CN112813045A - 棉花GhALS突变型蛋白、基因及其分子标记和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种棉花GhALS突变型蛋白，所述棉花GhALS突变型蛋白的氨基酸序列对应于野生型棉花GhALS的氨基酸序列的第642位由Ser突变为Asn。本发明还公开了该突变型基因、表达盒、重组载体或细胞，本发明还公开了突变型蛋白、突变型基因或核酸，表达盒、重组载体或细胞在植物抗除草剂方面的应用。本发明还公开了抗除草剂棉花相关的dCAPs分子标记及其应用。本发明的分子标记可实现抗除草剂植物的分子鉴定和快速选育。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及抗除草剂的棉花突变体、抗除草剂的棉花乙酰乳酸合成酶突变蛋白、基因、分子标记及其应用。
背景技术
棉花是一个重要的战略经济作物，近几年每年的播种面积稳定在5000万亩左右。然而，我国棉田杂草危害严重，常年造成棉花的经济损失约14-16％(马小艳等，2010)。化学除草是目前广泛普及的稻田除草方式，包括除草剂的土壤封闭处理和除草剂的茎叶处理。化学除草有严格的的施用范围，除草剂使用不当会引发药害，造成减产甚至绝产。因此，培育抗除草剂的棉花品种是防治杂草、提高生产效率的有效途径。
目前，我国已经获得多个自主知识产权的抗草甘膦除草剂基因G10eve(G10-EPSPS、G10aroA)、EPSPS-G6、G2-aroA、GR79、GAT等及其相应的抗除草剂棉花转化体(陆国清等，2018；马燕斌等，2016；燕树锋等，2018；张小兵，2015)，但因转基因安全评价所需时间较长，目前还未能商业化。此外，我国也发掘、创制了多份非转基因抗草甘膦的棉花突变材料(巩元勇等，2014；燕树锋等，2016)，但因抗性水平未达大田应用水平，如R1098突变体对10％草甘膦水剂抗性较差(燕树锋等，2016)，也未商业化。总之，我国可利用的抗除草剂棉花种质不多，目前没有商业化推广应用的抗除草剂棉花品种。因此，发掘新抗除草剂基因、创制抗除草剂棉花新种质、培育抗除草剂棉花新品种对我国棉花的轻简化栽培和优质高效生产具有重大意义。
乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS)，也称乙酰羟酸合成酶，是支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)生物合成的第一个关键酶，是磺酰脲类(Sulfonylureas，SU)、咪唑啉酮类(Imidazolinones，IMI)、三唑嘧啶类(Triazolopyrimidines，TP)、嘧啶氧(硫)苯甲酸类[Pyrimidinylthio(or oxy)-benzoates，PTB；pyrimidinyl-carboxyherbicides；PCs]和磺酰胺基羰基三唑啉酮类(Sulfonylamino-carbonyltriazolinones，SCT)等ALS抑制剂类除草剂的作用靶标。ALS某些氨基酸位点的突变可使得植物对ALS抑制剂类除草剂产生抗性。国际除草剂抗性行动委员会HRAC归纳统计的可产生除草剂抗性的ALS突变位点包括：Ala 122、Pro 197、Ala 205、Asp 376、Arg 377、Trp 574、Ser 653、Gly 654(以模式植物拟南芥的ALS氨基酸位置计算)，这些突变在多种农作物(包括水稻、玉米、小麦、油菜、向日葵等)、模式植物拟南芥和上百种杂草中均有报道。
棉花含有6个不同的ALS基因(John W.Grula等，1995)；可能鉴于多拷贝的缘故，棉花ALS基因突变产生除草剂抗性的相关研究报道较少。棉花愈伤组织经过SU除草剂筛选、组培再生获得2株同时抗SU、IMI除草剂的突变体植株，分别发生了Trp563Ser、Trp563Cys突变，但该两抗性株均败育，未能收获下一代(Rajasekaran等，1996)。棉花种子经EMS诱变获得了4份抗IMI除草剂的棉花种质EM4-3-1、SCM3-4-3、SCM3-7-3和RM3-8-1，它们可抗16倍大田推荐施用浓度的甲氧咪草烟(imazamox)，等位性测验表明这4份种质的抗性基因可能是同一基因或紧密连锁，但未克隆到抗除草剂基因(Bechere等，2010)。
ALS突变体抗除草剂水平与ALS氨基酸突变的位置有关，还与突变后的氨基酸种类及突变氨基酸的数目有关。有些研究还表明，氨基酸变异引起的ALS突变酶对抑制剂类除草剂产生抗性的同时，有些ALS突变酶的酶学特性也有所改变。所以，不同位点的氨基酸残基变异产生不同类型的ALS抑制剂类除草剂抗性。
目前，ALS抑制剂类除草剂的作用机理尚未确定，很难提前预测ALS蛋白其它氨基酸位点的突变是否会产生除草剂抗性，只能依赖于科研人员长期、艰苦的实践探索，并凭借一些运气才可能发现ALS蛋白新的除草剂抗性位点。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种可以赋予植物抗除草剂抗性的突变型蛋白。进一步地，本发明所要解决的技术问题是提供一种可以赋予植物抗(耐)乙酰乳酸合成酶类除草剂抗性的突变型蛋白。
本发明还要解决的技术问题是提供一种编码棉花GhALS突变型蛋白的核酸或基因。
本发明还要解决的技术问题是提供了表达盒、重组载体或细胞，其含有所述的突变型基因或核酸。
本发明还要解决的技术问题是提供了所述的蛋白，所述的突变型基因或核酸，所述的表达盒、重组载体或细胞在植物抗除草剂方面的应用。
本发明还要解决的技术问题是提供了获得具有除草剂抗性的植物的方法。
本发明还要解决的技术问题是提供了鉴定该抗除草剂的棉花乙酰乳酸合成酶基因的分子标记。
本发明最后要解决的技术问题是提供了鉴定具有除草剂抗性植物的方法。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种棉花GhALS突变型蛋白，所述棉花GhALS突变型蛋白的氨基酸序列对应于野生型棉花GhALS的氨基酸序列的第642位由Ser突变为Asn。
其中，所述突变型蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明内容还包括一种棉花GhALS突变型基因或核酸，其编码所述的突变型蛋白。
其中，所述的棉花GhALS突变型基因或核酸，其核苷酸序列SEQ ID NO.5所示。本发明的突变型基因发生突变的核苷酸包括但不仅限于上述突变，在上述位点突变成其他核苷酸的情况也在本发明的保护范围之内，例如：G突变为C、A等均在本发明的保护范围之内。
本发明所述的抗除草剂棉花为品系Lu37-1，或品系Lu37-1经杂交、回交、组织培养等产生的后代植物，其中所述品系Lu37-1的种子于2021年2月6日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO：P202111，地址为湖北武汉。本发明内容还包括将所述植物品系Lu37-1经杂交、回交、组织培养等产生的后代植物；或表达SEQ ID NO.6所示氨基酸的植物。
本发明内容还包括表达盒、重组载体或细胞，其含有所述的突变型基因或核酸。
本发明内容还包括所述的突变型蛋白，所述的突变型基因或核酸，所述的表达盒、重组载体或细胞在植物抗除草剂方面的应用。
其中，所述除草剂为咪唑啉酮类除草剂，优选为甲咪唑烟酸、甲氧咪草烟或咪唑乙烟酸。
本发明内容还包括获得具有除草剂抗性的植物的方法，包括如下步骤：
1)使植物包含所述的突变型基因或核酸；或
2)使植物表达所述的棉花GhALS突变型蛋白。
进一步地，所述获得具有除草剂抗性的植物的方法包括转基因、杂交、或回交。
本发明内容还包括抗除草剂棉花相关的dCAPs分子标记，所述dCAPs分子标记为分子标记MfeI1925或分子标记BmrI1925，所述分子标记MfeI1925的核苷酸序列如SEQ IDNO.7或SEQ ID NO.8所示，所述分子标记BmrI1925的核苷酸序列如SEQ ID NO.9或SEQ IDNO.10所示。
本发明内容还包括引物对，所述扩增分子标记MfeI1925的引物对，其核苷酸序列如SEQ NO.17和SEQ NO.18所示；所述扩增分子标记BmrI1925的引物对，其核苷酸序列如SEQNO.17和SEQ NO.19所示。
本发明的所述分子标记包括分子标记MfeI1925或/和分子标记BmrI1925：
(a)分子标记MfeI1925的核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，自5′端起第385位碱基是SNP位点，其碱基为G或A；分子标记MfeI1925的引物对为SEQNO.17和SEQNO.18。引物对SEQ NO.17和SEQ NO.18扩增棉花DNA，来源于野生型棉花DNA的SEQ ID NO.7片段经限制性内切酶MfeI酶切后，不能被酶切，琼脂糖电泳表现为416bp带型，来源于抗除草剂棉花DNA的SEQ ID NO.8片段经限制性内切酶MfeI酶切后，被切成383bp和33bp两条带，琼脂糖电泳表现为383bp带型；或
(b)分子标记BmrI1925的核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，自5′端起第385位碱基是SNP位点，其碱基为G或A；分子标记BmrI1925的引物对为SEQ NO.17和SEQNO.19。引物对SEQ NO.17和SEQ NO.19扩增棉花DNA，来源于野生型棉花DNA的SEQ ID NO.9片段经限制性内切酶BmrI酶切后，被切成293bp和376bp两条带，琼脂糖电泳表现为376bp带型，来源于抗除草剂棉花DNA的SEQ ID NO.10片段经限制性内切酶BmrI酶切后，不能被酶切，琼脂糖电泳表现为669bp带型。
本发明内容还包括鉴定或筛选抗性植物的方法，其中植物是包含所述的突变型基因或核酸的植物、表达所述的GhALS突变型蛋白的植物或所述的方法获得的植物，或含有所述的dCAPs分子标记的植物，包括以下步骤：
1)鉴定所述植物是否包含所述的突变型基因或核酸；或，
2)鉴定所述植物是否表达所述的GhALS突变型蛋白；
3)采用所述的dCAPs分子标记鉴定或筛选所述植物是否具备除草剂抗性。
本发明内容还包括一种控制杂草的方法，其特征在于，包括：对种植作物的大田施用有效剂量的除草剂，所述植物包含所述的核酸或基因或所述的表达盒、重组载体或细胞，所述除草剂为咪唑啉酮类除草剂。
本发明内容还包括一种用于保护植物免受由除草剂引起的损伤的方法，包括：对种植作物的大田施用有效剂量的除草剂，所述植物包含所述的核酸或基因或将所述的表达盒、重组载体导入植物，导入后的植物产生除草剂抗性蛋白，所述除草剂为咪唑啉酮类除草剂。
本发明还提供一种除草剂的防护剂，该防护剂包括所述的突变型蛋白。
