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ES2818921T3 - Péptido que tiene actividad inhibidora de la angiogénesis y composición que contiene el mismo - Google Patents

Péptido que tiene actividad inhibidora de la angiogénesis y composición que contiene el mismo Download PDF

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ES2818921T3
ES2818921T3 ES14864515T ES14864515T ES2818921T3 ES 2818921 T3 ES2818921 T3 ES 2818921T3 ES 14864515 T ES14864515 T ES 14864515T ES 14864515 T ES14864515 T ES 14864515T ES 2818921 T3 ES2818921 T3 ES 2818921T3
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Sang Jae Kim
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Abstract

Una composición anti-angiogénica que comprende un péptido de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NÚM.: 1 para su uso en la prevención o tratamiento del crecimiento o metástasis tumoral, en la que la prevención o tratamiento comprende la inhibición de la proliferación de células endoteliales vasculares o la formación del tubo.

Description

DESCRIPCIÓN
Péptido que tiene actividad inhibidora de la angiogénesis y composición que contiene el mismo
Antecedentes
La proliferación, diferenciación y destrucción de células y tejidos para mantener la homeostasis corporal está controlada por un equilibrio de las interacciones entre varios factores estimulantes de células y las células de la matriz extracelular. Cuando se produce un desequilibrio en esta regulación, se producen diversas enfermedades que comprenden una apoptosis o no activación para detener la señal de proliferación, un suministro nutricional por angiogénesis continua, un tumor maligno expresado por permeación a los tejidos circundantes y se produce una metástasis.
La angiogénesis comprende toda una degradación de la membrana basal celular, un movimiento celular, una invasión a la matriz extracelular, una proliferación celular y una síntesis de la cavidad endotelial del capilar. Para la inhibición de estos, existe un procedimiento directo para dirigirse a células endoteliales vasculares y un procedimiento indirecto para dirigirse a células cancerosas o células circundantes que producen factores de angiogénesis. Se han llevado a cabo ampliamente estudios que están destinados a desarrollar una proteína de anticuerpo para inhibir la actividad del factor de angiogénesis o un material de bajo peso molecular para bloquear el receptor.
La angiogénesis se produce a través de una serie de etapas que incluyen un movimiento y una división de las células endoteliales para formar paredes sanguíneas. Son conocidas aproximadamente 15 clases de proteínas para activar el crecimiento y el movimiento de las células endoteliales, y estas regulan la angiogénesis. Por lo tanto, la angiogénesis se puede inhibir con un inhibidor de proteínas de activación tal como angiogenina, factor de crecimiento epitelial, estrógeno, factor de crecimiento de fibroblastos, interleuquina 8, prostaglandina E1 y E2, factor de necrosis tumoral o G -CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos).
Las proteínas de choque térmico (HSP) son chaperonas moleculares que desempeñan un papel crítico en el mantenimiento de la homeostasis. Son críticas para la supervivencia celular, especialmente en situaciones de estrés tal como hipoxia. Las HSP, especialmente HSP90 y HSP 70, están altamente expresadas en una amplia variedades de tumores [Morano KA, Annals of the New York Academy of Sciences, 1113: 1-14, 2007; Calderwood SK et al, Trends in biochemical sciences, 31:164-72, 2006]. Ha sido demostrado que la expresión de diversas HSP se correlaciona con la proliferación, diferenciación y apoptosis de las células tumorales en varios cánceres, lo que indica que las HSP desempeñan un papel crucial en la supervivencia de las células cancerosas debido a su función citoprotectora. La sobreexpresión de HSP70 induce la tumorigenicidad a las células de fibrosarcoma ratón y la sobreexpresión de HSP70 en células T de ratones transgénicos produjo un aumento del linfoma de células T en estos ratones [Jaattela M, International journal of cancer Journal international du cancer, 60:689-93, 1995; Seo JS et al, Biochemical and biophysical research communications, 218:582-7, 1996; Volloch VZ et al, Oncogene, 18:3648-51, 1999; Murphy ME, Carcinogenesis, 34:1181-8, 2013]. En especial, es sabido que HSP70 cumple un papel crucial en la protección de las células de la apoptosis. Además, la sobreexpresión de la expresión de HSP parece estar implicada en la angiogénesis, invasión y metástasis [Calderwood SK et al, Trends in biochemical sciences, 31:164-72. 2006; Zhou J et al, The Journal of biological chemistry, 279: 13506-13, 2004; Bruns AF et al, PloS one, 7:e48539, 2012; Sun J et al, Arteriosclerosis, thrombosis and vascular biology. 24:2238-44, 2004; Gong W, et al, Oncology reports, 2013; Eustace BK et al, Cell cycle, 3:1098-100, 2004; Eustace BK et al, Nature cell biology, 6:507-14, 2004].
El documento WO2013167299 desvela la SEQ ID NÚM.:1 como un péptido antiinflamatorio para uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias tal como, por ejemplo, psoriasis, enfermedades vasculares y aterosclerosis, cáncer y enfermedades tumorales.
Sobre la base de la teoría de que el cáncer se puede curar mediante la inhibición del crecimiento del cáncer y la metástasis a través del bloqueo de la vascularización para suministrar oxígeno y nutrición a las células, se han desarrollado fármacos para la anti-angiogénesis para tratar no solo el cáncer, sino también la artritis retinopatía diabética, inflamación crónica y enfermedad cardíaca isquémica. El tratamiento de la anti-angiogénesis inhibe directamente el crecimiento y metástasis tumoral y normaliza indirectamente las circunstancias vasculares del tumor para mejorar el efecto del tratamiento que administra los fármacos biológicos y químicos de manera efectiva y refinar la circunstancia de hipoxia.
Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar fármacos anti-angiogénesis para tratar o prevenir tumores malignos, diversas enfermedades (artritis, retinopatía diabética, inflamación crónica, enfermedades cardíacas isquémicas, etc.), tumores relacionados con angiogénesis excesiva (cáncer), enfermedades vasculares del corazón (por ejemplo, aterosclerosis), inflamación crónica (por ejemplo, artritis reumática o enfermedad de Crohn), diabéticos (por ejemplo, retinopatía diabética), psoriasis y endometriosis.
Descripción detallada de la invención
Problema técnico
Por tanto, los inventores de la presente han intentado desarrollar una composición para la anti-angiogénesis que tenga un efecto secundario mínimo y un efecto de tratamiento superior, y han completado la presente invención. El objeto de acuerdo con una realización de la presente invención es proporcionar un péptido con un efecto de antiangiogénesis, una composición que lo comprende y un procedimiento para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis.
El objeto de acuerdo con otra realización de la presente invención es proporcionar una composición para inhibir eficientemente el crecimiento y la metástasis tumoral.
El objeto de acuerdo con otra realización de la presente invención es proporcionar una composición para el tratamiento y la prevención de enfermedades relacionadas con la angiogénesis.
So luciones para el problema
El objeto de la invención es definido mediante las reivindicaciones adjuntas.
En una realización de la presente invención, es proporcionada una composición anti-angiogénica que comprende un péptido de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NÚM.:1 para uso en la prevención o tratamiento de crecimiento o metástasis tumoral, en la que la prevención o tratamiento comprende la inhibición de la proliferación de células endoteliales vasculares o la formación del tubo.
En otra realización de la presente invención, es proporcionada una composición anti-angiogénica que comprende un péptido de la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nú M.:1 para uso en la prevención o tratamiento de oftalmopatía relacionada con angiogénesis excesiva.
En la composición para usar de acuerdo con la realización de la presente invención, la composición puede inhibir la proliferación de células endoteliales vasculares o la formación del tubo.
En la composición para uso de acuerdo con la realización de la presente invención, la composición puede inhibir la proliferación de células endoteliales vasculares por VEGF-A (Factor de crecimiento endotelial vascular A), formación del tubo o invasión de células endoteliales.
En la composición para uso de acuerdo con la realización de la presente invención, la oftalmopatía puede ser retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, rechazo del injerto de córnea, glaucoma neovascular, síndrome escarlata, retinopatía proliferativa, psoriasis y degeneración macular.
En la composición para uso de acuerdo con la realización de la presente invención, la composición puede inhibir la proliferación de células endoteliales vasculares, vascularización e invasión inducida por V EG f (Factor de crecimiento vascular endotelial) de células endoteliales vasculares.
En la composición para uso de acuerdo con la realización de la presente invención, la composición puede ser una composición farmacéutica.
En la composición para uso de acuerdo con la realización de la presente invención, la composición puede ser una composición alimenticia.
De acuerdo con otra realización de la presente invención, puede ser proporcionada la composición anti-angiogénica para uso en la prevención y tratamiento de las enfermedades relacionadas con angiogénesis que comprende una etapa de administración de la composición a un sujeto.
En la composición para el uso de acuerdo con otra realización de la presente invención, el uso para el tratamiento y prevención de enfermedades relacionadas con angiogénesis comprende una etapa de administración de la composición a un individuo que lo necesita.
Efecto de la invención
De acuerdo con la presente invención, puede ser proporcionada la composición para inhibir efectivamente la angiogénesis. Por lo tanto, la composición para uso de acuerdo con la presente invención puede ser para el tratamiento y prevención de enfermedades relacionadas con angiogénesis y en especial el tratamiento de oftalmopatía por el crecimiento tumoral e inhibición de metástasis y angiogénesis excesiva.
