. dómén 572, 575, 582 és 583 gyökei határozzák meg a zseb felszínét az egyik oldalon. A zseb felülete belsejének megmaradó részét a FAD és egy hurok, az L278-G282 határozza meg, amely összeköttetésben van a FAD izoalloxazingyűrűjével.
Az AHAS-fehérje szerkezeti modelljeit alkalmazhatjuk herbicidek vagy AHAS inhibitorok ésszerű tervezéséhez is.
2. Herbicidek modellezése kötőhelyekbe
Az imazetapirt, a PURSUIT-ban levő aktív imidazolinont helyezzük el javasolt kötőhelyébe, az interaktív molekuláris grafikát (4. ábra) és a fentebb leírt szoftvert alkalmazva (4. ábra). A K185-öt választjuk „horgonyként, hogy kölcsönhatásba lépjen a karboxilcsoporttal. Az imidazolinon NH-CO egységét úgy helyezzük át, hogy hidrogénkötéseket képezzen G50 és A51 közé. Ez az imazetapir metil szubsztituensét a kis α-hélix gerincén levő V500-hoz közel helyezi el. Az izopropilcsoport valószínűleg a 125-135 gyökök - amelyek hozzájárulnak a belső zseb felületéhez - területében levő aminosavak hidrofób gyökeihez kötődik. A piridingyűrű a legvalószínűbben „szendvicseként helyezkedik el az A134 vagy F135, F507 és W503 között. A W503 kölcsönhatásban van az imidazolinon gyűrű rendszerrel is.
Hasonló módon, a szulfonil-karbamid herbicidet olyan helybe modellezzük, amely részben átfedi a leírt imidazolinon kötőhelyet. A szulfonil-karbamid és imidazolinon kötőhelyek átfedése egybevág a versengő kötési kísérletekkel és az elfogadott mutáns adatokkal, amelyek azt mutatják, hogy azonos mutáció kukoricákon (W503L) rezisztenciát biztosít mindkét herbicidre. Ezekben a modellekben az ismert mutációs helyek, amelyek szulfonil-karbamid-rezisztenciát adnak át, azaz a G50, A51, K185, V500, W503 és F507, szoros kapcsolatban vannak a megkötött herbicidekkel. A P126 és A51 szükségesek helyén megtartani a K185 oldalláncot, ezáltal egy hidrofób nyílást alakítva ki. Az S582, amely speciális imidazolinon szekvenciahely, távol van a kötőterülettől és abban a területben helyezkedik el, ahol a homológia nagyon szegényes, így várható változás a hajtogatódásban. A FAD kötőhelyeknek kétségtelenül kicsiny a homológiája az AHAS és a POX között ezen a területen; az S582 olyan gyök, amely rezisztenciát biztosít kukoricában, és ez az S582 és szomszéd gyökei szoros kapcsolatban állnak az aktív hely zsebbel. Az valószínűsíthető, hogy a FAD és a hurokterület, amely magában foglalja a 278 és 285 közti gyököket, enyhén elmozdul a harmadik doménből (lefelé a 4. ábrában); valószínűsíthető továbbá, hogy az S582-t tartalmazó hurok behajtogatódik a 499 és 507 helyek közt levő hélix és a 278 és 285 helyek közt levő hurok közt kialakult térbe. A D305, egy másik ismert rezisztenciahely, közel van a FAD-hoz és megváltoztatja a kölcsönhatást az 1. és 2. domének között. Az M280 valószínűleg érintett a 498 és 507 közti helyeknél levő hélix elhelyezésében, vagy közvetlenül érintett az inhibitorkötésben. Az M280 és a D305 közvetlenül is érintett lehet az inhibitorkötésben, ha az 1. és 2. domének enyhén közelednek egymáshoz.
3. A mutációk kiválasztása
Meghatározzuk azokat a speciális aminosavgyököket, amelyek az AHAS primer szekvenciájába mutációk bevezetéséhez alkalmas helyek. Ezeket az aminosa9
HU 226 259 Β1 vakat olyan helyekre alapozva választjuk ki, amely helyeken amennyiben az aminosavgyök módosul, ennek eredménye változás (azaz csökkenés) lesz egy herbicid affinitásában a kötőzsebhez. Nem szükséges, hogy a mutációs hely a kötőzsebben helyezkedjék el, mivel a zseben kívül levő aminosavgyökök maguk is megváltoztathatják a zseb töltését vagy konfigurációját. A mutációhoz szolgáló célhelyek kiválasztását molekuláris modellek alkalmazásával érjük el, amint fentebb leírtuk. így például a fenti modell szerint a 128. helynél levő arginin (az 1. ábrában R128-cal jelölve, az aminosavakhoz az egybetűs kódot alkalmazva) a szubsztrátum- és herbicidkötő zseb bejáratához közel helyezkedik el és a konformációs szabadság nagy mértékével bír, amely lehetővé teheti számára, hogy részt vegyen 1 a töltött herbicidek transzportjában a kötözsebbe. Ennélfogva ezt a gyököt helyettesítjük alaninnal, hogy eltávolítsuk mind töltését, mind hosszú hidrofób oldalláncát. (Az így létrejövő mutációt R128A-nak nevezzük).
A mutációk tartalmazhatnak egyszerű helyettesíté- 2 seket, amelyek helyettesítik a vad típusú szekvenciát bármely más aminosawal. Egy másik megoldás szerint a mutációk tartalmazhatnak egy vagy több, előnyösen maximum 5 aminosav kiiktatást vagy hozzáadást egy adott helynél. A hozzáadott szekvencia tartalmaz- 2 hat olyan szekvenciát, amelyről ismert, hogy valamely másik fehérjében létezik, vagy tartalmazhat teljesen szintetikus szekvenciát is. Ezenkívül egynél több mutáció és/vagy egy mutációtípusnál több is bevezethető egy egyedi polipeptidbe. 3
4. Helyspecifikus mutagenezis
Az AHAS-t kódoló DNS-t lehet úgy manipulálni, hogy bejuttatjuk a kívánt mutációkat. A mütagenezist olyan eljárások alkalmazásával hajtjuk végre, amelyek a szakterületen szabványosak; ilyenek vannak leírva 3 például az alábbi irodalmi helyen: Higuchi R.: Recombinant PCR; in PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, szerkesztők: Innis és munkatársai; kiadó: Academic Press, 177-183. oldal (1990).
5. A variánsok kifejezése és tisztítása 4
A mutált vagy variáns AHAS szekvenciát valamely
DNS expressziós vektorba klónozzuk (lásd például a
3. példát) és kifejezzük megfelelő sejtben, például E. coliban. Az AHAS-t kódoló DNS-t előnyösen hozzákapcsoljuk valamely transzkripciós szabályozóelemhez, és a variáns AHAS-t egy fúziós fehérje részeként fejezzük ki például glutation-S-transzferázzal együtt, hogy megkönnyítsük a tisztítást (lásd a későbbi 3. példát). A variáns AHAS-t azután tisztítjuk affinitáskromatográfia alkalmazásával vagy más, a szakterületen ismert alkalmas eljárással. Egy AHAS-polipeptid „tisztítás-a az AHAS-polipeptid izolálására vonatkozik olyan formában, amely lehetővé teszi enzimaktivitásának mérését anélkül, hogy a sejtnek, amelyben a polipeptid kifejeződött további, komponensei erre befolyást gyakorolnának.
6. Az enzim tulajdonságainak mérése A tisztított AHAS-variáns mérhető az alábbi három tulajdonság közül egyre vagy többre:
(a) fajlagos vagy katalitikus aktivitás piruvát átalakításához acetolaktáttá (kifejezve, mint egység/mg tiszta AHAS, ahol az aktivitás egységét úgy határozzuk meg, mint 1 pmol termelt acetolaktát/óra), vagy piruvát és 2-ketobutirát kondenzációjához (kifejezve, mint egység/mg tiszta AHAS, ahol az aktivitás egységét úgy határozzuk meg, mint 1 pmol termelt acetohidroxi-butirát/óra);
(b) a herbicid, mint például imidazolinon által kiváltott gátlás szintje (kifejezve IC5{j-ként; ez az a koncentráció, amelynél az enzim aktivitásának 50%-a gátlódik); és (c) a rezisztencia szelektivitása a kiválasztott herbicidre az egyéb herbicidekkel szemben. A szelektivitási indexet úgy határozzuk meg, mint a mutáns védő rezisztenciáját imidazolinonokra a vad típusú enzimre vonatkoztatva, osztva az azonos mutáns védő rezisztenciájával más herbicidekre, szintén a vad típusra vonatkoztatva. A védő rezisztenciát egy herbicidre, a vad típusú enzimre vonatkoztatva úgy fejezzük ki, mint a variáns IC50-értéke osztva a vad típus IC50-értékével. A szelektivitási indexet (S. I.) a következő egyenlet képviseli:
A variáns IC50-értéke herbicid A-ra/ a vad típus IC50-értéke herbicid A-ra a variáns IC5o-értéke herbicid B-re/ a vad típus IC50-értéke herbicid B-re
A megfelelő vizsgálati eljárások között ezen meghatározások kivitelezésére találjuk a később, a 4. példában részletesebben leírt eljárásokat, de a lehetőségek nemcsak ezekre korlátozódnak.
7a. A megfelelő variánsok értékelése
A variáns AHAS-polipeptidek enzimes tulajdonságait összehasonlítjuk a vad típusú AHAS-éval. Előnyösen egy adott mutáció olyan AHAS-variáns fehérjét eredményez, amely megőrzi az in vitro enzimaktivitást a piruvát vagy a piruvát és acetolaktát irányában, vagyis a piruvát átalakításában acetolaktáttá vagy a piruvát és 2-ketobutirát kondenzációjában acetohidroxibutirát képződésével (és így várhatóan megőrzi biológiai aktivitását in vivő is), ugyanakkor olyan katalitikus aktivitást mutat, amely viszonylag rezisztensebb a ki50 választott herbicidre vagy herbicidekre, mint a vad típusú AHAS-é. A variáns AHAS előnyösen mutat:
(i) legalább egy herbicid hiányában (a) katalitikus aktivitást egyedül is, amely elegendő egy olyan sejt életképességének fenntartásához, amelyben ez kifejeződött;
vagy (b) katalitikus aktivitást kombinálva bármely herbicidrezisztens AHAS-variáns fehérjével, amely szintén a sejtben fejeződik ki, és amely lehet azonos vagy különböző, mint az
HU 226 259 Β1 előző AHAS-variáns fehérje, ahol a katalitikus aktivitás elegendő egy olyan sejt életképességének fenntartására, amelyben ezek kifejeződtek; ahol a sejt az életképességhez AHAS-aktivitást igényel;
(ii) katalitikus aktivitást, amely rezisztensebb legalább egy herbicidre, mint a vad típusú AHAS-é, és amely viszonylag rezisztensebb a herbicid(ek)re, mint a vad típusú AHAS-é.
Ennél fogva a speciális AHAS-variáns tehénének nem szükséges rendelkeznie a teljes katalitikus aktivitással, amely szükséges a sejt életképességének fenntartására, csak bizonyos katalitikus aktivitással kell rendelkeznie olyan mennyiségben, amely egyedül vagy kombinálva ugyanazon AHAS-variáns további másolatainak katalitikus aktivitásával és/vagy más AHAS-variáns fehérje vagy fehérjék katalitikus aktivitásával elegendő egy olyan sejt életképességének fenntartására, amely életképességéhez AHAS-aktivitást igényel, (gy például a katalitikus aktivitás megnövelhető a minimálisan elfogadható szintekre egy variáns kódoló gén többszörös másolatainak bevezetésével a sejtbe, vagy egy olyan gén bevezetésével, amely magában foglal többletként egy viszonylag erős promotert, hogy fokozza a variáns termelését.
Az „ellenállóbb vagy „rezisztensebb” kifejezés azt jelenti, hogy a variáns katalitikus aktivitása a herbicid(ek) által kisebb mértékben csökken, ha egyáltalán csökken, mint ahogyan a vad típusú AHAS katalitikus aktivitás csökken a herbicid(ek) által. Előnyösen az ellenállóbb variáns AHAS megőriz elegendő katalitikus aktivitást, hogy fenntartsa a sejt, növény vagy organizmus életképességét, miközben azonos herbicid(ek) azonos koncentrációjánál a vad típusú AHAS nem őriz meg elegendő katalitikus aktivitást, hogy fenntartsa a sejt, növény vagy organizmus életképességét.
A katalitikus aktivitás herbicid(ek) távollétében előnyösen legalább 5%-a, legelőnyösebben több, mint 20%-a a vad típusú AHAS katalitikus aktivitásának herbicid(ek) távollétében. A legelőnyösebb AHAS-variánsok ellenállóbbak az imidazolinon herbicidre, mint más herbicidekre, például szulfonil-karbamid-alapú herbicidekre, bár bizonyos alkalmazásoknál a szelektivitás sem nem szükséges, sem nem előnyös.
Imidazoiinonrezisztens AHAS-variánsok esetében előnyös, ha az AHAS-variáns fehérje rendelkezik:
(i) katalitikus aktivitással, amely az említett herbicid távollétében több, mint 20%-a az említett vad típusú AHAS katalitikus aktivitásának;
(ii) katalitikus aktivitással, amely viszonylag ellenállóbb imidazolinon herbicidek jelenlétére a vad típusú AHAS-sal összehasonlítva; és (iii) katalitikus aktivitással, amely viszonylag érzékenyebb szulfonil-karbamid herbicidek jelenlétére az imidazolinon herbicidekkel összehasonlítva. A legelőnyösebb herbicidrezisztens AHAS-variánsok mintegy 20 egység/mg minimális fajlagos aktivitást mutatnak, minimális gátlást mutatnak vagy egyáltalán nem mutatnak gátlást imidazolinonokra, és szelektivitási indexük mintegy 1,3-tól 3000-ig terjed más herbicidekre vonatkoztatva.
A nélkül, hogy ragaszkodnánk bármiféle elmélethez, úgy hisszük, hogy ennek a módszernek a rendszeres és megismételt alkalmazása vad típusú vagy más cél AHAS-fehérjére olyan AHAS-variánsok kialakítását eredményezi, amelyek rendelkeznek a magas enzimaktivitás kívánt tulajdonságaival, amint ezt a korábbiakban elmagyaráztuk, és rezisztenciával a herbicidek egy vagy több osztályára. így például egy vad típusú AHAS szekvencia mutációja egy adott helyen egy adott aminosavra olyan mutánst eredményezhet, amely magasfokú herbicidrezisztenciát mutat, miközben jelentős veszteséget mutat az enzimaktivitásban a piruvát vagy a piruvát és a 2-ketobutirát irányában. A fenti eljárásnak egy második alkalmazásában a kiindulási vagy cél AHAS-polipeptid azután ez a variáns lehet (a vad típusú AHAS helyett). Az ésszerű tervezés azután magában foglalja más aminosavak helyettesítését az eredetileg mutált helynél és/vagy aminosavak kiiktatását vagy hozzátételét kiválasztott pontoknál vagy tartományoknál abban a reményben, hogy a herbicidrezisztencia megőrződik, míg az enzimaktivitás magasabb szintje fennmarad.
Herbicidrezisztens AHAS-fehérjék szerkezeti alapon történő ésszerű tervezése számos előnyt nyújt a hagyományos megközelítésekhez viszonyítva, amelyek véletlenszerű mutagenezisre és kiválasztásra alapozódnak. Így például amikor egy adott aminosav helyettesítése egy másikkal több, mint egy nukleotid helyettesítését igényli a kodonon belül, a valószínűség ennek véletlenszerű előfordulására olyan kicsiny, hogy gyakorlatilag kivihetetlen. Ezzel ellentétben a nukleotidszekvenciában egy kodonon belül még kettős és hármas változások is könnyen bevezethetők, amikor ezeket egy ésszerű tervezési megközelítés sugallja, (gy például egy ésszerűen tervezett mutáció annak érdekében, hogy szelektív imidazolinonrezisztencia adódjék át, változást igényel argininből glutamáttá. Az arginint a CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG kódolják, míg a glutamátokat a GAA és GAG kódolják. Mivel az arginin kodonok egyike sem kezdődik GA-val, ez a mutáció a szomszédos nukleotidok kettős helyettesítését igényli, amely oly ritkán történik meg a véletlenszerű mutagenezis alkalmazásával, hogy el nem várható és meg nem ismételhető a siker bármiféle reményében. Bár a mutációs gyakoriságot lehet növelni a véletlenszerű mutagenezis során, a változások a nukleotidszekvenciában az előfordulás azonos valószínűségével mennek végbe az AHAS-gén mentén a mutációk egy előzetes helyre irányítottságának hiányában. Ez megnöveli egy olyan irreleváns mutáció nyerésének esélyét, amely befolyásolhatja az enzimaktivitást. Hasonlóképpen ritka az esély arra véletlenszerű mutagenezist alkalmazva, hogy egy többszörös aminosavhelyettesítéses, -kiiktatásos, vagy helyettesítéses/kiiktatásos mutációt találunk, amely herbicidrezisztenciát biztosít, miközben a katalitikus aktivitás fennmarad. A kiiktatásos mutációk, amelyek herbicidrezisztenciát adnak át, szintén valószínűtlenek egy véletlenszerű
HU 226 259 Β1 mutagenezises megközelítést alkalmazva. A kiiktatásoknak nagyon kis területre kellene korlátozódnia és triplettekben kellene előfordulnia, hogy fennmaradjon az AHAS leolvasókeret abból a célból, hogy fennmaradjon az enzimaktivitás.
Egy ésszerű, szerkezeti alapon történő megközelítéssel azonban kettős aminosavhelyettesítéses és/vagy -kiiktatásos mutációk viszonylag könnyen kivitelezhetők és pontosan célozhatok. Ezenkívül a véletlen mutagenezisben alkalmazott különböző mutagének a mutációk speciális típusait alakítják ki. Így például a nátrium-azid növényekben ponthelyettesítéses mutációkat alakít ki, míg a besugárzása kiiktatások (deléciók) kialakításának irányában hat. Következésképpen két mutagenezis munkamenetet kellene alkalmazni, hogy a helyettesítés/kiiktatás többszörös kombinációját kapjuk meg.
Végül a jelen szerkezeti alapon működő eljárás herbicidrezisztens AHAS-variánsok ésszerű tervezéséhez lehetővé teszi herbicidrezisztens mutációk ismétlődő javítását, ez pedig olyan lépés, amelyet véletlenszerű mutagenezist nem tesz lehetővé. Egy véletlenszerű mutagenezissel kialakított mutációs hely azonosítása a herbicidrezisztenciához nagyon csekély mértékű megjósolható értéket szolgáltat, ha egyáltalán szolgáltat a további, a mutánsok jellemzőiben való javítások irányításához. A jelen szerkezeti alapon működő megközelítés viszont lehetővé teszi a bevezetendő javításokat a szerkezeti modellben levő aminosavpozíció elhelyezkedésére, környezetére és funkciójára alapozva.
Az ismétlődő javítási eljárás ugyancsak lehetővé teszi az AHAS három fő tulajdonságának, a rezisztencia szintjének, a rezisztencia szelektivitásának és a katalitikus hatékonyságának egymástól független manipulálhatóságát. így például kompenzáló mutációkat lehet tervezni előre kiszámítható módon. Ha egy adott mutációnak káros hatása van egy enzim aktivitására, egy második, kompenzáló mutációt lehet alkalmazni az aktivitás helyreállítására, fgy például egy változást a nettó töltésben egy doménen belül, amikor egy töltött gyököt vezetünk be vagy vesztünk el valamely mutáció miatt, kompenzálhatunk egy második mutáció bevezetésével. A második helyen az enzimaktívitás helyreállítása céljából bevezetendő, kiiktatandó vagy helyettesítendő pozíció kiszámítása a szerkezet-funkció kapcsolat ismeretét igényli, ez pedig egy modellből, például az itt leírt modellből származik.
7b. Nem peptid herbicidek vagy AHAS inhibitorok tervezése
Egy olyan kémiai egységet, amely illeszkedik a célfehérje aktív helyére vagy kötődik bármely pozícióban, ahol ez gátolhat aktivitást, a szakterületen ismert eljárásokkal tervezhetünk, például számítógépes tervezési programokkal, amelyek egy receptorhellyel speciálisan kölcsönhatásba lépő vegyületek tervezésében nyújthatnak segítséget.
Az ilyen programokra példa lehet a LUDI program [Biosym Technologies, San Diego, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok; lásd még Lám és munkatársai: Science 263, 380 (1994); Thompson és munkatársai: J. Med. Chem. 37, 3100 (1994)].
A kötőzsebek és különösen azok az aminosavgyökök, amelyeket azonosítottak azzal a tulajdonságukkal kapcsolatban, hogy érintettek az inhibitorkötésben, alkalmasak „horgony” pontokként az inhibitor tervezésénél.
A helyspecifikus herbicidek tervezése előnyös azoknak a gyomfajtáknak a szabályozásában, amelyek spontán fejlesztenek ki herbicidrezisztenciát a földeken, elsősorban az AHAS-génben levő mutációk miatt.
Herbicidrezisztens AHAS-variánsok: DNS-ek, vektorok és polipeptidek
A jelen találmány magában foglalja a herbicidrezisztens AHAS-polipeptid variánsokat kódoló izolált DNS-molekulákat is. A jelen találmány szerinti AHASpolipeptideket kódoló gének származhatnak bármely fajtából, de elsősorban valamely növényfajtából, és a herbicidrezisztenciát átvivő mutációkat be lehet vezetni ekvivalens pozícióknál ezen AHAS-gének bármelyikén belül. Egy adott kodon pozíció ekvivalenciája különböző AHAS-génekben függvénye mind a primer aminosavszekvencia és fehérje megőrzésének, mind a hasonló háromdimenziós szerkezet megőrzésének. így például az 5. ábra bemutatja a szekvenciahomológia nagy mértékét különböző növényfajtákból származó AHAS-polipeptidek között.
A kiviteli módok egyik sorozatában ezek az AHAS DNS-ek egy AHAS-polipeptid és előnyösen az 1. ábra kukorica AHAS-polipeptidje variánsait kódolják, amelyben a polipeptid helyettesítéssel vagy kiiktatással módosul az 1. ábra egy vagy több alábbi aminosava előtt vagy után:
P48, G49, S52, M53, E54, A84, A95, T96, S97, G98, P99, G100, A101, V125, R127, R128, M129,1130, G131, T132, D133, F135, Q136, D186, 1187, T259,
T260, L261, M262, G263, R276, M277, L278, G279,
H281, G282, T283, V284, G300, V301, R302, F303,
D304, R306, V307, T308, G309, K310, 1311, E312,
A313, F314, A315, S316, R317, A318, K319, I320,
E329, I330, K332, N333, K334, Q335, T404, G413, V414, G415, Q416, H417, 0418, M419, W420, A421, A422, L434, S435, S436, A437, G438, L439, G440,
A441, M442, G443, D467, G468, S469, L471, N473,
L477, M479, Q495, H496, L497, G498, M499, V501,
Q502, Q504, D505, R506, Y508, K509, A510, N511,
R512, A513, H514, T515, S524, H572, Q573, E574,
H575, V576, L577, P578, M579, I580, P581, G583,
G584, továbbá az előzőek bármelyikének funkcionális ekvivalensei; az 1. ábra Q124 és D324 közti beiktatásai vagy kiiktatásai vagy ezek funkcionális ekvivalensei; és a fentiek bármelyikének bármely kombinációja.
A mutációk, akár az 1. ábra polipeptidjébe, akár más növényi AHAS-génekben ekvivalens pozíciókba vezetjük be ezeket, olyan változásokat tartalmazhatnak a DNS-szekvenciában, amelyek eredményezik egy vagy több aminosav egyszerű helyettesítését, vagy legfeljebb 5 aminosav kiiktatását a fenti listákon szereplő helyek bármelyike előtt vagy után.
Egy másik eljárás szerint a mutációk olyan változásokat tartalmazhatnak a DNS-szekvenciában, amely
HU 226 259 Β1 szerint egy vagy több aminosav van hozzáadva vagy kiiktatva keretben a fenti pozícióknál. A hozzáadások előnyösen mintegy 3 és mintegy 30 nukleotid közti számú nukleotidot, és a kiiktatások szintén mintegy 3 és mintegy 30 közti számú nukleotidot tartalmaznak. Ezenkívül egy egyedi mutáns peptid tartalmazhat több, mint egy hasonló, vagy különböző mutációt.