本发明利用EMS对常规抗虫棉品种鲁棉研37号(山东棉花研究中心)种子进行诱变，诱变群体后代经长期、不断的除草剂筛选，获得一个高抗咪唑啉酮类除草剂的棉花品系，命名Lu37-1。本发明已将该Lu37-1棉花品系的种子保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)，邮编：430072，保藏编号为CCTCC NO：P202111。Lu37-1棉花品系在其基因组中包含一个新的GhALS基因，所述的GhALS基因包含SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，编码SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的GhALS蛋白。当与来源于野生型棉花植物的GhALS基因编码的GhALS蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO.2)相比较时，SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列与野生型氨基酸序列具有单个氨基酸的差异，即SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列在642氨基酸位点为Asn，SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列在642氨基酸位点为Ser。表达SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的蛋白的植物，如本发明Lu37-1棉花、实施例10的拟南芥和实施例11的水稻，其对ALS抑制剂类除草剂不敏感，从而使得植物具有ALS抑制剂类除草剂抗性。本发明在植物育种中的应用，可用于培育具有除草剂抗性的植物，尤其是农作物抗除草剂中的应用。本发明所述的农作物包括但不仅限于棉花，还可以包含其他的农作物。
有益效果：相对于现有技术，本发明具备以下优点：
(1)茎叶喷雾处理：在棉花幼苗处于1叶期时喷施系列剂量梯度的ALS抑制剂类除草剂甲咪唑烟酸，26天后，野生型棉花植物在3倍剂量顶芽受损无新叶产生甚至死亡，相比之下，含有本发明的棉花植物在24倍剂量下仍正常长出新真叶，且真叶平展，表明其在茎叶喷雾处理下的抗性倍数不低于24倍推荐剂量。
(2)土壤封闭处理：将棉花播种于土壤后，在种子和土壤表面都喷施系列剂量梯度的ALS抑制剂类除草剂甲咪唑烟酸，26天后，21倍剂量下，野生型棉花植物无苗萌发，相比之下，含有本发明的棉花植物可以萌发，且长势正常化，叶片平展，表明其在土壤封闭处理下的抗性倍数不低于21倍推荐剂量。
(3)ALS酶活性：野生型棉花ALS对甲咪唑烟酸极为敏感，在0.1μmol·L-1甲咪唑烟酸时，ALS酶活开始下降，在甲咪唑烟酸10μmol·L-1时ALS酶活仅有对照的35％。而抗除草剂棉花ALS在甲咪唑烟酸10μmol·L-1时仍未受抑制，在10000μmol·L-1时，抗除草剂棉花ALS仍有43％活力。对ALS酶活抑制率的几率值和甲咪唑烟酸浓度的对数值进行直线回归分析，计算甲咪唑烟酸抑制棉花ALS酶活性的半抑制浓度IC50值，其中，野生型棉花植物IC50＝8.983μmol·L-1，抗除草剂棉花植物IC50＝7633.026μmol·L-1，即抗除草剂棉花ALS对甲咪唑烟酸的耐受性是野生型棉花ALS的850倍。
(4)野生型拟南芥种子和表达本发明抗除草剂蛋白的转基因拟南芥种子在含有甲咪唑烟酸除草剂的培养基上培养，21天后，野生型拟南芥在0.1μM甲咪唑烟酸的培养基上即黄化不长，相比之下，表达本发明抗除草剂蛋白的转基因拟南芥在2μM甲咪唑烟酸的培养基上仍正常呈绿色，表明其抗性倍数是野生型拟南芥的20倍以上。野生型拟南芥种子和表达本发明抗除草剂蛋白的转基因拟南芥茎叶喷雾甲咪唑烟酸除草剂，21天后，野生型拟南芥在1μM甲咪唑烟酸处理下即已叶片发紫、无法长大，严重者死亡，相比之下，表达本发明SEQID NO.5的转基因拟南芥在21.8μM甲咪唑烟酸处理下所有植株仍正常生长呈绿色，在44μM甲咪唑烟酸处理下仍有部分植物正常生长呈绿色，表明在茎叶喷雾处理下，过量表达本发明SEQ ID NO.5的转基因拟南芥的抗性倍数是野生型拟南芥的40倍以上。
(5)野生型水稻种子和表达本发明抗除草剂蛋白的转基因水稻种子以甲咪唑烟酸除草剂浸种24h后播种营养土中，21天后，非转基因野生型水稻在12mg/L甲咪唑烟酸处理下只有2株小苗，该2株小苗与空白对照相比，生长明显受到抑制没有长高；而过量表达本发明SEQ ID NO.5的转基因水稻在12-240mg/L甲咪唑烟酸处理下发芽率和长势与空白对照无明显差异，生长状态良好，叶片正常呈绿色，在1200mg/L甲咪唑烟酸处理下仍有2株小苗，与野生型水稻在12mg/L甲咪唑烟酸处理下有2株小苗的表现相当，表明过量表达本发明SEQ IDNO.5的转基因水稻的抗性倍数是野生型水稻的100倍以上。
(6)本发明公开的分子标记可快速鉴定和筛选抗除草剂棉花植物，进行分子标记辅助选择，提高育种效率，加速育种进程，且在实际操作中可采用PCR扩增和酶切检测或测序检测，不需要特殊的SNP分析仪器，有利于在大多数实验室和育种单位推广利用。
附图说明
图1是田间喷施甲咪唑烟酸除草剂筛选M2群体获得抗除草剂棉花，其中，除草剂抗性植株(右侧)长高，叶片正常展开，叶片呈绿色，而非抗性植株(左侧)则生长受抑制，顶芽皱缩，新叶卷曲，叶片失绿呈淡黄色；
图2是Lu37-1抗除草剂品系茎叶喷雾处理鉴定其抗甲咪唑烟酸除草剂水平，其中Lu37代表野生型鲁研棉37号，Lu37-1代表Lu37-1抗除草剂品系，数字0代表清水处理，数字3、6、9、12、21、24代表喷施甲咪唑烟酸除草剂的推荐田间使用的剂量倍数。野生型棉花在3倍剂量下顶芽新叶不生长甚至顶芽死亡，Lu37-1抗除草剂品系在24倍剂量下新叶仍能长出并且叶片平展；
图3是Lu37-1抗除草剂品系在18倍剂量的甲咪唑烟酸除草剂土壤封闭处理鉴定其除草剂水平，其中，除草剂抗性植株(右侧)长高，叶片正常展开，叶片呈绿色，而非抗性植株(左侧)则不萌发，或萌发后也生长受抑制，植物矮化，顶芽皱缩不长；
图4是Lu37-1抗除草剂品系在3倍剂量咪唑乙烟酸除草剂进行茎叶喷雾处理鉴定其抗除草剂水平，其中，除草剂抗性植株(右侧)长高，叶片正常展开，叶片呈绿色，而非抗性植株鲁研棉37号(左侧)则生长受抑制，顶芽皱缩，无新叶长出；
图5是Lu37-1抗除草剂品系在3倍剂量甲氧咪草烟除草剂进行茎叶喷雾处理鉴定其抗除草剂水平，其中，除草剂抗性植株(右侧)长高，叶片正常展开，叶片呈绿色，而非抗性植株鲁研棉37号(左侧)则生长受抑制，顶芽皱缩，无新叶长出；
图6是Lu37-1抗除草剂品系ALS酶活性测定，其中，WT代表野生型鲁研棉37号，其IC50＝8.983μmol·L-1，Mutant代表Lu37-1抗除草剂品系，其IC50＝7633.026μmol·L-1，即Lu37-1抗除草剂品系ALS对甲咪唑烟酸的耐受性是野生型棉花的850倍；
图7是引物组合GhALS-F1/R1扩增野生型鲁研棉37号和Lu37-1抗除草剂品系的ALS基因的PCR电泳图，从左至右样品依次为水、鲁研棉37号DNA、鲁研棉37号DNA、Lu37-1-1DNA、Lu37-1-2DNA、DNA Marker DL2000，其中Marker从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
图8是过量表达GhALS突变基因的转基因拟南芥培养基筛选鉴定其抗甲咪唑烟酸除草剂水平，其中，上排从左到右依次为50mg/L卡那霉素、0.1uM甲咪唑烟酸、0.4μM甲咪唑烟酸，下排从左到右依次为0.6μM甲咪唑烟酸、1μM甲咪唑烟酸、2μM甲咪唑烟酸；每个平皿中含4株系拟南芥幼苗，其中左上角为野生型拟南芥，其它3个为转基因拟南芥。0.1μM甲咪唑烟酸下，野生型拟南芥也黄化不长；2μM甲咪唑烟酸下，过量表达本发明SEQ ID NO.5的转基因拟南芥仍能生长。
图9是过量表达GhALS突变基因的转基因拟南芥茎叶喷雾鉴定其抗甲咪唑烟酸除草剂水平，其中，上2排为转基因拟南芥，除草剂处理浓度从上到下、左到右依次为0、1、4.3、8.7、21.8、44、109、218μM；下2排为野生型拟南芥，除草剂处理浓度从上到下、左到右依次为0、1、4.3、8.7、21.8、44、109、218μM。野生型拟南芥在1μM处理下已经死亡，而过量表达本发明SEQ ID NO.5的转基因拟南芥在44μM下仍有部分存活生长。
图10是过量表达GhALS突变基因的转基因水稻T1种子在甲咪唑烟酸除草剂浸泡24h并播种21d后，测定其发芽率及长势鉴定抗性水平，其中，杯子从左至右代表除草剂浓度依次为：0、12、24、48、72、120、240、480、720、960、1200mg/L甲咪唑烟酸，非转基因野生型水稻(下图)在12mg/L甲咪唑烟酸处理下只有2株小苗，该2株小苗与空白对照相比，生长明显受到抑制没有长高；而过量表达本发明SEQ ID NO.5的转基因水稻(上图)在12-240mg/L甲咪唑烟酸处理下与空白对照无明显差异，生长状态良好，叶片正常呈绿色，在1200mg/L甲咪唑烟酸处理下仍有2株小苗，与野生型水稻在12mg/L甲咪唑烟酸处理下有2株小苗的表现相当，表明过量表达本发明SEQ ID NO.5的转基因水稻的抗性倍数是野生型水稻的100倍以上。
图11是dCAPs分子标记MfeI1925，来源于野生型棉花PCR DNA片段(孔2)经限制性内切酶MfeI酶切后，不能被酶切，琼脂糖电泳表现为416bp带型，来源于抗除草剂棉花PCRDNA片段(孔3-孔5)经限制性内切酶MfeI酶切后，被切成383bD和33bp两条带，琼脂糖电泳表现为383bp带型。
图12是dCAPs分子标记BmrI1925，来源于野生型棉花PCR DNA片段(孔1)经限制性内切酶BmrI酶切后，被切成293bp和376bp两条带，琼脂糖电泳表现为376bp带型，来源于抗除草剂棉花PCR DNA片段(孔2)经限制性内切酶BmrI酶切后，不能被酶切，琼脂糖电泳表现为669bp带型。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1棉花抗咪唑啉酮类除草剂突变体的筛选
将常规抗虫棉品种鲁棉研37号(山东棉花研究中心提供)种子(此为M0)用清水浸泡8小时，用0.8％(w/w)甲磺酸乙酯(EMS)室温下浸泡14小时，加入硫代硫酸钠溶液中和反应，弃去EMS溶液，自来水翻动浸泡种子5次，每次5分钟，然后播种田间，并进行常规肥水管理，长出的植株为M1代植株。M1植株成熟后，种子混收、晾干，过冬保存。次年种子播种田间，土壤覆盖后，在土壤表面喷施6倍剂量的百垄通(“百垄通”是德国巴斯夫公司生产一种水剂型咪唑啉酮类除草剂，商品包装为8mL/包，有效成分为240g/L甲咪唑烟酸，苗后定向喷雾防治一年生禾本科杂草的推荐用药量为20-30mL/亩；为方便配制，我们取3包百垄通/亩，折合24mL/亩，作为1倍推荐使用剂量，即甲咪唑烟酸的1倍田间推荐使用剂量为5.76g a.i./亩(86.4g a.i./ha))进行土壤封闭处理，长出的植株为M2代植株。40天后，如图1所示，除草剂抗性植株(右侧)长高，叶片正常展开，叶片呈绿色，而非抗性植株(左侧)则生长受抑制，顶芽皱缩，新叶卷曲，叶片失绿呈淡黄色。共计获得抗除草剂的M2单株9株，分别编号Lu37-1至Lu37-9，这些抗性单株进行常规肥水管理，其中，有8个M2单株可正常结实，种子成熟后，单株收种M3。
实施例2：Lu37-1抗除草剂品系的获得
8个单株M3种子播种于温室穴盘中，待M3植株长至2叶期时，15天内分4次进行茎叶喷施百垄通，其中，第1天、第5天喷施1倍剂量，第10天、第15天喷施3倍剂量；1个月后，Lu37-1号单株后代中有2个单株呈正常绿色和长高，其它单株后代和对照野生型植株均呈顶芽萎缩、生长受抑制，新生叶呈淡黄色。该2个抗性单株(M3代)分别命名为Lu37-1-1和Lu37-1-2，对其及其后代连续2年进行自交，获得M5代种子，用于后续研究和专利保藏。本发明的抗除草剂棉花种子已于2021年2月6号保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)，邮编：430072，保藏编号为CCTCCNO：P202111，分类命名为：棉花种子Lu37-1(Gossypium hirsutum.L.Lu37-1)。
实施例3：Lu37-1抗除草剂品系茎叶喷雾处理鉴定其抗甲咪唑烟酸除草剂水平
