KR20050040517A - 허혈성 질환에 대한 저항성을 나타내는 형질전환 생쥐 - Google Patents
허혈성 질환에 대한 저항성을 나타내는 형질전환 생쥐 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 성체에서 텔로머라제를 발현시켜서 허혈성 질환에 대한 저항성을 나타내는 형질전환 생쥐, 전기 형질전환 생쥐의 작제방법 및 전기 형질전환 생쥐를 모델동물로 사용하여 허혈성 질환 치료제를 검색하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 텔로머라제를 발현하는 형질전환 생쥐는 허혈에 의한 저항성이 현저히 우수하므로, 허혈성 질환의 치료제 개발을 위한 동물모델로서 널리 활용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 허혈성 질환에 대한 저항성을 나타내는 형질전환 생쥐에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 성체에서 텔로머라제를 발현시켜서 허혈성 질환에 대한 저항성을 나타내는 형질전환 생쥐, 전기 형질전환 생쥐의 작제방법 및 전기 형질전환 생쥐를 모델동물로 사용하여 허혈성 질환 치료제를 검색하는 방법에 관한 것이다.
텔로머라제(telomerase)는 세포내에서 염색체 말단에 있는 텔로미어의 길이를 유지하는 효소이다. 텔로머라제의 활성이 거의 없는 체세포는 분열과정을 반복하면서 텔로미어의 길이는 점차 줄어들고, 어떤 특정길이 이하로 짧아지면 세포가 죽음에 이른다는 것이 알려져 있어, 텔로미어의 길이는 세포의 노화와 밀접한 관계를 가지고 있을 것으로 추측되고 있다. 또한, 체세포가 암화되어 계속 분열을 하기 위해서는 텔로머라제가 재활성되어야 한다는 것이 알려지면서, 많은 종류의 암에서 텔로머라제의 활성이 증가되어 있음이 연구자들에 의해 보고되었다(참조: Cerni, Mutation Research, 462:31-47, 2000; Blasco et al., Genes & Development, 13:2353-2359, 1999). 아울러, 텔로머라제의 발현이 발생단계의 뇌세포의 생존을 촉진시킨다는 연구결과도 보고되었다(참조: Yamaguchi et al., Exp. Cell Res., 242(1):120-127, 1998; Fu et al., J. Mol. Neurosci., 14(1-2):3-15, 2000).
지금까지의 연구결과에 의하면, 뇌세포에서 텔로머라제의 발현을 억제하는 경우, 뇌세포가 세포자멸(apoptosis) 또는 세포괴사(excitotoxicity)에 더 민감하게 반응함을 알 수 있었으므로, 텔로머라제의 활성도가 뇌세포의 생존에 매우 중요함을 알 수 있었다.
이처럼 텔로머라제의 기능에 대한 연구가 활발히 진행되고 있지만, 실질적으로 생체에서 텔로머라제의 기능을 연구하기에 큰 어려움이 있었다. 즉, 포유류는 태어나자마자 급속히 텔로머라제의 발현양이 감소하기 때문에, 실험적으로 사용하는 포유동물에서는 텔로머라제의 활성을 거의 측정할 수 없다는 것이다. 이를 극복하기 위하여, 출산되지 않은 배아를 대상으로 실험하고 있으나, 실질적으로 성체에서 텔로머라제가 어떤 역할을 하는지 알 수 없었으므로, 텔로머라제의 연구에 별다른 진전이 없는 실정이다.