A jelen találmány magában foglal DNS és megfelelő RNS szekvenciákat, valamint szensz és antiszensz szekvenciákat. Az AHAS-polipeptideket kódoló nuk- 10 leinsavszekvenciák természetben előforduló AHAS szabályozó szekvenciákkal vannak szegélyezve, vagy társulva lehetnek heterológ szekvenciákkal, ideértve a promotereket, fokozókat, válaszelemeket, szignálszekvenciákat, poliadenilezési szekvenciákat, intronokat,
5’- és 3’-végi nemkódoló régiókat, és hasonlókat. Ezenkívül a nukleinsavat lehet azért is módosítani, hogy megváltozzék a stabilitás, oldhatóság, kötési affinitás és fajlagosság. így például variáns AHAS-kódoló szekvenciák szelektíven metilezhetők. A jelen talál- 20 mány szerinti nukleinsavszekvenciák módosíthatók valamely jelzéssel is, amely képes kimutatható jel nyújtására akár közvetlenül, akár közvetetten. Az ilyen jelzésekre példák lehetnek a radioizotópok, fluoreszcens molekulák, biotin és hasonlók.
A találmány vektorokat is nyújt, amely AHAS-variánsokat kódoló nukleinsavakat tartalmaz. Nagy számú vektort, ideértve a plazmidokat és a gomba vektorokat, írtak már le kifejezéshez sokféle eukarióta és prokarióta gazdaszervezetben. A vektorok előnyösen 30 magukban foglalhatnak valamely promotert is, amely működőképesen kapcsolódik az AHAS-t kódoló részhez. A kódolt AHAS-t bármilyen alkalmas vektor és gazdasejt alkalmazásával ki lehet fejezni bármely olyan eljárást használva, amelyet itt leírunk vagy idézünk, vagy amely egyébként jól ismert azok számára, akik a szakterületen járatosak. A megfelelő vektorokra példák lehetnek - anélkül, hogy eljárásunk csak ezekre 5 korlátozódna - a pBIN-alapú vektorok, a pBluescript vektorok és a pGEM vektorok.
A jelen találmány továbbá magában foglalja mind a herbicidrezisztens AHAS-polipeptid variánsokat, mind ezek peptidfragmentumát. Amint fentebb megmagyaráztuk, az AHAS-polipeptid variánsok származhatnak az 1. ábrákon bemutatott kukoricapolipeptidekből, vagy bármely növényi vagy mikrobiológiai eredetű AHAS-polipeptidből, előnyösen növényi AHAS-polipeptidből. A polipeptidek tovább módosíthatók például foszforilezéssel, 15 szulfátozással, acilezéssel, gllkozilezéssel, vagy más fehérjemódosításokkal. A polipeptideket izolálhatjuk növényekből, vagy heterológ organizmusokból vagy sejtekből (ideértve, de nemcsak ezekre korlátozva, a bakteriális, élesztő-, rovar-, növényi és emlőssejteket), amelyekbe egy AHAS-polipeptid variánst kódoló gént bevezettünk és kifejeztünk. Ezenkívül az AHAS-polipeptidek módosíthatók közvetlenül valamely jelzéssel is, amely képes kimutatható jel nyújtására akár közvetlenül, akár közvetve. Az ilyen jelzésekre példák lehetnek a radioizo25 topok, fluoreszcens vegyületek és hasonlók.
Kémiai anyagokra rezisztens növények, és AHASvaríáns géneket tartalmazó növények A jelen találmány magában foglal transzgenikus sejteket, ideértve, de nemcsak ezekre korlátozva, a magvakat, organizmusokat és növényeket, amelyekbe herbicidrezisztens AHAS-variánsokat kódoló géneket vezettünk be. A megfelelő befogadó növényekre nem korlátozó jellegű példákat mutat be az 1. táblázat.
1. táblázat Befogadó növények
| Közönséges név | Család | Latin név |
| Kukorica | Gramineae | Zea mays |
| Kukorica, fog alakú | Gramineae | Zea mays dentiformis |
| Kukorica, kavics alakú | Gramineae | Zea mays vulgáris |
| Kukorica, pattogatni való | Gramineae | Zea mays microsperma |
| Kukorica, lágy | Gramineae | Zea mays amylacea |
| Kukorica, édes | Gramineae | Zea mays amyleasaccharata |
| Kukorica, édes | Gramineae | Zea mays saccharate |
| Kukorica, viaszos | Gramineae | Zea mays ceratina |
| Búza, dinkel | Pooideae | Triticum spelta |
| Búza, durum | Pooideae | Triticum durum |
| Búza, angol | Pooideae | Triticum turgidum |
| Búza, nagy tönköly | Pooideae | Triticum spelta |
| Búza, lengyel | Pooideae | Triticum polonium |
| Búza, poulard | Pooideae | Triticum turgidum |
| Búza, egyszemes | Pooideae | Triticum monococcum |
| Búza, kis tönköly | Pooideae | Triticum monococcum |
HU 226 259 Β1
1. táblázat (folytatás)
| Közönséges név | Család | Latin név |
| Búza, lágy | Poóideae | Triticum aestivum |
| Rizs | Gramineae | Oryza sativa |
| Rizs, amerikai vad | Gramineae | Zizania aquatica |
| Rizs, ausztrál | Gramineae | Oriza australiensis |
| Rizs, indiai | Gramineae | Zizania aquatica |
| Rizs, vörös | Gramineae | Oryza glaberrima |
| Rizs, tuscarora | Gramineae | Zizania aquatica |
| Rizs, nyugat-afrikai | Gramineae | Oriza glaberrima |
| Árpa | Pooideae | Hordeum vulgare |
| Árpa, abesszin közbenső, más néven szabálytalan | Pooideae | Hordeum írregulare |
| Árpa, őszi kétsoros | Pooideae | Hordeum spontaneum |
| Árpa, csupasz | Pooideae | Hordeum trifurcatum |
| Árpa, egyiptomi | Pooideae | Hordeum trifurcatum |
| Árpa, négysoros | Pooideae | Hordeum vulgare polystichon |
| Árpa, hatsoros | Pooideae | Hordeum vulgare hexastichon |
| Árpa, kétsoros | Pooideae | Hordeum distichon |
| Gyapot, abroma | Dicotyledoneae | Abroma augusta |
| Gyapot, közép-amerikai | Malvaceae | Gossypium hirsutum |
| Gyapot, ázsiai fás, vagy indiai fás | Maívaceae | Gossypium arboreum |
| Gyapot, brazil, vagy vese alakú, vagy pernambuco | Malvaceae | Gossypium barbadense brasiliense |
| Gyapot, levantei | Malvaceae | Gossypium herbaceum |
| Gyapot, hosszú selymes, vagy hosszú fürtös, vagy tengeri sziget | Malvaceae | Gossypium barbadense |
| Gyapot, mexikói, vagy rövid fürtös | Malvaceae | Gossypium hirsutum |
| Szójabab, szója | Leguminosae | Glycine max |
| Cukorrépa | Chenopodiaceae | Béta vulgáris altissima |
| Cukornád | Fásszárúak | Arenga pinnata |
| Paradicsom | Solanaceae | Lycopersicon esculentum |
| Paradicsom, cseresznyepiros | Solanaceae | Lycopersicon esculentum cerasiforme |
| Paradicsom, közönséges | Solanaceae | Lycopersicon esculentum commune |
| Paradicsom, ríbizliszerű | Solanaceae | Lycopersicon pimpinellifolium |
| Paradicsom, héjas | Solanaceae | Physalis ixocarpa |
| Paradicsom, foltos | Solanaceae | Solanum incanum |
| Paradicsom, körte alakú | Solanaceae | Lycopersicon esculentum pyriforme |
| Paradicsom, fás | Solanaceae | Cyphomandra betacea |
| Burgonya | Solanaceae | Solanum tuberosum |
| Burgonya, spanyol vagy édes burgonya | Convolvulaceae | Ipomea batatas |
| Rozs, közönséges | Pooideae | Secale cereale |
| Rozs, hegyi | Pooideae | Secale montanum |
| Paprika, harang alakú | Solanaceae | Capsicum annuum grossum |
| Paprika, madár, vagy cayenne vagy guinea | Solanaceae | Capsicum annuum minimum |
| Paprika, sapka alakú | Solanaceae | Capsicum sinense |
HU 226 259 Β1
1. táblázat (folytatás)
| Közönséges név | Család | Latin név |
| Paprika, bikaorr, vagy édes | Solanaceae | Capsicum annuum grossum |
| Paprika, cseresznye | Solanaceae | Capsicum annuum cerasiforme |
| Paprika, fürtös vagy vörös fürtös | Solanaceae | Capsicum annuum fasciculatum |
| Paprika, kúpos | Solanaceae | Capsicum annuum conoides |
| Paprika, kecske vagy sarkantyú | Solanaceae | Capsicum frutescens |
| Paprika, hosszú | Solanaceae | Capsicum frutescens longum |
| Paprika, diszvörös vagy ráncos | Solanaceae | Capsicum annuum abbreviatum |
| Paprika, tabasco vörös | Solanaceae | Capsicum annuum conoides |
| Saláta, kerti | Compositae | Lactuca sativa |
| Saláta, spárgaszerű vagy zellerszerű | Compositae | Lactuca sativa asparagina |
| Saláta, kék | Compositae | Lactuca perennis |
| Saláta, kék vagy cikóriaszerű | Compositae | Lactuca pulchella |
| Saláta, káposztaszerű vagy fejes | Compositae | Lactuca sativa capitata |
| Saláta, kötöző, vagy hosszúlevelű vagy romaine | Compositae | Lactuca sativa longifolia |
| Saláta, ráncos vagy fodros vagy vágott vagy leveles | Compositae | Lactuca sativa crispa |
| Zeller | Umbelliferae | Apium graveolens |
| Zeller, halvány, vagy kerti | Umbelliferae | Apium graveolens dulce |
| Zeller, gyökeres, vagy répagyökerű | Umbelliferae | Apium graveolens rapaceum |
| Padlizsán, kerti | Solanaceae | Solanum melongena |
| Cirok | Sorghum | Minden terményfajta |
| Lucerna | Leguminosae | Medicago sativum |
| Sárgarépa | Umbelliferae | Daucus carota sativa |
| Bab, futó | Leguminosae | Phaseolus vulgáris vulgáris |
| Bab | Leguminosae | Phaseolus aureus |
| Bab, brazil széles | Leguminosae | Canavalia ensiformis |
| Bab, széles | Leguminosae | Vicia faba |
| Bab, közönséges, vagy francia, vagy fehér, vagy vese | Leguminosae | Phaseolus vulgáris |
| Bab, egyiptomi | Leguminosae | Dolíchos lablab |
| Bab, hosszú, vagy Yardos | Leguminosae | Vigna sesquipedalis |
| Bab, szárnyas | Leguminosae | Psophocarpus tetragonolobus |
| Zab, közönséges, vagy szegélyező, vagy fás | Avena | Sativa |
| Zab, fekete, vagy sörtés, vagy félszeg | Avena | Strigosa |
| Zab, sörtés | Avena | |
| Borsó, kerti, vagy zöld, vagy hántolnivaló | Leguminosae | Pisum sativum sativum |
| Borsó, feketeszemű | Leguminosae | Vigna sinensis |
| Borsó, ehető héjú | Leguminosae | Pisum sativum axiphium |
| Borsó, szürke | Leguminosae | Pisum sativum speciosum |
| Borsó, szárnyas | Leguminosae | Tetragonolobus purpureus |
| Borsó, ráncos | Leguminosae | Pisum sativum medullare |
| Napraforgó | Compositae | Helianthus annuus |
| Tök, őszi, vagy téli | Dicotyledoneae | Cucurbita maxima |
HU 226 259 Β1
1. táblázat (folytatás)
| Közönséges név | Család | Latin név |
| Tök, cserjés vagy nyári | Dicotyledoneae | Cucurbita pepo melopepo |
| Tök, süveg alakú | Dicotyledoneae | Cucurbita maxima turbaniformis |
| Uborka | Dicotyledoneae | Cucumis sativus |
| Uborka, afrikai vagy keserű | Dicotyledoneae | Momordica charantia |
| Uborka, fecskendőszerű, vagy vad | Dicotyledoneae | Ecballium elaterium |
| Uborka,vad | Dicotyledoneae | Cucumis anguria |
| Nyárfa, kaliforniai | Fásszárúak | Populus trichocarpa |
| Nyárfa, európai fekete | Populus nigra | |
| Nyárfa, szürke | Populus canescens | |
| Nyárfa, Lombardy | Populus italica | |
| Nyárfa, ezüstlevelű, vagy fehér | Populus alba | |
| Nyárfa, nyugati balzsam | Populus trichocarpa | |
| Dohány | Solanaceae | Nicotiana |
| Arabidopsis thaliana | Curciferae | Arabidopsis thaliana |
| Pázsitfű | Lolium | |
| Pázsitfű | Agrostis | |
| További pázsitfű családok | ||
| Lóhere | Leguminosae |
Az AHAS-polipeptid variánsok kifejezése transzgenikus növényekben magas szintű rezisztenciát biztosít herbicidekre, ideértve, de nemcsak ezekre korlátozva, az imidazolinon herbicideket, mint például az imazetapirt (PURSUIT), lehetővé téve ezeknek a herbicideknek az alkalmazását a transzgenikus növények termesztése során.
Idegen géneknek növényekbe való bevezetésére szolgáló eljárások ismeretesek a szakterületen. Nem korlátozó jellegű példák lehetnek az ilyen eljárásokra az Agrobacteriummal történő fertőzés, a részecskebombázás, a protoplasztok polietilénglikolos (PEG) kezelése, a protoplasztok elektroporációja, a mikroinjektálás, a makroinjektálás, a gyökérsaij-injektálás, a pollentömlő út, a száraz mag átitatás, a lézerperforálás és az elektroforézis. Ezeket az eljárásokat például az alábbi irodalmi helyeken ismertetik: Jenes B. és munkatársai, és Ritchie S. W. és munkatársai: In: Transgenic Plats, 1. kötet, „Engineering and Utilization”; szerkesztők: Kung S.-D. és Wu R.; kiadó Academic Press, Inc. Harcourt Brace Jovanovich (1993); és Mannonen és munkatársai; Critical Reviews in Biotechnology, 14, 287-310 (1994).
Egy előnyös kiviteli módban az egy AHAS-variánst kódoló DNS-t olyan DNS-vektorba klónozzuk, amely valamely antibiotikumrezisztencia markergént tartalmaz, és a rekombináns AHAS DNS-t tartalmazó plazmidot egy Ti plazmidot tartalmazó Agrobacterium tumefaciensbe vezetjük be. Ezt a „biner vektor rendszerit például az alábbi irodalmi helyeken ismertetik: 4.490.838 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalom, és An és munkatársai: Plánt Mól.
Bioi. Manual A3, 1-19 (1988). A transzformált Agrobacteriumot azután együtt tenyésztjük a befogadó növényekből származó levéllemezekkel, hogy lehetővé tegyük a növénysejtek fertőzését és transzformálását. A transzformált növénysejteket azután regeneráló tápközegben tenyésztjük, amely a sarjak kialakulását segítik elő, először a megfelelő antibiotikum jelenlétében, hogy kiválasszuk a transzformált sejteket, majd a herbicid jelenlétében. A herbicidrezisztens AHAS-t kódoló DNS-sel sikeresen transzformált növénysejtekben a sarjak képződése megtörténik a herbicidek olyan szintjeinek jelenlétében is, amelyek a nem transzformált sejtekből való sarjképzést gátolják. Miután meggyőződtünk az AHAS-variáns DNS jelenlétéről például polimeráz-láncreakció (PCR) elemzés alkalmazásával, a transzformált növényeket megvizsgáljuk azon képességükre, hogy ellenállnak a herbiciddel történő permetezésnek és azon képességükre, hogy magjuk kicsírázik, gyökerük beindul és burjánzik a herbicid jelenlétében.
Egyéb alkalmazások
A jelen találmány eljárásait és anyagait alkalmazhatjuk herbicidrezisztens AHAS-variánsok szerkezeti alapon történő ésszerű tervezésére, amely variánsok beépíthetők növényekbe, hogy szelektív herbicidrezisztenciát adjanak át ezeknek. Az AHAS köztes variánsai (például olyan variánsok, amelyek az optimálisnál kisebb fajlagos aktivitást, de nagy rezisztenciát és szelektivitást mutatnak, vagy fordítva) használhatók mint templátok második generációs AHAS-variánsok tervezéséhez, amelyek megőrzik a megfelelő fajlagos aktivitást, nagy rezisztenciát és szelektivitást.
HU 226 259 Β1
Herbicidrezisztens AHAS-géneket transzformálhatunk terményfajtákba egyedi vagy többszörös másolatban, hogy herbicidrezisztenciát adjanak át. A herbicidekre csökkentett érzékenységű terményfajták kialakítására való genetikai mérnöki beavatkozással képesek vagyunk:
(1) megnövelni a fajlagosan hatásos és környezetileg enyhe herbicidek, mint például az imidazolinon herbicidek alkalmazási spektrumát és rugalmasságát;
(2) fokozni ezeknek a herbicideknek a kereskedelmi értékét;
(3) csökkenteni a gyomok elterjedését a földeken a herbicidek hatékony alkalmazásával a herbicidekre rezisztens terményfajtákhoz, és ezáltal megfelelően növelni az aratás hozamát;
(4) növelni a herbicidrezisztens növények magjainak eladását;
(5) növelni a rezisztenciát a korábbi ültetéskor alkalmazott herbicidek átviteléből származó terménykárosodás ellen;
(6) csökkenteni az érzékenységet a kedvezőtlen éghajlati körülmények miatt a kukorica jellemzőiben bekövetkező változásokra; és (7) növelni a tűrőképességet az egyenetlenül vagy rosszul alkalmazott herbicidekre.
Igy például transzgenikus AHAS-fehéije variánst tartalmazó növényeket termeszthetünk. A növényt kezelhetjük gyomirtáshoz hatékony mennyiségű herbiciddel, amelyre az AHAS-variáns transzgenikus növény rezisztens, ezzel gyomszabályozást érünk el a tenyészetben a nélkül, hogy károsan befolyásolnák a termeszteni szándékolt növényt.
A fentebb leírt DNS-vektorokat, amelyek herbicidrezisztens AHAS-variánsokat kódolnak, tovább hasznosíthatjuk úgy, hogy az AHAS-variáns kifejezése szelektálható markert nyújtson a sejtek vektorral való transzformálásánál. A befogadónak szánt sejtek lehetnek tenyészetben vagy in situ, és az AHAS-variáns géneket használhatjuk egyedül vagy más szelektálható markerekkel kombinálva. Az egyetlen követelmény az, hogy a befogadó sejt érzékeny legyen a rokon herbicid citotoxikus hatására. Ennek a kiviteli módnak előnye a viszonylag alacsony költség és a például imidazolinonalapú herbicidek toxicitásának hiánya, és ez alkalmazható bármely olyan rendszerben, amely DNS által közvetített transzformációt igényel.
Az alábbi példák azt a célt szolgálják, hogy részletesebben bemutassák a jelen találmányt, de nem korlátozó jelleggel.
1. példa Herbicidrezisztens AHAS-variánsok tervezése
A fentebb részletesen leírt modell javasolt herbicidkötő helyéhez közel elhelyezkedő gyököket választunk ki mutagenezishez abból a célból, hogy tervezzünk egy aktív AHAS-polipeptidet csökkentett herbicidkötő kapacitással. A zseb felületénél minden helyet megvizsgálunk a zsebben levő további gyökökkel, valamint kofaktorokkal és herbicidekkel potenciálisan kialakuló kölcsönhatások szempontjából, igy például a pozitívan töltött gyök(ök)től elvárható, hogy interferálnak a kötő helyen belül levő töltéseloszlással, ez pedig csökkenést eredményez a negatívan töltött herbicidek kötésének affinitásában.
Három gyököt azonosítottunk, mint leghasznosabb célpontokat a mutagenezishez:
(1) Az F135-ösről úgy véljük, hogy kölcsönhatásban van mind a FAD izoalloxazingyűrűjével, mind a herbicid aromás csoportjával. A töltöttebb gyökök zsebbe való bejuttatásának stratégiájával összhangban ezt a gyököt argininre cseréljük.
(2) Az M53 érinti a 498-507 hélixet. Ez a hélix ismert herbicidrezisztencia mutációs helyeket tartalmaz és be van vonva a TPP kötésbe. Ezenkívül a glutaminsavhelyettesítésről az 53. helyen úgy véljük, hogy támogat egy kölcsönhatást K185-tel, csökkentve a K185 affinitását az imazetapir karboxilátcsoportjához.
(3) Az R128 a zseb bejáratához közel helyezkedik el, ahol véleményünk szerint érintett a töltött herbicidek kezdeti transzportjában a kötőzsebbe. Ezt a gyököt alaninra változtatjuk, hogy eltávolítsuk mind töltését, mind hosszú hidrofób oldalláncát.
2. példa Az AHAS helyspecifikus mutagenezise herbicidrezisztens variánsok előállítására Az Arabidopsis AHAS-gént azonos leolvasási fázisban beiktatjuk a glutation S-transzferáz gén kódoló régiójának 3’-végéhez a pGEX-2T vektorban (Pharmacia). A vektor konstrukciója ezen a módon fenntartja a hat aminosavas trombin felismerő szekvenciát a kifejezett glutation-S-transzferáz (GST)/AHAS fúziós fehérje kapcsolásánál. A kifejezett fúziós fehérje trombinos emésztése olyan AHAS-fehéijét eredményez, amelynek N-terminális kiindulási helye a tranzit peptid végénél van egy vélt tranzit peptid feldolgozó helynél, egy maradék N-terminális glicinnel, amely a trombin felismerő helyből származik. A hasított AHAS-fehéije végső aminoterminálisa Gly-Ser-Ser-lle-Ser szekvenciából áll. Ebben a vektorban helyspecifikus mutációkat vezetünk be az AHAS-génbe.
A helyspecifikus mutagenezist Higuchi PCR-eljárása szerint hajtjuk végre [Recombinanat PCR. In: Innis M. A. és munkatársai: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, kiadó: Academic Press, San Diego, 177-183. oldal (1990)]. Két PCR-terméket, melyek mindegyike átfedi a mutációs helyet, amplifikálunk. A mutációt az átfedő régió láncindítói hordozzák. Az átfedő, PCR-rel amplifikált fragmenseket egyesítjük, denaturáljuk, és hagyjuk egymással újra összeforradni, így alakítva ki két lehetséges heteroduplex terméket rejtett 3'-végekkel. A rejtett 3’-végeket Taq DNS-polimerázzal meghosszabbítjuk olyan fragmentumot előállítva, amely a két átfedő PCR-termék összesítése, és amely tartalmazza a kívánt mutációt. Ennek a fragmentumnak az ezt követő újra amplifikálása kizárólag a két „külső” primer jelenlétében a teljes hosszúságú termék feldúsulását eredményezi. A mutációt tartalmazó terméket azután újra bejuttatjuk az Arabidopsis AHASgénbe a pGEX-2T vektorban.
HU 226 259 Β1
3. példa AHAS-variánsok expressziója és tisztítása
A. Eljárások
A kukorica vad típusú AHAS-gént (a vektor elnevezése pAC751), az Arabidopsis Ser653Asn mutánst, vagy az Arabidopsis lle401Phe mutánst tartalmazó pGEX-2T vektorral transzformált E. coli (DH5a) sejteket növesztjük egy éjszakán át LB-tápközegben, amely 50 pg/ml ampicillint is tartalmaz. Az E. coli égy éjszakán át nőtt tenyészetét 1:10 arányban hígítjuk 1 liter LB tápközeggel, amely 50 pg/ml ampicillint és 0,1% (térfogat/térfogat) A típusú habgátlót is tartalmaz. A tenyészetet 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk rázatás közben, amíg az OD600 eléri a mintegy 0,8 értéket. Izopropil-tio-galaktózt (IPTG) adunk hozzá 1 mmol/liter végső koncentrációig, és a tenyészetet további 3 órán át inkubáljuk.
