JPH11504213A - 構造に基づきデザインされた除草剤耐性生産物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 イミダゾリノン除草剤およびＡＨＡＳ阻害除草剤等の除草剤に対して選択的に高い耐性を示すアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）変異体を製造するための構造に基づくモデリング方法をここに開示する。本発明は、そのような変異体をコードするＤＮＡ、ＤＮＡを含むベクター、変異体ポリペプチドを製造する方法および特異的ＡＨＡＳ遺伝子変異を含む除草剤耐性植物を包含する。作物の雑草管理の方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 構造に基づきデザインされた除草剤耐性生産物技術分野 本発明は、イミダゾリノンおよび他の除草剤に耐性であるアセトヒドロキシ酸 シンターゼ（ＡＨＡＳ）の変異体の構造に基づくモデリングおよびデザイン、Ａ ＨＡＳ阻害除草剤、ＡＨＡＳの変異体、これら変異体をコードするＤＮＡ、これ ら変異体を発現する植物および雑草管理の方法に関する。背景技術 アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）は、細菌、酵母および植物のイソ ロイシン、ロイシンおよびバリンの生合成の第一段階を触媒する酵素である。例 えば、トウモロコシ（Ｚea Ｍays）の成熟ＡＨＡＳは葉緑体（図１を参照）に局 在するほぼ599個のアミノ酸のプロテインである。該酵素は、アセト乳酸を生成 するためコファクターとしてチアミンピロホスフェート（ＴＰＰ）およびフラビ ンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を、基質としてピルビン酸を用いる。また 、この酵素は、ピルビン酸とケト酪酸の縮合を触媒してアセトヒドロキシ酪酸を 生成する。ＡＨＡＳは、アセト乳酸シンターゼまたはアセト乳酸ピルビン酸リア ーゼ（炭酸化）としても知られ、ＥＣ 4.1.3.18と命名されている。活性酵素は 多分少なくともホモダイマーである。Ibdahらは、抄録（Ｐrotein Ｓcience，3 ：479−Ｓ,1994）で、ＡＨＡＳの活性部位に対する一つのモデルを開示している 。 Ｎemours and Ｃompany−Ｗilmington,ＤＥ）等スルホニルウレア系化合物、ト リアゾロピリミジンスルホンアミド類(Ｂroadstrike^TM−Ｄow Ｅlanco；Ｇerwic kら、Ｐestic.Ｓci.29：357−364,1990参照)、スルファモイルウレア類(Ｒodawa yら、水稲、麦および大麦におけるＡc322,140の選択性のメカニズム、Ｂrighton Ｃrop Ｐrotection Ｃonference−Ｗeeds,1993の講演要旨集)、ピリ Ｎemours and Ｃompany；殺虫剤マニュアル10版、ページ888−889、Ｃlive Ｔom lin編、英国穀物保護委員会、49 Ｄowning Ｓtreet,Ｆarmham,Ｓurrey Ｇ49 7ＰＨ,英国）およびスルホニルカルボキサミド類（Ａlvaradoら、米国特許4,833 ,914）のようないろいろな除草剤がＡＨＡＳ酵素活性を阻害することにより作用 する(Ｃhaleffら、Ｓcience，224：1443,1984；ＬaＲossaら、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem．259 ,8753,1984；Ｒay,Ｐlant Ｐhysiol.75：827,1984；Ｓhanerら、Ｐlant Ｐhy siol.76：545,1984参照)。これらの除草剤は非常に効果的でかつ環境にやさしい 。しかし、これらの除草剤の植物毒性効果に対して雑草のみならず作物も反応す るので、農業にそれらを使用することは選択性の欠如のため限られる。 Ｂedbrookらは、米国特許5,013,659、5,141,870および5,378,824にいくつかの スルホニルウレア耐性ＡＨＡＳ変異体を開示している。しかし、これらの変異体 は、植物、種子または細胞を変異させ、除草剤抵抗性変異体を選択することによ って得られたか、そのような突然変異体から誘導された。このアプローチは、目 標プロテインの構造モデルに基づく論理的なデザイン手法というよりはむしろ少 なくとも初めは対応する突然変異体の偶然の機会による導入に頼る点で予測がで きない。 従って、栽培される作物に選択的に広範囲および／または特異的な除草剤耐性 を付与する方法および組成物には当該技術において、需要が依然としてある。本 発明者らは、ＡＨＡＳの選択的除草剤耐性変異体およびそれを含む植物が、ピル ビン酸オキシダーゼ（ＰＯＸ）に対するＡＨＡＳの構造に基づくモデルリング、 除草剤結合ポケットまたはＡＨＡＳモデル上のポケットを定め、結合ポケットに 対する除草剤の結合性を変える特異的な突然変異体をデザインすることによって 製造できることを発見した。これらの変異体および植物は、一種類以上の除草剤 によって阻害されたり殺されたりされず、作物の成長を支えるべく充分なＡＨＡ Ｓ酵素活性を維持する。図の説明 図１は、植物ＡＨＡＳ酵素の一つの例として示されるトウモロコシ由来のアセ トヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）の約599アミノ酸配列に対応する600アミ ノ酸配列の例示である。この配列はトランジット配列を含まず、余分のグリシン はトロンビン分解部位から残っている。Ｍet53、Ａrg128およびＰhe135残基は太 字で示されている。 図２は、トウモロコシＡＨＡＳおよびラクトバチラスプラナルム由来ピルビン 酸オキシダーゼ（ＰＯＸ）の配列を一列にならべたものである。 図３は、ＡＨＡＳサブユニットの二次構造の図式的な表示である。通常の二次 構造部分のαヘリックスおよびβシートは、各々円と長円として描かれ、サブユ ニット中の三つのドメインの各々に対して別々に番号をつけている。ループやコ イル領域を、その始まりと終りを表わす数字をつけて黒線で示す。コファクター 結合部位および公知の変異部位は、各々八角形および星印で示される。 トウモロコシＡＨＡＳの活性部位のコンピュターによるモデルの例示である。 図５は、異なる植物種から得られるＡＨＡＳアミノ酸配列の相同性の例示であ る。pＡＣ751は、図１におけるようにpＡＣ751大腸菌発現ベクターで発現される トウモロコシals2ＡＨＡＳアイソザイムであり、トウモロコシals2はトウモロコ シals2ＡＨＡＳアイソザイムである。トウモロコシals1はトウモロコシals1ＡＨ ＡＳアイソザイムである。Ｔobac1はタバコＡＨＡＳ ＳuＲＡアイソザイムであ る。Ｔobac2はタバコＡＨＡＳ ＳuＲＢアイソザイムてある。Ａthcsr12はシロイ ヌナズナ（Ａrabidopsis thaliana）Ｃsr1.2ＡＨＡＳ遺伝子である。Ｂnaal3は セイヨウアブラナ（Ｂrassica napus）ＡＨＡＳIIIアイソザイムであり、Ｂnaal 2はセイヨウアブラナＡＨＡＳIIアイソザイムである。 pＡＣ751およびトウモロコシals2は、同一遺伝子であるが、トウモロコシals2 がトランジット配列のはじめから出発するのに対して、pＡＣ751はpＧＥＸ−2Ｔ 発現ベクター中のトロンビン認識配列によるＮ末端に付加的にグリシンを有する 推定成熟Ｎ末端部位ではじまる。Ｎ末端グリシンはその位置において天然のアミ ノ酸ではない。 ＡＨＡＳプロテインのアミノ酸配列の並びは,ＰＩＬＥＵＰ（ＧＣＧパッケー ジ−Ｇenetics Ｃomputer Ｇroup,Ｉnc.,−Ｕniversity Ｒeseach Ｐark−Ｍadi son−ＷＩ）によってつくられる。コンセンサス配列は、ＰＲＥＴＴＹ ＧＣＧパ ッケージによってつくられる。 図６は、トウモロコシＡＨＡＳの精製を示すプロテインに対して染色されたＳ ＤＳポリアクリルアミドゲルの写真例である。レーンは左から右へ、Ａ；分子量 マー カー、Ｂ；大腸菌（Ｅ．coli）粗細胞抽出物、Ｃ；グルタチオン−アガロース アフィニティ精製物、Ｄ；該アフィニティ精製物のトロンビン消化物、Ｅ；二度 目のグルタチオン−アガロースカラムとセファクリルＳ−100ゲルろ過を含む。 の存在下における、野生型と変異ＡＨＡＳプロテインの酵素活性のインビトロ試 験結果のグラフ例である。Ｙ軸は変異酵素の活性（％）を示し、100％値は阻害 剤の非存在下で測定される。 度での存在下における、野生型と変異ＡＨＡＳプロテインの酵素活性のインビト ロ試験結果のグラフ例である。Ｙ軸は変異酵素の活性（％）を示し、100％値は 阻害剤の非存在下で測定される。 ラビドプシス（Ａrabidopsis）ＡＨＡＳプロテインとＭet124Ｉle変異ＡＨＡＳ プロテインの酵素活性のインビトロ試験のグラフ例である。Ｙ軸は変異酵素の活 性（％）を示し、100％値は阻害剤の非存在下で測定される。 ラビドプシスＡＨＡＳプロテインとＭet124Ｈis変異アラビドプシスＡＨＡＳプ ロテインの酵素活性のインビトロ試験のグラフ例である。Ｙ軸は変異酵素の活性 （％）を示し、100％値は阻害剤の非存在下で測定される。 ラビドプシスＡＨＡＳプロテインとＡrg199Ｇlu変異アラビドプシスＡＨＡＳプ ロテインの酵素活性のインビトロ試験のグラフ例である。Ｙ軸は変異酵素の活性 （％）を示し、100％値は阻害剤の非存在下で測定される。 図12は、35Sプロモターのコントロール下にnptＩＩ遺伝子（カナマイシン耐性 をコードする）およびアラビドプシスＡＨＡＳプロモターのコントロール下にＡ ＨＡＳ遺伝子（野生型または変異体）含む植物形質転換のために使用されるＤＮ Ａ ベクターの模式図による説明である。 図13はＭet124Ｉle変異またはＡrg199Ｇlu変異のどちらかを含むアラビドプシ スＡＨＡＳ遺伝子で形質転換されたタバコ植物および非形質転換対照の発根を示 す写真である。植物は0.25μＭのイマゼタピルを含有する培地に移した後、18日 間生育させた。 図14は、Ｍet124Ｉle、Ｍet124ＨＩsまたはＡrg199Ｇlu変異を含むアラビドプ シスＡＨＡＳ遺伝子で形質転換されたタバコ植物とイマゼタピルのフィールド率 （100g／ヘクタール）の二倍で散布された非形質転換対照とを示す写真である。 図15は、除草剤ＣＬ299,263（imazamox）の存在下に行われた発芽試験の結果 を示す写真であって、この試験は、Ｍet124Ｉle、Ｍet124ＨＩsまたはＡrg199Ｇ lu変異を含むアラビドプシスＡＨＡＳ遺伝子で形質転換された一次タバコ植物形 質転換体から収穫された種子について行われた。発明の開示 本発明は、除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインの製造に対する構造に基づく モデリング方法を提供する。本方法は、 (a) 目標ＡＨＡＳプロテインをピルビン酸オキシダーゼ鋳型またはそのＡＨＡ Ｓモデリング同等物上に該目標ΛＨＡＳプロテインの三次元構造を誘導するため に並べること； (b) 目標ＡＨＡＳプロテインの除草剤結合ポケットを局在させるために一つ以 上の除草剤を該三次元構造にモデリングすること； (c) 変異の目標として、変異が該結合ポケットに対して少なくとも一つの除草 剤の親和性を変えるために、目標ＡＨＡＳプロテイン中の少なくとも一つのアミ ノ酸位置を選沢すること； (d) 例えば、該位置で少なくとも一つの異なるアミノ酸の変異を含む変異体Ａ ＨＡＳをコードする変異ＤＮＡを製造するため、目標ＡＨＡＳプロテインをコー ドするＤＮＡを変異すること、そして (e) 例えば、該位置で異なるアミノ酸のような変異を含む変異体ＡＨＡＳが製 造される条件下第一の細胞中で該変異ＤＮＡを発現すること、 を包含する。 更に、本方法は、 (f) 第二の細胞で平行して野生型ＡＨＡＳプロテインをコードするＤＮＡ発現 すること； (g) 野生型および変異体ＡＨＡＳプロテインを細胞から精製すること； (h) 除草剤の存在または非存在下、ピルビン酸のアセト乳酸への変換またはア セトヒドロキシ酪酸を生成するピルビン酸とケト酪酸との縮合における触媒活性 について野生型および変異体ＡＨＡＳプロテインを試験すること；および (i) 第一の除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインが、 (1)：少なくとも一つの除草剤の非存在下、 (a) それが発現される細胞の生存を維持するのに単独で充分な触媒活性；また は (b) 第一のＡＨＡＳ変異体プロテインと同じか異なっていてもよい細胞中に発 現されるあらゆる除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインと組み合わせて、それが 発現される細胞の生存を維持するのに充分な触媒活性；ここにおいて細胞は生存 のためＡＨＡＳを必要とする、および (2)：少なくとも一つの除草剤に野生型ＡＨＡＳよりも耐性である触媒活性； を有することが同定されるまで、ステップ（e）のＡＨＡＳ変異体をコードする ＤＮＡがステップ（c）のＡＨＡＳをコードするＤＮＡとして使用されるように 、ステップ（c）−（h）を繰り返すこと をさらに包含することができる。 除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインの製造に対する構造に基づく別のモデリ ング方法も提供される。この方法は、 (a) 目標ＡＨＡＳプロテインの三次元構造を誘導するために、目標ＡＨＡＳプ ロテインを図１の配列を有するポリペプチドから得られる最初のＡＨＡＳ鋳型ま たはその機能的同等物上に並べること； (b) 目標ＡＨＡＳプロテインの除草剤結合ポケットを局在させるために一つ以 上の除草剤を該三次元構造にモデリングすること； (c) 変異の目標として、変異が該結合ポケットに対して少なくとも一つの除草 剤の親和性を変えることからなる目標ＡＨＡＳプロテイン中の少なくとも一つの ア ミノ酸位置を選沢すること； (d) 該位置で変異を含む変異体ＡＨＡＳをコードする変異ＤＮＡを製造するた め、目標ＡＨＡＳプロテインをコードするＤＮＡを変異すること、および (e) 該位置で変異を含む変異体ＡＨＡＳが製造される条件下第一の細胞中で変 異ＤＮＡを発現すること、 を包含する。 更に、この方法は、 (f) 第二の細胞で平行して目標野生型ＡＨＡＳプロテインをコードするＤＮＡ を発現すること； (g) 野生型および変異体ＡＨＡＳプロテインを細胞から精製すること； (h) 除草剤の存在または非存在下、ピルビン酸のアセト乳酸への変換またはア セトヒドロキシ酪酸を生成するピルビン酸とケト酪酸との縮合における触媒活性 について野生型および変異体ＡＨＡＳプロテインを試験すること；および (i) 第一の除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインが、 (1) 少なくとも一つの除草剤の非存在下、 (a) それが発現される細胞の生存を維持するのに単独で充分な触媒活性；また は (b) 第一のＡＨＡＳ変異体プロテインと同じか異なっていてもよい細胞中に発 現されるあらゆる除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインと組み合わせて、それが 発現される細胞の生存を維持するのに充分な触媒活性；ここにおいて細胞は生存 のためＡＨＡＳを必要とする、および (2) 少なくとも一つの除草剤に野生型ＡＨＡＳよりも耐性である触媒活性； を有することが同定されるまで、ステップ（e）のＡＨＡＳ変異体をコードする ＤＮＡがステップ（c）のＡＨＡＳをコードするＤＮＡとして使用されるようス テップ（c）−（h）を繰り返すこと、 をさらに包含することができる。 