따라서, 성체에서 텔로머라제의 역할을 연구할 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 성체에서 텔로머라제의 역할을 연구할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 성체에서도 텔로머라제를 발현하는 형질전환 생쥐를 작제하는데 성공하였으며, 전기 형질전환 생쥐를 이용하여 규명된 텔로머라제의 신규한 역할인 허혈상태의 손상을 억제하는 특성을 기반으로, 허혈성 질환의 치료제를 검색할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 허혈성 질환에 대한 저항성을 나타내는 형질전환 생쥐를 작제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 방법으로 작제된 형질전환 생쥐를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전기 형질전환 생쥐를 이용하여 허혈성 질환의 치료제를 검색하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 허혈성 질환에 대한 저항성을 나타내는 형질전환 생쥐의 작제방법은 생쥐의 수정란에 텔로머라제 cDNA를 포함하는 발현벡터를 도입시켜서, 형질전환된 수정란을 수득하는 단계; 및, 전기 수득한 수정란을 대리모에 착상시키고, 착상된 수정란을 발생시켜서, 텔로머라제를 발현시키는 성체를 수득하는 단계를 포함한다: 이때, 텔로머라제 cDNA가 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 생쥐의 텔로머라제 cDNA(서열번호 1)를 사용함이 바람직하다.
이하, 본 발명의 텔로머라제가 성체에서도 발현되는 형질전환 생쥐를 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
본 발명자들은 텔로머라제 cDNA(서열번호 1)를 진핵세포에서 유전자를 발현시킬 수 있는 프로모터와 폴리아데닌(polyA) 형성부위 사이에 삽입시킴으로써 발현벡터 pTERT를 작제하고, 이를 FVB/N 생쥐의 수정란에 미세주입한 후, 대리모인 ICR 암컷 생쥐의 난관에 이식하여 형질전환 생쥐를 작제하였다. 이어, 유전자가 게놈에 삽입되었는지 써던블롯(Southern blot)법을 이용하여 확인하고, 텔로머라제가 생쥐 뇌에서 발현됨을 역전사-중합연쇄반응(reverse-transcription-polymerase chain reaction)을 이용하여 확인하였다.
전기 작제한 형질전환 생쥐를 대상으로 뇌에서 텔로머라제의 기능을 조사한 결과, 텔로머라제를 발현하는 형질전환 생쥐의 뇌는 정상쥐의 뇌보다 허혈성 질환(ischemia)에 대하여 저항성이 높고, 텔로머라제를 발현하는 형질전환 생쥐는 N-메틸-D-아스파르트산(N-methyl-D-aspartate, NMDA)에 의해 괴사되는 정도가 정상 생쥐보다 낮음을 알 수 있었는데, NMDA가 뇌의 허혈상태에서 대량으로 분비되는 물질임을 감안한다면, 본 발명의 형질전환 생쥐는 NMDA의 독성에 대하여 높은 저항성을 나타내어 허혈에 의한 뇌의 손상이 감소됨을 예측할 수 있었다. 아울러, 본 발명의 형질전환 생쥐를 서로 교배시켜서 자손 생쥐를 수득한 경우, 자손 생쥐의 성체에서도 텔로머라제가 발현되고, 허혈성 질환에 대하여 저항성이 높음을 알 수 있었다.
본 발명자들은 상기 작제된 형질전환 생쥐의 수정란을 "TERT(transgenic mouse fertilized egg)"라고 명명하고, 2002년 5월 3일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 10237BP로 기탁하였다.
본 발명의 일 실시태양에 의하면, 본 발명의 형질전환된 생쥐는 허혈성 질환의 치료제의 개발에 이용될 수도 있다. 즉, 종래의 생쥐를 이용할 경우에는 허혈성 질환을 유발시켰을 때, 각종 장기 특히 뇌부분의 손상이 심하여, 허혈성 질환의 치료효과가 있을 것으로 예상된 물질을 투여하여도 그의 정상적인 효과를 측정하는데 많은 어려움이 있었으나, 본 발명의 형질전한된 생쥐는 허혈성 질환에 대한 높은 저항성을 나타내어, 허혈에 의한 각종 장기의 손상이 현저히 감소하기 때문에, 본 발명의 형질전한된 생쥐에 허혈성 질환을 유발시키고, 허혈성 질환의 치료효과가 있을 것으로 예상된 물질을 투여할 경우에, 전기 투여된 물질의 효과를 보다 상세하게 모니터링할 수 있으므로, 허혈성 질환의 치료제의 개발에 널리 활용될 수 있다.
