JP7523012B1

JP7523012B1 - ペプチドフラグメント及びその利用

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Publication number: JP7523012B1
Application number: JP2023081456A
Authority: JP
Inventors: 菜穂子ベイリー小林; 徹彦吉田
Original assignee: Toagosei Co Ltd
Current assignee: Toagosei Co Ltd
Priority date: 2023-05-17
Filing date: 2023-05-17
Publication date: 2024-07-26
Anticipated expiration: 2043-05-17
Also published as: JP2024165340A; WO2024237246A1

Abstract

【課題】細胞膜透過性が向上したペプチドフラグメントを提供する。
【解決手段】ここで開示されるペプチドフラグメントは、アミノ酸配列：ＲＲＲＲＳＮＲＲＧ（配列番号１）を含み、アミノ酸残基の合計が１０以下である。
【選択図】図１

Description

本開示は、ペプチドフラグメント及びその利用に関する。

従来から、ヒトやそれ以外の哺乳動物等の細胞（真核細胞）内にポリペプチド、核酸等の外来物質を導入し、当該細胞（さらには該細胞から成る組織や器官）の形質を転換させること或いは当該細胞の機能を改善・向上させることが行われている。

上述した技術には、例えば、細胞の外部から細胞膜を通過して細胞質内に外来物質を導入させる細胞膜透過性ペプチド（cell-penetrating peptide:ＣＰＰ）が用いられる。例えば、特許文献１～３には、疾患の治療に用いられる核酸医薬品の技術が開示されており、細胞膜透過性ペプチドにより核酸を細胞内に導入する技術が開示されている。

米国特許出願公開第２０２２／０３８７６０１号明細書米国特許出願公開第２０２２／０３６４０８５号明細書米国特許出願公開第２０２２／０３６４０８４号明細書

細胞膜透過性ペプチドは、上述のように核酸等の外来物質を細胞内部へと導入するツールとして利用されており、その導入効率の向上が望まれている。

本開示により、細胞膜透過性を有するペプチドフラグメント（合成ペプチド）が提供される。一態様におけるペプチドフラグメントは、アミノ酸配列：ＲＲＲＲＳＮＲＲＧ（配列番号１）を含み、アミノ酸残基の合計が１０以下である。好ましい態様では、ペプチドフラグメントはアミノ酸配列：ＲＲＲＲＳＮＲＲＧ（配列番号１）から成る。
配列番号１に示すアミノ酸配列を含むペプチドフラグメントは、優れた細胞膜透過性を発揮する。そのため、当該ペプチドフラグメントを含む構築物は、細胞外部から細胞内部（少なくとも細胞質内）へと導入される。

また、本開示により、真核細胞の外部から当該細胞の内部に目的とする外来物質を導入することができる外来物質導入用の構築物（以下、単に「構築物」ともいう）が提供される。ここで開示される構築物は、ペプチドフラグメントと、上記ペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した外来物質とを含みアミノ酸配列：ＲＲＲＲＳＮＲＲＧ（配列番号１）から成る。
かかる構築物によれば、上記外来物質を真核細胞の外部から当該細胞の内部（例えば、少なくとも細胞質）に導入することができる。

いくつかの態様では、上記外来物質はポリペプチド、核酸、色素および薬剤から成る群より選択される少なくとも１種の有機化合物である。これにより、多様な機能を有する有機化合物を真核細胞内に導入することができる。

いくつかの態様では、上記外来物質は、上記ペプチドフラグメントのＣ末端側に配置される。これにより、構築物を効率よく真核細胞の内部へ導入することができる。

また、本開示により、真核細胞の外部から少なくとも該細胞の細胞質内に目的とする外来物質をインビトロまたはインビボにおいて導入する方法が提供される。ここで開示される方法は、（１）ここで開示される構築物を用意する工程と、（２）上記構築物を、目的とする真核細胞を含む試料中に供給する工程とを包含する。これにより、目的とする外来物質を真核細胞の内部に導入することができる。

いくつかの態様では、上記構築物を導入する対象の真核細胞が哺乳類細胞である。これにより、哺乳類細胞の内部に目的とする外来物質を導入することができる。

図１は、ＮＳＣ－３４細胞の培養液に対し、例１～８の構築物またはＦＡＭを添加して培養した後、当該細胞をフローサイトメータにより解析することで得られた各例の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示すグラフである。