Además, un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NÚM.:1, un péptidos que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene 80% de homología o más del péptido, o un fragmento de la secuencia de aminoácidos tiene una eficacia de anti-angiogenésis superior.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 y la Figura 2 son las fotografías que representan los resultados de que PEP1 inhibe la producción de HIF-1a en células inducidas por hipoxia. Las células MCF7 y HeLa después del tratamiento con PEP1 (20 pM) o vehículo, fueron incubadas en una circunstancia de hipoxia durante un tiempo fijo. El lisado celular fue inmunotransferido para analizar la cantidad de HIF-1a.
La Figura 3 es un gráfico que representa la inhibición de la producción de V EG F en circunstancias de hipoxia inducida por PEP1. Las células MCF7 y HeLa fueron tratadas con PEP1 (20 pM) o vehículo y fueron incubadas en circunstancias de normoxia y en circunstancias de hipoxia durante el tiempo designado. La cantidad de V EG F secretada en el sobrenadante de incubación celular fue confirmada por ELISA (versus simulado, ‘ significa p <0,05, ** significa p <0,01, >K significa p <0,001 respectivamente)
Las Figuras 4 y 5 son el resultado de la regulación por disminución de HSP70 y HSP90 mediante el tratamiento de PEP1 en células tumorales. Se trataron células Jurkat (figura 4) y MCF7 (Figura 5), en medio sin suero, mediante el aumento de la concentración de PEP1 o péptido mezclado durante 2 horas. La cantidad de péptidos HSP70 y HSP90 se analiza mediante inmunotransferencia usando anticuerpos de HSP70, HSP90 y GAPDH.
Las Figuras 6 y 7 son los resultados experimentales que demuestran la inhibición de la producción de HSP en circunstancias inducidas por hipoxia por PEP1. Las células MCF y HeLa fueron tratadas con PEP1 (20 pM) o vehículo y fueron incubadas en circunstancias de hipoxia durante el tiempo fijo. Los lisados celulares se someten a inmunotransferencia para analizar la cantidad de HSP70 y HSP90.
La Figura 8 es el resultado que muestra que las células Jurkat y MCF7 fueron tratadas con vehículo, PEP1, 17-AAG y KAK437. Las células Jurkat y MCF7, en medios sin suero, fueron tratadas con vehículo, PEP1 (5 pM para Jurkat y 20 pM para MCF7), 17-AAG (1 pM), KNK437 (1 pM) durante 2 horas. El lisado celular se analizó mediante inmunotransferencia de manera similar a la usada en la Figura 4.
La Figura 9 es el resultado de que las células MCF7, con o sin MG132 (5 pM), fueron tratadas con PEP1 o PBS. La HSP intracelular y la HSP extracelular fueron teñidas mediante tinción superficial intracelular y tinción superficial, según los materiales y procedimientos mencionados, y fueron analizadas mediante citometría de flujo (color rojo: DMSP; color azul: PEP1 DMSO; color naranja: PEP1 MG132; color verde: MG132).
Las Figuras 10 y 11 son los gráficos que representan la inhibición de la proliferación de células cancerosas por PEP1 en circunstancias de hipoxia. Fueron incubadas células MCF7 y HeLa en circunstancias de normoxia (panel izquierdo) o en circunstancias de hipoxia (panel derecho) con o sin PEP1. En el día 2, día 4, día 6 de la incubación, fue recontado el número de células (representación de los datos mediante media ± SD, versus simulado, *significa p <0,05, fue utilizada la prueba t de 1 vía).
Las Figuras 12 y 13 son los resultados que representan el efecto de PEP1 sobre la población de monocitos Tie2+ en células tumorales. La población de monocitos Tie2+ CD11b+ se analizó mediante tinción de inmunofluorescencia para la detección de Tie2 (verde, AlexaFlour 488) y CD11b (rojo, AlexaFlour 633). Usando la tinción DApI, fueron visualizados los núcleos celulares. La barra de escala representa 50 pM. Las flechas en las imágenes megascópicas representan Tie2+ CD11b+. Los macrófagos estaban representados por hpf. Los 5 campos fueron seleccionados aleatoriamente de cada 2 portaobjetos del grupo de tratamiento de tejido tumoral para la cuantificación (* significa p <0,05, ** significa p <0,01, *** significa p <0,001, usando una prueba de 2 vías).
Las Figuras 14 a 16 son los resultados que representan la disminución de los niveles de proteína HSP70 y HSP90 en el tumor mediante el tratamiento con PEP1. Mediante el uso de la tinción inmunohistoquímica con los anticuerpos contra HSP70 y HSP90, fueron visualizados los niveles de proteína HSP70 y HSp90 (Figura 14) y fueron cuantificados mediante el software Leica Qwin (Figura 15). 10 campos fueron seleccionados aleatoriamente para la cuantificación de 6 portaobjetos de cada grupo de tratamiento (representación de los datos por medio de ± SD, versus control, * medias p <0,05, usando la prueba T de 2 vías). Los extractos de proteínas del tumor fueron inmunotransferidos mediante anticuerpos contra HSP70, HSP90, GRP78 y GAPDH (Figura 16).
Las Figuras 17 y 18 son los resultados que representan el efecto de PEP1 sobre el nivel de secreción de HSP70 en sangre. En la Figura 17, el nivel de HSP70 (panel de la izquierda) y HSP90 (panel de la derecha) fue confirmado mediante el uso del suero recolectado de los modelos de ratones tratados con PEP1 (5pg/kg) o PBS (10 ratones por grupo; n = 20) a través de ELISA. En la Figura 18, fue analizada la relación entre el nivel sanguíneo de HSP70 y el peso del tumor (panel izquierdo) o el tamaño del tumor (tumor de la derecha) (R2 = 1, versus el peso del tumor, HSP70 muestra P = 0,037 versus el tamaño del tumor, HSP70 muestra p = 0,039, usando la prueba t de 2 vías).
Las Figuras 19 a 21 representan la inhibición del crecimiento tumoral in vivo por PEP1. Fueron inyectadas células MC38 a modelos de ratón BALB/c atímico (Nu/Nu) (10 ratones para 1 grupo; n = 20) por vía subcutánea. En el modelo de ratón con tumor, fueron inyectadas por vía intraperitoneal PEP1 o PBS una vez cada 2 días. Cuando el diámetro del tumor era de 10 mm, fue inyectada PEP1 o PBS en el tumor. En el experimento de la Figura 19, fue medido el volumen del tumor cada 2 días. En el experimento de la Figura 20, fue medido el peso del tumor 14 días después de sacrificar el ratón. El tumor eliminado se mostró en la Figura 21 (versus vehículo, *significa p <0,05, **significa p <0,01, usando la prueba t de 2 vías).
Las Figuras 22 a 24 representan los resultados de la prueba histológica del tumor de ratón tratado con PEP1. Las células tumorales recolectadas del modelo de ratón que tiene el tumor tratado con PEP1 o vehículo se prepararon para inmunohistoquímica. En el experimento de la Figura 22, las secciones fijadas en parafina fueron teñidas mediante tinción H&E y se observaron con un microscopio. En el experimento de la Figura 23, la apoptosis se analizó mediante el ensayo TUN EL con las secciones. En el experimento de la Figura 24, las células en proliferación fueron analizadas mediante inmunohistoquímica con anticuerpos PCNA (antígeno nuclear de células en proliferación). Los 10 campos seleccionados aleatoriamente de 6 portaobjetos de cada grupo de tratamiento, para la cuantificación, fueron analizados mediante el software Leica Qwin.
Las Figuras 25a y 25b, como los experimentos para la evaluación del efecto anti-angiogénesis de PEP1, en células endoteliales de vena umbilical humana, después de tratar PEP1 en cada concentración (0,05, 0,5, 5 |iM), mediante la medición de la proliferación celular (Figura 25a) y la viabilidad celular (Figura 25b), representan el resultado del efecto de inhibición de la proliferación de células endoteliales vasculares.
Las Figuras 26a y 26b representan que, como los experimentos para la evaluación del efecto antiangiogénesis de PEP1, después de tratar PEP1 en las células endoteliales vasculares en cada concentración (0,05, 0,5, 5 |iM), mediante la observación del resultado (Figura 26a) y realización del gráfico (Figura 26b), el efecto de inhibir la vascularización con la célula endotelial vascular. Las Figuras 27a y 27b representan que, como los experimentos para la evaluación del efecto anti-angiogénesis de PEP1, después de tratar PEP1 a cada concentración (0,05, 0,5, 5 |iM) a las células endoteliales vasculares inducidas por VEGF-A (Factor de crecimiento endotelial vascular), mediante la medición de la proliferación celular (Figura 27a) y la viabilidad celular (Figura 27b), el resultado de observar el efecto de inhibición de la proliferación de células endoteliales vasculares.
Las Figuras 28a y 28b representan que, como los experimentos para la evaluación del efecto antiangiogénesis de PEP1, después de administrar PEP1 en cada concentración (0,05, 0,5, 5 pM) a las células endoteliales vasculares inducidas por VEGF-A (Factor de crecimiento endotelial vascular), mediante la observación del resultado (Figura 28a) y realización del gráfico (Figura 28b), el efecto de inhibir la vascularización con la célula endotelial vascular.
La Figura 29 es el esquema del diagrama mimético que es un inserto Transwell instalado.
Las Figuras 30a y 30b representan que, como los experimentos para la evaluación del efecto antiangiogénesis de PEP1, después de administrar PEP1 a cada concentración (0,05, 0,5, 5 pM) a las células endoteliales vasculares inducidas por VEGF-A (Factor de crecimiento endotelial vascular), mediante la observación del resultado después de fijar un inserto con metanol y eliminar las células no invasoras en la parte superior del inserto (Figura 30a) y mediante la realización del gráfico (Figura 30b), el resultado de inhibir la invasión de células endoteliales vasculares .
