KR101263212B1

KR101263212B1 - 신규한 세포막 투과성 펩타이드 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101263212B1
Application number: KR1020100050518A
Authority: KR
Inventors: 전용필
Original assignee: 성신여자대학교 산학협력단
Priority date: 2010-05-28
Filing date: 2010-05-28
Publication date: 2013-05-10
Anticipated expiration: 2030-05-28
Also published as: KR20110130943A

Abstract

본 발명은 세포막을 통과하기 어려운 거대 분자의 생물학적 활성을 가지는 물질에 결합하여 상기 물질을 세포 내 또는 생체 내로 전달하는 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 세포투과성 펩타이드 또는 그의 변이체에 관한 것으로, 본 발명에 따른 세포막 투과성 펩타이드는 거대 분자 물질을 세포 및 물질의 손상 없이 그 기능을 유지한 상태로 세포막을 투과하여 세포 비특이적으로 세포질 또는 핵질 및 생체 내 각 장기로 운반할 수 있으므로 다양한 치료용 약물의 전달 시스템 및 약물 치료 기술에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

신규한 세포막 투과성 펩타이드 및 그의 용도{A new cell-permeable peptide and its use}

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 세포막 투과성 펩타이드 또는 그의 변이체에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 세포막을 통과하기 어려운 거대 분자의 생물학적 활성을 가지는 물질에 결합하여 상기 물질을 세포 내 또는 생체 내로 전달하는 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 세포투과성 펩타이드 또는 그의 변이체에 관한 것이다.

세포막을 투과할 수 있는 성질을 가진 펩타이드인 세포막 투과성 펩타이드(cell-permeable peptide; CPP)는 대개 30 개 이하의 아미노산으로 구성되어 있으며, 이중 지질막을 자유롭게 통과하는 성질을 가진 것으로 알려져 있다. CPP는 PTD(protein-transduction domains), MTS(membrane-translocating sequences) 이라고도 불리는 데, 수송대상체에 결합된 형태 또는 혼합된 형태로 세포막을 통과해 단백질, DNA, RNA 등의 운반 대상을 세포 내로 뿐만 아니라 세포질, 세포내 소기관, 핵 안에까지 운반할 수 있다(Endoh와 Ohtsuki, 2010; Joliot와 Prochiantz, 2004; Mogi와 Kondo, 2010).

또한 CPP는 세포막에 반응하여 엔도사이토시스(endocytosis)나 또는 직접 세포막을 투과할 수 있는 성질을 갖고 있는 올리고펩타이드로 세포막을 투과할 수 있는 전기화학 및 물리화학적 특성을 갖는다 (Jung 등, 2007; Kwon 등, 2009; M등, 2009).

이러한 CPP는 약물 전달 시스템으로의 응용방법과 연관되어 연구가 되어와 의약학 분야에서 잘 알려져 있으며, 특이적인 생물학적 시스템에서 응용되어 유전자 발현을 조절하는 하나의 도구로서 연구가 많이 진행되어 사용되고 있다. 또한 질병 진단에 이용하고자 하는 노력이 경주되고 있다(Dietz, 2010; Gao 등, 2010; Hao 등, 2010; Standley 등, 2010).

세포의 특성을 변형하기 위하여 기존에 주로 사용되어 왔던 방법은 유전자 변형을 통한 것으로 “인체에 적용”이라는 응용에서 기존 유전체의 변형이 가져올 암묵적 위험으로 그 한계성을 극명히 보이고 있다.

그러나 내인성 질병 또는 외인성 질병을 치료하는 방법 중 가장 핵심에 있는 것이 조직을 구성하고 있는 세포의 온전성을 유지하게 하는 것으로 다양한 방법으로 유전자의 발현 조절 즉 전사량의 조절, 단백질 합성량의 조절 또는 활성 조절하는 것이다.

한편 유전자 변형을 통한 식량 증산이 각광을 한 때 받았으나 여러 예기치 않은 문제점들이 있을 수 있어 그리 환영받지 못하고 있는 실정이다.

동물, 식물과 같은 다세포 생물에서의 세포 반응은 외부 신호에 의한 반응이 가장 큰 특징 중의 하나이다. 이에 따라 외부 신호를 세포질 또는 핵으로 전달하는 세포신호전달계가 매우 잘 조직되어 있다.

최근 들어 이러한 잘 알려진 사실을 바탕으로 신호전달물질 조절을 통한 형질 발현, 치료 등을 하기 위한 노력이 경주되고 있다. 이에 따라 특정 신호전달 매개체의 활성을 조절하는 물질의 제약화가 시도되어 왔다(Nguyen 등, 2010).

세포 내의 신호전달은 거의 모두가 단백질을 매개로 하여 진행된다. 다른 한편 단백질은 세포내외부, 그리고 환경의 변화에 의해 쉽게 그 기능을 상실하는 특징이 있다. 이는 단백질이 독성이나 생물체 특성의 변질 등을 유발하진 않는 매우 유용한 제약 대상물 또는 생물자원 개발 매개물로 사용될 수 있음을 의미한다.

따라서 생물학적인 활성이 있는 단백질을 원하는 세포 내로 운반함에 있어 독성이 거의 없으며, 세포 내의 각종 소기관으로 운반 물질을 운반하는 효율이 매우 높다는 장점으로 인해 CPP의 응용분야는 거의 무한대인 것으로 사료되고 있다.

대한민국 등록특허 제10-0935030호 “새로운 세포투과성 펩타이드 및 이를 이용한 생물학적 활성물질의 전달 방법”에는 거대 분자 물질을 세포 및 물질의 손상 없이 세포 내 및 생체 내 각 장기로 운반할 수 있으므로 다양한 치료용 약물의 전달 시스템 및 약물 치료 기술에 유용하게 이용할 수 있는 소수성을 띄는 새로운 형태의 세포투과성 펩타이드 PLAC가 개시되어 있으며, 대한민국 등록특허 제10-0811745호 “세포투과성 펩타이드 Ｐｅｐ１으로부터 설계된 신규한 항균 펩타이드 Ｐｅｐ 1 Ｋ 및 그의 용도”에는 다양한 균주 및 항생제에 내성을 가진 균주에서 강력한 항균활성을 나타낼 뿐 아니라 인간 적혈구 세포에서 어떠한 용혈활성도 나타내지 않기 때문에 무독성 항균제, 식품 방부제 및 화장품 첨가제로 유용하게 사용될 수 있는 세포투과성 펩타이드 Pep-1-K가 개시되어 있다.

또한 대한민국 등록특허 제10-0951719호 “세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체 및 그 용도”에는 세포내 투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자를 화학적으로 결합시킴으로써, 내포작용(endocytosis) 없이, 형광표지 자성나노입자를 세포 내로 안정하게 직접 도입시킬 수 있는 세포투과성 펩타이드-형광표지 자성나노입자 복합체 및 이를 함유하는 세포 영상용 조성물이 개시되어 있다.

이외에도 현재까지 많은 CPP가 보고되고 상업화되고 있으나 세포막을 통과하여 물질을 세포내로 이동하는 정도가 세포-특이적인 것들이 대부분이다. 또한 그 효과가 높지 않다. 최근 들어서는 이들 중 특정 CPP를 이용하여 체세포에서 배아줄기세포적 성격을 갖는 유도된 다능 줄기세포(induced pluripotent stem cell)가 개발되기도 하였다(Kim 등., 2009). 따라서 기능성 단백질이나 DNA, RNA를 세포내로 운송하는데 있어서 세포 특이성이 없고, 효율성이 높은 새로운 CPP의 개발이 요구되어 왔다.

CPP 개발에 따른 장점은 세포 분화, 세포 특성 유지 또는 조직과 기관의 기능 조절에 필요한 다양한 형태의 조절물질을 효율적으로 세포내로 유입시킬 수 있다는 것이다. 특히 활성기간이 매우 제한적인 단백질을 쉽게 세포내로 이동시킴으로서 소기의 목적을 예상되는 위해성 없이 처치할 수 있는 매우 유용한 매개물이다. 다른 한편 재조합 형태, 또는 대상물과 혼합된 형태로 세포내로 대상물을 트랜스펙션할 수 있는 장점이 있다.

그러나 이론적으로 또는 일부 실험에서 증명되고 있으나 위에서 언급되었듯이 기존 CPP들이 가지는 한계성이 있는데 이것이 문제점 이다. 즉 세포 특이적으로 물질 이동 효율이 다름과 유전자 변형에 사용되고 있는 다른 방법들에 비하여 효율이 떨어진다는 것이다. 최근에 발표된 유도만능줄기세포의 경우 매우 높은 농도의 CPP-기능성 단백질을 사용하였다. 현시점에서 기존의 문제점을 극복할 수 있고 부작용이 없는 전달매개물을 찾는 작업이 활발히 진행되고 있다.

본 발명자들은 세포 분화, 세포 특성 유지 또는 조직과 기관의 기능 조절에 필요한 다양한 형태의 조절물질을 효율적으로 전달할 수 있는 전달매개물을 탐색하고자 예의 연구를 거듭한 결과 신규한 CPP를 동정하고 이를 통해 종래 전달물질이 갖는 문제점을 극복할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 신규한 세포막 투과성 펩타이드를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드와 생물학적 활성을 갖는 물질이 융합된 융합체를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 융합체를 이용한 세포내 전달용 조성물 및 유전자 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 융합체를 이용한 생물학적 활성을 갖는 목적 물질의 전달 방법을 제공하는 것이다..

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 융합체를 이용한 유전자 치료 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적은 신규한 세포막 투과성 펩타이드 yPF를 제조하고, 이를 이용하여 기능성 단백질에 결합시켜 재조합 단백질을 제조한 후, 이를 이용한 줄기세포, 세포주 및 조직세포에서의 트랜스팩션 실험 결과 yPF를 매개로 기능성 단백질이 세포내로 효과적으로 이동하였음을 확인함으로써 달성되었다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 세포막 투과성 펩타이드 또는 이의 변이체를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 세포막 투과성 펩타이드 또는 그의 변이체와 생물학적 활성을 갖는 물질이 융합된 융합체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 융합체를 유효성분으로 포함하는 생물학적 활성물질의 세포내 전달용 조성물 및 유전자 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 세포막 투과성 펩타이드 또는 그의 변이체와 목적 단백질이 융합된 융합 단백질을 발현하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 세포막 투과성 펩타이드를 생물학적 활성을 갖는 목적 물질과 결합시켜 전달 복합체를 제조하는 단계; 및

2) 상기의 전달 복합체를 생체 또는 세포 내로 주입하는 단계로 구성되는 생물학적 활성을 갖는 목적 물질의 전달 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 1) 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 세포막 투과성 펩타이드 또는 그의 변이체를 목적 유전자와 결합시켜 전달 복합체를 제조하는 단계; 및

2) 상기의 전달 복합체를 세포 내로 주입하는 단계로 구성되는 유전자 치료 방법을 제공한다.

이하에서 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명에 따른 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 세포막 투과성 펩타이드로 yPF로 명명하였다. 상기 펩타이드 또는 그의 변이체는 생물학적 활성을 갖는 물질에 결합하여 세포 내 또는 생체 내로 상기 물질을 전달하여 생리적 현상과 관련된 활성 또는 치료 목적과 관련된 활성을 나타내게 할 수 있다. 본 발명의 물질 전달기능을 가지는 세포막 투과성 펩타이드 또는 그의 변이체는 매우 작은 펩타이드이므로 혹시 발생할 수 있는 활성물질에 대한 생물학적 간섭을 최소화할 수 있다.

상기 변이체는 상기 펩타이드의 아미노산 단편 또는 일부가 치환 또는 결실되거나, 아미노산 서열의 일부가 생체 내에서 안정성을 증가시킬 수 있는 구조로 변형되거나, 친수성을 높이기 위해 아미노산 서열의 일부가 변형되거나, 아미노산의 일부 또는 전부가 L- 또는 D- 아미노산으로 치환되거나 또는 아미노산의 일부가 변형된 단편들일 수 있다. 상기 변이체는 세포막 투과성 및 세포 내 전달 기능을 보유하도록 변형될 수 있을 것이다.

본 발명자들은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 세포막 투과성 펩타이드(yPF)를 합성하였다.

상기 펩타이드가 세포 내로 유입가능성을 조사하기 위해 yPF-GFP의 재조합 단백질을 제조하고, 이들의 농도 비의존적 R1 배아 줄기세포 내, HeLa 세포 내 및 자궁 세포 내 트랜스펙션 실험을 실시한 결과, 도 2 내지 5에 나타낸 바와 같이, yPF를 매개로 기능 단백질인 GFP (녹색)가 각 세포 내로 이동하였음을 알 수 있었으며, yPF-GFP 트랜스펙션이 줄기세포, 세포주, 조직세포에서 온도를 이용하여 조절될 수 있음을 확인하였다.

상기 생물학적 활성은 세포 내 또는 생체 내로 전달되어 생리적 현상과 관련된 활성 또는 치료 목적과 관련된 활성을 나타낸다. 또한 상기 생물학적 활성을 갖는 물질은 DNA, RNA, 단백질, 지방, 탄수화물 및 화학화합물일 수 있다. 상기 화학화합물은 항암제, 면역질환 치료제, 항바이러스 치료제, 항생제 및 생물의 성장, 발달 또는 분화의 인자일 수 있다. 본 발명의 물질 전달기능을 가지는 세포막 투과성 펩타이드는 매우 작은 펩타이드이므로 혹시 발생할 수 있는 활성물질에 대한 생물학적 간섭을 최소화할 수 있다. 상기 펩타이드 또는 그의 변이체와 생물학적 활성을 갖는 물질의 융합체는 정맥내(intravein), 복막내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular), 피하내(subcutaneous), 피내(intradermal), 비내(nasal), 점막내(mucosal), 흡입(inhalation) 및 경구(oral) 등의 경로로 주입함으로써 생체 내 전달될 수 있다.

상기 융합체를 특정 세포, 조직 또는 장기로 전달하고자 하는 경우, 상기 생물학적 활성을 갖는 물질은 특정 세포, 조직 또는 장기에서 특이적으로 발현하는 수용체와 선택적으로 결합할 수 있는 리간드의 세포외 부분 단백질, 또는 이들 수용체 또는 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 단클론항체(mAb) 및 변형된 형태와 결합하여 융합체를 형성할 수 있다. 상기 펩타이드와 생물학적 활성을 갖는 물질의 결합은 뉴클레오티드 수준에서 발현 벡터를 이용한 클로닝 기법에 의한 간접적인 연결에 의하거나 펩타이드와 생물학적 활성을 갖는 물질의 화학적 또는 물리적 공유 결합 또는 비공유 결합에 의한 직접적인 연결에 의할 수 있다.

본 발명의 조성물은 종래에 생물학적 활성물질이 쉽게 통과할 수 없었던 세포막을 통과하여 세포 내에 직접 작용할 수 있게 한다. 따라서 본 발명의 조성물은 약물전달체계(drug delivery system)의 발전에 획기적인 계기가 될 수 있다.

본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 조성물은 상기 유효성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 융합체를 유효성분으로 포함하는 조성물은 정맥내(intravein), 복막내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular), 피하내(subcutaneous), 피내(intradermal), 비내(nasal), 점막내(mucosal), 흡입(inhalation) 및 경구(oral) 등의 경로로 주입함으로써 생체 내 전달될 수 있다. 투여량은 대상의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 화합물의 경우 약 0.1 내지 100 ㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 0.5 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수 회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 목적 단백질은 세포 내 또는 생체 내로 전달되어 생리적 현상과 관련된 활성 또는 치료 목적과 관련된 활성을 나타내는 것일 수 있다. 상기 재조합 발현 벡터는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드와 목적 단백질의 서열 및 상기 융합 단백질의 정제를 용이하게 하는 태그(tag) 서열 예를 들어, 연속된 히스티딘 코돈, 말토우즈 바인딩 단백질 코돈 및 Myc 코돈 등을 포함할 수 있고, 융합체의 가용성(solubility)을 증가시키기 위한 융합파트너(partner) 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 융합 단백질의 전체적 구조와 기능의 안정 또는 각 유전자가 코딩하는 단백질의 유연성(flexibility)을 위하여 1개 이상의 글라이신, 프롤린, 아미노산 AAY를 포함하는 스페이서(spacer) 아미노산 또는 염기서열을 추가로 포함할 수 있다. 또한 상기 융합 단백질의 불필요한 부분을 제거하기 위하여 효소에 의해 특이적으로 절단되는 서열, 발현 조절 서열 및 세포 내 전달을 확인하기 위한 마커(marker) 또는 리포터 유전자 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 재조합 발현벡터에 사용되는 발현 조절 서열은 목적 DNA 및/또는 RNA가 선택적으로 전달 또는 발현되는 세포, 조직, 장기에 특이적인 프로모터를 포함하는 조절 도메인(regulatory domain)으로 구성될 수 있다.

또한, 본 발명은 1) 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 세포막 투과성 펩타이드 또는 그의 변이체를 생물학적 활성을 갖는 목적 물질과 결합시켜 전달 복합체를 제조하는 단계; 및

단계 1의 결합은 뉴클레오티드 수준에서 발현 벡터를 이용한 클로닝 기법에 의한 간접적인 연결에 의하거나 펩타이드 또는 그의 변이체와 생물학적 활성을 갖는 물질의 화학적 또는 물리적 공유 결합 또는 비공유 결합에 의한 직접적인 연결에 의할 수 있다. 상기 펩타이드 또는 그의 변이체와 생물학적 활성을 갖는 물질의 전달 복합체를 생체 또는 세포 내 주입은 정맥내(intravein), 복막내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular), 피하내(subcutaneous), 피내(intradermal), 비내(nasal), 점막내(mucosal), 흡입(inhalation) 및 경구(oral) 등의 경로로 주입함으로써 수행될 수 있다.본 발명의 전달 방법은 배양 세포뿐만 아니라 일반적인 생체 내 전달, 즉 동물 세포, 동물 조직 및 동물체로의 전달 시에도 충분히 확대 적용될 수 있다.

본 발명에 따른 세포막 투과성 펩타이드는 거대 분자 물질을 세포 및 물질의 손상 없이 그 기능을 유지한 상태로 세포막을 투과하여 세포 비특이적으로 세포질 또는 핵질 및 생체 내 각 장기로 운반할 수 있으므로 다양한 치료용 약물의 전달 시스템 및 약물 치료 기술에 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 세포막 투과성 펩타이드 yFP를 이용하여 제조한 재조합 단백질을 나타낸 도이다.
도 2는 yPF-GFP의 농도 비의존적 R1 배아 줄기세포 내 트랜스펙션 결과를 나타낸 공초점현미경 상을 나타낸 도로서, A : R1 배아 줄기세포를 1,000ng/mL GFP에서 배양한 후 세포내 이동을 관찰한 상이며; B : 1 ng/mL yPF에서 배양한 후 세포내 이동을 관찰한 상이고; C : 10 ng/mL yPF에서 배양한 후 세포내 이동을 관찰한 상이며; D : 100 ng/mL yPF에서 배양한 후 세포내 이동을 관찰한 상이다. yPF를 매개로 기능 단백질인 GFP (녹색)가 세포내로 이동하였음을 알 수 있다.
도 3은 HeLa 세포 내로 농도 비의존적 yPF-GFP 트랜스펙션 결과를 나타낸 공초점현미경 상으로서. A : Hela 세포주를 100ng/mL GFP에서 배양한 후 세포내 이동을 관찰한 상이고; B : 1 ng/mL yPF에서 배양한 후 세포내 이동을 관찰한 상이며; C : 10 ng/mL yPF에서 배양한 후 세포내 이동을 관찰한 상이고; D : 100 ng/mL yPF에서 배양한 후 세포내 이동을 관찰한 상이다. yPF를 매개로 기능 단백질인 GFP (녹색)가 세포내로 이동하였음을 알 수 있다.
도 4는 자궁 세포 내로 농도 비의존적 yPF-GFP 트랜스펙션 결과를 나타낸 공초점현미경 상으로써, A : 자궁 내막세포를 100ng/mL GFP에서 배양한 후 세포내 이동을 관찰한 상이고; B : 1 ng/mL yPF에서 배양한 후 세포내 이동을 관찰한 상이며; C : 10 ng/mL yPF에서 배양한 후 세포내 이동을 관찰한 상이고; D : 100 ng/mL yPF에서 배양한 후 세포내 이동을 관찰한 상이다. yPF를 매개로 기능 단백질인 GFP (녹색)가 세포내로 이동하였음을 알 수 있다. 핵물질은 PI(적색)로 대비 염색하였다. 주황색은 녹색과 적색이 겹친 것을 나타낸다.
도 5는 yPF-GFP 트랜스펙션이 줄기세포, 세포주, 조직세포에서 온도를 이용한 조절되는 결과를 나타낸 공초점현미경 상으로써, yPF-GFP (10 ng/mL)를 함유한 배양액에서 R1 배아 줄기세포(A), HeLa 세포주(B), 자궁내막 기질세포(C)를 37℃와 4℃에서 6시간 배양한 후 공초점현미경을 이용하여 yPF를 매개로한 GFP의 트랜스펙션 여부를 확인하였다. 37℃에서는 모든 세포 종류에서 yPF를 매개로 GFP가 세포내로 트랜스펙션 되었으나 4℃에서는 모든 세포 종류에서 GFP가 (녹색) 세포내로 트랜스펙션 되지 않음을 확인하였다. 일부 세포에서는 PI로 핵물질을 대비 염색하였다. 주황색은 녹색과 적색이 겹친 것을 나타낸다.

이하에서 본 발명의 바람직한 실시형태를 실시예를 참고로 보다 구체적으로 설명한다. 하지만 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 세포막 투과성 펩타이드 yPF 의 합성 및 분리정제

본 실시예에서는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 세포막 투과성 펩타이드 yPF를 합성하였다.

yPF을 합성하기 위하여 아미노산 서열에 합당한 센스(sense)와 안티센스(antisense) 올리고테옥시뉴클레오타이드(oligodeoxy nucleotide)를 각각 합성한 후 94℃에서 7분 방치하여 형성된 2차 또는 3차 구조를 제거하고(denaturation) 70℃ 그리고 54℃로 점진적으로 온도를 낮추어 DNA 2중가닥을 만들었다. pET-20b 벡터를 변형한 pET-20b-delXho에 끼워 넣기 위하여 센스(sense)와 안티센스(antisense) 올리고테옥시뉴클레오타이드(oligodeoxy nucleotide) 이외의 제한효소 특이 서열을 5‘과 3’에 넣었다. 이후 대장균(E. coli)에 넣어(형질변화(transformaiton)) 대량 증폭하였다. 이후 서열의 온전성을 확인하고 대장균에 넣어 발현 유도하였다.

상기에서 합성한 세포막 투과성 펩타이드 yPF의 아미노산 서열은 하기 표 1과 같다.

펩타이드	아미노산 서열
yPF	ATCLFLLGLFLLLPRPVPA

실시예 2 : yFP 를 이용한 재조합 GFP 단백질의 제조

본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 제조한 yFP가 세포 내로 유입가능한 지여부를 알아보기 위하여, 기능성 단백질의 일예로써 GFP(Green Fluorescent Protein) 단백질을 이용하여, GFP의 N-말단에 상기 yPF가 위치하고 C-말단에 6His가 오도록 재조합 GFP 단백질을 제조하였다(도 1 참조).

yPF-GFP 재조합 단백질을 얻기 위하여 도 1과 같이 yPF 다음에 GFP 핵산 유전자 서열을 넣었다. GFP는 일반 상용되는 서열에 사용된 발현 벡터에 넣기 위해 필요한 제한효소 염기서열을 갖는 프라이머(primer)를 이용하여 증폭하였다. 이후 제한효소를 처리한 후 도 1에 표시한 것처럼 끼워 넣었다.

이어서 E. coli를 이용하여 상기 재조합 GFP 단백질을 일반적 방법으로 대량 합성하여 Histidine이 특이적을 결합하는 니켈 컬럼(QIAGEN)을 이용하여 순수 분리하였다. 이후 가장 널리 사용되는 브레드포드 방법을 이용하여 단백질 정량을 수행하였다. 간단히 단백질은 PBS에 분주 후 -50℃ 냉동고에 보관하고 사용 시 녹여 사용하였다.

실험예 1 : yPF - GFP 의 농도 비의존적 R1 배아 줄기세포 내 트랜스펙션

본 실험예에서는 상기 실시예 2에서 제조한 재조합 GFP 단백질을 이용하여 yPF-GFP의 농도가 GFP의 수송에 직접적 영향이 있는 가를 확인하기 위하여, R1 배아 줄기세포를 구입하여 생쥐배아줄기세포배양액을 이용하여 5% CO₂가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 24-well 배양접시에 멸균된 커버슬립을 넣고 0.1% gelatin으로 도포한 후 R1세포(한양대학교 의과대학 생화학교실)를 심고 80%찰때가지 배양하였다. 이후 yPF-GFP 농도를 각각 1ng/mL, 10ng/mL, 100ng/mL로 달리 함유한 배양액에서 6시간 배양하였다. 이후 PBS로 10회 세척하고 메탄올을 이용하여 고정하였다. 공초점현미경을 이용하여 세포막을 통과하여 세포내로 침투한 yPF-GFP 제조합 단백질의 존재 유무를 분석 하였다. 대조군으로 1,000 ng/mL GFP를 상기와 동일하게 처리하고 관찰하였다.

도 2에서 알 수 있듯이, 상대적으로 GFP를 1,000ng/mL로 높은 농도에서 R1 배아 줄기세포에 처리할 경우에도 GFP가 세포 내에서 관찰되지 않았다(도 2A). 그러나 yPF를 N-말단에 부착한 경우 1 ng/mL 농도에서 고 농도에 이르기 까지 세포 내로 기능단백질인 GFP가 이동하여 있음이 관찰되었다. 처리한 농도간 유의한 차이는 관찰되지 않았다.

이러한 결과는 매우 효율적으로 yPF를 이용하여 기능 단백질을 세포내로 이동시킬 수 있음을 보여준다.

실험예 3 : HeLa Cell 세포 내로 농도 비의존적 yPF - GFP 트랜스펙션

본 실험예에서는 yPF가 세포 종류 특히 세포주에서 효율적으로 기능 단백질을 수송하는 가를 알아보았다. 이를 위해, 세포주 중의 하나인 HeLa 세포주를 대상으로 yPF-GFP가 효율적으로 세포내로 이동할 수 있는 가를 조사하였다.

HeLa 세포(강원대학교 의과대학)는 DMEM 배양액을 이용하여 배양하였다. 공초점현미경을 이용하여 관찰하기 위하여 커버슬립을 이용하여, 5% CO₂가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 24-well 배양접시에 멸균된 커버슬립을 넣고 HeLa세포를 심고 80%찰때가지 배양하였다. 이후 yPF-GFP 제조합단백질 농도를 각각 1ng/mL, 10ng/mL, 100ng/mL로 달리 함유한 배양액에서 6시간 배양하였다. 이후 PBS로 10회 세척하고 메탄올을 이용하여 고정하였다. 메탄올을 이용하여 고정하고 공초점현미경을 이용하여 세포막을 통과하여 세포내로 침투한 yPF-GFP의 존재 유무를 분석 하였다.

도 3A는 CPP가 결합되어 있지 않은 GFP를 100 ng/mL로 6시간 처리한 후 같은 방법으로 준비하고 공초점현미경을 이용하여 세포내 트랜스펙션 여부를 분석한 결과로 세포내에서 관찰되지 않음을 알 수 있다. 그러나 배아줄기세포에서와 마찬가지로 yPF가 결합된 yPF-GFP를 1 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL로 처리할 경우 농도 비의존적으로 세포내로 트랜스펙션 되었음을 알 수 있다(도 3B-D 참조).

이러한 결과는 yPF가 매우 경제적으로 줄기세포 뿐만이 아니라 세포주에 기능 단백질을 트랜스펙션할 수 있는 매개자로 사용될 수 있음을 보여주는 것이다.

실험예 3 : 자궁 세포 내로 농도 비의존적 yPF - GFP 트랜스펙션

본 실험예에서는 조직을 적취 후 조직 세포를 배양할 경우 외부에서 유전자 발현 변형을 유도하는 물질의 수송이 세포 주에 비하여 그 효율이 낮다는 문제점을 해결하는데 있어 CPP원리를 적용하고자 yPF-GFP를 자궁내막세포에 세포주나 배아 줄기세포에서처럼 효율적으로 트랜스펙션 될 수 있을지를 알아보았다.

이를 위하여 생쥐 자궁 내막 기질세포를 자궁에서 수획하여 체외 배양하면서 yPF를 매개로 기능성 단백질이 세포내로 효율적으로 트랜스펙션하는가를 알아보았다. 한편, 핵의 위치를 표지하기 위하여 PI (적색)으로 염색하였다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 세포를 100 ng/mL GFP를 함유한 배양액서 배양하더라도 GFP가 세포내로 트랜스펙션되어 있지 않았다(도 4A). 하지만 yPF를 N 말단에 갖고 있는 재조합 단백질인 yPF-GFP는 농도 비의존적으로 1 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL 처리 농도 모두에서 자궁내막 기질세포로 트랜스펙션되어 있음을 관찰할 수 있다. 또한 R1 배아줄기세포와 HeLa 세포주에서처럼 세포질을 통하여 핵질까지 이동되어 있음이 관찰되었다.

실험예 4 : yPF - GFP 트랜스펙션의 온도의존적 조절

세포의 특성을 변형하는 목적을 효과적으로 달성하기 위해서는 외부에서 전달하고자하는 물질의 트랜스펙션을 조절할 수 있어야하며, 기관, 조직, 세포의 저온 보존은 의학적 수의학적 및 기초과학적 관점에서 발전되어 임상 및 기초 연구에서 일반적으로 사용되고 있다.

따라서 본 실험에서는 줄기세포, 세포주 및 조직세포에서 yPF-GFP 트랜스펙션을 온도의존적으로 조절할 수 있는 지 여부를 조사하였다. 이를 위해 4℃를 유지하는 배양기를 이용하여 yPF-GFP를 함유한 배양액에서 각 세포들을 6시간 배양하였다. 배양한 이후 PBS를 이용하여 10회 세척하고 메탄올을 이용하여 고정하였다. 그리고 필요에 따라 핵물질을 PI(적색)로 염색하여 핵의 위치를 분명히 보이도록 하였다. 이후 공초점현미경을 이용하여 세포내로 이동되었는지를 확인하였다.

도 5에 나타낸 바와 같이, yPF를 매개로하여 기능 단백질의 하나인 GFP가 온도 의존적으로 세포내로 트랜스펙션 됨을 확인하였다.

<110> SUNGSHIN WOMEN`S UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> A new cell-permeable peptide and its use <130> P4687 <140> 10-2010-0050518 <141> 2010-05-28 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> yPF <400> 1 ggaattccat atggccacgt gcctgttcct cctggg 36

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 세포투과성 펩타이드 yPF.
청구항 제1항 기재의 세포투과성 펩타이드 yPF와 생물학적 활성을 갖는 기능성 단백질이 융합된 재조합단백질.
청구항 제2항에 있어서, 상기 생물학적 활성을 갖는 기능성 단백질이 Green Fluorescent protein(GFP)임을 특징으로 하는 재조합단백질 yPF-GFP.
삭제
청구항 제2항에 있어서, 상기 기능성 단백질은 세포, 조직 또는 장기의 수용체와 선택적으로 결합하는 리간드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합단백질 yPF-GFP.
청구항 제2항 기재의 재조합단백질을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 세포 또는 조직 내 약물전달용 조성물.
청구항 제2항 기재의 재조합단백질을 유효성분으로 함유하는 것이 특징으로 하는 세포 또는 조직 내 유전물질 전달용 조성물.
청구항 제2항 기재의 세포투과성 펩타이드 yPF와 생물학적 활성을 갖는 기능성 단백질이 융합된 재조합단백질 GFP를 발현하는 재조합 발현벡터.
청구항 제8항에 있어서, 상기 세포투과성 펩타이드 yPF를 코딩하는 DNA와 생물학적 활성을 갖는 기능성 단백질 GFP를 코딩하는 DNA를 포함하는 재조합 발현벡터.
제1항 기재의 펩타이드 yPF를 생물학적 활성을 갖는 기능성 단백질 GFP와 결합시켜 전달 복합체를 제조하는 단계와;
상기에서 제조된 전달 복합체를 인간을 제외한 포유동물의 생체 또는 세포 내로 주입하는 단계로 구성되는 것이 특징인 생물학적 활성물질의 전달 방법.
제1항 기재의 펩타이드를 유전물질과 결합시켜 전달 복합체를 제조하는 단계와;
상기에서 제조된 전달 복합체를 인간을 제외한 포유동물의 세포 또는 조직 내로 주입하는 단계로 구성되는 유전물질 전달방법.