将Lu37-1 M5代种子和野生型鲁研棉37号种子播种于温室纸杯中，带到幼苗长至一叶期时，茎叶喷雾百垄通(甲咪唑烟酸)除草剂，其中，抗除草剂棉花的除草剂施用剂量包括0、3、6、9、12、18、21、24倍的田间推荐使用剂量(田间推荐使用剂量为5.76g a.i./亩)，野生型棉花的除草剂施用剂量包括0、3、6倍的田间推荐使用剂量，其中剂量0为不含除草剂的清水处理，作为空白对照。26天后，如图2所示，野生型鲁研棉37号在3倍剂量的百垄通下顶芽受损不长甚至顶芽坏死，Lu37-1抗除草剂品系在24倍剂量的百垄通下叶片仍正常平展，与清水处理相比，仅植株略矮化，叶色稍淡，表明Lu37-1抗除草剂品系在茎叶喷雾处理下的抗性倍数不低于24倍推荐剂量。
实施例4：Lu37-1抗除草剂品系土壤封闭处理鉴定其抗甲咪唑烟酸除草剂水平
将Lu37-1 M5代种子和野生型鲁研棉37号种子播种于温室穴盘中，在种子和土壤表面百垄通(甲咪唑烟酸)除草剂，除草剂施用剂量包括1、3、9、12、18、21倍的田间推荐使用剂量，26天后，在1、3、9、12倍剂量下，野生型鲁研棉37号长出的幼苗都有不同程度的矮化，顶芽邹缩扭曲，新生叶的叶色发黄，在21倍剂量下，野生型鲁研棉37号无苗萌发，相比之下，Lu37-1抗除草剂品系在21倍剂量下可以萌发，且长势正常化，叶片平展，表明其在土壤封闭处理下的抗性倍数不低于21倍推荐剂量。图3所示是18倍剂量下野生型鲁研棉37和Lu37-1抗除草剂品系的表型。
实施例5：Lu37-1抗除草剂品系茎叶喷雾处理鉴定其抗咪唑乙烟酸、甲氧咪草烟除草剂
将Lu37-1 M5代种子和野生型鲁研棉37号种子播种于温室纸杯中，带到幼苗长至一叶期时，茎叶喷雾3倍剂量的咪唑乙烟酸除草剂，以不含除草剂的清水处理作为空白对照。26天后，如图4所示，野生型鲁研棉37号在3倍剂量的咪唑乙烟酸下顶芽受损不长甚至顶芽坏死，Lu37-1抗除草剂品系在3倍剂量的咪唑乙烟酸下叶片正常平展，与清水处理相比无差异，表明Lu37-1抗除草剂品系抗咪唑乙烟酸除草剂。
将Lu37-1 M5代种子和野生型鲁研棉37号种子播种于温室纸杯中，待到幼苗长至一叶期时，茎叶喷雾3倍剂量的甲氧咪草烟除草剂，以不含除草剂的清水处理作为空白对照。26天后，如图5所示，野生型鲁研棉37号在3倍剂量的甲氧咪草烟下顶芽受损不长甚至顶芽坏死，Lu37-1抗除草剂品系在3倍剂量的甲氧咪草烟下叶片正常平展，与清水处理相比无差异，表明Lu37-1抗除草剂品系抗咪唑乙烟酸除草剂。
实施例6：Lu37-1抗除草剂品系ALS酶活性测定
参照陈以峰等(乙酰乳酸合酶活性的简易测定方法建立，江西农业大学学报，1996(02)：213-218)方法，取Lu37-1和野生型鲁研棉37号愈伤组织提取ALS粗酶液，与各浓度甲咪唑烟酸孵育后测530nm吸收值，计算ALS相对酶活力，如图6所示，野生型鲁研棉37棉(WT)花ALS对甲咪唑烟酸极为敏感，在0.1μmol·L-1甲咪唑烟酸时，ALS酶活开始下降，在甲咪唑烟酸10μmol·L-1时ALS酶活仅有对照的35％。而Lu37-1抗除草剂品系(Mutant)ALS在甲咪唑烟酸10μmol·L-1时仍未受抑制，与对照无异；在10000μmol·L-1时，Lu37-1抗除草剂品系ALS仍有43％活力。以SPSS软件对ALS酶活抑制率的几率值和甲咪唑烟酸浓度的对数值进行直线回归分析，求得甲咪唑烟酸抑制棉花ALS酶活性的半抑制浓度IC50值，其中，野生型IC50＝8.983μmol·L-1，Lu37-1抗除草剂品系IC50＝7633.026μmol·L-1，即Lu37-1抗除草剂品系ALS对甲咪唑烟酸的耐受性是野生型棉花的850倍，说明Lu37-1抗除草剂品系对ALS抑制剂类除草剂的抗性与其体内ALS酶活紧密相关，初步推测其抗性属ALS基因突变产生的靶标抗性。
实施例7：Lu37-1抗除草剂品系GhALS突变基因克隆
鉴于ALS酶活鉴定的结果，我们将Lu37-1抗除草剂品系的抗除草剂基因候选为ALS基因。基因组文库筛选和southern杂交鉴定表明陆地棉中有6个ALS基因，其中Genbank登陆号分别为Z46959.1、Z46960.1是编码棉花ALS蛋白的主要持家基因，分别编码genbank登录号CAA87083.1、CAA87084.1的ALS蛋白(John W.Grula等，1995)；鉴于此，将CAA87083.1、CAA87084.1氨基酸序列与Cottongen网站最新版的棉花参考基因组序列Gossypiumhirsutum(AD1)′TM-1′genome UTX_v2.1(https：//www.cottongen.org/tools/jbrowse)进行tblastn比对，获得E value值＝0的序列7条，包括Gohir.A10G138800、Gohir.D10G128000、Gohir.D02G013000、Gohir.D02G013100、Gohir.A02G012300、Gohir.A02G012202、Gohir.A02G012201。其中，Z46960.1基因与Gohir.A10G138800基因的CDS核苷酸序列100％相同，对应地，其所编码CAA87084.1蛋白与Gohir.A10G138800蛋白的氨基酸序列100％相同，表明NCBI公布的Z46960.1基因即是Cottongen公布的Gohir.A10G138800基因；Z46959.1基因与Gohir.D10G128000基因序列相似性最高，达98.03％，在CDS编码区有2处SNP，导致其编码CAA87083.1蛋白与Gohir.D10G128000蛋白在其氨基酸有一处差异，我们认为该差异是棉花品种间的SNP差异，即NCBI公布的Z46959.1基因即是Cottongen公布的Gohir.D10G128000基因。
本发明选取Z46959.1(Gohir.D10G128000基因)、Z46960.1(Gohir.A10G138800基因)的CDS编码区外侧的共有序列设计PCR引物，其中，正向引物为GhALS-F15′-CACCACAAGCCTCTCATCGAC-3′(SEQ ID NO.11)，反向引物为GhALS-R15′-CCCCATAACCCACCCTCATTC-3′(SEQ ID NO.12)，分别扩增抗除草剂Lu37-1的2个单株(Lu37-1-1、Lu37-1-2)和野生型鲁研棉37号植物的基因组DNA，PCR反应体系如下：2×Phanta MaxBuffer 25μl，dNTP Mix(10mM each)1μl，5×PCR enhancer 10μl，10μM正向引物1μl，10μM反向引物1μl，80-160ng/μL基因组DNA 1μl，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase1μl，无菌水10μl，共50μl。PCR扩增反应程序如下：预变性：95℃ 3min；35个循环：变性95℃15sec；退火58℃15sec，延伸72℃2min；保温：72℃5min。
取5μl PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，发现有预期大小2071bp片段后(图7)，剩余的PCR产物经PCR清洁试剂盒(购自Axygen公司)清洁回收后，用Hieff
ZeroTOPO-Blunt Cloning Kit试剂盒克隆至pESI-Blunt载体(购自上海翊圣生物科技有限公司)，连接体系如下：10×Enhancer 0.5μL，pESI-Blunt vector(30ng/μL)0.5μL，50ng/μLPCR产物2μL，ddH2O 2μL，共5μL。
混匀上述体系，于室温(20-30℃)反应5min，然后将全量5μL连接产物加入100μL大肠杆菌感受态细胞，轻轻混匀，室温放置5min，然后热击转化大肠杆菌。
次日，每个转化随机挑取24个大肠杆菌单克隆进行PCR检测，引物组合分别为通用引物M13-F/R、特异引物GhALS-F1/R1；每个样取2对引物PCR结果均呈阳性的10个单克隆，送金斯瑞生物科技有限公司测序。
实施例8：Lu37-1抗除草剂品系GhALS突变基因的突变位点分析
3个植物样品的克隆测序结果与cottongen网站最新版的棉花参考基因组序列Gossypium hirsutum (AD1)′TM-1′genome UTX_v2.1(https：//www.cottongen.org/tools/jbrowse)进行序列比对，发现野生型鲁研棉37号的测序克隆含有2种序列：序列1的2071bp(SEQ ID NO.1)和序列3的2068bp(SEQ ID NO.3)，它们分别与参考基因组中的Gohir.D10G128000基因序列和Gohir.A10G138800基因序列100％匹配，无碱基差异，并已涵括基因CDS编码区，其编码ALS蛋白，表明所获得的棉花ALS基因序列是正确的；除草剂植物Lu37-1-1、Lu37-1-2的测序克隆也含有2种序列：序列5的2071 bp(SEQ ID NO.5)和序列3的2068bp(SEQ ID NO.3)，其中，序列3的2068bp(SEQ ID NO.3)与参考基因组中的Gohir.A10G138800基因序列100％匹配，无碱基差异，序列5(SEQ ID NO.5)与参考基因组中的Gohir.D10G128000基因序列比对，在Gohir.D10G128000基因CDS编码区的第1925位碱基由G变A，导致第642位氨基酸由Ser变Asn，即发生了Ser642Asn突变，即抗除草剂突变植株的ALS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其编码的ALS突变型蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.6所示。
实施例9：过量表达GhALS突变基因的转基因拟南芥培养基培养鉴定其抗甲咪唑烟酸除草剂水平
在植物表达载体pCAMBIA2301质粒(购自pcambia公司)多克隆位点中的XbaI和SbfI酶切位点间添加CaMV35S启动子，在SacI和EcoRI酶切位点间添加NOS终止子，获得新植物表达载体pCAMBIA2301-CaMV35S-NOS。为验证抗除草剂突变植株的ALS基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.5)的功能，设计特异正向引物GhALS-F35′-CGGGGGACTCTAGAGGATCACACCACAAG CCTCTCATCGAC-3′(SEQ ID NO.13)，反向引物GhALS-R35′-GGGGAAATTCGAGCTCGGTACCCCATA ACCCACCCTCATTC-3′(SEQ ID NO.14)，引物5′端含有infusion连接所需的同源臂序列。GhALS-F3/R3引物PCR扩增含有SEQ ID NO.5的质粒DNA。取pCAMBIA2301-CaMV35S-NOS经KpnI/BamHI双酶切后的100ng产物，与GhALS-F3/R3的PCR产物10ng一起，用ClonExpress IIone step cloning kit C112试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)进行infusion连接，获得GhALS突变基因过量表达的植物表达载体pCAMBIA2301-CaMV35S-GhALS-NOS，挑取阳性克隆转化农杆菌EHA105，浸花法转化拟南芥。在卡那霉素培养基上筛选获得的抗卡那霉素的转基因拟南芥T1单株连续繁殖加代至T3代，取T3代转基因种子与野生型拟南芥种子在含有甲咪唑烟酸除草剂的培养基上培养，21天后，野生型拟南芥在0.1μM甲咪唑烟酸的培养基上即黄化不长，相比之下，表达本发明SEQ ID NO.5的转基因拟南芥在2μM甲咪唑烟酸的培养基上仍正常呈绿色(图8)，表明在培养基中除草剂持续作用下，过量表达本发明SEQID NO.5的转基因拟南芥的抗性倍数是野生型拟南芥的20倍以上。