更に別の態様において、方法は、 (a) 目標ＡＨＡＳプロテインの三次元構造を誘導するために、同定された除草 剤結合ポケットおよび図１の配列を有する最初のＡＨＡＳ鋳型またはその機能的 同等 物上に目標ＡＨＡＳプロテインを並べること； (b) 変異の目標として、変異が該結合ポケットに対する少なくとも一つの除草 剤の親和性を変えるために、目標ＡＨＡＳプロテイン中の少なくとも一つのアミ ノ酸位置を選沢すること； (c) 該位置で変異を含む変異体ＡＨＡＳをコードする変異ＤＮＡを製造するた め、目標ＡＨＡＳプロテインをコードするＤＮＡを変異すること； (d) 該位置で変異を含む変異体ＡＨＡＳが製造される条件下で第一の細胞に変 異ＤＮＡを発現すること； を包含する。 この方法は、 (e) 第二の細胞で平行して野生型ＡＨＡＳプロテインをコードするＤＮＡ発現 すること； (f) 野生型および変異体ＡＨＡＳプロテインを細胞から精製すること； (g) 除草剤の存在または非存在下、ピルビン酸のアセト乳酸への変換またはア セトヒドロキシ酪酸を生成するピルビン酸とケト酪酸との縮合における触媒活性 について野生型および変異体ＡＨＡＳプロテインを試験すること；および (h) 最初の除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインが、 (1) 少なくとも一つの除草剤の非存在下、 (a) それが発現される細胞の生存を維持するのに単独で充分な触媒活性； または (b) 最初のＡＨＡＳ変異体プロテインと同じか異なっていてもよい細胞中に発 現されるあらゆる除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインと組み合わせて、それが 発現される細胞の生存を維持するのに充分な触媒活性、ここにおいて細胞は生存 のためＡＨＡＳを必要とする、および (2) 少なくとも一つの除草剤に野生型ＡＨＡＳよりもな耐性である触媒活性； を有することが同定されるまでステップ（d）のＡＨＡＳ変異体をコードするＤ ＮＡがステップ（b）のＡＨＡＳをコードするＤＮＡとして使用されるようにス テップ（b）−（g）を繰り返すこと、 をさらに包含することができる。 上記方法の好ましい態様において、除草剤非存在下の触媒活性は、野生型ＡＨ ＡＳの触媒活性の少なくとも５％そして最も好ましくは約20％以上である。この 除草剤がイミダゾリノン除草剤である場合、除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテイ ンは、 (i) 除草剤非存在下において、野生型ＡＨＡＳの触媒活性の約20％よりも高い 触媒活性； (ii) 野生型ＡＨＡＳに較べてイミダゾリノン除草剤の存在に対して比較的よ り耐性である触媒活性、および (iii) イミダゾリノン除草剤に較べてスルホニルウレア除草剤の存在に対して 比較的より感受性である触媒活性； を有すると好ましい。 更に、本発明はアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）変異体プロテイン をコードする単離ＤＮＡを提供するものであって、該変異体プロテインは、 並びにこれらのいずれかと機能的に同等なもの、およびこれらのいずれかとのい ずれかの組み合わせからなるグループから選ばれた図１の配列のアミノ酸残基に おける少なくとも一つの異なるアミノ酸残基による置換； 前者のいずれかと機能的に同等なものおよび前者のいずれかのすべての組み合わ せからなるグループから選ばれた図１の配列の少なくとも一つのアミノ酸残基の 前５個までのアミノ酸残基または後５個までのアミノ酸残基の削除； (iii) 図１の配列のＱ124とＨ150の間での少なくとも一つのアミノ酸残基また は機能的に同等なものの削除； (iv) 図１の配列のＱ124とＨ150の間での少なくとも一つのアミノ酸残基また は機能的に同等なものの付加； (v) 図１の配列のＧ300とＤ324の間での少なくとも一つのアミノ酸残基または 機能的に同等なものの削除； (vi) 図１の配列のＧ300とＤ324の間での少なくとも一つのアミノ酸残基また は機能的に同等なものの付加； (vii) 以上のいずれかとのいずれかの組み合わせ； によって修飾されたＡＨＡＳプロテインからなる。 この番号システムにおいて、残基＃２は、即ち葉緑体ターゲッティングペプチ ドの除去後の成熟プロテインの推定アミノ末端に対応する。 上記修飾は、プロテインの酵素活性を阻害する除草剤、好ましくはイミダゾリ ノン系除草剤の能力を変えることに向けられている。好ましい態様において、該 単離ＤＮＡはＡＨＡＳの除草剤耐性変異体をコードする。また、これらＡＨＡＳ 変異 体をコードするＤＮＡからなるＤＮＡベクター、変異体ＡＨＡＳプロテイン自体 およびＡＨＡＳ変異体を発現するかまたはこれらのベクターを含むインビボまた は細胞培養中で増殖する細胞が提供される。 別の態様において、本発明は一つの細胞または複数の細胞、そして特に例えば 種子のような一つの植物細胞または複数の植物細胞に除草剤耐性を付与するため の方法を提供する。ＡＨＡＳ遺伝子、好ましくはシロイヌナズナＡＨＡＳ遺伝子 をＡＨＡＳの酵素活性を阻害する除草剤の能力を変えるように変異する。変異遺 伝子を適合する発現ベクターにクローン形成し、遺伝子を、それが細胞に除草剤 耐性を付与するのに充分なレベルで発現される条件下で除草剤感受性細胞に形質 転換する。また、本発明に記載の除草剤耐性ＡＨＡＳ遺伝子を含む作物が栽培さ れ、雑草をコントロールするのに効果的量の除草剤で処理されるような雑草管理 の方法が考えられる。 また、ＡＨＡＳ活性を阻害する第一の除草剤を製造するための構造に基づくモ デリング方法が開示される。この方法は、 (a) 目標ＡＨＡＳプロテインの三次元構造を誘導するために、ピルビン酸オキ シダーゼ鋳型またはそのＡＨＡＳモデリング機能同等物上に目標ＡＨＡＳプロテ インを、並べること； (b) 目標ＡＨＡＳプロテインの除草剤結合ポケットの位置、構造またはそれら の組み合わせを誘導するために第二の除草剤を該三次元構造にモデリングするこ と；および (c) 第一の除草剤が生存のためにＡＨＡＳ活性を要求する細胞の生存を破壊す るのに充分にＡＨＡＳ活性を阻害するように、結合ポケットのＡＨＡＳ活性阻害 有効部分と相互作用する、好ましくは結合する、非ペプチド性の第一の除草剤を デザインすること； からなる。 また、ＡＨＡＳ活性を阻害する第一の除草剤を製造するための構造に基づく別 のモデリング方法が含まれる。この方法は、 (a) 目標ＡＨＡＳプロテインの三次元構造を誘導するために、図１の配列を有 するポリペプチドから得られる第一のＡＨＡＳ鋳型またはその機能同等物上に目 標 ＡＨＡＳプロテインを並べること； (b) 目標ＡＨＡＳプロテインの除草剤結合ポケットの位置、構造またはそれら の組み合わせを誘導するために第二の除草剤を該三次元構造にモデリングするこ と；および (c) 第一の除草剤が生存のためにＡＨＡＳ活性を要求する細胞の生存を破壊す るのに充分ＡＨＡＳ活性を阻害するように、結合ポケットのＡＨＡＳ活性阻害有 効部分と相互反応する、好ましくは結合する、非ペプチド性の第一の除草剤をデ ザインすること； からなる。 好ましくは、各方法において第一の除草剤は結合ポケットの官能性基と相互作 用する少なくとも一つの官能性基を含有する。発明の詳細な説明 本発明は、酵素ＡＨＡＳの修飾体およびＡＨＡＳ阻害除草剤の論理的なデザイ ンまたは構造に基づく分子モデリングを含む。これら修飾酵素（ＡＨＡＳ変異体 プロテイン）は除草剤の作用に対して耐性である。また、本発明は、これら変異 体をコードするＤＮＡ、これらＤＮＡを含むベクター、ＡＨＡＳ変異体プロテイ ンおよびこれら変異体を発現する細胞を含む。更に、これら変異体を発現するこ とによって植物に除草剤耐性をつくる方法および雑草管理の方法が提供される。 本発明のＤＮＡおよびＡＨＡＳ変異体は、ＡＨＡＳの構造の分子モデリングに基 づく研究において発見された。ＡＨＡＳ変異体およびＡＨＡＳ阻害除草剤の論理的な構造に基づくデザイン 本発明に記載のＡＨＡＳの除草剤耐性変異体は、植物に除草剤耐性を付与する のに有用であり、ＰＯＸモデル、ＡＨＡＳモデルまたはそれらの機能的に同等な もの、例えばトランスケトラーゼ、カルボリガーゼ、ピルビン酸デカルボキシラ ーゼ、コファクターとしてＦＡＤおよび／またはＴＰＰを結合するプロテインま たはＰＯＸおよび／またはＡＨＡＳに類似する構造的特徴を有する全てのプロテ イン、また図１の配列を有するモデルのようなＡＨＡＳモデルまたは前のモデル からモデル化された変異体を含む図１の配列と機能的に同等なものを用いてデザ インされる。用いることのできるプロテインは、上記に挙げた分子のいずれかに 対して、それらのＣα 炭素において3.5オングストロームよりも小さい平均二乗偏差を有するいかなる プロテインをも含む。ＡＨＡＳを対象とする除草剤を、これらの鋳型から同様に 合わせることができる。ＡＨＡＳアミノ酸配列の機能的に同等なものは、特に例 えば推定結合ポケットのような保存領域において実質的、即ち60−70％の相同性 を有する配列である。相同性の程度は、例えばＧＣＧによるＧＡＰおよびＰＩＬ ＥＵＰのような当該技術において公知のプログラムに基づく簡単な整列によって 決定される。相同性は、同一のアミノ酸または保存的置換を意味する。図１のＡ ＨＡＳプロテイン中の特定のアミノ酸残基の機能的に同等なものは、例えばＧＣ ＧによるＧＡＰおよびＰＩＬＥＵＰのような当該技術において公知のプログラム によって図１の配列と一緒に並べた時、図１のアミノ酸残基と同じ位置にある他 のＡＨＡＳプロテインのアミノ酸残基である。 論理的デザインは、典型的には、(1) 目標ＡＨＡＳプロテインをＰＯＸバック ボーンまたは構造またはＡＨＡＳバックボーンまたは構造と並べること、(2) 任 意に、そしてＡＨＡＳバックボーンが同定された除草剤結合ポケットを有するな らば、目標プロテインの除草剤結合ポケットを局限するために、一つ以上の除草 剤を三次元構造中へモデリング、(3) このモデルに基づく変異の選択、(4) 部位 特異的変異誘発および（5）変異体の発現および精製を含む。追加のステップは 、(6) 酵素の性質の試験および（7）野生型ＡＨＡＳの性質と比べた適当な変異 体の評価を含む。各ステップを以下別々に論述する。 1.分子モデリング 分子モデリング(modelling)（および特にプロテイン相同モデリング）技術は 、指定プロテインの構造および活性の知識を提供することができる。プロテイン の構造モデルは、Ｘ−線結晶学などの実験データから直接に、相同モデリングな どにより間接的に、またはその組合わせにより決定することができる(Ｗhite等 によるＡnnu.Ｒev.Ｂiophys.Ｂiomol.Ｓtruct.23：349,1994参照)。ＡＨＡＳの 三次元構造の解明はポリペプチドに対して除草剤耐性を付与するＡＨＡＳ内の特 定のアミノ酸残基の変異にかかわる理論的スキームの開発の基礎を提供する。 ラクトバシルス プランタラム（Ｌactobacillus plantarum）からの関連ピル ビン酸オキシダーゼ（ＰＯＸ）の既知のＸ−線結晶構造を鋳型として使用するト ウ モロコシＡＨＡＳの構造の分子モデリングは、除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体または ＡＨＡＳ阻害性除草剤のデザインに有用であるＡＨＡＳ構造の三次元モデルを提 供する。この分子モデリング方法は、ＡＨＡＳおよびＰＯＸが多くの生化学的特 徴を共有し、かつまた共通の先祖遺伝子から誘導することができるという利点を 有する(Ｃhang等によるＪ.Ｂacteriol.170：3937,1988)。 ＡＨＡＳ中の高度の交雑種（cross−species）相同性から、本明細書に記載さ れているモデリングされたＡＨＡＳまたはその機能的に同等なものはまた、ＡＨ ＡＳ変異体プロテインをデザインするための鋳型として使用することができる。 相互作用性分子グラフィックおよび配列形成を用いるモデルの一つの誘導は以 下で詳細に説明する。この方法から得られる三次元ＡＨＡＳ構造は酵素の活性部 位およびこれに制限されないが、イミダゾリノン除草剤を包含する除草剤などの 阻害剤の結合部位または結合ポケットのおおよその空間的構成を予想させる。こ のモデルを次いでリファインし、次いで以下でまた説明する生化学的検討に基づ いて再解明する。 プロテイン相同モデリングには、検討するプロテインの一次配列をその結晶構 造が既知である第二のプロテインとともに並べることが必要である。ピルビン酸 オキシダーゼ（ＰＯＸ）はＡＨＡＳ相同モデルの作製に選択される。これはＰＯ ＸとＡＨＡＳとが多くの生化学的特徴を共有しているからである。例えば、ＡＨ ＡＳおよびＰＯＸは両方共に、酵素反応メカニズムの点で、かつまたコファクタ ーおよび金属必須条件の点で共通している。これら両酵素では、その酵素活性に チアミンピロホスフェート(ＴＰＰ)、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ ）および二価カチオンが必要である。ＦＡＤはＰＯＸにおける触媒作用期間中の レドックス反応を媒介する。これは多分、ＡＨＡＳの構造的機能のみを有し、Ｐ ＯＸからＡＨＡＳに進化する際の痕跡残物である。これら酵素は両方ともに、基 質としてピルビン酸を利用し、安定な反応中間体としてヒドロキシエチルチアミ ンピロホスフェートを生成する(Ｓchloss,Ｊ.Ｖ.等によるＩn Ｂiosynthesis of branched chain amino acids,Ｂarak,Ｚ.Ｊ.Ｍ.,Ｃhipman Ｄ.Ｍ.,Ｓchloss,Ｊ .Ｖ.(編集)、ＶＣＨ出版社、Ｗeinheim,ドイツ国、1990)。 さらにまた、ＡＨＡＳ活性はＰＯＸのＮ−末端半分およびＡＨＡＳのＣ−末端 半分 からなるキメラＰＯＸ−ＡＨＡＳプロテインに存在し、これはＰＯＸそれ自体に より示されるＡＨＡＳ活性は低度である。ＡＨＡＳおよびＰＯＸはまた、溶液中 で類似の性質を示す(Ｒisse,Ｂ.等によるＰrotein Ｓci.,1：1699および1710,19 92；Ｓingh,Ｂ.Ｋ.,＆ Ｓchmitt,Ｇ.Ｋ.(1989),ＦＥＢＳ Ｌetters,258：113； Ｓingh,Ｂ.Ｋ.等による(1989)、Ｉn：Ｐrospects for Ａmino Ａcid Ｂiosynthe sis Ｉnhibitorsin Ｃrop Ｐrotection and Ｐharmaceutical Ｃhemistry,(Ｌop ping,Ｌ.Ｇ.,等編集，ＢＣＰＣＭonograph.87頁)。プロテイン濃度を増加させな がら、ＰＯＸおよびＡＨＡＳの両方は、モノマーからダイマーおよびテトラマー への段階的転移を受ける。ＦＡＤ濃度を増加させると、より順位の高いサブユニ ット構築物が誘発される。両プロテインのテトラマー形態は熱による変質および 化学的変質に対して最も安定である。 さらにまた、ラクトバシルス プランタラム（Ｌactobacillus plantarum）か らのＰＯＸの結晶構造は、Ｍuller等により解明されている(Ｓcience,259：965, 1993)。本発明者等は、ＡＨＡＳとＰＯＸとの間の物理的、生化学的および遺伝 学的相同性の程度に部分的に基づいて、ＰＯＸのＸ−線結晶構造がＡＨＡＳ構造 の相同モデリングのための構造上の出発点として使用できることを見出した。 しかしながら、ＡＨＡＳ配列とＬ.プランタラムＰＯＸ配列とは完全コンピュ ーターによる配列形成に充分なほどには類似していない。