A sejteket centrifugálással nyerjük ki 8.670*g-nél 10 percig JA-10 rotorban, és újraszuszpendáljuk az eredeti tenyésztési térfogat 1/100-ában MTPBS-ben (16 mmol/l Na2HPO4,4 mmol/l NaH2HPO4,150 mmol/l NaCI, pH=7,3). Triton Χ-100-at és lizozimot adunk hozzá 1% (térfogat/térfogat), illetve 100 pg/ml koncentrációban. A sejteket 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk 15 percen át, lehűtjük 4 °C hőmérsékletre jégen, és ultrahangos keveréssel lizáljuk 10 másodpercig egy mikrocsúcs szondával ellátott Branson Sonifier Cell Disrupter típusú ultrahangos sejtzúzó berendezés 7. szintjével. A sejtmentes extraktumot 35.000*g-nél centrifugáljuk 10 percen át 4 °C hőmérsékleten. A felülúszót dekantáljuk és a centrifugálási lépést megismételjük.
A kifejezett fúziós fehérjék tisztítását Smith és Johnson módosított eljárásával hajtjuk végre [Gene 67, 31-40 (1988)]. A felülúszót szobahőmérsékletre melegítjük és átengedjük egy glutation-agaróz-gyöngyöket (kénkötés, Sigma) tartalmazó 2 ml-es oszlopon, amelyet előzőleg MTPBS-sel egyensúlyoztunk ki. Az oszlopot ezt követően MTPBS-sel mossuk szobahőmérsékleten, amíg az eluátum A280-értéke egyezik az MTPBS hasonló értékével. A fúziós fehérjét azután olyan oldat alkalmazásával eluáljuk, amely 5 mmol/l redukált glutationt tartalmaz 50 mmol/l trisz.HCI-ben (pH=8,0). Az eluált fúziós fehérjét mintegy 30 NIH egység trombinnal kezeljük és dializáljuk 50 mmol/l citrátot (pH=6,5) és 150 mmol/l NaCI-t tartalmazó oldattal szemben.
A fúziós fehérjét egy éjszakán át emésztjük szobahőmérsékleten. Az emésztett mintákat dializáljuk MTPBS-sel szemben és kétszer átengedjük egy glutation-agaróz oszlopon, amelyet MGPBS-sel egyensúlyoztunk ki, így távolítjuk el a felszabadult glutation transzferáz fehérjét. A fehérje frakciót, amely nem kötődött az oszlophoz, összegyűjtjük és YM10 szűrőn (Amicon) végzett ultraszűréssel koncentráljuk. A koncentrált mintákat ráterheljük egy 1,5*95 cm-es Sephacryl S-100 gélszűrő oszlopra, amelyet gélszűrő pufferral (50 mmol/l HEPES, 150 mmol/l NaCI, pH=7,0) egyensúlyoztunk ki. 2 ml-es frakciókat gyűjtünk 0,14 mmol/l/perc átfolyási sebességnél. Az enzim stabilitását az enzim tárolásával vizsgáljuk 4 °C hőmérsékleten gélszűrő pufferban 0,02% nátrium-azid hozzáadásával és 2 mmol/l tiamin-pirofoszfát és
100 pmol/l flavin-adenin-dinukleotid (FAD) jelenlétében vagy távollétében.
B. Eredmények
A GST génnel - a géntől 3’-irányban és azonos leolvasási fázisban - fuzionált vad típusú AHAS-gént tartalmazó pAC751 plazmiddal transzformált E. coli egy 91 kD-s fehérjét fejez ki, amikor IPGT-vel indukáljuk. A 91 kD-s fehérje a GST/AHAS fúziós fehérje számított molekulatömegét (26 kD és 65 kD összege) mutatja. Amikor a DH5a/pAC751 sejtmentes extraktumát keresztülbocsátjuk egy glutation agaróz affinitás gélen, mossuk és eluáljuk szabad glutationnal, olyan készítmény keletkezik, amely a 91 kD-s fehérjében dús (6. ábra, C vonal). A hat aminosavas trombin felismerő hely, amelyet a GST és AHAS találkozásához alkottunk meg, sikeresen lehasadt trombinnal (6. ábra, D vonal). A hasított fúziós fehérje készítmény a várt 26 kD-s GST fehérjéből és a 65 kD-s kukorica AHASfehérjéből áll. A kukorica AHAS-t homogenitásig tisztítjuk egy második átbocsátással a glutation-agaróz oszlopon, hogy affinitás segítségével kivonjuk a GST-t, és egy végső Sephacryl S-100 gélszűrési lépésnek alávetéssel, hogy eltüntessük a trombint (6. ábra, E vonal). A 65 kD-s fehérjét Western foltképzéssel ismerjük fel olyan monoklonális antitest segítségével, amelyet egy kukorica AHAS-peptid ellen alakítottunk ki.
A tisztított, vad típusú kukorica AHAS-t elemezzük elektroporlasztásos tömegspektroszkópiával, és úgy határozzuk meg, hogy ennek molekulatömege 64.996 dalton (részletes adatokat nem mutatunk be). A jósolt tömeg, ahogyan számítottuk a pGEX-2T vektorba beiktatott gén következtetett szekvenciájából, 65.058. A 0,096% eltérés az empirikusan meghatározott és a jósolt tömeg között a tömegspektrométer hangolási szóródásán belül van. A két tömegmeghatározás szoros közelsége azt sugallja, hogy nincsenek tévesen beépített nukleotidok az expressziós vektor megalkotása során, és a fehérje olyan transzláció utáni módosulásai nem jelennek meg, amelyek nagy változásokat okozhatnának a molekulatömegben. Ezenkívül a hamis csúcsok hiánya a tisztított készítményben is azt jelzi, hogy a minta mentes a szennyeződéstől.
4. példa Az AHAS-variánsok enzimes tulajdonságai
Az E. coliban termelt vad típusú és variáns AHAS enzimes tulajdonságait Singh és munkatársai módosított eljárásával mérjük [Anal. Biochem 171, 173-179 (1988)] a következőképpen:
1*AHAS vizsgálópuffert [50 mmol/l HEPES, pH=7,0, 100 mmol/liter piruvát, 10 mmol/l MgCI2, 1 mmol/liter tiamin pirofoszfát (TPP)] és 50 pmol/l flavin adenin dinukleotidot (FAD) tartalmazó reakciókeveréket kapunk vagy egy 2*vizsgálópufferban levő enzim hígításával, vagy koncentrált enzim hozzáadásával 1 *AHAS vizsgálópufferhez. Minden imazetapirt tartalmazó és ezekhez tartozó kontroll vizsgáló összeállítás tartalmaz végső koncentrációjában 5% DMSO-t (dimetil-szulfoxid), mivel a vizsgálókeverékhez az imazetapirt 50% DMSO-s oldatban adjuk hozzá. A vizsgálato18
HU 226 259 Β1 kát 250 μΙ végső térfogatban végezzük 37 °C hőmérsékleten, mikrotitrálólemezeken. Miután a reakciót hagytuk végbemenni 60 percen át, kaliometriásan mérjük az acetolaktát felgyülemlését, ahogyan ezt Singh és munkatársai leírják [Anal. Biochem. 171, 173-179 (1988)].
A pAC751-ből a 3. példában leírtak szerint kifejezett és tisztított kukorica AHAS aktív a piruvátnak acetolaktáttá való átalakításában. A teljes AHAS-aktivitás függ a FAD és TPP kofaktorok jelenlététől a vizsgáló tápközegben. Aktivitás nem mutatható ki, amikor csupán FAD-ot adunk hozzá a vizsgálóközeghez. A tisztított enzim aktivitása csupán TPP-vel vagy kofaktorok nélkül kevesebb mint 1%-a annak az aktivitásnak, amely TPP és FAD együttes jelenlétében mutatkozik. Normálisan a nyers növényi extraktumban levő AHAS nagyon labilis, különösen a szubsztrátum és a kofaktorok távollétében. Ezzel ellentétben a bakteriális kifejező rendszerből tisztított AHAS nem mutat veszteséget a katalitikus aktivitásban, amikor 1 hónapon át tároljuk 4 °C hőmérsékleten olyan oldatban, amely 50 mmol/l HEPES-t, pH=7,0, 150 mmol/l NaCI-t és 0,02% NaN3-at tartalmaz, és ez érvényes FAD és TPP jelenlétében és távollétében egyaránt. Ezenkívül bomlástermék nem látható ezekből a tárolt készítményekből, amikor felbontjuk SDS-PAGE gélen.
A vad típusú és az M124E, R199A és F206R variánsok fajlagos aktivitásait a 2. táblázatban mutatjuk be. Amint ezt az 5. ábra egymás alá rendezéséből meghatározzuk, az Arabidopsis AHAS-ban levő M124E mutáció a kukorica M53E mutáció ekvivalense, az Arabidopsisban levő R199 mutáció a kukorica R128A mutáció ekvivalense, és az Arabidopsisban levő F206R mutáció a kukorica F135R mutáció ekvivalense. A kukorica AHAS szerkezeti modellben tervezett mutációkat felhasználjuk, hogy azonosítsuk az ekvivalens aminosavakat a kétszikű Arabidopsis AHAS-génben, és ezeket beépítjük az Arabidopsis AHAS-génbe és vizsgáljuk benne. Az ésszerűen tervezett herbicid mutációk ezen transzlációja és beépítése a kétszikű Arabidopsis AHAS-génbe megkönnyítheti a herbicidrezisztencia értékelését valamely kétszikű fajtában.
2. táblázat Fajlagos aktivitás
| Fajlagos aktivitás | % katalitikus aktivitás a vad típuséhoz hasonlítva | |
| Vad típus | 99,8 | 100 |
| Met124Glu | 9,15 | 9,16 |
| Arg199Ala | 86,3 | 86,5 |
| Phe206Arg | 5,07 | 5,1 |
A R199A mutáció magas szintű katalitikus aktivitást tart fenn (2. táblázat), ugyanakkor a rezisztencia jelentős szintjét mutatja imazetapirra (7. ábra). Megjegyzésre méltó, hogy ez a variáns teljes érzékenységet őriz meg szulfonil-karbamidokra (8. ábra). így ez a variáns teljesíti a nagyfokú fajlagos aktivitás és szelektív herbicidrezisztencia követelményeit. Ezzel ellentétben az M124E helyettesítés csaknem teljes rezisztenciát mutat imazetapirra (7. ábra), de meglehetősen csökkent katalitikus aktivitást is mutat (2. táblázat). Az imidazolinonrezisztenciára vonatkoztatva ez a variáns nagyobb érzékenységet mutat szulfonil-karbamidra (8. ábra), azt sugallva, hogy ez a gyök jelölt egy olyan mutáció megalkotására, amely szelektív rezisztenciát ad. Egy aminosav helyettesítése glutaminsavtól eltérő aminosawal segíthet megtartani a katalitikus aktivitást. Az F206R helyettesítés hasonló eredményeket alakít ki az M124E variánsnál észleltekhez, de hiányzik benne a szelektivitás a rezisztenciában.
5. példa Az AHAS herblcidrezlsztens variáns ismételt javítása az ésszerű tervezési megközelítés alkalmazásával
A 124 gyök cseréje az AHAS-ban Met-ről Glu-ra, amint a 4. példában leírjuk, imidazolinonrezisztenciát biztosít, de csökkenti az enzimaktivitást is a vad típusúnál mért érték 9,2%-ára. A kukorica AHAS szerkezet fent leírt modellje azt sugallja, hogy a Met53 (amely ekvivalens az Arabidopsis Met124 gyökével) kölcsönhatásban van egy sor hidrofób gyökkel az α-hélix első felületén, amely egy külön alegységből származik, de szoros közelségben van a Met53-hoz. fgy a hidrofób kölcsönhatás Met53 és a hélixen levő gyökök között stabilizálja mind az alegység/alegység társulást, mind az aktív hely konformációját. Úgy véljük, hogy a hidrofób Met gyök helyettesítésre egy töltött glutamát gyökkel nagy valószínűséggel destabilizálja az alegységek közti hidrofób kölcsönhatást, ez pedig a katalitikus aktivitás elvesztését eredményezi.
Erre a szerkezet/funkció elemzésre alapozva az eredeti Arabidopsis Met124Glu (amely ekvivalens a kukorica Met53Glu-val) mutáns enzim aktivitását azután ismételten javítjuk egy további hidrofób aminosav (Ile) helyettesítésével ennél a pozíciónál. Az Ile oldallánc hidrofób természete az aktivitás helyreállítását eredményezi a vad típusú szintekre (fajlagos aktivitás 102, amely ekvivalens a vad típusú aktivitás 102%-ával), de az Ile oldallánc nagyobb tömege még képes fenntartani az imidazolinonrezisztencia jelentős szintjét (9. ábra).
Összehasonlításként egy hisztidin gyök helyettesítése ennél a pozíciónál olyan AHAS-variánst eredményez, amely 42,5 fajlagos aktivitási értéket mutat, amely a vad típusú aktivitás 42,6%-ával ekvivalens. Ez a mutáns ugyanakkor nagymértékű rezisztenciát mutat PURSUIT-ra (10. ábra).
6. példa Az AHAS herblcidrezlsztens variáns ismétlődő javítása egy ésszerű tervezési megközelítés alkalmazásával
Az ismétlődő finomításra a jelen találmány szerinti eljárást alkalmazva egy másik példa lehet az Arg128Ala variáns. A kukorica AHAS szerkezeti modellje azt sugallja, hogy az Arg 128 gyök, amely a herbicidkötő zseb peremén helyezkedik el, részt vesz a töltött szubsztrá19
HU 226 259 Β1 tumok és herbicidek beléptetésében a herbicidkötő zsebbe és az aktív helyre. Az Arg 128 gyök távol van a TPP-nek attól a felétől, amely a kiindulási piruvátmolekulát köti az AHAS reakciómechanizmusában, ez magyarázza meg, miért van az Arabidopsis Arg199 (amely ekvivalens a kukorica Arg128-cal) helyettesítésének alaninra oly csekély hatása az enzim katalitikus aktivitására. A szerkezeti modell továbbá azt jelzi, hogy egy radikálisabb cserét lehetne végezni ennél a pozíciónál, hogy megemeljük a rezisztencia szintjét, miközben fenntartjuk a katalitikus aktivitás magas szintjét. Ezen az alapon a mutáció ismételt javítását végezzük el, hogy helyettesítsük a pozitívan töltött arginin gyököt egy negatívan töltött glutamát gyökre. Az így mutált enzim a rezisztencia javított szintjeivel bír PURSUIT-ra, miközben megtartja magas szintű aktivitását (fajlagos aktivitása 114, ez a vad típusú aktivitás 114%-ával ekvivalens).
7. példa A különböző fajtákból származó AHAS-ok felcserélhetósége a herbicidrezisztens ÁHASvariánsok szerkezeti alapon történő ésszerű tervezésében te AHAS háromdimenziós szerkezetének szerkezeti modelljét valamely egyszikű AHAS szekvenciával, például kukoricából származó szekvenciával építjük fel, amint a korábbiakban leírtuk. Abból a célból, hogy mutációkat vezessünk be valamely kétszikű fajtából, például Arabidopsisból származó AHAS-ba, az egyszikű és kétszikű fajtákból származó AHAS-ok szekvenciáit egymás alá rendezzük a GAP és PILEUP programokat alkalmazva (Genetics Computer Group, 575 Sequence Drive, Madison, Wisconsin 53711). A számítógéppel kialakított egymás alá rendezésből meghatározzuk az ekvivalens pozíciókat. A mutációkat azután bejuttatjuk a kétszikű AHAS-génbe, ahogyan ezt fentebb leírtuk. A mutáns AHAS-fehérje E. coliban való kifejezése és biokémiai tulajdonságainak (azaz fajlagos aktivitásának és herbicidekre való rezisztenciájának) felbecslése után a mutáns gént bejuttatjuk valamely kétszikű növénybe a növénytranszformálási eljárások valamelyikével, ahogyan ezt a korábbiakban leírtuk.
8. példa Herbicidrezisztens növények előállítása ésszerűen tervezett AHAS-génekkel való transzformálással
DNS-konstrukciók
E. coli expressziós vektorokban található, ésszerűen tervezett AHAS-variáns géneket alkalmazunk DNS restrikciós fragmensek forrásaként, hogy helyettesítsük az ekvivalens restrikciós fragmenst egy Arabidopsis AHAS-génben. Ez a gén egy 5,5 kb-os genomikus fragmentumban van jelen, amely tartalmazza még az Arabidopsis AHAS promotert, az Arabidopsis AHAS terminációs szekvenciát és az 5’- és 3’-végi szegélyező DNS-eket. Miután a DNS-szekvenciaelemzést a mutációs helyek körül elvégeztük, hogy igazoljuk a kívánt mutáció jelenlétét, a teljes 5,5 kb-s fragmentumot mindegyik plazmidból beiktatjuk egy pBIN-alapú növényi transzformációs vektorba (Mogen, Leiden, Hollandia). A növényi transzformációs vektor tartalmazza a neomicin foszfotranszferáz II (nptll) kanamicin rezisztencia gént, amelyet a 35S karfiol-mozaikvírus promoter hajt meg. A végső vektor konstrukciót a 12. ábrában mutatjuk be. Az Arabidopsis AHAS-géneket, amelyek Met124lle, Met124His és Arg199Glu mutációkkal bírnak (ezek az 1. ábrában bemutatott AHAS szekvenciában Met53lle, Met53His és Arg128Glu mutációknak felelnek meg), pJK002-nek, pJK003-nak, illetve pJK004nek nevezzük el.
Ezen vektorok mindegyikét Agrobacterium tumefaciens LBA4404 törzsbe transzformáljuk (R&D Life Technologies, Gaithersburg, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) az An és munkatársai által leírt transzformációs eljárással [Plánt Mól. Bioi. Manual A3, 1-19 (1988)].
Növénytranszformálás
A Nicotiana tabacum cv. Wisconsin 38 levéllemez transzformálását úgy hajtjuk végre, ahogyan ezt Horsch és munkatársai leírták [Science 227, 1229-1231 (1985)], de némi módosítással. A steril körülmények között növesztett növényekből levéllemezeket vágunk ki és együtt tenyésztjük fejjel lefelé Murashinge Skoog tápközegben (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, Amerikai Egyesült Államok) 2-3 napon át 25 °C hőmérsékleten sötétben a pJK002, pJK003 vagy pJK004 plazmidokat tartalmazó Agrobacterium tumefaciens törzsekkel. A lemezeket szárazra itatjuk és átvisszük a B5-vitaminokat tartalmazó regeneráló Murashige Skoog tápközegbe, amely tartalmaz 1 mg/l benzil-adenint, 0,1 mg/l 1-naftil-ecetsavat, 100 mg/l kanamicint és 500 mg/l cefotaximot (mind a Sigma termékei).
A transzformánsokat kezdetben a transzformációs vektorban jelen levő nptll-gén által kiváltott kanamicinrezisztencia segítségével választjuk ki. A levéllemezekből származó saijakat kimetsszük és friss Murashige Skoog hormonmentes tápközegre helyezzük, amely cefotaximot és kanamicint tartalmaz.
In vivő herbicidrezisztencia
Kanamicinrezisztens dohánysarjakat viszünk át olyan tápközegre, amely 0,25 pmol/liter imazetapirt tartalmaz. Az imidazolinon herbicid ezen koncentrációjánál a nem transzformált dohánysarjak (amelyek endogén vad típusú AHAS-t tartalmaznak) nem képesek elindítani a gyökér képződését. Ezzel ellentétben gyökérbeindulás és -növekedés figyelhető meg a mutáns AHAS-gének mindegyikével transzformált dohánysarjakból. A Met124lle és Arg199Glu mutáns génekkel transzformált sarjakból kifejlődött gyökereket mutat be a 13. ábra a vad típusú növénnyel együtt. Ezenkívül a Met124lle vagy Arg199Glu mutáns génekkel transzformált növények ellenállók a kétszeres permetezésre is az imazetapirral történt szántóföldi kezelésre (100 g/hektár) is. A gyökérnövekedés kialakulásai a transzformált növényekben a nem transzformáit növényekkel szemben herbicid jelenlétében, valamint a viselkedésük herbicides permetezés után azt sugallja, hogy az ésszerűen tervezett herbicidrezisztencia gének kifejezése herbicidrezisztenciát biztosit in vivő.
HU 226 259 Β1
Az ésszerűen tervezett gének kimutatása herbicidrezisztens dohányban.
Genomikus DNS-t izolálunk az AHAS-sal transzformáit dohánynövényekből, és az Arabidopsis AHAS-variáns gén jelenlétét PCR-elemzéssel igazoljuk. Az Arabidopsis AHAS-gén és a két dohány AHAS-gén közti különbségeket használjuk ki, hogy olyan PCR-primereket tervezzünk, amelyek csak az Arabidopsis gént terjesztik ki egy dohány genomikus DNS háttérben. Az ésszerűen tervezett herbicidrezisztencia géneket kimutatjuk, ahogyan ezt a megfelelő méretű DNS-fragmentum kiterjesztése bemutatja, a herbicidrezisztens növények legtöbbjében. PCR szignál nem mutatható ki a nem transzformált dohány növényekben.
Transzformált AHAS-gének szegregációja
Abból a célból, hogy megfigyeljük az ésszerűen tervezett AHAS-gének szegregációját transzformált növényekben, csírázási vizsgálatokat hajtunk végre. Magokat helyezünk hormonmentes Murashige-Skoog tápközegbe, amely 2,5 pmol/ml PURSUIT-ot és 100 pmol/liter kanamicint is tartalmaz. Az így létrejövő palántákat vizuálisan értékeljük a herbicidre való rezisztenciára vagy fogékonyságra.
Mivel a dohánynövények diploidok, az várható, hogy az önbeporzó növények utódai rezisztens:fogékony 3:1 arányban szegregálódnak, tükrözve 1 homozigóta palánta (a rezisztens AHAS-génre), 2 heterozigóta palánta (a rezisztens AHAS-génre) és 1 olyan palánta jelenlétét, amelyben nincs rezisztens AHAS-gén.
Az eredmények azt jelzik, hogy a rezisztens AHASgének a várt 3:1 arányban szegregálódnak, alátámasztva azt a következtetést, hogy a herbicidrezisztenciát az ésszerűen tervezett AHAS-génnek egy egyedi, domináns kópiája adja át.
Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a herbicidrezisztens AHAS-gének ésszerű tervezését lehet alkalmazni olyan növények előállításához, amelyek herbicidrezisztens növekedést mutatnak in vivő.
9. példa Különböző herbicidekre keresztrezisztens növények előállítása ésszerűen tervezett AHASgénekkel való transzformálással
Dohánynövényeket, amelyeket ésszerűen tervezett AHAS-génekkel transzformáltunk, amint ezt a 8. példában leírjuk, megvizsgáljuk keresztrezisztenciára is egy másik herbicidre, a CL 299.263-ra (amely imazamox néven is ismert). Csírázási vizsgálatokat hajtunk végre a Met124lle, Met124His és Arg199Glu Arabidopsis AHAS-variáns géneket tartalmazó primer transzformánsokból aratott magokon 2,5 pmol/l CL 299.263 jelenlétében vagy távollétében (15. ábra). A herbicidnek ez a koncentrációja a vad típusú dohánynövények súlyos elsatnyulását és kifakulását okozza. A Met124His AHAS-génnel transzformált dohánynövények mutatják a rezisztencia legmagasabb szintjét (15. ábra). Az Arg199Glu transzformánsok a rezisztencia közbenső szintjét mutatják, míg a Met124lle kicsiny rezisztenciát mutat (15. ábra).
Minden fentebb idézett szabadalmi leírást, bejelentést, cikket és egyéb publikációt és vizsgálati eljárást teljes terjedelmében a kitanítás részeként kell figyelembe venni.
A fenti részletes leírás fényében a jelen találmánynak több változata is felvetődhet azok számára, akik a szakterületen járatosak. Az ilyen nyilvánvaló változatok az itt következő igénypontok oltalmi körén belül vannak.