Mejor modo de exam inar la invención
Debido a que la presente invención puede ser adaptada a diversos campos de uso y con diversas modificaciones, las siguientes son descripciones más detalladas de la presente invención. Sin embargo, esto no es un medio para limitar la forma de aplicación práctica; se debe entender que la intención es incluir el concepto y el alcance de la tecnología en todas las modificaciones, equivalentes a alternativas. En la descripción de la presente invención, si se considera que cualquier descripción detallada sobre la técnica anterior deteriora los principios fundamentales de la presente invención, se omitirá la descripción.
El telómero es conocido como una secuencia repetitiva de material genético que se halla en los extremos de los cromosomas y que evita que los cromosomas se dañen o se fusionen con otros cromosomas. La longitud del telómero se acorta en cada división celular, y después de un cierto número de división celular, la longitud del telómero se acorta extremadamente hasta el punto en que la célula deja de dividirse y muere. Por otra parte, es sabido que el alargamiento de los telómeros prolonga la vida útil de una célula. Por ejemplo, las células cancerosas excretan una enzima llamada telomerasa, que previene el acortamiento de los telómeros, de este modo se produce la proliferación de células cancerosas. Los inventores de la presente invención han identificado que un péptido derivado de la telomerasa es eficaz en la anti-angiogénesis y han completado la presente invención.
La angiogénesis excesiva está relacionada con enfermedades tal como cáncer, degeneración macular relacionada con la edad, artritis reumatoide y psoriasis. Si existen tales enfermedades, debido a la angiogénesis excesiva, la formación del nuevo vaso sanguíneo en el tejido que tiene enfermedades destruye los tejidos normales. En caso de cáncer, los nuevos vasos sanguíneos pueden hacer que las células tumorales sean parásitas de otros tejidos por circulación.
Dicha enfermedad relacionada con la angiogénesis es crecimiento tumoral y metástasis, retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, rechazo del injerto corneal, glaucoma neovascular, síndrome escarlata, retinopatía proliferativa, psoriasis, degeneración macular, artropatía hemofílica, proliferación capilar dentro de placas ateroscleróticas, queloide, granulación de heridas, adhesión vascular, artritis reumatoide, inflamación crónica, osteoartritis, enfermedad autoinmune, enfermedad de Crohn, restenosis, aterosclerosis, estenosis del intestino, enfermedad por arañazo de gato, úlceras, complicaciones de cirrosis, glomerulonefritis, nefropatía diabética, nefroesclerosis maligna, síndrome microvascular trombótico, rechazo de trasplante de órganos, glomerulopatía, diabetes o trastornos o enfermedades relacionados con angiogénesis no controlados o de inflamación para los ejemplos, pero sin limitarse a ellos.
Por lo tanto, como fármacos de tratamiento para la retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, degeneración macular retiniana, glaucoma neovascular, enfermedad oclusiva venosa retiniana, enfermedades oclusivas arteriales retinianas, placa alar, rubeosis, angiogénesis retiniana, tumor sólido, hemangioma, el crecimiento y metástasis del tumor, la búsqueda del compuesto anti-angiogénesis útil es significativa para encontrar los fármacos ampliamente usables para las muchas enfermedades.
HSP90, mediante la regulación de las proteínas cliente que son importantes para la viabilidad celular y el crecimiento tumoral, tiene una estrecha relación con la formación del tumor [Calderwood SK, Trends in biochemical sciences. 31, 164-72, 2006; García-Carbonero R et al, The lancet oncology, 14, e358-69, 2013]. La lista de tales proteínas cliente incluye un receptor de tirosina quinasa, una proteína de transferencia de señal, una proteína del ciclo celular, una proteína anti-apoptosis, etc. [García-Carbonero R et al., The lancet oncology. 14, e358-69, 2013]. Para estas proteínas, HIF-la (alfa) cumple un papel clave en la inducción de angiogénesis en circunstancias de hipoxia. Por tanto, la sobreexpresión de HSP90 induce un aumento de la vascularización del tumor [Sun J et al, Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology., 24:2238-44, 2004; Pfosser A et al, Cardiovascular research. 65:728-36. 2005]. Tanto HSP70 como HSP90 que se muestran localmente en la grieta extracelular y la membrana plasmática [[Ferrarini M et al, International journal of cancer Journal international du cancer. 51:613-9. 1992; Vanbuskirk A et al, The Journal of experimental medicine. 170:1799-809, 1989, especialmente HSP70 liberada de los tumores están estrechamente relacionadas con el progreso y el mal pronóstico de algunos tumores [Yeh CH et al, Leukemia research, 34:605-9, 2010; Kocsis J et al, Cell stress & chaperones , 15:143-51, 2010], y se encuentra que el valor sérico de HSP70 está relacionado con el valor interno de HSP70 [Dempsey NC et al, Journal of leukocyte biology, 87:467-76, 2010]. Además, la inhibición de HSP90 produce la disminución de la angiogénesis y el efecto citopático directo a las células cancerosas. [Ganji PN et al, Angiogenesis, 16:903-17, 2013; Bohonowych JE et al, BMC cancer, 11:520, 2011]. HSP70 también ha sido un objetivo para el tratamiento farmacéutico, y se desarrollaron algunos candidatos [Evans CG et al, Journal of medicinal chemistry, 53:4585-602, 2010; Powers Mv et al, Cell cycle, 9:1542-50, 2010].
Los inventores de la presente descubrieron el efecto de PEP1 sobre los valores de HIF-la y V EG F en el crecimiento de células cancerosas, circunstancias de normoxia y circunstancia de hipoxia, y realizaron el experimento para evaluar el efecto de PEP1 in vivo usando modelos de ratón de xenoinjerto.
Los inventores de la presente confirmaron que cuando fue administrada PEP1 a las células cancerosas, disminuye la producción de HIF1-a en circunstancias de hipoxia, y que cuando fue administrada PEP1 a las células cancerosas, disminuye el nivel de proteínas HSP70 y HSP90.
En una realización de la presente divulgación, es incluido un péptido de una secuencia de aminoácidos SEQ ID NÚM.: 1, un fragmento de péptido del péptido mencionado anteriormente o un péptido que tiene una identidad de secuencia del 80% o más con la secuencia de aminoácidos del péptido mencionados anteriormente comprenden telomerasa, en particular, telomerasa derivada de Homo sapiens.
Los péptidos descritos en la presente pueden incluir péptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99 % de homología de secuencia con el péptido de SEQ ID NO 1 o un fragmento del mismo. Además, los péptidos develados pueden incluir péptidos que tienen diferencias de la SEQ ID NÚM.: 1 o un fragmento de la misma en al menos un aminoácido, al menos 2 aminoácidos, al menos 3 aminoácidos, al menos 4 aminoácidos, al menos 5 aminoácidos, al menos 6 aminoácidos, o al menos 7 aminoácidos.
Los cambios en los aminoácidos incluyen modificaciones de las características físicas y químicas del péptido. Por ejemplo, se puede realizar una modificación de aminoácidos para mejorar la estabilidad térmica del péptido, alterar la especificidad del sustrato y cambiar el pH óptimo.
El término "aminoácido" en la presente incluye no sólo los 22 aminoácidos estándares que se integran naturalmente en un péptido, sino también los isómeros D y los aminoácidos modificados. Por tanto, en una realización específica de la presente invención, un péptido de la presente memoria incluye un péptido que tiene D-aminoácidos. Además, un péptido puede incluir aminoácidos no estándares tales como los que se han modificado postraduccionalmente. Los ejemplos de modificación postraduccional incluyen fosforilación, glicosilación, acilación (que incluyen acetilación, miristilación, palmitoilación), alquilación, carboxilación, hidroxilación, glicación, biotinilación, ubiquitinilación, modificación de propiedades químicas (por ejemplo, desimidación de eliminación-p, desamidación) y modificación estructural (por ejemplo, formación de puente disulfuro). Además, los cambios de aminoácidos incluyen los cambios de aminoácidos que ocurren debido a la reacción química durante el proceso de combinación con agentes de reticulación para la formación de un péptido conjugado, tal como cambios en un grupo amino, grupo carboxilo o cadena lateral.
Un péptido descrito en la presente puede ser un péptido de tipo salvaje que se ha identificado y aislado de fuentes naturales. Mientras tanto, cuando se compara con la SEQ ID NÚM.: 1 o sus fragmentos, los péptidos descritos en la presente pueden ser variantes artificiales que comprenden uno o más aminoácidos sustituidos, suprimidos y/o insertados. La alteración de aminoácidos en polipéptidos de tipo salvaje, no solo en variantes artificiales, comprende el plegamiento de proteínas y/o sustituciones conservadoras de aminoácidos que no influyen significativamente en las actividades. Los ejemplos de sustituciones conservadoras pueden estar dentro de los grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparaginas), aminoácidos hidrófobos (leucina, isoleucina, valina y metionina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina y treonina). Las sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran las actividades específicas son conocidas en la técnica. Las alteraciones más comunes son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly y las alteraciones opuestas de los mismos. En la siguiente Tabla 1 se muestran otros ejemplos de sustituciones conservadoras:
Figure imgf000007_0001
La transformación sustancial de las propiedades biológicas de los péptidos es realizada mediante la selección de una sustitución significativamente diferente en las siguientes eficacias: (a) la eficacia en el mantenimiento de la estructura del esqueleto polipeptídico en el área de sustitución, tal como estructuras tridimensionales en forma de hoja o helicoidal, (b) la eficacia para mantener la carga eléctrica o la hidrofobicidad de la molécula en el área diana, o (c) la eficacia para mantener la masa de la cadena lateral. Los residuos naturales son divididos en grupos de acuerdo con las propiedades generales de la cadena lateral de la siguiente manera:
(1) hidrofobicidad: Norleucina, met, ala, val, leu, ile;
(2) hidrofilicidad neutra: cys, ser, thr;
(3) acidez: asp, glu;
(4) alcalinidad: asn, gin, his, lys, arg;
(5) residuo que afecta la orientación de la cadena: gly, pro; y
(6) aromaticidad: trp, tyr, phe.