实施例10：过量表达GhALS突变基因的转基因拟南芥茎叶喷雾鉴定其抗甲咪唑烟酸除草剂水平
取T3代转基因种子与野生型拟南芥幼苗，在有机栽培基质中培养，在幼苗未抽薹前，以不同浓度梯度的甲咪唑烟酸除草剂对其茎叶喷雾处理，如图9所示，除草剂浓度分布共2排，从上到下、左到右依次为0、1、4.3、8.7、21.8、44、109、218μM。21天后，野生型拟南芥(下2排)在1μM甲咪唑烟酸处理下即已叶片发紫、无法长大，严重者死亡，相比之下，表达本发明SEQ ID NO.5的转基因拟南芥(上2排)在21.8μM甲咪唑烟酸处理下所有植株仍正常生长呈绿色，在44μM甲咪唑烟酸处理下仍有部分植物正常生长呈绿色，表明在茎叶喷雾处理下，过量表达本发明SEQ ID NO.5的转基因拟南芥的抗性倍数是野生型拟南芥的40倍以上。
实施例11：GhALS突变基因转化水稻过量表达进行抗除草剂功能验证
在植物表达载体pCAMBIA1390质粒(购自pcambia公司)多克隆位点中的HindIII和PstI酶切位点间添加玉米ZmUbi启动子，获得新植物表达载体pCAMBIA1390-ZmUbi-NOS。设计特异正向引物GhALS-F45′-GGTACCTGCAGGTCGACGCACCACAAGCCTCTCATCGAC-3′(SEQ IDNO.15)，反向引物GhALS-R45′-TTAGAATTCCCGGGGATCCCCCATAACCCACCCTCATTC-3′(SEQ IDNO.16)，引物5′端含有infusion连接所需的同源臂序列。GhALS-F4/R4引物PCR扩增含有SEQID NO.5的质粒DNA。取pCAMBIA1390-ZmUbi-NOS经BamHI酶切后的100ng产物，与GhALS-F4/R4的PCR产物10ng一起，用ClonExpress II one step cloning kit C112试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)进行infusion连接，获得GhALS突变基因过量表达的植物表达载体pCAMBIA1390-ZmUbi-GhALS-NOS，挑取阳性克隆转化农杆菌EHA105。采用常规的农杆菌介导法转化粳型水稻日本晴(购自江苏省农业种质资源保护与利用平台)，获得转基因植株收种后，T1后代以不同浓度的甲咪唑烟酸除草剂浸种24h，每处理含20粒种子，设水浸泡24h处理为空白对照。如图10所示，杯子从左至右代表除草剂浓度依次为：0、12、24、48、72、120、240、480、720、960、1200mg/L甲咪唑烟酸，21天后，非转基因野生型水稻在12mg/L甲咪唑烟酸处理下只有2株小苗，该2株小苗与空白对照相比，生长明显受到抑制没有长高；而过量表达本发明SEQ ID NO.5的转基因水稻在12-240mg/L甲咪唑烟酸处理下发芽率和长势与空白对照无明显差异，生长状态良好，叶片正常呈绿色，在1200mg/L甲咪唑烟酸处理下仍有2株小苗，与野生型水稻在12mg/L甲咪唑烟酸处理下有2株小苗的表现相当，表明过量表达本发明SEQ ID NO.5的转基因水稻的抗性倍数是野生型水稻的100倍以上。
实施例12：抗除草剂突变体棉花dCAPs分子标记MfeI1925的开发
鉴于抗除草剂棉花与野生型棉花在Gohir.D10G128000基因上存在一个SNP差异，我们拟将该SNP差异转化为dCaps分子标记。
1)利用dCAPS Finder 2.0网站(http：//helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)，通过引入错配碱基的方法设计PCR扩增的反向引物：选取Gohir.D10G128000基因CDS编码区第1925位突变碱基大约处于中间位置的60bp DNA序列，参数设定在引物中引入1个错配碱基，网站自动分析列出SNP位点突变所引起的限制性内切酶酶切位点的信息及引物序列，我们从中选取MfeI酶，该酶识别CAATTG序列，对应的引物序列为GhD 10ALS642M-R 5′-CTCTGTGATCACATCTTTGAAAGCGCCTCAA-3′(SEQ ID NO.18)。反向引物GhD10ALS642M-R可与Gohir.D10G128000、Gohir.A10G138800基因配对结合。
2)设计PCR扩增的正向引物。棉花Gohir.D10G128000、Gohir.A10G138800基因序列的相似性高，通过snapgene软件分析比较Gohir.D10G128000、Gohir.A10G138800的SNP，我们设计了正向引物GhD10ALS642-F1 5′-TTGCAAACCCGGAGGCAGTT-3′(SEQ IDNO.17)，该引物100％与Gohir.D10G128000配对，与Gohir.A10G138800则在引物3’端第1个碱基和第10个碱基有错配。
3)预期结果：鉴于上述正向反向引物中的SNP，GhD10ALS642-F1和GhD10ALS642M-R组合扩增棉花DNA，以期特异性地扩增Gohir.D10G128000基因DNA片段416bp。GhD10ALS642M-R 3′端引入的1个突变碱基与突变体Gohir.D10G128000基因第1925位突变碱基一起，形成CAATTG序列，可被MfeI酶识别。这样，抗除草剂棉花的Gohir.D10G128000基因416bp DNA片段被MfeI酶切成383bp、33bp两个片段，而野生型棉花Gohir.D10G128000基因416bp DNA片段不能被酶切，电泳后有效区分突变型和野生型ALS基因。
4)分子标记的验证：CTAB法提取抗除草剂棉花Lu37-1与野生型棉花的总DNA，用无菌水稀释至100ng/μL，然后GhD10ALS642-F1和GhD10ALS642M-R引物组合进行PCR扩增，反应体系为：棉花DNA 1μL，10μM正反引物各0.5μL，2×Rapid Taq Master Mix 10μL(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，无菌水8μL。PCR扩增反应程序为：预变性：95℃ 3min；35个循环：变性95℃ 15sec；退火58℃ 15sec，延伸72℃15sec；保温：72℃ 5min。
PCR结束后，取4μL反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，获得单一特异性条带，然后进一步对PCR产物测序，其中，野生型棉花DNA序列416bp，如SEQ ID NO.7所示；抗除草剂Lu37-1棉花DNA序列416bp，如SEQ ID NO.8所示；SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8序列自5′端起第385位碱基是SNP位点，其碱基为G或A，命名为dCAPs分子标记MfeI1925。SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8序列都显示Gohir.D10G128000特异的SNP，表明GhD10ALS642-F1和GhD10ALS642M-R组合特异性地扩增Gohir.D10G128000基因DNA片段416bp，即GhD10ALS642-F1引物可特异性结合Gohir.D10G128000基因，实现设计预期。
取4μL PCR产物进行MfeI酶切，10μL酶切体系为：10×Cutsmart buffer 1μL，PCR产物4μL，MfeI酶1μL(NEB公司)，无菌水4μL。37度酶切1-3h，其中野生型棉花PCR产物酶切3h，Lu37-1棉花PCR产物分3管，分别酶切1、2、3h，取全部酶切产物在2％琼脂糖电泳，100V60min。结果如图10所示，野生型棉花Gohir.D10G128000基因416bp DNA片段(孔2)不能被酶切，琼脂糖电泳表现为416bp带型，抗除草剂棉花Lu37-1的Gohir.D10G128000基因416bpDNA片段(孔3-孔5)被MfeI酶切成383bp和33bp两条带，琼脂糖电泳表现为比416bp小的383bp带型，而33bp酶切产物由于片段太小，在琼脂糖电泳中不能显示。该结果成功区分抗除草剂棉花和野生型棉花，表明所开发的分子标记有效；此外，Lu37-1具有单一的383bp带型，表明Lu37-1中的突变型ALS基因已纯合。
实施例13：抗除草剂突变体棉花dCAPs分子标记BmrI1925的开发
1)引物设计：分析棉花Gohir.D10G128000、Gohir.A10G138800基因序列的酶切位点，发现野生型基因在CDS编码区的第1925位碱基突变点处存在BmrI酶切位点，即BmrI酶可酶切野生型Gohir.D10G128000、Gohir.A10G138800的DNA片段，而Gohir.D10G128000基因CDS编码区的第1925位碱基由G变A后，丧失BmrI酶切位点，突变型Gohir.D10G128000的DNA片段无法被BmrI酶切。鉴于上个实施例中，正向引物GhD10ALS642-F15′-TTGCAAACCCGGAGGCAGTT-3′(SEQ ID NO.17)可特异性地结合Gohir.D10G128000基因，我们设计了反向引物GhD10ALS-R35′-AACAAAAACAGCATTCATCATTTG-3′(SEQ ID NO.19)，该反向引物与Gohir.D10G128000基因100％匹配，与Gohir.A10G138800基因则在其3′端有2个碱基的错配。
2)预期结果：鉴于上述正反引物中的SNP，GhD10ALS642-F1和GhD10ALS-R3组合扩增棉花DNA，以期特异性地扩增Gohir.D10G128000基因DNA片段669bp。由于Lu37-1抗除草剂棉花在Gohir.D10G128000基因CDS编码区的第1925位碱基发生突变破坏了BmrI酶识别位点，这样，抗除草剂棉花的Gohir.D10G128000基因669bp DNA片段不能被BmrI酶切，而野生型棉花Gohir.D10G128000基因669bp DNA片段能被酶切，电泳后有效区分突变型和野生型ALS基因。
3)分子标记的验证：CTAB法提取抗除草剂棉花Lu37-1与野生型棉花的总DNA，用无菌水稀释至100ng/μL，然后GhD10ALS642-F1和GhD10ALS-R3引物组合进行PCR扩增，反应体系为：棉花DNA 1μL，10μM正反引物各0.5μL，2×Rapid Taq Master Mix 10μL(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，无菌水8μL。PCR扩增反应程序为：预变性：95℃ 3min；35个循环：变性95℃ 15sec；退火58℃ 15sec，延伸72℃ 15sec；保温：72℃ 5min。
PCR结束后，取4μL反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，获得单一特异性条带，然后进一步对PCR产物测序，其中，野生型棉花DNA序列669bp，如SEQ ID NO.9所示；抗除草剂Lu37-1棉花DNA序列669bp，如SEQ ID NO.10所示。SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10序列自5′端起第385位碱基是SNP位点，其碱基为G或A，命名为dCAPs分子标记BmrI1925。该测序结果表明GhD10ALS642-F1和GhD10ALS-R3引物组合特异性地扩增Gohir.D10G128000基因DNA片段669bD，实现设计预期。