이에 따라, 본 발명의 허혈성 질환의 치료제를 검색하는 방법은 본 발명의 형질전환 생쥐에 허혈성 질환을 유발시키는 단계; 전기 허혈성 질환이 유발된 형질전환 생쥐에 허혈성 질환 치료의 약리효과가 있을 것으로 예상되는 물질을 투여하는 단계; 및, 전기 물질이 투여된 형질전환 생쥐의 조직괴사 정도를 측정하여, 허혈성 질환의 치료에 유효한 물질을 선별하는 단계를 포함한다. 이때, 허혈성 질환을 유발하는 방법이 특별히 이에 제한되지는 않으나, 외과적 수술 또는 허혈증상을 유발하는 물질을 처리하여 유발시킴이 바람직한데, 외과적 수술은 대뇌피질로 통하는 동맥을 막아 혈액의 공급을 완전 중단시키는 것이 바람직하고, 허혈증상을 유발하는 물질로는 NMDA을 사용함이 바람직하다.
상술한 허혈성 질환의 치료제를 검색하는 방법의 실질적인 유용성 여부를 판단하기 위하여, 공지된 허혈 증상 치료제를 이용하여, 허혈성 질환의 치료제를 검색하는 방법이 실질적으로 사용가능한지 알아보았다. 즉, 본 발명의 형질전환 생쥐와 정상 생쥐에 각각 허혈성 질환을 유발시키고, WO 01/51613(2001. 7. 19. 공개)에 개시된, 허혈 상태에서 세포생존율을 향상시키는 효과를 나타내는 테트라사이클린과 허혈 상태에서 세포생존율을 향상시키는 효과를 나타내지 않는 앰피실린을 각각 투여한 다음, 뇌의 조직괴사 정도를 측정한 결과, 정상 생쥐를 이용한 경우에는 테트라사이클린을 투여한 생쥐와 앰피실린을 투여한 생쥐의 뇌조직에서 조직 괴사정도의 차이가 구별되지 않은 반면, 본 발명의 형질전환 생쥐를 이용한 경우에는 테트라사이클린을 투여한 생쥐와 앰피실린을 투여한 생쥐의 뇌조직에서 조직 괴사정도의 차이가 명확히 구별되었으므로, 허혈성 질환의 치료제를 검색하는 방법에 있어서 본 발명의 형질전환 생쥐가 모델동물로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시 예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명할 것이다.
실시예 1: 형질전환 생쥐의 작제
먼저, 생쥐의 텔로머라제 cDNA(서열번호 1)를 닭의 베타-액틴 프로모터(chicken beta-actin promoter)와 토끼의 베타-글로빈 폴리아데닌(rabbit β-glogin polyA) 형성부위 사이에 삽입함으로써 발현벡터 pTERT를 제작하였다(참조: 도 1). 도 1은 텔로머라제를 발현하는 발현벡터 pTERT를 나타내는 유전자 지도이다.
배란유도제(PMSG)와 난포자극 호르몬(HCG)을 각각 5IU씩 자성 생쥐의 복강내에 투여하여 과배란을 유도한 후, 난관의 팽대부를 절제하여 수정란을 수득하고, 하이알루로니다제(300ng/ml)를 2분정도 처리하여 난구세포들을 제거하여 수정란만을 수득하였다. 전기 수득한 수정란 중, 핵이 잘 보이는 것에 미세조작기를 이용하여 전기 발현벡터 pTERT를 삽입하고, 전기 수정란을 대리모인 ICR 암컷쥐의 난관에 이식하여 임신시킨 후, 출산시켰다. 출산된 새끼들의 꼬리를 1cm 가량 자른 후, 이로부터 DNA를 추출하여 텔로머라제 발현벡터가 염색체내에 삽입여부를 써던블롯법을 이용하여 확인하고, 삽입된 유전자로부터 mRNA가 발현이 되는지의 여부를 역전사-핵산중합효소연쇄반응법을 이용하여 확인한 결과, 출산된 새끼의 일부 개체의 DNA에 삽입되었음을 확인할 수 있었고, 생쥐의 텔로머라제 cDNA(서열번호 1)가 발현됨을 확인할 수 있었다.
