KR101361445B1

KR101361445B1 - 펩타이드, 5-플루오로우라실, 및 성숙수지상세포를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101361445B1
Application number: KR1020110142340A
Authority: KR
Inventors: 배외식; 김상두
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2011-12-26
Filing date: 2011-12-26
Publication date: 2014-02-12
Anticipated expiration: 2031-12-26
Also published as: KR20130074325A; WO2013100500A1

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 서열을 가지는 WKYMVm 펩타이드를 포함하고, 5-플루오로우라실(5-fluorouracil) 및/또는 성숙수지상세포(mature dendritic cells)를 유효량 포함하는 암 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 체내의 면역반응을 증진시켜 항암효과의 증진, 낮은 부작용, 높은 암의 전이 억제효과 등을 가진다.

Description

펩타이드, 5-플루오로우라실, 및 성숙수지상세포를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물{Composition comprising peptide, 5-fluorouracil, and mature dendritic cells for cancer treatment}

본 발명은 서열번호 1의 서열을 가지는 WKYMVm 펩타이드를 포함하고, 5-플루오로우라실(5-fluorouracil) 및/또는 성숙수지상세포(mature dendritic cells)를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

기존의 항암제는 분열이 활발히 진행되고 있는 세포의 각종 대사경로에 개입하여, 핵산의 합성을 억제하거나 세포 독성을 일으켜 항암활성을 나타내는 약제가 대부분이었기 때문에, 암세포에만 선택적으로 작용하는 것이 아니라 정상세포, 특히 세포 분열이 활발한 조직 세포에도 손상을 입혀 구토, 위장장애, 탈모증, 골수기능저하로 인한 백혈구 감소증 등 심각한 부작용을 초래한다. 또한, 암세포의 전이 능력 및 유전적 불안정으로 인하여 항암제에 대한 내성 획득, 및 재발에 대한 문제점도 있다.

따라서 최근에는 정상세포의 손상을 최소화할 수 있는 표적지향성을 가지는 항암제의 개발, 항암제의 투여용량을 줄여 부작용을 최소화하는 방법, 체내의 면역력을 높이는 방법 등 효과적인 항암제를 개발하기 위한 다양한 연구들이 활발하게 진행되고 있다. 하지만 대부분의 항암제들은 여전히 높은 부작용 및 재발위험성 등의 문제점을 가지고 있다.

이와 같이 암을 효과적으로 치료하기 위해서는, 높은 항암효과를 가지는 동시에 부작용 및 재발위험성을 함께 줄일 수 있는 효과적인 항암제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 서열번호 1의 서열을 가지는 WKYMVm 펩타이드를 포함하고, 5-플루오로우라실(5-fluorouracil) 및/또는 성숙수지상세포(mature dendritic cells)를 유효량 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 서열번호 1의 서열을 가지는 WKYMVm 펩타이드 및 5-플루오로우라실(5-fluorouracil)을 유효량 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 1의 서열을 가지는 WKYMVm 펩타이드 및 성숙수지상세포(mature dendritic cell)를 유효량 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 1의 서열을 가지는 WKYMVm 펩타이드, 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 및 성숙수지상세포(mature dendritic cell)를 유효량 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 조성물은 대장암 또는 림프세포에서 유래하는 암을 억제하는 데 사용되는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 서열번호 1의 서열을 가지는 WKYMVm 펩타이드 및 5-플루오로우라실(5-fluorouracil)을 병용투여하여 항암치료 효과를 높이는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 1의 서열을 가지는 WKYMVm 펩타이드 및 성숙수지상세포(mature dendritic cell)를 병용투여하여 항암치료 효과를 높이는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 1의 서열을 가지는 WKYMVm 펩타이드, 5-플루오로우라실(5-fluorouracil) 및 성숙수지상세포(mature dendritic cell)를 병용투여하여 항암치료 효과를 높이는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 WKYMVm 펩타이드를 포함하고, 5-플루오로우라실 및/또는 성숙수지상세포의 병용투여는, 체내 면역성을 증진시켜 항암제의 사용량을 줄일 수 있기 때문에 항암제로 인한 부작용 및 내성을 효과적으로 줄일 수 있을 뿐만 아니라 항암효과를 현저히 증가시킬 수 있기 때문에 암의 치료에 적용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한 항암제의 종류를 자유롭게 변경하여 다양한 종류의 암 치료에 사용가능할 것으로 기대된다.