取4μL PCR产物进行BmrI酶切，10μL酶切体系为：10×2.1NEBbuffer 1μL，PCR产物4μL，BmrI酶1μL(NEB公司)，无菌水4μL。37℃酶切2h，取全部酶切产物在2％琼脂糖电泳，160V 20min。结果如图11所示，野生型棉花Gohir.D10G128000基因669bp DNA片段(孔1)被酶切成293bp和376bp两条带，琼脂糖电泳表现为376bp带型，而293bp酶切产物由于弥散，在琼脂糖电泳中不能显示；抗除草剂棉花Lu37-1的Gohir.D10G128000基因669bp DNA片段(孔2)不能被酶切，琼脂糖电泳表现为669bp带型，该结果成功区分抗除草剂棉花和野生型棉花，表明所开发的分子标记有效；此外，Lu37-1没有376bp带型，表明Lu37-1中的突变型ALS基因已纯合，不包含有野生型ALS基因。上述分子标记的开发可利用于后代抗除草剂株系的快速分子鉴定。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 棉花GhALS突变型蛋白、基因及其分子标记和应用
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2071
<212> DNA
<213> acetolactate synthase(棉花GhALS野生型基因Gohir.D10G128000 )
<400> 1
caccacaagc ctctcatcga caatggcggc tgccacttcg aactccgctt tgcctaagct 60
ttctacgtta acttcgtcct tcaaatcttc catacccatt tccaaatcca gccttccctt 120
ctccacaacc cctcaaaagc ccacccctta ccgctccttc gacgtttcct gctctctttc 180
tcatgcaagc tccaacccca gatccgctgc cgcatccgtt acccaaaaaa ctgctcctcc 240
ccattatttc atttccaggt atgcggatga tgagccccgg aaaggcgctg atatcctggt 300
ggaagccctg gaacgtgaag gggtcaagga tgtgtttgcc tacccaggtg gagcttcaat 360
ggagatccac caggctttaa cccgctcaaa aatcatccga aatgtccttc cgcgacacga 420
gcaaggtggg gtctttgccg ccgagggtta cgcgcgctcc tctggcattt ccggcgtttg 480
cattgcgacg tctggccctg gggcaaccaa cttggtgagt ggtctcgctg atgcgatgct 540
cgatagtatc cctctcgtgg cgatcactgg tcaagtccct cgtcggatga tcggtaccga 600
tgctttccag gaaactccaa ttgttgaggt aacaaggtct attacgaagc ataattatct 660
tgttcttgat gtggatgata ttcctaggat tgttagtgag gctttctttt tagcttcatc 720
gggcaggccg ggacctgttc tgattgatgt tcctaaggat atacaacagc aacttgctgt 780
tcctaaatgg aaccattctc ttagattgcc agggtatttg tctaggttgc ctaaggctcc 840
cgctgaggct catctcgaac agatcgtgag attggtttct gagtctaaga agcctgtttt 900
atatgttggt ggtgggtgtt tgaactctag tgaggagttg aagaggtttg ttgagcttac 960
agggataccc gttgcaagta ctttgatggg tcttggagcc tttccgattt cggatgagtt 1020
gtcgttacaa atgcttggga tgcacggaac tgtgtatgcc aattatgctg ttgataagag 1080
tgatttgttg cttgcttttg gagtgagatt tgatgatagg gtgacaggaa aacttgaggc 1140
ttttgccagc cgggcaaaga ttgtgcatat cgatatcgac tctgctgaga ttgggaagaa 1200
caagcagcct catatgtcag tgtgttccga tgtgaaattg gcattgcagg ggataaataa 1260
gatattggag accacgggag ctaagctgaa tcttgattat tcggaatgga ggcaggagtt 1320
aaacgagcag aagctgaaat tccctttgag ttacaagacc tttggtgaag ctattccacc 1380
tcaatatgca attcaggttc ttgatgaatt aactggcggg aatgcaatta taagtaccgg 1440
tgttggccag catcaaatgt gggctgctca attttacaag tataagaagc ctcgtcaatg 1500
gttaacgtct gggggattgg gtgctatggg atttggattg cctgctgcta ttggagctgc 1560
tgttgcaaac ccggaggcag ttgttgtaga catcgacggt gatggaagtt ttatcatgaa 1620
tgtgcaagag ttggcgacta tccgtgtgga aaatcttccg gttaagatat tattgttgaa 1680
taatcagcat ttgggtatgg ttgttcaatg ggaggaccgg ttttacaagg caaacagggc 1740
tcatacatac ttgggagacc catccaacga gtcggaaata ttcccaaata tgttgaaatt 1800
tgctgaagca tgcgggatac cagctgcccg ggtgacgaag aaagaagatc tcaaagcagc 1860
aattcagaaa atgttggaca ctcctggacc ttacttgttg gatgtgattg tcccacatca 1920
agaacatgtc ctgcctatga tccccagtgg aggcgctttc aaagatgtga tcacagaggg 1980
tgatggaaga acacaatatt gacctcaatg agcatcaaat ggtttttttt ttggggtaat 2040
gtatgtaatg aatgagggtg ggttatgggg g 2071
<210> 2
<211> 659
<212> PRT
<213> acetolactate synthase(棉花GhALS野生型基因Gohir.D10G128000 )
<400> 2
Met Ala Ala Ala Thr Ser Asn Ser Ala Leu Pro Lys Leu Ser Thr Leu
1 5 10 15
Thr Ser Ser Phe Lys Ser Ser Ile Pro Ile Ser Lys Ser Ser Leu Pro
20 25 30
Phe Ser Thr Thr Pro Gln Lys Pro Thr Pro Tyr Arg Ser Phe Asp Val
35 40 45
Ser Cys Ser Leu Ser His Ala Ser Ser Asn Pro Arg Ser Ala Ala Ala
50 55 60
Ser Val Thr Gln Lys Thr Ala Pro Pro His Tyr Phe Ile Ser Arg Tyr
65 70 75 80
Ala Asp Asp Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala Leu
85 90 95
Glu Arg Glu Gly Val Lys Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser
100 105 110
Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Lys Ile Ile Arg Asn Val
115 120 125
Leu Pro Arg His Glu Gln Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala
130 135 140
Arg Ser Ser Gly Ile Ser Gly Val Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly
145 150 155 160
Ala Thr Asn Leu Val Ser Gly Leu Ala Asp Ala Met Leu Asp Ser Ile
165 170 175
Pro Leu Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr
180 185 190
Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr
195 200 205
Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Asp Asp Ile Pro Arg Ile Val
210 215 220
Ser Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu
225 230 235 240
Ile Asp Val Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Leu Ala Val Pro Lys Trp
245 250 255
Asn His Ser Leu Arg Leu Pro Gly Tyr Leu Ser Arg Leu Pro Lys Ala
260 265 270
Pro Ala Glu Ala His Leu Glu Gln Ile Val Arg Leu Val Ser Glu Ser
275 280 285
Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Leu Asn Ser Ser Glu
290 295 300
Glu Leu Lys Arg Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Ala Ser Thr
305 310 315 320
Leu Met Gly Leu Gly Ala Phe Pro Ile Ser Asp Glu Leu Ser Leu Gln
325 330 335
Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp Lys
340 345 350
Ser Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr
355 360 365
Gly Lys Leu Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile Asp
370 375 380
Ile Asp Ser Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Met Ser Val
385 390 395 400
Cys Ser Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Ile Asn Lys Ile Leu Glu
405 410 415
Thr Thr Gly Ala Lys Leu Asn Leu Asp Tyr Ser Glu Trp Arg Gln Glu
420 425 430
Leu Asn Glu Gln Lys Leu Lys Phe Pro Leu Ser Tyr Lys Thr Phe Gly
435 440 445
Glu Ala Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu Thr
450 455 460
Gly Gly Asn Ala Ile Ile Ser Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp
465 470 475 480
Ala Ala Gln Phe Tyr Lys Tyr Lys Lys Pro Arg Gln Trp Leu Thr Ser
485 490 495
Gly Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ile Gly Ala
500 505 510
Ala Val Ala Asn Pro Glu Ala Val Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly
515 520 525
Ser Phe Ile Met Asn Val Gln Glu Leu Ala Thr Ile Arg Val Glu Asn
530 535 540
Leu Pro Val Lys Ile Leu Leu Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val
545 550 555 560
Val Gln Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr
565 570 575
Leu Gly Asp Pro Ser Asn Glu Ser Glu Ile Phe Pro Asn Met Leu Lys
580 585 590
Phe Ala Glu Ala Cys Gly Ile Pro Ala Ala Arg Val Thr Lys Lys Glu
595 600 605
Asp Leu Lys Ala Ala Ile Gln Lys Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr
610 615 620
Leu Leu Asp Val Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile
625 630 635 640
Pro Ser Gly Gly Ala Phe Lys Asp Val Ile Thr Glu Gly Asp Gly Arg
645 650 655
Thr Gln Tyr
<210> 3
<211> 2068
<212> DNA
<213> acetolactate synthase(棉花GhALS野生型基因Gohir.A10G138800)
<400> 3
caccacaagc ctctcatcga caatggcggc tgccactgcg aactccgctt tgcctaagct 60
ttctacgtta acttcctcct tcaaatcttc catacccatt tccaaatcca gccttccctt 120
ctccacaacc cctcaaaagc ccacccctta ccgctccttc gacgtttcct gctctctttc 180
tcatgcaagc tctaacccca gatccgccgc cacatccgtt accccaaaaa atgctcctcc 240
ccatgatttc atttccaggt atgcggatga tgagccccgg aaaggcgctg atatcctggt 300
ggaagccctg gttcgtgaag gggtcaagga tgtgtttgcc tacccaggtg gagcttcaat 360
ggagatccac caggctttaa cccgctcaaa aatcatccga aatgtccttc cgcgacacga 420
gcaaggtggg gtctttgccg ccgagggcta cgcgcgctcc tctggcattc ccggcgtttg 480
cattgcgacg tctggccctg gggcaaccaa cttggtgagt ggtctcgctg atgcaatgct 540
cgatagtatc cctctcgtgg cgatcactgg tcaagtccct cgtcggatga tcggtaccga 600
tgctttccag gaaactccaa ttgttgaggt aacaaggtct attacgaagc ataattatct 660
tgttcttgat gtggatgata ttcctaggat tgttagtgag gctttctttt tagcttcctc 720
gggcaggccg ggacctgttc tgattgatgt tcctaaggat atacaacagc aacttgctgt 780
tcctaaatgg aaccattctc ttagattgcc agggtatttg tctaggttgc ctaaggctcc 840
cggtgaggct catctcgaac agattgttag attggtttct gagtctaaga agcctgtttt 900
atatgttggt ggtgggtgtt tgaactctag tgaggagttg aagaggtttg ttgagcttac 960
agggatacct gttgcaagta ctttgatggg tcttggagcc tttccgattt cggatgactt 1020
gtcgttacaa atgcttggga tgcacggaac tgtgtatgcc aattatgctg ttgataagag 1080
tgatttgttg cttgcttttg gagtgagatt tgatgatagg gtgacgggaa aacttgaggc 1140
ttttgccagc cgggcaaaga ttgtgcatat cgatatcgat tctgccgaga ttgggaagaa 1200
caagcagcct catgtgtcag tgtgttccga tgtgaaattg gcattgcagg ggataaataa 1260
gatattggag accaaggtag caaagctgaa tcttgattat tcggaatgga ggcaggagtt 1320
aaacgagcag aagctgaaat tccctttgag ttacaagacc tttggtgaag ctattccacc 1380
tcaatatgca attcaggttc ttgatgaatt aactggcggg aatgcaatta taagtactgg 1440
tgttggtcag catcaaatgt gggctgctca attttacaag tataagaagc ctcgtcaatg 1500
gttaacatct gggggattgg gtgctatggg atttggattg cctgctgcta ttggagctgc 1560
cgttgcaaac ccagaggcag tcgttgtaga catcgatggt gatggaagtt ttatcatgaa 1620
cgtgcaagag ttggcgacta tccgtgtgga aaatcttccg gttaagatat tattgttgaa 1680
taatcagcat ttgggtatgg ttgttcaatg ggaggaccgg ttttacaagg caaacagggc 1740
tcatacatac ttgggagacc catccaacga gtcggaaata ttcccaaata tgttgaaatt 1800
tgctgaagca tgcgggatac cagctgcccg ggtgacaaag aaagaagatc taaaagcagc 1860
aatgcagaaa atgttggaca ctcctggacc ttacttgttg gatgtgattg tcccacatca 1920
agaacatgtc ctgcctatga tccccagtgg aggggctttc aaagatgtga tcacagaggg 1980
tgatggaaga acacaatatt gacctcaatg agcatcaaat ggtctttttt gggtaatgta 2040
tgtaatgaat gagggtgggt tatggggg 2068
<210> 4
<211> 659
<212> PRT
<213> acetolactate synthase(棉花GhALS野生型基因Gohir.A10G138800)
<400> 4
Met Ala Ala Ala Thr Ala Asn Ser Ala Leu Pro Lys Leu Ser Thr Leu
1 5 10 15
Thr Ser Ser Phe Lys Ser Ser Ile Pro Ile Ser Lys Ser Ser Leu Pro
20 25 30
Phe Ser Thr Thr Pro Gln Lys Pro Thr Pro Tyr Arg Ser Phe Asp Val
35 40 45
Ser Cys Ser Leu Ser His Ala Ser Ser Asn Pro Arg Ser Ala Ala Thr
50 55 60
Ser Val Thr Pro Lys Asn Ala Pro Pro His Asp Phe Ile Ser Arg Tyr
65 70 75 80
Ala Asp Asp Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala Leu
85 90 95
Val Arg Glu Gly Val Lys Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser
100 105 110
Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Lys Ile Ile Arg Asn Val
115 120 125
Leu Pro Arg His Glu Gln Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala
130 135 140
Arg Ser Ser Gly Ile Pro Gly Val Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly
145 150 155 160
Ala Thr Asn Leu Val Ser Gly Leu Ala Asp Ala Met Leu Asp Ser Ile
