KR101284772B1

KR101284772B1 - 항염증, 진통효과를 가지는 기능성 식품 조성물

Info

Publication number: KR101284772B1
Application number: KR1020110049147A
Authority: KR
Inventors: 정종문; 서형호; 유기환
Original assignee: 정종문; 주식회사 벤스랩
Priority date: 2011-05-24
Filing date: 2011-05-24
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2031-05-24
Also published as: KR20120130996A

Abstract

본 발명은 곡물 및 과실에서부터 유효활성 성분(안토시아닌, 퀘르세틴, 커큐민)을 추출하고, 얻어진 추출물들을 선택적으로 조합함에 의해 얻어지는 항염증, 진통효과를 가지는 기능성 식품 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
이를 위한 본 발명의 기능성 식품 조성물은, 적양배추, 사과껍질 및 울금을 각각 추출한 후, 이들을 적정의 비율로 혼합함으로써 적정량의 용량범위에서 항산화 효과, 염증성 부종 완화 효과, 급성 및 만성염증 억제효과, 염증유발 효소인 Lipoxygenase, Cyclooxygenase-2 및 iNOS(inducible Nitric oxide synthase)의 발현 억제효과, COX-2 및 Type I collagenase의 활성저해효과, 염증유발인자인 TNF-α(tumor necrosis factor-alpha), IL-1β(interleukin 1-beta), IL-6(interleukin 6) 및 Prostaglandins의 생성억제효과 등이 우수한 소염진통제 및 관절염의 예방 및 증상개선에 효과가 있는 기능성 식품 조성물을 얻는 것을 특징으로 한다.

Description

항염증, 진통효과를 가지는 기능성 식품 조성물{Functional food composition with the effects of anti-inflammation and pain-relieving}

본 발명은 엽채류와 근채류 및 과실을 이용하여 염증과 통증의 예방 및 증상개선에 효과가 있는 유효활성 성분의 최적 추출방법을 확립하고 그 추출물을 최적의 비율로 함유하는 혼합조성물을 개발하는 것에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 적양배추, 사과껍질 및 울금 추출물을 각각 추출한 후 이들을 적정의 비율로 혼합하여 적정량의 용량범위에서 항산화 효과, 염증성 부종 억제효과, 급성 및 만성염증에서 염증유발 효소인 리포옥시게나제(lipoxygenase, LOs), 싸이클로옥시게나제-2(Cyclooxygenase-2, COX-2) 및 유도 일산화질소 합성효소(Inducible Nitric oxide synthase, iNOS)의 발현 억제효과, COX-2 및 1형 콜라겐가수분해효소(Type I collagenase)의 활성억제효과, 염증유발인자인 일산화질소(nitroxide, NO), 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α), 인터루킨1-베타(interleukin 1-beta, IL-1β), 인터루킨-6(interleukin-6, IL-6) 및 프로스타그란딘(Prostaglandins, PGs)의 생성억제효과, 형태-조직학적 슬관절 변형억제효과 등이 우수한 항염증, 진통효과를 가지는 기능성 식품 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

일반적으로 적양배추(Brassica oleracea L. var . capitata f. rubra .)는 잎색이 붉은 색을 띠고 있는 양배추의 일종으로 적채, 빨간양배추, 자색양배추라 불리고 식품공전 원재료 분류에서 엽경채류로 분류되며 식용이 가능하다. 적양배추는 수분 90%, 조단백질 1.5 ~ 2.3%, 당질 6.4%, 지방 0.6%가 함유되어 있으며 주요 영양성분으로는 100g당 β카로틴 15.0μg, 비타민A 3.0μg, 비타민B2 0.05mg, 비타민B6 0.25mg, 비타민C 51.0mg, 비타민E 0.11mg, 식이섬유 1.82g, 아연 0.16mg, 인 41.0mg, 철분 0.5mg, 칼륨 282.0mg, 칼슘 31.0mg이고 지방성분에는 리놀렌산(linolenic acid)이 많이 함유되어 있다. 또한 적양배추의 주색소는 강력한 항산화 물질로 알려진 플라보노이드계 안토시아닌(anthocyanin)으로 수산기가 4개 붙어 있는 경우가 많다. 특히 적양배추에는 비타민U라고 불리는 메틸메티오닌술포산염(methyl-methionine-sulfonate)과 비타민K가 많이 들어 있는데 이는 위액분비를 억제하고 궤양조직의 재생을 촉진하여 위염, 위궤양과 십이지장궤양을 방지하는데 효과가 있다. [참고문헌: 1. 두산세계대백과 encyber (주)두산 2. 식품위생학, 대학서림, pp138(1993)]

사과(Malus pumila Mill .)는 식품공전 원재료분류에서 과실류로 분류되며 식용이 가능하다. 품종에는 조생종(홍괴, 홍로, 축)과 중생종(욱, 홍옥, 스타아킹) 및 만생종(국광, 고울던딜리셔스, 인도, 후지)이 있다. 품종에 따라 차이는 있지만 수분함량은 약 86%정도이며 당의 함량은 11 ~ 14%이고 이러한 당의 조성은 과당(fructose) 52%, 포도당(glucose) 26%, 자당(sucrose) 20%이다. 유기산은 주로 사과산과 구연산이며 소량의 키나산, 호박산, 글리콜산, 시트라말산, α-케토글루탈산, 이소구연산 등이 있다. 무기성분은 100g당 칼륨 110mg, 칼슘 3mg, 인 8mg, 철 0.1mg 함유되어 있는데 가장 많이 함유되어 있는 칼륨은 펙틴 성분과 결합하여 나트륨을 체외로 배출함으로써 혈압을 낮춰 고혈압 치료와 예방에 효과가 있다. 아미노산의 조성은 아스파라긴산과 아스파라긴이 많으며 소량의 스레오닌, 세린, 글루타민산, 글루타민, 알라닌, 이소로이신, 페닐알라닌 등이 있다. 방향성분은 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 피로필아세테이트, 부틸아세테이트, 헥실아세테이트, 부틸프로피오네이트, 에틸2-메틸부틸레이트, 이소부틸알콜, 부틸알콜, 2-메틸부틸알콜, 헥실알콜, t-2-헥세닐알콜, 4-메톡실벤젠 등이 있으며 방향은 이들 물질들이 결합된 조합으로 이루어진다. 사과에 함유된 수용성 식물섬유인 펙틴질은 정장작용에 효과가 있고 장내 유산균의 발생을 촉진시키며 수분을 흡수하여 부피가 늘어나서 변비에 효과적이고 포만감에 따른 비만예방에 도움을 준다.

또한, 사과 껍질에는 사과의 비타민 C가 대부분 들어있고 퀘르세틴(quercetin), 캄페롤(kaempferol)과 같은 생리활성성분이 다량 함유되어 있으며 카프로산(caproic acid), 클로로겐산(chlorogenic acid)과 같은 항산화 물질이 다량 함유되어 있어서 심혈관질환, 뇌혈관질환, 동맥경화 예방, 소염작용 및 암을 억제하는 작용이 있다는 연구가 보고되고 있다.[참고문헌: 1. 원색한국식물도감, 교학사(1996) 2. 두산세계대백과 encyber (주)두산 3. 조선약용식물지, 한국문화사, pp197(1999)]

울금은 생강과의 강황(Curcuma longa L.)의 덩이뿌리를 그대로 또는 주피를 제거하고 쪄서 말린 것으로 식용 및 약용으로 널리 사용된다. 주성분으로는 커큐미노이드(curcuminoids)가 약 15%이며 이 중에서 커큐민(curcumin, diferuloylmethane)이 가장 많이 포함되어 있고 이외에 디카페오일메탄(dicaffeoylmethane)과 카페오일페룰오일메탄(cafferoylferuloymethane) 등이 있다. 또한 정유는 약 15%로써 그 중에서 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 56.5%, 세스퀴테르펜 알콜(sesquiterpene alcohol) 22%, d-캠퍼(d-camphor) 2.5%, d-캄펜(d-camphene) 등이 함유되어 있다. 지용성 성분으로는 캄페스테롤(campesterol), 스티그마스테롤(stigmasterol), β-시토스테롤(sitosterol), 콜레스테롤(cholesterol) 등이 있다. 일본 후생성, 문부성 및 과학기술처의 3부처가 공동사업에서 울금의 성분인 커큐민(curcumin)이 암예방의 후보물질 1위에 올라 연구가 진행중이고 지금까지의 연구결과 보고서에는 울금의 발암억제, 간장강화작용, 당뇨병의 합병증 예방, 고혈압 억제, 동맥경화 예방 등의 과학적 증명이 보고되었다. 또한 2001년 미국 신경학회지에 의하면 인도 사람들은 미국 사람들에 비해 알츠하이머의 발병률이 25%에 불과하다는 보고가 있었고 2002년 세계보건기구(WHO)의 자료에 의하면 인도인의 암 발병률이 미국의 암 발병률의 1/7의 수준인 것으로 나타났다.