도 1 은 WKYMVm 펩타이드, 5-플루오로우라실, 성숙수지상세포의 투여 방법에 대한 개략적인 모식도이다.
도 2 는 WKYMVm 펩타이드, 5-플루오로우라실, 성숙수지상세포의 단독 및 병용투여에 의한 항암효과를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3 은 WKYMVm 펩타이드, 5-플루오로우라실, 성숙수지상세포의 단독 및 병용투여에 의한 암세포 사멸 유도효과를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4 는 WKYMVm 펩타이드, 5-플루오로우라실, 성숙수지상세포의 병용투여에 의해 면역세포의 종양조직으로의 이동 유도효과를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5 는 WKYMVm 펩타이드, 5-플루오로우라실, 성숙수지상세포의 병용투여에 의한 면역세포의 종양조직으로의 이동 유도 효과에 항-CD8 항체, 항-CD4 항체 및 항-asialo-GM1 항체가 미치는 영향을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6 은 WKYMVm 펩타이드, 5-플루오로우라실, 및 성숙수지상세포의 병용투여에 의해 유도된 CD8 T lymphocyte 및 NK 세포의 항암효과를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7 은 WKYMVm 펩타이드, 5-플루오로우라실, 및 성숙수지상세포의 병용투여가 암조직 또는 말초혈액에서의 사이토킨 양에 미치는 효과를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8 은 WKYMVm 펩타이드, 5-플루오로우라실, 및 성숙수지상세포 병용투여의 암전이 억제효과를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9 는 WKYMVm 펩타이드, 5-플루오로우라실, 및 성숙수지상세포 병용투여의 항암효과를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.

이전에 본 발명자들은 단핵백혈구(monocyte), 호중구(neutrophil) 등과 같은 백혈구 세포를 증가시키는 펩타이드 리간드(Trp-Lys-Tyr-Met-Val-D-Met-NH₂: 서열번호 1, 이하, “WKYMVm 펩타이드”라 함)를 발표한바 있다(Bae et al., 1999, J. Leukoc. Biol. 65, 241-248). 따라서 본 발명자들은 WKYMVm 펩타이드를 이용하여 면역반응을 촉진시키는 동시에 항암제를 병용투여하여 항암제의 사용량을 줄이면서 항암 효과는 증가시킬 수 있는 방법에 대하여 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.

대표적인 항암제 중 하나인 5-플루오로우라실(5-fluorouracil, 5-FU)은 DNA의 전구물질인 티민과 유사한 구조를 가지고 있어 암세포의 DNA 합성을 저해하며 항암효과를 나타내기 때문에, 위암을 비롯한 소화기계 암에서 널리 사용되고 있다. 그러나 골수저하, 설사 등의 부작용으로 인한 한계를 가지고 있다. 또한 수지상세포는 체내의 면역반응을 촉진하여 면역항암치료에 사용할 수 있을 것이라는 가능성이 제시되고 있어 많은 연구가 진행되고 있지만, 아직 항암 효과 등에 있어 미비한 실정이다.

따라서 본 발명자들은 체내의 면역반응을 촉진할 수 있는 WKYMVm 펩타이드 및 수지상세포와 항암제인 5-플루오로우라실을 병용투여하여 항암 치료에 사용하고자 하였다.

본 발명의 일 실시예에서는 WKYMVm 펩타이드, 5-플루오로우라실, 또는 성숙수지상세포를 단독으로 투여하는 것보다, WKYMVm 펩타이드에 5-플루오로우라실 및/또는 성숙수지상세포를 병용투여하면 암의 부피를 약 5배 정도 줄일 수 있다는 것을 확인하였으며(실시예 1 참조), 다른 실시예에서는 병용투여를 통하여 암의 전이를 5배 이상 억제할 수 있다는 것을 확인하였을 뿐만 아니라, 인위적으로 암을 유발시킨 쥐의 생존률을 현저히 증가시킬 수 있다는 것을 확인하였다(실시예 6 및 7 참조).

상기 결과들로부터, 서열번호 1의 서열을 가지는 WKYMVm 펩타이드를 포함하고, 5-플루오로우라실(5-fluorouracil) 및/또는 성숙수지상세포(mature dendritic cells)를 병용 투여하는 것은 단독으로 사용하는 것보다 항암 효과를 현저히 높일 수 있을 뿐만 아니라, 부작용을 줄이는 동시에 암의 전이까지 억제할 수 있기 때문에, 암의 치료에 적용될 수 있을 것으로 기대된다. 이에 본 발명은 서열번호 1의 서열을 가지는 WKYMVm 펩타이드를 포함하고, 5-플루오로우라실(5-fluorouracil) 및/또는 성숙수지상세포(mature dendritic cells)를 병용투여하여 항암치료 효과를 높이는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 서열을 가지는 WKYMVm 펩타이드를 포함하고, 5-플루오로우라실(5-fluorouracil) 및/또는 성숙수지상세포(mature dendritic cells)를 유효량 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 암 치료용 약학적 조성물을 적용할 수 있는 암의 종류에는 제한이 없다. 바람직하게는, 대장암 또는 림프세포에서 유래하는 암을 억제하는 데 사용할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 생리식염수, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올, 식물성 오일, 및 이소프로필미리스테이트 등을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 다른 측면은 서열번호 1의 서열을 가지는 WKYMVm 펩타이드를 포함하고, 5-플루오로우라실(5-fluorouracil) 및/또는 성숙수지상세포(mature dendritic cells)를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 약제학적 유효량을 개체에 투여하여 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명에서 개체란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간, 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다. 또한, 본 발명에서 약제학적 유효량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하게 조절될 수 있음은 당업자에게 명백하다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로, 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직하게는, 1일 0.001 내지 100mg/체중kg으로, 보다 바람직하게는 0.01 내지 30mg/체중kg으로 투여한다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 여러번 나누어 투여할 수도 있다. 본 발명의 서열번호 1의 서열을 가지는 WKYMVm 펩타이드, 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 및/또는 성숙수지상세포(mature dendritic cells)는 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%의 양으로 존재할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여방법에는 제한이 없으며, 예를 들면, 경구, 직장, 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막, 또는 뇌혈관(intra cerbroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. WKYMVm 펩타이드 , 5- FU , 성숙수지상세포의 항암효과 측정

WKYMVm 펩타이드, 5-fluorouracil(5-FU), 및 성숙수지상세포(mature dendritic cell, mDC)를 병용투여할 경우 항암효과가 있는지 확인하기 위하여, 우선 골수세포(bone marrow cell)를 DC 배지(10% fetal bovine serum, 2mM L-glutamine, 50uM beta-mercaptoethanol, 및 항생제를 포함하는 RPMI 1640 배지)에서 5일간 배양하며 0, 2, 4일째 GM-CSF(1,000U/mL) 및 IL-4(500U/mL)를 처리하였다. 그리고 5일째 상기 세포를 수집하여 새로운 DC 배지로 옮겨준 후, lipopolysaccharide(100ng/mL), CpG oligodeoxynucleotide 1826(10μg/mL) 및 CT-26 세포 용해물(100μg/mL)을 첨가하여 2일간 배양하여 성숙수지상세포를 준비하였다. 그리고 생후 6-8 주령 BALB/c 수컷 마우스에 결장암세포주인 CT-26 세포주(5X10⁵ cells/100μL의 인산염완충용액(phosphate buffered saline, PBS))를 피하주사(subcutaneous injection)하여 암을 유발시켰다(-3 days). 그리고 상기 마우스에 0일(0 day) 및 1일(1 day)에 각각 100μg/100μL의 5-FU를 피하주사하고, 2일(2 day)에 WKYMVm 펩타이드(100μg/100μL)를 12시간 간격으로 4회 피하주사하고 성숙수지상세포(1X10⁶ cells/100μL)를 12시간 간격으로 2회 꼬리 정맥으로 주사하였다. 그리고 4일(4 day) 및 5일(5 day)에 5-FU(100μg/100μL)를 피하주사하였다. 그 후에, 상기 생쥐에 WKYMVm 펩타이드, 5-FU, 및 성숙수지상세포를 일주일에 2회씩 3주 동안 반복 병용투여하였다. 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 마우스, WKYMVm 펩타이드, 5-FU, 또는 성숙수지상세포를 단독 또는 두 개의 조합으로 실험군과 같이 나누어 투여한 마우스를 이용하였다. 그리고 하기 식을 이용하여 암의 부피를 정량화하였다. 실험순서에 대한 개략적인 모식도는 도 1에 나타내었고, 상기 실험 결과는 도 2에 나타내었다.

암의 부피(mm³) = 길이(mm) X 너비(mm)²/2

도 2에 나타난 바와 같이, WKYMVm 펩타이드, 5-FU, 또는 성숙수지상세포를 각각 처리한 경우에는 약간 암의 부피가 줄어든 반면, WKYMVm 펩타이드 및 mDC, 또는 mDC 및 5-FU를 병용투여한한 경우에는 암의 부피가 줄어든 것을 확인할 수 있었다. 또한 WKYMVm 펩타이드, 5-FU, 및 성숙수지상세포를 병용투여한 경우에는 암의 부피가 현저하게 줄어든 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통하여, 두 개를 병용투여할 경우에도 항암 효과가 증가되지만, 세 개를 모두 병용투여하면 항암효과가 현저히 증가된다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2. WKYMVm 펩타이드 , 5- FU , 성숙수지상세포의 예정된 세포사멸 유도효과 측정

WKYMVm 펩타이드, 5-fluorouracil(5-FU), 및 성숙수지상세포(mature dendritic cell, mDC) 병용투여의 항암효과가 예정된 세포사멸(apoptosis)을 유도하기 때문인지 확인하기 위하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 마우스에 단독 또는 병용투여하고 39일 후에 암을 마우스로부터 제거한 후 10% neutral phosphate buffered formalin(NBF)으로 고정한 후, 파라핀에 넣어 여러 층으로 절단하고 염색하였다. 형태학적 분석을 위해서는 헤마톡시린 및 이오신(hematoxylin and eosin, H&E)으로 염색한 후 광학 현미경을 통해 관찰하였고, 면역학적 분석을 위해서는 anti-murine cleaved caspase-3 항체 또는 anti-murine FAS 항체로 1차 결합시킨 후, FITC가 결합되어 있는 anti-murine IgG 또는 Alexa 594가 결합되어 있는 anti-murine IgG를 이용하여 2차 결합시킨 후 형광 현미경으로 관찰하였다. 또한 TUNEL(Terminal deoxy-nucleotidyl transferase-mediated digoxigenin-dUTP nick end labeling) 염색법을 이용하여 염색하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, TUNEL 염색, FAS 및 Caspase-3 염색 모두 유사한 결과를 나타내었다. WKYMVm 펩타이드, 또는 성숙수지상세포 단독으로 처리한 경우에는 세포가 거의 죽지 않은 것을 확인하였고, 5-FU를 단독처리한 경우에는 일부 세포가 죽은 것을 확인할 수 있었다. 또한 두 개를 병용투여한 경우에도 일부 세포가 죽은 것을 확인할 수 있었지만, WKYMVm 펩타이드, 5-FU, 및 성숙수지상세포를 병용투여한 경우에는 거의 모든 세포가 죽은 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통하여, KYMVm 펩타이드, 5-FU, 및 성숙수지상세포의 병용투여는 예정된 세포사멸을 유도하여 암세포를 사멸시키는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3. WKYMVm 펩타이드 , 5- FU , 성숙수지상세포의 항암면역반응 유도효과 측정

WKYMVm 펩타이드, 5-fluorouracil(5-FU), 및 성숙수지상세포(mature dendritic cell, mDC)의 병용투여가 항암면역반응을 유도하는지 확인하기 위하여, FITC(Fluorescein isothiocyanate)가 결합되어 있는 anti-murine CD3 항체, PE(Phycoerythrin)가 결합되어 있는 anti-murine CD4 항체, FITC가 결합되어 있는 anti-murine CD11b 항체, 또는 PE가 결합되어 있는 anti-murine DX5 항체를 이용하여 실시예 2와 동일한 방법으로 암을 염색하고 형광 현미경을 통하여 관찰하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, WKYMVm 펩타이드, 5-fluorouracil(5-FU), 및 성숙수지상세포(mature dendritic cell, mDC)의 병용투여는 CD8 T lymphocyte 및 NK(natural killer) 세포를 현저히 암 주변으로 유도한다는 것을 확인하였다. 또한 CD4 T lymphocyte도 약하게 암 주변으로 모이는 것을 확인할 수 있었다.

또한, CD8 T lymphocyte 및 NK(natural killer) 세포가 서로 영향을 주어 암 주변으로 모이는 것이 아닌지 확인하기 위하여, rat anti-mouse CD8 항체, rat anti-mouse asialo-GM1 항체, 또는 rat anti-mouse CD4 항체 100μg을 각각 암을 마우스에 피하주사하기 하루 전, 피하주사한 당일, 및 피하주사후 5일째에 복강내주사(intraperitoneal injection)하였다. 그리고 상기와 동일한 방법으로 염색하고 형광 현미경을 통하여 관찰하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, anti-CD8 항체를 처리한 경우에는 CD8 T lymphocyte는 암 주변으로 유도되지 않았지만, NK 세포는 암 주변에 모여있는 것을 확인할 수 있었다. 또한 anti-asialo-GM1 항체를 처리한 경우에는 NK 세포는 암 주변으로 유도되지 않았지만, CD8 T lymphocyte는 암 주변으로 모여들었으며, anti-CD4 항체를 처리한 경우에는 CD8 T lymphocyte 및 NK 세포 모두 암 주변으로 유도된 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. WKYMVm 펩타이드 , 5- FU , 및 성숙수지상세포의 병용투여에 의해 유도된 CD8 T lymphocyte 및 NK 세포의 항암효과 측정

항암면역반응은 다양한 종류의 백혈구(leukocyte)들이 함께 작용하여 일어나게 된다. 따라서, WKYMVm 펩타이드, 5-FU, 및 성숙수지상세포의 병용투여에 의하여 유도된 CD8 T lymphocyte 및 NK 세포가 항암면역반응을 일으키는지 확인하기 위하여, rat anti-mouse CD8 항체, rat anti-mouse asialo-GM1 항체, 또는 rat anti-mouse CD4 항체 100μg을 실시예 3과 동일한 방법으로 복강주사한 후, 암의 부피를 날짜별로 측정하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 병용투여한 경우에는 암의 부피가 현저히 감소하였지만, 항체를 함께 투여한 경우에는 암의 부피가 처리하지 않은 대조군과 유사하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 rat anti-mouse CD4 항체를 처리한 경우에는 암의 부피가 병용투여한 마우스와 동일한 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, WKYMVm 펩타이드, 5-FU, 및 성숙수지상세포의 병용투여에 의하여 유도된 CD8 T lymphocyte 및 NK 세포가 항암효과에 중요한 역할을 하는 것을 확인하였다.

실시예 5. WKYMVm 펩타이드 , 5- FU , 및 성숙수지상세포의 병용투여가 암세포의 사이토킨 분비에 미치는 효과 측정

WKYMVm 펩타이드, 5-FU, 및 성숙수지상세포의 병용투여가 암세포의 사이토킨(cytokine) 분비에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 마우스에 WKYMVm 펩타이드, 5-FU, 및 성숙수지상세포를 병용투여한 후 42일째에 마우스의 암 용해물 또는 마우스의 심장으로부터 혈액을 추출하여 효소결합면역흡착검사(enzyme-linked immunosorbent assay , enzyme-linked immunospecific assay, ELISA)를 실시하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다.

도 7A 및 도 7B에 나타난 바와 같이, WKYMVm 펩타이드, 5-FU, 및 성숙수지상세포를 병용투여한 경우에는 인터페론-감마(IFN-gamma) 및 인터루킨-12(IL-12)가 급격히 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한 WKYMVm 펩타이드 및 성숙수지상세포 두 개만을 병용투여한 경우에도 인터루킨-12가 급격히 증가된 것을 확인할 수 있었다.

또한, rat anti-mouse CD8 항체, rat anti-mouse asialo-GM1 항체, 또는 rat anti-mouse CD4 항체 100μg을 실시예 3과 동일한 방법으로 함께 투여하면 인터페론-감마 및 인터루킨-12의 양이 다시 급격히 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과들은 WKYMVm 펩타이드, 5-FU, 및 성숙수지상세포의 병용투여에 의하여 유도된 CD8 T lymphocyte 및 NK 세포가 인터페론-감마 및 인터루킨-12를 생성시킨다는 것을 의미한다.

실시예 6. WKYMVm 펩타이드 , 5- FU , 및 성숙수지상세포 병용투여의 암전이 억제효과 측정

암의 재발을 막기 위해서는, 암의 전이를 방지하는 것이 가장 중요하기 때문에 WKYMVm 펩타이드, 5-FU, 및 성숙수지상세포의 병용투여가 암전이를 억제하는지 확인하였다. 자연적인 폐전이 실험을 위해서는, 실시예 1과 동일하게 CT-26 세포주를 이용하여 마우스에 암을 유발시키고, 3주 동안 WKYMVm 펩타이드, 5-FU, 및 성숙수지상세포를 병용투여하였다. 그리고 42일째 상기 마우스의 폐 표면의 암 결절(tumor nodule) 수를 측정하였다. 그리고 인위적인 폐전이 실험을 위해서는, 마우스의 꼬리 정멱에 CT-26 세포주를 주사하고, 2주 동안 WKYMVm 펩타이드, 5-FU, 및 성숙수지상세포를 병용투여한 후, 실시예 2와 동일한 방법으로 마우스의 폐를 헤마톡시린 및 이오신(hematoxylin and eosin, H&E)으로 염색하고 관찰하였다. 그 결과는 도 8에 나타내었다.

도 8A에 나타난 바와 같이, CT-26 세포주를 피하주사한 경우 자연스럽게 폐 조직으로 암이 전이되었고, WKYMVm 펩타이드, 5-FU, 및 성숙수지상세포를 병용투여한 경우에는 암이 거의 전이되지 않은 것을 확인할 수 있었다.

또한 도 8B에 나타난 바와 같이, 인위적으로 폐 조직으로 암을 전이시킨 경우에도, WKYMVm 펩타이드, 5-FU, 및 성숙수지상세포를 병용투여한 경우에는 암이 거의 전이되지 않은 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7. WKYMVm 펩타이드 , 5- FU , 및 성숙수지상세포 병용투여의 항암효과 측정

WKYMVm 펩타이드, 5-FU, 및 성숙수지상세포의 병용투여의 실질적인 항암효과를 확인하기 위하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 마우스에 암을 유발시킨 후 WKYMVm 펩타이드, 5-FU, 및 성숙수지상세포를 단독 또는 병용투여하고 마우스의 생존률을 측정하였다. 그 결과는 도 9A에 나타내었다.

도 9A에 나타난 바와 같이, WKYMVm 펩타이드, 5-FU, 및 성숙수지상세포를 병용투여한 경우 80일이 지나도 80% 이상의 마우스가 생존해 있는 것을 확인할 수 있었다.

또한 CD8 T lymphocyte 및/또는 NK 세포를 병용투여 시 항암효과가 있는지 확인하기 위하여, CT-26 세포주를 1X10⁶ cells 농도로 높여 마우스에 투여한 후, 상기와 동일하게 실험을 진행하였다. 그 결과는 도 9B에 나타내었다.

도 9B에 나타난 바와 같이, CT-26 세포주의 농도를 증가시켰을 때는 KYMVm 펩타이드, 5-FU, 및 성숙수지상세포를 병용투여한 경우에도 80일째 생존률이 40% 정도로 감소된 것을 확인하였다. 또한 CD8 T lymphocyte 또는 NK 세포를 단독으로 KYMVm 펩타이드, 5-FU, 및 성숙수지상세포와 병용투여한 경우에는 생존률이 미비하게 증가하였으나, CD8 T lymphocyte 및 NK 세포를 병용투여한 경우에는 80일이 지나도 생존률이 80%이상인 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과들을 통하여 WKYMVm 펩타이드, 5-FU, 및 성숙수지상세포를 병용투여한 경우 각각 단독으로 처리한 경우에 비하여 항암 효과가 현저히 증가되는 것을 확인하였으며, 또한 CD8 T lymphocyte 및 NK 세포를 병용투여하는 경우, 항암 효과가 더욱 증가되는 것을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

항암제와 병용되는 항암치료 효과 증진용 약학적 조성물로서, 상기 조성물은 서열번호 1에 기재된 서열을 가지는 WKYMVm 펩타이드를 포함하고, 상기 항암제는 5-플루오로우라실(5-fluorouracil) 및 성숙수지상세포 (mature dendritic cell)인, 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 상기 항암제와 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(seqeuntial)으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
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제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 조성물은 대장암 또는 림프세포에서 유래하는 암을 억제하는 데 사용되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
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