Se pueden realizar sustituciones no conservadoras mediante el intercambio de un miembro de las clases anteriores por el de una clase diferente. Cualquier residuo de cisteína que no esté relacionado con el mantenimiento de la estructura tridimensional apropiada del péptido se puede sustituir típicamente con serina, de este modo aumenta la estabilidad oxidativa de la molécula y se evita la reticulación inapropiada. Por el contrario, se puede lograr una mejora de la estabilidad mediante la adición de enlaces de cisteína al péptido.
Otro tipo de variantes de aminoácidos de péptidos son las que tienen un patrón modificado de glicosilación de péptidos. El término "cambio" en la presente significa la supresión de al menos un residuo de carbohidrato que se encuentra en un péptido y/o la adición de al menos un residuo glicosilado que no existe dentro de un péptido.
La glicosilación de los péptidos típicamente está unida a N o a O. El término "unido a N" en la presente se refiere a que los residuos de carbohidratos están unidos a la cadena lateral de los residuos de asparagina. Como secuencias de tripéptidos, asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina (en la que X es cualquier aminoácido excepto prolina) son una secuencia de reconocimiento para unir un residuo de carbohidrato enzimáticamente a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, con la presencia de una de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido, se crean los potenciales sitios de glicosilación. "Glicosilación unida a O" significa la unión de un azúcar de N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a hidroxilaminoácidos. Los hidroxilaminoácidos son más típicamente serina o treonina, pero se puede usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
La adición de un sitio de glicosilación a un péptido se realiza convenientemente mediante el cambio de una secuencia de aminoácidos para contener una secuencia de tripéptidos mencionada anteriormente (para sitios de glicosilación unidos a N). Estos cambios se pueden realizar mediante la adición de al menos uno de los residuos de serina o treonina a la primera secuencia de anticuerpo, o mediante la sustitución con estos residuos (para sitios de glicosilación unidos a O).
Además, el péptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NÚM.: 1, el péptido que comprende la secuencia de aminoácidos que tiene más del 80% de homología con la secuencia mencionada anteriormente, o los fragmentos del péptido mencionado anteriormente tienen la ventaja de una baja toxicidad y alta estabilidad en materia viva. La s E q ID No: 1 como se usa en la presente es un péptido derivado de telomerasa compuesto por 16 aminoácidos.
El péptido descrito en la SEQ ID NÚM.: 1 es el mismo que en la siguiente tabla 1. El "nombre" en la siguiente Tabla 2 fue para la distinción de péptidos. En una realización específica diferente de la presente invención, el péptido de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 1 incluye "péptidos sintéticos" sintetizados mediante la selección y síntesis de un péptido correspondiente a la posición pertinente dentro de la telomerasa. La SEQ ID NÚM.: 2 es la secuencia de aminoácidos de la telomerasa completa.
[TABLA 2]
Figure imgf000009_0001
En una realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la invención que comprende el péptido de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NÚM.: 1 que tiene actividad de antiangiogénesis como ingrediente activo.
La composición para su uso de acuerdo con una realización de la presente invención puede contener de 0,01 g/L a 1 kg/L, específicamente de 0,1 g/L a 100 g/L, más específicamente de 1 g/L a 10 g/L de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de al menos una de SEQ ID NÚM.: 1, un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos un 80% de homología de secuencia con las secuencias mencionadas anteriormente, o un fragmento de las mismas. Cuando el péptido está contenido en los intervalos mencionados anteriormente, se puede satisfacer tanto la seguridad como la estabilidad de la composición y los intervalos son apropiados en términos de rentabilidad.
La composición para uso de acuerdo con una realización de la presente invención puede tener aplicaciones con todos los animales, que incluyen seres humanos, perros, pollos, cerdos, vacas, ovejas, cobayos y monos.
La composición para su uso de acuerdo con una realización de la presente invención puede proporcionar la composición farmacéutica para inhibir la angiogénesis que comprende el péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 1, el péptido que comprende la secuencia de aminoácidos que tiene más de 80 % de homología con la secuencia mencionada anteriormente, o fragmentos del péptido mencionado anteriormente. En la composición farmacéutica para uso de acuerdo con una realización de la presente invención se puede administrar por vía oral, rectal, transdérmica, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, en la médula ósea, epidural o subcutánea.
Las formas de administración oral pueden ser, pero sin limitación, comprimidos, pastillas, cápsulas blandas o duras, gránulos, polvos, solución o emulsión. Las formas de administración no oral pueden ser, pero sin limitación, inyecciones, goteos, lociones, ungüentos, geles, cremas, suspensiones, emulsiones, supositorios, parches o spray.
La composición farmacéutica para uso de acuerdo con una realización de la presente invención, si es necesario, puede contener aditivos, tal como diluyentes, excipientes, lubricantes, aglutinantes, desintegrantes, tampones, dispersantes, tensioactivos, agentes colorantes, aromáticos o edulcorantes. En una realización de la presente invención, la composición farmacéutica se puede fabricar mediante procedimientos convencionales de la industria en la técnica.
La dosis del ingrediente activo de la composición farmacéutica para uso de acuerdo con una realización de la presente invención, puede variar de acuerdo con la edad, sexo, peso, patología y estado del paciente, vía de administración o criterio del prescriptor. La dosis basada en estos factores se puede determinar dentro de los niveles de los expertos en la técnica, y la dosis diaria, por ejemplo, puede ser, pero sin limitación, 10 ng/kg/día a 10 mg/kg/día, específicamente 0,1 mg./kg/día a 1 mg/kg/día, más específicamente el 1 mg/kg/día a 100 mg/kg/día, más específicamente 2 mg/kg/día a 50 mg/kg/día, pero se puede ajustar si existen diferencias del efecto de acuerdo con la dosis de administración. En una realización de la presente invención, la composición farmacéutica se puede administrar, pero sin limitación, 1 a 3 veces al día.
En una realización de la presente invención es proporcionada la composición alimenticia para uso en antiangiogénesis que comprende el péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 1, el péptido que comprende la secuencia de aminoácidos que tiene más del 80% de homología con la secuencia mencionada anteriormente, o fragmentos del péptido mencionado anteriormente.
En una realización de la presente invención, la composición alimenticia no se limita a formas específicas, sino que, por ejemplo, pueden ser comprimidos, gránulos, polvos, líquidos y formas sólidas. Cada forma se puede preparar con ingredientes comúnmente usados en la industria elegidos apropiadamente por los expertos en la técnica, además del ingrediente activo, y puede producir un efecto sinérgico en combinación con otros ingredientes.
Los términos usados en la presente están destinados al uso para describir las realizaciones, no para limitar la presente invención. Los términos sin números delante no son para limitar la cantidad, sino para mostrar que puede haber más de una cosa del término usado. Los términos "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" se interpretarán abiertamente (es decir, "que incluye pero no sin limitación").
La razón por la que los valores numéricos se mencionan como intervalos es solo porque es conveniente describirlos en el intervalo en lugar de números individuales. A menos que se indique lo contrario, se debe entender que cada valor numérico individual se describe individualmente e integrado en la memoria descriptiva. Los umbrales en todos los intervalos están incluidos y se pueden combinar de forma independiente.
A menos que se indique lo contrario o que contradiga claramente el contexto, todos los procedimientos mencionados en la presente se pueden realizar en el orden adecuado. El uso de cualquier realización y de toda realización, o lenguaje ejemplificativo (por ejemplo, "tal como", "como ~"), a menos que se incluya en las reivindicaciones, se usa para describir más claramente la presente invención, no para limitar el alcance de la presente invención. Cualquier frase en la presente fuera de las reivindicaciones no debe interpretarse como una necesidad de la presente invención. A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen los significados entendidos normalmente por los expertos en la técnica a la que pertenece la presente invención.
Las realizaciones preferidas de la presente invención incluyen el mejor modo conocido por los inventores para realizar la presente invención. Las variaciones en las realizaciones preferidas pueden resultar claras para los expertos en la técnica después de leer las declaraciones anteriores. Los inventores de la presente esperan que los expertos en la técnica puedan usar las variaciones de forma adecuada y que la presente invención se lleve a cabo de otras formas distintas a las enumeradas en la presente. Por lo tanto, la presente invención, según lo permitido por la ley de patentes, incluye equivalentes, modificaciones y variaciones de la misma, de la invención establecida en las reivindicaciones adjuntas. Además, todas las posibles variaciones dentro de cualquier combinación de los componentes mencionados anteriormente se incluyen la presente invención, a menos que se indique explícitamente lo contrario o contradiga el contexto.
En las realizaciones siguientes, mediante el uso de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), se intentó confirmar el efecto de inhibición directo de PEP1 sobre la proliferación de células endoteliales vasculares, la vascularización y la invasión celular.