Claims (50)
1. Szerkezeti információk alkalmazásán alapuló eljárás imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicidekre rezisztens acetohidroxisav-szintetáz (AHAS) variáns fehérjék előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) egy cél AHAS-fehérjét piruvát-oxidáz templáttal egymás alá rendezünk, ily módon származtatva a cél AHAS-fehérje háromdimenziós szerkezetét;
(b) a háromdimenziós szerkezetbe egy vagy több imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicidet modellezünk, lokalizálva ily módon egy imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicideket megkötő zsebet a cél AHAS-fehérjében;
(c) kiválasztunk egy aminosavpozíció-célpontot egy olyan mutációhoz az említett cél AHAS-fehérjében, amely megváltoztatja legalább egy imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicid affinitását a kötőzsebhez;
(d) mutáljuk a cél AHAS-fehérjét kódoló DNS-t, miáltal olyan mutált DNS-t állítunk elő, amely a mutációt a célpozícióban tartalmazó AHAS-variánst kódol; és (e) kifejezzük a mutált DNS-t egy első sejtben olyan körülmények között, amelyek között a mutációt a célpozícióban tartalmazó AHAS-variáns termelődik.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (f) kifejezünk továbbá egy vad típusú AHAS-t kódoló DNS-t párhuzamosan egy második sejtben;
(g) a vad típusú és a variáns AHAS-fehérjéket a sejtekből tisztítjuk;
(h) megvizsgáljuk a vad típusú és a variáns AHASfehérjéket katalitikus aktivitásra a piruvátnak acetolaktáttá való átalakításában vagy a piruvát és a 2-ketobutirát acetohidroxi-butiráttá történő kondenzálásában, az imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicid nélkül és annak jelenlétében; és (i) a (c)—(h) lépéseket addig ismételjük - a (c) lépésben AHAS-t kódoló DNS-ként az (e) lépésben szerinti variánst kódoló DNS-t használva - amíg olyan imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicidekre rezisztens AHAS-variáns fehérjét nem azonosítunk, amely rendelkezik (i) az imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicid távollétében (a) önmagában is olyan katalitikus aktivitással, amely elegendő egy olyan sejt élet21
HU 226 259 Β1 képességének fenntartására, amelyben kifejeződik; vagy (b) olyan katalitikus aktivitással, amely bármely - szintén az említett sejtben kifejeződő - imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicidekre rezisztens AHASvariáns fehérjével - amely lehet azonos vagy különböző, mint az első AHAS-variáns fehérje - kombinálva elegendő egy olyan sejt életképességének fenntartására, amelyben kifejeződik;
ahol a sejt az életképességhez AHAS-aktivitást igényel; és (ii) olyan katalitikus aktivitással, amely ellenállóbb egy imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbiciddel szemben, mint a vad típusú AHAS-é.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a katalitikus aktivitás imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicid távollétében több, mint 20%-a a vad típusú AHAS imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicid távollétében mérhető katalitikus aktivitásának.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy herbicidként imidazolinon herbicidet alkalmazunk, és a herbicidrezisztens AHAS-variáns fehérje katalitikus aktivitása (i) a herbicid távollétében nagyobb, mint a vad típusú AHAS katalitikus aktivitásának 20%-a;
(ii) ellenállóbb az imidazolinon herbicidek jelenlétére a vad típusú AHAS-hoz hasonlítva; és (iii) érzékenyebb szulfonilurea herbicidek jelenlétére, mint Imidazolinon herbicidek jelenlétére.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy cél AHAS-fehérjeként Arabidopsis thalianából származó AHAS-fehérjét alkalmazunk.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első sejtként E. coli-sejtet alkalmazunk.
7. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első és második sejtként E. co//-sejteket alkalmazunk.
8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy cél AHAS-fehérjeként egy, az 1. azonosító számú (SEQ ID NO: 1) szekvenciával bíró fehérjét vagy más növényi eredetű AHAS-fehérje szekvenciájával bíró AHAS-fehérjét alkalmazunk.
9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mutációként az 1. azonosító számú szekvencia (SEQ ID NO: 1) F135, M53 és R128 aminosavainak legalább egyikét egy olyan eltérő aminosavra cseréljük, amely eltérő aminosav megegyezik egy másik növényi eredetű AHAS-fehérje szekvenciájában az egymás alá rendezéskor az előbbiek bármelyikének megfelelő pozícióba kerülő aminosawal, vagy az ilyen mutációk bármelyikeinek bármilyen kombinációját hajtjuk végre.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a következő helyettesítések bármelyikét hajtjuk végre: Met53Trp, Met53Glu, Met53lle, Met53His, Arg128Ala, Arg128Glu, Phe135Arg, vagy ezek bármelyikeinek bármely kombinációját.
11. Szerkezeti információk alkalmazásán alapuló eljárás imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicidekre rezisztens AHAS-variáns fehérjék előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) egy cél AHAS-fehérjét egymás alá rendezünk egy, az 1. azonosító számú szekvencia (SEQ ID NO: 1) szerinti szekvenciával vagy egy másik növényi eredetű AHAS-fehérje aminosavszekvenciájából származó első AHAS templáttal, ily módon származtatva a cél AHAS-fehérje háromdimenziós szerkezetét;
(b) egy vagy több imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicidet modellezünk a háromdimenziós szerkezetbe, miáltal imidazolinonvagy szulfonilureaalapú herbicidet kötő zsebet lokalizálunk a cél AHAS-fehérjében;
(c) kiválasztunk egy aminosavpozíció-célpontot egy olyan mutációhoz a cél AHAS-fehérjében, amely megváltoztatja legalább egy imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicid affinitását a kötőzsebhez;
(d) mutáljuk a cél AHAS-fehérjét kódoló DNS-t, és így olyan mutált DNS-t állítunk elő, amely a mutációt az említett helynél tartalmazó AHAS-variánst kódolja; és (e) kifejezzük a mutált DNS-t egy első sejtben olyan körülmények között, amelyek között a mutációt az említett helynél tartalmazó említett AHAS-variáns termelődik.
12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (f) kifejezünk továbbá egy vad típusú AHAS-t kódoló DNS-t párhuzamosan egy második sejtben;
(g) tisztítjuk a vad típusú és a variáns AHAS-fehérjéket a sejtekből;
(h) megvizsgáljuk a vad típusú és a variáns AHASfehérjéket katalitikus aktivitásra a piruvátnak acetolaktáttá való átalakításában vagy a piruvát és a 2-ketobutirát acetohidroxi-butiráttá történő kondenzálásában, az említett legalább egy imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicid nélkül vagy annak jelenlétében; és (I) addig ismételjük a (c)-(h) lépéseket - a (c) lépésben AHAS-t kódoló DNS-ként az (e) lépés szerinti variánst kódoló DNS-t használva - amíg az első olyan herbicidrezisztens AHAS-variáns fehérjét nem azonosítjuk, amely rendelkezik (i) az imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicid távollétében (a) önmagában is olyan katalitikus aktivitással, amely elegendő egy olyan sejt életképességének fenntartására, amelyben kifejeződik; vagy (b) olyan katalitikus aktivitással, amely bármely - szintén az említett sejtben kifejeződő - imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicidekre rezisztens AHAS-variáns fehérjével - amely lehet azonos vagy különböző, mint az első
HU 226 259 Β1
AHAS-variáns fehérje - kombinálva elegendő egy olyan sejt életképességének fenntartására, amelyben kifejeződik;
ahol az említett sejt az életképességhez AHAS-aktivitást igényel; és (ii) olyan katalitikus aktivitással, amely ellenállóbb legalább egy imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbiciddel szemben, mint a vad típusú AHAS-é.
13. Szerkezeti információk alkalmazásán alapú eljárás imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicidekre rezisztens AHAS-variáns fehérjék előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) egy cél AHAS-fehérjét egymás alá rendezünk egy azonosított herbicidkötő zsebbel bíró és az 1. azonosító számú (SEQ ID NO: 1) szerinti szekvenciával bíró első AHAS templáttal, ily módon származtatva a cél AHAS-fehérje háromdimenziós szerkezetét;
(b) kiválasztunk egy aminosavpozícló-célpontot egy olyan mutációhoz a cél AHAS-fehérjében, amely megváltoztatja legalább egy imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicid affinitását a kötőzsebhez;
(c) mutáljuk a cél AHAS-fehérjét kódoló DNS-t, miáltal mutált DNS-t állítunk elő, amely a mutációt az említett helyen tartalmazó AHAS-variánst kódolja; és (d) kifejezzük a mutált DNS-t egy első sejtben olyan körülmények között, amelyek között a mutációt az említett helynél tartalmazó említett AHAS-variáns termelődik.
14. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (e) kifejezünk továbbá egy vad típusú AHAS-t kódoló DNS-t párhuzamosan egy második sejtben;
(f) tisztítjuk a vad típusú és a variáns AHAS-fehérjéket a sejtekből;
(g) megvizsgáljuk a vad típusú és a variáns AHASfehérjéket katalitikus aktivitásra a piruvátnak acetolaktáttá való átalakításában vagy a piruvát és a 2-ketobutirát acetohidroxi-butiráttá történő kondenzálásában, az imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicid nélkül vagy annak jelenlétében; és (h) addig ismételjük a (b)-(g) lépéseket - a (b) lépésben AHAS-t kódoló DNS-ként a (d) lépés szerinti variánst kódoló DNS-t használva - amíg az első olyan herbicidrezisztens AHAS-variáns fehérjét nem azonosítjuk, amely rendelkezik (i) az imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicid távollétében (a) önmagában is olyan katalitikus aktivitással, amely elegendő egy olyan sejt életképességének fenntartására, amelyben kifejeződik; vagy (b) olyan katalitikus aktivitással, amely bármely - szintén az említett sejtben kifejeződő - imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicidekre rezisztens AHAS-variáns fehérjével - amely lehet azonos vagy különböző, mint az első AHAS-variáns fehérje - kombinálva elegendő egy olyan sejt életképességének fenntartására, amelyben kifejeződik;
ahol a sejt az életképességhez AHAS-aktivitást igényel; és (ii) katalitikus aktivitással, amely ellenállóbb legalább egy imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbiciddel szemben, mint a vad típusú AHAS-é.
15. A 12. vagy 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan herbicidrezisztens AHAS-variáns fehérjét azonosítunk, melynek katalitikus aktivitása az említett legalább egy imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicid távollétében több, mint 20%-a a vad típusú AHAS katalitikus aktivitásának.
16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy herbicidként imidazolinonalapú herbicidet alkalmazunk és az első herbicidrezisztens AHAS-variáns fehérjeként alkalmazott fehérje katalitikus aktivitása (i) a herbicid távollétében, mint a vad típusú AHAS katalitikus aktivitásának 20%-a;
(ii) viszonylag ellenállóbb az imidazolinonalapú herbicidek jelenlétére a vad típusú AHAS-hoz hasonlítva; és (iii) viszonylag érzékenyebb szulfonilureaalapú herbicidek jelenlétére az imidazolinonalapú herbicidekhez hasonlítva.
17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy cél AHAS-fehérjeként Arabidopsis thalianából származó fehérjét alkalmazunk.
18. A 11. vagy 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első sejtként E. co//-sejtet alkalmazunk.
19. A 12. vagy 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első és második sejtként E. coli sejteket alkalmazunk.
20. A 11. vagy 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mutációként az 1. azonosító számú szekvencia (SEQ ID NO: 1) F135, M53 és R128 aminosavainak legalább egyikét egy olyan eltérő aminosavra cseréljük, amely eltérő aminosav megegyezik egy másik növényi eredetű AHAS-fehérje szekvenciájában az egymás alá rendezéskor az előbbiek bármelyikének megfelelő pozícióba kerülő aminosawal, vagy az ilyen mutációk bármelyikeinek bármilyen kombinációját hajtjuk végre.
21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a következő helyettesítések bármelyikét hajtjuk végre: Met53Trp, Met53Glu, Met53lle, Met53His, Arg128Ala, Arg128Glu, Phe135Arg, vagy ezek bármelyikének kombinációját.
22. Izolált DNS, amely olyan acetohidroxisav-szintetáz (AHAS) variáns fehérjét kódol, amelyben az 1. azonosító számú szekvencia (SEQ ID NO: 1) M53, R128 és F135 aminosavainak legalább egyike más aminosawal van helyettesítve, vagy az ilyen szubsztitúciók bármely kombinációját tartalmazza.
HU 226 259 Β1
23. A 22. igénypont szerinti DNS, amely olyan AHAS-fehérjét kódol, melyben a végrehajtott módosítás megváltoztatta valamely imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicidnek azt a képességét, hogy gátolja a fehérje enzimaktivitását.
24. A 23. igénypont szerinti DNS, amely AHAS-fehérjeként Arabidopsis thalianából származó fehérjét kódol.
25. A 24. igénypont szerinti DNS, amely olyan AHAS-fehérjét kódol, melyben a végrehajtott helyettesítés a következők bármelyike: Met53Trp, Met53Glu, Met53lle, Met53His, Arg128Ala, Arg128Glu, Phe135Arg vagy ezek bármelyikének kombinációja.
26. A 37. igénypont szerinti DNS, amely olyan AHAS-fehérjét kódol, amely rendelkezik:
(a) a legalább egy imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú AHAS-gátló herbicid távollétében (i) önmagában is olyan katalitikus aktivitással, amely elegendő egy olyan sejt életképességének fenntartására, amelyben kifejeződik; vagy (ii) olyan katalitikus aktivitással, amely bármely - szintén az említett sejtben kifejeződő imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicidekre rezisztens AHAS-variáns fehérjével - amely lehet azonos vagy különböző, mint az első AHAS-variáns fehérje - kombinálva elegendő egy olyan sejt életképességének fenntartására, amelyben kifejeződik;
ahol a sejt az életképességhez AHAS-aktivitást igényel; és (b) olyan katalitikus aktivitással, amely ellenállóbb legalább egy imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbiciddel szemben, mint a vad típusú AHAS-é.
27. A 22. igénypont szerinti DNS, azzal jellemezve, hogy az AHAS-variáns a vad típusú AHAS katalitikus aktivitásának több mint 20%-ával rendelkezik.
28. A 39. igénypont szerinti DNS, azzal jellemezve, hogy az AHAS-variáns rezisztensebb imidazolinonalapú herbicidekkel szemben, mint szulfonilureaalapú herblcidekkel szemben.
29. DNS-vektor, amely 22. igénypont szerinti DNSszekvenciát tartalmaz működőképesen összekapcsolva egy transzkripciós szabályozóelemmel.
30. Sejt, amely egy AHAS-t kódoló, 29. igénypont szerinti DNS-vektorból származó DNS-szekvenciát tartalmaz, amely sejt baktérium-, gomba-, növényi, rovarvagy emlőssejt.
31. A 30. igénypont szerinti sejt, amely növényi sejt.
32. Mag, amely 31. igénypont szerinti sejtet tartalmaz.
33. Variáns AHAS-fehérje, amelyet 22. igénypont szerinti DNS által kódol.
34. Variáns AHAS-fehérje, amelyben az 1. azonosító számú szekvencia (SEQ ID NO: 1) M53, R128 és F135 aminosavainak legalább egyike egy eltérő aminosawal van helyettesítve, amely eltérő aminosav megegyezik egy másik növényi eredetű AHAS-fehérje szekvenciájában az egymás alá rendezéskor az előbbiek bármelyikének megfelelő pozícióba kerülő aminosawal, vagy az ilyen szubsztitúciók bármely kombinációját tartalmazza.
35. A 46. igénypont szerinti variáns AHAS-fehérje, amelyben a végrehajtott módosítás megváltoztatta egy imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicidnek azt a képességét, hogy gátolja a fehérje enzimaktivitását.
36. A 35. igénypont szerinti variáns AHAS-fehérje, amely Arabidopsis thalianából származik.
37. A 33. igénypont szerinti variáns AHAS-fehérje, amelyben a végrehajtott helyettesítés: Met53Trp, Met53Glu, Met53lle, Met53His, Arg128Ala, Arg128Glu, Phe135Arg vagy ezek bármelyikének kombinációja.
38. A 33. igénypont szerinti variáns AHAS-fehérje, amely rendelkezik:
(a) a legalább egy AHAS-gátló imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicid távollétében (i) önmagában is olyan katalitikus aktivitással, amely elegendő egy olyan sejt életképességének fenntartására, amelyben ez kifejeződik; vagy (ii) olyan katalitikus aktivitással, amely bármely - szintén az említett sejtben kifejeződő imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicidekre rezisztens AHAS-variáns fehérjével - amely lehet azonos vagy különböző, mint az első AHAS-variáns fehérje - kombinálva elegendő egy olyan sejt életképességének fenntartására, amelyben kifejeződik; ahol a sejt az életképességhez AHAS-aktivitást igényel; és (b) olyan katalitikus aktivitással, amely ellenállóbb legalább egy herbiciddel szemben, mint a vad típusú AHAS-é.
39. A 33. igénypont szerinti variáns AHAS-fehérje, amely a vad típusú AHAS katalitikus aktivitásának több mint 20%-ával rendelkezik.
40. Eljárás herbicidrezisztencia kialakítására egy sejtben, azzal jellemezve, hogy (a) 22. igénypont szerinti DNS-t kompatibilis expressziós vektorba klónozunk; és (b) a DNS-t a sejtbe transzformáljuk a gén megfelelő mértékű expressziójára alkalmas körülmények között, és így a sejtben imidazolinon- vagy szulfonilureaalapú herbicidekkel szemben rezisztenciát alakítunk ki.
41. Sejt, amely a 40. igénypont szerinti eljárással lett előállítva.
42. Növény, amely 41. igénypont szerinti sejtet tartalmaz.
43. A 40. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t alkalmazunk, amelyben a mutált gén eltérő aminosavat kódol az 53., 128. vagy 135. pozíciók legalább egyikében vagy ezek kombinációjában.
44. A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t alkalmazunk, amely Arabidopsis thaliana AHAS-gént tartalmaz.
45. A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényi sejtet transzformálunk.
HU 226 259 Β1
46. A 45. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy magban található sejtet transzformálunk.
47. Eljárás gyomok visszaszorítására termőföldön, azzal jellemezve, hogy a termőföldet - melyen 42. igénypont szerinti imidazolinon- és/vagy szulfonil- 5 ureaalapú herbicidekre rezisztens növényeket termesztünk - az imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbiciddel kezeljük.
48. Eljárás gyomok visszaszorítására termőföldön, azzal jellemezve, hogy a termőföldet - melyen 42. 10 igénypont szerinti imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicidekre rezisztens növényeket termesztünk
- az imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicidet tartalmazó gyomirtó készítménnyel kezeljük.
49. Sejt, amely 22. igénypont szerinti DNS-sel van transzformálva, és amelyben a DNS a sejtben olyan mértékben expresszálódik, hogy imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicidekkel szemben rezisztenciát biztosít a sejtnek.