総合的に、アミノ酸の 約20％のみが同一であり、一方残基の約50％は類似の分類（すなわち、酸、塩基 、芳香族など）に属する。しかしながら、これらの配列を親水性および疎水性残 基の観点から比較すると、その600個のアミノ酸のうちの500個以上が一致する。 ＡＨＡＳの二次構造予測（Ｈolley等によるＰroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ,86 ：152,1989）はＰＯＸの実際の二次構造に相当に類似していることを示した。残 基の70％近くについて、予測ＡＨＡＳ二次構造はＰＯＸのものと一致する。 ＰＯＸモノマーは３つのドメインからなり、これらのドメインはいずれも、α −ヘリックスおよび長いループからなるクロスオーバーによる中央の平行β−シ ートを有する(Ｍuller等によるＳcience,259,965,1993)。このシートの位相幾何 学的形態はドメイン間で相違している、すなわち第一ドメインおよび第三ドメイ ンでは、そのストランドが配列２−１−３−４−６−５でβ−シートに集合され 、一 方第二ドメインのβ−シートでは、その配列は３−２−１−４−５−６と読める 。 コンピューター生成配列形成は、二次構造予測および配列相同性に基づいてい た。ＮeedlemanおよびＷunchによりＪ.Ｍol.Ｂiol.,48：443,1970に記載されて いる慣用の対式配列整列方法が使用された。２種の配列を並べて、配列形成スコ ア(alignment score)を最大にした。この配列形成スコア（相同性スコア）は、 並べられた残基の全ての対にかかわるスコアおよびこの配列中に空間を導入する ための任意のペナルティの合計である。この残基対を並べるためのスコアは、要 約された整数値である。相同性スコアシステムは、一定の残基対の間の逸脱頻度 を見出すことに基づいている。(ＭＯ Ｄayhoff,ＲＭ Ｓchwartz ＆ ＢＣ Ｏrcut t,“Ａtlas of Ｐrotein Ｓequence and Ｓtructure”,vol.5,suppl.3,345〜362 頁、1978)。 この配列形成をさらに、連続する規則的二次構造が保存されるように、空間再 配置によりリファインする。同様の配列形成スキームを評価することによって見 出されたアミノ酸置換を、相互作用性分子グラフィックにより比較した。一定の 部位内のアミノ酸の特定の機能にかかわる大部分の保存性置換を備えた配列を選 び出した。ＰＯＸおよびＡＨＡＳの最終配列は図２に示されている。残基の保存 されたクラスターを、特にＴＰＰ結合部位およびＦＡＤ結合部位について同定し た。この配列は第一ドメイン、第二ドメインの大部分および第三ドメインのほぼ 半分に、ＡＨＡＳとＰＯＸとの間の高度の類似性を示した。不十分に並べられ、 ＰＯＸとＡＨＡＳとでは相違して重畳されていることがある領域の大部分は当該 プロテインの表面に存在するものと予想され、コファクターまたは阻害剤結合に は包含されなかった。変異部位の予測は配列における小さな移動によっては実質 的な影響を受けない。 ＴＰＰ結合残基の大部分はＰＯＸとＡＨＡＳとの間で高度に保存される(例え ば、Ｐ48−Ｇ49−Ｇ50)。若干の場合に、ＴＰＰに近い残基はＰＯＸとＡＨＡＳ との間で相違しているが、高度に保存されている領域内に残る(例えば、残基90 〜110)。他方、ＦＡＤ結合部位は、ほとんど保存されないものと見做される。若 干のＦＡＤ結合性残基は強力に保存されるが(例えば、Ｄ325−1326−Ｄ327−Ｐ3 28)、その他はＰＯＸとＡＨＡＳとの間で明白に相違している(例えば、位置278 〜285からのルー プに存在する残基は相同ではない)。詳細な分析によって、ほとんど保存されな い接触部位の少なくとも一部では、その相互作用がこの側鎖によるよりも、その ペプチド幹鎖により媒介されることが解明された。すなわち、保存はポリペプチ ド重畳に必要なだけであって、アミノ酸配列には不必要である(例えば、残基258 〜263の幹鎖はＦＡＤのリビトール鎖を結合する)。アデニンおよびイソアロキサ ジン結合部位の半分は明白に相違している。 一次構造配列を形成した後に、ＡＨＡＳアミノ酸配列をＰＯＸ鋳型構造体に転 位させることによって相同モデルを構築した。欠落している配座（missing coor dinates）はアミノ酸残基の鋳型を用いて構築し、未確定側鎖を完成させた。こ の分子の小部分のデータバンク調査およびエネルギー最低化（energy−minimiza tion）を採用して、未確定のループ領域の配座を完成した。補因子ＴＰＰおよび ＦＡＤをそれらの結合ポケット中にモデル化した。このモデルを次いで、完全50 0サイクルエネルギー最低化に付した。コンピュターモデリングは全部、Ｓilico n Ｇraphics Ｃo.からのＩndigo Ｅlan Ｒ4000 Ｗorkstationで行った。相互作 用性分子モデリングおよびエネルギー最低化は、Ｍolecular ＳimulationsＩnc. からのＱuanta／ＣＨＡＲＭm 4.0を用いて行った。このステップ中に、配座は安 定する。これは、例えばvan der Ｗaals接触に近似するような格別には好ましく ない相互作用は生起しないことを示した。この結果を図３に模式図として示す。 予測ＡＨＡＳ構造の特徴 上記のモデリングしたＡＨＡＳ構造を検討することによって、プロテインの大 部分が溶剤を許容する大部分の疎水性側鎖とともに、エネルギー的に妥当である バックボーンと重畳していることが判った。β−シートの表面は滑らかであり、 それらに付着しているクロスオーバー領域を収容している。 ダイマー形ＡＨＡＳのモデルは、配列形成スキームに関して定義されているＣ α配座の対を用いて、エネルギー最低化モノマー形ＡＨＡＳの配座の重複および ２つのＰＯＸサブユニットに２つのコピイをスーパーインポーズすることによっ て生成された。長い「ループ」およびα−ヘリックスにより取り囲まれている６ −ストランドからなる平行β−シートコアからなる３つの同様に重畳されている ドメイン中 に、このＡＨＡＳのポリペプチド鎖を重畳する。一方のサブユニットの第一ドメ インが他方のサブユニットのコファクター−結合ドメイン２および３のほぼ近く にあるように集合させる。溶剤で満たされた空間がこの部位でサブユニット間に 残される。このポケットは３つのドメインの合流によって定められており、サブ ユニットのための準備された入口部位である。これはまた、除草剤用の結合部位 であるように用意されている。 この結合ポケットの内面はコファクターにより縁どられている。ＴＰＰのチア ゾールはこのポケットの底部に配置される。ドメイン３はその軸がＴＰＰのピロ ホスフェート向かっている地点である短いα−ヘリックスとともにポケットの内 面に関連し、その双極子モーメントによるホスフェート電荷を補償する。この必 須のヘリックスは、ＴＰＰと密に接触している「逆戻り」(turn)残基であるＧ49 8から出発し、Ｆ507で終わり、スルホニルウレア耐性のための３つの既知の変異 部位、すなわちＶ500、Ｗ503およびＦ507（米国特許第5,013,659号；同第5,141, 870号および同第5,378,824号参照）を含んでいる。ドメイン１では、Ｐ48−Ｓ52 として定められているループ（β−ストランドとα−ヘリックス２との間）がＷ 503に対面し、この部位での変異はイミダゾリノンに対する耐性を付与する。残 基Ｙ47〜Ｇ50はまた、ＴＰＰと接触している。このループはもう一つの逆戻り地 点のＰ184〜Ｑ189に隣接しており、これはドメイン１のβ−シートの最後のスト ランドとβ−ストランドとを連結しており、このβ−ストランドはドメイン２と 連結している。ポケット内では、その入口近くがドメイン２の相補ストレッチ（ complementary stretch）と相互作用するドメイン１の長形領域である。Ｔ96〜 Ｇ100からなる逆戻りはループ125〜129とＴＰＰとの間である。ドメイン３の追 加のストレッチおよび結合ポケットを並べるドメイン２の２つの領域はこのポケ ットの裏側の角にある。ドメイン３の残基572、575、582および583は一側面でポ ケット表面を定めている。このポケット表面の内部の残りの部分はＦＡＤにより およびまたＦＡＤのイソアロキサジン環と接触しているループ、Ｌ278〜Ｇ282に より定められている。 ＡＨＡＳプロテインの構造モデルはまた、除草剤またはＡＨＡＳ阻害剤の理論 的デザインに使用することができる。 2.結合部位中への除草剤のモデリング イマゼタピル(imazethapyr)、すなわちＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標名）の活性 イミダゾリノンを、相互作用性分子グラフィック（図４）および上記ソフトウエ アー(図４)を用いて、その用意されている結合部位中に配置した。「アンカー」 としてＫ185を選択し、カルボキシル基の電荷と相互反応させた。イミダゾリノ ンのＮＨ−ＣＯ単位を配置し、Ｇ50およびＡ51への水素結合を生成させた。これ は、小さいα−ヘリックスのバックボーン上のＶ500に近いイマゼタピルのメチ ル置換基を配置させた。イソプロピル基は、ポケット内面に関与する残基125〜1 35の領域でアミノ酸の疎水性残基により結合させることができる。ピリジン環は Ａ134またはＦ135、Ｆ507およびＷ503間に最も多分、「サンドイッチ」されてい る。Ｗ503はまた、イミダゾリノン環系と相互作用する。 同様の方法で、スルホニルウレア除草剤のモデルを前記イミダゾリノン結合部 位と部分的に重複している部位に作製した。スルホニルウレア結合部位とイミダ ゾリノン結合部位との重複は、競合結合試験および確立された変異データと一致 し、トウモロコシにおける同一の変異、Ｗ503Ｌが両除草剤に対する耐性を付与 することができることを示している。これらのモデルでは、スルホニルウレア除 草剤耐性を付与する既知の変異部位、すなわちＧ50、Ａ51、Ｋ185、Ｖ500、Ｗ50 3、Ｆ507は、結合した除草剤と密に接触している。Ｐ126およびＡ51は疎水性孔 を生成させることによってＫ185側鎖をその場所に保持するのに必要である。特 異的イミダゾリノン耐性部位は、結合領域から離れており、その相同性が重畳に おける変化が予想されるほど不十分である領域に位置する。ＦＡＤ結合部位は明 らかに、この領域でＡＨＡＳとＰＯＸとの間で低い相同性を有する。Ｓ582はト ウモロコシにおける耐性を付与する残基であり、そしてＳ582およびその隣接残 基はこの活性部位ポケットと密に接触している。ＦＡＤおよび残基278〜285を包 含するループ領域は第三ドメインから僅かに離れて移動するものと予想され(図 ４の下流に向かって)、そしてＳ582を含むループは位置499〜507のヘリックスと 位置278〜285のループとの間の空間で重畳されているものと予想される。もう一 つの既知の耐性部位であるＤ305はＦＡＤに近接しており、ドメイン１とドメイ ン２との相互反応を媒介する。Ｍ280は位置498〜507でヘリックス配置に包含さ れるか、または阻害剤結合に直接に包含される。ドメイン１およびドメイン２が 相互に僅かに近接し て移動する場合には、Ｍ208およびＤ305はまた、阻害剤結合に直接に包含される 。 3.変異の選択 ＡＨＡＳの一次配列中に変異を導入するための部位として、特定のアミノ酸残 基を正確に定める。これらのアミノ酸はそれらの位置に基づいて選択される。す なわち、アミノ酸残基位置が修飾された場合には、結合ポケットに対する除草剤 の親和性に関する変更が生じる(すなわち、減退する)。ポケットそれ自体の外側 のアミノ酸残基として結合ポケットに存在する変異位置がポケットの電荷または 形態を変更することができるか否かは必須ではない。変異のための目標部位の選 択は、前記したとおりにして分子モデルを使用して達成される。例えば、上記モ デルに従う場合に、位置128に存在するアルギニン（アミノ酸について１文字コ ードを用いて図１にＲ128として示されている）は、基質−および除草剤−結合 ポケットへの入口近くに位置しており、高度の配座自由性を有し、従って結合ポ ケット中への帯電した除草剤の輸送に関与することができる。従って、この残基 をアラニンにより置換して、その電荷およびその長い疎水性側鎖の両方を分離す る。(生成する変異体をＲ128Ａと命名する)。 この変異は、単純な置換、すなわち野生型配列をいずれか別のアミノ酸で置き 換えることによることができる。別法として、この変異は、１個または２個以上 の、好ましくは５個までのアミノ酸を指定部位から削除するか、または指定部位 に付加することからなることもできる。この付加配列は別種のプロテインに存在 することが既知であるアミノ酸配列からなることができ、あるいは完全合成配列 であることもできる。さらにまた、１つ以上の変異および（または）１形式以上 の変異を単一のポリペプチド中に導入することもできる。 4.部位指向変異 ＡＨＡＳをコードするＤＮＡは、所望の変異が導入されるように操作すること ができる。変異は、例えばＨiguchi,Ｒ.によるＲecombinant ＰＣＲ,Ｉn Ｍ.Ａ. innis等編集、ＰＣＲ Ｐrotocols：Ａ Ｇuide to Ｍethods and Ａpplications, Ａcademic Ｐress,177〜183頁、1990に記載されているような当技術で標準的な 方法を使用して行われる。 5.変異体の発現および精製 変異させたまたは変化させたＡＨＡＳ配列をＤＮＡ発現ベクターにクローン形 成し(例えば、例３参照)、例えば大腸菌（Ｅ.coli）などの適当な細胞で発現さ せる。好ましくは、ＡＨＡＳをコードするＤＮＡを転写調節エレメントに結合さ せ、変異体ＡＨＡＳを縮合プロテイン、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェ ラーゼの一部として発現させ、精製を促進させる(下記例３参照)。この変異体Ａ ＨＡＳを次いで、アフィニテイクロマトグラフイまたは当技術で公知のいずれか その他の適当な方法を使用して精製する。ＡＨＡＳポリペプチドの「精製」は、 当該ポリペプチドを発現させる細胞の別の成分により干渉されることなく、その 酵素活性の測定を可能にする形態でＡＨＡＳポリペプチドを単離することを意味 する。 6.酵素性の評価 この精製した変異体ＡＨＡＳは下記の３つの性質の１つまたは２つ以上につい て試験することができる： (a) ピルビン酸をアセト乳酸に変換することにかかわる特異性または触媒活性 (これは単位／mg純粋ＡＨＡＳとして表わされ、この活性の単位は生成されるア セト乳酸１μmol／時間であると定義される)、あるいはピルビン酸と２−ケト酪 酸とを縮合させてアセトヒドロキシ酪酸を生成することにかかわる特異性または 触媒活性(これは単位／mg純粋ＡＨＡＳとして表わされ、この活性の単位は生成 されるアセトヒドロキシ酪酸１μmol／時間であると定義される)； (b) 除草剤、例えばイミダゾリノンなどによる阻害レベル(これはＩＣ₅₀とし て表わされ、ＩＣ₅₀は酵素活性の50％が阻害される濃度である)；および (c) 選択された除草剤に対する耐性対別種の除草剤に対する耐性の選択性(こ の選択性の指数は野生型酵素に比較したこの変異体のイミダゾリノンに対する集 約耐性（fold resistance）を野生型酵素と比較した同一変異体の別種の除草剤 に対する集約耐性で割り算した数値であると定義される)。この野生型酵素と比 較した除草剤に対する集約耐性は変異体のＩＣ₅₀値を野生型のＩＣ₅₀値により割 り算した数値として表わされる。従って、この選択指数（Ｓ.Ｉ.）