Realizaciones para establecemiento de la presente invención
A continuación, la presente divulgación es descrita en detalle a través de ejemplos y ejemplos de prueba. Sin embargo, los siguientes ejemplos y ejemplos de prueba son solo para fines ilustrativos y será evidente para los expertos en la técnica que el alcance de la presente divulgación no está limitado por los ejemplos y ejemplos de prueba.
Ejemplo 1: S ín tesis de un péptido
El péptido de la SEQ ID NÚM.: 1 fue sintetizado de acuerdo con el procedimiento convencionalmente conocido de síntesis de péptidos en fase sólida. Más específicamente, el péptido fue sintetizado mediante el acoplamiento de cada aminoácido del extremo C-terminal a través de la síntesis de péptidos en fase sólida Fmoc, SP P S , usando ASP48S (Peptron, Inc., Daejeon ROK). Los péptidos con su primer aminoácido en el extremo C-terminal unido a una resina se usaron de la siguiente manera:
Resina de NH2-Lys(Boc)-2-cloro-Tritilo
Resina de NH2-Ala-2-cloro-Tritilo
Resina de NH2-Arg(Pbf)-2-cloro-Tritilo
Todos los aminoácidos para sintetizar el péptido fueron protegidos por Fmoc en el extremo N-terminal, y los residuos de aminoácidos fueron protegidos por Trt, Boc, t-Bu (t-butiléster), Pbf (2,2,4,6,7-pentametil dihidro-benzofuran-5-sulfonilo) que se puede disolver en un ácido. Los ejemplos incluyen los siguientes:
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ahx-OH, Trt-ácido mercaptoacético.
Fueron usados HBTU [2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-hexafluorofosfato de tetametilaminio]/HOBt [N-hidroxibenzotriazol]/NMM [4-metilmorfolina] como reactivos de acoplamiento. Fue usada piperidina en DMF 20% para eliminar Fmoc. Para eliminar la protección de los residuos o separar los péptidos sintetizados de la resina, se usó un cóctel de escisión [TFA (ácido trifluoroacético)/TIS (triisopropilsilano)/EDT (etanoditiol)/H2O = 92,5/2,5/2,5/2,5].
La síntesis de péptidos fue realizada mediante el uso de un armazón en fase sólida con la repetición de los siguientes procesos: comenzando con la protección de aminoácidos, reacción separada de cada aminoácido, lavado con disolventes y desprotección. Cada péptido fue sintetizado mediante el uso del armazón de fase sólida combinado a partir del aminoácido con la protección de aminoácidos, reacción de los aminoácidos correspondientes por separado, lavado con un disolvente y desprotección, y repetición de los procesos. Tras la liberación de la resina, los péptidos sintetizados se purificaron mediante HPLC, se validaron mediante espectrometría de masas, se liofilizaron y se verificaron para la síntesis mediante MS, y después se liofilizaron
Se encontró que la pureza del péptido preparado era del 95% o más mediante cromatografía líquida de alta resolución.
El proceso de síntesis específico de PEP 1 puede ser el siguiente:
1) Acoplamiento
El aminoácido (8 equivalentes) protegido con resina de NH2-Lys (Boc)-2-cloro-Tritilo y el agente de acoplamiento HBTU (8 equivalentes)/HOBt (8 equivalentes)/NMM (16 equivalentes) fundidos en DMF fueron mezclados de manera conjunta, y fueron incubados a temperatura ambiente (RT) durante 2 h. Después de la incubación, la mezcla de reacción fue sometida a lavados secuenciales de DMF, MeOH y DMF.
2) 2) Desprotección Fmoc
Fue añadida piperidina en DMF 20% y se incubó a RT durante 5 minutos 2 veces, después se lavó secuencialmente con DMF, MeOH y DMF.
3) Preparación de la estructura básica del péptido, resina NH2-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-cloro tritilo) mediante la repetición de las reacciones 1) y 2) mencionadas anteriormente.4
4) Escisión: Fue añadido cóctel de escisión al péptido completamente sintetizado, de este modo es separado el péptido sintetizado de la resina.
5) Fue añadido éter dietílico preenfriado a la mezcla obtenida y después fue usada centrifugación para precipitar el péptido recogido.
6) Después de la purificación por HPLC preparativa, el peso molecular fue confirmada por LC/MS y liofilizada para producción en forma de polvo.
Ejemplo 2: Incubación de líneas celulares y procedimiento de análisis
Incubación de líneas celulares
La línea celular MCF7 (el adenocarcinoma de mama humano), línea celular Jurkat (el linfocito T humano) y línea celular MC38 (el adenocarcinoma de colon murino) fueron mantenidas en el suero bovino fetal 10% y fue añadido medio RPMI 1460 con 100 U/ml de penicilina y estreptomicina. La línea celular HeLa (adenocarcinoma cervical humano) fue mantenida en el suero bovino fetal 10% y se añadió medio DMEM (medio de Eagle modificado de Dulbecco) con penicilina y estreptomicina 100 U/ml.
Verificación de la expresión de proteína y crecim iento celular en la circunstancia de hipoxia
En la circunstancia de hipoxia, para verificar el efecto de PEP1 sobre el nivel de HSP, fueron tratadas células MCF7 y HeLa con PEP1 20 j M, y fueron incubadas en la circunstancia de hipoxia y la circunstancia de normoxia. Mediante el uso de BBL GasPak (Becton Dickinson), que reduce el oxígeno a un nivel no detectable en 90 minutos por reacción catalítica, se indujo la circunstancia de anoxia. El tiempo de incubación estuvo en un intervalo de 2 a 24 horas. Como se mencionó anteriormente, las células se recolectaron e inmunotransfirieron usando anticuerpos anti a-HSP70, a-HSP90, a-HIF-1a, o a-GAPDH. Para la cuantificación de proteínas, se usó a-GAPDH para la normalización de la cantidad de HSP70/90 por la cantidad de GAPDH.
Para verificar el efecto de PEP1 sobre el crecimiento de células cancerosas en la circunstancia de hipoxia, se sembraron células MCF7 y HeLa en una placa de 96 pocillos de 1x104 células por pocillo y fueron incubadas en el medio completo con FBS 10% a 37 °C, con CO2 5%. Después de tratamiento la privación de suero en 2 horas, se incubó en el medio completo con o sin PEP1 (20 |iM). Como se mencionó anteriormente, las células fueron incubadas durante 1 día a 6 días en la circunstancia de hipoxia o normoxia. El número de células viables fue medido mediante el procedimiento de tinción por exclusión con azul de tripano. Fueron repetidos todos los experimentos de cálculo.
Procedimiento de análisis para el nivel de proteína HSP70 y HSP90 por inmunotransferencia
Fueron sembradas células Jurkat y MCF7 (5 x 105) y fueron incubadas durante 12 horas.
Después de someter a inanición durante 2 horas mediante la adición del medio OPTI-MEM, igual que en la figura mostrada, las células fueron tratadas con PEP1 a las diferentes concentraciones, con los péptidos mezclados, 1-AAG (1 |iM) o KNK437 (1 j M). Después de la incubación de 2 horas, las células fueron recogidas y lisadas usando tampón de lisis celular (Thermo Scientific, IL, USA.). Mediante el uso del ensayo de proteína de Bradford (Bio-Rad, USA), fue cuantificada la concentración de proteína y las muestras fueron tratadas mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia con anticuerpos anti-a-HSp70 (sc-32239 y sc-66048, Santa Cruz, CA, USA), a-HSP90 (ab1429, abcam, USA), a-GRP78 (sc-13968), a-HIF-1a (sc-10790) r a-GAPDH (sc-25778). La banda inmunorreactiva fue visualizada mediante el kit de quimioluminiscencia intensivo (iNtRoN Biotechnology, INC, Korea) y fue analizada con ImageQuantTM LAS-4000 (G E Healthcare Life Science, NJ, USA).
Procedimiento de análisis para el nivel de proteína HSP70 y HSP90 por citometría de flujo
Las células MCF7 fueron tratadas con PEP1 o el grupo de control. Para la prueba de inhibición del proteasoma, durante la incubación, las células fueron tratadas con el inhibidor de proteasoma 5 |iM MG132 (Calboicam). Mediante el uso de tripsina, las células se separaron y enjuagaron con PBS frío (solución salina tamponada con fosfato) y el tampón f Ac S (PBS que contiene BSA 1% y NaN3 0,1%). Para la tinción intracelular, las células fueron tratadas con el tampón de permeabilización (eBioscience, CA, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células se hicieron reaccionar con a-HSP70-FITC (ab61907, Abcam) o a-HSP90-PE (ab65171, Abcam) a 4 °C durante 30 minutos. Mediante el uso de citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson Co., CA, USA), se realizó el análisis de citometría de flujo. Los datos se analizaron usando el software FlowjoTM (versión 10.0.5, Tree Star, Inc., OR, USA).
Procedimiento de evaluación del efecto del PEP1 al crecim iento tumoral in vivo
Ratones atímicos BALB/c de 7 semanas (Nu/Nu) (10 ratones por grupo; n = 20, hembras, Orient Bio Co. Gyunggido, Korea) fueron divididos aleatoriamente en dos grupos después de la inyección subcutánea de carcinoma de colon murino MC38 (5x105 células/ml en 200 ml de PBS por sitio). Fue inyectada PEP1 (50 jg/kg en 100 j l de solución de NaCl 0,9%) o PBS en los ratones una vez cada 2 días. Cuando el tamaño del tumor alcanza 10 mm, fueron inyectadas PEP1 y PBS en el interior del tumor. El tamaño del tumor fue medido una vez cada 2 días y el volumen del tumor fue calculado siguiendo la ecuación; volumen (mm3) = ((ancho2 x largo)/2). Todos los experimentos fueron aprobados por el Institute for Experimental Animals (College of Medicine, Seoul National University at Seoul, Korea).