50. Növény, amely 23. igénypont szerinti DNS-sel van transzformálva, és amelyben a DNS olyan mértékben expresszálódik, hogy imidazolinon- és/vagy szulfonilureaalapú herbicidekkel szemben rezisztenciát biztosít a növénynek.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/426,125 US5853973A (en) | 1995-04-20 | 1995-04-20 | Structure based designed herbicide resistant products |
| US08/455,355 US5928937A (en) | 1995-04-20 | 1995-05-31 | Structure-based designed herbicide resistant products |
| PCT/US1996/005782 WO1996033270A1 (en) | 1995-04-20 | 1996-04-19 | Structure-based designed herbicide resistant products |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP9900852A2 HUP9900852A2 (hu) | 1999-07-28 |
| HUP9900852A3 HUP9900852A3 (en) | 2001-11-28 |
| HU226259B1 true HU226259B1 (en) | 2008-07-28 |
Family
ID=27026922
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9900852A HU226259B1 (en) | 1995-04-20 | 1996-04-19 | Structure-based designed herbicide resistant products |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6576455B1 (hu) |
| EP (1) | EP0821729B1 (hu) |
| JP (2) | JP4469422B2 (hu) |
| AT (1) | ATE342968T1 (hu) |
| AU (1) | AU5575896A (hu) |
| BR (1) | BR9604993B1 (hu) |
| CA (1) | CA2218526C (hu) |
| CZ (1) | CZ331797A3 (hu) |
| DE (1) | DE69636637T2 (hu) |
| DK (1) | DK0821729T3 (hu) |
| ES (1) | ES2275275T3 (hu) |
| HU (1) | HU226259B1 (hu) |
| MX (1) | MX9708079A (hu) |
| NO (1) | NO326115B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ307012A (hu) |
| PL (1) | PL186091B1 (hu) |
| WO (1) | WO1996033270A1 (hu) |
Families Citing this family (565)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0821729B1 (en) * | 1995-04-20 | 2006-10-18 | Basf Aktiengesellschaft | Structure-based designed herbicide resistant products |
| NZ335101A (en) * | 1996-11-07 | 2000-11-24 | Zeneca Ltd | Herbicide resistant plants comprising more that one resistence gene |
| US6348643B1 (en) | 1998-10-29 | 2002-02-19 | American Cyanamid Company | DNA sequences encoding the arabidopsis acetohydroxy-acid synthase small subunit and methods of use |
| US7019196B1 (en) | 1998-11-05 | 2006-03-28 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Herbicide resistant rice |
| US6809232B1 (en) | 1999-11-29 | 2004-10-26 | Midwest Oilseeds, Inc. | Methods and compositions for the introduction of molecules into cells |
| US7314969B2 (en) | 1999-11-29 | 2008-01-01 | Midwest Oilseeds, Inc. | Methods and compositions for the introduction of molecules into cells |
| PT1280928T (pt) | 2000-05-10 | 2017-01-30 | Univ Louisiana State | Resistência a herbicidas inibidores de aceto-hidroxiácido sintase |
| US20030028919A1 (en) * | 2001-01-25 | 2003-02-06 | Karnosky David F. | Transgenic trees having increased resistance to imidazolinone herbicides |
| TWI377253B (en) * | 2001-04-16 | 2012-11-21 | Martek Biosciences Corp | Product and process for transformation of thraustochytriales microorganisms |
| AU2003249939A1 (en) * | 2002-07-09 | 2004-01-23 | Basf Plant Science Gmbh | Use of ahas mutant genes as selection marker in potato transformation |
| SG155063A1 (en) | 2003-04-29 | 2009-09-30 | Pioneer Hi Bred Int | Novel glyphosate-n-acetyltransferase (gat) genes |
| EP1659855B1 (en) * | 2003-08-29 | 2011-11-02 | Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuaria | Rice plants having increased tolerance to imidazolinone herbicides |
| US7393922B2 (en) * | 2003-08-29 | 2008-07-01 | The Ohio State University Research Foundation | Insecticidal Cry4Ba proteins with enhanced toxicity |
| DK1740039T3 (da) | 2004-04-30 | 2012-08-20 | Dow Agrosciences Llc | Hidtil ukendte herbicidresistensgener |
| AU2005279457C1 (en) * | 2004-07-30 | 2012-05-17 | Advanta Seeds, B.V. | Herbicide-resistant sunflower plants, plynucleotides encoding herbicide-resistant acetohydroxy acid synthase large subunit proteins, and methods of use |
| ES2692594T1 (es) * | 2005-03-02 | 2018-12-04 | Instituto Nacional De Tecnologia Agropecuaria | Plantas de arroz resistentes a herbicidas, polinucleótidos que codifican proteínas de la subunidad grande de la acetohidroxiácido sintasa resistentes a herbicidas y métodos para su uso |
| US8017400B2 (en) | 2005-05-09 | 2011-09-13 | Kumiai Chemical Industry Co., Ltd. | Method for transformation using mutant acetolactate synthase gene |
| EA020462B1 (ru) * | 2005-07-01 | 2014-11-28 | Басф Се | Резистентные к гербицидам растения подсолнечника, полинуклеотиды, кодирующие резистентные к гербицидам большие субъединицы белков ацетогидроксикислотной синтазы, и применение растений и полинуклеотидов |
| ES2528914T3 (es) | 2005-10-28 | 2015-02-13 | Dow Agrosciences Llc | Nuevos genes de resistencia a herbicidas |
| US20070118920A1 (en) * | 2005-11-09 | 2007-05-24 | Basf Agrochemical Products B.V. | Herbicide-resistant sunflower plants, polynucleotides encoding herbicide-resistant acetohydroxyacid synthase large subunit proteins, and methods of use |
| AU2007223364B2 (en) | 2006-03-02 | 2014-02-13 | Athenix Corporation | Methods and compositions for improved enzyme activity in transgenic plant |
| US7951995B2 (en) | 2006-06-28 | 2011-05-31 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Soybean event 3560.4.3.5 and compositions and methods for the identification and detection thereof |
| UA108733C2 (uk) | 2006-12-12 | 2015-06-10 | Толерантна до гербіциду рослина соняшника | |
| CL2007003743A1 (es) | 2006-12-22 | 2008-07-11 | Bayer Cropscience Ag | Composicion que comprende fenamidona y un compuesto insecticida; y metodo para controlar de forma curativa o preventiva hongos fitopatogenos de cultivos e insectos. |
| CL2007003744A1 (es) | 2006-12-22 | 2008-07-11 | Bayer Cropscience Ag | Composicion que comprende un derivado 2-piridilmetilbenzamida y un compuesto insecticida; y metodo para controlar de forma curativa o preventiva hongos fitopatogenos de cultivos e insectos. |
| EP1969930A1 (de) | 2007-03-12 | 2008-09-17 | Bayer CropScience AG | Phenoxyphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide |
| EP1969934A1 (de) | 2007-03-12 | 2008-09-17 | Bayer CropScience AG | 4-Cycloalkyl-oder 4-arylsubstituierte Phenoxyphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide |
| EP1969929A1 (de) | 2007-03-12 | 2008-09-17 | Bayer CropScience AG | Substituierte Phenylamidine und deren Verwendung als Fungizide |
| EP1969931A1 (de) * | 2007-03-12 | 2008-09-17 | Bayer CropScience Aktiengesellschaft | Fluoalkylphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide |
| WO2008110279A1 (de) | 2007-03-12 | 2008-09-18 | Bayer Cropscience Ag | Dihalogenphenoxyphenylamidine und deren verwendung als fungizide |
| EP2120558B1 (de) | 2007-03-12 | 2016-02-10 | Bayer Intellectual Property GmbH | 3,4-Disubstituierte Phenoxyphenylamidin-Derivate und deren Verwendung als Fungizide |
| US10017827B2 (en) | 2007-04-04 | 2018-07-10 | Nidera S.A. | Herbicide-resistant sunflower plants with multiple herbicide resistant alleles of AHASL1 and methods of use |
| EP2574233A1 (en) | 2007-04-04 | 2013-04-03 | BASF Plant Science GmbH | AHAS mutants |
| WO2008128639A1 (de) | 2007-04-19 | 2008-10-30 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Thiadiazolyloxyphenylamidine und deren verwendung als fungizide |
| DE102007045920B4 (de) | 2007-09-26 | 2018-07-05 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Synergistische Wirkstoffkombinationen |
| DE102007045957A1 (de) | 2007-09-26 | 2009-04-09 | Bayer Cropscience Ag | Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akarziden Eigenschaften |
| DE102007045953B4 (de) | 2007-09-26 | 2018-07-05 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften |
| DE102007045922A1 (de) | 2007-09-26 | 2009-04-02 | Bayer Cropscience Ag | Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften |
| DE102007045956A1 (de) | 2007-09-26 | 2009-04-09 | Bayer Cropscience Ag | Wirkstoffkombination mit insektiziden und akariziden Eigenschaften |
| DE102007045919B4 (de) | 2007-09-26 | 2018-07-05 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften |
| EP2090168A1 (de) | 2008-02-12 | 2009-08-19 | Bayer CropScience AG | Methode zur Verbesserung des Pflanzenwachstums |
| BRPI0818295B1 (pt) * | 2007-10-05 | 2022-10-11 | Cibus Europe B.V. | Método para produção de planta resistente à herbicida |
| US8097712B2 (en) | 2007-11-07 | 2012-01-17 | Beelogics Inc. | Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof |
| EP2072506A1 (de) | 2007-12-21 | 2009-06-24 | Bayer CropScience AG | Thiazolyloxyphenylamidine oder Thiadiazolyloxyphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide |
| EP2092824A1 (de) | 2008-02-25 | 2009-08-26 | Bayer CropScience AG | Heterocyclyl-Pyrimidine |
| EP2103615A1 (de) | 2008-03-19 | 2009-09-23 | Bayer CropScience AG | 4'4'-Dioxaspiro-spirocyclisch substituierte Tetramate |
| KR20100135952A (ko) | 2008-04-30 | 2010-12-27 | 바이엘 크롭사이언스 아게 | 식물 보호제로서의 티아졸-4-카복실산 에스테르 및 티오에스테르 |
| CA2729426A1 (en) | 2008-06-27 | 2009-12-30 | Bayer Cropscience Ag | Thiadiazolyloxyphenylamidines and use thereof as fungicides |
| US8697941B2 (en) | 2008-07-23 | 2014-04-15 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Molecular markers linked to PPO inhibitor tolerance in soybeans |
| US8748695B2 (en) | 2008-07-23 | 2014-06-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Molecular markers linked to PPO inhibitor tolerance in soybeans |
| EP2168434A1 (de) | 2008-08-02 | 2010-03-31 | Bayer CropScience AG | Verwendung von Azolen zur Steigerung der Resistenz von Pflanzen oder Pflanzenteilen gegenüber abiotischem Stress |
| US9371564B2 (en) | 2008-08-08 | 2016-06-21 | Bayer Bioscience N.V. | Methods for plant fiber characterization and identification |
| WO2010017902A1 (de) | 2008-08-14 | 2010-02-18 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Insektizide 4-phenyl-1h-pyrazole |
| DE102008041695A1 (de) | 2008-08-29 | 2010-03-04 | Bayer Cropscience Ag | Methoden zur Verbesserung des Pflanzenwachstums |
| EP2161259A1 (de) | 2008-09-03 | 2010-03-10 | Bayer CropScience AG | 4-Halogenalkylsubstituierte Diaminopyrimidine als Fungizide |
| BRPI0919380A2 (pt) | 2008-09-26 | 2015-08-18 | Basf Agrochemical Products Bv | Moléculas de ácido nucleico, vetores de expressão, bom como métodos para controlar ervas daninhas e para produzir uma planta brassica |
| CN102216296B (zh) * | 2008-10-01 | 2015-03-18 | 拜耳作物科学公司 | 作为作物保护剂的杂环取代的噻唑类 |
| WO2010037482A2 (de) * | 2008-10-02 | 2010-04-08 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Verwendung von schwefelhaltigen, heteroaromatischen säureanaloga |
| SI2386203T1 (sl) | 2008-10-15 | 2014-03-31 | Bayer Cropscience Ag | Uporaba ditiin tetrakarboksimidov za zatiranje fitopatogenih gljiv |
| EP2184273A1 (de) | 2008-11-05 | 2010-05-12 | Bayer CropScience AG | Halogen-substituierte Verbindungen als Pestizide |
| TW201031327A (en) | 2008-11-14 | 2010-09-01 | Bayer Cropscience Ag | Active compound combinations having insecticidal and acaricidal properties |
| EP2201838A1 (de) | 2008-12-05 | 2010-06-30 | Bayer CropScience AG | Wirkstoff-Nützlings-Kombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften |
| EP2376487B1 (de) | 2008-12-11 | 2016-01-06 | Bayer Intellectual Property GmbH | Thiazolyoximether und -hydrazone als pflanzenschutzmittel |
| WO2010069495A1 (de) * | 2008-12-18 | 2010-06-24 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Atpenine |
| EP2198710A1 (de) | 2008-12-19 | 2010-06-23 | Bayer CropScience AG | Verwendung von 5-Pyridin-4yl-(1,3)Thiazole zur Bekämpfung phytopathogener Pilze |
| EP2198709A1 (de) | 2008-12-19 | 2010-06-23 | Bayer CropScience AG | Verfahren zur Bekämpfung resistenter tierischer Schädlinge |
| CN102333445B (zh) | 2008-12-29 | 2014-09-03 | 拜尔农作物科学股份公司 | 改善利用转基因植物生产潜力的方法 |
| EP2204094A1 (en) | 2008-12-29 | 2010-07-07 | Bayer CropScience AG | Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants Introduction |
| EP2223602A1 (de) | 2009-02-23 | 2010-09-01 | Bayer CropScience AG | Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials genetisch modifizierter Pflanzen |
| EP2039772A2 (en) | 2009-01-06 | 2009-03-25 | Bayer CropScience AG | Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants introduction |
| EP2039770A2 (en) | 2009-01-06 | 2009-03-25 | Bayer CropScience AG | Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants |
| EP2039771A2 (en) | 2009-01-06 | 2009-03-25 | Bayer CropScience AG | Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants |
| WO2010081645A2 (de) | 2009-01-15 | 2010-07-22 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Fungizide wirkstoffkombinationen |
| WO2010081646A2 (de) | 2009-01-15 | 2010-07-22 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Fungizide wirkstoffkombinationen |
| US8487118B2 (en) | 2009-01-19 | 2013-07-16 | Bayer Cropscience Ag | Cyclic diones and their use as insecticides, acaricides and/or fungicides |
| EP2227951A1 (de) | 2009-01-23 | 2010-09-15 | Bayer CropScience AG | Verwendung von Enaminocarbonylverbindungen zur Bekämpfung von durch Insekten übertragenen Viren |
| BRPI1004930B1 (pt) | 2009-01-28 | 2017-10-17 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Compounds, fungicidal composition and method for controlling phytopathogenic fungi of crops. |
| AR075126A1 (es) | 2009-01-29 | 2011-03-09 | Bayer Cropscience Ag | Metodo para el mejor uso del potencial de produccion de plantas transgenicas |
| EP2223917A1 (de) | 2009-02-02 | 2010-09-01 | Bayer CropScience AG | Isothiazolyloxyphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide |
| JP6121649B2 (ja) | 2009-02-03 | 2017-04-26 | バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングＢａｙｅｒ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ ＧｍｂＨ | 殺細菌剤としての硫黄含有複素芳香族酸類似体の使用 |
| EP2218717A1 (en) | 2009-02-17 | 2010-08-18 | Bayer CropScience AG | Fungicidal N-((HET)Arylethyl)thiocarboxamide derivatives |
| WO2010094666A2 (en) | 2009-02-17 | 2010-08-26 | Bayer Cropscience Ag | Fungicidal n-(phenylcycloalkyl)carboxamide, n-(benzylcycloalkyl)carboxamide and thiocarboxamide derivatives |
| TW201031331A (en) | 2009-02-19 | 2010-09-01 | Bayer Cropscience Ag | Pesticide composition comprising a tetrazolyloxime derivative and a fungicide or an insecticide active substance |
| KR101703633B1 (ko) | 2009-03-11 | 2017-02-07 | 바이엘 인텔렉쳐 프로퍼티 게엠베하 | 할로겐알킬메틸렌옥시페닐-치환된 케토에놀 |
| DE102009001469A1 (de) | 2009-03-11 | 2009-09-24 | Bayer Cropscience Ag | Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen |
| DE102010000662A1 (de) | 2009-03-18 | 2010-10-21 | Bayer Cropscience Ag | Aminopropylthiazol-Derivate als Fungizide |
| DE102009001681A1 (de) | 2009-03-20 | 2010-09-23 | Bayer Cropscience Ag | Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen |
| DE102009001730A1 (de) | 2009-03-23 | 2010-09-30 | Bayer Cropscience Ag | Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen |
| DE102009001732A1 (de) | 2009-03-23 | 2010-09-30 | Bayer Cropscience Ag | Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen |
| DE102009001728A1 (de) | 2009-03-23 | 2010-09-30 | Bayer Cropscience Ag | Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen |
| MX2011009830A (es) | 2009-03-25 | 2011-10-06 | Bayer Cropscience Ag | Combinaciones de principios activos con propiedades insecticidas y acaricidas. |
| US8828907B2 (en) | 2009-03-25 | 2014-09-09 | Bayer Cropscience Ag | Active ingredient combinations having insecticidal and acaricidal properties |
| AU2009342807B2 (en) | 2009-03-25 | 2015-04-02 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Synergistic combinations of active ingredients |
| EP2410848A1 (de) | 2009-03-25 | 2012-02-01 | Bayer CropScience AG | Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden eigenschaften |
| WO2010108504A1 (de) | 2009-03-25 | 2010-09-30 | Bayer Cropscience Ag | Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden eigenschaften |
| EP2232995A1 (de) | 2009-03-25 | 2010-09-29 | Bayer CropScience AG | Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen |
| EP2239331A1 (en) | 2009-04-07 | 2010-10-13 | Bayer CropScience AG | Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants |
| WO2010127797A2 (en) | 2009-05-06 | 2010-11-11 | Bayer Cropscience Ag | Cyclopentanedione compounds and their use as insecticides, acaricides and/or fungicides |
| EP2251331A1 (en) | 2009-05-15 | 2010-11-17 | Bayer CropScience AG | Fungicide pyrazole carboxamides derivatives |
| AR076839A1 (es) | 2009-05-15 | 2011-07-13 | Bayer Cropscience Ag | Derivados fungicidas de pirazol carboxamidas |
| WO2010133337A1 (de) | 2009-05-19 | 2010-11-25 | Bayer Cropscience Ag | Herbizide spiroheterocyclische tetronsäurederivate |
| EP2253617A1 (de) | 2009-05-20 | 2010-11-24 | Bayer CropScience AG | Halogen-substituierte Verbindungen als Pestizide |
| EP2255626A1 (de) | 2009-05-27 | 2010-12-01 | Bayer CropScience AG | Verwendung von Succinat Dehydrogenase Inhibitoren zur Steigerung der Resistenz von Pflanzen oder Pflanzenteilen gegenüber abiotischem Stress |
| EP2437595B1 (de) | 2009-06-02 | 2018-10-31 | Bayer CropScience AG | Verwendung von fluopyram zur kontrolle von sclerotinia ssp |
| EP2264012A1 (de) | 2009-06-03 | 2010-12-22 | Bayer CropScience AG | Heteroarylamidine und deren Verwendung als Fungizide |
| EP2264010A1 (de) | 2009-06-03 | 2010-12-22 | Bayer CropScience AG | Hetarylamidine |
| EP2264011A1 (de) | 2009-06-03 | 2010-12-22 | Bayer CropScience AG | Heteroarylamidine und deren Verwendung als Fungizide |
| EP2440663A1 (en) | 2009-06-09 | 2012-04-18 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Early endosperm promoter and methods of use |
| WO2010145789A1 (en) | 2009-06-18 | 2010-12-23 | Bayer Cropscience Ag | Propargyloxybenzamide derivatives |
| EP2272846A1 (de) | 2009-06-23 | 2011-01-12 | Bayer CropScience AG | Thiazolylpiperidin Derivate als Fungizide |
| EP2277868A1 (de) | 2009-06-24 | 2011-01-26 | Bayer CropScience AG | Phenyloxy(thio)phenylamidbenzoxa(thia)zole |
| EP2277870A1 (de) | 2009-06-24 | 2011-01-26 | Bayer CropScience AG | Substituierte Benzoxa(thia)zole |
| EP2277869A1 (de) | 2009-06-24 | 2011-01-26 | Bayer CropScience AG | Cycloalkylamidbenzoxa(thia)zole als Fungizide |
| EP2451784A1 (de) | 2009-07-08 | 2012-05-16 | Bayer CropScience AG | Phenyl(oxy/thio)alkanol-derivate |
| JP5792164B2 (ja) | 2009-07-08 | 2015-10-07 | バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングＢａｙｅｒ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ ＧｍｂＨ | 置換フェニル（オキシ／チオ）アルカノール誘導体 |
| CN104430378A (zh) | 2009-07-16 | 2015-03-25 | 拜尔农作物科学股份公司 | 含苯基三唑的协同活性物质结合物 |
| WO2011006604A1 (de) | 2009-07-17 | 2011-01-20 | Bayer Cropscience Ag | Substituierte aminothiazole und deren verwendung als fungizide |
| WO2011015524A2 (en) | 2009-08-03 | 2011-02-10 | Bayer Cropscience Ag | Fungicide heterocycles derivatives |
| EP2292094A1 (en) | 2009-09-02 | 2011-03-09 | Bayer CropScience AG | Active compound combinations |
| AR077956A1 (es) | 2009-09-14 | 2011-10-05 | Bayer Cropscience Ag | Combinaciones de compuestos activos |
| WO2011032656A1 (de) | 2009-09-18 | 2011-03-24 | Bayer Cropscience Ag | 5-fluor-2-thio-substituierte pyrimidin-derivate |
| EP2308866A1 (de) | 2009-10-09 | 2011-04-13 | Bayer CropScience AG | Phenylpyri(mi)dinylpyrazole und ihre Verwendung als Fungizide |
| US8962584B2 (en) | 2009-10-14 | 2015-02-24 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. | Compositions for controlling Varroa mites in bees |
| EP2488496A1 (en) | 2009-10-16 | 2012-08-22 | Bayer CropScience AG | Aminopropenoates as fungicides |
| WO2011056544A1 (en) | 2009-10-26 | 2011-05-12 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Somatic ovule specific promoter and methods of use |
| WO2011051243A1 (en) | 2009-10-29 | 2011-05-05 | Bayer Cropscience Ag | Active compound combinations |
| CN102712634B (zh) | 2009-10-30 | 2016-04-06 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 杂芳基哌啶和杂芳基哌嗪衍生物 |
| WO2011051198A2 (de) | 2009-10-30 | 2011-05-05 | Bayer Cropscience Ag | Pyridin-derivate als pflanzenschutzmittel |
| PH12012500972A1 (en) | 2009-11-17 | 2013-01-07 | Bayer Cropscience Ag | Active compound combinations |
| EP2343280A1 (en) | 2009-12-10 | 2011-07-13 | Bayer CropScience AG | Fungicide quinoline derivatives |
| WO2011082941A1 (de) | 2009-12-16 | 2011-07-14 | Bayer Cropscience Ag | Benzylsubstituierte thiadiazolyloxyphenylamidiniumsalze als fungizide |
| PE20130187A1 (es) | 2009-12-21 | 2013-02-28 | Bayer Cropscience Ag | Bis(difluorometil) pirazoles como fungicidas |
| JP2013514970A (ja) | 2009-12-21 | 2013-05-02 | バイエル・クロップサイエンス・アーゲー | チエニルピリ（ミ）ジニルアゾール及び植物病原性菌類を防除するためのそれらの使用 |
| CN102906252A (zh) | 2009-12-23 | 2013-01-30 | 拜尔知识产权有限公司 | 对hppd抑制剂型除草剂耐受的植物 |
| AR079883A1 (es) | 2009-12-23 | 2012-02-29 | Bayer Cropscience Ag | Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de las hppd |
| WO2011076892A1 (en) | 2009-12-23 | 2011-06-30 | Bayer Cropscience Ag | Plants tolerant to hppd inhibitor herbicides |
| WO2011076885A1 (en) | 2009-12-23 | 2011-06-30 | Bayer Cropscience Ag | Plants tolerant to hppd inhibitor herbicides |
| ES2668198T3 (es) | 2009-12-23 | 2018-05-17 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de HPPD |
| WO2011080255A2 (en) | 2009-12-28 | 2011-07-07 | Bayer Cropscience Ag | Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives |
| TWI483679B (zh) | 2009-12-28 | 2015-05-11 | Bayer Ip Gmbh | 殺真菌劑肟醯基（ｈｙｄｒｏｘｉｍｏｙｌ）－雜環衍生物 |
| CN102724879B (zh) | 2009-12-28 | 2015-10-21 | 拜尔农科股份公司 | 杀真菌剂肟基-四唑衍生物 |
| BR112012018108A2 (pt) | 2010-01-22 | 2015-10-20 | Bayer Ip Gmbh | combinações acaricidas e/ou inseticidas de ingredientes ativos |
| WO2011094205A1 (en) | 2010-01-26 | 2011-08-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Hppd-inhibitor herbicide tolerance |
| ES2700996T3 (es) | 2010-02-10 | 2019-02-20 | Bayer Cropscience Ag | Cetoenoles cíclicos sustituidos con bifenilo |
| WO2011098443A1 (de) | 2010-02-10 | 2011-08-18 | Bayer Cropscience Ag | Spiroheterocyclisch-substituierte tetramsäure-derivate |
| UA108638C2 (uk) | 2010-03-04 | 2015-05-25 | Застосування солей імідів малеїнової кислоти для боротьби з фітопатогенними грибами | |