は下記式で表 わされる： これらの決定に適する試験方法は、これに制限されないものとして、下記例４ に詳細に記載されている方法を包含する。 7.a.適当な変異体の評価 変異体ＡＨＡＳポリペプチドの酵素としての性質を野生型ＡＨＡＳと比較する 。好ましくは、一定の変異は、インビトロでピルビン酸またはピルビン酸および ２−ケト酪酸に向かう酵素活性を保有する、すなわちピルビン酸をアセト酪酸に 変換するか、またはピルビン酸と２−ケト酪酸とを縮合させて、アセトヒドロキ シ酪酸を生成させるＡＨＡＳ変異体ポリペプチドをもたらし(従って、インビボ での生物学的活性が予想される)、他方で野生型ＡＨＡＳに比較して選択された 除草剤（１種または２種以上）に対して比較的大きい耐性を示す触媒活性を示す 。好ましくは、この変異体ＡＨＡＳは： (i) 少なくとも１種の除草剤の不存在下に、 (a) この変異体が発現された細胞の生存を維持するのに単独で充分な触媒活 性を示し；あるいは (b) 細胞中でまた発現された除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインと組合わ されて触媒活性を示す；この組合わされるプロテインは第一のＡＨＡＳ変異プロ テインと同一であっても、あるいは相違していてもよく、これが発現される細胞 の生存を維持するのに充分なものである；この場合に、当該細胞は生存にＡＨＡ Ｓ活性を要する、および (ii) 野生型ＡＨＡＳに比較して、少なくとも１種の除草剤に対してよりも大 きい耐性を有し、かつまた野生型ＡＨＡＳに比較して除草剤（１種または２種以 上）に対して比較的大きい耐性を有する触媒活性を示す。 従って、いずれか１種の特定のＡＨＡＳ変異体プロテインが細胞の生存の維持 に要する全触媒活性を有する必要はないが、単独でまたは同一ＡＨＡＳ変異体の 追加のコピイの触媒活性および（または）別種のＡＨＡＳ変異体プロテイン（１ 種または２種以上）の触媒活性と組合わされて、その生存にＡＨＡＳ活性を要す る細胞の生存を維持するのに充分な量で若干の触媒活性を有していなければなら ない。例えば、細胞中に変異体をコードする遺伝子の複数のコピイを導入するこ とによって、あるいは当該変異体の生成を増強させるために比較的強力なプロモ ーターを さらに含有する遺伝子を導入することによって、触媒活性を許容される最低レベ ルまで増加させることができる。 より大きい耐性の用語は、野生型ＡＨＡＳ触媒活性が除草剤（１種または２種 以上）によって減少される程度に比較して、変異体の触媒活性が、生じたとして も、低度で除草剤（１種または２種以上）によって減少されることを意味する。 好ましくは、このより大きい耐性を有する変異体ＡＨＡＳは細胞、植物または有 機体の生存を維持するのに充分な触媒性を保有し、これに対して野生型ＡＨＡＳ は細胞、植物または有機体の生存を維持するのに充分な触媒性を保有していない 。 好ましくは、除草剤（１種または２種以上）の不存在下における触媒活性は少 なくとも約５％であり、最も好ましくは除草剤（１種または２種以上）の不存在 下における野生型ＡＨＡＳの触媒活性の約20％よりも大である。最も好適なＡＨ ＡＳ変異体はスルホニルウレアを基剤とする除草剤に対する耐性よりも大きいイ ミダゾリノンに対する耐性を有する。しかしながら、いくつかの用途では、この 選択性は必要ではなく、好ましくないこともある。 イミダゾリノン−耐性ＡＨＡＳ変異体の場合に、このＡＨＡＳ変異体は、好ま しくは、 (i) 当該除草剤の不存在下に、野生型ＡＨＡＳの触媒活性の約20％よりも大 きい触媒活性を有し、 (ii) 野生型ＡＨＡＳに比較して、イミダゾリノン除草剤の存在に対して比 較的より耐性である触媒活性を有し、および (iii) イミダゾリノン除草剤に比較して、スルホニルウレア除草剤の存在下 に比較的大きい感受性を有する触媒活性を有する。 最も好ましい除草剤−耐性ＡＨＡＳ変異体は、約20単位／mgの最低特異活性を示 し、イミダゾリノンによる阻害が最低であるか、または無く、かつまた別種の除 草剤に対するのに比較して、約1.3〜約3000の範囲にわたる選択指数を示す。 理論に拘束されることは望まないが、野生型またはその他の目標ＡＨＡＳプロ テインに対するこの方法を全体的に繰り返し適用することによって、前記で説明 した大きい酵素活性および１種または２種以上の除草剤に対する耐性という望ま しい性質を有するＡＨＡＳ変異体の生成がもたらされるものと信じられる。例え ば、特 定の位置における野生型ＡＨＡＳ配列の指定アミノ酸への変異は、高度の除草剤 耐性を示すが、ピルビン酸またはピルビン酸および２−ケト酪酸に対する酵素活 性を格別には喪失していない変異体をもたらすことができる。上記方法の第二の 用途では、この出発または目標ＡＨＡＳポリペプチドがこの変異体である(野生 型ＡＨＡＳの代わりに)。理論的デザインには、元の変異位置における別のアミ ノ酸の置換および（または）除草剤耐性の保有が予想されるが、また高度の触媒 活性の維持も予想される選択された地点または範囲におけるアミノ酸の付加また は削除が包含される。 除草剤耐性ＡＨＡＳプロテインの構造に基づく理論的デザインはランダム変異 および選択に頼る慣用の手段に優る多くの利点を提供する。例えば、特定のアミ ノ酸の別のアミノ酸による置換がコドン内の１個以上のヌクレオチドの置換を要 する場合には、これがランダムに生じる可能性は実用することができないほど低 い。これに対して、理論的デザイン手段により示唆されている場合には、コドン 内のヌクレオチド配列の２つまたは３つの変更でさえも容易に実施することがで きる。例えば、選択的イミダゾリノン耐性を付与する理論的にデザインした変異 の一つはアルギニンからグルタミンへの変更を要する。アルギニンはＣＧＴ、Ｃ ＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、ＡＧＧによりコードされ、他方グルタミンはＧ ＡＡおよびＧＡＧによりコードされる。アルギニンコドンの中でＧＡから始まる ものはないことから、この変更には隣接ヌクレオチドの二重の置換が必要であり 、この二重置換は、成功を確信しては予想できず、反復できないようなランダム 変異を使用することによっては非常に稀に生じるのみである。変異頻度はランダ ム変異中に増加させることができるが、ヌクレオチド配列における変更は、先行 の部位指向変異の不存在下ではＡＨＡＳ遺伝子全体に等しく生じる可能性がある 。これは酵素活性により干渉される無意味な変異が得られる可能性が増加させる 。同様に、ランダム変異を使用して、触媒活性を維持しながら除草剤耐性を付与 する複数のアミノ酸の置換、削除または置換／削除による変異が見出されること は稀である。除草剤耐性を付与する削除による変異はまた、ランダム変異手段を 使用してはほとんど見込みがない。削除は小領域に制限する必要があり、かつま た酵素活性を保有するためにＡＨＡＳリーディングフレームが保有されるように 、三重に生じさせなければなら ない。 しかしながら、構造に基づく理論的手段の場合には、二重のアミノ酸置換およ び（または）削除による変異が比較的容易に達成され、かつまた正確に目標を定 めることができる。さらにまた、ランダム変異に使用される異なる変異原は特定 の変異型を創造する。例えば、ナトリウムアジドは植物における一点置換変異を 創造し、一方照射は削除を生じさせる傾向を有する。従って、複数の置換／削除 組合わせを達成するためには、２種の変異プロトコールを使用しなければならな い。 さらにまた、除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体を理論的にデザインする本発明の構造 に基づく方法は、除草剤耐性変異体の確実な改良を可能にする。このステップは ランダム変異によっては促進されない。ランダム変異による除草剤耐性のための 変異部位の同定は、あったとしても、変異特性の追加の改良を導く確実な利益を もたらすことはほとんどない。他方、本発明による構造に基づく手段は、構造モ デルにおけるアミノ酸の位置、環境および機能に基づく手段として改良を可能に する。 この繰り返し式改良方法はまた、ＡＨＡＳの３つの重要な性質：耐性のレベル 、耐性の選択性および触媒効力を独立して取り扱うことを可能にする。例えば、 断定的方法で、補償変異をデザインすることができる。特定の変異が酵素活性に 対して有害な作用を有する場合には、第二の補償変異を使用して、活性を保有さ せることができる。一例として、帯電した残基が変異によって導入されるか、ま たは削除される場合に、ドメイン内の元の電荷の変化を第二の変異の導入によっ て補償することができる。酵素活性を保有させるための第二の部位における導入 、削除または置換を行う位置および残基の種類の決定には、本明細書に記載され ているようなモデルから誘導される構造−機能関係にかかわる知見が必要である 。 7.b.非ペプチド除草剤またはＡＨＡＳ阻害剤のテザイン 目標プロテインの活性部位を変更し、活性部位に適合させることができるか、 またはいずれかの位置に結合する化学的実体は当業者に公知の方法によって、例 えばレセプター部位と特異的に相互反応する化合物のデザインを助けるコンピュ ーターデザインプログラムによって、デザインすることができる。 このようなプログラムの例には、ＬＵＤＩ（Ｂiosym Ｔechnologies−Ｓan Ｄ iego, ＣＡ）がある(また、Ｌam等によるＳcience,263：380,1994；Ｔhompson等による Ｊ.Ｍed.Ｃhem.,37：3100,1994を参照することができる)。 結合ポケットおよび特に阻害剤結合に包含されるものとして同定されているア ミノ酸残基を、阻害剤デザイン用のアンカー地点として使用することができる。 部位特異性除草剤のデザインは、農場で、特にＡＨＡＳ遺伝子の変異によって除 草剤耐性を自発的に発現できる雑草の種のコントロールに有利である。 除草剤−耐性ＡＨＡＳ変異体：ＤＮＡ、ベクターおよびポリペプチド 本発明はまた、除草剤−耐性ＡＨＡＳ変異体ポリペプチドをコードする単離Ｄ ＮＡ分子を包含する。本発明によるＡＨＡＳポリペプチドをコードする遺伝子は 、いずれかの種から、好ましくは植物種から誘導することができ、除草剤耐性を 付与する変異は、これらのＡＨＡＳ遺伝子いずれかの中の相当する位置に導入す ることができる。相違するＡＨＡＳ遺伝子の指定のコドン位置の同等性は一次ア ミノ酸配列およびそのプロテインの保存および類似の三次元構造の保有の両方の 関数である。例えば、図５は相違する植物種から誘導されたＡＨＡＳ間の高度の 配列相同性を例示している。これらのＡＨＡＳポリペプチドは少なくとも約60％ 〜約70％の総合的相同性を示す。理論に拘束されることは望まないが、高度の保 存配列を有するポリペプチドの領域では、ポリペプチド鎖形態がまた保存されて いるものと信じられる。従って、分子モデル形成用の種の一つからＡＨＡＳをコ ードする配列を使用して、初期試験および相互作用性改良用の第二の種からのＡ ＨＡＳ遺伝子中に予想どうりの変異を導入することができ、さらに遺伝子転換植 物（transgenic plant）における発現用の追加の第三の植物種から誘導されるＡ ＨＡＳ中に最適化した変異を導入することができる。 一連の態様において、これらのＡＨＡＳ ＤＮＡはＡＨＡＳポリペプチドの、 好ましくは図１のトウモロコシＡＨＡＳポリペプチドの変異体をコードする。こ こで、このポリペプチドは、図１のアミノ酸残基： 前者のいづれかと機能的に同等なものの先行または後続の１種または２種以上 の置換または削除；図１のＱ124とＨ150、あるいはその機能的に同等なものとの 間での挿入または削除；図１のＧ300とＤ324、あるいはその機能的に同等なもの との間での挿入または削除；および前者のいずれかのすべての組合わせにより修 飾することができる。 図１のポリペプチド中に導入するか、または別種のＡＨＡＳ遺伝子における同 等の位置に導入するかにかかわらず、この変異は前記残基のいずれかの先行する ５個までのアミノ酸または後続の５個までのアミノ酸の削除またはいずれか１個 または２個以上の別のアミノ酸の単純置換をもたらすＤＮＡ配列の変更を包含す ることができる。適当なアミノ酸置換には、これらに制限されないものとして、 天然産生アミノ酸が包含される。 別法として、この変異は、１種または２種以上のアミノ酸が上記位置でフレー ムとして付加または削除されるようなＤＮＡ配列の変更を包含することができる 。好ましくは、この付加は約3〜約30ヌクレオチドを包含し、そして削除は約3〜 約30ヌクレオチドを包含する。さらにまた、一回変異したポリペプチドが一つよ りも多い類似のまたは相違する変異を含むことができる。 本発明はまた、ＤＮＡおよび対応するＲＮＡ配列、ならびにセンスおよびアン チ センス配列を包含する。ＡＨＡＳポリペプチドをコードする核酸配列は天然ＡＨ ＡＳ調節配列により側面に配列することができ、あるいはプロモーター、エンハ サー、応答エレメント、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５′ −および３′−非コード領域などの異種配列と組合わせることができる。さらに また、核酸を修飾して、安定性、溶解性、結合親和性および特異性を変えること ができる。一例として、変異体ＡＨＡＳコード配列は選択的にメチル化すること ができる。本発明の核酸配列はまた、直接にまたは間接的に、検知可能なシグナ ルを提供できるラベルにより修飾することができる。ラベルの例には、放射性同 位元素、蛍光分子、ビオチンなどが包含される。 本発明はまた、ＡＨＡＳ変異体をコードする核酸を含有するベクターを提供す る。プラスミドおよび真菌ベクターを包含する多数のベクターが種々の真核ホス トおよび原核ホストにおける発現にかかわり開示されている。有利には、ベクタ ーにはまた、作動するようにＡＨＡＳコードプロテインに結合されているプロモ ーターが包含される。コードされたＡＨＡＳはいずれか適当なベクターおよびホ スト細胞を使用し、本明細書に記載されているか、または引用されている方法、 あるいはまた別段では関連技術で当業者に公知の方法を用いて発現させることが できる。適当なベクターの例には、これらに制限されないものとして、pＢＩＮ に基づくベクター、pＢluescriptベクターおよびpＧＥＭベクターが包含される 。 本発明はまた、変異体除草剤−耐性ＡＨＡＳポリペプチドまたはそのポリペプ チド断片の両方を包含する。上記で説明したように、変異体ＡＨＡＳポリペプチ ドは図１に示されているトウモロコシポリペプチドから、あるいはいずれかの植 物または微生物ＡＨＡＳポリペプチドから、好ましくは植物ＡＨＡＳポリペプチ ドから誘導することができる。これらのポリペプチドはまた、例えばホスホリル 化、スルフェート化、アシル化、グリコシル化、またはその他のプロテイン修飾 により修飾することができる。これらのポリペプチドは植物から分離することが でき、あるいは異種有機体または細胞（これらに制限されないものとして、バク テリア、酵母、昆虫、植物および哺乳動物細胞を包含する）から分離することが できる。これらの細胞中に変異体ＡＨＡＳポリペプチドをコードする遺伝子を導 入し、発現させる。さらにまた、ＡＨＡＳポリペプチドは検知可能なシグナルを 生じることがで きるラベルにより、直接にまたは間接的に、修飾することができ、このようなラ ベルには放射性同位元素、蛍光化合物などが包含される。 化学物質−耐性植物および変異体ＡＨＡＳ遺伝子を含有する植物 本発明は、形質転換原性細胞（trnsgenic cell）を包含し、この細胞には、こ れらに制限されないものとして、種子、有機体および植物が包含される。このよ うな細胞に除草剤−耐性ＡＨＡＳ変異体をコードする遺伝子を導入する。