Evaluación de las célu las proliferadas y apoptosis de la sección del tumor
Para evaluar la apoptosis del tumor, mediante el uso de secciones tumorales fijadas con formalina e incluidas en parafina, fue analizada la fragmentación del ADN mediante un ensayo Tunnel. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, la sección del tumor fue teñida con el kit de detección de apoptosis (ApopTag Peroxidase In Situ, Millipore). Las células en proliferación del tumor fueron detectadas mediante el uso de PCNA (antígeno nuclear de células en proliferación). Para buscar el antígeno, las secciones de tejido fueron desparafinadas en tampón citrato 10 |iM (pH 6,0) durante 40 minutos, se hidrataron y se calentaron. Los tejidos fueron teñidos con anticuerpo monoclonal anti-PCNA de ratón (ab29, Abcam). Después del segundo tratamiento y desarrollo de anticuerpo, las secciones de tejido fueron teñidas con coloración de contraste mediante el procedimiento de tinción H&E. Y después, fue seleccionado aleatoriamente el campo de los 6 portaobjetos de cada grupo de tratamiento, y el campo se analizó mediante el software Leica Qwin para su cuantificación.
A nális is de inmunotransferencia para la expresión de HSP en el tumor
De forma similar al procedimiento de tinción con PCNA, mediante el uso de tinción inmunohistoquímica, se evaluó la expresión de las proteínas HSP70 y HSP90 en el tumor. Los anticuerpos contra las proteínas de choque térmico (HSP70; sc-7298, HSP90; ab1429) se usaron como primeros anticuerpos. La expresión de proteínas HSP70 y HSP90 por tumores se evaluó mediante inmunotransferencia usando lisado tumoral. Después de congelar con oxígeno líquido, el tumor se trituró con el mortero y se homogeneizó mediante tampón de extracción (H EPES 20 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, Triton X-100 0,05%, Dt T 1 mM, ortovanadato de sodio 0,5 mM, EDTA 1 mM, PM SF 0,5 mM, aprotinina 10 |ig/ml, leupeptina 5 |ig/ml, pepstatina 2 |ig/ml). Después de repetir la centrifugación, como se indicó anteriormente, el sobrenadante se usó para SD S-PAGE e inmunotransferencia.
A nális is de EL IS A (Ensayo de inmunoabsorbancia ligado a enzima)
La secreción de V EG F en las células cancerosas se confirmó mediante ELISA (ensayo de inmunoabsorbancia ligada a enzimas). Las células MCF7 y HeLa fueron incubadas en la circunstancia de hipoxia o normoxia después de añadir PEP1 o vehículo durante 24 horas. La cantidad de V EG F en el sobrenadante celular se confirmó mediante el kit de análisis inmunológico de V EG F humano (R&D Systems, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para analizar la concentración de HSP70 y HSP90 en sangre, se recogió sangre de los ratones del modelo que tenía tumor. Después de la preparación del suero, se confirmó la concentración de HSP70 y HSP90 en sangre mediante el kit de análisis inmunológico para HSP70 (R&D Systems, USA) yHSP90 (Cusabio Biotech Co., Ltd, DE, USA).
A nális is de m icroscopio confocal
La sección de tumor cortada fue fijada en paraformaldehído 4% a temperatura ambiente durante 15 minutos. Fue enjuagada con PBS 2 veces, incubada en PBS con Triton X-100 0,25% durante 10 minutos y vuelta a enjuagar con PBS 3 veces. Después del bloqueo del tejido en BSA-PBST 1% durante 30 minutos, fue incubada con la mezcla de anticuerpos anti-Tie2 de ratón (557039, BD Pharmigen) y anti-CD11b (anticuerpos anti-CD11b de rata, ab8878, abcam) en la cámara humedecida a 4 °C. Después del lavado, los tejidos fueron incubados con la mezcla de anti-IgG de ratón de cabra AlexaFlour 488 e IgG anti-rata de cabra AlexaFlour633. Para visualizar el núcleo celular, fue incubada con DAPI (Sigma Aldrich) durante 1 minuto y analizada mediante microscopio confocal.
Procedimiento de análisis estadístico
La comparación estadística entre los grupos de control y tratados fue realizada mediante la prueba t de Student. Cuando el valor p es igual o inferior a 0,05 (p< 0,05), se considera significativo.
Ejemplo 3: Verificación de inhibición de la producción de HIF-1a y V EG F inducida por hipoxia
HIF-1a (factor inducible por hipoxia-1 alfa) es conocido como el material que es activado por reacción con la estimulación de la hipoxia, los diversos factores de crecimiento y las citoquinas. Además, el V EG F (factor de crecimiento endotelial vascular) está regulado por HIF-1a y estimula la angiogénesis directamente.
En este ejemplo, fue verificado el efecto de PEP1 sobre el nivel de proteína HIF-1a en la circunstancia de hipoxia y, debido a que HIF-1a es conocida por regular la producción de V EG F (Factor de crecimiento endotelial vascular), fue verificado si el tratamiento con PEP1 afecta la síntesis de V EG F inducida por la circunstancia de hipoxia o no.
Como nivel de expresión de HIF-la, la cantidad de HIF-1a en células MCF7 y HeLa disminuyó con el tiempo en la circunstancia de hipoxia (véanse las Figuras 1 y 2). Por tanto, la expresión de HIF-1a aumentó por la circunstancia de hipoxia en el grupo de control tratado de forma simulada, pero disminuyó mucho en la célula del grupo tratado con PEP1.
Como resultado del experimento, la cantidad de V EG F secretado aumentó por la circunstancia de hipoxia inducida. Sin embargo, se confirmó que la cantidad de V EG F secretado disminuyó con el tratamiento de PEP1 (véase la Figura 3).
Ejemplo 4: Verificación de la inhibición de la expresión de HSP70 y HSP 90 mediante el tratamiento con PEP1
Como HIF-1a que afecta a la angiogénesis era conocida como una proteína cliente de HSP, en este ejemplo, fue confirmado si la PEP1 afecta los niveles de proteína de HSP70 y HSP90. Como se menciona en la Figura 4 y la Figura 5, si el tratamiento con PEP1 duró 2 horas, disminuyó significativamente HSP70 y HSP90 tanto en linfocitos de células T Jurkat como células de cáncer de mama MCF7. En el experimento que usa células Jurkat, PEP1 5 pM redujo HSP70 y HSP90 más del 50%.
En las células MCF7, el grupo de tratamiento con PEP1 5 mM disminuyó HSP90 más del 20% en comparación con el grupo de control. En el grupo de tratamiento con PEP1 20 pM, la HSp70 disminuyó al 50% en comparación con el grupo de control. Sin embargo, en los péptidos mezclados que tienen una secuencia similar que no es la misma que la del PEP1, el péptido no afectó al nivel de HSP70 y HSP90 (véanse las Figuras 4 y 5).
Además, fue realizado el mismo experimento mencionado en el ejemplo 3 que verificó el efecto de PEP1 sobre HIF-la en la circunstancia de hipoxia para HSP70 y HSP90. Estos resultados se muestran en la Figura 6 y Figura 7. Como se menciona en la Figura 6 y Figura 7, fue verificado en las células MCF7 y HeLa que las expresiones de HSP70 y HSP90 no fueron afectadas con el tiempo en el grupo de control tratado de manera simulada, pero se redujo significativamente en las células del grupo de tratamiento con PEP1. Fue confirmado claramente que el tratamiento de con PEP1 lleva a la degradación de HSP y regula sus proteínas cliente. (Véanse las Figuras 1 ,2 , 6 y 7.). Estos resultados muestran que PEP1 puede afectar las diversas reacciones celulares relacionadas con la circunstancia de hipoxia mediante la disminución del nivel de proteína HSP.
A continuación, fue comparada la actividad de inhibición de HSP por PEP1 con la actividad de inhibición de HSP por 17-AAG y KNK437 que con conocidos como inhibidores de HSP90 y HSP70 respectivamente. 17-AAG inhibe HSp90 al inhibir la actividad de HSP90 ATPasa [Uehara Y, Current cancer drug targets, 3: 325-30, 2003]. KNK437 inhibe la síntesis de HSP inducida por estrés. En los resultados, solo PEP1 disminuyó los niveles de HSP70 y HP90 en las células Jurkat y MCF (Véase la Figura 8.).
En las células Jurkat, solo PEP1 disminuyó los niveles de proteína HSP70 y HSP90, y 17-AAG y KNK437 disminuyeron la cantidad de HSP90 pero no la cantidad de HSP70. En el caso de las células MCF7, PEP1 y KNK437 disminuyen las cantidades de HSP90 y HSP70, pero la 17-AAG muestra muy poco efecto sobre los niveles de HSP90 y HSP70.
Las disminuciones de HSP90 y HSP70 por PEP1 se verificaron más claramente mediante análisis de citometría de flujo. Mediante la tinción de la superficie celular de HSP90 y HSP70 y la tinción intracelular, se demostró que el tratamiento con PEP1 afectó menos a la HSP de la superficie celular que a la HSP intracelular, pero disminuye la HSP90 y la HSP70 intracelular y en el citoplasma (Véase Figura 9). En caso de tratar PEP1 con el inhibidor de proteasoma MG132, el efecto de PEP1 desapareció, y esto sugiere que PEP1 puede conducir a la degradación dependiente de proteasoma de HSP90 y HSP70 (Véase Figura 9).
Ejemplo 5: Verificación del crecim iento tumoral en la circunstancia de hipoxia y la circunstancia de normoxia
De forma similar a los ejemplos 3 y 4, fue estudiado el efecto de PEP1 sobre el crecimiento de células tumorales en la circunstancia de hipoxia y la circunstancia de normoxia. PEP1 inhibió poco el crecimiento celular de MCF7 y HeLa en la circunstancia de normoxia, pero su efecto de inhibición aumentó significativamente en la circunstancia de hipoxia (véanse las Figuras 10 y 11).
Ejemplo 6: Efecto de PEP1 sobre el reclutamiento de monocitos Tie2+ en el tumor
Tie2 cumple un papel clave en la angiogénesis [Du R et al, Cancer cell, 13: 206-20, 2008]. Sobre la base de que PEP1 puede inhibir la expresión de HIF-1a y v E g F por desestabilización de HSP, se realizó el experimento para determinar si PEP1 puede reclutar TEM (monocitos que expresan Tie2 en el tumor). En el resultado de la tinción inmunohistoquímica, se confirmó que el número de monocitos Tie2+ CD11b+ recogidos del ratón tratado con PEP1 era significativamente menor que el del tumor de ratón de control (véanse las Figuras 12 y 13). Esto muestra que la inhibición de la expresión de HlF-1a y V EG F por PEP1 afecta el reclutamiento de TEM que es importante para la angiogénesis.
Ejemplo 7: Dism inuciones de HSP70 y HSP90 en tumores por el tratamiento con PEP1
Para verificar si PEP1 inhibe las expresiones de HSP70 y HSP90 in vivo, fue realizada la tinción inmunohistoquímica con los anticuerpos a-HSP70 o a-HSP90. En consonancia con los datos de las líneas de células de cáncer, la sección del tumor recogida del grupo tratado con PEP1, cuando se comparó con el grupo de control tratado con PBS, mostró un patrón de tinción más débil (Véase Figura 14). En la muestra tratada con PEP1, la parte teñida positiva fue mucho más pequeña que la del grupo de control (Véase Figura 15).
Las disminuciones de los niveles de proteína HSP70 y HSP90 en la muestra de tumor tratada con PEP1 se verificaron mediante un experimento de inmunotransferencia usando lisados tumorales. Las disminuciones de HSP70 y HSP90 se observaron en las tres muestras de tumor tratadas con PEP1 (Véase Figura 16). En especial, apenas se encontró HSP90 en la muestra tratada con PEP1. Como la otra familia de HSP, GRP78 también disminuyó en la muestra tratada con PEP1. Sintéticamente, estos resultados demuestran que PEP1 disminuye HSP en el sistema in vivo y tiene la capacidad de inhibir el crecimiento tumoral.
Ejemplo 8: Efecto de PEP1 sobre el nivel de HSP70 secretado en sangre
HSP70 y HSP90 pueden ser secretadas a partir de las células tumorales, y las investigaciones recientes han demostrado sus diversas funciones para la formación de tumores y la reacción antitumoral. En la secreción de HSP90 y HSP70, para explicar más detalladamente el papel de PEP1, se midieron las concentraciones de HSP70 y HSP90 de la sangre recogida del ratón portador de tumor. Aunque no hubo cambios en el nivel de HSP90 secretado entre el grupo tratado con PEP1 y el grupo de control, el nivel de HSP70 del ratón tratado con PEP1 fue más bajo que el del grupo de control (Véase la Figura 17).
Además, el nivel más bajo de HSP70 está relacionado con la cantidad de tumor y el peso del tumor (Véase Figura 18).
Ejemplo 9: Inhibición del crecim iento tumoral por PEP1
Los resultados de los ejemplos mencionados anteriormente muestran el efecto inhibidor de PEP1 sobre la función de HSP90 y HSP70, y sugieren que PEP1 tiene potencialmente el efecto inhibidor de tumores como los otros inhibidores de HSP.
Por tanto, en este ejemplo, fue estudiado el efecto inhibidor de tumores de PEP1 in vivo usando el modelo de ratón. Se analizó in vivo el crecimiento tumoral en células cancerosas murinas MC38 con o sin tratamiento de PEP1. Se observó la diferencia significativa en la cantidad de tumor entre el grupo tratado con PEP1 y el grupo de control (Véase Figura 19). En el momento del día 18 después de la inyección, se observó que la cantidad promedio de tumor del grupo de control era 3 veces mayor que la del grupo tratado con PEP1. Sintéticamente, el peso del tumor del grupo de control es mucho más pesado que el del grupo tratado con PEP1, y este resultado muestra que PEP1 puede inhibir el crecimiento del tumor in vivo (Véase Figuras 20 y 21).
Ejemplo 10: Prueba histológica del tumor recogido de ratones tratados con PEP1
La prueba histológica por tinción con H&E (hematoxilina y eosina) muestra que la sección de tejido del ratón tratado con PEP1 tiene más cavidades que la del grupo de control. Esto sugiere que la mayor apoptosis ocurrió en el tumor del ratón tratado con PEP1 (Véase Figura 22). También se detectó la menor vascularización en el tumor recogido del ratón tratado con PEP1, lo que significa que PEP1, al igual que otros inhibidores de HSP, tiene el efecto de inhibir la angiogénesis (Véase Figura 22). El progreso de la apoptosis celular se puede observar mediante tinción TUNEL, y seguramente confirma el efecto anticáncer de PEP1. Como se menciona en la Figura 23, en comparación con el tumor del grupo de control, se detectó el alto nivel significativo de apoptosis celular en la muestra de tumor tratada con PEP1. Además, la tinción de la sección del tumor para detectar la proliferación de PCNA muestra claramente la disminución de la proliferación celular del grupo tratado con PEP1 (véase la Figura 24).
Ejemplo 11: Verificación del efecto de inhibición de PEP1 sobre la proliferación celular y la angiogénesis en las células endoteliales vascu lares
1) Incubación celular
En este ejemplo, las células endoteliales de la vena umbilical humana fueron incubadas en el medio EGM-2 y solo fueron seleccionados 2 a 5 ciclos de la célula endotelial vascular para el experimento.
2) Materiales
Como materiales experimentales, fueron adquiridos respectivamente células endoteliales de la vena umbilical humana (Lonza, Walkersville, MD, USA) y v E g F-A (factor de crecimiento endotelial vascular-A Merck Millipore, Billerica, MA, USA). Fue disuelta PEP1 en PBS (solución salina tamponada con fosfato, a pH 7,4) y se utilizó.
3) Análisis de la proliferación de células endoteliales vasculares y su efecto
Las células endoteliales vasculares fueron sembradas en una placa de 6 pocillos (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) a razón de 1 x 105 células/pocillo. Las células se sincronizaron con el medio básico EBM-2 (Lonza) que no tiene suero ni factores de angiogénesis, fueron tratadas con PEP1 en cada concentración (0,05, 0,5, 5 |iM) y se estimularon con el medio EGM-2, con el fin de observar el efecto de inhibición de la proliferación celular.
Para detectar la proliferación celular, mediante el uso de la solución de tinción de azul de tripano (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), Las células se contaron directamente en el microscopio (x100) y la viabilidad celular se analizó usando el kit de ensayo de viabilidad (Merck Millipore Inc.) con el analizador Muse ™.
PEP1 inhibió de una manera dependiente de la concentración las células endoteliales vasculares que fueron estimuladas por el medio EGM-2 incluyendo varios inductores de angiogénesis (Figura 25a), y no afectó en absoluto la tasa de supervivencia celular (Figura 25b). Esto sugiere que PEP1 inhibe eficazmente la proliferación de células endoteliales vasculares sin citotoxicidad.
4) Análisis de la formación del tubo endotelial de las células endoteliales vasculares y el efecto
En la placa de 24 pocillos revestida con 200 pl de matriz de membrana basal Matrigel® (10,4 mg/ml, BD Biosciences) durante 30 minutos a 37 °C, las células endoteliales vasculares se sembraron y se privaron de suero en el medio básico EBM-2 durante 2 horas. El cambio de la formación del tubo se observó con el microscopio invertido Olympus CKX41 (objetivo CAchN 10/0,25php, Olympus Optical Co., Tokio, Japón) y el software ToupTek Toupview (versión x86, 3,5,563, Hangzhou ToupT- ek Photonics Co., Zhejiang, PR China) (Figura 26a).
Se sugiere que PEP1 de inhibe de manera dependiente de la concentración la formación del tubo en la proliferación de células endoteliales vasculares que fue estimulada por el medio EGM-2 que incluye varios inductores de angiogénesis (Figura 26b), y por lo tanto es capaz de inhibir la angiogénesis mediante el movimiento y diferenciación de las células endoteliales vasculares.
Ejemplo 12: Verificación del efecto de PEP1 que inhibe la proliferación, angiogénesis, e invasión de las célu las endoteliales vascu lares por VEGF-A
1) Análisis de la proliferación y la tasa de supervivencia por el VEGF-A en las células endoteliales vasculares y su efecto
Las células endoteliales vasculares fueron sembradas en una placa de 6 pocillos (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) a razón de 1 x 105 células/pocillo. Las células fueron sincronizadas en la fase G1/G0 mediante el medio básico EBM-2 (Lonza) que no tiene suero ni factores de angiogénesis, fueron tratadas con PEP1 en cada concentración (0,05, 0,5, 5 pM) y se estimularon con VEG F- A (10 ng/ml) durante 24 horas, con el fin de observar el efecto inhibidor de la proliferación celular.
Para detectar la proliferación celular, mediante el uso de solución de tinción con azul de tripano (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), las células se contaron directamente en el microscopio (x100) y la viabilidad celular se analizó usando el kit de ensayo de viabilidad (Merck Millipore Inc.) con el analizador Muse ™.
PEP1 inhibió de manera dependiente de la concentración la proliferación de células endoteliales vasculares por VEGF-A de modo similar a la condición del EGM-2 que incluye varios inductores de angiogénesis (Figura 27a), pero no afectó la tasa de supervivencia celular (Figura 27b).
2) Análisis de la formación del tubo endotelial por VEGF-A y su efecto
En la placa de 24 pocillos revestida por 200 pl de matriz de membrana basal Matrigel® (10,4 mg/ml, BD Biosciences) durante 30 minutos a 37 °C, las células endoteliales vasculares (4x104 células/pocillo) se sembraron y se privaron de suero en el medio básico EBM-2 durante 2 horas. Después de tratamiento con PEP1 a cada concentración (0,05, 0,5, 5 pM), las células fueron estimuladas con VEGF-A (10 ng/ml) durante 6 horas. El cambio en la formación del tubo fue observado con el microscopio invertido Olympus CKX41 (objetivo CAchN 10/0,25php, Olympus Optical Co., Tokio, Japan) y el software ToupTek Toupview (versión x86, 3,5,563, Hangzhou ToupTek Photonics Co., Zhejiang, RP China) (Figura 28a).
Fue verificado que PEP1 inhibe de manera dependiente de la concentración la formación del tubo endotelial por VEGF-A en la célula endotelial vascular (Figura 28b).
3) Análisis de invasión de las células endotelial vasculares y su efecto
Cada una de las células endoteliales vasculares de la inanición de suero por el medio EBM-2 básico durante 2 horas fueron sembraron como 100 ml (4x105 células/ml) en un inserto transwell revestido con Matrigel® (1 mg/ml, BD Biosciences) (Costar, 6,5 mm de diámetro), y se añadieron 600 ml de medio EBM-2 básico al pocillo inferior. El diagrama mimético del inserto instalado se muestra en la Figura 29.
Después de tratamiento con PEP1 en cada concentración (0,05, 0,5, 5 pM) y estimular con VEGF-A (10 ng/ml) durante 18 horas, el inserto fue fijado con metanol y las células no infiltradas en la parte superior del inserto fueron eliminadas usando un hisopo con punta de algodón. Después de tinción con la solución de tinción de Giemsa (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) y la observación de las 6 partes diferentes al microscopio (x200), las células infiltradas fueron recontadas directamente usando el microscopio (Figura 30a).
Fue verificado que PEP1 inhibe fuertemente la invasión celular por VEGF-A (Figura 30b).
La significación estadística de los resultados del experimento fue analizada mediante la prueba t de Student, y el valor p fue definido como el valor estadísticamente significativo cuando es inferior a 0,05.
<110> KAEL-GEMVAX CO., LTD. KIM, Sangjae
<120> Un péptido que tiene actividad inhibidora de la angiogénesis y la composición que comprende el mismo
<130> OF14P183PCT
<150> KR 10-2013-0142897
<151> 2013-11-22
<150> KR 10-2014-0020605
<151> 2014-02-21
<160> 2
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys
1 5 10 15
<210> 2
<211> 1132
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala val Arg Sor Leu Leu Arg ser 1 5 10 15
Hia Tyt Arg Glu val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly
20 25 30
Pro Gln Gly Trp Arg Leu val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg
35 40 45
Ala Leu val Ala Gln Cys Leu val Cys val Pro Trp Asp Ala Arg Pro 50 55 60
Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu 65 10 75 flO val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys asa Val 35 30 35
Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro
100 105 110
Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro asa Thr Val Thr
115 120 125
Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val ' 130 135 140
Gly ASp Asp val Leu val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe val H 5 150 155 160 Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr 165 170 175
GJLn Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly
180 185 190
Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Agn His Ser Val Arg
195 200 205
Glu Ala Gly val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg
210 215 220
Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg 225 230 235 240 Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp 245 250 255
Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val
260 265 270
val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala
275 280 285
Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His
290 295 300
Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro 305 310 315 320 Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly 325 330 335
Asp LyS Glu Gln Leu Arg Pro Ser Fhe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro
340 345 350
Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Vil Glu Thr H e Phe Leu Gly Ser
355 360 365
Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His 385 390 395 400 Ala Gln Cy& Pro Tyr Gly val Leu Leu LyS Thr His Cys Pro Leu Arg 405 410 415
Ala Ala val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu LyS Pro Gln
420 425 430
Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu
435 440 445
Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe
450 455 460
Val Axg Ala Cys Leu Arg Arg Leu val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser 465 470 475 430 Arg nis Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe lie Ser 485 490 495
Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met
500 505 510
Ser Val Arg Asp Cys Ala Trp Leu Arg Axg Ser Pro Gly Val Gly Cys
515 520 525
Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu lie Leu Ala Lys Phe 530 535 540
Leu nia Trp Leu Met Ser val Tyr val val Glu Leu Leu Arg Ser Phe 545 550 555 560
Phe Tyr val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr 565 570 575
Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser lie Gly lie Arg Gln His
580 585 590
Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln
595 600 605
Hi3 Arg Glu Ale Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe H e 610 615 620
Pro Lys Pro ASp Gly Leu Arg Pro lie val Asn Met ASp Tyr val Val 625 630 635 640
Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Axg Ala Glu Arg Leu Thr Ser 645 650 655
Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg
660 665 670
Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser val Leu Gly Leu Asp Asp H e His Arg
675 680 685
Ale Trp Arg Thr Phe val Leu Arg val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro 690 695 700
GLu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr H e 705 710 715 720
Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val lie Ala Ser lie lie Lys Pro Gln 725 730 735
ASrt: Thr Tyr CyS val Arg Arg Tyr Ala val val Glu LyS Ala Ala HiS
740 745 750
Gly His val Arg LyS Ala phe LyS His val Ser Thr Leu Thr Asp
755 760 765
Leu Gln Pro Tyr Ket Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser 770 775 7BÜ
Pro Leu Arg Asp Ala Val Val lie Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu 785 790 795 800
Ala Ser Ser Gly Leu Phe ASp val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His 805 810 815 Ala val Arg H e Arg Gly Lys Ser Tyr val Gln Cys Gln Gly ile Pro
620 £25 630
GLn Gly Ser lie Leu Ser Thr Leu Leu CyS Ser Leu CyS Tyr Gly ASp
635 640 B45
Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly H e Arg Arg ASp Gly Leu Leu Leu 650 655 660
Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala 665 B70 B75 BBO Ly9 Thr Phe Leu Arg Thr Leu val Arg Gly val Pro Glu Tyr Gly Cys 665 630 635
Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu
300 305 310
Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe val Gln Met Pro Ala HÍS Gly Leu Phe
315 320 325
Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser 330 335 340
ASp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser H e Arg Ala Ser Leu Thr Phe 345 350 355 360 Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly 365 370 375
val Leu Arg Leu Lys Cys HiS Ser Leu Phe Leu ASp Leu Gln Val Asn
3B0 3B5 330
Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn lie Tyr Lys lie Leu Leu Leu Gln
335 1000 1005
Ala Tyr Arg Phe HiS Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe HiS Gln Gln 1010 1015 1020
Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val lie Ser Asp Thr Ala 1025 1030 1035 1040 Ser Leu Cys Tyr Ser lie Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser Leu 1045 1050 1055
Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala Val Gln Trp
1060 1065 1070
Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg His Arg Val Thr
1075 10B0 10B5
Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr Ala Gln Thr Gln Leu Ser 1090 1095 1100
Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn 1105 1110 1115 1120 Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr lie Leu Asp
1125 1130

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una composición anti-angiogénica que comprende un péptido de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NÚM.:
1 para su uso en la prevención o tratamiento del crecimiento o metástasis tumoral, en la que la prevención o tratamiento comprende la inhibición de la proliferación de células endoteliales vasculares o la formación del tubo.
2. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la composición es para la prevención o tratamiento del crecimiento tumoral.
3. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la composición es para la prevención o tratamiento de la metástasis tumoral.
4. La composición para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3, en la que el tumor es hipóxico y la composición disminuye la producción de HIF1-a y los niveles de las proteínas HSP70 y HSP90 en el tumor.
5. Una composición anti-angiogénica que comprende un péptido de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NÚM.:
1 para su uso en la prevención o tratamiento de la oftalmopatía relacionada con angiogénesis excesiva.
6. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la composición inhibe la proliferación de células endoteliales vasculares o la formación del tubo.
7. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la prevención o tratamiento comprende la inhibición de la proliferación de células endoteliales vasculares o la formación del tubo.
8. La composición para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la composición inhibe la proliferación de células endoteliales vasculares por VEGF-A (Factor de crecimiento endotelial vascular A), la formación del tubo, o la invasión de células endoteliales vasculares.
9. La composición para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la composición está caracterizada por la inhibición de la proliferación de células endoteliales vasculares, la formación del tubo inducida por V EG F (Factor de crecimiento vascular endotelial) y la invasión de células endoteliales vasculares.
10. La composición para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la composición es una composición farmacéutica.
11. La composición para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la composición es una composición alimenticia.
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