| JP2013521255A (ja) | 2010-03-04 | 2013-06-10 | バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | フルオロアルキル置換２−アミドベンズイミダゾールおよび植物中のストレス耐性を強化するためのその使用 |
| ES2641642T3 (es) | 2010-03-08 | 2017-11-10 | Monsanto Technology Llc | Moléculas de polinucleótido para regulación génica en plantas |
| BR112012023551A2 (pt) | 2010-03-18 | 2015-09-15 | Bayer Ip Gmbh | aril e hetaril sulfonamidas como agentes ativos contra estresse abiótico em plantas |
| WO2011117184A1 (de) | 2010-03-24 | 2011-09-29 | Bayer Cropscience Ag | Fludioxonil-derivate |
| WO2011124554A2 (de) | 2010-04-06 | 2011-10-13 | Bayer Cropscience Ag | Verwendung der 4-phenylbuttersäure und/oder ihrer salze zur steigerung der stresstoleranz in pflanzen |
| AR081810A1 (es) | 2010-04-07 | 2012-10-24 | Bayer Cropscience Ag | Piridinilpirazoles biciclicos |
| CA2795838A1 (en) | 2010-04-09 | 2011-10-13 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Use of derivatives of the(1-cyanocyclopropyl)phenylphosphinic acid, the esters thereof and/or the salts thereof for enhancing the tolerance of plants to abiotic stress |
| PT2706058E (pt) | 2010-04-14 | 2015-11-25 | Bayer Ip Gmbh | Derivados de ditiina como fungicidas |
| EP2557930A2 (en) | 2010-04-14 | 2013-02-20 | Bayer CropScience AG | Fungicidal combinations of dithiino-tetracarboxamide derivatives and inorganic salts |
| WO2011128294A1 (de) | 2010-04-14 | 2011-10-20 | Bayer Cropscience Ag | Dithiinopyridazindion-derivate |
| AU2011240063B2 (en) | 2010-04-14 | 2015-01-15 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Active compound combinations |
| EP2377867A1 (de) | 2010-04-14 | 2011-10-19 | Bayer CropScience AG | Dithiinopyridazinon-Derivate |
| CA2796156A1 (en) | 2010-04-14 | 2011-10-20 | Bayer Cropscience Ag | Thienodithiin derivatives as fungicides |
| WO2011134912A1 (en) | 2010-04-28 | 2011-11-03 | Bayer Cropscience Ag | Fungicide hydroximoyl-heterocycles derivatives |
| US20130116287A1 (en) | 2010-04-28 | 2013-05-09 | Christian Beier | Fungicide hydroximoyl-heterocycles derivatives |
| BR112012027762B1 (pt) | 2010-04-28 | 2018-06-05 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Derivados de cetoheteroarilpiperidina e - piperazina como fungicidas |
| WO2011134911A2 (en) | 2010-04-28 | 2011-11-03 | Bayer Cropscience Ag | Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives |
| US8815775B2 (en) | 2010-05-18 | 2014-08-26 | Bayer Cropscience Ag | Bis(difluoromethyl)pyrazoles as fungicides |
| CN103025723A (zh) | 2010-05-27 | 2013-04-03 | 拜尔农作物科学股份公司 | 作为杀真菌剂的吡啶基羧酸衍生物 |
| CA2800712A1 (en) | 2010-05-27 | 2011-12-01 | Carl Friedrich Nising | Heterocyclic alkanol derivatives as fungicides |
| EA021116B1 (ru) | 2010-05-27 | 2015-04-30 | Байер Интеллектуэль Проперти Гмбх | Гетероциклические производные алканолов в качестве фунгицидов |
| PL2576529T3 (pl) | 2010-05-27 | 2017-10-31 | Bayer Ip Gmbh | Heterocykliczne pochodne alkanolu jako fungicydy |
| KR20130082100A (ko) | 2010-05-27 | 2013-07-18 | 바이엘 인텔렉쳐 프로퍼티 게엠베하 | 살진균제로서의 헤테로사이클릭 알칸올 유도체 |
| WO2011147813A1 (de) | 2010-05-27 | 2011-12-01 | Bayer Cropscience Ag | Heterocyclische thiosubstituierte alkanolderivate als fungizide |
| PL2576516T3 (pl) | 2010-06-03 | 2015-06-30 | Bayer Ip Gmbh | N-[(het)aryloetylo)]pirazolo(tio)karboksyamidy i ich analogi heteropodstawione |
| UA110703C2 (uk) | 2010-06-03 | 2016-02-10 | Байєр Кропсайнс Аг | Фунгіцидні похідні n-[(тризаміщений силіл)метил]-карбоксаміду |
| JP5730993B2 (ja) | 2010-06-03 | 2015-06-10 | バイエル・クロップサイエンス・アーゲーＢａｙｅｒ Ｃｒｏｐｓｃｉｅｎｃｅ Ａｇ | Ｎ−［（ヘタ）アリールアルキル）］ピラゾール（チオ）カルボキサミド類及びそれらのヘテロ置換された類似体 |
| US9593317B2 (en) | 2010-06-09 | 2017-03-14 | Bayer Cropscience Nv | Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering |
| CN109504700A (zh) | 2010-06-09 | 2019-03-22 | 拜尔作物科学公司 | 植物基因组改造中常用的在核苷酸序列上修饰植物基因组的方法和工具 |
| WO2011161035A1 (de) | 2010-06-22 | 2011-12-29 | Bayer Cropscience Ag | 3-aryl-4-(2-thienylmethylen)-isoxazol-5(4h)-one als fungizide |
| WO2011161034A1 (de) | 2010-06-22 | 2011-12-29 | Bayer Cropscience Ag | 3-aryl-4-(2,6-dimethylbenzyliden)-isoxazol-5(4h)-one als fungizide |
| AR083431A1 (es) | 2010-06-28 | 2013-02-27 | Bayer Cropscience Ag | Compuestos heterociclicos como pesticidas |
| ES2638519T3 (es) | 2010-07-20 | 2017-10-23 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Benzocicloalquenos como agentes antifúngicos |
| EP3058823A1 (en) | 2010-08-05 | 2016-08-24 | Bayer Intellectual Property GmbH | Active compound combinations comprising prothioconazole and fluxapyroxad for controlling oil seed rape diseases |
| US20120122928A1 (en) | 2010-08-11 | 2012-05-17 | Bayer Cropscience Ag | Heteroarylpiperidine and -Piperazine Derivatives as Fungicides |
| CN103237894A (zh) | 2010-08-13 | 2013-08-07 | 先锋国际良种公司 | 包含具有羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)活性的序列的组合物和方法 |
| US8759527B2 (en) | 2010-08-25 | 2014-06-24 | Bayer Cropscience Ag | Heteroarylpiperidine and -piperazine derivatives as fungicides |
| EP2423210A1 (de) | 2010-08-25 | 2012-02-29 | Bayer CropScience AG | Heteroarylpiperidin- und -piperazinderivate als Fungizide |
| AU2011295083A1 (en) | 2010-08-26 | 2013-03-21 | Bayer Intellectual Property Gmbh | 5-iodo-triazole derivatives |
| AU2011298423B2 (en) | 2010-09-03 | 2015-11-05 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Substituted fused pyrimidinones and dihydropyrimidinones |
| WO2012038476A1 (en) | 2010-09-22 | 2012-03-29 | Bayer Cropscience Ag | Use of active ingredients for controlling nematodes in nematode-resistant crops |
| EP2460406A1 (en) | 2010-12-01 | 2012-06-06 | Bayer CropScience AG | Use of fluopyram for controlling nematodes in nematode resistant crops |
| PE20131399A1 (es) | 2010-10-07 | 2013-12-16 | Bayer Cropscience Ag | Composicion fungicida que comprende un derivado de tetrazoliloxima y un derivado de tiazolilpiperidina |
| WO2012045726A2 (en) | 2010-10-07 | 2012-04-12 | Bayer Cropscience Ag | 5-heteroarylimino-1,2,3-dithiazoles |
| PL2627168T3 (pl) * | 2010-10-15 | 2021-11-02 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Mutanty Beta vulgaris tolerujące herbicydy będące inhibitorami ALS |
| MX2013004286A (es) | 2010-10-21 | 2013-06-05 | Bayer Ip Gmbh | 1(heterociclico carbonil) piperidinas. |
| CA2815105A1 (en) | 2010-10-21 | 2012-04-26 | Bayer Intellectual Property Gmbh | N-benzyl heterocyclic carboxamides |
| CN107033139B (zh) | 2010-10-27 | 2019-11-19 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 作为杀真菌剂的杂芳基哌啶和杂芳基哌嗪衍生物 |
| CN103298802B (zh) | 2010-11-02 | 2016-06-08 | 拜耳知识产权有限责任公司 | N-杂芳基甲基吡唑基羧酰胺 |
| EP2669373B1 (en) | 2010-11-10 | 2016-06-01 | Bayer CropScience AG | HPPD variants and methods of use |
| EP2640706B1 (en) | 2010-11-15 | 2017-03-01 | Bayer Intellectual Property GmbH | N-aryl pyrazole(thio)carboxamides |
| CN103369962A (zh) | 2010-11-15 | 2013-10-23 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 5-卤代吡唑(硫代)甲酰胺 |
| AR083876A1 (es) | 2010-11-15 | 2013-03-27 | Bayer Cropscience Ag | 5-halogenopirazolcarboxamidas |
| CA2818918A1 (en) | 2010-11-24 | 2012-05-31 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Brassica gat event dp-061061-7 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof |
| CA2810180C (en) | 2010-11-24 | 2015-07-28 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Brassica gat event dp-073496-4 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof |
| EP3372081A3 (en) | 2010-12-01 | 2018-10-24 | Bayer CropScience Aktiengesellschaft | Use of fluopyram for controlling nematodes in crops |
| EP2460407A1 (de) | 2010-12-01 | 2012-06-06 | Bayer CropScience AG | Wirkstoffkombinationen umfassend Pyridylethylbenzamide und weitere Wirkstoffe |
| TWI667347B (zh) | 2010-12-15 | 2019-08-01 | 瑞士商先正達合夥公司 | 大豆品種ｓｙｈｔ０ｈ２及偵測其之組合物及方法 |
| US20130289077A1 (en) | 2010-12-29 | 2013-10-31 | Juergen Benting | Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives |
| EP2474542A1 (en) | 2010-12-29 | 2012-07-11 | Bayer CropScience AG | Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives |
| EP2471363A1 (de) | 2010-12-30 | 2012-07-04 | Bayer CropScience AG | Verwendung von Aryl-, Heteroaryl- und Benzylsulfonamidocarbonsäuren, -carbonsäureestern, -carbonsäureamiden und -carbonitrilen oder deren Salze zur Steigerung der Stresstoleranz in Pflanzen |
| CN104987330B (zh) | 2011-02-01 | 2019-04-05 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 作为杀真菌剂的杂芳基哌啶和杂芳基哌嗪衍生物 |
| WO2012110519A1 (de) | 2011-02-17 | 2012-08-23 | Bayer Cropscience Ag | Substituierte 3-(biphenyl-3-yl)-8,8-difluor-4-hydroxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-one zur therapie und halogensubstituierte spirocyclische ketoenole |
| EP2494867A1 (de) | 2011-03-01 | 2012-09-05 | Bayer CropScience AG | Halogen-substituierte Verbindungen in Kombination mit Fungiziden |
| CN103415504B (zh) | 2011-03-01 | 2016-04-20 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 2-酰氧基吡咯啉-4-酮类化合物 |
| EP2683239A1 (en) | 2011-03-10 | 2014-01-15 | Bayer Intellectual Property GmbH | Use of lipochito-oligosaccharide compounds for safeguarding seed safety of treated seeds |
| EP2499911A1 (en) | 2011-03-11 | 2012-09-19 | Bayer Cropscience AG | Active compound combinations comprising fenhexamid |
| BR112013023502A2 (pt) | 2011-03-14 | 2016-08-02 | Bayer Ip Gmbh | composto fórmula (i), composição fungicida, método para o controle de fungos fitopatogênicos de culturas, utilização dos compostos de fórmula (i) e processo para a produção das composições |
| AU2012230503B2 (en) | 2011-03-18 | 2016-07-07 | Bayer Intellectual Property Gmbh | N-(3-carbamoylphenyl)-1H-pyrazole-5-carboxamide derivatives and the use thereof for controlling animal pests |
| WO2012126938A2 (en) | 2011-03-23 | 2012-09-27 | Bayer Cropscience Ag | Active compound combinations |
| UA111193C2 (uk) | 2011-03-25 | 2016-04-11 | Баєр Інтеллекчуел Проперті Гмбх | Застосування n-(тетразол-4-іл)- або n-(триазол-3-іл)арилкарбоксамідів або їх солей для контролю небажаних рослин на площах трансгенних культур, що толерантні до гербіцидів, що є інгібіторами hppd |
| CA2830790A1 (en) | 2011-03-25 | 2012-10-04 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Active compound combinations |
| MX2013010821A (es) | 2011-03-25 | 2013-10-17 | Bayer Ip Gmbh | Uso de n-(1,2,5-oxadiazol-3-il)benzamidas para combatir plantas no deseadas en areas en plantas de cultivo transgenicas tolerantes a los herbicidas inhibidores de la hppd. |
| EP2694494A1 (en) | 2011-04-08 | 2014-02-12 | Bayer Intellectual Property GmbH | Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives |
| AR085587A1 (es) | 2011-04-13 | 2013-10-09 | Bayer Cropscience Ag | Combinaciones de compuestos activos |
| AR085588A1 (es) | 2011-04-13 | 2013-10-09 | Bayer Cropscience Ag | Combinaciones de compuestos activos |
| AR085568A1 (es) | 2011-04-15 | 2013-10-09 | Bayer Cropscience Ag | 5-(biciclo[4.1.0]hept-3-en-2-il)-penta-2,4-dienos y 5-(biciclo[4.1.0]hept-3-en-2-il)-pent-2-en-4-inos sustituidos como principios activos contra el estres abiotico de las plantas |
| AR085585A1 (es) | 2011-04-15 | 2013-10-09 | Bayer Cropscience Ag | Vinil- y alquinilciclohexanoles sustituidos como principios activos contra estres abiotico de plantas |
| AR090010A1 (es) | 2011-04-15 | 2014-10-15 | Bayer Cropscience Ag | 5-(ciclohex-2-en-1-il)-penta-2,4-dienos y 5-(ciclohex-2-en-1-il)-pent-2-en-4-inos sustituidos como principios activos contra el estres abiotico de las plantas, usos y metodos de tratamiento |
| EP2510787A1 (en) | 2011-04-15 | 2012-10-17 | Bayer Cropscience AG | Propenoates as fungicides |
| EP2511255A1 (de) | 2011-04-15 | 2012-10-17 | Bayer CropScience AG | Substituierte Prop-2-in-1-ol- und Prop-2-en-1-ol-Derivate |
| JP5870186B2 (ja) | 2011-04-22 | 2016-02-24 | バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングＢａｙｅｒ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ ＧｍｂＨ | （チオ）カルボキサミド誘導体と殺菌活性化合物を含んでいる活性化合物組合せ |
| UA113408C2 (xx) | 2011-05-17 | 2017-01-25 | Комбінації активних сполук, що містить протіоконазол та іпродіон | |
| EP2524598A1 (en) | 2011-05-17 | 2012-11-21 | Bayer CropScience AG | Active compound combinations comprising dithianon |
| EP2524599A1 (en) | 2011-05-17 | 2012-11-21 | Bayer CropScience AG | Active compound combinations |
| EP2524600A1 (en) | 2011-05-17 | 2012-11-21 | Bayer CropScience AG | Active compound combinations comprising phosphorous acid or a derivative thereof and Tebuconazole or Myclobutanil |
| EP2524601A1 (en) | 2011-05-17 | 2012-11-21 | Bayer CropScience AG | Active compound combinations comprising a phosphorous acid derivative and cyazofamid |
| EP2718443B1 (en) | 2011-06-06 | 2017-11-29 | Bayer CropScience NV | Methods and means to modify a plant genome at a preselected site |
| EP2532233A1 (en) | 2011-06-07 | 2012-12-12 | Bayer CropScience AG | Active compound combinations |
| US9241493B2 (en) | 2011-06-14 | 2016-01-26 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Use of an enaminocarbonyl compound in combination with a biological control agent |
| AR086992A1 (es) | 2011-06-20 | 2014-02-05 | Bayer Ip Gmbh | Tienilpiri(mi)dinilpirazoles |
| EP2540165A1 (en) | 2011-06-30 | 2013-01-02 | Bayer CropScience AG | Use of a halogenated pesticide in combination with a biological pest control agent |
| US9173395B2 (en) | 2011-07-04 | 2015-11-03 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Use of substituted isoquinolinones, isoquinolindiones, isoquinolintriones and dihydroisoquinolinones or in each case salts thereof as active agents against abiotic stress in plants |
| IN2014DN00156A (hu) | 2011-08-10 | 2015-05-22 | Bayer Ip Gmbh | |
| AU2012293611B2 (en) | 2011-08-11 | 2017-02-09 | Bayer Cropscience Ag | 1,2,4-triazolyl-substituted keto-enols |
| MX2014001689A (es) | 2011-08-12 | 2014-05-27 | Bayer Cropscience Nv | Expresion especifica de celula guardiana de transgenes en algodon. |
| US20140206726A1 (en) | 2011-08-22 | 2014-07-24 | Juergen Benting | Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives |
| AU2012299691B2 (en) | 2011-08-22 | 2015-01-29 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Methods and means to modify a plant genome |
| EP2561759A1 (en) | 2011-08-26 | 2013-02-27 | Bayer Cropscience AG | Fluoroalkyl-substituted 2-amidobenzimidazoles and their effect on plant growth |
| CN103781353B (zh) | 2011-09-09 | 2016-10-19 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 用于改良植物产量的酰基高丝氨酸内酯衍生物 |
| MX347562B (es) | 2011-09-12 | 2017-05-03 | Bayer Ip Gmbh | Derivados fungicidas de 3-fenil[(heterociclilmetoxi)imino]metil}-1 ,2,4-oxadiazol-5(4h)-ona sustituidos en 4. |
| US9840715B1 (en) | 2011-09-13 | 2017-12-12 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for delaying senescence and improving disease tolerance and yield in plants |
| WO2013040005A1 (en) | 2011-09-13 | 2013-03-21 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
| BR112014005975A8 (pt) | 2011-09-13 | 2017-09-12 | Monsanto Technology Llc | Método de controle de planta, método de redução de expressão de um gene pds em uma planta, cassete de expressão microbiana, método de fazer um polinucleotídeo, método de identificação de polinucleotídeos, e composições para controle de erva daninha |
| UA115535C2 (uk) | 2011-09-13 | 2017-11-27 | Монсанто Текнолоджи Ллс | Спосіб та композиція для боротьби з бур'янами (варіанти) |
| BR112014005958A2 (pt) | 2011-09-13 | 2020-10-13 | Monsanto Technology Llc | métodos e composições químicas agrícolas para controle de planta, método de redução de expressão de um gene accase em uma planta, cassete de expressão microbiana, método para fazer um polinucleotídeo, método de identificação de polinucleotídeos úteis na modulação de expressão do gene accase e composição herbicida |
| BR112014005795A2 (pt) | 2011-09-13 | 2020-12-08 | Monsanto Technology Llc | métodos de controle de plantas, de redução da expressão de um gene de hppd de uma planta, de preparação de um nucleotídeo, e de identificação de polinucleotídeos úteis na modulação da expressão do gene de hppd no tratamento externo de uma planta, composições e cassete de expressão microbiana |
| EP2755987B1 (en) | 2011-09-13 | 2018-06-06 | Monsanto Technology LLC | Methods and compositions for weed control |
| UY34328A (es) | 2011-09-13 | 2013-04-30 | Monsanto Technology Llc | ?composiciones y métodos para controlar malezas comprendiendo un polinucleótido y agente de transferencia, y que modulan protoporfirinógeno ix oxidasa?. |
| US10806146B2 (en) | 2011-09-13 | 2020-10-20 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
| US10760086B2 (en) | 2011-09-13 | 2020-09-01 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
| US10829828B2 (en) | 2011-09-13 | 2020-11-10 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
| MX350775B (es) | 2011-09-13 | 2017-09-15 | Monsanto Technology Llc | Métodos y composiciones para el control de malezas. |
| US9920326B1 (en) | 2011-09-14 | 2018-03-20 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for increasing invertase activity in plants |
| EP2755471A1 (en) | 2011-09-16 | 2014-07-23 | Bayer Intellectual Property GmbH | Use of phenylpyrazolin-3-carboxylates for improving plant yield |
| JP6100264B2 (ja) | 2011-09-16 | 2017-03-22 | バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングＢａｙｅｒ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ ＧｍｂＨ | 植物の収量を向上させるための５−フェニル−２−イソオキサゾリン−３−カルボキシレート又は５−ベンジル−２−イソオキサゾリン−３−カルボキシレートの使用 |
| PH12014500562A1 (en) | 2011-09-16 | 2014-04-14 | Bayer Ip Gmbh | Use of acylsulfonamides for improving plant yield |
| EP2757886A1 (de) | 2011-09-23 | 2014-07-30 | Bayer Intellectual Property GmbH | Verwendung 4-substituierter 1-phenyl-pyrazol-3-carbonsäurederivate als wirkstoffe gegen abiotischen pflanzenstress |
| JP6255344B2 (ja) | 2011-10-04 | 2017-12-27 | バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングＢａｙｅｒ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ ＧｍｂＨ | サッカロピンデヒドロゲナーゼ遺伝子を阻害することによって真菌類及び卵菌類を防除するためのＲＮＡｉ |
| KR20140080522A (ko) | 2011-10-06 | 2014-06-30 | 바이엘 인텔렉쳐 프로퍼티 게엠베하 | 살진균제로서의 헤테로시클릴피리(미)디닐피라졸 |
| ES2632584T3 (es) | 2011-10-06 | 2017-09-14 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Heterociclilpiri(mi)dinilpirazol |
| WO2013050324A1 (de) | 2011-10-06 | 2013-04-11 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Abiotischen pflanzenstress-reduzierende kombination enthaltend 4- phenylbuttersäure (4-pba) oder eines ihrer salze (komponente (a)) und eine oder mehrere ausgewählte weitere agronomisch wirksame verbindungen (komponente(n) (b) |
| CN103958531B (zh) | 2011-11-21 | 2016-12-28 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 杀真菌剂n‑[(三取代的甲硅烷基)甲基]‑羧酰胺衍生物 |
| CN105906567B (zh) | 2011-11-30 | 2019-01-22 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 杀真菌的n-二环烷基和n-三环烷基(硫代)羧酰胺衍生物 |
| CN104270946B (zh) | 2011-12-19 | 2017-05-10 | 拜耳农作物科学股份公司 | 邻氨基苯甲酸二酰胺衍生物用于防治转基因作物中的害虫的用途 |
| EP2606732A1 (en) | 2011-12-19 | 2013-06-26 | Bayer CropScience AG | Use of an anthranilic diamide derivatives with heteroaromatic and heterocyclic substituents in combination with a biological control agent |
| ES2649403T3 (es) | 2011-12-20 | 2018-01-11 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Nuevas amidas aromáticas insecticidas |
| WO2013096818A1 (en) | 2011-12-21 | 2013-06-27 | The Curators Of The University Of Missouri | Soybean variety s05-11268 |
| WO2013096810A1 (en) | 2011-12-21 | 2013-06-27 | The Curators Of The University Of Missouri | Soybean variety s05-11482 |
| KR102015968B1 (ko) | 2011-12-27 | 2019-08-29 | 바이엘 인텔렉쳐 프로퍼티 게엠베하 | 살진균제로서의 헤테로아릴피페리딘 및 피페라진 유도체 |
| WO2013098146A1 (en) | 2011-12-29 | 2013-07-04 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Fungicidal 3-[(1,3-thiazol-4-ylmethoxyimino)(phenyl)methyl]-2-substituted-1,2,4-oxadiazol-5(2h)-one derivatives |
| JP6002242B2 (ja) | 2011-12-29 | 2016-10-05 | バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングＢａｙｅｒ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ ＧｍｂＨ | 殺菌性３−［（ピリジン−２−イルメトキシイミノ）（フェニル）メチル］−２−置換−１，２，４−オキサジアゾール−５（２ｈ）−オン誘導体 |
| EP2800816A1 (en) | 2012-01-06 | 2014-11-12 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Ovule specific promoter and methods of use |
| WO2013103365A1 (en) | 2012-01-06 | 2013-07-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Pollen preferred promoters and methods of use |
| RU2615834C2 (ru) | 2012-01-25 | 2017-04-11 | Байер Интеллектуэль Проперти Гмбх | Комбинация активных соединений, а также содержащая комбинацию композиция и их применение, семя, обработанное комбинацией или композицией, и способ борьбы для защиты сельскохозяйственных культур |
| EP2806739A1 (en) | 2012-01-25 | 2014-12-03 | Bayer Intellectual Property GmbH | Active compound combinations containing fluopyram and biological control agent |
| EP2622961A1 (en) | 2012-02-02 | 2013-08-07 | Bayer CropScience AG | Acive compound combinations |
| NZ722692A (en) | 2012-02-22 | 2018-02-23 | Bayer Ip Gmbh | Use of succinate dehydrogenase inhibitors (sdhis) for controlling wood diseases in grape |
| BR122019010638B1 (pt) | 2012-02-27 | 2020-12-29 | Bayer Intellectual Property Gmbh | combinação, método para controle de fungos fitopatogênicos prejudiciais e uso da referida combinação |
| WO2013139949A1 (en) | 2012-03-23 | 2013-09-26 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Compositions comprising a strigolactame compound for enhanced plant growth and yield |
| CN104245687B (zh) | 2012-04-12 | 2016-12-14 | 拜尔农科股份公司 | 作为杀真菌剂的n-酰基-2-(环)烷基吡咯烷和哌啶 |
| BR112014025976B1 (pt) | 2012-04-20 | 2019-10-29 | Bayer Cropscience Ag | composto, processo para preparar um composto, composição fungicida, método para controlar fungos, uso de compostos e processo para produzir composições para controlar fungos |
| EP2838363A1 (en) | 2012-04-20 | 2015-02-25 | Bayer Cropscience AG | N-cycloalkyl-n-[(trisubstitutedsilylphenyl)methylene]-(thio)carboxamide derivatives |
| WO2013160230A1 (en) | 2012-04-23 | 2013-10-31 | Bayer Cropscience Nv | Targeted genome engineering in plants |
| EP2662360A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | 5-Halogenopyrazole indanyl carboxamides |