염증은 반응기간에 따라서 급성염증(acute inflammation, 즉각적 반응, 비특이적 반응, 수일~수주일), 만성염증(chronic inflammation, 지연된 반응, 특이성 반응, 수주일 이상), 아급성 염증(subacute inflammation, 급성과 만성염증의 중간단계, 다핵구와 단핵구의 혼합형 산출물의 특징)으로 나뉜다.

또한, 염증을 유발하는 인자에는 펩티드성 인자 이외에 프로스타그란딘, 루코트리엔, 혈소판활성인자와 같은 지질성 인자, 염증인자 합성효소, NO(nitric oxide)와 같은 자유라디칼, 여러 종류의 세포접착분자, 면역계, 응고인자 등이 관여한다.

현재까지 알려진 염증의 기전은 외부의 생물학적인 원인(세균, 바이러스, 기생충), 물리학적인 원인(기계적인 자극, 열, 방사선, 전기), 화학적 원인 등으로 인한 세포손상으로 히스타민 및 키닌 등이 방출되어 혈관확장, 모세혈관 투과성 증가 및 염증부위로 대식세포의 집결이 일어나고, 이에 따라서 감염부위의 혈류량 증가, 부종, 면역세포 및 항체 이동, 통증, 발열 등의 현상이 일어난다.

현재 사용되고 있는 염증의 치료제에는 이부프로펜과 같은 합성의약품, 항히스타민제, 스테로이드, 코티손, 면역억제제, 면역 항진제 등이 사용되고 있으나 치료효과가 일시적이거나 단순 증상완화, 과민반응, 면역체계 악화 등의 부작용이 많이 있고 염증의 근본적인 치료가 어렵다.

통증은 기간에 따라 급성 통증, 아급성 통증, 재발성 통증, 지속성인 암통증, 만성통증, 만성통증 증후군이 있다. 현재까지 알려진 통증의 기전은 통각수용기에서 신경섬유로 향하는 구심성 신경로를 통하여 대뇌피질 및 계통영역을 자극하여 느끼는 불쾌한 감각이다. 통증과 관련된 물질로는 아라키돈산을 기질로 사용되어 사이클로옥시제나제(cyclooxygenese) 및 리포옥시제나제(lipooxigenase) 효소에 의해 생성되는 프로스타그란딘(prostaglandin), 루코트리엔(leukotriene), 트롬복산(thromboxane)과 이외에 세로토닌(serotonin), 카테콜아민(catecholamine), 프로톤(protons), 히스타민(histamine), 포타슘 이온 등이 있다.

또한, 통증치료에는 약물치료(진통제, 비마약성 진통제, 비스테로이드성 항염증제, 항우울제), 주사치료(주로 근육통증 부위에 국소적으로 주사), 물리치료(냉치료, 열치료, 고전압 직류전기 치료, 경피적 전기 신경자극 치료, 운동치료, 초음파 치료, 이온도입 및 음파 영동법)가 있지만 이러한 치료방법은 대개 부작용이 있고 반복적인 치료에 내성이 있으며 그 효과가 일시적인 경우가 많기 때문에 현실적으로 적절하고 완벽한 치료를 기대하기 어렵다.

퇴행성 관절염(degenerative arthritis)이란 골관절염(osteoarthritis, degenerative joint disease)이라고도 하며, 가장 흔한 관절염의 유형이다. 외상, 질병 및 관절기형으로 인한 경우도 있으나 주로 관절을 보호하는 연골의 퇴행성 손상으로 인해 염증과 통증을 유발하는 경우가 환자의 대다수이다. 일반적으로 노화가 퇴행성 관절염의 발생을 증가시키기는 하지만 성별, 유전적 요소, 비만정도, 생활습관 등도 연관되어 있다. 퇴행성 관절염의 치료는 중증인 경우 관절경을 이용한 유리체와 활액막을 제거, 활막 절제술, 소파관절 성형술, 다발성 천공술, 인공관절 치환술과 같은 수술적 치료가 이루어지며 중증이 아닌 경우 약물요법이 주로 이루어 진다.

류마티스 관절염의 원인은 아직 명확히 밝혀지지 않았지만 자가면역(autoimmunity) 현상이 주요 기전으로 알려져 있다. 활막(synovium)의 염증으로 시작하여 주위의 연골과 뼈로 염증이 확산되어 관절(주로 초기에는 손가락, 손목, 발가락 관절이, 병이 진행함에 따라 팔꿈치, 어깨, 발목, 무릎 관절)의 변형이 초래될 뿐만 아니라 피하 결절, 혈관염, 폐섬유화증, 빈혈, 피부 궤양 등의 합병증도 발생한다. 여러 가지 약제들이 이 병의 치료에 사용되고 있으나 아직까지 류마티스 관절염을 완치하는 약제는 개발되어 있지 않다.

이러한 퇴행성 관절염 및 류마티스 관절염에 사용되는 약물은 주로 합성의약품에는 아스피린, 아세트아미노펜과 같은 소염 진통제, 쎄레브렉스, 바이옥스와 같은 NSAIDs(non-steroidal anti-inflammatory drugs)계열 제제, TNF 차단제(tumor necrosis factor 차단제- 류마티스 관절염의 경우 사용) 등이 사용되고 있으나 질병의 근원적인 치료가 불가능하고 소화기계 부작용(위염, 구토, 소화기성 궤양, 위장출혈, 궤양성 대장염)과 순환기계 부작용(혈압저하, 심계항진) 및 혈액응고기전 등에 심각한 부작용이 보고되고 있어서 사용에 주의를 요한다.

또한, 천연물 의약품에는 현재 조인스정, 아드로다캡슐, 이모튼정, 세이미정, 아트렌정, 글루코사민, 황산 콘드로이친과 같은 제품이 사용되고 있으나 그 효과가 미미하거나 그 효과를 입증하기 위한 엄격한 임상연구를 거친 제품이 드물다. 실제로 국내에서 관절염 치료를 위해 글루코사민을 복용하는 것이 사회적으로 유행처럼 되었으나 미국 FDA에서 대규모 환자들을 대상으로 치료효과를 규명하기 위한 연구를 수행한 결과, 전혀 효과가 없는 것으로 밝혀졌다.

본 발명은 기존에 사용중인 염증성 질환, 통증성 질환 및 관절염 증상 개선제의 상기한 여러 문제점을 감안하여, 천연 식물추출물을 이용함으로써 다른 합성의약품과 비교하여 부작용의 염려가 없으며, 단순증상 완화 이상의 관절염의 근본적인 증상 개선 및 예방에 탁월한 효과를 갖는 기능성 식품 조성물 및 상기 기능성 식품 조성물의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 현재까지 개발된 소염, 진통제의 대부분이 약효의 평가를 COX-2, Lipoxygenase, iNOS 같은 염증유발효소의 활성을 저해하는데 주력하였다면, 본 발명은 이러한 효소들의 활성을 저해함은 물론이고 생체내에서의 생합성(발현)도 억제하는 천연 추출물을 발명함으로써 염증과 통증의 근원적인 증상 개선을 도모하는 기능성 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 관절건강에 중요한 항산화 작용을 함으로써 관절연골세포의 파괴를 질환의 발생 후는 물론 발생 전에도 예방하는 식물 조성물을 개발함으로써 질환의 치료 및 질환발생의 고위험군에 있는 고령자들의 퇴행성 관절염의 발병을 예방하는 복합 천연 식품 기능성 조성물을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

또한, 소염 및 진통의 효과를 가지는 여러 가지 천연물을 탐색한 후 합성의약품을 대체할 수 있는 천연 식물 추출물을 발굴하고 특히, 서로 시너지 효과를 가지는 이들 천연 식물 추출물의 조합으로 이루어지는 기능성 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 기능성 식품 조성물은, 적양배추 추출물과 사과껍질 추출물 및 울금 추출물의 혼합된 식물 조성물을 주성분으로 함유하여, 염증성 질환과 통증성 질환 및 관절염의 예방과 증상을 개선하는 것을 특징으로 한다.