非制限 的例として、適当な受容植物を下記表１に挙げる 形質転換原性植物における変異体ＡＨＡＳポリペプチドの発現は、これらに制 限されないものとして、イミダゾリノン除草剤、例えばイマゼタピル（imazetha pyr） 質転換原性植物の栽培中に使用することを可能にする。 植物中への外来遺伝子の導入方法は当技術で公知である。このような方法の非 制限的例には、アグロバクテリウム（Ａgrobacterium）感染、粒子衝撃、原形質 体のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）処理、原形質体のエレクトロポレーショ ン(electroporation)、マイクロインジェクション(microinjection)、マクロイ ンジェクション(macroinjection)、チラーインジェクション(tiller injection) 、花粉管経路、乾燥種子膨潤、レーザー鑚孔、および電気泳動が包含される。こ れ らの方法は、例えばＢ.Ｊenes等およびＳ.Ｗ.Ｒitchie等によるＩn Ｔransgenic Ｐlants,Ｖol.1,Ｅngineering and Ｕtilization,Ｓ.Ｄ.Ｋung編集、Ｒ.Ｗu,Ａ cademic Ｐress,Ｉnc.,Ｈarcourt ＢraceＪovanovich 1993；およびＭannonen等 によるＣritical Ｒeviews in Ｂiotechnology,14：287〜310,1994に記載されて いる。 好適態様において、変異体ＡＨＡＳをコードするＤＮＡは、抗生物質耐性マー カー遺伝子を含有するＤＮＡベクターにクローン形成し、次いでこの組換えＡＨ ＡＳＤＮＡ含有プラスミドをＴiプラスミド含有アグロバクテリウム ツメファ シエンス(Ａgrobacterium tumefaciens)中に導入する。この「二成分ベクター系 」は、例えば米国特許第4,490,838号およびＡn等によるＰlant Ｍol.Ｂiol.Ｍan ual,Ａ3：1〜19（1988）に記載されている。この形質転換したアグロバクテリウ ムを次いで、受容体植物からの葉ディスクとともに共培養し、植物細胞を感染さ せ、形質転換させる。この形質転換された植物細胞を次いで、新芽の発芽を促進 する再生培地で、先ず形質転換細胞を選択するために適当な抗生物質の存在下に 、次いで除草剤の存在下に、培養する。除草剤−耐性ＡＨＡＳをコードするＤＮ Ａにより充分に形質転換された植物細胞においては、形質転換されていない細胞 からの新芽の発生を阻止するレベルの除草剤が存在しても、新芽の発芽が生じる 。例えば、ポリアミラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析を使用して変異体ＡＨＡＳ ＤＮＡの存在を確認した後に、形質転換した植物を、それらの除草剤噴霧に対す る耐性能力およびそれらの除草剤の存在下における種子発芽および発根抑制およ び増殖にかかわる能力について試験する。 その他の用途 本発明の方法および組成物は除草剤−耐性ＡＨＡＳ変異体の構造に基づく理論 的デザインに使用することができ、この場合に、この変異体は植物中に組み込ん で、植物に対して選択的除草剤耐性を付与することができる。ＡＨＡＳの中間変 異体（例えば、最適に近い特異活性を示すが、高度の耐性および選択性を示すか 、またはその逆である変異体）は、適度の特異的活性を保有し、かつまた高度の 耐性および選択性を有する第二世代ＡＨＡＳ変異体をデザインするための鋳型と して有用である。 除草剤耐性ＡＨＡＳ遺伝子は、単一のまたは複数のコピーで作物種を形質転換 さ せることができる。除草剤に対して減少された感受性を有する作物種の遺伝子エ ンジニアリングは： (1) イミダゾリノン除草剤などの特異的有効な、環境に優しい除草剤の適用範 囲および柔軟性を増大させることができ； (2) これらの除草剤の市場価値を高めることができ； (3) 除草剤耐性作物種に対する除草剤の効果的な使用により作物栽培地におけ る雑草による抑圧を減少させ、収穫量を対応して増加させることができ； (4) 除草剤耐性植物の種子の販売高を増加させることができ； (5) 以前の栽培で使用された除草剤の持ち込みからの作物の打撃に対する抵抗 性を増大させることができ； (6) 有害な風土条件による除草剤特性の変化に対する感受性を減少させること ができ；かつまた (7) 不均一に、または誤って施用された除草剤に対する寛容性を増大させるこ とができる。 一例として、形質転換原性ＡＨＡＳ変異体プロテインを含有する植物を栽培す ることができる。この作物をＡＨＡＳ変異体形質転換原性植物が耐性である除草 剤の雑草制御有効量で処理することによって、栽培される作物に有害に作用する ことなく、作物の雑草制御を生じさせることができる。 除草剤−耐性ＡＨＡＳ変異体をコードする前記ＤＮＡベクターを使用してまた 、ＡＨＡＳ変異体の発現がベクターによる細胞の形質転換にかかわる選択性のマ ーカーを提供することができる。対象受容細胞は培養物であることができ、また はその元のものであることができ、またＡＨＡＳ変異体遺伝子は単独でまたは別 種の選択可能なマーカーと組合わせて使用することができる。唯一の要件は、受 容細胞が同種除草剤の細胞毒性作用に対して感受性であることである。この態様 は、比較的安価であり、かつまた例えばイミダゾリノン基剤除草剤の毒性が欠落 しているという利点をもたらし、ＤＮＡ媒介形質転換を必要とする全ての系に適 用することができる。好ましい態様の例示 以下の実施例により本発明を説明するが、これらに限定されるものではない。 実施例１：除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体のデザイン 詳しく上述したモデルの提案された除草剤結合部位に近接する残基が変異誘発 用に、除草剤結合能の減少した活性ＡＨＡＳポリペプチドをデザインするため選 択された。ポケット表面の各部位は、コファクターおよび除草剤の他にポケット の他の残基との相互作用の可能性があるものと考えた。例えば、正に帯電した残 基の付加は、結合部位内の電荷分布に影響し、負に帯電した除草剤の結合親和性 の消失をもたらすものと期待される。 三つの残基が変異誘発に最も有用なターゲットとして決定された。 (1) Ｆ135はＦＡＤのイソアロキサチン環および除草剤の芳香環の両方と相互 作用すると考えられた。結合ポケットにもっと帯電した残基を導入する戦略にし たがって、この残基をアルギニンに変えた。 (2) Ｍ53はヘリックス498−507と接触している。このヘリックスは、公知の除 草剤耐性変異部位を含み、ＴＰＰ結合とも関わっている。更に、53位でグルタミ ン酸の置換は、Ｋ185との相互作用を有利にし、イマゼタピルのカルボキシル基 に対するＫ185の親和性を減少させるものと考えられた。 (3) Ｒ128はポケットの入口の近かくに位置し、それが結合ポケットへの帯電 した除草剤の最初の輸送に関与するものと考えられた。この残基は、その電荷と 長い疎水性鎖とを除くためにアラニンに変換された。 実施例２：除草剤耐性変異体を製造するための部位特異的変異誘発 アラビドプシスＡＨＡＳ遺伝子をpＧＥＸ−2Ｔベクター（Ｐharmacia）中のグ ルタチオンＳ−トランスフェラーゼ遺伝子のコード領域の３′末端にインフレー ム(in−frame)挿入した。このようにしたベクターの構築は、発現されるグルタ チオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）／ＡＨＡＳ融合プロテインの結合部に ６個のアミノ酸のトロンビン認識配列を保持していた。発現された融合プロテイ ンのトロンビン消化は、トロンビン認識部位から得られるＮ末端グリシン残基を 有する推定トランジットペプチドプロセシング部位のトランジットペプチドの末 端に、Ｎ末端出発位置を有するＡＨＡＳを与える。切り出されたＡＨＡＳプロテ インの最終アミノ末端はＧly−Ｓer−Ｓer−Ｉle−Ｓerからなる。部位特異的変 異誘発はこのベクターのＡＨＡＳ遺伝子に導入された。 部位特異的変異誘発は、樋口のＰＣＲ法（Ｒecombinant ＰＣＲ.Ｉn ＭＡ Ｉn nis,et al.ＰＣＲ Ｐrotocols: Ａ Ｇuide to Ｍethods and Ａpplications,Ａc ademic Ｐress,Ｓan Ｄiego,pp.177−183,1990）にしたがってつくられた。二つ のＰＣＲ産生物で、その各々が変異部位が重なっているものが増幅された。重な り領域のプライマーは変異を含んでいた。重複ＰＣＲ増幅断片を組み合わせ、変 成させ、再連結させて、中断（recessed）３′末端を有するヘテロ二本鎖産生物 を製造した。中断３′末端を所望の変異を含む二つの重複ＰＣＲ産生物の和であ る断片を製造するためにＴaq ＤＮＡポリメラーゼによって伸ばした。このフラ グメントを二つの外側プライマーだけと引き続いて再増幅すると全長の産生物に 富む結果となった。変異を含む産生物をpＧＥＸ−2Ｔベクター中のアラビドプシ スＡＨＡＳ遺伝子に再び導入した。 実施例３：ＡＨＡＳ変異体の発現と精製 Ａ）方法 トウモロコシ野生型ＡＨＡＳ遺伝子(ベクター名pＡＣ751)、アラビドプシスＳ er653Ａsn変異体またはアラビドプシスＩle401Ｐhe変異体を含むpＧＥＸ−2Ｔベ クターで形質転換された大腸菌（ＤＨ5α）細胞をアンピシリン50μg／mＬを含 むＬＢ培養液中で一夜増殖させた。大腸菌の一夜培養物をアンピシリン50μg／m ＬおよびアンチホームＡ（0.1 v／v％）のＬＢ1リットルに１：10で希釈した。 培養物を37°ＣでＯＤ⁶⁰⁰が約0.8になるまで振りながら培養した。イソプロピル チオガラクトース（ＩＰＴＧ）を最終濃度が1mＭになるよう加え、培養物を３時 間以上培養した。 細胞をＪＡ−10ローターで10分間8670xgで遠心することより集め、ＭＴＰＢＳ (16mＭのＮa₂ＨＰＯ₄、4mＭのＮaＨ₂ＰＯ₄、150mＭのＮaＣl、pＨ7.3)中に元の 培養量の１／100にして再懸濁した。トリトンＸ−100およびリソザイムを各々最 終濃度が1v／v％および100μg／mＬになるよう加えた。細胞を30°Ｃで15分間培 養し、氷で4°Ｃに冷やし、ミクロチッププローブの付いたＢranson Ｓonifier 細胞破砕器を用いてレベル７で10秒超音波をかけ破砕した。細胞を含まぬ抽出物 を35,000xgで4°Ｃ、10分間遠心した。上清をデカンテーションし、遠心工程を 繰り返した。 発現された融合プロテインの精製をＳmithおよびＪohnsonの方法（Ｇene 67： 31−40,1988）を修飾しておこなった。その上清を室温に温め、ＭＴＰＢＳ中で 平衡にされたグルタチオン−アガロースビーズ（硫黄結合、Ｓigma）の2mＬカラ ムに通した。次いで、カラムをＭＴＰＢＳを用いて流出液のＡ²⁸⁰がＭＴＰＢＳ のそれと同じになるまで室温で洗浄した。次いで、融合プロテインをトリス（Ｔ ris）塩酸(50mＭ、pＨ8.0)中の還元グルタチオン（5mＭ）を含む溶液で溶出した 。溶出融合プロテインを約30ＮＩＨ単位のトロンビンを用いて処理し、クエン酸 （50mＭ、pＨ6.5）およびＮaＣl（150mＭ）に対して透析した。 融合プロテインを室温で一夜消化した。消化サンプルをＭＴＰＢＳに対して透 析し、遊離したグルタチオントランスフェラーゼプロテインを除くためＭＴＰＢ Ｓ中で平衡にされたグルタチオン−アガロースカラムに二度通した。カラムに吸 着しないプロテインフラクションを集め、ＹＭ10フィルター（Ａmicon）で限外 ろ過して濃縮した。濃縮サンプルをゲルろ過緩衝液（50mＭのＨＥＰＥＳ、150m ＭのＮaＣl、pＨ7.0）中で平衡にされたセファクリルＳ−100ゲルろ過カラム（1 .5×95cm）にかける。2mＬフラクションを0.14mＬ／分の流速で集めた。酵素の 安定性は、0.02％のナトリウムアジドを添加し、2mＭのチアミンピロフォスフェ ートおよび100μＭのフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）の存在または 非存在下に、ゲルろ過緩衝液中で4°Ｃで保存して試験された。 Ｂ）結果 ＧＴＳ遺伝子でダウンストリーム且つイン−フレームに融合された野生型ＡＨ ＡＳ遺伝子を含むpＡＣ751プラスミドによって形質転換された大腸菌がＩＰＴＧ で形質転換されると91kＤのプロテインが発現された。この91kＤのプロテインは 、ＧＳＴ／ＡＨＡＳ融合プロテインの予想された分子量（26kＤと65kＤの和）を 示した。ＤＨ5α／pＡＣ751の細胞を含まぬ抽出物をグルタチオン−アガロース 親和性ゲルに通し、洗い、そして遊離グルタチオンで溶出すると、91kＤのプロ テインに富んだ製造物が得られ(図６、レーンＣ)。ＧＳＴとＡＨＡＳの結合部に 設計された６個のアミノ酸のトロンビン認識部位をトロンビンでうまく切断した (図６、レーンＤ)。切断された融合プロテインは、予想された26kＤのＧＳＴプ ロテインおよび65kＤのトウモロコシＡＨＡＳプロテインからなっていた。トウ モロコシＡＨＡＳをＧＳＴ を除くためグルタチオン−アガロース親和性カラムに二度通して精製し、トロン ビンを除くため最後のセファクリルＳ−100ゲルろ過工程に付した(図６、レーン Ｅ)。65kＤのプロテインは、ウエスタンブロット上トウモロコシＡＨＡＳペプチ ドに対するモノクロナル抗体によって認識される。 精製された野生型トウモロコシＡＨＡＳをエレクトロスプレイ質量スペクトル によって分析し、64,996ダルトンの分子量を有することを決定した(データは示 されていない)。pＧＥＸ−2Ｔベクターに挿入された遺伝子の推定アミノ酸配列 から計算される予想質量は65,058である。実際に測定された質量と予想質量との 間で0.096％の誤差は質量スペクトルの調節変動の範囲内であった。二つの質量 決定が近似していることは、発現ベクターの構築の際間違って混入したヌクレオ チドが無いこと、分子量に大きな変化をおこすようなプロテインに対する翻訳後 の修飾も無いことを示唆する。更に、精製酵素の製造物にみかけのピークがない ことは、サンプルに混ざりがないことを示した。 実施例４：ＡＨＡＳ変異体の酵素特性 大腸菌で製造される野生型および変異体ＡＨＡＳの酵素特性をＳinghらの方法 (Ａnal.Ｂiochem.171：173−179,1988)を修飾して以下のように測定した。即ち 、 1Ｘ ＡＨＡＳ試験緩衝液（50mＭのＨＥＰＥＳ、ＰＨ7.0、100mＭのピルビン酸 、10mＭのＭgＣl₂、1mＭのチアミンピロフォスフェートおよび50μＭのフラビン アデニンジヌクレオチド(ＦＡＤ)）を含む反応混合物を酵素の2Ｘ試験緩衝液に 希釈するか、1Ｘ ＡＨＡＳ試験緩衝液に濃縮された酵素を加えるかして得た。イ マゼタピルおよび関連対照を含む全ての試験は、50％ＤＭＳＯ溶液として試験混 合物にイマゼタピルを添加するため最終５％濃度のＤＭＳＯを含有した。試験を ミクロタイタープレート中37°Ｃ、最終容量250μＬで行った。反応を60分間行 わせた後、アセト酪酸の蓄積をＳinghらによって記載されているように比色測定 した(Ａnal.Ｂiochem.171：173−179,1988)。 上記実施例３に記載されたpＡＣ751から発現され精製されたトウモロコシＡＨ ＡＳはピルビン酸のアセト乳酸への変換に活性である。完全なＡＨＡＳ活性は、 試験メジウム中のコファクターであるＦＡＤおよびＴＰＰの存在による。ＦＡＤ のみを試験 メジウムに加えたのでは活性は見られなかった。ＴＰＰだけと一緒にした精製酵 素の活性は、共にＦＡＤおよびＴＰＰの存在下に検出される活性の１％にも達し なかった。通常、植物の粗抽出物に存在するＡＨＡＳは、特に基質およびコファ クターの非存在下に非常に不安定である。これと対照的に細菌発現システムから の精製ＡＨＡＳは、50mＭのＨＥＰＥＳ ＰＨ7.0、150mＭのＮaＣl、0.02％ＮaＮ₃ 中、ＦＡＤおよびＴＰＰの存在または非存在にかかわらず4°Ｃで一ヵ月貯蔵し て触媒活性を失わなかった。更に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに溶かした時に、これ ら貯蔵物から分解物は検出されなかった。 野生型ＡＨＡＳとＭ124Ｅ、Ｒ199ＡおよびＦ206Ｒ変異体の比活性を下記表２ に示す。図５の配列から決定されるように、アラビドプシスＡＨＡＳのＭ124Ｅ 変異はトウモロコシＭ53Ｅ変異と同等であり、アラビドプシスのＲ199Ａ変異は トウモロコシＲ128Ａと同等であり、アラビドプシスのＦ206Ｒ変異はトウモロコ シＦ135Ｒと同等である。トウモロコシＡＨＡＳ構造モデルにおいてデザインさ れた変異を双子葉植物のアラビドプシスＡＨＡＳ遺伝子中の等価アミノ酸を同定 するために使用し、アラビドプシスＡＨＡＳ遺伝子中に挿入および試験した。双 子葉植物のアラビドプシスＡＨＡＳ遺伝子中へ論理的にデザインされた除草剤変 異のこの翻訳と挿入は、双子葉植物種の植物における除草剤耐性の評価を促進す ることができる。 Ｒ199Ａ変異は、イマゼタピルに対し有意なレベルの耐性を示す（図７）と同 時に、高いレベルんの触媒活性を保っている(表２)。特に、この変異体はスルホ ニルウレアに対し完全な感受性を保っている(図８)。したがって、この変異体は 高い比活性と選択的な除草剤耐性の基準を満たしている。対照的に、Ｍ124Ｅ置 換はイマゼタピルに対しほぼ完全な耐性をもたらすが、またひどく減少した触媒 活性 を示した(表２)。イミダゾリノン耐性に比較して、この変異体はスルホニルウレ アに対し大きな感受性を示す（図８）ことから、この残基は選択的耐性を付与す る変異を与えるよい候補であることを示唆している。グルタミン酸以外のアミノ 酸の置換が触媒活性を維持するのに役立っている。Ｆ206Ｅ置換はＭ124Ｅ変異体 について観察された結果と類似したものを与えたが、耐性の選択性に欠けた。 実施例５：論理的デザインアプローチによるＡＨＡＳ除草剤耐性変異体の反復改 良 上記実施例４に記載したようにＡＨＡＳの残基124をＭetからＧluに変えると 、イミダゾリノン耐性が付与されたが、酵素活性は野生型の値の9.2％に減少さ れた。上述のトウモロコシＡＨＡＳ構造のモデルは、Ｍet53（アラビドプシスＭ et124残基と同等）が別のサブユニットから得られるα−ヘリックスの表面上の Ｍet53に近接している一連の疎水性残基と相互作用する。したがって、Ｍet53と ヘリックス上の残基との疎水性相互作用がサブユニット／サブユニット会合およ び活性部位のコンフォメーションを安定している。疎水性Ｍetを帯電したグルタ ミン酸残基で置換することは多分サブユニット間の疎水性相互作用を不安定にし 、触媒活性の喪失をもたらす。 この構造／機能解析に基づいて、元のアラビドプシスＭet124Ｇlu（トウモロ コシＭet53Ｇluと同等）変異酵素の活性を、次いでこの位置でより疎水性なアミ ノ酸（Ｉle）を置換することによって反復的に改善した。Ｉle側鎖の疎水性は、 野生型のレベルまで活性を戻すことになった（比活性102、野生型活性の102％と 同等）が、Ｉle側鎖のより大きなかさばりがイミダゾリノン耐性の有意なレベル を依然として維持できた(図９)。 比較すると、この位置でヒスチジン残基の置換は、野生型活性の42.6％と同等 耐性を示した(図10)。 実施例６：論理的デザインアプローチを用いＡＨＡＳ除草剤耐性変異体の反復改 良 本発明の方法を用いる反復調整の別の例はＡrg128Ａla変異体を含む。トウモ ロコシＡＨＡＳの構造モデルは除草剤結合ポケットの縁にあるＡrg128残基が帯 電した基質と除草剤とを除草剤結合ポケットと活性部位に運ぶのに寄与する。Ａ rg128残基は、ＡＨＡＳの反応メカニズムにおける最初のピルビン酸分子を結合 するＴＰＰ 部分から離れており、アラビドプシスＡＨＡＳＡrg199（トウモロコシＡrg128と 同等）のアラニンへの置換は酵素の触媒活性に余り影響しなかった理由を説明し ている。構造モデルは、もっとはげしい変化をこの位置で触媒活性の高いレベル を維持しながら耐性のレベルを上げるためすることができることを示した。これ に基づいて、変異の反復改善は、正に帯電したアルギニン残基を負に帯電したグ ルタミン酸残基で置換してなされた。このようにして変異された酵素は、高い活 性 されたレベルの耐性を有していた(図11)。 実施例７：除草剤耐性変異体の構造に基づく論理的デザインにおける各種の種か ら得られるＡＨＡＳ交換性 ＡＨＡＳの三次元構造の構造モデルを上述したようにトウモロコシから得られ た単子葉植物ＡＨＡＳ配列で構築する。アラビドプシスのような双子葉植物種か ら得られるＡＨＡＳに変異を導入するため、単子葉植物種および双子葉植物種か ら得られるＡＨＡＳ配列をＧＡＰおよびＰＩＬＥＵＰプログラム（Ｇenetics Ｃ omputer Ｇroup,575 ＳequenceＤrive，Ｍadison,ＷＩ 53711）を用いて並べる 。同等の位置をコンピュター産出の並びから決定する。次いで、変異を上述のよ うに双子葉植物ＡＨＡＳ遺伝子に導入する。大腸菌の変異ＡＨＡＳプロテインの 発現および生化学的性質の評価（即ち、比活性および除草剤耐性）に続いて、変 異遺伝子を上記の植物形質転換法によって双子葉植物に導入する。 実施例８：論理的にデザインされたＡＨＡＳ遺伝子を用いる形質転換による除草 剤耐性植物の製造 ＤＮＡ構築： 大腸菌発現ベクター内に含まれる論理的にデザインされたＡＨＡＳ変異体遺伝 子を、アラビドプシスＡＨＡＳ遺伝子に等価制限フラグメントを置き換えるため のＤＮＡ制限フラグメントの元として使用した。この遺伝子は、アラビドプシス ＡＨＡＳプロモター、アラビドプシスＡＨＡＳ終結配列および５′−と３′−隣 接ＤＮＡを含む5.5kbの遺伝子ＤＮＡフラグメント中に存在する。適切な変異の 存在を確認するために変異部位を通したＤＮＡ塩基配列の配列形成をした後、各 プラスミドからの全5.5kbフラグメントをpＢＩＮに基づく植物形質転換ベクター （Ｍogen, Ｌeiden,Ｎetherlands）に挿入した。また、植物形質転換ベクターは、35Ｓカリ フラワーモザイクウイルスプロモターによって駆動されるネオマイシンホスホト ランスフェラーゼII（nptＩＩ）カナマイシン耐性遺伝子を含む。最終ベクター 構築を図12に示す。Ｍet124Ｉle、Ｍet124ＨisおよびＡrg199Ｇlu変異（図１に 示されたトウモロコシＡＨＡＳ配列におけるＭet53Ｉle、Ｍet53ＨisおよびＡrg 128Ｇlu変異に対応）を有するアラビドプシスＡＨＡＳ遺伝子を含むベクターに 各々pＪＫ002、pＪＫ003およびpＪＫ004のラベルを付けた。 これらのベクターの各々を、Ａn et al.Ｐlant Ｍol.Ｂiol.Ｍanual 43：1−1 9(1988)に記載された形質転換方法を用いてアグロバクテリウム ツメファシエ ンス株ＬＢＡ4404に形質転換した(Ｒ＆Ｄ Ｌife Ｔechnologies,Ｇaithersburg, ＭＤ)。 植物形質転換： タバコ属cv.Ｗisconsin 38の葉の断片形質転換をＨorschら（Ｓcience,227：1 229−1231,1985）によって記載されているものを少し変えて行った。葉の断片を 無菌状態で成長した植物から切り出し、Ｍurashige Ｓkoog培地（Ｓigma Ｃhemi cal Ｃo.,Ｓt.Ｌouis,ＭＯ）で、プラスミドpＪＫ002、pＪＫ003またはpＪＫ004 を含むアグロバクテリウム ツメファシエンスと共に２−３日間、25°Ｃ暗所で ひっくり返して培養した。この断片を乾式ブロットし、ベンジルアデニン(1ＭＧ ／Ｌ)、１−ナフチル酢酸(0.1mg／Ｌ)、カナマイシン（500mg／Ｌ）およびセホ タキシム（500mg／Ｌ）（全てＳigmaから入手）を含むＢ5ビタミンとともに再生 Ｍurashige Ｓkoog培地に移した。 初めに、形質転換体を形質転換ベクター中に存在するnptＩＩ遺伝子によって 付与されるカナマイシン耐性によって選択した。葉の断片から得られる苗条を切 り出し、セホタキシムおよびカナマイシンを含有する新鮮なＭurashige Ｓkoog 培地に置いた。 インビボ除草剤耐性 カナマイシン耐性タバコ苗条をイマゼタピル（0.25μＭ）を含む培地に移した 。この濃度のイミダゾリノン除草剤で、非形質転換タバコ苗条（内因性野生型Ａ ＨＡＳを含有）は、根形成を開始できなかった。対照的に、根形成および成長が 各変異ＡＨＡＳ遺伝子で形質転換されたタバコ苗条から観察された。Ｍet124Ｉl eおよび Ａrg199Ｇlu変異遺伝子で形質転換された苗条から出た根を野生型と共に図13に 示す。更に、Ｍet124ＩleおよびＡrg199Ｇlu変異遺伝子で形質転換された植物は 、イマゼタピルの農場レート（100g／ヘクタール）の二倍散布に対して耐性であ った(図13)。除草剤の存在下の非形質転換植物に対する形質転換植物の根成長の パターンおよび除草剤散布後の様子は、論理的にデザインされた除草剤耐性遺伝 子の発現がインビボ除草剤耐性を付与していることを示唆している。 除草剤耐性タバコ中の論理的にデザインされた遺伝子の検出 ゲノムＤＮＡをＡＨＡＳ形質転換タバコ植物から単離し、アラビドプシスＡＨ ＡＳ変異遺伝子の存在をＰＣＲ分析で証明した。アラビドプシスＡＨＡＳ遺伝子 のヌクレオチド配列と二つのタバコＡＨＡＳ遺伝子のヌクレオチド配列との間の 差異を、タバコゲノムＤＮＡバックグラウンドのアラビドプシス遺伝子のみを増 幅するＰＣＲプライマーのデザインに用いた。論理的にデザインされた除草剤耐 性遺伝子を検出した。これは除草剤耐性植物の大多数において適当なサイズのＤ ＮＡフラグメントの増幅によって示されている。非形質転換タバコ植物からＰＣ Ｒシグナルは見られなかった。 形質転換ＡＨＡＳ遺伝子の分離 形質転換植物中の論理的にデザインされたＡＨＡＳ遺伝子の分離を調べるため 、 で含むホルモンの入っていないＭurashige Ｓkoog培地に置いた。得られた実生 を除草剤に対する耐性または感受性に対して目で点数をつけた。 タバコ植物は二倍体であるから、自家授粉植物の子孫は耐性３に感受性１の比 に分かれることが期待され、耐性ＡＨＡＳ遺伝子に対する一つの実生ホモ接合体 、耐性ＡＨＡＳ遺伝子に対する二つの実生ヘテロ接合および耐性ＡＨＡＳ遺伝子 を欠く一つの実生の存在を示す。 結果は、耐性ＡＨＡＳ遺伝子が予想された３：１の比に分かれることを示し、 除草剤耐性が論理的にデザインされたＡＨＡＳ遺伝子の一つの支配的なコピーに よって付与されるという結論を支持している。 これらの結果は、除草剤耐性ＡＨＡＳ遺伝子の論理的にデザインをインビボで 除草剤耐性の成長を示す植物の製造に使用できることを示している。 実施例９：論理的にデザインされたＡＨＡＳ遺伝子による形質転換によって異な る除草剤に対する交差耐性植物の製造 上記実施例８の論理的にデザインされたＡＨＡＳ遺伝子を用いて形質転換され たタバコ植物を、また別の除草剤ＣＬ299,263（イマザモックスとしても公知） に対する交差耐性について試験した。発芽試験をＣＬ299,263（2.5μＭ）の存在 または非存在下、Ｍet124Ｉle、Ｍet124ＨisおよびＡrg199Ｇluのアラビドプシ スＡＨＡＳ変異体遺伝子を含む一次形質転換体から収穫された種子について行っ た(図15)。この濃度の除草剤は、野生型タバコ植物の激しい発育阻害と脱色を生 じさせる。Ｍet124ＨisＡＨＡＳ遺伝子で形質転換されたタバコ植物は、最大レ ベルの耐性を示した(図15)。Ａrg199Ｇlu形質転換体は中間レベルの耐性を示し たが、Ｍet124Ｉleはほとんど耐性を示さなかった(図15)。 上記のすべての特許、出願、論文、出版物および試験方法はここに引用して組 み入れる。 本発明の多くの変更が上記の詳細な記述のもと当業者に示唆を与えるであろう 。そのような明らかな変更は、添付されている特許請求項の全ての意図された範 囲に入るものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 クウァフ，ジェ−グ アメリカ合衆国 ペンシルヴァニア州 19030、フェアレス ヒルズ、ヨークシャ ー レーン 203 (72)発明者 ストックトン，ジェラルド ダブリュ. アメリカ合衆国 ペンシルヴァニア州 19067、ヤードレイ、サウス ミルトン ドライブ 391

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインの製造に対する構造に基づくモデリン グ方法であって、 (a) 目標ＡＨＡＳプロテインを、ピルビン酸オキシダーゼ鋳型またはそのＡＨ ＡＳモデリング同等物上に、該目標ＡＨＡＳプロテインの三次元構造を誘導する ために並べること； (b) 該目標ＡＨＡＳプロテインの除草剤結合ポケットを局在させるために一つ 以上の除草剤を該三次元構造にモデリングすること； (c) 変異の目標として、該変異が該結合ポケットに対して少なくとも一つの除 草剤の親和性を変えるために、該目標ＡＨＡＳプロテイン中のアミノ酸位置を選 沢すること； (d) 該位置で該変異を含む変異体ＡＨＡＳをコードする変異ＤＮＡを製造する ため、該目標ＡＨＡＳプロテインをコードするＤＮＡを変異すること、そして (e) 該位置で該変異を含む該変異体ＡＨＡＳが製造される条件下に、第一の細 胞中で該変異ＤＮＡを発現すること； からなる前記方法。 ２．請求項１において定義される、構造に基づくモデリング方法であって、 (f) 第二の細胞に対応する野生型ＡＨＡＳプロテインをコードするＤＮＡ発現 すること； (g) 該野生型および該変異体ＡＨＡＳプロテインを該細胞から精製すること； (h) 少なくとも一つの該除草剤の存在または非存在下、ピルビン酸のアセト乳 酸への変換またはアセトヒドロキシ酪酸を生成するピルビン酸とケト酪酸との縮 合における触媒活性について該野生型および該変異体ＡＨＡＳプロテインを試験 すること；および (i) 第一の除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインが、 (1) 少なくとも一つの該除草剤の非存在下、 (a)それが発現される細胞の生存を維持するのに単独で充分な触媒活性 ；または (b)第一の該ＡＨＡＳ変異体プロテインと同じか異なっていてもよい該 細 胞中にも発現されるあらゆる除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインと組み合わせ て、それが発現される細胞の生存を維持するのに充分な触媒活性；ここにおいて 該細胞は生存のためＡＨＡＳを必要とする、および (2) 少なくとも一つの除草剤に対して野生型ＡＨＡＳよりも耐性である触媒 活性； を有することが同定されるまで、ステップ（e）の該変異体をコードする該ＤＮ Ａがステップ（c）のＡＨＡＳをコードするＤＮＡとして使用されるように、ス テップ（c）−（h）を繰り返すこと、 をさらに包含する前記方法。 ３．該ＡＨＡＳモデリングと同等なものがトランスケトラーゼ、カルボリガーゼ およびピルビン酸デカルボキシラーゼからなるグループから選択されることを特 徴とする、請求項１において定義される、構造に基づくモデリング方法。 ４．少なくとも一つ以上の該除草剤の非存在下の該触媒活性は、少なくとも一つ の該除草剤の上記条件下の該野生型ＡＨＡＳの触媒活性の約20％以上であること を特徴とする、請求項２において定義される、構造に基づくモデリング方法。 ５．該除草剤がイミダゾリノン除草剤であり、該第一の除草剤耐性ＡＨＡＳ変異 体プロテインは、 (1) 該除草剤非存在下において、該野生型ＡＨＡＳの触媒活性の約20％よりも 高い触媒活性； (2) 野生型ＡＨＡＳに較べてイミダゾリノン除草剤の存在に対して比較的より 耐性である触媒活性；および (3) イミダゾリノン除草剤に較べてスルホニルウレア除草剤の存在に対して比 較的より感受性である触媒活性； を有することを特徴とする、請求項４において定義される、構造に基づくモデリ ング方法。 ６．該除草剤がイミダゾリノン類、スルホニルウレア類、トリアゾロピリミジン スルホンアミド類、ピリミジルオキシ安息香酸類、スルファモイルウレア類、ス ルホカルボキサミド類およびそれらの組み合わせから選択されることを特徴とす る、請求項１において定義される、構造に基づくモデリング方法。 ７．該目標ＡＨＡＳプロテインがシロイヌナズナ（Ａrabidopsis thaliana）か ら誘導されることを特徴とする、請求項１において定義される、構造に基づくモ デリング方法。 ８．該第一の細胞が大腸菌（Ｅ．coli）であることを特徴とする、請求項１にお いて定義される、構造に基づくモデリング方法。 ９．該第一および第二の細胞が大腸菌であることを特徴とする、請求項１におい て定義される、構造に基づくモデリング方法。 １０．該目標ＡＨＡＳプロテインが図１の配列またはその機能的に同等なものを 有するプロテインを含むことを特徴とする、請求項１において定義される構造に 基づくモデリング方法。 １１．該変異が、 並びにこれらのいずれかと機能的に同等なもの、およびこれらのいずれかとのい ずれかの組み合わせからなるグループから選ばれた図１の配列のアミノ酸残基に おいて少なくとも一つの異なるアミノ酸残基による置換； 並びにこれらのいずれかと機能的に同等なもの、およびこれらのいずれかとのい ずれかの組み合わせからなるグループから選ばれた図１の配列の少なくとも一つ のアミノ酸残基の前５個までのアミノ酸残基または後５個までのアミノ酸残基の 削除； (iii) 図１の配列のＱ124とＨ150の間での少なくとも一つのアミノ酸残基また は機能的に同等なものの削除； (iv) 図１の配列のＱ124とＨ150の間での少なくとも一つのアミノ酸残基また は機能的に同等なものの付加； (v) 図１の配列のＧ300とＤ324の間での少なくとも一つのアミノ酸残基または 機能的に同等なものの削除； (vi) 図１の配列のＧ300とＤ324の間での少なくとも一つのアミノ酸残基また は機能的に同等なものの付加； (vii) 以上のいずれかとのいずれかの組み合わせ； からなるグループから選択されることを特徴とする、請求項１において定義され る、構造に基づくモデリング方法。 １２．該置換がＭet53Ｔrp、Ｍet53Ｇlu、Ｍet53Ｉle、Ｍet53Ｈis、Ａrg128Ａl a、Ａrg128Ｇlu、Ｐhe135Ａrg、Ｉle330Ｐhe、並びにこれらのいずれかと機能的 に同等 なものおよびこれらのいずれかとのいずれかの組み合わせからなるグループから 選択されることを特徴とする、請求項11において定義される構造に基づくモデリ ング方法。 １３．除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインの製造に対する構造に基づくモデリ ング方法であって、 (a) 目標ＡＨＡＳプロテインを、図１の配列を有するポリペプチドから得られ る第一のＡＨＡＳ鋳型またはその機能的同等物上に、該目標ＡＨＡＳプロテイン の三次元構造を誘導するために並べること； (b) 該目標ＡＨＡＳプロテインの除草剤結合ポケットを局在させるために一つ 以上の除草剤を該三次元構造にモデリングすること； (c) 変異の目標として、変異が該結合ポケットに対して少なくとも一つの除草 剤の親和性を変えるために、該目標ＡＨＡＳプロテイン中の少なくとも一つのア ミノ酸位置を選沢すること； (d) 該位置で変異を含む変異体ＡＨＡＳをコードする変異ＤＮＡを製造するた め、該目標ＡＨＡＳプロテインをコードするＤＮＡを変異すること、そして (e) 該位置で該変異を含む該変異体ＡＨＡＳが製造される条件下第一の細胞中 で該変異ＤＮＡを発現すること； からなる前記方法。 １４．請求項13において定義される、構造に基づくモデリング方法であって、 (f) 第二の細胞で平行して野生型ＡＨＡＳをコードするＤＮＡを発現すること ； (g) 該野生型および該変異体ＡＨＡＳプロテインを該細胞から精製すること； (h) 少なくとも一つの除草剤の存在または非存在下、ピルビン酸のアセト乳酸 への変換またはアセトヒドロキシ酪酸を生成するピルビン酸とケト酪酸との縮合 における触媒活性について該野生型および該変異体ＡＨＡＳプロテインを試験す ること；および (i) 第一の除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインが、 (1) 少なくとも一つの該除草剤の非存在下、 (a)それが発現される細胞の生存を維持するのに単独で充分な触媒活性 ；または (b)第一の該ＡＨＡＳ変異体プロテインと同じか異なっていてもよい該 細胞中にも発現されるあらゆる除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインと組み合わ せて、それが発現される細胞の生存を維持するのに充分な触媒活性；ここにおい て該細胞は生存のためＡＨＡＳを必要とする、および (2) 少なくとも一つの除草剤に対して野生型ＡＨＡＳよりも耐性である触媒 活性 を有することが同定されるまで、ステップ（e）の該変異体をコードする該ＤＮ Ａがステップ（c）のＡＨＡＳをコードするＤＮＡとして使用されるように、ス テップ（c）−（h）を繰り返すこと をさらに包含する前記方法。 １５．少なくとも一つの該除草剤の非存在下の該触媒活性が、該野生型ＡＨＡＳ の触媒活性の約20％以上であることを特徴とする、請求項14において定義される 、構造に基づくモデリング方法。 １６．該除草剤がイミダゾリノン除草剤であり、該第一の除草剤耐性ＡＨＡＳ変 異体プロテインは、 (1) 該除草剤の非存在下において、該野生型ＡＨＡＳの触媒活性の約20％より も高い触媒活性； (2) 野生型ＡＨＡＳに較べてイミダゾリノン除草剤の存在に対して比較的より 耐性である触媒活性、および (3) イミダゾリノン除草剤に較べてスルホニルウレア除草剤の存在に対して比 較的により感受性である触媒活性 を有することを特徴とする、請求項15において定義される、構造に基づくモデリ ング方法。 １７．該除草剤がイミダゾリノン類、スルホニルウレア類、トリアゾロピリミジ ンスルホンアミド類、ピリミジルオキシ安息香酸類、スルファモイルウレア類、 スルホカルボキサミド類およびそれらの組み合わせから選択されることを特徴と する、請求項13において定義される、構造に基づくモデリング方法。 １８．該目標ＡＨＡＳプロテインがシロイヌナズナから誘導されることを特徴と する、請求項13において定義される、構造に基づくモデリング方法。 １９．該第一の細胞が大腸菌であることを特徴とする、請求項13において定義さ れる、構造に基づくモデリング方法。 ２０．該第一および第二の細胞が大腸菌であることを特徴とする、請求項19にお いて定義される、構造に基づくモデリング方法。 ２１．該変異が、 並びにこれらのいずれかと機能的に同等なものおよびこれらのいずれかとのいず れかの組み合わせからなるグループから選ばれた図１の配列のアミノ酸残基にお いて少なくとも一つの異なるアミノ酸残基による置換； 並びにこれらのいずれかと機能的に同等なものおよびこれらのいずれかとのいず れかの組み合わせからなるグループから選ばれた図１の配列の少なくとも一つの アミノ酸残基の前５個までのアミノ酸残基または後５個までのアミノ酸残基の削 除； (iii) 図１の配列のＱ124とＨ150の間での少なくとも一つのアミノ酸残基また は機能的に同等なものの削除； (iv) 図１の配列のＱ124とＨ150の間での少なくとも一つのアミノ酸残基また は機能的に同等なものの付加； (v) 図１の配列のＧ300とＤ324の間での少なくとも一つのアミノ酸残基または 機能的に同等なものの削除； (vi) 図１の配列のＧ300とＤ324の間での少なくとも一つのアミノ酸残基また は機能的に同等なものの付加； (vii) 以上のいずれかとのいずれかの組み合わせ； からなるグループから選択されることを特徴とする、請求項13において定義され る構造に基づくモデリング方法。 ２２．該置換がＭet53Ｔrp、Ｍet53Ｇlu、Ｍet53Ｉle、Ｍet53Ｈis、Ａrg128Ａl a、Ａrg128Ｇlu、Ｐhe135Ａrg、Ｉle330Ｐhe、前者いずれかと機能的に同等なも のおよ び前者いずれかの組み合わせからなるグループから選択されることを特徴とする 、請求項21において定義される、構造に基づくモデリング方法。 ２３．除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインの製造に対する、構造に基づくモデ リング方法であって、 (a) 該目標ＡＨＡＳプロテインの三次元構造を誘導するために、同定された除 草剤結合ポケットおよび図１の配列を有する最初のＡＨＡＳ鋳型またはその機能 的同等物上に目標ＡＨＡＳプロテインを並べること； (b) 変異の目標として、該変異が該結合ポケットに対する少なくとも一つの除 草剤の親和性を変えるために、該目標ＡＨＡＳプロテイン中の少なくとも一つの アミノ酸位置を選沢すること； (c) 該位置で該変異を含む変異体ＡＨＡＳをコードする変異ＤＮＡを製造する ため、該目標ＡＨＡＳプロテインをコードするＤＮＡを変異すること； (d) 該位置で該変異を含む該変異体ＡＨＡＳが製造される条件下で該変異ＤＮ Ａを第一の細胞で発現すること； からなる前記方法。 ２４．請求項23において定義される構造に基づくモデリング方法であって、 (e) 第二の細胞で平行して野生型ＡＨＡＳプロテインをコードするＤＮＡ発現 すること； (f) 該野生型および該変異体ＡＨＡＳプロテインを該細胞から精製すること； (g) 少なくとも一つの該除草剤の存在または非存在下、ピルビン酸のアセト乳 酸への変換またはアセトヒドロキシ酪酸を生成するピルビン酸とケト酪酸との縮 合における触媒活性について該野生型および該変異体ＡＨＡＳプロテインを試験 すること； (h) 第一の除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインが、 (1) 少なくとも一つの該除草剤の非存在下、 (a)それが発現される細胞の生存を維持するのに単独で充分な触媒活性 ；または (b)第一の該ＡＨＡＳ変異体プロテインと同じか異なっていてもよい該 細胞中にも発現されるあらゆる除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインと組み合わ せて、 それが発現される細胞の生存を維持するのに充分な触媒活性；ここにおいて該細 胞は生存のためＡＨＡＳを必要とする、および (2) 少なくとも一つの除草剤に対して野生型ＡＨＡＳよりも耐性である触媒 活性； を有することが同定されるまで、ステップ（d）の該ＡＨＡＳをコードする該Ｄ ＮＡがステップ（b）のＡＨＡＳをコードするＤＮＡとして使用されるように、 ステップ（b）−（g）を繰り返すこと； をさらに包含する前記方法。 ２５．少なくとも一つの該除草剤の非存在下の該触媒活性が、該野生型ＡＨＡＳ の触媒活性の約20％以上であることを特徴とする、請求項24において定義される 、構造に基づくモデリング方法。 ２６．該除草剤がイミダゾリノン除草剤であり、第一の除草剤耐性ＡＨＡＳ変異 体プロテインは、 (1) 該除草剤非存在下において、該野生型ＡＨＡＳの触媒活性の約20％よりも 高い触媒活性； (2) 野生型ＡＨＡＳに較べてイミダゾリノン除草剤の存在に対して比較的より 耐性である触媒活性；および (3) イミダゾリノン除草剤に較べてスルホニルウレア除草剤の存在に対して比 較的より感受性である触媒活性； を有することを特徴とする、請求項25において定義される、構造に基づくモデリ ング方法。 ２７．該除草剤がイミダゾリノン類、スルホニルウレア類、トリアゾロピリミジ ンスルホンアミド類、ピリミジルオキシ安息香酸類、スルファモイルウレア類、 スルホカルボキサミド類およびそれらの組み合わせから選択されることを特徴と する、請求項23において定義される、構造に基づくモデリング方法。 ２８．該目標ＡＨＡＳプロテインがシロイヌナズナから誘導されることを特徴と する、請求項23において定義される、構造に基づくモデリング方法。 ２９．該細胞が大腸菌であることを特徴とする、請求項23において定義される、 構造に基づくモデリング方法。 ３０．該第一および第二の細胞が大腸菌であることを特徴とする、請求項24にお いて定義される、構造に基づくモデリング方法。 ３１．該変異が、 並びにこれらのいずれかと機能的に同等なものおよびこれらのいずれかとのいず れかの組み合わせからなるグループから選ばれた図１の配列のアミノ酸残基にお いて少なくとも一つの異なるアミノ酸残基による置換； 並びにこれらのいずれかと機能的に同等なものおよびこれらのいずれかとのいず れかの組み合わせからなるグループから選ばれた図１の配列の少なくとも一つの アミノ酸残基の前５個までのアミノ酸残基または後５個までのアミノ酸残基の削 除； (iii) 図１の配列のＱ124とＨ150の間での少なくとも一つのアミノ酸残基また は機能的に同等なものの削除； (iv) 図１の配列のＱ124とＨ150の間での少なくとも一つのアミノ酸残基また は機能的に同等なものの付加； (v) 図１の配列のＧ300とＤ324の間での少なくとも一つのアミノ酸残基または 機能的に同等なものの削除； (vi) 図１の配列のＧ300とＤ324の間での少なくとも一つのアミノ酸残基また は機能的に同等なものの付加； (vii) 以上のいずれかとのいずれかの組み合わせ； からなるグループから選択されることを特徴とする、請求項23において定義され る、構造に基づくモデリング方法。 ３２．該置換がＭet53Ｔrp、Ｍet53Ｇlu、Ｍet53Ｉle、Ｍet53Ｈis、Ａrg128Ａl a、Ａrg128Ｇlu、Ｐhe135Ａrg、Ｉle330Ｐhe、並びにこれらのいずれかと機能的 に同等なものおよびこれらのいずれかとのいずれかの組み合わせからなるグルー プから選択されることを特徴とする、請求項31において定義される、構造に基づ くモデリング方法。 ３３．アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）変異体プロテインをコードす る単離ＤＮＡであって、該変異体プロテインが、 並びにこれらのいずれかと機能的に同等なものおよびこれらのいずれかとのいず れかの組み合わせからなるグループから選ばれた図１の配列のアミノ酸残基にお いて少なくとも一つの異なるアミノ酸残基による置換； 並びにこれらのいずれかと機能的に同等なものおよびこれらのいずれかとのいず れかの組み合わせからなるグループから選ばれた図１の配列の少なくとも一つの ア ミノ酸残基の前５個までのアミノ酸残基または後５個までのアミノ酸残基の削除 ； (iii) 図１の配列のＱ124とＨ150の間での少なくとも一つのアミノ酸残基また は機能的に同等なものの削除； (iv) 図１の配列のＱ124とＨ150の間での少なくとも一つのアミノ酸残基また は機能的に同等なものの付加； (v) 図１の配列のＧ300とＤ324の間での少なくとも一つのアミノ酸残基または 機能的に同等なものの削除； (vi) 図１の配列のＧ300とＤ324の間での少なくとも一つのアミノ酸残基また は機能的に同等なものの付加； (vii) 以上のいずれかとのいずれかの組み合わせ； によって修飾されたＡＨＡＳプロテインまたはその機能的に同等なものからなる ことを特徴とする、前記単離ＤＮＡ。 ３４．該修飾が該プロテインの酵素活性を阻害する除草剤の能力を変えることを 特徴とする、請求項33において定義されるＤＮＡ。 ３５．該除草剤がイミダゾリノン類、スルホニルウレア類、トリアゾロピリミジ ンスルホンアミド類、ピリミジルオキシ安息香酸類、スルファモイルウレア類、 スルホカルボキサミド類およびそれらの組み合わせから選択されることを特徴と する、請求項34において定義されるＤＮＡ。 ３６．該目標ＡＨＡＳプロテインがシロイヌナズナから誘導されることを特徴と する、請求項33において定義されるＤＮＡ。 ３７．該置換がＭet53Ｔrp、Ｍet53Ｇlu、Ｍet53Ｉle、Ｍet53Ｈis、Ａrg128Ａl a、Ａrg128Ｇlu、Ｐhe135Ａrg、Ｉle330Ｐhe、並びにこれらのいずれかと機能的 に同等なものおよびこれらのいずれかとのいずれかの組み合わせからなるグルー プから選択されることを特徴とする、請求項33において定義されるＤＮＡ。 ３８．該変異体ＡＨＡＳプロテインが、 (a) 少なくとも一つのＡＨＡＳ阻害除草剤の非存在下、 (1) それが発現される細胞の生存を維持するのに単独で充分な触媒活性 ；または (2) 該ＡＨＡＳ変異体プロテインと同じか異なっていてもよい該細胞中 に 発現されるあらゆる第二の除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインと組み合わせて 、それが発現される細胞の生存を維持するのに充分な触媒活性；ここにおいて該 細胞は生存のためＡＨＡＳ活性を必要とする、および (b) 少なくとも一つの除草剤に野生型ＡＨＡＳよりも耐性である触媒活性； を有することを特徴とする、請求項37において定義されるＤＮＡ。 ３９．該変異体ＡＨＡＳが該野生型ＡＨＡＳの触媒活性の約20％以上を有するこ とを特徴とする、請求項33において定義されるＤＮＡ。 ４０．該変異体ＡＨＡＳがイミダゾリノンに基づく除草剤に対して、スルホニル ウレアに基づく除草剤に対してよりも少なくとも２倍は耐性であることを特徴と する、請求項39において定義されるＤＮＡ。 ４１．作動するように転写調節エレメントに結合している請求項33のをＤＮＡを 含むＤＮＡベクター。 ４２．該細胞が細菌、カビ、植物、昆虫および哺乳動物の細胞からなるグループ から選択されることを特徴とする、請求項41において定義されるＤＮＡベクター から誘導されるＡＨＡＳをコードするＤＮＡ配列を含む細胞。 43.植物細胞からなる請求項42において定義される細胞。 ４４．請求項43において定義される細胞からなる種子。 ４５．請求項33において定義されるＤＮＡによってコードされるプロテインから なる変異体ＡＨＡＳプロテイン。 ４６． 並びにこれらのいずれかと機能的に同等なものおよびこれらのいずれかとのいず れかの組み合わせからなるグループから選ばれた図１の配列のアミノ酸残基にお いて少なくとも一つの異なるアミノ酸残基による置換； 並びにこれらのいずれかと機能的に同等なものおよびこれらのいずれかとのいず れかの組み合わせからなるグループから選ばれた図１の配列の少なくとも一つの アミノ酸残基の前５個までのアミノ酸残基または後５個までのアミノ酸残基の削 除； (iii) 図１の配列のＱ124とＨ150の間での少なくとも一つのアミノ酸残基また は機能的に同等なものの削除； (iv) 図１の配列のＱ124とＨ150の間での少なくとも一つのアミノ酸残基また は機能的に同等なものの付加； (v) 図１の配列のＧ300とＤ324の間での少なくとも一つのアミノ酸残基または 機能的に同等なものの削除； (vi) 図１の配列のＧ300とＤ324の間での少なくとも一つのアミノ酸残基また は機能的に同等なものの付加； (vii) 以上のいずれかとのいずれかの組み合わせ； によって修飾されたＡＨＡＳプロテインからなる変異体ＡＨＡＳプロテイン。 ４７．該修飾が該プロテインの酵素活性を阻害する除草剤の能力を変えることを 特徴とする、請求項46において定義される変異体ＡＨＡＳプロテイン。 ４８．該除草剤がイミダゾリノン類、スルホニルウレア類、トリアゾロピリミジ ンスルホンアミド類、ピリミジルオキシ安息香酸類、スルファモイルウレア類、 スルホカルボキサミド類およびそれらの組み合わせから選択されることを特徴と する、請求項46において定義される変異体ＡＨＡＳプロテイン。 ４９．該目標ＡＨＡＳプロテインがシロイヌナズナから誘導されることを特徴と する、請求項46において定義される変異体ＡＨＡＳプロテイン。 ５０．該置換がＭet53Ｔrp、Ｍet53Ｇlu、Ｍet53Ｉle、Ｍet53Ｈis、Ａrg128Ａl a、Ａrg128Ｇlu、Ｐhe135Ａrg、Ｉle330Ｐhe、並びにこれらのいずれかと機能的 に同等なものおよびこれらのいずれかとのいずれかの組み合わせからなるグルー プから選択されることを特徴とする、請求項46において定義される変異体ＡＨＡ Ｓプロテイン。 ５１．該変異体ＡＨＡＳプロテインが、 (a) 少なくとも一つのＡＨＡＳ阻害除草剤の非存在下、 (1) それが発現される細胞の生存を維持するのに単独で充分な触媒活性 ；または (2) 該ＡＨＡＳ変異体プロテインと同じか異なっていてもよい該細胞中 に発現されるあらゆる第二の除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインと組み合わせ て、それが発現される細胞の生存を維持するのに充分な触媒活性；ここにおいて 該細胞は生存のためＡＨＡＳを必要とする、および (b) 少なくとも一つの除草剤に野生型ＡＨＡＳよりも耐性である触媒活性； を有することを特徴とする、請求項46において定義される変異体ＡＨＡＳプロテ イン。 ５２．該変異体ＡＨＡＳが該野生型ＡＨＡＳの触媒活性の約20％以上を有するこ とを特徴とする、請求項46において定義される変異体ＡＨＡＳプロテイン。 ５３．細胞に除草剤耐性を付与するための方法であって、 (a) 請求項33において定義されるＤＮＡを適切な発現ベクターにクローニング すること；および (b) 該遺伝子が該細胞に除草剤耐性を付与するのに充分なレベルで発現される ことからなる条件下該ＤＮＡを該細胞に形質転換すること； を特徴とする、前記方法。 ５４．請求項53の方法に従って製造される細胞。 ５５．請求項54において定義される細胞を含む植物。 ５６．該変異遺伝子が53、128、135またはそれらの組み合わせの少なくとも一つ の位置で異なるアミノ酸をコードすることを特徴とする、請求項53において定義 される方法。 ５７．該ＡＨＡＳ遺伝子がシロイヌナズナ遺伝子を含むことを特徴とする、請求 項56において定義される方法。 ５８．該細胞が細菌、カビ、植物、昆虫および哺乳動物の細胞からなるグループ から選択されることを特徴とする、請求項53において定義される方法。 ５９．該細胞が植物細胞であることを特徴とする、請求項58において定義される 方法。 ６０．該細胞が種子中にあることを特徴とする、請求項59において定義される方 法。 ６１．除草剤耐性ＡＨＡＳプロテインの製造方法であって、 (a) 変異の目標として、ＡＨＡＳプロテイン中のアミノ酸位置を選沢すること ； (b) 該位置で変異をコードする変異ＤＮＡを製造するため、ＡＨＡＳをコード するＤＮＡを変異すること； (c) 該位置に該変異を含む変異体ＡＨＡＳが製造される条件下に、第一の細胞 中で該変異ＤＮＡを発現すること； (d) 第二の細胞で平行して野生型ＡＨＡＳプロテインを発現すること； (e) 該野生型および該変異体ＡＨＡＳプロテインを該細胞から精製すること； (f) イミダゾリノン除草剤またはスルホニルウレア除草剤の非存在または存在 下、ピルビン酸のアセト乳酸への変換における触媒活性について該野生型および 該変異体ＡＨＡＳプロテインを試験すること； (g) 除草剤耐性ＡＨＡＳ変異体プロテインが、 (1) 除草剤の非存在下において、該野生型ＡＨＡＳの触媒活性の約20％より も高い触媒活性； (2) 野生型ＡＨＡＳに較べてイミダゾリノン除草剤の存在に対して比較的よ り耐性である触媒活性、そして (3) イミダゾリノン除草剤に較べてスルホニルウレア除草剤の存在に対して 比較的より感受性である触媒活性； を有するまで、該変異体がステップ（b）のＡＨＡＳをコードするＤＮＡとして 使用されるようステップ（a）−（g）を繰り返すこと； からなる前記方法。 ６２．該除草剤がイミダゾリノン類、スルホニルウレア類、トリアゾロピリミジ ンスルホンアミド類、ピリミジルオキシ安息香酸類、スルファモイルウレア類、 スルホカルボキサミド類およびそれらの組み合わせから選択されることを特徴と する、請求項61において定義される方法。 ６３．該ＡＨＡＳプロテインがシロイヌナズナから誘導されることを特徴とする 、請求項61において定義される方法。 ６４．該細胞が大腸菌であることを特徴とする、請求項61において定義される方 法。 ６５．該目標ＡＨＡＳプロテインが図１の配列を有するプロテインを含むことを 特 徴とする、請求項61において定義される方法。 ６６．該方法が 並びにこれらのいずれかと機能的に同等なものおよびこれらのいずれかとのいず れかの組み合わせからなるグループから選ばれた図１の配列のアミノ酸残基にお いて少なくとも一つの異なるアミノ酸残基による置換； 並びにこれらのいずれかと機能的に同等なものおよびこれらのいずれかとのいず れかの組み合わせからなるグループから選ばれた図１の配列の少なくとも一つの アミノ酸残基の前５個までのアミノ酸残基または後５個までのアミノ酸残基の削 除； (iii) 図１の配列のＱ124とＨ150の間での少なくとも一つのアミノ酸残基また は機能的に同等なものの削除； (iv) 図１の配列のＱ124とＨ150の間での少なくとも一つのアミノ酸残基また は機能的に同等なものの付加； (v) 図１の配列のＧ300とＤ324の間での少なくとも一つのアミノ酸残基または 機能的に同等なものの削除； (vi) 図１の配列のＧ300とＤ324の間での少なくとも一つのアミノ酸残基また は機能的に同等なものの付加； (vii) 以上のいずれかとのいずれかの組み合わせ； からなるグループから選択されることを特徴とする、請求項65において定義され る方法。 ６７．該置換がＭet53Ｔrp、Ｍet53Ｇlu、Ｍet53Ｉle、Ｍet53His、Ａrg128Ａla 、Ａrg128Ｇlu、Ｐhe135Ａrg、Ｉle330Ｐhe、並びにこれらのいずれかと機能的 に同等なものおよびこれらのいずれかとのいずれかの組み合わせからなるグルー プから選択されることを特徴とする、請求項66において定義される方法。 ６８．作物における雑草を管理するための方法であって、請求項55において定義 される除草剤耐性植物を栽培し、そして雑草を管理するのに有効な量の該除草剤 を用いて該作物を処理する； ことを特徴とする、前記方法。 ６９．作物における雑草を管理するための方法であって、請求項55において定義 される除草剤耐性植物を含む作物を栽培し、そして雑草を管理するのに有効な量 の該除草剤を含む除草組成物を用いて該作物を処理すること、 を特徴とする、前記方法。 ７０．ＡＨＡＳ活性を阻害する第一の除草剤を製造するための構造に基づくモデ リング方法であって、 (a) 目標ＡＨＡＳプロテインの三次元構造を誘導するために目標ＡＨＡＳプロ テイ ンをピルビン酸オキシダーゼ鋳型またはそのＡＨＡＳモデリング機能同等物上に 並べること； (b) 該目標ＡＨＡＳプロテインの除草剤結合ポケットの位置、構造またはそれ らの組み合わせを誘導するために、ＡＨＡＳ阻害活性を有する第二の除草剤を該 三次元構造にモデリングすること、そして (c) 該第一の除草剤が生存のためにＡＨＡＳ活性を要求する細胞の生存を破壊 するのに充分該ＡＨＡＳ活性を阻害するために、該結合ポケットのＡＨＡＳ活性 阻害効果性部分と関わる非ペプチド性の第一の除草剤をデザインすること； からなる前記方法。 ７１．該ＡＨＡＳモデリングの機能同等物がトランスケトラーゼ、カルボリガー ゼおよびピルビン酸デカルボキシラーゼからなるグループから選択されることを 特徴とする、請求項70において定義される構造に基づくモデリング方法。 ７２．該第一の除草剤が該結合ポケットの官能性基と相互作用する少なくとも一 つの官能性基を含むことを特徴とする、請求項70において定義される構造に基づ くモデリング方法。 ７３．該第一の除草剤が該結合ポケットの少なくともＡＨＡＳ活性阻害に有効な 部分に結合することを特徴とする、請求項70において定義される構造に基づくモ デリング方法。 ７４．該第一の除草剤が該触媒活性を野生型ＡＨＡＳの触媒活性の約20％以下に 阻害することを特徴とする、請求項70において定義される構造に基づくモデリン グ方法。 ７５．該目標ＡＨＡＳプロテインがシロイヌナズナから誘導されることを特徴と する、請求項70において定義される構造に基づくモデリング方法。 ７６．該目標ＡＨＡＳプロテインが図１の配列またはその機能的に同等なもの有 するプロテインを含むことを特徴とする、請求項70において定義される構造に基 づくモデリング方法。 ７７．ＡＨＡＳ活性を阻害する第一の除草剤を製造するための構造に基づくモデ リング方法であって、 (a) 目標ＡＨＡＳプロテインの三次元構造を誘導するために、該目標ＡＨＡＳ プロ テインを図１の配列を有するポリペプチドから得られる第一のＡＨＡＳ鋳型また はその機能的同等物上に並べること； (b) 該目標ＡＨＡＳプロテインの除草剤結合ポケットの位置、構造またはそれ らの組み合わせを誘導するために、第二の除草剤を該三次元構造にモデリングす ること；および (c) 該第一の除草剤が生存のためにＡＨＡＳ活性を要求する細胞の生存を破壊 するのに充分該ＡＨＡＳ活性を阻害するために、該結合ポケットのＡＨＡＳ活性 阻害効果性部分と関わる非ペプチド性の第一の除草剤をデザインすること； からなる前記方法。 ７８．該第一の除草剤が該結合ポケットの官能性基と相互作用する少なくとも一 つの官能性基を含むことを特徴とする、請求項77において定義される、構造に基 づくモデリング方法。 ７９．該第一の除草剤が該結合ポケットの少なくともＡＨＡＳ活性阻害に有効な 部分に結合することを特徴とする、請求項77において定義される、構造に基づく モデリング方法。 ８０．該第一の除草剤が該ＡＨＡＳの該触媒活性を野生型ＡＨＡＳの触媒活性の 約20％以下に阻害することを特徴とする、請求項77において定義される、構造に 基づくモデリング方法。 ８１．該目標ＡＨＡＳプロテインがシロイヌナズナから誘導されることを特徴と する、請求項77において定義される、構造に基づくモデリング方法。 ８２．ＡＨＡＳ活性を阻害する第一の除草剤を製造するための、構造に基づくモ デリング方法であって、 (a) 該除草剤が生存のためにＡＨＡＳ活性を要求する細胞の生存を破壊するの に充分に該ＡＨＡＳ活性を阻害するために、ＡＨＡＳプロテインの結合ポケット のＡＨＡＳ活性阻害有効部分と関わる非ペプチド性の除草剤をデザインすること ； からなる前記方法。 ８３．請求項33において定義されるＤＮＡで形質転換された細胞であって、該Ｄ ＮＡを該細胞に除草剤耐性を付与するのに充分なレベルで該細胞中に発現するこ とを特徴とする、前記細胞。 ８４．請求項33において定義されるＤＮＡで形質転換された植物であって、該Ｄ ＮＡを該植物に除草剤耐性を付与するのに充分なレベルで該植物中に発現するこ とを特徴とする、前記植物。