| EP2847171A1 (en) | 2012-05-09 | 2015-03-18 | Bayer CropScience AG | 5-halogenopyrazole indanyl carboxamides |
| EP2662362A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | Pyrazole indanyl carboxamides |
| CN104768934B (zh) | 2012-05-09 | 2017-11-28 | 拜耳农作物科学股份公司 | 吡唑茚满基甲酰胺 |
| EP2662363A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | 5-Halogenopyrazole biphenylcarboxamides |
| EP2662361A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | Pyrazol indanyl carboxamides |
| EP2662364A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | Pyrazole tetrahydronaphthyl carboxamides |
| EP2662370A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | 5-Halogenopyrazole benzofuranyl carboxamides |
| AR091104A1 (es) | 2012-05-22 | 2015-01-14 | Bayer Cropscience Ag | Combinaciones de compuestos activos que comprenden un derivado lipo-quitooligosacarido y un compuesto nematicida, insecticida o fungicida |
| EP2855680B8 (en) | 2012-05-24 | 2020-04-15 | Monsanto Technology LLC | Compositions and methods for silencing gene expression |
| TR201816247T4 (tr) | 2012-05-30 | 2018-11-21 | Bayer Cropscience Ag | Metalaksil ve metalaksil-m'den seçilen bir fungisit ve bir biyolojik kontrol ajanı içeren bileşim. |
| CN104837350B (zh) | 2012-05-30 | 2018-08-03 | 拜尔农作物科学股份公司 | 包含生物防治剂和杀真菌剂的组合物作为杀真菌剂的用途 |
| IN2014DN08912A (hu) | 2012-05-30 | 2015-05-22 | Bayer Cropscience Ag | |
| CN104507317B (zh) | 2012-05-30 | 2019-11-15 | 拜尔农作物科学股份公司 | 包含生物防治剂和杀真菌剂的组合物、及其用途、试剂盒 |
| EP3205210A1 (en) | 2012-05-30 | 2017-08-16 | Bayer CropScience Aktiengesellschaft | Composition comprising a biological control agent and a fungicide selected from inhibitors of the succinate dehydrogenase |
| US9585399B2 (en) | 2012-05-30 | 2017-03-07 | Bayer Cropscience Ag | Compositions comprising a biological control agent and an insecticide |
| NZ702162A (en) | 2012-05-30 | 2016-11-25 | Bayer Cropscience Ag | Compositions comprising a biological control agent and an insecticide |
| PT2854547T (pt) | 2012-05-30 | 2018-11-16 | Bayer Cropscience Ag | Composição que compreende um agente de controlo biológico e trifloxistrobina |
| EP2871958A1 (en) | 2012-07-11 | 2015-05-20 | Bayer CropScience AG | Use of fungicidal combinations for increasing the tolerance of a plant towards abiotic stress |
| CN104602520A (zh) | 2012-07-31 | 2015-05-06 | 拜尔农作物科学股份公司 | 包括杀虫萜烯混合物和杀虫剂的组合物 |
| JP2015532650A (ja) | 2012-09-05 | 2015-11-12 | バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト | 非生物的植物ストレスに対する活性物質としての置換された２−アミドベンズイミダゾール類、２−アミドベンゾオキサゾール類および２−アミドベンゾチアゾール類またはそれらの塩の使用 |
| CA2884895C (en) | 2012-09-14 | 2024-05-14 | Bayer Cropscience Lp | Hppd variants and methods of use |
| CA2887571A1 (en) | 2012-10-11 | 2014-04-17 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Guard cell promoters and uses thereof |
| AR093058A1 (es) | 2012-10-18 | 2015-05-13 | Monsanto Technology Llc | Metodos y composiciones para el control de pestes en plantas |
| DE102012219029A1 (de) | 2012-10-18 | 2014-04-24 | Bayer Cropscience Ag | Verwendung von Dithiin-tetracarboximiden zum Bekämpfen von neuer Blattfallkrankheit Marssonia coronaria |
| MX2015004773A (es) | 2012-10-19 | 2015-08-14 | Bayer Cropscience Ag | Metodo de promocion de crecimiento de planta usando derivados de carboxamida. |
| JP6184502B2 (ja) | 2012-10-19 | 2017-08-23 | バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト | カルボキサミドまたはチオカルボキサミド誘導体を用いる植物における非生物的ストレスに対する耐性の強化方法 |
| PT2908641T (pt) | 2012-10-19 | 2018-04-16 | Bayer Cropscience Ag | Método para o tratamento de plantas contra fungos resistentes a fungicidas utilizando derivados de carboxamida ou tiocarboxamida |
| US9801374B2 (en) | 2012-10-19 | 2017-10-31 | Bayer Cropscience Ag | Active compound combinations comprising carboxamide derivatives |
| EP2735231A1 (en) | 2012-11-23 | 2014-05-28 | Bayer CropScience AG | Active compound combinations |
| WO2014079957A1 (de) | 2012-11-23 | 2014-05-30 | Bayer Cropscience Ag | Selektive inhibition der ethylensignaltransduktion |
| CA2892693C (en) | 2012-11-30 | 2021-08-10 | Bayer Cropscience Ag | Binary fungicidal mixtures |
| WO2014082950A1 (en) | 2012-11-30 | 2014-06-05 | Bayer Cropscience Ag | Ternary fungicidal mixtures |
| CA2892702A1 (en) | 2012-11-30 | 2014-06-05 | Bayer Cropscience Ag | Binary fungicidal or pesticidal mixture |
| BR112015012519A2 (pt) | 2012-11-30 | 2017-07-11 | Bayer Cropscience Ag | misturas ternárias fungicidas e pesticidas |
| US9510596B2 (en) | 2012-11-30 | 2016-12-06 | Bayer Cropscience Ag | Binary pesticidal and fungicidal mixtures |
| WO2014086758A2 (en) | 2012-12-03 | 2014-06-12 | Bayer Cropscience Ag | Composition comprising a biological control agent and an insecticide |
| CA2893027A1 (en) | 2012-12-03 | 2014-06-12 | Bayer Cropscience Ag | Composition comprising biological control agents |
| EP2925146A2 (en) | 2012-12-03 | 2015-10-07 | Bayer CropScience AG | Composition comprising a biological control agent and a fungicide |
| EP2925141A2 (en) | 2012-12-03 | 2015-10-07 | Bayer CropScience AG | Composition comprising a biological control agent and a fungicide |
| WO2014086750A2 (en) | 2012-12-03 | 2014-06-12 | Bayer Cropscience Ag | Composition comprising a biological control agent and an insecticide |
| WO2014086753A2 (en) | 2012-12-03 | 2014-06-12 | Bayer Cropscience Ag | Composition comprising biological control agents |
| EP2925140A2 (en) | 2012-12-03 | 2015-10-07 | Bayer CropScience AG | Composition comprising a biological control agent and a fungicide |
| BR112015012763B1 (pt) | 2012-12-03 | 2020-05-12 | Bayer Cropscience Ag | Composição, semente revestida com uma composição, uso da composição, kit de componentes e método para reduzir danos globais em plantas e controlar nematodes e insetos |
| EP2740720A1 (de) | 2012-12-05 | 2014-06-11 | Bayer CropScience AG | Substituierte bicyclische- und tricyclische Pent-2-en-4-insäure -Derivate und ihre Verwendung zur Steigerung der Stresstoleranz in Pflanzen |
| EP2740356A1 (de) | 2012-12-05 | 2014-06-11 | Bayer CropScience AG | Substituierte (2Z)-5(1-Hydroxycyclohexyl)pent-2-en-4-insäure-Derivate |
| BR112015012926A2 (pt) | 2012-12-05 | 2017-07-11 | Bayer Cropscience Ag | uso de 1-(aril etinil)-, 1-(heteroaril etinil)-, 1-(heterociclil etinil)- substituído e 1-(cicloalquenil etinil)-ciclohexanóis como agentes ativos contra o estresse abiótico da planta |
| AR093909A1 (es) | 2012-12-12 | 2015-06-24 | Bayer Cropscience Ag | Uso de ingredientes activos para controlar nematodos en cultivos resistentes a nematodos |
| US20140173775A1 (en) | 2012-12-13 | 2014-06-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for producing and selecting transgenic plants |
| AR093996A1 (es) | 2012-12-18 | 2015-07-01 | Bayer Cropscience Ag | Combinaciones bactericidas y fungicidas binarias |
| BR112015014307A2 (pt) | 2012-12-19 | 2017-07-11 | Bayer Cropscience Ag | difluorometil-nicotínico- tetrahidronaftil carboxamidas |
| CA2894213A1 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-26 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods for auxin-analog conjugation |
| UY35252A (es) | 2013-01-01 | 2014-07-31 | Seeds Ltd Ab | MÉTODOS PARA INTRODUCIR dsRNA EN SEMILLAS DE PLANTAS PARA MODULAR LA EXPRESIÓN GENÉTICA |
| US10683505B2 (en) | 2013-01-01 | 2020-06-16 | Monsanto Technology Llc | Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression |
| US10000767B2 (en) | 2013-01-28 | 2018-06-19 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for plant pest control |
| EP2953942B1 (de) | 2013-02-06 | 2017-10-25 | Bayer CropScience Aktiengesellschaft | Halogensubstituierte pyrazolderivate als schädlingsbekämpfungsmittel |
| MX2015010306A (es) | 2013-02-11 | 2015-11-18 | Bayer Cropscience Lp | Composicion que comprende una gougerotina aislada y un fungicida. |
| KR20150119031A (ko) | 2013-02-11 | 2015-10-23 | 바이엘 크롭사이언스 엘피 | 스트렙토미세스-기반 생물학적 방제제 및 살곤충제를 포함하는 조성물 |
| KR20150119022A (ko) | 2013-02-11 | 2015-10-23 | 바이엘 크롭사이언스 엘피 | 고제로틴 및 생물학적 방제제를 포함하는 조성물 |
| JP2016515100A (ja) | 2013-03-07 | 2016-05-26 | バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト | 殺菌性３−｛フェニル［（ヘテロシクリルメトキシ）イミノ］メチル｝−ヘテロ環誘導体 |
| PL2964767T3 (pl) | 2013-03-07 | 2020-08-24 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Geny kodujące toksyny i sposoby ich zastosowania |
| CA2905377A1 (en) | 2013-03-11 | 2014-10-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions to improve the spread of chemical signals in plants |
| US20160326540A1 (en) | 2013-03-11 | 2016-11-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and Compositions Employing a Sulfonylurea-Dependent Stabilization Domain |
| WO2014159306A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-10-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Glyphosate application for weed control in brassica |
| CA2905027A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-10-09 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
| CA2905104A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-10-09 | Monsanto Technology Llc | Control of lolium species by topical application of herbicidal composition comprising dsrna |
| EP3744727A1 (en) | 2013-03-14 | 2020-12-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
| US20140289906A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions Having Dicamba Decarboxylase Activity and Methods of Use |
| US20140283211A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Monsanto Technology Llc | Methods and Compositions for Plant Pest Control |
| AU2014236162A1 (en) | 2013-03-14 | 2015-09-17 | Arzeda Corp. | Compositions having dicamba decarboxylase activity and methods of use |
| WO2014150914A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Phi-4 polypeptides and methods for their use |
| US10568328B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-02-25 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
| WO2014161821A1 (en) | 2013-04-02 | 2014-10-09 | Bayer Cropscience Nv | Targeted genome engineering in eukaryotes |
| CN105308032B (zh) | 2013-04-12 | 2017-05-24 | 拜耳作物科学股份公司 | 新的三唑衍生物 |
| US9550752B2 (en) | 2013-04-12 | 2017-01-24 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Triazolinthione derivatives |
| KR20150144779A (ko) | 2013-04-19 | 2015-12-28 | 바이엘 크롭사이언스 악티엔게젤샤프트 | 살충성 또는 농약성 2성분 혼합물 |
| CA2909725A1 (en) | 2013-04-19 | 2014-10-23 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants |
| TW201507722A (zh) | 2013-04-30 | 2015-03-01 | Bayer Cropscience Ag | 做為殺線蟲劑及殺體內寄生蟲劑的ｎ－（２－鹵素－２－苯乙基）－羧醯胺類 |
| WO2014177514A1 (en) | 2013-04-30 | 2014-11-06 | Bayer Cropscience Ag | Nematicidal n-substituted phenethylcarboxamides |
| EP2801575A1 (en) | 2013-05-07 | 2014-11-12 | Bayer CropScience AG | Heteroaryldihydropyridine derivatives as fungicides |
| WO2014206953A1 (en) | 2013-06-26 | 2014-12-31 | Bayer Cropscience Ag | N-cycloalkyl-n-[(bicyclylphenyl)methylene]-(thio)carboxamide derivatives |
| EP3019012A1 (de) | 2013-07-09 | 2016-05-18 | Bayer CropScience AG | Verwendung ausgewählter pyridoncarboxamide oder deren salzen als wirkstoffe gegen abiotischen pflanzenstress |
| US9850496B2 (en) | 2013-07-19 | 2017-12-26 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for controlling Leptinotarsa |
| PL3030663T3 (pl) | 2013-07-19 | 2020-04-30 | Monsanto Technology Llc | Kompozycje i sposoby kontroli leptinotarsa |
| US20160219812A1 (en) | 2013-07-25 | 2016-08-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Method for producing hybrid brassica seed |
| EP2837287A1 (en) | 2013-08-15 | 2015-02-18 | Bayer CropScience AG | Use of prothioconazole for increasing root growth of Brassicaceae |
| EP3032942B1 (en) | 2013-08-16 | 2020-03-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| ES2937045T3 (es) | 2013-09-13 | 2023-03-23 | Pioneer Hi Bred Int | Proteínas insecticidas y métodos para su uso |
| EP3049517B1 (en) | 2013-09-24 | 2018-04-11 | Bayer CropScience NV | Hetero-transglycosylase and uses thereof |
| AU2014334590A1 (en) | 2013-10-18 | 2016-04-28 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Glyphosate-N-acetyltransferase (GLYAT) sequences and methods of use |
| CN105849266A (zh) | 2013-11-04 | 2016-08-10 | 孟山都技术公司 | 控制节肢动物寄生物和害虫侵染的组合物和方法 |
| WO2015082587A1 (en) | 2013-12-05 | 2015-06-11 | Bayer Cropscience Ag | N-cycloalkyl-n-{[2-(1-substitutedcycloalkyl)phenyl]methylene}-(thio)carboxamide derivatives |
| RU2685723C1 (ru) | 2013-12-05 | 2019-04-23 | Байер Кропсайенс Акциенгезелльшафт | Производные n-циклоалкил-n-{ [2-(1-замещенный циклоалкил)фенил]метилен} -(тио)карбоксамида |
| UA119253C2 (uk) | 2013-12-10 | 2019-05-27 | Біолоджикс, Інк. | Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл |
| CN103710328A (zh) * | 2013-12-27 | 2014-04-09 | 西北大学 | 大肠杆菌乙酰乳酸合酶的制备及保存方法 |
| MX368629B (es) | 2014-01-15 | 2019-10-08 | Monsanto Technology Llc | Metodos y composiciones para el control de malezas utilizando polinucleotidos de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (epsps). |
| US10480007B2 (en) | 2014-02-07 | 2019-11-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants |
| BR112016018287A2 (pt) | 2014-02-07 | 2017-10-10 | Du Pont | proteínas inseticidas e métodos para uso das mesmas |
| MX2016011745A (es) | 2014-03-11 | 2017-09-01 | Bayer Cropscience Lp | Variantes de hppd y metodos de uso. |
| WO2015153339A2 (en) | 2014-04-01 | 2015-10-08 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for controlling insect pests |
| WO2015160620A1 (en) | 2014-04-16 | 2015-10-22 | Bayer Cropscience Lp | Compositions comprising ningnanmycin and an insecticide |
| WO2015160619A1 (en) | 2014-04-16 | 2015-10-22 | Bayer Cropscience Lp | Compositions comprising ningnanmycin and a fungicide |
| WO2015160618A1 (en) | 2014-04-16 | 2015-10-22 | Bayer Cropscience Lp | Compositions comprising ningnanmycin and a biological control agent |
| EP3158067B1 (en) | 2014-06-23 | 2020-08-12 | Monsanto Technology LLC | Compositions and methods for regulating gene expression via rna interference |
| WO2015200539A1 (en) | 2014-06-25 | 2015-12-30 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for delivering nucleic acids to plant cells and regulating gene expression |
| AR101214A1 (es) | 2014-07-22 | 2016-11-30 | Bayer Cropscience Ag | Ciano-cicloalquilpenta-2,4-dienos, ciano-cicloalquilpent-2-en-4-inas, ciano-heterociclilpenta-2,4-dienos y ciano-heterociclilpent-2-en-4-inas sustituidos como principios activos contra el estrés abiótico de plantas |
| CN114009454A (zh) | 2014-07-29 | 2022-02-08 | 孟山都技术公司 | 用于控制昆虫害虫的组合物和方法 |
| CA2955828A1 (en) | 2014-08-08 | 2016-02-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Ubiquitin promoters and introns and methods of use |
| CA2961733A1 (en) | 2014-09-17 | 2016-03-24 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
| BR112017007932A2 (pt) | 2014-10-16 | 2018-01-23 | Du Pont | proteínas inseticidas e métodos para uso das mesmas |
| AR103024A1 (es) | 2014-12-18 | 2017-04-12 | Bayer Cropscience Ag | Piridoncarboxamidas seleccionadas o sus sales como sustancias activas contra estrés abiótico de las plantas |
| US20170359965A1 (en) | 2014-12-19 | 2017-12-21 | E I Du Pont De Nemours And Company | Polylactic acid compositions with accelerated degradation rate and increased heat stability |
| AU2016207026B2 (en) | 2015-01-15 | 2021-12-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| MX2017009521A (es) | 2015-01-22 | 2018-11-09 | Monsanto Technology Llc | Composiciones y métodos para controlar leptinotarsa. |
| CN108064303A (zh) * | 2015-03-11 | 2018-05-22 | 先锋国际良种公司 | 基于结构的用于修饰pip-72多肽及由其衍生的pip-72多肽的方法 |
| US10214510B2 (en) | 2015-04-13 | 2019-02-26 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | N-cycloalkyl-N-(biheterocyclylethylene)-(thio)carboxamide derivatives |
| US20190119334A1 (en) | 2015-05-19 | 2019-04-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| WO2016196738A1 (en) | 2015-06-02 | 2016-12-08 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for delivery of a polynucleotide into a plant |
| CN108024517A (zh) | 2015-06-03 | 2018-05-11 | 孟山都技术公司 | 用于将核酸引入到植物中的方法和组合物 |
| CN107771181A (zh) | 2015-06-16 | 2018-03-06 | 先锋国际良种公司 | 用以防治昆虫有害生物的组合物和方法 |
| CA2994676A1 (en) | 2015-08-06 | 2017-02-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant derived insecticidal proteins and methods for their use |
| EA201890696A1 (ru) | 2015-09-11 | 2018-09-28 | Байер Кропсайенс Акциенгезельшафт | Варианты гфпд и способы применения |
| PE20240803A1 (es) | 2015-09-30 | 2024-04-18 | Bayer Cropscience Ag | Uso de isotianilo para control de enfermedad de patata manchada |
| AU2016341041A1 (en) | 2015-10-20 | 2018-03-15 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for marker-free genome modification |
| US20180325119A1 (en) | 2015-12-18 | 2018-11-15 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| BR112018012887B1 (pt) | 2015-12-22 | 2024-02-06 | Pioneer Hi-Bred International, Inc | Cassete de expressão, vetor, métodos de obtenção de célula vegetal e planta transgênica, métodos para expressar um polinucleotídeo |
| WO2017192560A1 (en) | 2016-05-04 | 2017-11-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| BR112018076047A2 (pt) | 2016-06-16 | 2019-03-26 | Pioneer Hi Bred Int | elemento de silenciamento, construto de dna, cassete de expressão, célula hospedeira, composição, célula vegetal, planta ou parte de planta, semente transgênica, método para controlar um inseto-praga de planta e kit |
| WO2017222821A2 (en) | 2016-06-24 | 2017-12-28 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant regulatory elements and methods of use thereof |
| RU2019102714A (ru) | 2016-07-01 | 2020-08-03 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Инсектицидные белки из растений и способы их применения |
| US20210292778A1 (en) | 2016-07-12 | 2021-09-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
| CN109688816A (zh) | 2016-07-29 | 2019-04-26 | 拜耳作物科学股份公司 | 活性化合物结合物和保护植物的繁殖材料的方法 |
| BR112019005668A2 (pt) | 2016-09-22 | 2019-06-04 | Bayer Ag | novos derivados de triazol |
| US20190281828A1 (en) | 2016-09-22 | 2019-09-19 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Novel triazole derivatives |
| US20190225974A1 (en) | 2016-09-23 | 2019-07-25 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Targeted genome optimization in plants |
| AU2017351474A1 (en) | 2016-10-26 | 2019-04-18 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Use of pyraziflumid for controlling Sclerotinia spp in seed treatment applications |
| BR112019008800A2 (pt) | 2016-11-01 | 2019-07-16 | Pioneer Hi Bred Int | polipeptídeo inseticida, composição inseticida, polinucleotídeo recombinante, construto de dna, célula de planta ou planta transgênica, método para inibir o crescimento ou exterminar uma população de praga de inseto agrícola, método para inibir o crescimento ou exterminar uma praga de inseto, método para controlar infestação de inseto lepidoptera e/ou coleoptera em uma planta transgênica e fornecer gerenciamento de resistência de inseto e uso de pelo menos um polipeptídeo inseticida |
| WO2018098214A1 (en) | 2016-11-23 | 2018-05-31 | Bayer Cropscience Lp | Axmi669 and axmi991 toxin genes and methods for their use |
| CN110248547A (zh) | 2016-12-08 | 2019-09-17 | 拜耳农作物科学股份公司 | 杀虫剂用于控制金针虫的用途 |
| EP3332645A1 (de) | 2016-12-12 | 2018-06-13 | Bayer Cropscience AG | Verwendung substituierter pyrimidindione oder jeweils deren salze als wirkstoffe gegen abiotischen pflanzenstress |
| WO2018108627A1 (de) | 2016-12-12 | 2018-06-21 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Verwendung substituierter indolinylmethylsulfonamide oder deren salze zur steigerung der stresstoleranz in pflanzen |
| EA201991547A1 (ru) | 2016-12-22 | 2020-01-17 | БАСФ АГРИКУЛЬЧУРАЛ СОЛЮШНС СИД УС ЛЛСи | Применение cry14 для борьбы с вредителями нематодами |
| UY37570A (es) | 2017-01-18 | 2018-08-31 | Bayer Cropscience Lp | Uso de bp005 para el control de patógenos de planta |
| US11279946B2 (en) | 2017-01-18 | 2022-03-22 | Basf Argicultural Solutions Seed Us Llc | BP005 toxin gene and methods for its use |
| CA3055317A1 (en) | 2017-03-07 | 2018-09-13 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Hppd variants and methods of use |
| KR101996129B1 (ko) * | 2017-07-11 | 2019-07-04 | 씨제이제일제당 (주) | 아세토하이드록시산 신타아제 변이체, 이를 포함하는 미생물 또는 이를 이용하는 l-분지쇄 아미노산 생산 방법 |
| WO2019025153A1 (de) | 2017-07-31 | 2019-02-07 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Verwendung von substituierten n-sulfonyl-n'-aryldiaminoalkanen und n-sulfonyl-n'-heteroaryldiaminoalkanen oder deren salzen zur steigerung der stresstoleranz in pflanzen |
| CN111263587B (zh) | 2017-09-19 | 2022-07-08 | 拜耳公司 | 异噻菌胺对抗巴拿马病的用途 |
| CA3076831A1 (en) | 2017-09-25 | 2019-03-28 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Tissue-preferred promoters and methods of use |
| BR112020008096A2 (pt) | 2017-10-24 | 2020-11-03 | Basf Se | método para conferir tolerância a um herbicida e planta de soja transgênica |
| WO2019083810A1 (en) | 2017-10-24 | 2019-05-02 | Basf Se | IMPROVING HERBICIDE TOLERANCE FOR 4-HYDROXYPHENYLPYRUVATE DIOXYGENASE (HPPD) INHIBITORS BY NEGATIVE REGULATION OF HPPD EXPRESSION IN SOYBEANS |
| GB2569562A (en) * | 2017-12-19 | 2019-06-26 | Wave Optics Ltd | Virtual reality or augmented reality headset |
| CN116410286A (zh) | 2018-03-14 | 2023-07-11 | 先锋国际良种公司 | 来自植物的杀昆虫蛋白及其使用方法 |
| CN115850420A (zh) | 2018-03-14 | 2023-03-28 | 先锋国际良种公司 | 来自植物的杀昆虫蛋白及其使用方法 |
| BR112020023800A2 (pt) | 2018-05-22 | 2021-02-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | elementos reguladores de planta e métodos de uso dos mesmos |
| BR112020024615A2 (pt) | 2018-06-04 | 2021-03-02 | Bayer Aktiengesellschaft | benzoilpirazóis bicíclicos de ação herbicida |
| US20210277409A1 (en) | 2018-06-28 | 2021-09-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods for selecting transformed plants |
| CA3107382A1 (en) | 2018-07-26 | 2020-01-30 | Bayer Aktiengesellschaft | Use of the succinate dehydrogenase inhibitor fluopyram for controlling root rot complex and/or seedling disease complex caused by rhizoctonia solani, fusarium species and pythium species in brassicaceae species |