상기 혼합된 식물 조성물은 적양배추 추출물과 사과껍질 추출물 및 울금 추출물이 1 : (0.1 ~ 5) : (0.1 ~ 10)의 중량비로 각각 혼합되게 하는 것이 바람직하다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 기능성 식품 조성물은, 적양배추 추출물과 사과껍질 추출물이 혼합된 식물 조성물을 주성분으로 함유하여, 염증성 질환과 통증성 질환 및 관절염의 예방과 증상을 개선하는 것을 특징으로 한다.

상기 혼합된 식물 조성물은 적양배추 추출물과 사과껍질이 1 : (0.1 ~ 5)의 중량비로 혼합되게 하는 것이 바람직하다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 기능성 식품 조성물은, 적양배추 추출물과 울금 추출물이 혼합된 식물 조성물을 주성분으로 함유하여, 염증, 통증, 관절염의 예방 및 증상을 개선하는 것을 특징으로 한다.

상기 혼합된 식물 조성물은 적양배추 추출물과 울금 추출물이 1 : (0.1 ~ 10)의 중량비로 혼합되도록 하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 기능성 식품 조성물은, 사과껍질 추출물과 울금 추출물이 혼합된 식물 조성물을 주성분으로 함유하여, 염증, 통증, 관절염의 예방 및 증상을 개선하는 것을 특징으로 한다.

상기 혼합된 식물 조성물은 사과껍질 추출물과 울금 추출물이 1 : (0.1 ~ 10)의 중량비로 혼합되도록 하는 것이 바람직하다.

상기 기능성 식품 조성물이 투여되는 기능성 식품에는 캡슐, 환, 과립, 분말, 캔디, 껌, 정제, 음료, 시럽 중 어느 하나가 되도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 기능성 식품 조성물에 함유된 추출물 중 적양배추 추출물을 제조하기 위한 제조방법은, 적양배추를 정제수로 2회 세척하고 분쇄 후 4 ~ 10배 중량비의 0 ~ 99% 에탄올 수용액으로 30 ~ 100℃에서 2 ~ 8시간, 1 ~ 4회 추출하고, 냉각 및 여과하는 제1 단계와; 상기 제1 단계에서 얻어진 여액을 50 ~ 100℃로 감압 농축하는 제2 단계; 및 상기 제2 단계에서 얻어진 엑기스를 동결건조하고 분말엑기스를 제조하는 제3 단계를 포함하며, 상기 과정을 통해 추출된 지표물질인 안토시아닌(anthocyanin)이 0.1 ~ 20%이 되도록 함을 특징으로 한다.

본 발명의 기능성 식품 조성물에 함유된 추출물 중 사과껍질 추출물을 제조하기 위한 제조방법은, 사과껍질을 4 ~ 10배 중량비의 0 ~ 100% 알코올성 수용액으로 30 ~ 100℃에서 2 ~ 8시간, 1 ~ 4회 추출하고, 냉각 및 여과하는 제1 단계와; 상기 제1 단계에서 얻어진 여액을 30 ~ 80℃로 감압 농축하는 제2 단계; 및 상기 제2 단계에서 얻어진 엑기스를 동결건조하고, 분말엑기스를 제조하는 제3 단계를 포함하며, 상기 과정으로부터 추출된 지표물질인 총 퀘르세틴(Quercetin)이 0.2 ~ 10%이 되도록 함을 특징으로 한다.

본 발명의 기능성 식품 조성물에 함유된 추출물 중 울금 추출물을 제조하기 위한 제조방법은, 울금을 정제수로 2회 세척하고 분쇄 후 4 ~ 10배 중량비의 0 ~ 100% 알코올성 수용액으로 60 ~ 100℃에서 2 ~ 8시간, 1 ~ 4회 추출하고, 냉각 및 여과하는 제1 단계와; 상기 제1 단계에서 얻어진 여액을 30 ~ 80℃로 감압 농축하는 제2 단계; 및 상기 제2 단계에서 얻어진 엑기스를 동결건조하고 분말엑기스를 제조하는 제3 단계를 포함하며, 상기 과정으로부터 추출된 지표물질인 커큐민(curcumin)이 0.1 ~ 40%이 되도록 함을 특징으로 한다.

본 발명의 천연 식물 추출물의 조성물을 이용한 기능성 식품 조성물을 이용하여 항산화능(DPPH 라디칼 소거능, SOD 유사활성, H₂O₂소거능), 염증유발효소(COX-2, Lipoxygenase, iNOS, Type I collagenase)의 활성 저해 및 생체내 발현 억제, 염증유발물질(일산화질소, 프로스타그란딘, TNF-α, IL-1β, IL-6)의 생체내 생성억제, 염증성 부종억제 등에 효과가 우수한 염증성 질환과 통증성 질환 및 관절염의 예방 및 증상 개선제로 유용한 효과를 나타낸다.

도 1은 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 DPPH 라디칼을 50% 소거하는 SC₅₀값을 ppm의 농도로 나타낸 그래프도.
도 2는 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 SOD 유사활성을 나타내는 SC₅₀값을 ppm의 농도로 나타낸 그래프도.
도 3은 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 H₂O₂를 50% 소거하는 SC₅₀값을 ppm의 농도로 나타낸 그래프도.
도 4는 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 마우스 대식세포에서 LPS에 유도되는 일산화질소의 생성을 저해하는 것을 나타낸 그래프도.
도 5는 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 COX-2 효소를 50% 저해하는 IC₅₀값을 ppm의 농도로 나타낸 그래프도.
도 6은 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 MIA(mono sodium iodoacetate)에 의한 만성염증 동물모델의 혈액에서 리포옥시제나제 효소의 활성을 시료의 무처리군과 비교하여 저해하는 비율을 나타낸 그래프도.
도 7은 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 카라기난에 의한 급성염증 동물모델의 부종이 일어난 족부위에서 TNF-α의 생성량을 나타낸 그래프도.
도 8은 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 MIA에 의한 만성염증 동물모델의 염증이 일어난 슬관절부위에서 TNF-α의 생성량을 나타낸 그래프도.
도 9는 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 카라기난에 의한 급성염증 동물모델의 부종이 일어난 족부위에서 IL-1β의 생성량을 나타낸 그래프도.
도 10은 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 MIA에 의한 만성염증 동물모델의 염증이 일어난 슬관절부위에서 IL-1β의 생성량을 나타낸 그래프도.
도 11은 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 카라기난에 의한 급성염증 동물모델의 부종이 일어난 족부위에서 IL-6의 생성량을 나타낸 그래프도.
도 12는 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 MIA에 의한 만성염증 동물모델의 염증이 일어난 슬관절부위에서 IL-6의 생성량을 나타낸 그래프도.
도 13은 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 마우스 대식세포에서 LPS에 유도되는 프로스타그란딘의 생성을 저해하는 것을 나타낸 그래프도.
도 14는 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 MIA에 의한 만성염증 동물모델의 염증이 일어난 슬관절부위에서 프로스타그란딘의 생성을 저해하는 것을 나타낸 그래프도.
도 15는 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 Type I collagenase를 50% 저해하는 IC₅₀값을 ppm의 농도로 나타낸 그래프도.
도 16은 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 카라기난에 의한 급성염증 동물모델의 발부종 억제효과를 시간대별로 나타낸 도면이다.
도 17은 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 카라기난에 의한 급성염증 동물모델의 발부종 억제효과를 6시간 후 발부종 사진으로 나타낸 도면이다.
도 18은 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 마우스 대식세포에서 LPS에 유도되는 5-리포옥시게니제의 발현을 저해하는 것을 면역세포화학염색을 실시한 후 광학현미경으로 1000배 확대한 도면이다.
도 19는 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 마우스 대식세포에서 LPS에 유도되는 iNOS의 발현을 저해하는 것을 면역세포화학염색을 실시한 후 광학현미경으로 1000배 확대한 도면이다.
도 20은 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 마우스 대식세포에서 LPS에 유도되는 COX-2의 발현을 저해하는 것을 면역세포화학염색을 실시한 후 광학현미경으로 1000배 확대한 도면이다.
도 21은 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 MIA에 의한 만성염증 동물모델의 염증이 일어난 슬관절 연골의 조직형태학적 변화를 hematoxylin과 eosin을 이용하여 염색한 후 광학현미경으로 400배 확대하여 관찰한 도면이다.