165 170 175
Pro Leu Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr
180 185 190
Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr
195 200 205
Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Asp Asp Ile Pro Arg Ile Val
210 215 220
Ser Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu
225 230 235 240
Ile Asp Val Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Leu Ala Val Pro Lys Trp
245 250 255
Asn His Ser Leu Arg Leu Pro Gly Tyr Leu Ser Arg Leu Pro Lys Ala
260 265 270
Pro Gly Glu Ala His Leu Glu Gln Ile Val Arg Leu Val Ser Glu Ser
275 280 285
Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Leu Asn Ser Ser Glu
290 295 300
Glu Leu Lys Arg Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Ala Ser Thr
305 310 315 320
Leu Met Gly Leu Gly Ala Phe Pro Ile Ser Asp Asp Leu Ser Leu Gln
325 330 335
Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp Lys
340 345 350
Ser Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr
355 360 365
Gly Lys Leu Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile Asp
370 375 380
Ile Asp Ser Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser Val
385 390 395 400
Cys Ser Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Ile Asn Lys Ile Leu Glu
405 410 415
Thr Lys Val Ala Lys Leu Asn Leu Asp Tyr Ser Glu Trp Arg Gln Glu
420 425 430
Leu Asn Glu Gln Lys Leu Lys Phe Pro Leu Ser Tyr Lys Thr Phe Gly
435 440 445
Glu Ala Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu Thr
450 455 460
Gly Gly Asn Ala Ile Ile Ser Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp
465 470 475 480
Ala Ala Gln Phe Tyr Lys Tyr Lys Lys Pro Arg Gln Trp Leu Thr Ser
485 490 495
Gly Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ile Gly Ala
500 505 510
Ala Val Ala Asn Pro Glu Ala Val Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly
515 520 525
Ser Phe Ile Met Asn Val Gln Glu Leu Ala Thr Ile Arg Val Glu Asn
530 535 540
Leu Pro Val Lys Ile Leu Leu Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val
545 550 555 560
Val Gln Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr
565 570 575
Leu Gly Asp Pro Ser Asn Glu Ser Glu Ile Phe Pro Asn Met Leu Lys
580 585 590
Phe Ala Glu Ala Cys Gly Ile Pro Ala Ala Arg Val Thr Lys Lys Glu
595 600 605
Asp Leu Lys Ala Ala Met Gln Lys Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr
610 615 620
Leu Leu Asp Val Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile
625 630 635 640
Pro Ser Gly Gly Ala Phe Lys Asp Val Ile Thr Glu Gly Asp Gly Arg
645 650 655
Thr Gln Tyr
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<211> 2071
<212> DNA
<213> acetolactate synthase(棉花GhALS突变型基因Gohir.D10G128000)
<400> 5
caccacaagc ctctcatcga caatggcggc tgccacttcg aactccgctt tgcctaagct 60
ttctacgtta acttcgtcct tcaaatcttc catacccatt tccaaatcca gccttccctt 120
ctccacaacc cctcaaaagc ccacccctta ccgctccttc gacgtttcct gctctctttc 180
tcatgcaagc tccaacccca gatccgctgc cgcatccgtt acccaaaaaa ctgctcctcc 240
ccattatttc atttccaggt atgcggatga tgagccccgg aaaggcgctg atatcctggt 300
ggaagccctg gaacgtgaag gggtcaagga tgtgtttgcc tacccaggtg gagcttcaat 360
ggagatccac caggctttaa cccgctcaaa aatcatccga aatgtccttc cgcgacacga 420
gcaaggtggg gtctttgccg ccgagggtta cgcgcgctcc tctggcattt ccggcgtttg 480
cattgcgacg tctggccctg gggcaaccaa cttggtgagt ggtctcgctg atgcgatgct 540
cgatagtatc cctctcgtgg cgatcactgg tcaagtccct cgtcggatga tcggtaccga 600
tgctttccag gaaactccaa ttgttgaggt aacaaggtct attacgaagc ataattatct 660
tgttcttgat gtggatgata ttcctaggat tgttagtgag gctttctttt tagcttcatc 720
gggcaggccg ggacctgttc tgattgatgt tcctaaggat atacaacagc aacttgctgt 780
tcctaaatgg aaccattctc ttagattgcc agggtatttg tctaggttgc ctaaggctcc 840
cgctgaggct catctcgaac agatcgtgag attggtttct gagtctaaga agcctgtttt 900
atatgttggt ggtgggtgtt tgaactctag tgaggagttg aagaggtttg ttgagcttac 960
agggataccc gttgcaagta ctttgatggg tcttggagcc tttccgattt cggatgagtt 1020
gtcgttacaa atgcttggga tgcacggaac tgtgtatgcc aattatgctg ttgataagag 1080
tgatttgttg cttgcttttg gagtgagatt tgatgatagg gtgacaggaa aacttgaggc 1140
ttttgccagc cgggcaaaga ttgtgcatat cgatatcgac tctgctgaga ttgggaagaa 1200
caagcagcct catatgtcag tgtgttccga tgtgaaattg gcattgcagg ggataaataa 1260
gatattggag accacgggag ctaagctgaa tcttgattat tcggaatgga ggcaggagtt 1320
aaacgagcag aagctgaaat tccctttgag ttacaagacc tttggtgaag ctattccacc 1380
tcaatatgca attcaggttc ttgatgaatt aactggcggg aatgcaatta taagtaccgg 1440
tgttggccag catcaaatgt gggctgctca attttacaag tataagaagc ctcgtcaatg 1500
gttaacgtct gggggattgg gtgctatggg atttggattg cctgctgcta ttggagctgc 1560
tgttgcaaac ccggaggcag ttgttgtaga catcgacggt gatggaagtt ttatcatgaa 1620
tgtgcaagag ttggcgacta tccgtgtgga aaatcttccg gttaagatat tattgttgaa 1680
taatcagcat ttgggtatgg ttgttcaatg ggaggaccgg ttttacaagg caaacagggc 1740
tcatacatac ttgggagacc catccaacga gtcggaaata ttcccaaata tgttgaaatt 1800
tgctgaagca tgcgggatac cagctgcccg ggtgacgaag aaagaagatc tcaaagcagc 1860
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agaacatgtc ctgcctatga tccccaatgg aggcgctttc aaagatgtga tcacagaggg 1980
tgatggaaga acacaatatt gacctcaatg agcatcaaat ggtttttttt ttggggtaat 2040