한편, 전기 작제된 형질전환 생쥐를 서로 교배시켜서, 자손 1세대 생쥐를 수득한 다음, 수득한 자손 1세대를 대상으로 하여, 상술한 써던블롯법과 역전사-핵산중합효소연쇄반응법을 시험한 결과, 자손 1세대에서도 생쥐의 텔로머라제 cDNA(서열번호 1)가 DNA에 삽입되어 발현됨을 확인할 수 있었다.
이에, 본 발명자들은 상기 작제된 형질전환 생쥐의 수정란을 "TERT(transgenic mouse fertilized egg)"라고 명명하고, 2002년 5월 3일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 10237BP로 기탁하였다.
실시예 2: 텔로머라제 유전자의 발현량 측정
전기 실시예 1에서 작제된 형질전환 생쥐에서 발현되는 텔로머라제 유전자의 발현량을 측정하기 위하여, 정량적 역전사-핵산중합효소연쇄반응법(Quantitative RT-PCR)을 수행하였다. 즉, 전기 실시예 1에서 작제된 형질전환 생쥐의 꼬리조직으로부터 분리한 mRNA를 역전사반응시켜서 cDNA를 수득한 다음, 수득한 cDNA를 PCR방법으로 증폭시키고, 증폭된 DNA양을 검출함으로써, 증폭전의 유전자의 발현량을 유추하였다(참조: 도 2). 도 2는 정상 생쥐와 형질전환 생쥐의 뇌에서 발현되는 텔로머라제의 양을 정량적으로 비교한 그래프로서, WT는 정상 생쥐를 나타내고, TG는 형질전환된 생쥐를 나타낸다. 도 2에서 보듯이, 형질전환 생쥐에서 정상 생쥐보다 텔로머라제가 많이 발현됨을 알 수 있었다.
실시예 3: 형질전환 생쥐의 뇌의 허혈에의한 손상 측정
정상생쥐와 실시예 1에서 작제된 형질전환 생쥐를 대상으로, 각각 6-8주령의 숫컷 생쥐를 선별한 다음, 외과적 수술을 통하여 대뇌피질로 통하는 동맥을 막아 혈액의 공급을 완전 중단시켰다. 24시간이 지난 후, 각 생쥐에서 뇌를 적출하고, 적출된 뇌의 조직으로 조직박편 시료를 제작한 다음, 이를 현미경으로 관찰하여, 허혈손상으로 인해 사멸된 부위의 용적을 측정하였다(참조: 도 3). 도 3은 정상 생쥐(WT)와 형질전환 생쥐(TERT-TG)의 허혈에 의한 뇌손상을 비교한 그래프로서, 형질전환 생쥐의 뇌는 정상의 쥐에 비하여 허혈에 의한 뇌의 손상이 1/3 정도인 것으로 측정되었다. 이러한 결과로부터, 텔로머라제의 발현이 허혈에 의한 뇌세포의 손상을 억제함을 예측할 수 있었다.
실시예 4: 신경세포에대한 NMDA 독성정도 측정
전기 실시예 3의 결과를 확인하기 위하여, 허혈상태에서 뇌로부터 대량으로 분비되는 NMDA에 의한 세포괴사에 대하여, 텔로머라제가 미치는 영향을 측정하였다.