이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명은 적양배추 추출물과 사과껍질 추출물 및 울금 추출물을 적정 비율로 혼합하여, 소정량의 범위로 최적화시킴으로써 각각의 추출물보다 우수한 염증성 부종 억제효과, 염증유발효소인 Type I collagenase, lipoxygenase, 및 COX-2의 저해효과, 염증성 부종 완화효과, 염증유발인자인 일산화질소(NO) 및 프로스타그란딘(prostaglandins)의 생성억제효과, 염증유발효소인 iNOS, 5-lipoxygenase 및 COX-2의 생체내 발현억제효과, 염증유발 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 생성억제, 관절염의 잠재적인 유발요인이며 이 질환의 심화 요인으로 지목되는 유해활성산소 라디칼 소거효과 및 항산화 효과를 가짐으로써 보다 뛰어난 염증성 질환, 통증성 질환 및 관절염의 예방 및 증상 개선에 유용한 복합 기능성 식품 조성물에 관한 것이다.

이와 같은 기능성 식품 조성물은 적양배추 추출물과 사과껍질 추출물 및 울금 추출물을 각각 물 또는 알코올성 수용액으로 추출하여 조성물을 제조함에 있어서 다음과 같은 방법을 사용하였다.

1) 먼저, 적양배추를 추출하여 조성물을 제조하는 방법은 다음과 같다.

적양배추를 정제수로 2회 세척 후 식품용 분쇄기를 사용하여 300 ~ 500rpm으로 5 ~ 10분간 분쇄 후 4 ~ 10배량의 0 ~ 99% 에탄올 수용액으로 30 ~ 100℃에서 2 ~ 8시간, 1 ~ 4회 추출 및 냉각하고, 0.125mm(80mesh) 규격의 스테인레스 스틸 거름망으로 여과하는 제1 단계를 실시한다. 상기 제1 단계에서 얻어진 여액을 50 ~ 100℃로 15brix까지 감압 농축하는 제2 단계를 실시한다. 상기 제2 단계에서 얻어진 엑기스를 동결건조하고 분말엑기스를 제조하는 제3 단계를 실시한다.

상기의 방법으로 얻어진 적양배추 분말엑기스에는 특히, 안토시아닌(anthocyanin)이 0.1 ~ 20 중량%로 함유되어 있다.

2) 다음, 사과껍질을 추출하여 조성물을 제조하는 방법은 다음과 같다.

사과껍질을 4 ~ 10배량의 0 ~ 100% 에탄올 수용액으로 30 ~ 100℃에서 2 ~ 8시간, 1 ~ 4회 추출한 다음 냉각하고 0.125mm(80 mesh) 규격의 스테인레스 스틸 거름망을 사용하여 여과하는 제1 단계를 실시한다.

상기 제1 단계에서 얻어진 여액을 50 ~ 100℃로 20brix까지 감압 농축하는 제2 단계를 실시한다. 상기 제2 단계에서 얻어진 엑기스를 동결건조하고 분말엑기스를 제조하는 제3 단계를 실시한다.

상기의 방법으로 얻어진 사과껍질 분말엑기스에는 특히, 퀘르세틴(quercetin)이 대개 0.2 ~ 10 중량%로 함유되어 있다.

3) 다음, 울금을 추출하여 조성물을 제조하는 방법은 다음과 같다.

울금을 정제수로 2회 세척한 후 식품용 분쇄기를 사용하여 500 ~ 700rpm으로 5 ~ 10분간 분쇄 후 4 ~ 10배량의 물 또는 0 ~ 100% 에탄올 수용액으로 60 ~ 100℃에서 2 ~ 8시간, 1 ~ 4회 추출하고, 냉각 후 0.074mm(200 mesh) 규격의 스테인레스 스틸 거름망으로 여과하는 제1 단계를 시행한다.

상기 제1 단계에서 얻어진 여액을 30 ~ 80℃로 15brix까지 감압 농축하는 제2 단계를 실시한다. 상기 제2 단계에서 얻어진 엑기스를 동결건조하고 분말엑기스를 제조하는 제3 단계를 시행한다.

상기의 방법으로 얻어진 울금 분말엑기스에는 특히, 커큐민(curcumin)이 대개 0.2 ~ 30 중량%로 함유되어 있다.

이상 상기한 1) ∼3)의 과정을 통해 적양배추 추출물과 사과껍질 추출물 및 울금 추출물이 1 : 0.2 ~ 1의 중량비로 혼합된 것은 안토시아닌(anthocyanin)이 0.1 ~ 30 중량%로 함유되어 있다.

참고로, 본 발명에서 사용된 적양배추의 주산지는 제주도이며 5 ~ 7월에 수확한 것을 사용하였고, 사과껍질의 주산지는 경상북도이고 중생종과 만생종을 혼용하였으며, 울금의 주산지는 전라남도이며 11월 중순 ~ 12월 중순에 수확한 것을 사용하였다. 그렇다고 하여 각 식물의 원산지나 품종 때문에 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

상기 식물추출물은 그 자체로도 사용할 수 있지만 분말, 타정, 과립 또는 겔 등으로 제조하기 위하여 식품학적으로 허용되는 흡습제(moisture absorbent), 부형제(forming agent), 희석제(dilute), 담체(carrier) 등과 함께 혼합하여 사용 가능하다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 수득한 적양배추 추출물과 사과껍질 추출물 및 울금 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 조합을 주성분으로 하고, 비타민군과 퀘르세틴(quercetin) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 조합을 부가성분으로 포함하는 염증성 질환, 통증성 질환 및 관절염용 기능성 조성물 외에 기타 식품 성분을 함유하는 식품을 제공한다.

상기 식품은 음료류, 특수영양식품, 건강보조식품, 기능성 식품류 외 기타 식품류를 포함한다.

한편, 상기 식품의 형태는 분말, 과립, 정제, 캡슐, 액상 또는 음료 형태를 포함한다.

또한, 본 발명은 상기의 식품첨가제를 식품에 살균제, 향신료, 조미제, 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등 또는 식품소재의 필수원료로 사용하는 것을 특징으로 하는 식품첨가제의 이용방법을 제공한다. 이때, 식품첨가제는 식품을 침지, 분무 또는 혼합하여 상기 식품에 첨가할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 기능성 조성물 100 중량% 당 0 내지 약 20 중량%의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 염증성 질환, 통증성 질환 및 관절염 예방과 증상 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 조성물의 양은, 일반적으로 본 발명의 건강기능식품 조성물의 경우는 전체 식품 중량의 10 내지 80 중량％, 바람직하게는 20 내지 70 중량％로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물에는 100ml를 기준으로 0.1 ∼ 30g, 바람직하게는 1 ∼ 30g의 비율로 가할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명하면 다음과 같으나, 본 발명의 범위가 아래의 실시예에 의해 한정된 것은 아니다.

실시예 1 : 혼합 추출물의 제조

상기한 방법으로 추출한 적양배추 추출물과 사과껍질 추출물 및 울금 추출물이 5 : 2 : 2 중량비로 분말 혼합기를 이용하여 혼합하였다.

실험예 1 : DPPH 라디칼 소거능 실험

매우 안정한 free radical인 DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl, Sigma, MO, USA)가 hydrogen proton-radical scavenger에 의해 보라색에서 노란색의 diphenylpicrylhydrazine으로 변색되는 현상을 이용하여 각 샘플의 전자 공여능을 측정하였다. 그 결과는 첨부한 도 1 및 <표 1>에 나타낸 바와 같다.

도 1은 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 DPPH 라디칼을 50% 소거하는 SC₅₀값을 ppm의 농도로 나타낸 그래프도이다.

[실험방법]

각 샘플을 농도별로 용해한 후 각각 75㎕를 DPPH(0.2 mM in ethanol) 750㎕와 3차 정제수 675㎕으로 혼합한다. 상온에서 30분간 반응하고 96 웰플레이트(well plate)에 반응액 200㎕를 옮긴 후 ELISA reader 기기(Molecular Devices, CA, USA)로 520nm의 파장에서 흡광도를 측정한다. DPPH 라디칼 소거활성(%)은 (1-시료 첨가구의 흡광도/시료 무첨가구의 흡광도)X100의 계산식을 사용하였다. SC₅₀ 값은 발생한 라디칼 50%를 소거하는데 필요한 최소농도를 ppm 단위로 표시한 것이다.

<표 1>

상기 <표 1> 및 도 1에서 보는 바와 같이, 본 발명에 의하여 제조된 실시예 1에 대한 DPPH 라디칼의 소거능은 사과껍질 추출물을 제외하고 각각의 추출물을 사용한 경우 또는 SK제약의 조인스정을 사용한 경우보다 우수한 것을 알 수 있다. 양성 대조군으로는 vitamin C를 사용하였다.

실험예 2 : SOD 유사활성 실험

각각의 식물 추출 조성물이 가지고 있는 유해활성산소 라디칼(superoxide radical)의 소거활성을 측정하기 위해서 잔틴 옥시다제(xanthine oxidase)에 의해 잔틴(xanthine)에서 유리된 산소라디칼의 소거활성을 비교하였고 그 결과는 첨부한 도 2 및 <표 2>에 나타낸 바와 같다.

도 2는 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 SOD 유사활성을 나타내는 SC₅₀값을 ppm의 농도로 나타낸 그래프도이다.

[실험방법]

37℃에서 완충용액(0.1M phosphate buffer, pH 8.0)에 용해한 잔틴 옥시다제 용액(0.045U/ml) 500㎕에 잔틴용액(0.4mM)과 NBT용액(0.24mM, nitro blue tetrazolium)으로 이루어진 발색시약 500㎕를 첨가하고 각각의 농도별로 용해한 샘플용액 50㎕를 첨가한 후 20분간 반응시키고 950㎕의 SDS(70mM)용액의 첨가로 반응을 정지시킨 후 560nm에서 시토크롬-c의 산화에 따른 변색의 정도를 측정하였다.

<표 2>

상기 <표 2> 및 도 2에서 보는 바와 같이, 본 발명에 의하여 제조된 실시예 1에 대한 SOD 유사활성은 사과껍질 추출물을 제외하고 각각의 추출물을 사용한 경우 또는 SK제약의 조인스정을 사용한 경우보다 뛰어난 것을 알 수 있다. 양성 대조군으로는 vitamin C를 사용하였다.

실험예 3 : H ₂ O ₂ 소거능 실험

일반적으로 생체내에서 발생한 유해활성산소 라디칼인 초과산화수소이온이 SOD(Super Oxide Dismutase)에 의해서 분해된 후 발생되는 산물인 과산화수소를 더욱 안전한 물과 산소로 바꾸는 항산화 활성을 측정하기 위하여 Fenton반응에 의해 생성된 hydroxyl radical이 2-deoxyribose를 산화하여 발생하는 MDA(malondialdehyde)를 520nm에서 흡광의 정도를 측정하는 방법을 이용하였고 그 결과는 도 3 및 <표 3>에 나타낸 바와 같다.

도 3은 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 H₂O₂를 50% 소거하는 SC₅₀값을 ppm의 농도로 나타낸 그래프도이다.

[실험방법]

FeSO₄ _·7H₂O(50mM)-EDTA(50mM)용액 100㎕에 2-deoxyribose(50mM)용액 150㎕를 혼합한 용액에 각각의 농도로 용해한 샘플을 150㎕씩 첨가한 후 완충용액(0.2M sodium phosphate buffer, pH 7.0) 300㎕과 H₂O₂(50mM) 10ml 및 증류수 200㎕를 넣고 37℃에서 4시간 동안 반응시키고 2.8% trichloroacetic acid 1000㎕와 NaOH(50mM)용액에 녹인 1% 2-thiobarbituric acid 1000㎕를 첨가하고 100℃에서 15분간 가열하고 급속 냉각한 다음 분광광도계를 이용하여 530nm에서 흡광도를 측정하였다. Hydroxy radical 소거활성(%)은 (1 - 시료 첨가구의 흡광도/시료 무첨가구의 흡광도) X 100의 계산식으로 구하였다.

<표 3>

상기 <표 3> 및 도 3에서 보는 바와 같이, 본 발명에 의하여 제조된 실시예 1에 대한 H₂O₂ 소거능은 적양배추 추출물, 사과껍질 추출물 및 울금 추출물을 각각 사용한 경우 또는 SK제약의 조인스정을 사용한 경우보다 훨씬 우수한 것을 알 수 있다. 양성 대조군으로는 vitamin C를 사용하였다.

실험예 4 : LPS 유도 NO 생성량 억제 실험

각 샘플이 염증유발 물질인 NO(nitric oxide,일산화질소)의 생성을 억제하는 효과는 마우스 대식세포에 LPS(lipopolysaccharide)를 처리함으로써 생성되는 배양액내의 nitric oxide 농도를 Griess 반응을 이용하여 측정하였고 그 결과는 도 4 및 <표 4>에 나타낸 바와 같다.

도 4는 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 마우스 대식세포에서 LPS에 유도되는 nitric oxide의 생성을 저해하는 것을 나타낸 그래프도이다.

[실험방법]

NO의 농도는 배양액 내의 nitric oxide 농도를 Griess 반응을 이용하여 측정하였다. 먼저, FBS와 항생제가 함유된 DMEM 배지를 이용하여 96 웰 컬쳐 플레이트(well culture plate)에 1×10^４cells/well의 마우스 대식세포 유래의 RAW 264.7 세포를 분주 후 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 24시간동안 배양하였다. 24시간 후, 이전 배양에 사용된 배지를 제거하고 FBS와 항생제가 함유되지 않은 새로운 DMEM 배지를 분주한 후 실시예 1에 의해 제조된 식물조성물을 농도별(mg/mL)로 처리하였다. 1시간 후 1mg/mL의 LPS를 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 동안 생성된 NO는 Griess시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 전체 NO₂ ^-의 농도로 측정하였는데, 세포배양 상층액 50㎕와 Griess시약 50㎕를 혼합하여 96 웰플레이트(well plate)에서 10분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. Nitric oxide 소거능(%)은 (1-시료를 첨가한 반응군의 흡광도/시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도)×100의 계산식을 이용하여 나타내었다.

<표 4>

상기 <표 4> 및 도 4에서 보는 바와 같이, 본 발명에 의하여 제조된 세가지 식물추출을 사용한 경우 마우스 대식세포에서 LPS에 의해 유도된 염증유발물질의 하나인 NO의 생성이 현저히 억제됨을 알 수 있었으며, 특히 실시예 1을 처리한 경우에서 NO의 생성 억제가 아주 우수한 것으로 나타났다.

실험예 5 : COX -2의 활성저해 실험

각 샘플이 염증유발 효소인 COX-2(cyclooxygenase-2)의 활성을 저해하는 효능을 알아보기 위해서 이러한 효소의 기질인 아라키돈산(arachidonic acid)을 사용하여 hematin의 산화를 유도하여 변색되는 현상을 이용하였고, 그 결과는 도 5 ~ 6 및 <표 5>에 나타낸 바와 같다.

도 5는 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 COX-2 효소를 50% 저해하는 IC₅₀값을 ppm의 농도로 나타낸 그래프도이다.

[실험방법]

COX-2 억제효능은 96 웰플레이트(well plate)에 한 웰(well)당 30units/ml의 COX-2를 40㎕씩 넣고, 100mM Tris-HCl buffer(pH 8.0) 90㎕, 30μM EDTA 20㎕, 150μM hematin 20㎕ 그리고 시료 20㎕를 혼합하여 25℃에서 5분간 반응시키고 5mM TMPD 5㎕와 20mM 아라키돈산 5㎕를 첨가하여 25℃에서 5분간 반응시킨 후 ELISA reader 기기를 사용하여 590nm에서 흡광도를 측정하였다. COX-2의 억제율(%)은 다음과 같은 식을 이용하여 50% inhibitory concentration(IC₅₀) 값으로 나타내었다. COX-2 억제율(%)＝[(대조군의 흡광도－실험군의 흡광도)/대조군의 흡광도]×100

<표 5>

상기 <표 5> 및 도 5에서 보는 바와 같이, 본 발명에 의하여 제조된 식물추출 조성물을 사용한 경우 염증관련 효소인 COX-2의 활성이 현저히 억제됨을 알 수 있었으며, 특히 실시예 1을 처리한 경우에서 적양배추 추출물, 사과껍질 추출물 및 울금 추출물을 각각 사용한 경우보다 COX-2의 활성 억제가 아주 우수한 것으로 나타났다.

실험예 6 : MIA ( Mono sodium iodoacetate )유도 퇴행성관절염 동물모델 제작

SD계 흰쥐에 MIA를 관절강내 주사(intra-articular injection)함으로써 관절연골세포(chondrocyte)의 대사(metabolism)를 저해해서 연골(cartilage), 인대(ligament) 및 힘줄(tendon)의 손상을 유발해서 골관절염을 발생시키는 원리를 이용하였다. 그 결과는 <표 6>에 나타낸 바와 같다.

[실험방법]

체중 300g 이상의 SD계 흰쥐의 관절강내로 27게이지(gauge)의 주사바늘이 있는 1ml 주사기를 이용하여 MIA(40mg/ml)를 50㎕씩 주사하고 각 실험군을 10 마리로 해서 각각의 샘플 또는 식염수 또는 Ibuprofen을 14일간 매일 정해진 투여량으로 경구투여 하였다.

<표 6>

실험예 7 : 리포옥시제나제 ( LOs , Lipoxygenases ) 활성저해 실험

각 샘플이 MIA를 이용한 퇴행성관절염 동물모델에서 염증 및 통증유발효소인 리포옥시제나제를 저해하는 효능을 측정하기 위해 Lipoxygenase Inhibitor Screening Assay Kit(Cayman Chemical Com, MI, USA)를 사용하여 리포옥시제나제에 의한 lipoxygenation 반응의 결과산물인 과산화수소의 양을 측정하는 원리를 이용하였고, 그 결과는 도 6 및 <표 7>에 나타낸 바와 같다.

도 7은 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 MIA에 의한 만성염증 동물모델의 혈액에서 Lipoxygenase 효소의 활성을 시료의 무처리군과 비교하여 저해하는 비율을 나타낸 그래프도이다.

[실험방법]

상기한 퇴행성관절염 동물모델의 혈청샘플 10㎕에 5-LO(220units/ml) 90ml와 1 mM linoleic acid 10ml를 첨가하여 5분간 상온에서 반응시킨 후, 색원체(chromogen) 100ml를 가하여 상온에서 5분 동안 반응시키고 ELISA reader 기기로 490nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 50% 저해농도(IC₅₀) 값으로 나타내었고 5-LO 억제율(%)은 [(대조군의 흡광도－실험군의 흡광도)/대조군의 흡광도]×100 식을 이용하여 IC₅₀값으로 나타내었다.

<표 7>

상기 <표 7> 및 도 6에서 보는 바와 같이, 본 발명에 의하여 제조된 식물추출 조성물을 사용한 경우 염증관련 효소인 리포옥시제나제의 활성이 억제됨을 알 수 있었으며, 특히 실시예 1를 처리한 경우에서 리포옥시제나제의 활성 억제가 매우 우수한 것으로 나타났다. 또한 양성 대조군으로 사용한 Ibuprofen은 리포옥시제나제의 활성저해에 영향을 주지 못하는 것으로 나타났다.

실험예 8 : TNF -α 생성저해 실험

각 샘플이 염증유발인자인 TNF-α의 생체내 발현을 감소시키는 효능을 알아보기 위해서 카라기난 유도 발부종 동물모델 및 MIA유도 퇴행성관절염 동물모델을 대상으로 TNF-α sandwich ELISA kit(eBiosience, Vienna, Austria)을 사용하여 측정하였고, 그 결과는 도 7~8 및 <표 8~9>에 나타낸 바와 같다.

도 7은 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 카라기난에 의한 급성염증 동물모델의 혈청에서 TNF-α의 생성량을 나타낸 그래프도이고,

도 8은 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 MIA에 의한 만성염증 동물모델의 혈청에서 TNF-α의 생성량을 나타낸 그래프도이다.

[실험방법]

각 샘플을 <표 8 ~ 9>에서 제시한 기간 및 용량으로 매일 1회씩 경구투여한 카라기난 유도 발부종 동물모델 및 MIA유도 퇴행성관절염 동물모델을 희생하고 채혈 및 혈장분리를 한 다음 혈장내에 존재하는 TNF-α의 농도를 ELISA kit의 제조회사가 제시한 방법으로 측정하였다. 먼저, 96 웰 플레이트(well plate)에 코팅되어 있는 anti-rat TNF-α antibody에 혈장 중의 TNF-α를 결합시키고 각 웰(well)을 5번 세척하고 여기에 biotin-conjugated anti-rat TNF-α antibody를 반응시킨 후 각 웰(well)을 5번 세척하고 streptavidin-HRP를 처리하고 최종적으로 tetramethyl-benzidine으로 발색하여 ELISA reader 기기를 이용해서 450nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. TNF-α의 양은 ELISA kit에 포함된 표준 재조합 TNF-α의 반응표준곡선을 이용하여 산술비례적으로 구하였다.

<표 8>

<표 9>

상기 <표 8 ~ 9> 및 도 7 ~ 8에서 보는 바와 같이, 카라기난에 의한 급성염증 동물모델 및 MIA에 의한 만성염증 동물모델에서 본 발명에 의하여 제조된 식물추출 조성물을 사용한 경우 염증관련 인자인 TNF-α의 생체내 생성이 억제됨을 알 수 있었으며, 특히 실시예 1를 처리한 경우에서 TNF-α의 생체내 생성 억제가 적양배추 추출물 또는 사과껍질 추출물 또는 울금 추출물을 각각 처리한 경우보다 매우 우수한 것으로 나타났다. 또한 양성 대조군으로 사용한 Ibuprofen은 TNF-α의 생체내 생성에 아주 미미한 영향만 주는 것으로 나타났다.

실험예 9 : IL -1β 생성저해 실험

각 샘플이 염증유발인자인 IL-1β의 생체내 발현을 감소시키는 효능을 알아보기 위해서 카라기난 유도 발부종 동물모델 및 MIA유도 퇴행성관절염 동물모델을 대상으로 IL-1β sandwich ELISA kit(eBiosience, Vienna, Austria)을 사용하여 측정하였고, 그 결과는 도 9 ~ 10 및 <표 10 ~ 11>에 나타낸 바와 같다.

도 9는 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 카라기난에 의한 급성염증 동물모델의 혈청에서 IL-1β의 생성량을 나타낸 그래프도이고,

도 10은 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 MIA에 의한 만성염증 동물모델의 혈청에서 IL-1β의 생성량을 나타낸 그래프도이다.

[실험방법]

각 샘플을 표 10 ~ 11에서 제시한 기간 및 용량으로 매일 1회씩 경구투여한 카라기난 유도 발부종 동물모델 및 MIA유도 퇴행성관절염 동물모델을 희생하고 채혈 및 혈장분리를 한 다음 혈장내에 존재하는 IL-1β의 농도를 ELISA kit의 제조회사가 제시한 방법으로 측정하였다. 먼저, 96 웰 프레이트(well plate)에 코팅 되어 있는 anti-rat IL-1β antibody에 혈장 중의 IL-1β를 결합시키고 각 웰(well)을 5번 세척하며 여기에 biotin-conjugated anti-rat IL-1β antibody를 반응시킨 후 각 웰(well)을 5번 세척하고 streptavidin-HRP를 처리하고 최종적으로 tetramethyl-benzidine으로 발색하여 ELISA reader 기기를 이용해서 450nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. IL-1β의 양은 ELISA kit에 포함된 표준 재조합 IL-1β의 반응표준곡선을 이용하여 산술비례적으로 구하였다.

<표 10>

<표 11>

상기 <표 10 ~ 11> 및 도 9 ~ 10에서 보는 바와 같이, 카라기난에 의한 급성염증 동물모델 및 MIA에 의한 만성염증 동물모델에서 본 발명에 의하여 제조된 식물추출 조성물을 사용한 경우 염증관련 인자인 IL-1β의 생체내 생성이 억제됨을 알 수 있었으며, 특히 실시예 1를 처리한 경우에서 IL-1β의 생체내 생성 억제가 적양배추 추출물 또는 사과껍질 추출물 또는 울금 추출물을 각각 처리한 경우보다 매우 우수한 것으로 나타났다. 또한 양성 대조군으로 사용한 Ibuprofen은 IL-1β의 생체내 생성에 아주 미미한 영향만 주는 것으로 나타났다.

실험예 10 : IL -6 생성저해 실험

각 샘플이 염증유발인자인 IL-6의 생체내 발현을 감소시키는 효능을 알아보기 위해서 카라기난 유도 발부종 동물모델 및 MIA유도 퇴행성관절염 동물모델을 대상으로 IL-6 sandwich ELISA kit(eBiosience, Vienna, Austria)을 사용하여 측정하였고, 그 결과는 도 11 ~ 12 및 <표 12 ~ 13>에 나타낸 바와 같다.

도 11는 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 카라기난에 의한 급성염증 동물모델의 혈청에서 IL-6의 생성량을 나타낸 그래프도이고,

도 12은 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 MIA에 의한 만성염증 동물모델의 혈청에서 IL-6의 생성량을 나타낸 그래프이다.

[실험방법]

각 샘플을 <표 12 ~ 13>에서 제시한 기간 및 용량으로 매일 1회씩 경구투여한 카라기난 유도 발부종 동물모델 및 MIA유도 퇴행성관절염 동물모델을 희생하고 채혈 및 혈장분리를 한 다음 혈장내에 존재하는 IL-6의 농도를 ELISA kit의 제조회사가 제시한 방법으로 측정하였다.

먼저, 96 웰 플레이트(well plate)에 코팅되어 있는 anti-rat IL-6 antibody에 혈장 중의 IL-6를 결합시키고 각 웰(well)을 5번 세척하고 여기에 biotin-conjugated anti-rat IL-6 antibody를 반응시킨 후 streptavidin-HRP를 처리하고 최종적으로 tetramethyl-benzidine으로 발색하여 ELISA reader 기기를 이용해서 450nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. IL-6의 양은 ELISA kit에 포함된 표준 재조합 IL-6의 반응표준곡선을 이용하여 산술비례적으로 구하였다.

<표 12>

<표 13>

상기 <표 12 ~ 13> 및 도 11 ~ 12에서 보는 바와 같이, 카라기난에 의한 급성염증 동물모델 및 MIA에 의한 만성염증 동물모델에서 본 발명에 의하여 제조된 식물추출 조성물을 사용한 경우 염증관련 인자인 IL-6의 생체내 생성이 억제됨을 알 수 있었으며, 특히 실시예 1를 처리한 경우에서 IL-6의 생체내 생성 억제가 사과껍질 추출물을 처리한 경우를 제외하고 적양배추 추출물 또는 울금 추출물을 각각 처리한 경우보다 매우 우수한 것으로 나타났다. 또한 양성 대조군으로 사용한 Ibuprofen은 IL-6의 생체내 생성에 아주 미미한 영향만 주는 것으로 나타났다.

실험예 11 : 프로스타그란딘 ( PGs , Prostaglandins ) 생성억제 실험

각 샘플이 LPS를 이용한 염증 세포모델과 MIA를 이용한 퇴행성관절염 동물모델에서 염증 및 통증유발인자인 프로스타그란딘(Prostaglandins)의 생성을 억제하는 효능을 측정하기 위해 Ptostaglandin Screening EIa Kit(Cayman Chemical Co., MI, USA)를 사용하여 프로스타그란딘과 Tracer(acetylcholinesterase를 인위적으로 결합시킨 프로스타그란딘)가 서로 경쟁적으로 anti-PGs-antibody에 결합하는 원리를 이용하였고, 그 결과는 도 13 ~ 14 및 <표 14 ~ 15>에 나타낸 바와 같다.

도 13은 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 마우스 대식세포에서 LPS에 유도되는 프로스타그란딘의 생성을 저해하는 것을 나타낸 그래프도이고,

도 14는 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 MIA에 의한 만성염증 동물모델의 혈청에서 프로스타그란딘의 생성을 저해하는 것을 나타낸 그래프도이다.

[실험방법]

마우스 대식세포 유래의 RAW 264.7 세포를 FBS와 항생제가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 96 웰 컬처 플레이트(well culture plate)에 1×10^４cells/well의 분주 후 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 24시간동안 배양하였다. 24시간 후, 이전 배양에 사용된 배지를 제거하고 FBS와 항생제가 함유되지 않은 새로운 DMEM 배지를 분주한 후 각 샘플을 농도별로 처리하였다. 1시간 후 1mg/mL의 LPS를 처리하여 24시간 배양하였다. Prostaglandin AChE Tracer와 antiserum을 anti-PGs antibody가 코팅된 96 웰프레이트(well plate)에 넣고 표준 프로스타그란딘(prostaglandin) 또는 각 샘플을 처리한 배지를 50㎕씩 첨가한 후 18시간 상온에서 반응시킨 후 각 웰(well)을 5번 세척하고 Ellman's Reagent를 200㎕씩 넣고 70분간 발색하고 ELISA reader를 이용하여 420 nm의 파장에서 흡광도를 측정한다. 프로스타그란딘의 양은 ELISA kit에 포함된 표준곡선을 이용하여 산술비례적으로 구하였다.

<표 14>

<표 15>

상기 <표 14 ~15> 및 도 13 ~14에서 보는 바와 같이, 본 발명에 의하여 제조된 식물추출 조성물을 사용한 경우 마우스 대식세포에서 LPS에 의해서 유도된 염증유발물질의 하나인 프로스타그란딘의 생성이 억제됨을 알 수 있으며, 특히 실시예 1을 처리한 경우에서 적양배추 추출물 또는 사과껍질 추출물 또는 울금 추출물을 각각 처리한 경우보다 프로스타그란딘 생성 억제율이 우수한 것으로 나타났다.

실험예 12 : Type I Collagenase 활성저해 실험

각 샘플이 관절연골 건강에 주요 악영향을 미치는 Type I collagenase의 활성을 저해하는 효과를 보기 위하여 재조합 collagenase enzyme(Sigma, MO, USA)이 기질인 PZ-peptide (4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Lue-Gly-Pro-D-Arg, Fluka Chemie GmbH, Buchs, Switzerland)를 분해할 때의 변색현상을 이용하여 측정하였고 그 결과는 도 15 및 <표 16>에 나타낸 바와 같다.

도 15은 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 Type I collagenase를 50% 저해하는 농도인 IC₅₀값을 ppm의 농도로 나타낸 그래프도이다.

[실험방법]

Collagenase enzyme 0.2mg/ml의 농도로 용해하고 PZ-peptide는 0.3mg/ml의 농도로 완충용액에 희석한 후 농도별 샘플 100㎕과 collagenase 150㎕ 및 PZ-peptide 250㎕을 순서대로 혼합하여 vortex 후 37℃, 30분간 반응한 후 Citric acid(25mM) 500㎕을 첨가하고 ethyl acetate 1.5ml을 첨가한 후 상온에서 10분간 반응시키고 석영 cuvette을 이용하여 320nm 파장에서 흡광도를 측정한다.

<표 16>

상기 <표 16> 및 도 15에서 보는 바와 같이, 본 발명에 의하여 제조된 실시예 1에 대한 Type I collagenase저해능은 각각의 추출물을 사용한 경우 또는 SK제약의 조인스정을 사용한 경우보다 뛰어난 것을 알 수 있다.

실험예 13 : 카라기난 ( carrageenan ) 유도 급성 염증에 대한 부종( edema )억제 실험

상기 실시예 1에서 제조한 식물조성물에 의한 카라기난 유도 급성 염증반응에서 발 부종의 억제정도를 대조군과 비교하여 시간대별로 관찰하여 그 결과 값으로 하여 <표 17> 및 도 16 ~ 17에 나타내었다.

도 16은 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질을 <표 17>의 방법으로 실험한 카라기난에 의한 급성염증 동물모델의 발부종 억제효과를 시간대별로 나타낸 도면이다.

도 17은 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질을 <표 18>의 방법으로 실험한 카라기난에 의한 급성염증 동물모델의 발부종 억제효과를 발부종 6시간 후에 사진으로 나타낸 도면이다.

[실험방법]

SD(Spraque-Dqwley)계 흰쥐에 각 군의 개체수를 10으로 하여 다음 <표 19>의 농도로 경구투여하고 1% 카라기난을 용해한 생리식염수를 100㎕의 양으로 좌측 족저부에 주사하여 족 부종을 유도한 다음 Digimatic micrometer(Mitutoyo Corporation, Japan)를 이용하여 6시간 동안 각 시간별로 족부종의 정도를 측정하였다.

<표 17>

<표 18>

상기 도 16 ~ 17과 <표 17 ~ 18>에서 보는 바와 같이, 본 발명에 의하여 제조된 실시예 1의 농도에 비례해서 급성염증 동물모델의 발부종이 억제됨을 알 수 있다. 또한 합성의약품인 이부프로펜보다는 미세하게 덜 억제되지만 각각의 추출물을 사용한 경우 또는 SK제약의 조인스정을 사용한 경우보다 발부종이 더 억제되는 것을 알 수 있다.

실험예 14: 염증관련효소(5- LO , iNOS , COX -2)의 발현억제 실험

각 샘플이 LPS를 이용한 염증 세포모델에서 염증유발효소인 5-LO, iNOS, COX-2의 생체내 발현을 억제하는 효능을 측정하기 위해 면역세포화학염색(immunocytochemistry)을 실시하였고, 그 결과는 도 18 ~ 20에 나타낸 바와 같다.

도 18은 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 LPS에 의한 염증 세포모델에서 5-LO 효소가 발현을 하는 세포의 수가 줄어든 것을 광학현미경을 이용해서 1000배 확대하여 나타낸 도면이고,

도 19은 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 LPS에 의한 염증 세포모델에서 iNOS 효소가 발현을 하는 세포의 수가 줄어든 것을 광학현미경을 이용해서 1000배 확대하여 나타낸 도면이고,

도 20은 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 LPS에 의한 염증 세포모델에서 COX-2 효소가 발현을 하는 세포의 수가 줄어든 것을 광학현미경을 이용해서 1000배 확대하여 나타낸 도면이다.

[실험방법]

마우스 대식세포 유래의 RAW 264.7 세포를 FBS와 항생제가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 세포가 부착 후 증식할 수 있게 특수 코팅한 12mm 원형 광학현미경용 유리 커버슬라이드(coverslips)를 넣은 24 웰 컬처 플레이트(well culture plate)에 2×10^４cells/well의 분주 후 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 24시간동안 배양하였다. 24시간 후, 이전 배양에 사용된 배지를 제거하고 FBS와 항생제가 함유되지 않은 새로운 DMEM 배지를 분주한 후 각 샘플을 농도별로 처리하였다. 1시간 후 1mg/mL의 LPS를 처리하여 24시간 배양하였다. 24시간 후 아세톤으로 세포를 고정하고 내인성 과산화효소의 불활성을 위하여 0.3% H₂O₂를 10분간 처리하고 PBS로 3회 세척 후 일차항체의 비특이적인 결합을 방지하기 위해서 염소 혈청으로 처리하고 각각의 일차항체를 24시간동안 4℃에서 반응시킨다. 24시간 후 PBS로 3회 세척하고 VECTASTAIN elite ABC kit(VECTOR laboratories, CA, USA)를 이용하여 시그널을 증폭시킨 후 DAB(Sigma, MO, USA)로 염색하였다. 세포가 부착된 커버슬라이드를 포셉을 이용하여 24 웰 컬처 플레이트에서 분리한 후 탈수과정을 거치고 Canada balsam(Sigma, MO, USA)을 이용하여 슬라이드 글라스에 부착하였다. 일차항체인 5-LO(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), iNOS(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), COX-2(Cell Signaling Technology, MA, USA)의 희석농도는 200 : 1로 하였다. 이렇게 제작한 슬라이드는 광학현미경을 이용하여 1000배의 배율로 관찰하였다.

<표 19>

상기 <표 19> 및 도 18 ~ 20에서 보는 바와 같이, 본 발명에 의하여 제조된 실시예 1의 농도에 비례해서 염증관련 효소인 5-LO, iNOS, COX-2의 대식세포 내에서의 발현이 저해된 것을 알 수 있다. 또한 Ibuprofen은 iNOS의 발현은 다소 저해하였으나 5-LO 및 COX-2의 발현에는 영향을 주지 않는 것으로 나타난다.

실험예 15: 만성염증 동물모델의 슬관절연골 조직형태학적 변화(H & E 염색)

상기한 실험예 6에서와 같이 SD계 흰쥐에 MIA를 관절강내 주사(intra-articular injection)함으로써 만성염증 동물모델을 제작하고 동물을 희생하고 슬관절을 분리한 후 슬관절의 변화를 관찰하였다. 그 결과는 <표 19> 및 도 21에 나타낸 바와 같다.

도 21은 본 발명에 의해 제조된 혼합추출물과 비교물질이 MIA에 의한 만성염증 동물모델에서 슬관절 연골의 두께가 변화한 것을 광학현미경을 이용해서 400배 확대하여 나타낸 것이다.

[실험방법]

체중 300g 이상의 SD계 흰쥐의 관절강내로 27 게이지(gauge)의 주사바늘이 있는 1ml 주사기를 이용하여 MIA(40mg/ml)를 50ml씩 주사하고 각 실험군을 10 마리로 해서 각각의 샘플 또는 식염수 또는 Ibuprofen을 14일간 매일 <표 6>에 표기한 바와 같은 투여량으로 경구투여 하였다. 14일 후 동물을 희생하고 슬관절을 분리한 후 조직을 고정하고 4% 포름산을 이용하여 칼슘을 제거한 후 탈수과정과 자일렌을 이용한 투명과정을 거치고 파라핀을 이용하여 포매를 하였다. 회전형 박절기를 이용하여 6㎛로 박절하고 젤라틴이 코팅된 슬라이드 글라스에 부착하였다. 이를 다시 자일렌으로 박절된 조직 사이의 파라핀을 제거하고 단계적 에탄올과 정제수를 이용하여 함수시키고, hematoxylin과 Eosin을 이용하여 세포핵과 세포질을 염색하였다. 이를 다시 단계적 에탄올과 자일렌을 이용하여 탈수시키고 Canada balsam(Sigma, MO, USA)을 이용하여 커버 글라스에 부착하여 봉입하였다. 이렇게 제작한 슬라이드는 광학현미경을 이용해서 400배 확대하여 관찰하였다.

<표 20>

상기 <표 20> 및 도 21에서 보는 바와 같이, 본 발명에서 제조된 실시예 1에 의해서 만성염증 동물모델의 슬관절에서 MIA에 의한 연골세포층의 손상이 실시예 1의 농도에 비례해서 줄어든 것을 알 수 있다.

제조예: 본 발명의 추출물을 포함하는 식품 또는 건강 기능 식품의 제조예를 설명하나, 상기 제조예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 예로서, 본 발명은 상기 제조예에 한정되지 않고 다른 다양한 조건으로 변경될 수 있다.

제조예 1: 산제의 제조

실시예 1의 기능성 조성물 300mg, 유당 100mg, 탈크 10mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제조예 2: 정제의 제조

실시예 1의 기능성 조성물 50mg, 옥수수전분 100mg, 유당 100mg, 스테아린산 마그네슘 2mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제조예 3: 캅셀제의 제조

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제조예 4: 액제의 제조

실시예 1의 기능성 조성물 100mg, 이성화당 10g, 만니톨 5g, 정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고, 레몬향을 적량 가한 다음, 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제조예 5: 건강 기능 식품의 제조

실시예 1의 기능성 조성물 1000㎎, 비타민 혼합물 적량, 비타민 A 아세테이트 70㎍, 비타민 E 1.0㎎, 비타민 B10 13㎎, 비타민 B20 15㎎, 비타민 B6 0.5㎎, 비타민 B12 0.2㎍, 비타민 C 10㎎, 비오틴 10㎍, 니코틴산아미드 1.7㎎, 엽산 50㎍, 판토텐산 칼슘 0.5㎎, 무기질 혼합물 적량, 황산 제1철 1.75㎎, 산화아연 0.82㎎, 탄산마그네슘 25.3㎎, 제1 인산칼륨 15㎎, 제2 인산칼슘 55㎎, 구연산칼륨 90㎎, 탄산칼슘 100㎎, 염화마그네슘 24.8㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제조예 6: 건강 음료의 제조

실시예 1의 기능성 조성물 1000㎎, 구연산 1000㎎, 올리고당 100g, 매실농축액 2g, 타우린 1g, 정제수를 가하여 전체 900㎖으로 조정.

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

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적양배추 추출물과 사과껍질 추출물과 울금 추출물이 1 : (0.1 ~ 5) : (0.1 ~ 50)의 중량비로 각각 혼합된 것임을 특징으로 하는 항염증, 진통효과를 가지는 기능성 식품 조성물.
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청구항 2에 있어서,
상기 기능성 식품 조성물은 캡슐, 환, 과립, 분말, 캔디, 껌, 정제, 음료, 시럽 형태 중 어느 하나에 투여되는 항염증, 진통효과를 가지는 기능성 식품 조성물.
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