gtatgtaatg aatgagggtg ggttatgggg g 2071
<210> 6
<211> 659
<212> PRT
<213> acetolactate synthase(棉花GhALS突变型蛋白Gohir.D10G128000)
<400> 6
Met Ala Ala Ala Thr Ser Asn Ser Ala Leu Pro Lys Leu Ser Thr Leu
1 5 10 15
Thr Ser Ser Phe Lys Ser Ser Ile Pro Ile Ser Lys Ser Ser Leu Pro
20 25 30
Phe Ser Thr Thr Pro Gln Lys Pro Thr Pro Tyr Arg Ser Phe Asp Val
35 40 45
Ser Cys Ser Leu Ser His Ala Ser Ser Asn Pro Arg Ser Ala Ala Ala
50 55 60
Ser Val Thr Gln Lys Thr Ala Pro Pro His Tyr Phe Ile Ser Arg Tyr
65 70 75 80
Ala Asp Asp Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala Leu
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Glu Arg Glu Gly Val Lys Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser
100 105 110
Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Lys Ile Ile Arg Asn Val
115 120 125
Leu Pro Arg His Glu Gln Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala
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225 230 235 240
Ile Asp Val Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Leu Ala Val Pro Lys Trp
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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355 360 365
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370 375 380
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<210> 7
<211> 416
<212> DNA
<213> acetolactate synthase(野生型棉花dCAPs分子标记MfeI1925)
<400> 7
ttgcaaaccc ggaggcagtt gttgtagaca tcgacggtga tggaagtttt atcatgaatg 60
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atacatactt gggagaccca tccaacgagt cggaaatatt cccaaatatg ttgaaatttg 240
ctgaagcatg cgggatacca gctgcccggg tgacgaagaa agaagatctc aaagcagcaa 300
ttcagaaaat gttggacact cctggacctt acttgttgga tgtgattgtc ccacatcaag 360
aacatgtcct gcctatgatc cccagttgag gcgctttcaa agatgtgatc acagag 416
<210> 8
<211> 416
<212> DNA
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<400> 8
ttgcaaaccc ggaggcagtt gttgtagaca tcgacggtga tggaagtttt atcatgaatg 60
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atacatactt gggagaccca tccaacgagt cggaaatatt cccaaatatg ttgaaatttg 240
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ttcagaaaat gttggacact cctggacctt acttgttgga tgtgattgtc ccacatcaag 360
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<213> acetolactate synthase(野生型棉花dCAPs分子标记BmrI1925)
<400> 9
ttgcaaaccc ggaggcagtt gttgtagaca tcgacggtga tggaagtttt atcatgaatg 60
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atggaagaac acaatattga cctcaatgag catcaaatgg tttttttttt ggggtaatgt 480
atgtaatgaa tgagggtggg ttatgggggc ttagtttctg agttctggaa catagttttt 540
ctatgctttt aaaagcaacc aattaggttt tcagtttggt cttatgcaag tcttgtatgt 600
ctttagtaat gttatgtaat gggcgaatct aaacttgttt ttgttcaaat gatgaatgct 660
gtttttgtt 669
<210> 10
<211> 669
<212> DNA
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atggaagaac acaatattga cctcaatgag catcaaatgg tttttttttt ggggtaatgt 480
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<211> 21
<212> DNA
<213> GhALS-F1(Artificial Sequence)
<400> 11
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ttagaattcc cggggatccc ccataaccca ccctcattc 39
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<212> DNA
<213> GhD10ALS642-F1(Artificial Sequence)
<400> 17
ttgcaaaccc ggaggcagtt 20
<210> 18
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<213> GhD10ALS642M-R(Artificial Sequence)
<400> 18
ctctgtgatc acatctttga aagcgcctca a 31
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> GhD10ALS-R3(Artificial Sequence)
<400> 19
aacaaaaaca gcattcatca tttg 24
Claims (13)
1.一种棉花GhALS突变型蛋白，其特征在于，所述棉花GhALS突变型蛋白的氨基酸序列对应于野生型棉花GhALS的氨基酸序列的第642位由Ser突变为Asn。
2.根据权利要求1所述的棉花GhALS突变型蛋白，其特征在于，所述突变型蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
3.一种棉花GhALS突变型基因或核酸，其特征在于，其编码权利要求1~2中任一项所述的突变型蛋白。
4.根据权利要求3所述的棉花GhALS突变型基因或核酸，其特征在于，其核苷酸序列SEQID NO.5所示。
5.表达盒、重组载体或细胞，其含有权利要求3或4所述的突变型基因或核酸。
6.权利要求1~2任一项所述的突变型蛋白，权利要求3或4所述的突变型基因或核酸，权利要求5所述的表达盒、重组载体或细胞在植物抗除草剂方面的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述除草剂为咪唑啉酮类除草剂，优选为甲咪唑烟酸、甲氧咪草烟或咪唑乙烟酸。
8.获得具有除草剂抗性的植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）使植物包含权利要求3或4所述的突变型基因或核酸；或
2）使植物表达权利要求1~2之任一所述的棉花GhALS突变型蛋白。
9.抗除草剂棉花相关的dCAPs分子标记，其特征在于，所述dCAPs分子标记包括分子标记MfeI1925或/和分子标记BmrI1925，所述分子标记MfeI1925的核苷酸序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID NO. 8所示，所述分子标记BmrI1925的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9或SEQ IDNO. 10所示。
10.引物对，其特征在于，所述扩增分子标记MfeI1925的引物对，其核苷酸序列如SEQNO.17和SEQ NO.18所示；所述扩增分子标记BmrI1925的引物对，其核苷酸序列如SEQ NO.17和SEQ NO.19所示。
11.鉴定或筛选抗性植物的方法，其中植物是包含权利要求3或4所述的突变型基因或核酸的植物、表达权利要求1~2之任一所述的GhALS突变型蛋白的植物或权利要求8所述的方法获得的植物，或含有权利要求9所述的dCAPs分子标记的植物，其特征在于，包括以下步骤：
1) 鉴定所述植物是否包含权利要求3或4所述的突变型基因或核酸；或，
2) 鉴定所述植物是否表达权利要求1~2之任一所述的GhALS突变型蛋白；
3）采用权利要求9所述的dCAPs分子标记鉴定或筛选所述植物是否具备除草剂抗性。
12.一种控制杂草的方法，其特征在于，包括：对种植作物的大田施用有效剂量的除草剂，所述植物包含权利要求3或4所述的核酸或基因或权利要求5所述的表达盒、重组载体或细胞，所述除草剂为咪唑啉酮类除草剂。
13.一种用于保护植物免受由除草剂引起的损伤的方法，其特征在于，包括：对种植作物的大田施用有效剂量的除草剂，所述植物包含权利要求3或4所述的核酸或基因或将权利要求5所述的表达盒、重组载体导入植物，导入后的植物产生除草剂抗性蛋白，所述除草剂为咪唑啉酮类除草剂。
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2021
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