즉, 임신한지 15.5일 경의 텔로머라제 형질전환 생쥐의 태아를 추출하여, 태아의 전뇌부분을 해부현미경하에서 적출하고, 이를 배양액(MEM media, 5% horse serum, 2mM glutamine, 20mM glucose)에서 48시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양된 세포에 NMDA를 30, 100 및 1000μM의 농도로 각각 처리하고, 다시 24시간동안 배양한 후, 락테이트 디하이드로게나제(lactate dehydrogenase, LDH)의 활성을 측정하여 세포괴사(excitotoxicity)의 정도를 측정하였다(참조: 도 4). 도 4는 정상 생쥐와 형질전환 생쥐의 NMDA에 의한 세포괴사 정도를 NMDA의 농도별로 비교한 그래프로서, (●)는 정상쥐이고, (○)는 형질전환 생쥐를 나타낸다. 도 4에서 보듯이, 형질전환 생쥐가 정상쥐보다 NMDA에 의한 세포괴사 정도가 현저히 낮음을 알 수 있었다. NMDA는 뇌의 허혈시 대량으로 방출되고, 글루타메이트(glutamate)와 결합하여 활성화되며, 활성화된 NMDA는 특히 신경세포의 괴사를 유발시키므로, NMDA에 의한 신경세포 괴사를 텔로머라제가 감소시킨다는 결과는, 텔로머라제가 허혈에 의한 뇌 세포 손상을 감소시킨다는 실시예 3의 결과를 뒷받침함을 알 수 있었다.
실시예 5: 텔로머라제의 활성 억제효과 측정
전기 실시예 3 및 4에서 나타난 결과가 텔로머라제의 활성에 기인한 것인지를 확인하기 위하여, 텔로머라제 효소 활성을 저해하는 물질로 알려진 AZT(참조: Gomez et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 246(1):107-110, 1998; Melana et al., Clin. Cancer. Res., 4(3):693-696, 1998)를 이용하여, 텔로머라제가 활성화된 조직과 활성화되지 않은 조직의 NMDA에 의한 신경세포 괴사정도를 측정하였다.
즉, 임신한지 15.5일 경의 텔로머라제 형질전환 생쥐의 태아를 추출하여, 태아의 전뇌부분을 해부현미경하에서 적출하고, 이를 배양액(MEM media, 5% horse serum, 2mM glutamine, 20mM glucose)에서 48시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양된 세포에 2일간 AZT(농도: 5μM)를 처리하여 텔로머라제의 활성을 감소시킨 다음, NMDA를 30, 100 및 1000μM의 농도로 각각 처리하고, 다시 24시간동안 배양한 후, 락테이트 디하이드로게나제의 활성을 측정하여 세포의 괴사의 정도를 측정하였다(참조: 도 5). 도 5는 텔로머라제의 활성화 여부에 따른, NMDA에 의한 세포괴사 정도를 NMDA의 농도별로 비교한 그래프로서, (■)는 텔로머라제가 활성화된 세포를 나타내고, (▨)는 텔로머라제가 활성화되지 않은 세포를 나타낸다. 도 5에서 보듯이, 텔로머라제가 활성화되지 않은 세포에서 세포괴사 정도가 증가됨을 알 수 있었는 바, NMDA 독성에 대한 저항성은 텔로머라제의 활성과 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었다.
실시예 6: 허혈성 질환의 치료제를 검색
WO 01/51613(2001. 7. 19. 공개)에 개시된, 허혈상태에서 세포생존율을 향상시키는 효과를 나타내는 테트라사이클린과 허혈상태에서 세포생존율을 향상시키는 효과를 나타내지 않는 앰피실린을 이용하여, 본 발명의 형질전환 생쥐가 허혈성 질환의 치료제를 검색하는 방법에 유용한지를 알아보았다.
즉, 정상생쥐와 실시예 1에서 작제된 형질전환 생쥐를 대상으로, 각각 6-8주령의 숫컷 생쥐를 선별한 다음, 외과적 수술을 통하여 대뇌피질로 통하는 동맥을 막아 혈액의 공급을 완전 중단시키고, 1㎎/㎖ 농도의 테트라사이클린 10㎖와 1㎎/㎖ 농도의 앰피실린 10㎖를 각각 연수를 통하여 뇌에 주사하였다. 24시간이 지난 후, 각 생쥐에서 뇌를 적출하고, 적출된 뇌의 조직으로 조직박편 시료를 제작한 다음, 이를 현미경으로 관찰하여, 허혈손상으로 인해 사멸된 부위의 용적을 측정하였다(참조: 표 1).
| 처리군 | 허혈손상으로 인해 사멸된 부위의 용적(㎣) | |
| 앰피실린 처리 | 테트라사이클린 처리 | |
| 정상 생쥐 | 43.1 ±4.8 | 38.5 ±5.0 |
| 형질전환 생쥐 | 16.7 ±2.6 | 4.3 ±1.1 |
상기 표 1에서 보듯이, 정상 생쥐의 경우에는 앰피실린을 처리한 생쥐와 테트라사이클린을 처리한 생쥐가 완전히 구별되지 않았으나, 형질전환 생쥐의 경우에는, 앰피실린을 처리한 생쥐와 테트라사이클린을 처리한 생쥐가 명확히 구별되었다.
상기 결과로부터, 본원발명의 형질전환 생쥐는 허혈성 질환의 치료제를 검색하는 방법에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 성체에서 텔로머라제를 발현시켜서 허혈성 질환에 대한 저항성을 나타내는 형질전환 생쥐, 전기 형질전환 생쥐의 작제방법 및 전기 형질전환 생쥐를 모델동물로 사용하여 허혈성 질환 치료제를 검색하는 방법을 제공한다. 본 발명의 텔로머라제를 발현하는 형질전환 생쥐는 허혈에 의한 저항성이 현저히 우수하므로, 허혈성 질환의 치료제 개발을 위한 동물모델로서 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 텔로머라제를 발현하는 발현벡터 pTERT를 나타내는 유전자 지도이다.
도 2는 정상 생쥐(WT)와 형질전환 생쥐(TG)에서 발현되는 텔로머라제의 양을 정량적으로 비교한 그래프이다.
도 3은 정상 생쥐(WT)와 형질전환 생쥐(TERT-TG)의 허혈에 의한 뇌손상을 비교한 그래프이다.
도 4는 정상 생쥐와 형질전환 생쥐의 NMDA에 의한 세포괴사 정도를 NMDA의 농도별로 비교한 그래프이다.
도 5는 텔로머라제의 활성화 여부에 따른, NMDA에 의한 세포괴사 정도를 NMDA의 농도별로 비교한 그래프이다.
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<160> 1
<170> KopatentIn 1.6
<210> 1
<211> 3369
<212> DNA
<213> mouse GH3
<400> 1
atgacccgcg ctcctcgttg ccccgcggtg cgctctctgc tgcgcagccg ataccgggag 60
gtgtggccgc tggcaacctt tgtgcggcgc ctggggcccg agggcaggcg gcttgtgcaa 120
cccggggacc cgaagatcta ccgcactttg gttgcccaat gcctagtgtg catgcactgg 180
ggctcacagc ctccacctgc cgacctttcc ttccaccagg tgtcatccct gaaagagctg 240
gtggccaggg ttgtgcagag actctgcgag cgcaacgaga gaaacgtgct ggcttttggc 300
tttgagctgc ttaacgaggc cagaggcggg cctcccatgg ccttcactag tagcgtgcgt 360
agctacttgc ccaacactgt tattgagacc ctgcgtgtca gtggtgcatg gatgctactg 420
ttgagccgag tgggcgacga cctgctggtc tacctgctgg cacactgtgc tctttatctt 480
ctggtgcccc ccagctgtgc ctaccaggtg tgtgggtctc ccctgtacca aatttgtgcc 540
accacggata tctggccctc tgtgtccgct agttacaggc ccacccgacc cgtgggcagg 600
aatttcacta accttaggtt cttacaacag atcaagagca gtagtcgcca ggaagcaccg 660
aaacccctgg ccttgccatc tcgaggtaca aagaggcatc tgagtctcac cagtacaagt 720
gtgccttcag ctaagaaggc cagatgctat cctgtcccga gagtggagga gggaccccac 780
aggcaggtgc taccaacccc atcaggcaaa tcatgggtgc caagtcctgc tcggtccccc 840
gaggtgccta ctgcagagaa agatttgtct tctaaaggaa aggtgtctga cctgagtctc 900
tctgggtcgg tgtgctgtaa acacaagccc agctccacat ctctgctgtc accaccccgc 960
caaaatgcct ttcagctcag gccatttatt gagaccagac atttccttta ctccagggga 1020
gatggccaag agcgtctaaa cccctcattc ctactcagca acctccagcc taacttgact 1080
ggggccagga gactggtgga gatcatcttt ctgggctcaa ggcctaggac atcaggacca 1140
ctctgcagga cacaccgtct atcgcgtcga tactggcaga tgcggcccct gttccaacag 1200
ctgctggtga accatgcaga gtgccaatat gtcagactcc tcaggtcaca ttgcaggttt 1260
cgaacagcaa accaacaggt gacagatgcc ttgaacacca gcccaccgca cctcatggat 1320
ttgctccgcc tgcacagcag tccctggcag gtatatggtt ttcttcgggc ctgtctctgc 1380
aaggtggtgt ctgctagtct ctggggtacc aggcacaatg agcgccgctt ctttaagaac 1440
ttaaagaagt tcatctcgtt ggggaaatac ggcaagctat cactgcagga actgatgtgg 1500
aagatgaaag tagaggattg ccactggctc cgcagcagcc cggggaagga ccgtgtcccc 1560
gctgcagagc accgtctgag ggagaggatc ctggctacgt tcctgttctg gctgatggac 1620
acatacgtgg tacagctgct taggtcattc ttttacatca cagagagcac attccagaag 1680
aacaggctct tcttctaccg taagagtgtg tggagcaagc tgcagagcat tggagtcagg 1740
caacaccttg agagagtgcg gctacgggag ctgtcacaag aggaggtcag gcatcaccag 1800
gacacctggc tagccatgcc catctgcaga ctgcgcttca tccccaagcc caacggcctg 1860
cggcccattg tgaacatgag ttatagcatg ggtaccagag ctttgggcag aaggaagcag 1920
gcccagcatt tcacccagcg tctcaagact ctcttcagca tgctcaacta tgagcggaca 1980
aaacatcctc accttatggg gtcttctgta ctgggtatga atgacatcta caggacctgg 2040
cgggcctttg tgctgcgtgt gcgtgctctg gaccagacac ccaggatgta ctttgttaag 2100
gcagatgtga ccggggccta tgatgccatc ccccagggta agctggtgga ggttgttgcc 2160
aatatgatca ggcactcgga gagcacgtac tgtatccgcc agtatgcagt ggtccggaga 2220
gatagccaag gccaagtcca caagtccttt aggagacagg tcaccaccct ctctgacctc 2280
cagccataca tgggccagtt ccttaagcat ctgcaggatt cagatgccag tgcactgagg 2340
aactccgttg tcatcgagca gagcatctct atgaatgaga gcagcagcag cctgtttgac 2400
ttcttcctgc acttcctgcg tcacagtgtc gtaaagattg gtgacaggtg ctatacgcag 2460
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gacatggaga acaagctgtt tgctgaggtg cagcgggatg ggttgctttt acgttttgtt 2580
gatgactttc tgttggtgac gcctcacttg gaccaagcaa aaaccttcct cagcaccctg 2640
gtccatggcg ttcctgagta tgggtgcatg ataaacttgc agaagacagt ggtgaacttc 2700
cctgtggagc ctggtaccct gggtggtgca gctccatacc agctgcctgc tcactgcctg 2760
tttccctggt gtggcttgct gctggacact cagactttgg aggtgttctg tgactactca 2820
ggttatgccc agacctcaat taagacgagc ctcaccttcc agagtgtctt caaagctggg 2880
aagaccatgc ggaacaagct cctgtcggtc ttgcggttga agtgtcacgg tctatttcta 2940
gacttgcagg tgaacagcct ccagacagtc tgcatcaata tatacaagat cttcctgctt 3000
caggcctaca ggttccatgc atgtgtgatt cagcttccct ttgaccagcg tgttaggaag 3060
aacctcacat tctttctggg catcatctcc agccaagcat cctgctgcta tgctatcctg 3120
aaggtcaaga atccaggaat gacactaaag gcctctggct cctttcctcc tgaagccgca 3180
cattggctct gctaccaggc cttcctgctc aagctggctg ctcattctgt catctacaaa 3240
tgtctcctgg gacctctgag gacagcccaa aaactgctgt gccggaagct cccagaggcg 3300
acaatgacca tccttaaagc tgcagctgac ccagccctaa gcacagactt tcagaccatt 3360
ttggactaa 3369
Claims (10)
- (ⅰ) 생쥐의 수정란에 텔로머라제 cDNA를 포함하는 발현벡터를 도입시켜서, 형질전환된 수정란을 수득하는 단계; 및,(ⅱ) 전기 수득한 수정란을 대리모에 착상시키고, 착상된 수정란을 발생시켜서, 텔로머라제를 발현시키는 성체를 수득하는 단계를 포함하는,허혈성 질환에 대한 저항성을 나타내는 형질전환 생쥐의 작제방법.