| BR112021004933A2 (pt) | 2018-09-17 | 2021-06-01 | Bayer Aktiengesellschaft | uso do inibidor de succinato desidrogenase fluopiram para controlar claviceps purpurea e reduzir esclerócio em cereais |
| AU2019343273A1 (en) | 2018-09-17 | 2021-05-13 | Bayer Aktiengesellschaft | Use of the fungicide Isoflucypram for controlling Claviceps purpurea and reducing sclerotia in cereals |
| WO2020092487A1 (en) | 2018-10-31 | 2020-05-07 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods for ochrobactrum-mediated plant transformation |
| MX2022000950A (es) | 2019-07-22 | 2022-02-14 | Bayer Ag | 5-amino pirazoles y triazoles como plaguicidas. |
| AU2020318590A1 (en) | 2019-07-23 | 2022-02-17 | Bayer Aktiengesellschaft | Novel heteroaryl-triazole compounds as pesticides |
| MX2022000951A (es) | 2019-07-23 | 2022-02-14 | Bayer Ag | Novedosos compuestos de heteroaril-triazol como plaguicidas. |
| EP3701796A1 (en) | 2019-08-08 | 2020-09-02 | Bayer AG | Active compound combinations |
| US20220403410A1 (en) | 2019-09-26 | 2022-12-22 | Bayer Aktiengesellschaft | Rnai-mediated pest control |
| EP4037485A1 (en) | 2019-10-02 | 2022-08-10 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combinations comprising fatty acids |
| BR112022006774A2 (pt) | 2019-10-09 | 2022-06-28 | Bayer Ag | Compostos de heteroaril-triazol inovadores como pesticidas |
| KR20220081359A (ko) | 2019-10-09 | 2022-06-15 | 바이엘 악티엔게젤샤프트 | 살충제로서의 신규 헤테로아릴-트리아졸 화합물 |
| MX2022004552A (es) | 2019-10-14 | 2022-10-10 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Nuevos genes de resistencia a insectos y métodos de uso. |
| CA3157808A1 (en) | 2019-10-14 | 2021-04-22 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Novel insect resistant genes and methods of use |
| US20220380318A1 (en) | 2019-11-07 | 2022-12-01 | Bayer Aktiengesellschaft | Substituted sulfonyl amides for controlling animal pests |
| WO2021097162A1 (en) | 2019-11-13 | 2021-05-20 | Bayer Cropscience Lp | Beneficial combinations with paenibacillus |
| TW202134226A (zh) | 2019-11-18 | 2021-09-16 | 德商拜耳廠股份有限公司 | 作為殺蟲劑之新穎雜芳基-三唑化合物 |
| EP4061131A1 (en) | 2019-11-18 | 2022-09-28 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combinations comprising fatty acids |
| KR102147381B1 (ko) * | 2019-11-22 | 2020-08-24 | 씨제이제일제당 주식회사 | 아세토하이드록시산 신타제 신규 변이체 및 이를 포함하는 미생물 |
| TW202136248A (zh) | 2019-11-25 | 2021-10-01 | 德商拜耳廠股份有限公司 | 作為殺蟲劑之新穎雜芳基-三唑化合物 |
| AR121242A1 (es) | 2020-01-31 | 2022-05-04 | Pairwise Plants Services Inc | Supresión de la respuesta de escape a la sombra en plantas |
| MX2022010059A (es) | 2020-02-18 | 2022-08-25 | Bayer Ag | Nuevos compuestos de heteroaril-triazol como pesticidas. |
| EP3708565A1 (en) | 2020-03-04 | 2020-09-16 | Bayer AG | Pyrimidinyloxyphenylamidines and the use thereof as fungicides |
| CN119431532A (zh) | 2020-04-16 | 2025-02-14 | 成对植物服务股份有限公司 | 控制分生组织大小以改良作物的方法 |
| WO2021209490A1 (en) | 2020-04-16 | 2021-10-21 | Bayer Aktiengesellschaft | Cyclaminephenylaminoquinolines as fungicides |
| EP4139304A1 (de) | 2020-04-21 | 2023-03-01 | Bayer Aktiengesellschaft | 2-(het)aryl-substituierte kondensierte heterocyclen-derivate als schädlingsbekämpfungsmittel |
| TW202208347A (zh) | 2020-05-06 | 2022-03-01 | 德商拜耳廠股份有限公司 | 作為殺蟲劑之新穎雜芳基三唑化合物 |
| WO2021224220A1 (en) | 2020-05-06 | 2021-11-11 | Bayer Aktiengesellschaft | Pyridine (thio)amides as fungicidal compounds |
| JP2023525349A (ja) | 2020-05-12 | 2023-06-15 | バイエル、アクチエンゲゼルシャフト | 殺真菌性化合物としてのトリアジンおよびピリミジン（チオ）アミド化合物 |
| WO2021233861A1 (en) | 2020-05-19 | 2021-11-25 | Bayer Aktiengesellschaft | Azabicyclic(thio)amides as fungicidal compounds |
| BR112022024489A2 (pt) | 2020-06-02 | 2023-01-31 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos para o controle do tamanho do meristema para melhora da cultura agrícola |
| BR112022024394A2 (pt) | 2020-06-04 | 2023-01-31 | Bayer Ag | Heterociclil pirimidinas e triazinas como novos fungicidas |
| US20230234945A1 (en) | 2020-06-10 | 2023-07-27 | Bayer Aktiengesellschaft | Azabicyclyl-substituted heterocycles as fungicides |
| US20210395767A1 (en) | 2020-06-17 | 2021-12-23 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods for controlling meristem size for crop improvement |
| JP2023532224A (ja) | 2020-06-18 | 2023-07-27 | バイエル、アクチエンゲゼルシャフト | 新規殺菌剤としてのオキサジアジニルピリダジン |
| US20230292747A1 (en) | 2020-06-18 | 2023-09-21 | Bayer Aktiengesellschaft | Composition for use in agriculture |
| UY39275A (es) | 2020-06-19 | 2022-01-31 | Bayer Ag | 1,3,4-oxadiazol pirimidinas como fungicidas, procesos e intermediarios para su preparación, métodos de uso y usos de los mismos |
| BR112022025692A2 (pt) | 2020-06-19 | 2023-02-28 | Bayer Ag | 1,3,4-oxadiazóis e seus derivados como fungicidas |
| UY39276A (es) | 2020-06-19 | 2022-01-31 | Bayer Ag | Uso de compuestos de 1,3,4–oxadiazol–2–ilpirimidina para controlar microorganismos fitopatógenos, métodos de uso y composiciones. |
| WO2021255089A1 (en) | 2020-06-19 | 2021-12-23 | Bayer Aktiengesellschaft | 1,3,4-oxadiazole pyrimidines and 1,3,4-oxadiazole pyridines as fungicides |
| EP3929189A1 (en) | 2020-06-25 | 2021-12-29 | Bayer Animal Health GmbH | Novel heteroaryl-substituted pyrazine derivatives as pesticides |
| CN116033828A (zh) | 2020-07-02 | 2023-04-28 | 拜耳公司 | 作为害虫防治剂的杂环衍生物 |
| WO2022015619A2 (en) | 2020-07-14 | 2022-01-20 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| WO2022033991A1 (de) | 2020-08-13 | 2022-02-17 | Bayer Aktiengesellschaft | 5-amino substituierte triazole als schädlingsbekämpfungsmittel |
| WO2022040510A1 (en) | 2020-08-21 | 2022-02-24 | Bayer Cropscience Lp | Combinations of trichoderma and bradyrhizobium |
| WO2022053453A1 (de) | 2020-09-09 | 2022-03-17 | Bayer Aktiengesellschaft | Azolcarboxamide als schädlingsbekämpfungsmittel |
| WO2022058327A1 (en) | 2020-09-15 | 2022-03-24 | Bayer Aktiengesellschaft | Substituted ureas and derivatives as new antifungal agents |
| EP3974414A1 (de) | 2020-09-25 | 2022-03-30 | Bayer AG | 5-amino substituierte pyrazole und triazole als schädlingsbekämpfungsmittel |
| EP3915971A1 (en) | 2020-12-16 | 2021-12-01 | Bayer Aktiengesellschaft | Phenyl-s(o)n-phenylamidines and the use thereof as fungicides |
| WO2022129188A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Bayer Aktiengesellschaft | 1,2,4-oxadiazol-3-yl pyrimidines as fungicides |
| CA3205419A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Bayer Aktiengesellschaft | Use of dhodh inhibitor for controlling resistant phytopathogenic fungi in crops |
| WO2022129190A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Bayer Aktiengesellschaft | (hetero)aryl substituted 1,2,4-oxadiazoles as fungicides |
| WO2022129196A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Bayer Aktiengesellschaft | Heterobicycle substituted 1,2,4-oxadiazoles as fungicides |
| EP4036083A1 (de) | 2021-02-02 | 2022-08-03 | Bayer Aktiengesellschaft | 5-oxy substituierte hetereozyklen, als schädlingsbekämpfungsmittel |
| WO2022173885A1 (en) | 2021-02-11 | 2022-08-18 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying cytokinin oxidase levels in plants |
| US20220380792A1 (en) | 2021-02-25 | 2022-12-01 | Pairwise Plants Services, Inc | Methods and compositions for modifying root architecture in plants |
| BR112023019788A2 (pt) | 2021-03-30 | 2023-11-07 | Bayer Ag | 3-(hetero)aril-5-clorodifluorometil-1,2,4-oxadiazol como fungicida |
| BR112023019400A2 (pt) | 2021-03-30 | 2023-12-05 | Bayer Ag | 3-(hetero)aril-5-clorodifluorometil-1,2,4-oxadiazol como fungicida |
| EP4334315A1 (en) | 2021-05-06 | 2024-03-13 | Bayer Aktiengesellschaft | Alkylamide substituted, annulated imidazoles and use thereof as insecticides |
| WO2022238391A1 (de) | 2021-05-12 | 2022-11-17 | Bayer Aktiengesellschaft | 2-(het)aryl-substituierte kondensierte heterocyclen-derivate als schädlingsbekämpfungsmittel |
| CA3223995A1 (en) | 2021-06-17 | 2022-12-22 | Pairwise Plants Services, Inc. | Modification of growth regulating factor family transcription factors in soybean |
| UY39827A (es) | 2021-06-24 | 2023-01-31 | Pairwise Plants Services Inc | Modificación de genes de ubiquitina ligasa e3 hect para mejorar los rasgos de rendimiento |
| MX2023014883A (es) | 2021-07-01 | 2024-02-12 | Pairwise Plants Services Inc | Metodos y composiciones para mejorar el desarrollo del sistema radicular. |
| CA3229056A1 (en) | 2021-08-12 | 2023-02-16 | Pairwise Plants Services, Inc. | Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits |
| KR20240039209A (ko) | 2021-08-13 | 2024-03-26 | 바이엘 악티엔게젤샤프트 | 활성 화합물 조합물 및 이를 포함하는 살진균제 조성물 |
| US20230063927A1 (en) | 2021-08-17 | 2023-03-02 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying cytokinin receptor histidine kinase genes in plants |
| IL310966A (en) | 2021-08-25 | 2024-04-01 | Bayer Ag | Novel pyrazinyl-triazole compounds as pesticides |
| US20230074699A1 (en) | 2021-08-30 | 2023-03-09 | Pairwise Plants Services, Inc. | Modification of ubiquitin binding peptidase genes in plants for yield trait improvement |
| EP4144739A1 (de) | 2021-09-02 | 2023-03-08 | Bayer Aktiengesellschaft | Anellierte pyrazole als schädlingsbekämpfungsmittel |
| AR126938A1 (es) | 2021-09-02 | 2023-11-29 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para mejorar la arquitectura de las plantas y los rasgos de rendimiento |
| US20230087522A1 (en) | 2021-09-21 | 2023-03-23 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for reducing pod shatter in canola |
| AR127236A1 (es) | 2021-10-04 | 2024-01-03 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos para mejorar la fertilidad de la flor y el rendimiento de semillas |
| US20250064060A1 (en) | 2021-11-03 | 2025-02-27 | Bayer Aktiengesellschaft | Bis(hetero)aryl thioether (thio)amides as fungicidal compounds |
| JP2024543953A (ja) | 2021-11-30 | 2024-11-26 | バイエル、アクチエンゲゼルシャフト | 抗真菌化合物としてのビス（ヘテロ）アリールチオエーテルオキサジアジン |
| AR127904A1 (es) | 2021-12-09 | 2024-03-06 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos para mejorar la fertilidad de floretes y el rendimiento de semillas |
| AR128372A1 (es) | 2022-01-31 | 2024-04-24 | Pairwise Plants Services Inc | Supresión de la respuesta de evitación de la sombra en las plantas |
| CN119072236A (zh) | 2022-02-01 | 2024-12-03 | 环球化学股份有限公司 | 控制油菜上害虫的方法和组合物 |
| WO2023148035A1 (en) | 2022-02-01 | 2023-08-10 | Globachem Nv | Methods and compositions for controlling pests in rice |
| AU2023216389A1 (en) | 2022-02-01 | 2024-08-08 | Globachem Nv | Methods and compositions for controlling pests in cotton |
| WO2023148029A1 (en) | 2022-02-01 | 2023-08-10 | Globachem Nv | Methods and compositions for controlling pests in cereals |
| EP4472420A1 (en) | 2022-02-01 | 2024-12-11 | Globachem NV | Methods and compositions for controlling pests in soybean |
| WO2023148030A1 (en) | 2022-02-01 | 2023-08-10 | Globachem Nv | Methods and compositions for controlling pests in corn |
| WO2023148028A1 (en) | 2022-02-01 | 2023-08-10 | Globachem Nv | Methods and compositions for controlling pests |
| WO2023168217A1 (en) | 2022-03-02 | 2023-09-07 | Pairwise Plants Services, Inc. | Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits |
| WO2023192838A1 (en) | 2022-03-31 | 2023-10-05 | Pairwise Plants Services, Inc. | Early flowering rosaceae plants with improved characteristics |
| AU2023251095A1 (en) | 2022-04-07 | 2024-10-17 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for improving resistance to fusarium head blight |
| WO2023205714A1 (en) | 2022-04-21 | 2023-10-26 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving yield traits |
| US20230348922A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-02 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for enhancing yield and disease resistance |
| CN119110684A (zh) | 2022-05-03 | 2024-12-10 | 拜耳公司 | (5s)-3-[3-(3-氯-2-氟苯氧基)-6-甲基哒嗪-4-基]-5-(2-氯-4-甲基苄基)-5,6-二氢-4h-1,2,4-噁二嗪用于防治不想要的微生物的用途 |
| CN119522219A (zh) | 2022-05-03 | 2025-02-25 | 拜耳公司 | (5s)-3-[3-(3-氯-2-氟苯氧基)-6-甲基哒嗪-4-基]-5-(2-氯-4-甲基苄基)-5,6-二氢-4h-1,2,4-噁二嗪的晶型 |
| WO2023215809A1 (en) | 2022-05-05 | 2023-11-09 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying root architecture and/or improving plant yield traits |
| AR129709A1 (es) | 2022-06-27 | 2024-09-18 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para modificar el escape a la sombra en plantas |
| AR129748A1 (es) | 2022-06-29 | 2024-09-25 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para controlar el tamaño del meristemo para el mejoramiento de cultivos |
| WO2024006791A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement |
| WO2024015781A2 (en) * | 2022-07-12 | 2024-01-18 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Compositions and methods for soybean plant transformation |
| US20240043857A1 (en) | 2022-08-04 | 2024-02-08 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving yield traits |
| US20240060081A1 (en) | 2022-08-11 | 2024-02-22 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement |
| US20240090466A1 (en) | 2022-09-08 | 2024-03-21 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving yield characteristics in plants |
| EP4295688A1 (en) | 2022-09-28 | 2023-12-27 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combination |
| WO2024068517A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| WO2024068520A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| WO2024068518A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-heteroaryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| WO2024068519A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| EP4385326A1 (en) | 2022-12-15 | 2024-06-19 | Kimitec Biogorup | Biopesticide composition and method for controlling and treating broad spectrum of pests and diseases in plants |
| WO2024137438A2 (en) | 2022-12-19 | 2024-06-27 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Insect toxin genes and methods for their use |
| WO2024173622A1 (en) | 2023-02-16 | 2024-08-22 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying shade avoidance in plants |
| US20240294933A1 (en) | 2023-03-02 | 2024-09-05 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying shade avoidance in plants |
| WO2024186950A1 (en) | 2023-03-09 | 2024-09-12 | Pairwise Plants Services, Inc. | Modification of brassinosteroid signaling pathway genes for improving yield traits in plants |
| US20240384280A1 (en) | 2023-05-18 | 2024-11-21 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving yield characteristics in plants |
| WO2025008447A1 (en) | 2023-07-05 | 2025-01-09 | Bayer Aktiengesellschaft | Composition for use in agriculture |
| WO2025008446A1 (en) | 2023-07-05 | 2025-01-09 | Bayer Aktiengesellschaft | Composition for use in agriculture |
| WO2025019522A1 (en) | 2023-07-18 | 2025-01-23 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying root architecture in plants |
| WO2025024617A1 (en) | 2023-07-27 | 2025-01-30 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying plant yield traits |
| WO2025026738A1 (en) | 2023-07-31 | 2025-02-06 | Bayer Aktiengesellschaft | 6-[5-(ethylsulfonyl)-1-methyl-1h-imidazol-4-yl]-7-methyl-3-(pentafluoroethyl)-7h-imidazo[4,5-c]pyridazine derivatives as pesticides |
| EP4501112A1 (en) | 2023-08-01 | 2025-02-05 | Globachem NV | Plant defense elicitors |
| WO2025026815A1 (en) | 2023-08-01 | 2025-02-06 | Globachem Nv | Insecticidal mixtures |
| WO2025032038A1 (en) | 2023-08-09 | 2025-02-13 | Bayer Aktiengesellschaft | Pyridazin-4-yloxadiazines as novel fungicides |
| WO2025031668A1 (en) | 2023-08-09 | 2025-02-13 | Bayer Aktiengesellschaft | Azaheterobiaryl-substituted 4,5-dihydro-1h-2,4,5-oxadiazines as novel fungicides |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5013659A (en) * | 1987-07-27 | 1991-05-07 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase |
| US5378824A (en) | 1986-08-26 | 1995-01-03 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase |
| US4883914A (en) | 1987-08-17 | 1989-11-28 | American Cyanamid Company | Benzenesulfonyl carboxamide compounds useful as herbicidal agents |
| TW208716B (hu) * | 1990-12-27 | 1993-07-01 | American Cyanamid Co | |
| US5731180A (en) * | 1991-07-31 | 1998-03-24 | American Cyanamid Company | Imidazolinone resistant AHAS mutants |
| US5853973A (en) * | 1995-04-20 | 1998-12-29 | American Cyanamid Company | Structure based designed herbicide resistant products |
| EP0821729B1 (en) * | 1995-04-20 | 2006-10-18 | Basf Aktiengesellschaft | Structure-based designed herbicide resistant products |
| US6265215B1 (en) * | 1996-09-13 | 2001-07-24 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated peptides which complex with HLA-Cw16 and uses thereof |
-
1996
- 1996-04-19 EP EP96913160A patent/EP0821729B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-04-19 ES ES96913160T patent/ES2275275T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-04-19 AU AU55758/96A patent/AU5575896A/en not_active Abandoned
- 1996-04-19 DK DK96913160T patent/DK0821729T3/da active
- 1996-04-19 AT AT96913160T patent/ATE342968T1/de active
- 1996-04-19 CA CA2218526A patent/CA2218526C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-04-19 NZ NZ307012A patent/NZ307012A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-04-19 CZ CZ973317A patent/CZ331797A3/cs unknown
- 1996-04-19 PL PL96322899A patent/PL186091B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-04-19 DE DE69636637T patent/DE69636637T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-04-19 HU HU9900852A patent/HU226259B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-04-19 BR BRPI9604993-6A patent/BR9604993B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1996-04-19 WO PCT/US1996/005782 patent/WO1996033270A1/en active IP Right Grant
- 1996-04-19 JP JP53200296A patent/JP4469422B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-04-19 US US09/367,512 patent/US6576455B1/en not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-10-17 NO NO19974803A patent/NO326115B1/no not_active IP Right Cessation
- 1997-10-20 MX MX9708079A patent/MX9708079A/es unknown
-
2003
- 2003-04-04 US US10/407,339 patent/US6855533B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-01-12 US US11/033,687 patent/US20060156427A1/en not_active Abandoned
-
2006
- 2006-12-05 JP JP2006328154A patent/JP4469833B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK0821729T3 (da) | 2007-02-05 |
| NO326115B1 (no) | 2008-09-29 |
| US6576455B1 (en) | 2003-06-10 |
| BR9604993B1 (pt) | 2009-05-05 |
| BR9604993A (pt) | 1999-11-30 |
| DE69636637D1 (de) | 2006-11-30 |
| EP0821729A1 (en) | 1998-02-04 |
| AU5575896A (en) | 1996-11-07 |
| DE69636637T2 (de) | 2007-08-23 |
| US6855533B2 (en) | 2005-02-15 |
| JP4469422B2 (ja) | 2010-05-26 |
| NZ307012A (en) | 2000-01-28 |
| CZ331797A3 (cs) | 1998-06-17 |
| EP0821729A4 (en) | 1999-12-08 |
| US20030180929A1 (en) | 2003-09-25 |
| CA2218526A1 (en) | 1996-10-24 |
| ES2275275T3 (es) | 2007-06-01 |
| EP0821729B1 (en) | 2006-10-18 |
| MX9708079A (es) | 1998-07-31 |
| CA2218526C (en) | 2012-06-12 |
| US20060156427A1 (en) | 2006-07-13 |
| ATE342968T1 (de) | 2006-11-15 |
| JPH11504213A (ja) | 1999-04-20 |
| NO974803D0 (no) | 1997-10-17 |
| NO974803L (no) | 1997-12-19 |
| HUP9900852A2 (hu) | 1999-07-28 |
| PL186091B1 (pl) | 2003-10-31 |
| HUP9900852A3 (en) | 2001-11-28 |
| WO1996033270A1 (en) | 1996-10-24 |
| JP4469833B2 (ja) | 2010-06-02 |
| JP2007159577A (ja) | 2007-06-28 |
| PL322899A1 (en) | 1998-03-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU226259B1 (en) | Structure-based designed herbicide resistant products | |
| US5853973A (en) | Structure based designed herbicide resistant products | |
| RU2337531C2 (ru) | Растения пшеницы с повышенной устойчивостью к имидазолиноновым гербицидам | |
| US6483011B1 (en) | Modified ADP-glucose pyrophosphorylase for improvement and optimization of plant phenotypes | |
| US9663794B2 (en) | Heat-resistance rice gene OsZFP, screening marker and separation method thereof | |
| Pozniak et al. | Physiological and molecular characterization of mutation‐derived imidazolinone resistance in spring wheat | |
| Al‐Ahmad et al. | Mitigation of establishment of Brassica napus transgenes in volunteers using a tandem construct containing a selectively unfit gene | |
| SK10199A3 (en) | Hppd gene and inhibitors | |
| EP1373531B1 (en) | Method of encoding information in nucleic acids of a genetically engineered organism | |
| Durán-Prado et al. | Molecular basis of resistance to sulfonylureas in Papaver rhoeas | |
| JP6938373B2 (ja) | 除草剤耐性遺伝子及びその使用方法 | |
| Cao et al. | Engineering higher yield and herbicide resistance in rice by Agrobacterium‐mediated multiple gene transformation | |
| Srivastava et al. | Introgression of semi-dwarf gene in Kalanamak rice using marker-assisted selection breeding | |
| Guo et al. | Investigation of clomazone‐tolerance mechanism in a long‐grain cultivar of rice | |
| JP2019516373A (ja) | 半数体及びそれに続く倍加半数体植物の産生方法 | |
| Cui et al. | Developing of transgenic glyphosate-tolerant Indica restorer line with commercial application potential | |
| Munarti et al. | Stay green genes fragment homology analysis of Indonesian sorghum. | |
| CN112898392B (zh) | 水稻phi1基因在调控植物光合作用中的应用 | |
| Kölzsch | Approaches to generate herbicide resistant Taraxacum koksaghyz by directed and undirected mutagenesis of the acetohydroxyacid synthase | |
| EP4311430A1 (en) | Chlorotoluron tolerance gene and methods of use thereof | |
| Song et al. | Transformation a mutant Monochoria vaginalis acetolactate synthase (ALS) gene renders Arabidopsis thaliana resistant to ALS inhibitors | |
| JP2023088612A (ja) | 耐倒伏性植物の作出方法 | |
| Sattar et al. | and Jameel M. Al-Khayri | |
| CN112813045A (zh) | 棉花GhALS突变型蛋白、基因及其分子标记和应用 | |
| Peacock et al. | Biotechnology: Potentials and Limitations, ed. S. Silver, pp. 223-239. Dahlem Konferenzen 1986. Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo: Springer-Verlag. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |