NO326115B1 - Strukturbasert utforming og kontruksjon av varianter av acetohydroksysyresyntease (AHAS) som er resistente overfor imidazolinoner og andre herbicider, AHAS inhiberende herbicider, selve AHAS varianter, DNA kodende for disse variantene, celler og fro som uttrykker disse variantene og fremgangsmater for kontrollering av ugress. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører strukurbasert utforming og konstruksjon av varianter av acetohydroksysyresyntease (AHAS) som er resistente overfor imidazolinoner og andre herbicider, AHAS inhiberende herbicider, selve AHAS varianter, DNA kodende for disse variantene, celler og frø som uttrykker disse variantene og fremgangsmåter for kontrollering av ugress.

Acetohydroksysyresyntase (AHAS) er et enzym som katalyserer det innledende trinnet i biosyntesen til isoleucin, leucin og valin i bakterier, gjær og planter. For eksempel er moden AHAS fra Zea Mays omtrent et 599-aminosyreprotein som er lokalisert i kloro-plasten (se figur 1). Enzymet anvender thiamin pyrofosfat (TPP) og flavin adenin dinukleotid (FAD) som kofaktorer og pyruvat som et substrat for å danne acetolaktat. Enzymet katalyserer også kondensasjonen av puryvat og 2-ketobutyrat for å danen acetohydroksybutyrat. AHAS er også kjent som acetolaktatsyntase eller acetolaktat-pyruvatlyase (karboksylerende) og er betegnet EC 4.1.3.18. Det aktive enzymet er sannsynligvis minst en homodimer. Ibdah et al. (Protein Science, 3:479-S. 1994), i et sammendrag, beskriver en modell for det aktive setet til AHAS.

En mengde herbicider inkluderer imidazolinon forbindelser så som imaxethapyr (PURSUIT® - American Cyanamid Company-Wayne, NJ), sulfonylurea-basert forbind-else så som sulfometuronmetyl (OUST® . E.I. du Pont de Nemours and Company-Wilmington, DE), triazolopyrimidinsulfonamider (Broadstrike<TM.> £>ow Elanco, se Gerwick, et al., Pestic. Sei. 29:357-364,1990), sulfamoylurea (Rodaway et al., Mechanisms of Selectively of Ac 322,140 i Paddy Rice, Wheat and Barley, Proceedings og the Brighton Crop Protection Conference-Weeds, 1993), pyrimidyl-oksy-benzosyre (STABLE® - Kumiai Chemical Industry Company, E.I. du Pont de Nemours and Company; se The Pesticide Manual lOth Ed. s. 888-889, Clive Tomlin, Ed., British Crop Protection Council, 49 Downing Street, Farmham, Surrey G49 7PH, United Kingdom) og sulfonylkarboksamider (Alvarado et al., US-PS 4.883.914) virker ved å inhibere AHAS enzymatisk aktivitet (se Chaleff et al., Science 224:1443,1984; LaRossa et al., J. Biol. Chem. 259:8753,1984; Ray, Plant Physiol. 75:827, 11984; Shaner et al., Plant Physiol. 76:545,1984). Disse herbicidene er meget effektive og miljømessig benigne. Deres anvendelse i jordbruk er derimot begrenset av deres mangel på selektivitet på grunn av at avlinger samt uønsket ugress er følsomme overfor phytotoksiske effekter til disse herbicidene.

EP 492113 beskriver nær beslektet teknikk, men beskriver ikke en tre-dimensjonal modell for utvelgelse av posisjoner for mutagenesen.

Bedbrook et al., US-PS 5.013.659, 5.141.870 og 5.378.824, beskriver flere sulfonyl-urearesistente AHAS varianter. Disse variantene ble enten oppnådd ved mutagenese av planter, frø eller celler og selektering for herbicid-resistente mutanter, eller ble oppnådd fra slike mutanter. Denne metoden er upålitelig på grunn av at den bygger på (i det minste delvis) tilfeldig sjanse for introdusering av en relevant mutasjon, i stedenfor en rasjonell konstruksjonsmetode basert på en strukturell modell av målproteinet.

Det er fortsatt et behov innenfor fagområdet for fremgangsmåter og sammensetninger som tilveiebringer selektivt bredspektret og/eller spesifikk herbicid motstand i dyrkede avlinger. Foreliggende oppfinnere har oppdaget at selektive herbicidresistente variant-former av AHAS og planter inneholdende disse kan bli dannet ved strukturbasert utforming av AHAS overfor pyruvat oksydase (POX), som identifiserer en herbicid bindingslomme eller lommer på AHAS modellen, og konstruering av spesifikke mutasjoner som endrer affiniteten av herbicidet for bindingslommen. Disse variantene og plantene blir ikke inhibert eller drept av en eller flere klasser av herbicider og har beholdt tilstrekkelig AHAS enzymatisk aktivitet for å understøtte vekst av avling.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 er en illustrasjon av en 600 aminosyre lang sekvens som tilsvarer omtrent 599 aminosyresekvensen til acetohydroksysyresyntase (AHAS) fra Zea Mays som er gitt som et eksempel på et plante AHAS enzym. Sekvensen innbefatter ikke en transitt sekvens, og ekstraglycin er rudimentær fra et trombinspaltningssete. Residiene Met53, Argl28 og Phel35 er vist i uthevet tilstand. Figur 2 er en illustrasjon på oppstilling av sekvensen til mais AHAS og pyruvat oksidase (POX) fra Lactobacillus planarum. Figur 3 er en skjematisk representasjon av den sekundære strukturen til en AHAS subenhet. Regulære sekundære strukturelementer, a-heliks og fi-arkstruktur, er vist som sirkler og elipser, og er nummerert separat for hver av de tre domenene innenfor en subenhet. Løkker og ringregioner er representert ved svarte linjer, med nummeret som representerer omtrentlige begynnelser og ender til elementene. Beliggenhetene til kofaktorbindingssetene og kjente mutasjonsseter er indikert med henholdsvis oktahedroner og stjerner. Figur 4 er en illustrasjon av en data-dannet modell av det aktive setet til mais AHAS med imazethapyr (PURSUIT® herbicid) modellert inn i bindingslommen. Figur 5 er en illustrasjon av homologien blant AHAS aminosyresekvensene avledet fra forskjellige plantearter. pAC 751 er mais 2 AHAS isozym som uttrykt fra pAC 751 E. coli ekspresjonsvektoren som i figur 1; Mais 2 er mais 2 AHAS isozymet; Mais 1 er mais 1 AHAS isoymet; Tobac 1 er en tobacco AHAS SuRA isozymet; Tobaz 2 er tobacco AHAS SuRB isozymet; Athcsr 12 er Aeabidopsis thaliana Csr 1.2 AHAS gener; Bnaal 3 er Brassica napus AHAS III isozym; og Bnaal 2 er Brassica napus AHAS II isozymete.

pAC 751 og mais 2 er identiske gener med unntagelse av at mais 2 begynner ved begynnelsen av transittsekvensen og pAC 751 begynner ved det antatte modene N-terminale setet med en ytterligere glycin ved den N-terminale enden til trombin gjenkjenningssekvensen i pGEX-2T ekspresjonsvektoren. N-terminal glycin er ikke en naturlig aminosyre i den posisjonen.

Aminosyresekvens oppstillingene til AHAS proteinene er blitt utført av PILEUP (GCG Package - Genetics Computer Group, Inc., University Research Park - Madison-WI). Konsensussekvensen ble dannet av PRETTY GCG Package. Figur 6 er en fotografisk illustrasjon av en SDS-polyakrylamidgel farget for protein som viser rensing av mais AHAS. Kolonnen inneholder (fra venstre til høyre): A, molekyl-vektmarkører; B, rå E. coli celleektrakt; C, glutation-agarose affinitetsrenset preparat; D, trombinspaltning av affinitets renset preparat; E, andre føring gjennom glutation-agarose kolonne og Sephacryl S-100 gelfiltrering. Figur 7 er en grafisk illustrasjon av resultatene til in vitro analyser av enzymatisk aktivitet til vill-type og mutante AHAS proteiner i fravær og i nærvær av økte konsentrasjoner av imazethapyr (PURSUIT® herbicid). Y aksen representerer aktivitetsprosenten til mutant enzym, hvori 100% verdien blir målt i fravær av inhibitor. Figur 8 er en grafisk illustrasjon av resultatene til in vitro analyser av enzymatisk aktivitet til vill-type og mutante AHAS proteiner i fravær og nærvær av økte konsentrasjoner sulfometuronmetyl (OUST® herbicid). Y aksen representerer prosent aktivitet til mutant enzym, hvori 100% verdien blir målt i fravær av inhibitor. Figur 9 er en grafisk illustrasjon av in vitro analyser av enzymatisk aktivitet til vill-type Arabidopsis AHAS protein og Metl24Ile mutant Arabidopsis AHAS protein i nærvær og fravær av økende konsentrasjoner imazethapyr (PURSUIT® herbicid) og sulfometuronmetyl (OUST® herbicid). Y aksen representerer prosent aktivitet til det mutante enzymet, hvori 100% verdien blir målt i fråvær av inhibitor. Figur 10 er en grafisk illustrasjon av in vitro analyser av den enzymatiske aktiviteten til vill-type Arabidopsis AHAS protein og Metl24His mutant Arabidopsis AHAS proteinet i fravær og nærvær av økende konsentrasjoner imazethapyr (PURSUIT® hebicide) og sulfometuronmetyl (OUST® herbicide). Y-aksen representerer prosent aktivitet av det mutante enzymet, hvori 100% verdien blir målt i fravær av inhibitor. Figur 11 er en grafisk illustrasjon av in vitro analyser av den enzymatiske aktiviteten til vill-type Arabidopsis AHAS protein og Argl99Glu mutant Arabidopsis AHAs protein i fravær og nærvær av økende konsentrasjoner imazethapyr (PURSUIT® herbicide) og sulfometuronmetyl (OUST® herbicide). Y-aksen representerer prosent aktivitet til det mutante enzymet, hvori 100% verdien blir målt i fravær av inhibitor. Figur 12 er en skjematisk illustrasjon av en DNA vektor anvendt for plantetransformasjon, som inneholder nptll genet (kodende for kanamycin resistens) under kontroll av 35S promoteren og et AHAS gen (vill type eller variant) under kontroll av Arabidopsis AHAS promoteren. Figur 13 er et fotografi som viser rotutviklingen til tobakkplanter transformert med Arabidopsis AHAS genet inneholdende enten Metl24Ile eller Argl99Glu mutasjon og en ikke-transformert kontroll. Planter ble dyrket i 18 dager etter overføring inn i medium inneholdende 0,25 um imazethapyr. Figur 14 er et fotografi som viser tobakkplanter som formert med Arabidopsis AHAS genet inneholdende enten Metl24Ile, Met 124His eller Argl99Glu mutasjon og en ikke-transformert kontroll, som var blitt sprayet med to ganger feltraten (100 g/ha) av imazethapyr. Figur 15 er et fotografi som viser resultatene fra spiringstester utført i nærvær av herbicide CL 299,263 (imazamox), som ble utført på frø høstet fra primære tobakk-plantetransformanter som var blitt transformert med Arabidopsis AHAS genet inneholdende enten Metl24Ile, Met 124His eller Argl99Glu mutasjon.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en struktur-basert utformingsmetode for produsjon av herbicidresistent AHAS variant protein. Fremgangsmåten innbefatter:

(a) oppstilling av et mål AHAS-protein på puryvat oksidasetemplat for å avlede den tredimensjonale strukturen til nevnte mål-AHAS-protein; (b) utforming av en eller flere imidazolinon- og/eller sulfonylureabaserte herbicider inn i den nevnte tre-dimensjonale strukturen for å lokalisere en imidazolinon-og/eller sulfonylureabasert herbicidbindingslomme i nevnte mål-AHAS-protein; (c) utvelgelse som et mål for en mutasjon en aminosyreposisjon i nevnte mål-AHAS-protein, der nevnte mutasjon endrer affiniteten til minst et imidazolinon-og/eller sulfonylureabasert herbicid for nevnte bindingslomme; (d) mutering av DNA som koder for nevnte mål-AHAS-protein for å fremstille et mutert DNA som koder for en variant-AHAS inneholdende nevnte mutasjon i

nevnte posisjon; og

(e) uttrykking av nevnte muterte DNAi en første celle, under betingelser hvor nevnte variant-AHAS inneholdende nevnte mutasjon i nevnte posisjon blir produsert.

Fremgangsmåten kan videre innbefatte:

(f) uttrykking av DNA som koder for vill-type-AHAS parallelt i en andre celle:

(g) rensing av nevnte vill-type- og nevnte variant-AHAS-proteiner fra nevnte celler; (h) analysering av nevnte vill-type- og nevnte variant-AHAS-proteiner for katalytisk aktivitet ved omdanning av puryvat til acetolaktat eller ved kondensering av pyruvat og 2-ketobutyrat for å danne acetohydroksybutyrat, i fravær og i nærvær

av nevnte imidazolinon- eller sulfonylureabaserte herbicid; og

(i) gjentagelse av trinnene (c)-(h), hvori nevnte DNA kodende for nevnte variant ifølge trinn (e) blir anvendt som AHAS-kodende DNA i trinn © helt til et imidazolinon-trinn (e) blir anvendt som AHAS-kodende DNA i trinn (c) helt til et imidazolinon- eller sulfonylureabasert herbicidresistent AHAS-variantprotein er identifisert som har:

(i) i fravær av nevnte imidazolinon- eller sulfonylureabaserte herbicid,

(a) en katalytisk aktivitet som alene er tilstrekkelig for å opprettholde

levedyktigheten til en celle hvori den blir uttrykt; eller

(b) katalytisk aktivitet i kombinasjon med et hvilket som helst imdazolinon- eller sulfonylureabasert herbicidresistent AHAS-variantprotein som også blir uttrykt i nevnte celle, som kan være den samme eller forskjellig fra nevnte første AHAS-variant-protein, tilstrekkelig for å opprettholde levedyktigheten til en celle som den blir uttrykt i; hvori nevnte celle krever AHAS-aktivitet for levedyktighet; og (ii) katalytisk aktivitet som er mer resistent overfor minst et imidazolinon-eller sulfinylurea herbicid enn vill-type-AHAS.

I en foretrukket utførelsesform omfatter fremgangsmåten at nevnte katalytiske aktivitet i fravær av et imidazolinon- eller sulfonylureabasert herbicid er mer enn 20% av den katalytiske aktiviteten til nevnte vill-type-AHAS i fravær av et imidazolinon- eller sulfonylureabasert herbicid.

I en foretrukket utførelsesform omfatter herbicidet et imidazolinonherbicid og nevnte herbicidresistente AHAS-variantprotein

har:

(i) katalytisk aktivitet i fravær av nevnte herbicid på mer enn omtrent 20% av den katalytiske aktiviteten i nevnte vill-type-AHAS; (ii) katalytisk aktivitet som er mer resistent overfor tilstedeværelse av imidazolinon herbicider sammenlignet med vill-type-AHAAS; og (iii) katalytisk aktivitet som er mer sensitiv overfor tilstedeværelse av sulfonylureaherbicider sammenlignet med imidazolinonherbicider.

Det er foretrukket at nevnte mål-AHAS-protein er avledet fra Arabidopsis thaliana.

Det er videre foretrukket at nevnte første celle er E.coli eller at nevnte første og andre celler er E.coli.

Det er videre foretrukket at nevnte mål-AHAS-protein omfatter et protein med sekvensen SEQ ID No.l eller aminosyresekvensen til et annet plante-AHAS-protein.

Det er videre foretrukket at nevnte mutasjon er en substitusjon av minst en forskjellig aminosyrerest ved en aminosyrerest ifølge sekvensen vist i SEQ ID No.l utvalgt fra gruppen bestående av F135, M53, R128 og en aminosyrerest fra et annet plante-AHAS-protein ved en aminosyre oppstilt med en hvilken som helst av de foregående, og en hvilken som helst kombinasjon av en hvilken som helst av de foregående.

Det er videre foretrukket at nevnte substitusjon blir valgt fra gruppen bestående av Met53Trp, Met53Glu, Met53Ile, Met53His, Argl28Ala, Argl28Glu, Phel35Arg eller en kombinasjon av hvilke som helst av de foregående.

Ovennevnte modifikasjoner er rettet mot endring av evnen som et herbicid, og fortrinnsvis et imidazolinon-basert herbicid, har til å inhibere den enzymatiske aktiviteten til proteinet.

Foreliggende oppfinnelse angår videre isolert DNA kodende for et acetohydroksysyresyntase (AHAS)-variantprotein, kjennetegnet ved at variantproteinet omfatter et AHAS-protein modifisert ved substitusjon at minst en forskjellig aminosyrerest ved en aminosyrerest i sekvensen vist i SEQ ID No.l utvalgt fra gruppen bestående av M53, RI28, F135 og en hvilken som helst kombinasjon av hvilke som helst av de foregående.

En foretrukket utførelsesform omfatter DNA ifølge oppfinnelsen kjennetegnet ved at

modifiseringen endrer evnen et imidazolinon- og/eller sulfonylureabasert herbicid har til å inhibere den enzymatiske aktiviteten til nevnte protein. En foretrukket utførelsesform omfatter DNA ifølge oppfinnelsen kjennetegnet ved at nevnte AHAS-protein er avledet fra Arabidopsis thaliana. En foretrukket utførelsesform omfatter DNA ifølge oppfinnelsen kjennetegnet ved at nevnte substitusjon blir valgt fra gruppen bestående av Met53Trp, Met53Glu, Met53He, Met53His, Argl28Ala, Argl28Glu, Phel35Arg, eller en kombinasjon av hvilke som helst av de foregående.

En foretrukket utførelsesform omfatter DNA ifølge oppfinnelsen kjennetegnet ved at nevnte variant-AHAS-protein har,

i fravær av minst et imidazolinon- eller sulfonylureabasert AHAS- inhiberende herbicid, (i) en katalytisk aktivitet som alene er tilstrekkelig for å opprettholde levedyktigheten til en celle hvori det blir uttrykt; eller (ii) katalytisk aktivitet i kombinasjon med et hvilket som helst annet imidazolinon- eller sulfonylureabasert herbicidresistent AHAS-variantprotein som også blir uttrykt i nevnte celle, som kan være det samme som eller forskjellig fra nevnte AHAS-variantprotein, tilstrekkelig for å opprettholde levedyktigheten til en celle som den det blir uttrykt i;

hvori nevnte celle krever AHAS-aktivitet for levedyktighet; og (iii) katalytisk aktivitet som er mer resistent overfor minst et imidazolinon-eller sulfonylureabasert herbicid eller vill-type-AH AS.

En foretrukket utførelsesform omfatter DNA ifølge oppfinnelsen kjennetegnet ved at nevnte variant-AHAS har mer enn 20% av den katalytiske aktiviteten til vill-type-

AHAS. En foretrukket utførelsesform omfatter DNA ifølge oppfinnelsen kjennetegnet ved at nevnte variant-AHAS er mer resistent overfor imidazolinonbaserte herbicider enn ovenfor sulfonylureabaserte herbicider. I en foretrukket utførelsesform koder isolert DNA for en herbicid-resistent variant av AHAS.

Det er også tilveiebrakt DNA vektorer omfattende DNA kodende for disse AHAS variantene, selve variant AHAS proteinene og celler, dyrket enten in vivo eller i cellekultur, som uttrykker AHAS variantene eller omfatter disse vektorene.

I et annet aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å gi herbicidresistens til en celle eller celler og spesielt en plantecelle eller celler så som for eksempel et frø. Oppfinnelsen angår således en fremgangsmåte for å frembringe imidazolinon- og/eller sulfonylureabasert herbicidresistens i en celle kjennetegnet ved at den omfatter: (a) kloning av et DNA som definert ifølge oppfinnelsen inn i en kompatibel ekspresjonsvektor; og (b) transformering av nevnte DNA inn i nevnte celle, under betingeler hvori nevnte gen blir uttrykt i tilstrekkelige nivåer for å utvise herbicidresistens på nevnte celle. En foretrukket utførelsesform omfatter en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen kjennetegnet ved at nevnte muterte gen koder for en annen aminosyre i minst en av posisjonene 53,128,135 eller kombinasjoner derav. Et AHAS gen, fortrinnsvis Arabidopsis thaliana AHAS genet, er mutert for å endre evnen som et herbicid har til å inhibere den enzymatiske aktiviteten til AHAS. Det mutante genet ble klonet inn i en kompatibel ekspresjonsvektor, og genet blir transformert inn i en herbicid-sensitiv celle under betingelser hvori det blir uttrykt ved tilstrekkelige nivåer for å utvise herbicid resistens på cellen.

Også beskrevet er fremgangsmåter for ugresskontroll, hvori en avling inneholdende et herbicid resistent AHAS gen ifølge foreliggende oppfinnelse blir dyrket og behandlet med en ugress-kontrollert effektiv mengde herbicid. Foreliggende oppfinnelse angår således en fremgangsmåte for å kontrollere ugress i en avling kjennetegnet ved at den omfatter dyrking av en avling omfattende imidazolinon- og/eller sulfonylureabaserte herbicidresistente planter omfattende celler som definert ifølge oppfinnelsen, og behandling av nevnte avling med nevnte imidazolinon- og/eller sulfonylureabasert herbicid. Foreliggende oppfinnelsen angår således også en fremgangsmåte for å kontrollere ugress i en avling kjennetegnet ved at den omfatter dyrking av en avling omfattende imidazolinon- og/eller sulfonylureabaserte herbicidresistente planter omfattende celler som definert ifølge oppfinnelsen, og behandling av nevnte avling med nevnte imidazolinon- og/eller sulfonylureabaserte herbicidsammensetning inkludert nevnte herbicid.

Det er foretrukket i hver fremgangsmåte at det første herbicidet inneholder minst en funksjonell gruppe som reagerer med en funksjonell gruppe i bindingslommen.

Foreliggende oppfinnelse omfatter rasjonell konstruksjon eller strukturbasert molekylær utforming av modifiserte versjoner av enzymet AHAS og AHAS inhiberende herbicider. Disse modifiserte enzymene (AHAS variant proteinene) er motstandsdyktig overfor virkningen av herbicider. Foreliggende oppfinnelsen omfatter også DNA som koder for disse variantene, vektorer som innbefatter disse DNA, AHAS variantproteiner og celler som uttrykker disse variantene. I tillegg er det tilveiebrakt fremgangsmåte for å produsere herbicidmotstand i planter ved å uttrykke disse variantene og fremgangsmåter for ugresskontroll. DNA og AHAS variantene ifølge foreliggende oppfinnelse ble

oppdaget i studier som var basert på molekylær utforming av strukturen til AHAS.

Rasjonell strukturbasert konstruksjon av AHAS varianter og AHAS inhiberende herbicider.

Herbicidresistente varianter av AHAS ifølge foreliggende oppfinnelse er nyttige for å tilveiebringe herbicidresistens i planter og kan bli konstruert med POX modellen, AHAS modellen, eller funksjonelle ekvivalenter derav, så som for eksempel transketo-laser, karboligaser, puryvatdekarboksylase, proteiner som binder FAD og/eller TPP som en kofaktor, eller hvilke som helst proteiner som har strukturelle likheter med POX og/eller AHAS; med en AHAS modell så som en modell som har sekvensen ifølge figur 1; eller med en funksjonell ekvivalent av sekvensen ifølge figur 1 inkludert en variant utformet fra en tidligere modell. Proteiner som kan bli anvendt innbefatter hvilke som helst av proteinene som har mindre enn et gjennomsnittlig kvadratrotawik ("root mean square deviation") på mindre enn 3,5 ångstrom i deres Ca karboner i forhold til hvilke som helst av ovennevnte molekyler. AHAS rettede herbicider kan bli likeledes utformet fra disse templatene. En funksjonell ekvivalent av en AHAS aminosyresekvens er en sekvens med romlig, dvs. 60-70%, homologi, spesielt i konserverte regioner så som for eksempel, en antatt bindingslomme. Homologigraden kan bli bestemt ved enkel oppstilling basert på programmer kjent innenfor fagområdet, så som for eksempel GAP og PILEUP ifølge GCG. Homologi betyr identiske aminosyrer eller konservative substitu-sjoner. En funksjonell ekvivalent av et bestemt aminosyreresidie i AHAS proteinet ifølge figur 1 er et aminosyreresidie av et annet AHAS protein som når oppstilt med sekvensen i figur 1 ifølge programmer kjent innenfor fagområdet, så som for eksempel, GAP og PILEUP til GCG, er i samme posisjonen som aminosyreresidiet i figur 1.

Rasjonelle konstruksjonstrinn innbefatter vanligvis: (1) oppstilling av et mål AHAS protein med en POX skjelett eller struktur eller et AHAS skjelett eller en struktur; (2) eventuelt, og dersom AHAS skjelettet har en identifisert herbicid bindingslomme, utforming av en eller flere herbicider til den tre-dimensjonale strukturer for å lokalisere en herbicidbindende lomme i målproteinet; (3) seleksjon av et mutasjon basert på modellen; (4) sete-rettet mutagenese; og (5) ekspresjon og rensing av varianter. Ytterligere trekk kan innbefatte (6) analysering av enzymatiske egenskaper og (7) vurdering av egnede varianter ved sammenligning med egenskapene til vill-type AHAS. Hvert trinn er diskutert separat nedenfor.

1. Molekylær utforming

Molekylær utforming (og spesielt protein homologi utforming) teknikker kan tilveiebringe en forståelse for strukturen og aktiviteten til et gitt protein. Den strukturelle modellen til et protein kan bli bestemt direkte fra eksperimentelle data så som røntgen-krystallografi, indirekte ved homologiutforming eller lignende, eller kombinasjoner derav (se White, et al., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 23:349,1994). Bestemmelse av den tre-dimensjonale strukturen til AHAS tilveiebringer grunnlaget for utvikling av et rasjonelt skjema for mutasjon av bestemte aminosyreresidier innenfor AHAS som tilveiebringer herbicidresistens til polypeptidet.

Molekylær utforming av strukturen til Zea mais AHAS, ved anvendelse som et templat den kjente røntgen krystallstrukturen til beslektet pyruvatoksidase (POX) fra Lacto-bacillu plantarum, tilveiebringer en tre-dimensjonal modell på AHAS struktur som er nyttig for konstruering av herbicid-resistente AHAS varianter eller AHAS inhiberende herbicider. Denne utformingsprosedyren drar nytte av det faktum at AHAS og POX har et antall biokjemiske karaktertrekk felles og kan bli avledet fra et felles opphavsgen (Chang et al., J. Bacteriol. 170:3937,1988).

På grunn av høy grad av homologi mellom ulike arter i AHAS kan modellert AHAS beskrevet her eller funksjonelle ekvivalenter derav også bli anvendt som templater for AHAS variantproteinkonstruksjon.

Derivasjon av en modell ved anvendelse av interaktiv molekylær grafikk og oppstilling er beskrevet i detalj nedenfor. Tre-dimensjonal AHAS struktur som er et resultat av denne prosedyren forutsier den aproksimate romlige organisasjon av det aktive setet til enzymet og bindingssetet eller lommen til inhibitorene så som herbicider som inkluderer, men ikke begrenset til, imidazolinonherbicider. Modellen blir deretter forbedret og tolket basert på biokjemiske studier som også er beskrevet nedenfor.

Proteinhomologi utforming krever oppstilling av den primære sekvensen til proteinet som studeres med et andre protein hvor krystallstrukturen er kjent. Pyruvatoksidase (POX) ble valgt fra AHAS homologimodulering på grunn av at POX og AHAS har et antall felles biokjemiske karaktertrekk. For eksempel har både AHAS og POX felles aspekter når det gjelder enzymatiske reaksjonsmekansimer, samt kofaktor og metall-krav. I begge enzymene er tiaminpyrofosfat (TPP), flavinadenindinukleotid (FAD) og et divalent kation nødvendig for enzymatisk aktivitet. FAD formidler en redoksreaksjon iløpet av katalytiske analyser i POX, men har sannsynligvis bare en strukturell funksjon i AHAS, som sannsynligvis er en rudimentær rest fra utvikling av AHAS fra POX. Begge enzymene anvenser pyruvat som et substrat og danner hydroksyletyltiamin pyrofosfat som et stabilt reaksjonsmellomprodukt (Schloss, J.V. et al. In Biosynthesis of branched chain amino acids, Barak, Z.J.M., Chipman, D.M., Schloss, J.V. (eds) VCH Publishers, Weinheim, Germany, 1990).

I tillegg er AHAS aktiviteten tilstede i kimære POX-AHAS proteiner bestående av den N-terminale halvdelen av POX og den C-terminale halvdelen av AHAS, og det er en liten grad av AHAS aktivitet utvist av POX alene. AHAS og POX utviser også lignende egenskaper i oppløsning (Risse, B. et al., Protein Sei. 1: 1699 og 1710,1992; Singh, B.K., & Schmitt,G.K. (1989), FEBS Letters, 258: 113; Singh, B.K. et al. (1989) In: Prospects for Amino Acid Biosynthesis Inhibitos in Crop Protection and Pharmaceutical Chemistry, (Lopping, L.G., et al., eds., BCPC Monograph s. 87). Med øket protein-onsentrasjon gjennomgår både POX og AHAS trinnvise omdanninger fra monomerer til dimerer og tetramerer. Økninger i FAD konsentrasjonen induserer også høyere ordener av subenhetoppstillingen. Den tetramere formen av begge proteinene er mest stabil overfor varme og kjemiske denaturering.

Krystallstrukturen til POX fra Lactobacillus planarium er blitt bestemt av Muller et al., Science 259:965,1993. Foreliggende oppfinnere har oppdaget at basert delvis på grad av fysisk, biokjemisk og genetisk homologi mellom AHAS og POX, bør røntgen-krystallstrukturen til POX bli anvendt som et strukturelt utgangspunkt for homologiutforming av AHAS-strukturen.

AHAS og L. plantarum POX sekvenser var ikke like nok for en fullstendig databasert oppstilling. Bare omtrent 20% av aminosyrene er identiske, mens omtrent 50% av residiene er fra lignende klasse (dvs. sure, basiske, aromatiske og lignende). Dersom sekvensene blir sammenlignet med hensyn på hydrofile og hydrofobe residieklassifi-seringer blir over 500 av 600 aminosyrer parret. Sekundære strukturantagelser for AHAS (Holley et al., Proe. Natl.Acad.Sci.USA 86:152 1989) viste en sterk likhet med den virkelige sekundære strukturen til POX. For nesten 70% av residiene samsvarer antatt AHAS sekundær struktur den til POX.

POX monomerer består av tre domener som alle har et sentralt, parallelt 13-ark med overkrysninger bestående av a-helikser og lange løkker. (Muller et al., Science 259: 965,1993). Topologien til arkene er forskjellig i domenene, dvs. i første og tredje domener er trådene oppstilt i B-ark i sekvensen 2-1-3-4-6-5, mens i B-arket til den andre domenen er sekvensen 3-2-1-4-5-6.

Datadannede oppstillinger var basert på sekundærstrukturantagelser og sekvenshomologi. Konvensjonell par-vis sekvensoppstillingsmetoden beskrevet av Needleman and Wunch, J. Mol. Biol. 48:443,1970, ble anvendt. To sekvenser ble oppstilt for å maksi-malisere oppstillingsscoringen. Oppstillingsscoring (homologiscoring) er summen av scoringer for alle par av oppstilte residier, pluss en valgfri straff for innføring av GAP i oppstillingen. Scoringen for oppstilling av et par residier er en tabulert tallverdi. Homologiscoirngssystemet er basert på observering av divergensrfekvensen mellom et gitt residiepar. (MO Dayhoff, RM Schwartz & BC Orcutt "Atlas of Protein Sequence and Sturcture" vol. 5. suppl. 3 s. 345-362,1978).

Oppstillingene ble ytterligere forbedret ved reposisjonering av GAP for å konservere kontinuerlige regulære sekundære strukturer. Aminosyresubstitusjoner dannet ved vurdering av sannsynlige oppstillingsskjemaer ble sammenlignet ved hjelp av interaktiv molekylær grafikk. Oppstillinger med de mest konservative substitusjonene med hensyn til den bestemte funksjonaliteten til aminosyrene innenfor et gitt sete ble valgt. Den endelige oppstillingen av både POX og AHAS er vist i figur 2. Konserverte opphop-ninger av residier ble identifisert, spesielt for TPP bindingssetet og for deler av FAD bindingssetet. Oppstillingen viste en høy likhet mellom AHAS og POX for den første domenen, for de fleste delene av den andre domenen, og for omtrent halvparten av den tredje domenen. Det meste av regionene som ble dårlig oppstilt og kan bli foldet på annen måte i POX og i AHAS var ventet å være på overflaten av proteinet og var ikke involvert i kofaktor eller inhibitorbinding. Bestemmelse av mutasjonsseter blir ikke vesentlig påvirket av små skift i oppstillingen.

De fleste TPP bindingsresidiene er sterkt konserverte mellom POX og AHAS (for eksempel P48-G49-G50). I noen tilfeller er noen av residiene som var nær opptil TPP forskjellige mellom POX og AHAS, men forblir i en region som er sterkt konservert (for eksempel residene 90-110). Derimot ser det ut til at FAD bindingssetet er mindre konservert. Til tross for at noen FAD bindende residier ble sterkt konservert (for eksempel D325-I326-D327-P328), var andre klart forskjellige mellom AHAS og POX (for eksempel, residiene i løkken fra posisjonen 278 til 285 er ikke homologe). En detaljert analyse viste at, i det minste for noen av de mindre konserverte kontaktsetene, at interaksjoner var formidlet av polypeptidskjelettet i stedenfor av sidekjedene. Konserveringen var bare nødvendig for polypeptidfoldingen og var ikke nødvendig for aminosyresekvensen (for eksempel skjelettet til residiene 258-263 binder ribitolkjeden til FAD). En halvpart av adenin og isoaloksazin bindingsseter er klart forskjellige.

Etter opptelling av primærstrukturen ble en homologimodell dannet ved transposisjonen av AHAS aminosyresekvensene til POX templatstrukturen. Manglende koordinater ble trinnsvis dannet ved anvendelse av templater av aminosyreresidier til fullstendige udefinerte sidekjeder. Databanksøk og energiminimalisering av små deler av molekylet ble anvendt for å fullføre konformasjonene til de udefinerte løkkeregionene. Kofaktorene TPP og FAD ble utformet til deres bindingslommer. Denne modellen ble deretter utsatt for en fullstendig, 5000 syklusenergiminimalisering. All datautforming ble utført i en IRIS Indigo Elan, R4000 arbeidsstasjon fra Silicon Graphics Co. Interactive og molekylær utforming og energi-minimalisering ble utført ved anvendelse av Quanta/- CHARMm 4,0 fra Molecular Simulations Inc. I løpet av dette trinnet var konformasjonen stabil og indikerer at ingen sterkt uønskede interaksjoner, så som for eksempel nære van der Waals kontakter hadde oppstått. Resultatene er vist skjematisk i figur 3.

Karaktertrekkene til antatt AHAS struktur

Inspeksjon av utformet AHAS struktur beskrevet ovenfor viste at det meste av proteinet blir foldet med et skjelett som er energetisk godtagbart, med flest hydrofile sidekjeder mottagelige for oppløsningsmiddelet. Overflaten til 6-arkene er glatte og akkomoderer overkrysningsregionene som er koblet til disse.

En modell for dimer AHAS ble dannet ved duplikering av koordinatene til energimini-malisert monomer AHAS og overlegging av de to kopiene på to POX subenheter ved anvendelse av par av Ca koordinater som definert i oppstillingsskjemaet. Polypeptid-kjeden til AHAS blir foldet i tre likeledes foldede domener bestående av en 6-trådet parallelt B-ark kjerne omgitt av lange "løkker" og a-helikser. To subenheter er oppstilt slik at den første domenen til en subenhet er i nærhet med kofaktorbindende domene 2 og 3 til den andre subenheten. Et oppløsningsmiddelfylt område forblir mellom sub-enhetene i dette setet. Denne lommen, som er definert av konfluensen til de tre domenene, er det antatte innføringssetet for substratet. Det antas også å være bindingssetet for herbicider.

Den indre overflaten til bindingslommen er beskrevet av kofaktorene. Tiazol til TPP er beliggende i bunnen av lommen. Domene 3 bidrar til den indre overflaten av lommen med en kort a-heliks hvor aksen peker mot pyrofosfat til TPP, med kompensasjon av fosfatladninger med dets dipolare moment. Denne kritiske heliksen, som begynner med G498, et "vende" residie i nær kontakt med TPP, og som slutter ved F507, inneholder tre kjente mutasjonsseter for sulfonylurea resistens: V500, W503 og F507 (se US-PS 5.013.659; 5.141.870 og 5.378.824). I domene 1 vender løkken definert som P48-S52 (mellom fi-tråd 2 og a-heliks 2) mot W503, en mutasjon som utviser resistens mot imidazolinoner. Residiene Y47 til G50 er også i kontakt med TPP. Denne løkken er ved siden av P184-Q189, en annen sving, som kobler den siste tråden av B-ark av domene 1 med en fl-tråd som blir koblet med domene 2. Innenfor lommen, nære ved inngangen, er en lang region av domene 1 som reagerer med et komplementært stykke av domene 2. Residiene 125-129 og 133-137 av domene 1 og residiene 304-313 av domene 2 er ved overflaten av lommen. En sving bestående av T96-G100 er mellom løkke 125-129 og TPP. Et ytterligere område av domene 3 og to regioner av domene 2 som kler bindingslommen er i motsatt hjørne av lommen. Residiene 572, 575, 582 og 583 av domene 3 definerer lommeoverflaten på den ene siden. Den gjenværende delen av det indre av lommens overflate er definert av FAD og av en løkke, L278-G282, som kontakter isoalloksazin ringen til FAD.

De strukturelle modellene til AHAS proteinet kan også bli anvendt for rasjonell konstruksjon av herbicider eller AHAS inhibitorer.

2. Utforming av herbicider til bindingsseter

Imazethapyr, det aktive imidazolinonet i PURSUIT®, ble plassert inn i dets antatte

bindingssete ved anvendelse av interaktiv molekylær grafikk (figur 4) og data beskrevet ovenfor (figur 4). Kl 85 ble valgt som et "anker" for å reagere med ladninger til karbok-sylgruppen. Imidazolinonets NH-CO enhet ble plassert for å danne hydrogenbindinger

til G50 og A51. Dette posisjonerte metylsubstituttet av imazethapyr er opp til V500 på skjelettet til a-heliks. Isopropylgruppen blir muligens bundet av hydrofobe residier til aminosyrene i regionen av residiene 125- 135 som bidrar til den indre overflaten av lommen. Pyridinringen blir mest sannsynlig "sandwich" mellom A134 eller F135, F507 og W503. W503 reagerer også med imidazolinon ringsystemet.

På en lignende måte ble sulfonylureaherbicider utformet i et sete som delvis overlapper det beskrevne imidazolinonbindingssetet. Overlappingen av sulfonylurea og imidazoli-nonbindingssetene var i samsvar med konkurreringsbindingseksperimenter og med etablerte mutante data, som viser at den samme mutasjonen i mais, WO503L, kan utvise resistens overfor begge herbicidene. I disse modellene er de fleste kjente mutasjonssetene som utviser sulfonylureaherbicidresistens, dvs. G50, A51, Kl85, V500, W503, F507 i nær kontakt med bundede herbicider. Pl26 og A51 er nødvendig for å holde Kl 85 sidekjeden på plass ved å danne en hydrofob pore. S582, et sete for spesifikk imidazolinonresistens, er lang fra bindings-regionen og er beliggende i regionen hvor homologien er så dårlig at en forandring i folden er ventet. FAD bindingssetet har sannsynligvis lav homologi mellom AHAS og POX i denne regionen; S582 er et residie som utviser resistens i mais, og denne S582 og dets ved siden av liggende residier er i næ kontakt med aktiv setelommen. Det antas at FAD og løkkeregionen omfattende residiene 278 til 285 er beliggende litt bort fra den tredje domenen, (nedover i figur 4) og at en løkke som inneholder S582 blir foldet i rommet mellom heliksen i posisjonene 499 til 507 og løkken i posisjonene 278 til 285. D305, et annet kjent resistenssete er i nærheten av FAD og modulerer interaksjonen mellom domenene 1 og 2. M280 er enten involvert i posisjonering av heliksen i posisjonene 498 til 507 eller direkte i inhibitorbinding. M280 og D305 kan også være direkte involvert i den inhiberende bindingen dersom domenene 1 og 2 blir flyttet noe nærmere hverandre.

3. Seleksjon av mutasjoner

Spesifikke aminosyreresidier er nøyaktig bestemt som seter for innføring av mutasjoner i den primære sekvensen til AHAS. Disse aminosyrene blir selektert på deres posisjon ved at dersom denne aminosyreresidieposisjonen er modifisert vil det være en resulterende endring (dvs. reduksjon) i affiniteten som et herbicid har for bindingslommen. Det er ikke nødvendig at mutasjonsposisjonen ligger i bindingslommen, idet aminosyreresidiene utenfor selve lommen kan endre lommeladningen eller konfigurasjonen. Seleksjon av målseter for mutasjon blir oppnådd ved anvendelse av molekylære modeller som beskrevet ovenfor. For eksempel ifølge modellen ovenfor, er arginin i posisjon 128 betegnet RI 28 i figur 1 ved anvendelse av enkelt-bokstavkoden for aminosyrene (beliggende nære inngangen til substrat- og herbicid-bindingslommen og har en større grad av konformasjonsfrihet som kan muliggjøre at den deltar i transporten av ladede herbicider inn i bindingslommen. Dette residiet er derfor erstattet av alanin for å fjerne både dets ladning og dets lange hydrofobe sidekjede. (Resulterende mutasjon er betegnet RI 28A).

Mutasjonene kan omfatte enkeltmutasjoner som erstatter vill-type sekvensen med en

hvilke som helst annen aminosyre. Alternativt kan mutasjonene omfatte delesjoner eller addisjoner av en eller flere aminosyrer, fortrinnsvis opptil 5, ved et gitt sete. Den tilsatte sekvensen kan omfatte en aminosyresekvens kjent for å eksistere i et annet protein, eller kan omfatte en fullstendig syntetisk sekvens. Videre kan mer enn en mutasjon og/eller

mer enn en mutasjonstype bli introdusert i et enkelt polypeptid.

4. Sete- rettet mutagenese

DNA kodende for AHAS kan bli manipulert for å innføre ønskede mutasjoner. Mutagenesene blir utført ved anvendelse av metoder som er standard ifølge fagområdet, som beskrevet i for eksempel Higuchi, R., Recombinant PCR, In M.A. Innis, et al., eds, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, s. 177-183, 1990.

5. Ekspresjon og rensing av varianter

Mutante eller variant AHAS sekvensen blir klonet inn i en DNA ekspresjonsvektor (se for eksempel eksempel 3) og blir uttrykt i en egnet celle så som for eksempel, E. coli. Det er foretrukket at DNA kodende for AHAS er koblet til et transkripsjonsregulatorisk element, og varianten AHAS blir uttrykt som del av et fusjonsprotein, for eksempel, glutation-S-transferase, for å lette rensingen (se eksempel 3 nedenfor). Variant AHAS blir deretter renset ved anvendelse av affinitetskromatografi eller en annen egnet metode kjent innenfor fagområdet. "Rensing" av et AHAS polypeptid refererer til isolering av AHAS polypeptidet i en form som muliggjør at dets enzymatiske aktivitet blir målt uten innvirkning av andre komponenter i cellen hvori polypeptidet blir uttrykt.

6. Analysering av enzymatiske egenskaper

Renset variant AHAS kan bli analyser for en eller flere av følgende tre egenskaper:

(a) spesifikk eller katalytisk aktivitete for omdanning av pyruvat til acetolaktat (uttrykt som enheter/mg ren AHAS, hvori en aktivitetsenhet er definert som 1 umol acetolaktat produsert/time), eller for kondensasjon av pyruvat og 2-ketobutyrat for å danne acetohydroksybutyrat (uttrykt som enheter/mg ren AHAS, hvori en aktivitetsenhet er definert som 1 umol acetohydroksybutyrat produsert/t.; (b) inhibisjonsnivåer av herbicidet, så som for eksempel imidazolinon (uttrykt som IC50, konsentrasjon hvorved 50% av aktiviteten til enzymet er inhibert); og (c) selektiviteten til motstanden overfor selektert herbicid vs. andre herbicider. Selektivitetsindeksen er definert som ganger resistens som mutanten har overfor imidazolinoner i forhold til vill-typeenzym, delt på ganger resistens som samme mutant har overfor andre herbicider også i forhold til vill-typen). Ganger resistens overfor et herbicid i forhold til vill-type enzymet blir uttrykf som IC50 til varianten, del på IC50 til villtypen. Selektivitetsindeksen (S.I.) kan derfor bli representert i følgende ligning:

Egnede analysesystemer for å danne disse bestemmelsene innbefatter, men er ikke begrenset til, de som er beskrevet i detalj i eksempel 4 nedenfor.

7.a. Vurdering av egnede varianter

De enzymatiske egenskapene til variant AHAS polypeptidene blir sammenlignet med villtype AHAS. Det er foretrukket at en gitt mutasjon resulterer i et AHAS variant

polypeptid som beholder dets in vitro enzymatiske aktivitet overfor puryvat og pyruvat og 2-ketobutyrat, dvs. omdanningen av pyruvat til acetolaktat eller ved kondensasjon av pyruvat og 2-ketobutyrat for å danne acetohydroksybutyrat (og som følgelig er ventet å være biologisk aktive in vivo), mens en utviser katalytisk aktivitet som er relativt mer

resistent overfor selekterte herbicider enn vill-type AHAS. Det er foretrukket at variant AHAS utviser:

(i) i fravær av minst et herbicid,

(a) katalytisk aktivitet alene tilstrekkelig for å opprettholde levedyktigheten til en celle

som den blir uttrykt i; eller

(b) katalytisk aktivitet i kombinasjon med et hvilket som helst herbicid resistent AHAS

variantprotein som også blir uttrykt i cellen, som kan være den samme som eller forskjellig fra første AHAS variantprotein, tilstrekkelig for å opprettholde levedyktigheten til en celle som det blir uttrykt i; hvori cellen krever AHAS aktivitet for levedyktighet; og

(ii) katalytisk aktivitet som er mer resistent overfor minst et herbicid enn villtype

AHAS;

og som er relativt mer resistent overfor herbicidet enn villtype AHAS.

Et hvilket som helst spesifikt AHAS variantprotein trenger ikke å ha den totale katalytiske aktiviteten nødvendig for å opprettholde levedyktigheten til cellen, men må ha en viss katalytisk aktivitet i en mengde, alene eller i kombinasjon med den katalytiske aktiviteten av ytterligere kopier av samme AHAS variant og/eller den katalytiske aktiviteten til andre AHAS variant proteiner, tilstrekkelig for å opprettholde levedyktigheten til en celle som krever AHAS aktivitet for levedyktighet. For eksempel kan den katalytiske aktiviteten bli øket til minimale akseptable nivåer ved å innføre flere kopier av en variant kodende for genet inn i cellen eller ved å innføre genet som videre innbefatter en relativt sterk promoter for å forsterke produksjonen av varianten.

Mer resistent betyr at den katalytiske aktiviteten til varianten blir redusert av herbicidet, om i det hele tatt, i en mindre grad enn vill-type AHAS katalytisk aktivitet blir redusert av herbicidet. Foretrukket mer resistent variant AHAS forblir tilstrekkelig katalytisk for å opprettholde levedyktigheten til en celle, plante eller organisme hvori ved samme konsentrasjon av samme herbicid ville vill-type AHAS ikke opprettholde tilstrekkelig katalytisk aktivitet for å opprettholde levedyktigheten til cellen, planten eller organismen.

Det er foretrukket at den katalytiske aktiviteten i fravær av herbicider er på minst omtrent 5%, og mest foretrukket, mer enn omtrent 2% av den katalytiske aktiviteten til vill-type AHAS i fråvær av herbicider. De mest foretrukne AHAS variantene er mer resistente overfor imidazolinonherbicider enn andre herbicier så som sulfonylurea-baserte herbicider, men i noen søknader er selektivitet hverken nødvendig eller foretrukket.

Når det gjelder imidazolinonresistent variant AHAS er det foretrukket at AHAS variantproteinet har

(i) katalytisk aktivitet i fravær av nevnte herbicid på mer enn omtrent 20% av den katalytiske aktiviteten til nevnte vill-type AHAS; (ii) katalytisk aktivitet som er relativt mer resistent overfor tilstedeværelse av imidazolinonherbicider sammenlignet med villtype AHAS; og (iii) katalytisk aktivitet som er relativt mer sensitiv overfor tilstedeværelse av sulfonylureaherbicider sammenlignet med imidazolinonherbicider. De mest foretrukne herbicid-resistente AHAS varianter utviser en minimal spesifikk aktivitet på omtrent 20 enheter/mg, minimal eller ingen inhibisjon av imidazolinon, og en selektivitetsindeks som varierer fra omtrent 1,3 til omtrent 3000 i forhold til andre herbicider.

Uten å være bundet til noen teori antas det at systematisk og interativ applikasjon av denne metoden til villtype eller annet mål AHAS protein vil resultere i produksjon av AHAS varianter som har de ønskede egenskapene som omfatter høy enzymatisk aktivitet som forklart ovenfor og resistens overfor en eller flere klasser av herbicider. For eksempel kan mutasjon av en villtype AHAS sekvens ved en bestemt posisjon til en gitt aminosyre resultere i en mutant som utviser en høy grad av herbicid resistens, men et betydelig tap av enzymatisk aktivitet overfor pyruvat eller puryvat og 2-ketobutyrat. I en annen søknad av ovennevnte metode, vil begynnende eller mål AHAS polypeptidet deretter være denne varianten (i stedenfor vill-type AHAS). Rasjonell konstruksjon innbefatter følgelig substituering av andre aminosyrer ved den opprinnelige muterte posisjonen og/eller tilsetning eller deletering av aminosyrer ved selekterte posisjoner eller områder ved å anta opprettholdelse av herbicidresistens, men også opprettholdelse av et høyere nivå av enzymatisk aktivitet.

Den strukturbaserte rasjonelle konstruksjonen av herbicidresistente AHAS proteiner gir mange fordeler i forhold til konvensjonelle metoder som bygger på tilfeldig mutagenese og seleksjon. Når substitusjon av en bestemt aminosyre med en annen krevet substitusjon av mer enn et nukleotid i kodonet, er sannsynligheten for at dette oppstår tilfeldig så lav at det ikke er praktisk. I kontrast til dette, selv dobbelt eller trippel forandringer i nukleotidsekvensen innenfor et kodon kan lett bli implementert, når foreslått ved en rasjonell konstruksjonsmetode. En rasjonell konstruksjonsmutasjon for å utvise selektiv imidazolinonresistens krever en forandring fra arginin til glutamat. Arginin blir kodet av CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG, mens glutamat blir kodet av GAA og GAG. På grunn av at ingen av argininkodonene begynner med GA, vil denne mutasjonen kreve en dobbelsubstitusjon av ved siden av liggende nukleotider som vil oppstå så sjeldent ved anvendelse av tilfeldig mutagenese at det er usannsynlig at det vil resultere i vellykket resultat. Til tross for at mutasjonsfrekvensen kan bli øket i løpet av den tilfeldige mutagensen, vil endringer i nukleotidsekvensen ha en like stor sannsynlighet for å oppstå i AHAS genet, i fravær av tidligere sete-retting av mutasjonene. Dette øker sjansen for å oppnå en irrelevant mutasjon som interfererer med den enzymatiske aktiviteten. Det ere sjeldent, ved anvendelse av tilfeldig mutagenese, å finne en multippel aminosyresubstitusjon, delesjon eller substitusjon/delesjonsmutasjon som utviser herbicidresistens, mens den katalytiske aktiviteten opprettholdes. Delesjonsmutasjoner som utviser herbicidresistens er også usannsynlig ved anvendelse av en tilfeldig mutagenesemetode. Delesjoner må være begrenset til små regioner og ville måtte oppstå i tripletter for å beholde AHAS avlesningsrammen for å opprettholde enzymatisk aktivitet.

Med en rasjonell struktur-basert metode, blir dobbelt aminosyresubstitusjon og/eller delesjonsmutasjoner relativt lett oppnådd og nøyaktig målsøkt. Forskjellige mutagener anvendt i tilfeldig mutagenese danner spesifikke typer av mutasjoner. For eksempel danner natriumazid punktsubstitusjonsmutasjoner i planter, mens bestrålning pleier å danne delesjoner. To mutagenseprotokoller må følgelig bli anvendt for å oppnå en multippel kombinasjon substitusjon/delesjon.

Foreliggende struktur-baserte metode for rasjonell konstruksjon av herbicid-resistente AHAS varianter muliggjør forbedring av herbicidresistens mutasjoner, et trinn som ikke blir oppnådd ved tilfeldig mutagenese. Identifikasjon av et substitusjonssete for herbicidresistens ved tilfeldig mutagenese kan tilveiebringe liten, om noen, forutsigbar verdi for rettledning av ytterligere forbedringer i karaktertrekkene til mutanten. Den foreliggende strukturbaserte metoden muliggjør derimot for forbedringer basert på posisjonen, omgivelsene og funksjonen til aminosyreposisjonen i den strukturelle modellen.

Den forbedrede metoden muliggjør også uavhengig manipulasjon av tre viktige egenskaper til AHAS: motstandsnivået, selektiviteten til motstanden og den katalytiske effektiviteten. For eksempel kan kompensatoriske mutasjoner bli konstruert på en forutsigbar måte. Dersom en bestemt mutasjon har en skadelig effekt på aktiviteten til et enzym kan en andre kompensatorisk mutasjon bli anvendt for å gjenopprette aktiviteten. For eksempel kan en forandrin i nettoladning innenfor en domene når et ladet residie blir innført eller tapt på grunn av en mutasjon bli kompensert ved innføring av en andre mutasjon. Det å forutsi posisjonen og type av residier som skal bli innført, deletert eller substituert ved det andre setet for å gjenopprette den enzymatiske aktiviteten krever en kunnskap når det gjelder struktur-funksjonsforholdet oppnådd fra en modell som den som blir beskrevet her. 7.b. Konstruksjon av ikke- peptidherbicider eller AHAS inhibitorer En kjemisk del som endrer og som kan passe inn det aktive setet til målproteinet eller bli bundet i en hvilke som helst posisjon hvor den kan inhibere aktiviteten kan bli konstruert ifølge fremgangsmåter kjent innenfor fagområdet, så som for eksempel, datakonstruksjonsprogrammer som assisterer i konstruksjon av forbindelser som spesifikt reagerer med et reseptorsete.

Et eksempel på et slikt program er LUDI (Biosym Technologies - San Diego, CA) (se også Lam et al., Science 263:380,1994; Thompson, et al., J. Med. Chem., 37:3100, 1994).

Bindingslommen og spesielt aminosyreresidiene som er blitt identifisert å være involvert som inhibitorbinding kan bli anvendt som forankringspunkter for inhibitor-konstruksjon.

Konstruksjon av sete-spesifikke herbicider er fordelaktige for kontrollering av ugress-arter som spontant kan utvikle herbicid resistens i felten, spesielt på grunn av mutasjoner i AHAS genet.

Herbicidresistente AHAS varianter: DNA, vektorer og polvpeptider

Foreliggende oppfinnelse omfatter også isolerte DNA molekyler kodende for variant herbicidresistente AHAS polypeptider. Gener kodende for AHAS polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli avledet fra en hvilke som helst art og fortrinnsvis en planteart, og mutasjoner som utviser herbicid resistens kan bli innført ved ekvivalente posisjoner innenfor hvilke som helst av disse AHAS genene. Ekvivalensen til en gitt kodon posisjon i forskjellige AHAS gener er en funksjon av både konservering av primære aminosyresekvens og dets protein og retensjon av lignende tre-dimensjonale struktur. Figur 5 illustrerer for eksempel den høye graden av sekvenshomologi mellom AHAS polypeptider avledet fra forskjellige plantearter. Disse AHAS polypeptidene utviser minst omtrent 60 til omtrent 70% total homologi. Uten å være bundet til noen teori antas det at det i regioner av polypeptidet som har en sterkt konservert sekvens vil polypeptidkjedekonformasjonen også bli konservert. Det er følgelig mulig å anvende en AHAS-kodende sekvens fra en art for molekylær modellering, for å introdusere mutasjoner forutsigbart inn i AHAS genet fra en annen art for opprinnelig testing og forbedring, og til slutt, for å innføre optimaliserte mutasjoner i AHAS avledet fra en tredje planteart for ekspresjon i en transgen plante.

I en serie av utførelsesformer koder disse AHAS for DNA varianter av et AHAS polypeptid og fortrinnsvis fra mais AHAS polypeptid ifølge figur 1 hvor polypeptidet er modifisert ved substitusjon ved eller delesjon før eller etter en eller flere av figur 1 aminosyreresidiene

P48, G49, S52, M53, E54, A84, A95, T96, S97, G98, P99, GlOO; A101, V125, R127, R128, M129. 1130, G131, T132, D133, F135, Q136, D186, 1187, T259, T260, L261, M262, G2G3, R276, M277, L278, G279, H281, G282, T283, V284, G300, V301, R302, F303, D304, R306, V307, T308, G309, K310, 1311, E312, A313, F314, A315, S316, R317, A318, K319, 1320, E329, 1330, K332, N333, K334, Q335, T404, G413, V414, G415, Q416, H417, Q418, M419, W420, A421, A422, L434, S435, S436, A437, G438, L439, G440, A441, M442, G443, D467, G468. S469, L471, N473, L477, M479, Q495. H496, L497, G498. M499, V501, QS02, Q504, D505, R506, Y508, K509, A510, N511, R512, A513, H514, T515, S524, H572, Q573, E574. H575, V576, L577, P578. M579, 1580, P581, G583, G584,

funksjonelle ekvivalenter av hvilke som helst av de foregående; innskudd eller delesjoner mellom figur 1 Q124 og H150 eller funksjonelle ekvivalenter derav; innskudd eller delesjoner mellom figur 1 G300 og D324 eller funksjonelle ekvialenter derav; og hvilke som helst kombinasjon av hvilke som helst av de foregående.

Mutasjoner, når de blir innført i polypeptidet ifølge figur 1 eller ved tilsvarende posisjoner i et annet plante AHAS gen, kan omfatte endringer i DNA sekvensen som resulterer i en enkel substitusjon av hvilke som helst av en eller flere andre aminosyrer eller delesjoner på opptil 5 aminosyreresidier før eller opptil 5 aminosyreresidier etter hvilke som helst av residiene angitt ovenfor. Egnede aminosyresubstitusjoner innbefatter, men er ikke begrenset til, naturlig forekommende aminosyrer.

Alternativt kan mutasjonene omfatte endringer i DNA sekvensen slik at en eller flere aminosyrer blir tilsatt eller deletert i rammen ved ovennenvnte posisjoner. Det er foretrukket at addisjonene omfatter omtrent 3 til omtrent 30 nukleotider, og delesjonene omfatter omtrent 3 til omtrent 30 nukleotider. Et enkelt mutantpolypeptid kan videre inneholde mer enn en lignende eller annen mutasjon.

Foreliggende oppfinnelse omfatter DNA som koder for AHAS variantproteinet. Nukleinsyresekvenser kodende for AHAS polypeptider kan bli flankert av naturlige AHAS regulatoriske sekvenser, eller kan bli assosiert med heterologe sekvenser, inkludert promotere, enhancere, responselementer, signalsekvenser, polyadenylerings-sekvenser, introner, 5'- og 3'-ikke-kodende regioner og lignende. Nuklinsyrene kan bli modifisert for å endre stabilitet, oppløselighet, bindingsafflnitet og spesifisitet. For eksempel kan variant AHAS-kodende sekvenser bli selektivt metylert. Nukleinsyre-sekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også bli modifisert med en markør som har evne til å tilveiebringe et detekterbart signal, enten direkte eller indirekte. Eksempler på markører innbefatter radioisotoper, fluorescensmolekyler, biotin og lignende.

Oppfinnelsen tilveiebringer også vektorer omfattende nukleinsyrer kodende for AHAS varianter. Et stort antall vektorer, inkludert plasmid og soppvektorer, er blitt beskrevet for ekspresjon i forskjellige eukaryote og prokaryote verter. Det er fordelaktig at vektorene også innbefatter en promoter operabelt koblet til AHAS kodende del. Kodet AHAS kan blit uttrykt ved anvendelse av egnede vektorer og vertsceller, ved anvendelse av fremgangsmåtene beskrevet eller sitert heri eller er ellers kjent for fagfolk innenfor det relevante fagområdet. Eksempler på egnede vektorer innbefatter uten begrensning pBIN-baserte vektorer, pBLuescript vektorer og pGEM vektorer.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også både variant herbicid-resistente AHAS polypeptider eller peptidfragmenter derav. Som forklart ovenfor kan variant AHAS polypeptidene bli avledet fra mais polypeptidet vist i figur 1 eller fra en hvilken som helst plante eller mikrobielt AHAS polypeptid, fortrinnsvis plante AHAS polypeptid. Polypeptidene kan bli yttereligere modifisert ved for eksempel fosforylering, sulfoner-ing, acylering, glykosylering eller andre proteinmodifikasjoner. Polypeptidene kan bli isolert fra planter eller fra heterologe organismer eller celler (inkludert, men ikke begrenset til, bakterier, gjær, insekt, plante og pattedyrceller) hvori genet kodende for et variant AHAS polypeptid er blitt introdusert og uttrykt. AHAS polypeptidene kan videre bli modifisert med en markør som har evne til å tilveiebringe et deketerbart signal, enten direkte eller indirekte, inkludert radioisotoper, fluorescensforbindelser og lignende.

Kjemiske- ersistente planter og planter inneholdende variant AHAS gener Foreliggende oppfinnelse omfatter transgene celler og frø, hvori gener kodende for herbicid-resistente AHAS varianter er blitt innført. Ikke-begrensende eksempler på egende mottaker planter er oppført i tabell 1 nedenfor:

Ekspresjon av variant AHAS polypeptider i transgene planter utviser en høy grad av resistens overfor herbicider inkludert, men ikke begrenset til, imidazolinonherbicider så som for eksempel imazethapyr (PURSUIT®), som muliggjør anvendelse av disse herbicidene i løpet av dyrking av transgene planter.

Fremgangsmåte for innføring av fremmede gener inn i planter er kjente innenfor fagområdet. Ikke-begrensende eksempler på slike metoder innbefatter Agrobacterium infeksjon, partikkel bombardement, polyetylenglykol (PEG) behandling av protoplaster, elektroporasjon av protoplaster, mikroinjeksjon, makroinjeksjon, tiller injeksjon, poUenrørreaksjonsvei, tørr frø imibisjon, laserperforasjon og elektroforese. Disse fremgangsmåtene er for eksempel beskrevet i B. Jenes et al., og S.W. Ritschie et al. In Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, ed. S. -D. Kung, R. Wu, Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich 1993; og L. Mannonen et al., Critical Reviews in Biotechnology, 14:287-310,1994.

I en foretrukket utførelsesform blir DNA kodende for en variant AHAS klonet inn i en DNA vektor inneholdende et antibiotikaresistensmarkørgen, og rekombinant AHAS-DNA inneholdende plasmid blir innført i Agrobacterium tumefaciens inneholdende et Ti plasmid. Dette "binær vektorsystemet" er beskrevet i, for eksempel, US-patent 4.490.838 og i An et al., Plant Mol. Biol. Manual A3: 1-19 (1988). Transformert Agrobacterium blir deretter dyrket sammen med bladskiver fra mottagerplanten for å muliggjøre infeksjon og transformasjon av plantecellene. Transformerte planteceller blir deretter dyrket i regenereirngsmedium som fremmer dannelsen av skudd, først i nærvær av hensiktsmessig antibiotika for å selektere for transformerte celler, deretter i nærvær av herbicid. I plantecellene vellykket transformert med DNA kodende for Herbicid-resistent AHAS oppstår skuddannelse selv i nærvær av nivåer av herbicid som inhiberer skuddannelse fra ikke-transformerte celler. Etter bekreftelse på tilstedeværelse av variant AHAS DNA ved anvendelse av for eksempel polymerasekjedereaksjon (PCR) analyser, blir transformerte planter testet for deres evne til å motstå herbicid spraying og for deres evne til frøformering og rotinitiering og proliferasjon i nærvær av herbicid.

Andre anvendelser

Fremgangsmåtene og sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli anvendt i struktur-basert rasjonell konstruksjon av herbicid-resistente AHAS varianter som kan bli inkorporert i planter for å utvise selektiv herbicid resistens hos plantene. Intermediære varianter av AHAS (for eksempel varianter som utviser sub-optimal spesifikk aktivitet, men høy motstand og selektivitet, eller det motsatte (er nyttige som templater for konstruksjon av andre-generasjons AHAS varianter som har beholdt tilstrekkelig spesifikk aktivitet og høy resistens og selektivitet.

Herbicidresistente AHAS gener kan bli transformert i avlingsarter i enkelt eller multiple kopier for å utvise herbicid resistens. Genetisk konstruering av arter i avling med redusert sensitivitet overfor herbicider kan: (1) øke spekteret og fleksibiliteten av anvendelse av spesifikke effektive og miljømessige benigne herbicider så som imidazolinonherbicider; (2) forsterke den kommersielle verdien til disse herbicidene; (3) redusere frøtrykket i avlingsfelter ved effektiv anvendelse av herbicider på herbicid resistente avlingsarter og en tilsvarende økning i innhøstningsutbyttet; (4) øke salget av frø for herbicid-resistente planter; (5) øke motstanden mot avlingsskader fra overføring av herbicider anvendt i en tidligere plantning; (6) redusere mottageligheten mot forandringer i herbicid karaktertrekk på grunn av negative klimabeitngelser; og

(7) øke toleransen overfor ujevnt eller feilpåførte herbicider.

For eksempel kan transgene AHAS variantprotein inneholdende planter bli dyrket. Avlingen kan bli behandlet med en frøkontrollerende effektiv mengde av herbicid som AHAS variant transgen plante er resistent overfor og som resulterer i frøkontroll i avlingen uten negativt å påvirke den dyrkede avlingen.

DNA vektorer beskrevet ovenfor som koder for herbicid-resistente AHAS varianter kan videre bli anvendt slik at ekspresjonen av AHAS varianten tilveiebringer en selekterbar markør for transformasjon av cellene ved vektoren. De antatte mottakercellene kan være i kultur eller in situ, og AHAS variantgenene kan bli anvendt alene eller i kombinasjon med andre selekterbare markører. Det eneste kravet er at mottakercellen er sensitiv overfor cytotoksiske effekter til kognatherbicidet. Denne utførelsesformen drar nytte av de relativt lave kostnadene og mangelen på toksisitet til for eksempel imidazolinonbaserte herbicider, og kan bli anvendt i et hvilket som helst system som krever DNA-mediert transformasjon.

Eksemplifikasjon med hensyn til foretrukne utførelsesformer

Følgende eksempler skal illustrere foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1: Konstruksjon av herbicidresistente AHAS varianter

Residier beliggende nær opptil det antatte herbicid bindende setet til modellen beskrevet i detalj ovenfor ble selektert for mutagenese for å konstruere et aktivt AHAS polypeptid med redusert herbicidbindende kapasitet. Hvert sete på overflaten av lommen ble betraktet med hensyn på potensielle interaksjon med andre residier i lommen, samt med kofaktorer og herbicider. For eksempel er det ventet at tilføring av positivt ladede residier for å interfere med ladningsfordelingen innenfor bindingssetet resulterer i et tap av affinitet for binding av et negativt-ladet herbicid.

Tre residier ble identifisert som mest nyttige mål for mutagenese:

(1) Fl35 ble antatt å reagere med både isoalloksazinringen til FAD og med den aromatiske gruppen til herbicidene. I henhold til strategien for innføring av mer

ladede residier inn i bindingslommen ble dette residiet endret til arginin.

(2) M53 kontakter helix 498-507. Denne helixen inneholder kjente herbicid resistens mutasjonsseter og er også implisert i TPP bindingen. Substitusjon av glutaminsyre i posisjon 53 ble antatt å favorisere en interaksjon med Kl 85 og redusere affiniteten

til Kl 85 for karboksylatgruppen til imazethapyr.

(3) R128 er beliggende nær inngangen til lommen, hvor den er antatt å være involvert i den opprinnelige transporten av ladede herbicider inn i bindingslommen. Dette residiet ble endret til alanin for å fjerne både dets ladning og dets lange hydrofobe sidekjede.

Eksempel 2: Seterettet mutagenese av AHAS for å produsere herbicidresistente varianter

Arabidopsis AHAS genet ble skutt inn i ramme til 3'-enden av den kodende regionen til glutation S-transferasegenet i pGEX-2T vektoren (Pharmacia). Konstruksjon av vektoren på denne måten opprettholdt 6 aminosyretrombin gjenkjenningssekvensen ved grensen til det uttrykte glutation S-transferase (GST)/AHAS fusjonsproteinet. Trombinspaltning av uttrykt fusjonsprotein resulterte i et AHAS protein med en N-terminal utgangsposisjon i enden av transittpeptidet ved et antatt transittpeptidprosesseringssete, med en gjenværende N-terminal glycin avledet fra trombin gjenkjenningssetet. Den endelige aminoterminale enden til spaltet AHAS protein består av Gly-Ser-Ser-Ile-Ser. Seterettede mutasjoner ble ført inn i AHAS genet i denne vektoren.

Seterettede mutasjoner ble konstruert ifølge PCR metoden til Higuchi (Recombinant PCR. In MA Innis, et al. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, s. 177-183,1990). To PCR produkter, hver som overlapper mutasjonssetet, ble amplifisert. Primerene i den overlappende regionen inneholdt mutasjon. Overlappende PCR amplifiserte fragmenter ble kombinert, denaturert og på ny smeltet sammen og produserte to mulige heterodupleksprodukter med inngående 3'-ender. De inngående 3'-endene ble utvidet av Taq DNA polymerase for å produsere et fragment som var summen av de to overlappende PCR produktene som inneholdt den ønskede mutasjonen. En påfølgende reamplifikasjon av dette fragmentet med bare to "utenfor" primere resulterte i anrikning av full-lengde produktet. Produktet inneholdende mutasjonen ble deretter på ny introdusert i Arabidopsis AHAS genet i pGEX-2T vektoren.

Eksempel 3: Ekspresjon og rensing av AHAS varianter

A. Fremgangsmåter

E. coli (DHFcc) celle transformert med pGEX-2T vektoren inneholdt enten mais villtype AHAS genet (vektorbetegnelse pAC751), Arabidopsis Ser653Asn mutant, eller Arabidopsis Ile401Phe mutanten ble dyrket over natt i LB kraft inneholdende 50 ug/ml ampicillin. Over natt kulturen av E. coli ble fortynnet 1:10 i 1 L LB, 50 ug/ml ampicillin og 0,1% v/v antifoam A. Kulturen ble inkubert ved 37°C med risting helt til ODgQO nådde omtrent 0,8. Isopropyltiogalaktose (IPTG) ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 1 mM og kulturen ble inkubert i 3 ytterligere timer.

Cellene ble høstet ved sentrifugering ved 8,670 x g i 10 mimutter i en JA-10 rotor og resuspendert i 1/100 av opprinnelig kulturvolum i MTPBS (16 mM Na2HP04,4 mM NaH2P04,150 mM NaCl, pH 7,3). Triton X-100 og lysozym ble tilsatt til endelig konsentrasjon på 1% v/v og 100 ug/ml. Cellene ble inkubert ved 30°C i 15 minutter, avkjølt til 4°C på is og ble lysert ved sonikering i 10 sekunder på nivå 7 med en Branson Sonifer Cell Disrupter utstyrt med en mikrotipprobe. Det cellefrie ekstraktet ble sentri-fugert ved 35.000 x g i 10 min. ved 4°C. Supernatanten ble dekantert og sentrifugerings-trinnet ble gjentatt.

Rensing av uttrykte fusjonsproteiner ble utført som modifisert fra Smith and Johnson (Gene 67:31-40), 1988). Supernatanten ble varmet til romtemperatur og ble sendt gjennom en 2 ml kolonne glutation-agarose kuler (svovelbinding, Sigma) ekvilibrert i MTPBS. Kolonnen ble deretter vasket med MTBPS ved romtemperatur helt til A2go til elueringsmiddelet var i samsvar med MTPBS. Fusjonsproteinet ble deretter eluert ved anvendelse av en oppløsning inneholdende 5 mM redusert glutation i 50 mM tris HC1, pH 8,0. Det eluerte fusjonsproteinet ble behandlet med omtrent 30 NIH enheter trombin og dialysert mot 50 mM sitrat pH 6,5 og 150 mM NaCl.

Fusjonsproteinet ble spaltet over natt ved romtemperatur. Spaltede prøver ble dialysert mot MTPBS og sendt to ganger gjennom en glutation-agarosekolonne ekvilibrert i MTPBS for å fjerne frigjort glutationtransferaseprotein. Proteinfraksjonen som ikke ble bundet til kolonnen ble samlet og ble konsentrert ved ultrafiltrering på et IM 10 filter (Amicon). Den konsentrerte prøven ble applisert på en 1,5 x 95 cm Sephacryl S-100 gelfiltreringskolonne ekvilibrert i gelfiltreringsbuffer (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,0). To gelfraksjoner ble samlet ved en strømningsrate på 0,14 ml/min. Enzym-stabiliteten ble testet ved lagring av enzymet ved 4°C i gelfiltreringsbuffer ved tilsetning av 0,02% natriumazid og i nærvær eller fravær av 2 mM tiaminpyrofosfat og 100 um flavinadenindinukleotid (FAD).

B. Resultater

E. coli transformert med Pac571 plasmid inneholdende vid-type AHAS gen fusjonert nedstrøms og i ramme med GST genet uttrykte et 91 kD protein når indusert med IPTG. 91 kD proteinet utviste den antatte molekylvekten til et GST/AHAS fusjonsprotein (summen på henholdsvis 26 kD og 65 kD). Når det cellefrie ekstraktet av DH5a /pAC751 ble sendt gjennom en glutation-agarose affinitetsgel, vasket og eluert med fri glutation ble det tilveiebrakt et preparat anriket i 91 kD proteinet (figur 6, kolonne C). Seks aminosyretrombin gjenkjenningssetet omkonstruert i grensen av GST og AHAS ble vellykket spaltet av trombin (figur 6, kolonne D). Det spaltede fusjonsprotein-preparatet besto av ventet 26 kD GST proteinet og 65 kD mais AHAS proteinet. Mais AHAS ble renset til homogenisitet ved en andre føring gjennom glutation-agarose-kolonnen for å affinitetssubtrahere GST og utsatt for et endelig Sephacryl S-100 gelfiltreringstrinn for å eliminere trombin (figur 6, kolonne E). 65 kD proteinet blir gjenkjent på Western blot av et monoklonalt antistoff dannet mot et mais AHAS peptid.

Renset villtype mais AHAS ble analysert ved elektrospray massespektrometri og ble bestemt å ha en molekylvekt på 64,996 dalton (data ikke vist). Den antatte massen, som beregnet fra avledet aminosyresekvens til genet skutt inn i pGEX-2T vektoren, er 65,058. 0,096% diskrepanse mellom empirisk bestemt og antatt masse var innenfor innstillingsvariabiliteten til massespektrometeret. Nærheten til de to massebestemm-elsene tydet på at det ikke var noen feilinkorporerte nukleotider i løpet av konstruksjon av ekspresjonsvektoren, og heller ingen post-translasjonelle modifikasjoner til proteinet som vil forårsake store forandringer i molekylmassen. Mangel på ukjente topper i preparatet av renset enzym indikerte av prøven var fri for kontaminasjon.

Eksempel 4: Enzymatiske egenskaper til AHAS variantene

De enzymatiske egenskapene til vill-type og variant AHAS produsert i E. coli ble målt ved en modifikasjon av metoden til Singh et al. (Anal. Biochem 171:173-179,1988) som følger: en reaksjonsblanding inneholdende IX AHAS analysebuffer (50 mM HEPES pH 7,0, 100 mM pyruvat, 10 mM MgCl2, ImM tiaminpyrofosfat (TPP), og 50 mM flavinadenin dinukleotid (FAD)) ble oppnådd enten ved fortynning av enzymet i 2 x analysebuffer eller ved tilsetning av konsentrert enzym til 1 x AHAS analysebuffer. Alle analysene inneholdende imazethapyr og assosierte kontroller inneholdt en sluttkonsentrasjon på 5% DMSO på grunn av tilsetning av imazethapyr til analyseblandingene som en 50% DMSO oppløsning. Analysene ble utført i et sluttvolum på 250 ul ved 37°C i mikrotiterskåler. Etter at reaksjonen forløp i 60 minutter ble acetolaktat akkumuleringen målt kolorimetrisk som beskrevet av Singh et al., Anal. Biochem 171:173-179,1988.

Mais AHAS uttrykt og renset fra pAC751 som beskrevet i eksempel 3 ovenfor er aktiv ved omdanning av puryvat til acetolaktat. Full AHAS aktivitet er avhengig av tilstedeværelse av kofaktorene FAD og TPP i analysemediet. Ingen aktivitet ble detektert når bare FAD ble tilsatt til analysemediet. Aktiviteten til renset enzym med bare TPP, eller uten kofaktorer, var mindre enn 1% av aktiviteten detektert i nærvær av både TPP og FAD. Normalt er AHAS som er tilstede i rå planteekstrakter meget labile, spesielt i fravær av substrat og kofaktorer. I kontrast til dette viste renset AHAS fra det bakterielle ekspresjonssystemet ikke noe tap i den katalytiske aktiviteten når lagret i 1 måned ved 4°C i 50 mM HEPES pH 7,0,150 mM NaCl, 0,02% NaN3 i nærvær eller fravær av FAD og TPP. Ingen degraderingsprodukter var synlige fra disse lagrede preparatene når oppløst i SDS-PAGE geler.

De spesifikke aktivitetene til vill-type AGAS og M124E, R199A og F206R variantene er vist i tabell 2 nedenfor. Bestemt utifrå oppstillingen i figur 5 er M124E mutasjonen i Arabidopsis AHAS ekvivalenten av mais M53E mutasjonen, R199A mutajsonen i Arabidopsis er ekvivalent med mais R128A mutasjonen og F206R mutasjonen i Arabidopsis er ekvivalent med mais F135R mutasjonen. Mutasjonene vist i mais AHAS strukturelle modell ble anvendt for å identifisere ekvivalent aminosyre i dikot Arabidopsis AHAS genet og ble innkorporert og testet i Arabidopsis AHAS genet. Denne translasjonen og innkorporeringen av rasjonelt konstruert Herbicid mutasjoner i dikot Arabidopsis AHAS genet kan lette vurderingen av Herbicid resistensen i planter til en dikot art.

R199A mutasjonen opprettholder et høyt nivå av katalytisk aktivitet (tabell 2), og utviser et betydelig resistensnivå overfor imazethapyr (figur 7). Denne varianten beholder fullstendig sensitivitet overfor sulfonylureaer (figur 8). Denne varianten oppfyller kriteriene med høy spesifikk aktivitet og selektiv herbicidresistens. I kontrast til dette resulterte M124E substitusjonen i nesten fullstendig resistens overfor imazethapyr (figur 7), men utviste også betydelig redusert katalytisk aktivitet (tabell 2). I forhold til imidazolinonresistens utviste denne varianten høyere sensitivitet overfor sulfonylurea (figur 8), og dette tyder på at dette residiet er en god kandidat for å danne en mutasjon som utviser selektiv resistens. Substitusjon av en aminosyre forskjellig fra glutaminsyre kan hjelpe til med å opprettholde den katalytiske aktiviteten. F206R substitusjonen ga lignende resultater som de som ble observert med M124E varianten, men manglet selektivitet i resistensen.

Eksempel 5: Iterativ forbedring av AHAS Herbicid- resistent variant ved anvendelse av en rasjonell konstruksionsmetode

Forandring av residie 124 i AHAS fra Met eller Glu som beskrevet i eksempel 4 ovenfor utviste imidazolinonresistens, men reduserte også den enzymatiske aktiviteten til 9,2% av villtype verdien. Modellen av mais AHAS strukturen beskrevet ovenfor tydet på at Met53 (tilsvarende Arabidopsis Metl24 residiet) reagerte med en serie hydrofobe residier på utsiden av en a-heliks som er avledet fra en separat subenhet, men som er i nærhet til Met53. Den hydrofobe interaksjonen mellom Met53 og residiene på heliksen kan stabilisere både subenhet/subenhet assosiasjonen og konformasjonen til det aktive setet. Det var antatt av substitusjon av det hydrofobe Met residiet med et ladet glutamatresidie sannsynligvis destabiliserer inter-subenhethydrofob interaksjon og resulterer i et tap av katalytisk aktivitet.

Basert på denne struktur/funksjonsanalysen, ble aktiviteten til opprinnelig Arabidopsis Metl24Glu (ekvivalent med mais Met53Glu) mutantenzymet deretter iterativt forbedret ved substituering av en mer hydofob aminosyre (Ile) ved denne posisjonen. Den hydrofobe naturen til Ile sidekjeden resulterte i gjenoppretning av aktiviteten til villtype-nivåene (spesifikk aktivitet på 102, tilsvarende 102% av vill-type aktiviteten), men høyre bulk av Ile sidekjeden kunne fortsatt opprettholde et betydelig nivå av imidazolinonresistens (figur 9).

Substitusjon av et histidinresidie i denne posisjonen resulterte i en AHAS variant som utviser en spesifikk aktivitet på 42,5, ekvivalent med 42,6% av vill-type aktiviteten. Denne mutanten utviste til tross for dette en høy grad av resistens overfor PURSUIT®

(figur 10).

Eksempel 6: Iterativ forbedring av AHAS herbicidresistent variant ved anvendelse av

en rasjonal konstruksionsmetode

Et annet eksempel på iterativ forbedring ved anvendelse av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter Argl28Ala varianten. Den strukturelle modellen til mais AHAS tydet på at Argl28 residiet, som er beliggende ved leppen til herbicid bindingslommen, bidrar til å kanalisere ladede substrater og herbicider inn i herbicid bindingslommen og inn i det aktive setet. Argl28 residiet er langt fra TPP delen, som binder det opprinnelige pyruvat molekylet i reaksjonsmekanismen til AHAS, og for-klarer hvorfor substitusjon av Arabidopsis AHAS Argl99 (ekvivalent med mais Argl28) til alanin hadde liten virkning på den katalytiske aktiviteten til enzymet. Den strukturelle modellen indikerte videre at en mer radikal forandring kunne bli dannet i denne posisjonen for å øke motstandsnivået, med opprettholdelse av høye nivåer av katalytisk aktivitet. På dette grunnlaget ble en iterativ forbedring av mutasjonen dannet for å substituere positivt ladet argininresidie med et negativt ladet glutamatresidie. Enzymet mutert på denne måten hadde forbedrede nivåer av motstand overfor PERSUIT, med opprettholdelse av høye aktivitetsnivåer (spesifikk aktivitet på 114, tilsvarende 114% av vill-type aktiviteten (figur 11).

Eksempel 7: Omveksling av AHAS avledet fra forskjellige arter i strukturbasert

rasjonell konstruksjon av herbicidresistente AHAS varianter

En strukturell modell av den tre-dimensjonale strukturen til AHAS blir dannet med en monokot AHAS sekvens som den som er avledet fra mais, som beskrevet ovenfor. For å innføre mutasjoner inn i AHAS avledet fra en dikot art så som Arabidopsis, blir sekvensene til AHAS avledet fra monokot og dikot artene oppstilt ved anvendelse av GAP og PILEUP programmene (Genetics Computer Group, 575 Sequence Drive, Madison, WI53711). Ekvivalente posisjoner blir bestemt fra computer-dannet oppstilling. Mutasjonene blir deretter introdusert inn i dikot AHAS genet som beskrevet ovenfor. Etter ekspresjon av mutant AHAS protein i E. coli og vurdering av dets biokjemiske egenskaper (dvs. spesifikk aktivitet og resistens overfor herbicider), blir det mutante genet innført i en dikot plante ved plantetransformasjonsmetoder som beskrevet ovenfor.

Eksempel 8: Produksjon av Herbicidresistente planter ved transformasjon med

rasjonelt konstruerte AHAS gener

DNA konstruksjoner:

Rasjonelt konstruerte AHAS variantgener innbefattet i E. coli ekspresjonsvektorene ble anvendt som en ren kilde for DNA restriksjonsfragmenter for å erstatte det ekvivalente restriksjonsfragmentet i et Arabidopsis AHAS gen. Dette genet er tilstede i et 5,5 kb genomisk DNA fragment som også inneholder Arabidopsis AHAS promoteren, Arabidopsis AHAS termineringssekvensen og 5'- og 3'-flankerende DNA. Etter DNA sekvensering gjennom mutasjonssetene ble utført for å bekrefte tilstedeværelse av riktig mutasjon, ble hele 5,5 kb fragmenter fra hvert plasmid skutt inn i en pBIN basert plante transformasjonsvektor (Mogen, Leiden, Nederland). Plantetransformasjonsvektoren inneholder også neomycinfosfotransferase II (nptll) kanamycinresistensgenet drevet acv 35S cauliflower mosaikk virus promoter. Den endelige vektorkonstruksjonen er vist i figur 12. Vektorene inneholdende Arabidopsis AHAS genene med Metl24Ile, Metl24His og Argl99Glu mutasjonene (tilsvarende Met53Ile, Met53His og Argl28Glu mutasjonene i mais AHAS sekvensen er vist i figur 1) ble merket med henholdsvis pJK002, pJK003 og pJK004.

Hver av disse vektorene ble transformert inn i Agrobacterium tumefaciens stammen LB A4404 (R&D Life Technologies, Gaithersburg, MD) ved anvendelse av transforma-sjonsmetoden beskrevet i An et al., Plant Mol. Biol. Manual A3:l-19 (1988).

Plantetransformasjon:

Bladskivetransformasjon av Nicotiana tabacum cv. Wisconsin 38 ble utført som beskrevet av Horsch et al. (Science, 227: 1229-1231,1985) med visse modifikasjoner. Bladskivene ble kuttet fra planter dyrket under sterile betingelser og dyrket sammen opp ned i Murashige Skoog media (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) i 2-3 dager ved 25°C i mørket med Agrobacterium tumefaciens stammer inneholdende plasmidene pJK002, pJK003 eller pJK004. Skivene ble blottet tørre og overført til regenererings Murashige Skoog medium med B5 vitaminer inneholdende 1 mg/l benzyladenin og 0,1 mg/l 1-naftyleddiksyree, 100 mg/l kanamycin og 500 mg/ml cefotaxime (alle oppnådd fra Sigma).

Transformanter ble innledningsvis selektert ved kanamycin resistens utvist av nptll genet tilstede i transformasjonsvektoren. Skudd avledet fra bladskivene ble tatt ut og plassert på friskt Murashige Skoog hormonfritt medium inneholdende cetotaxime og kanamycin.

In vivo Herbicidresistens

Kanamycinresistente tobakkskudd ble overført til medium inneholdende en 0,25 nm imazethapyr. Ved denne konsentrasjonen av imidazolinonherbicid, hadde ikke-transformerte tobakkskudd (inneholdende endogen vill-type AHAS) ikke evne til å initiere rotdannelse. I kontrast til dette ble rotinitiering og vekst observert fra tobakkskudd transformert med hver av de mutante AHAS genene. Røttene utviklet fra skudd transformert med Metl24Ile og Argl99Glu mutantgener sammen med villtype er vist i figur 1. Planter transformert med Metl24Ile eller Argl99Glu mutantgener var resistente overfor spraying med to ganger feltraten (100 g/ha) av imazethapyr (figur 13). Mønstrene til rotveksten i transformerte vs. ikke-transformerte planter i nærvær av herbicid, samt adferden etter herbicid spraying tyder på at ekspresjon av rasjonelt konstruerte herbicidresistensgener utviser herbicidresistens in vivo.

Deteksjon av rasjonelt konstruerte gener i herbicidresistent tobakk.

Genomisk DNA ble isolert fra AHAS-transformert tobakkplanter, og tilstedeværelse av Arabidopsis AHAS variantgener ble verifisert ved PCR analyser. Forskjellene mellom nukleotidsekvensene til Arabidopsis AHAS genet og to tobakk AHAS gener ble vurdert for å konstruere PCR primere som bare amplifiserer Arabidopsis genet i en tobakk-genomisk DNA bakgrunn. Rasjonelt konstruerte herbicid resistens gener ble detektert, som vist ved amplifikasjon av et DNA fragment med riktig størrelse, i de fleste herbicid resistente plantene. Intet PCR signal fremkom fra ikke-transformerte tobakkplanter.

Segregasjon av transformerte AHAS gener:

For å registrere segregasjonen av rasjonelt konstruerte AHAS gener i transformerte planter ble spiringstester utført. Frøene ble plassert i hormon-fritt Murashige-Skoog medium inneholdende opptil 2,5 um PURSUIT® og 100 um kanamycin. Kimplantene som fremkom ble visuelt registrert på resistens eller mottagelighet for herbicid.

På grunn av at tobakkplanter er diploide er det ventet at avkommet til selv-pollinerte planter ville segregere 3:1 resistente:mottagelige, som reflekterer eksistensen av 1 kimplante som er homozygot for resistent AHAS gen, 2 kimplanter som er heterozygote for resistent AHAS gen og 1 kimplante som mangler et resistent AHAS gen.

Resultatene indikerte at resistente AHAS gener segregerer i det ventede 3:1 forholdet og understøtter konklusjonen om at herbicidresistens blir utvist av et enkelt, dominant kopi av et rasjonelt konstruert AHAS gen.

Disse resultatene indikerer at rasjonell konstruksjon av herbicid-resistente AHAS gener kan bli anvendt for å produsere planter som utviser herbicidresistent vekst in vivo.

Eksempel 9: Produksjon av planter som er krvss- resistente overfor forskjellige

herbicider ved transformasjon med rasjonelt konstruerte AHAS gener Tobakkplanter som formert med rasjonelt konstruerte AHAS gener er beskrevet i eksempel 8 ovenfor og ble også testet for kryss-resistens overfor et annet herbicid, CL

299,263 (også kjent som imazamox). Spiringstestene ble utført på frø høstet fra primære transformanter inneholdende Metl24Ile, Metl24His og Argl99Glu Arabidopsis AHAS variantgener, i fravær eller nærvær av 2,5 um CL 299,263 (figur 15). Denne konsentrasjonen av herbicidet forårsaker alvorlig stunting og bleking av vill-type tobakkplanter. Tobakkplanter transformert med Metl24His AHAS genet viste høyest resistensnivå

(figur 15). Argl99Glu transformantene viste et mellomliggende resistensnivå, mens Metl24Ile viste liten resistens (figur 15).

Claims (33)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et imidazolinon- og eller sulfonylureabasert resistent AHAS-variantprotein ved anvendelse av strukturbasert informasjon, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter: (a) oppstilling av et mål AHAS-protein på puryvat oksidasetemplat for å avlede den tredimensjonale strukturen til nevnte mål-AHAS-protein; (b) utforming av en eller flere imidazolinon- og/eller sulfonylureabaserte herbicider inn i den nevnte tre-dimensjonale strukturen for å lokalisere en imidazolinon-og/eller sulfonylureabasert herbicidbindingslomme i nevnte mål-AHAS-protein; (c) utvelgelse som et mål for en mutasjon en aminosyreposisjon i nevnte mål-AHAS-protein, der nevnte mutasjon endrer affiniteten til minst et imidazolinon-og/eller sulfonylureabasert herbicid for nevnte bindingslomme; (d) mutering av DNA som koder for nevnte mål-AHAS-protein for å fremstille et mutert DNA som koder for en variant-AHAS inneholdende nevnte mutasjon i nevnte posisjon; og (e) uttrykking av nevnte muterte DNAi en første celle, under betingelser hvor nevnte variant-AHAS inneholdende nevnte mutasjon i nevnte posisjon blir produsert.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at den videre omfatter: (f) uttrykking av DNA som koder for vill-type-AHAS parallelt i en andre celle: (g) rensing av nevnte vill-type- og nevnte variant-AHAS-proteiner fra nevnte celler; (h) analysering av nevnte vill-type- og nevnte variant-AHAS-proteiner for katalytisk aktivitet ved omdanning av puryvat til acetolaktat eller ved kondensering av pyruvat og 2-ketobutyrat for å danne acetohydroksybutyrat, i fravær og i nærvær av nevnte imidazolinon- eller sulfonylureabaserte herbicid; og (i) gjentagelse av trinnene (c)-(h), hvori nevnte DNA kodende for nevnte variant ifølge trinn (e) blir anvendt som AHAS-kodende DNA i trinn © helt til et imidazolinon-trinn (e) blir anvendt som AHAS-kodende DNA i trinn (c) helt til et imidazolinon- eller sulfonylureabasert herbicidresistent AHAS-variantprotein er identifisert som har: i fravær av nevnte imidazolinon- eller sulfonylureabaserte herbicid, (a) en katalytisk aktivitet som alene er tilstrekkelig for å opprettholde levedyktigheten til en celle hvori den blir uttrykt; eller (b) katalytisk aktivitet i kombinasjon med et hvilket som helst imdazolinon- eller sulfonylureabasert herbicidresistent AHAS-variantprotein som også blir uttrykt i nevnte celle, som kan være den samme eller forskjellig fra nevnte første AHAS-variant-protein, tilstrekkelig for å opprettholde levedyktigheten til en celle som den blir uttrykt i; hvori nevnte celle krever AHAS-aktivitet for levedyktighet; og (ii) katalytisk aktivitet som er mer resistent overfor minst et imidazolinon- eller sulfinylurea herbicid enn vill-type-AH AS.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at nevnte katalytiske aktivitet i fravær av et imidazolinon- eller sulfonylureabasert herbicid er mer enn 20% av den katalytiske aktiviteten til nevnte vill-type-AHAS i fråvær av et imidazolinon- eller sulfonylureabasert herbicid.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3,karakterisert ved at herbicidet er et imidazolinonherbicid og nevnte herbicidresistente AHAS-variantprotein har: (i) katalytisk aktivitet i fravær av nevnte herbicid på mer enn omtrent 20% av den katalytiske aktiviteten i nevnte vill-type-AH AS; (ii) katalytisk aktivitet som er mer resistent overfor tilstedeværelse av imidazolinon herbicider sammenlignet med vill-type-AH AAS; og (iii) katalytisk aktivitet som er mer sensitiv overfor tilstedeværelse av sulfonylureaherbicider sammenlignet med imidazolinonherbicider.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at nevnte mål-AHAS-protein er avledet fra Arabidopsis thaliana.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at nevnte første celle er E.coli.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at nevnte første og andre celler er E.coli.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at nevnte mål-AHAS-protein omfatter et protein med sekvensen SEQ ID No.l eller aminosyresekvensen til et annet plante-AHAS-protein.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at nevnte mutasjon er en substitusjon av minst en forskjellig aminosyrerest ved en aminosyrerest ifølge sekvensen vist i SEQ ID No.l utvalgt fra gruppen bestående av F135, M53, R128 og en aminosyrerest fra et annet plante-AHAS-protein ved en aminosyre oppstilt med en hvilken som helst av de foregående, og en hvilken som helst kombinasjon av en hvilken som helst av de foregående.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at nevnte substitusjon blir valgt fra gruppen bestående av Met53Trp, Met53Glu, Met53Ile, Met53His, Argl28Ala, Argl28Glu, Phel35Arg eller en kombinasjon av hvilke som helst av de foregående.

11. Isolert DNA kodende for et acetohydroksysyresyntase (AHAS)-variantprotein, karakterisert ved at variantproteinet omfatter et AHAS-protein modifisert ved substitusjon at minst en forskjellig aminosyrerest ved en aminosyrerest i sekvensen vist i SEQ ID No.l utvalgt fra gruppen bestående av M53, R128, F135 og en hvilken som helst kombinasjon av hvilke som helst av de foregående.

12. DNA ifølge krav 11,karakterisert ved at modifiseringen endrer evnen et imidazolinon- og/eller sulfonylureabasert herbicid har til å inhibere den enzymatiske aktiviteten til nevnte protein.

13. DNA ifølge krav 12, karakterisert ved at nevnte AHAS-protein er avledet fra Arabidopsis thaliana.

14. DNA ifølge krav 13, karakterisert ved at nevnte substitusjon blir valgt fra gruppen bestående av Met53Trp, Met53Glu, Met53He, Met53His, Argl28Ala, Argl28Glu, Phel35Arg, eller en kombinasjon av hvilke som helst av de foregående.

15. DNA ifølge krav 14, karakterisert ved at at nevnte variant-AHAS-protein har i fravær av minst et imidazolinon- eller sulfonylureabasert AHAS- inhiberende herbicid, (i) en katalytisk aktivitet som alene er tilstrekkelig for å opprettholde levedyktigheten til en celle hvori det blir uttrykt; eller (ii) katalytisk aktivitet i kombinasjon med et hvilket som helst annet imidazolinon- eller sulfonylureabasert herbicidresistent AHAS-variantprotein som også blir uttrykt i nevnte celle, som kan være det samme som eller forskjellig fra nevnte AHAS-variantprotein, tilstrekkelig for å opprettholde levedyktigheten til en celle som den det blir uttrykt i; hvori nevnte celle krever AHAS-aktivitet for levedyktighet; og (iii) katalytisk aktivitet som er mer resistent overfor minst et imidazolinon-eller sulfonylureabasert herbicid eller vill-type-AH AS.

16 DNA ifølge krav 11,karakterisert ved at nevnte variant-AHAS har mer enn 20% av den katalytiske aktiviteten til vill-type-AH AS.

17. DNA ifølge krav 16, karakterisert ved at nevnte variant-AHAS er mer resistent overfor imidazolinonbaserte herbicider enn ovenfor sulfonylureabaserte herbicider.

18. DNA-vektor, karakterisert ved at den omfatter DNA-sekvensen ifølge krav 11 operabelt koblet til et transkripsjonsregulatorisk element.

19. Celle, karakterisert ved at den omfatter en AHAS-kodende DNA-sekvens avledet fra en DNA-vektor ifølge krav 18, hvori nevnte celle blir utvalgt fra gruppen bestående av bakterielle, sopp, plante, insekt og pattedyrceller.

20. Celle ifølge krav 19, karakterisert ved at den omfatter en plantecelle.

21. Celle transformert med et DNA ifølge krav 12, karakterisert ved at nevnte DNA uttrykkes i nevnte celle slik at det utviser imidazolinon- og/eller sulfonylureabasert herbicidresistens på nevnte celle.

22. Frø, karakterisert ved at det omfatter en celle som definert i krav 20.

23. Variant-AHAS-protein, karakterisert ved at det omfatter et protein kodet av et DNA som definert i krav 11.

24. Variant-AHAS-protein ifølge krav 23,karakterisert ved at nevnte substitusjon blir valgt fra gruppen bestående av Met53Trp, Met53Glu, Met53Ile, Met53His, Argl28Ala, Argl28Glu, Phel35Arg, eller en kombinasjon av hvilke som helst av de foregående.

25. Variant-AHAS-protein ifølge krav 23, karakterisert ved at nevnte variant-AHAS-protein har (a) i fravær av nevnte ene AHAS-inhiberende imidazolinon- eller sulfonylureabaserte herbicid, (i) en katalytisk aktivitet alene som er tilstrekkelig for å opprettholde levedyktigheten til en celle som den blir uttrykti; eller (ii) katalytisk aktivitet i kombinasjon med et hvilket som helst andre herbicidresistent AHAS-variantprotein som også blir uttrykt i nevnte celle, som kan være den samme som eller forskjellig fra nevnte AHAS-variantprotein, tilstrekkelig for å opprettholde levedyktigheten til en celle som det blir uttrykt i; hvori nevnte celle krever AHAS-aktivitet for levedyktighet; og (b) katalytisk aktivitet som er mer resistent overfor minst et imidazolinon- eller sulfonylureabasert herbicid enn vill-type-AH AS.

26. Variant-AHAS-protein ifølge krav 23,karakterisert ved at nevnte variant AHAS har mer enn 20% av den katalytiske aktiviteten til vill-type-AH AS.

27. Fremgangsmåte for å frembringe imidazolinon- og/eller sulfonylureabasert herbicidresistens i en celle, karakterisert ved at den omfatter: (a) kloning av et DNA som definert ifølge krav 11 inn i en kompatibel ekspresjonsvektor; og (b) transformering av nevnte DNA inn i nevnte celle, under betingeler hvori nevnte gen blir uttrykt i tilstrekkelige nivåer for å utvise herbicidresistens på nevnte celle.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 27, karakterisert ved at nevnte muterte gen koder for en annen aminosyre i minst en av posisjonene 53, 128,135 eller kombinasjoner derav.

29. Fremgangsmåte ifølge krav 28, karakterisert ved at nevnte AHAS-gen omfatter Arabidopsis thaliana-genet.

30. Fremgangsmåte ifølge krav 28, karakterisert ved at nevnte celle er en plantecelle.

31. Fremgangsmåte ifølge krav 30, karakterisert ved at nevnte celle er et frø.

32. Fremgangsmåte for å kontrollere ugress i en avling, karakterisert ved at den omfatter dyrking av en avling omfattende imidazolinon- og/eller sulfonylureabaserte herbicidresistente planter omfattende celler som definert i krav 19, og behandling av nevnte avling med nevnte imidazolinon- og/eller sulfonylureabasert herbicid.

33. Fremgangsmåte for å kontrollere ugress i en avling, karakterisert ved at den omfatter dyrking av en avling omfattende imidazolinon- og/eller sulfonylureabaserte herbicidresistente planter omfattende celler som definert i krav 19, og behandling av nevnte avling med nevnte imidazolinon- og/eller sulfonylureabaserte herbicidsammensetning inkludert nevnte herbicid.