- 제 1항에 있어서,텔로머라제 cDNA는 생쥐의 텔로머라제 cDNA(서열번호 1)인 것을 특징으로 하는형질전환 생쥐의 작제방법.
- 제 1항의 방법으로 작제되어, 체세포와 생식세포에 생쥐의 텔로머라제 cDNA를 포함하고, 텔로머라제가 성체에서도 발현되어, 허혈성 질환에 대한 저항성을 나타내는 형질전환 생쥐.
- 제 3항의 생쥐를 상호교배하여 생산된 자손 생쥐.
- 생쥐의 텔로머라제 cDNA(서열번호 1)를 포함하는 발현벡터 pTERT가 도입된 수정란(TERT(transgenic mouse fertilized egg), KCTC 10237BP)으로부터 발생되어, 체세포와 생식세포에 생쥐의 텔로머라제 cDNA를 포함하고, 텔로머라제가 성체에서도 발현되어, 허혈성 질환에 대한 높은 저항성을 나타내는 형질전환 생쥐.
- (ⅰ) 제 3항의 형질전환 생쥐에 허혈성 질환을 유발시키는 단계;(ⅱ) 전기 허혈성 질환이 유발된 형질전환 생쥐에 허혈성 질환 치료의 약리효과가 있을 것으로 예상되는 물질을 투여하는 단계; 및,(ⅲ) 전기 물질이 투여된 형질전환 생쥐의 조직괴사 정도를 측정하여, 허혈성 질환의 치료에 유효한 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 허혈성 질환의 치료제를 검색하는 방법.
- 제 6항에 있어서,허혈성 질환은 외과적 수술 또는 허혈증상을 유발하는 물질을 처리하여 유발시키는 것을 특징으로 하는허혈성 질환의 치료제를 검색하는 방법.
- 제 7항에 있어서,외과적 수술은 대뇌피질로 통하는 동맥을 막아 혈액의 공급을 완전 중단하는 것을 특징으로 하는허혈성 질환의 치료제를 검색하는 방법.
- 제 7항에 있어서,허혈증상을 유발하는 물질은 N-메틸-D-아스파르트산(N-methyl-D-aspartate, NMDA)인 것을 특징으로 하는허혈성 질환의 치료제를 검색하는 방법.
- (ⅰ) 제 5항의 형질전환 생쥐의 대뇌피질로 통하는 동맥을 막아 혈액의 공급을 완전 중단시켜서, 허혈성 질환을 유발시키는 단계;(ⅱ) 전기 허혈성 질환이 유발된 형질전환 생쥐 TERT에 허혈성 질환 치료의 약리효과가 있을 것으로 예상되는 물질을 투여하는 단계; 및,(ⅲ) 전기 물질이 투여된 형질전환 생쥐 TERT의 조직괴사 정도를 측정하여, 허혈성 질환의 치료에 유효한 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 허혈성 질환의 치료제를 검색하는 방법.
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