以下、ここで開示される技術のいくつかの実施形態について説明する。本明細書において特に言及している事項以外の事柄であって、本技術の実施に必要な事柄（例えばペプチドの化学合成法、細胞培養技法、ペプチドや核酸を成分として含む構築物の調製に関するような一般的事項）は、細胞工学、生理学、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、遺伝学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。
また、ここで開示される技術は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。なお、本明細書において、アミノ酸をIUPAC-IUBガイドラインで示されたアミノ酸に関する命名法に準拠した１文字表記で表す場合がある。なお、本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸を包含する用語である。

また、本明細書において、「合成ペプチド」とは、そのペプチド鎖がそれのみ独立して自然界に安定的に存在するものではなく、人為的な化学合成あるいは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって製造され、所定の組成物中で安定して存在し得るペプチド（ペプチドフラグメント）をいう。ここで「ペプチド」とは、１または複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマー（ダイマー、トリマー、オリゴマーを含む）を指す用語であり、アミノ酸残基の数によって限定されない。

また、本明細書において、ペプチドまたはタンパク質を構成するアミノ酸残基は、特に断りがない限り、Ｌ体であってもよく、Ｄ体であってもよい。
なお、本明細書中に記載されるアミノ酸配列は、常に左側がＮ末端側であり右側がＣ末端側を表す。

いくつかの態様において、ここで開示されるペプチドフラグメントは、アミノ酸配列：ＲＲＲＲＳＮＲＲＧ（配列番号１）を含む。また、ペプチドフラグメントは、例えば、アミノ酸配列：ＲＲＲＲＳＮＲＲＧ（配列番号１）から成る。ここで開示されるペプチドフラグメントは、例えば、合成ペプチドである。

上述した特許文献１～３には、アミノ酸配列：ＲＲＲＲＲＲＧ（配列番号２）から成る細胞膜透過性ペプチドが開示されている。本発明者は、当該細胞膜透過性ペプチドの細胞膜透過性を向上させるため、鋭意検討を行い、ここで開示されるペプチドフラグメントを創出した。後述する試験例からも明らかなように、ここで開示されるペプチドフラグメントは、配列番号２から成る細胞膜透過性ペプチドよりも優れた細胞膜透過性を発揮する。そのため、ここで開示されるペプチドフラグメントを含む構築物は、真核細胞の細胞膜の外部から内部へと効率よく導入される。

ここで開示されるペプチドフラグメントのアミノ酸残基の数は、細胞膜透過性を損なわれない限りにおいて限定されるものではない。ペプチドフラグメントを構成するアミノ酸残基の数は、例えば、１２以下、１１以下、または１０以下であり得る。

また、ここで開示されるペプチドフラグメントは、細胞膜透過性を損なわない限りにおいて、配列番号１の改変配列を含んでもよい。ここで、「改変配列」とは、１個または数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列（改変アミノ酸配列）である。
本明細書における改変配列の典型例としては、例えば、１個、２個または３個のアミノ酸残基が保守的に置換したいわゆる同類置換（conservative amino acid replacement）によって生じた配列や、所定のアミノ酸配列について１個、２個または３個のアミノ酸残基が付加（挿入）した若しくは欠失した配列等が挙げられる。同類置換の典型例としては、例えば、塩基性アミノ酸残基が別の塩基性アミノ酸残基に置換した配列（例えばアルギニン残基とリジン残基との相互置換）等が挙げられる。

ここで開示される構築物は、ここで開示されるペプチドフラグメントと、外来物質とを含む。外来物質は、ペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合している。

構築物は、例えば、ペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に、外来物質を直接的または間接的に結合（連結）することによって設計・構築される。ペプチドフラグメントと外来物質とが間接的に結合している場合には、例えば、ペプチドフラグメントと外来物質との間にリンカーが配置される。リンカーは、特に限定されるものではないが、ペプチド性リンカーであってもよく、非ペプチド性リンカーであってもよい。また、ペプチド性リンカーと非ペプチド性リンカーの併用であってもよい。なお、ペプチドフラグメントと外来物質を直接的または間接的に結合する方法は、特に限定されず、従来公知の種々の科学的手法に従って実施することができる。

ペプチド性リンカーは、１または２以上のアミノ酸残基で構成され得る。ペプチド性リンカーを構成するアミノ酸残基の数は、特に限定されない。ペプチド性リンカーを構成するアミノ酸残基の数は、例えば、１以上または２以上である。また、ペプチド性リンカーを構成するアミノ酸残基の数は、例えば、１０以下または５以下である。いくつかの態様において、ペプチド性リンカーを構成するアミノ酸配列は、立体障害を生じさせず、かつ、柔軟なアミノ酸配列である。このようなペプチド性リンカーは、例えば、グリシン、アラニン、及び／又はセリンを含み得る。また、いくつかの態様において、ペプチド性リンカーはβアラニンを含み得る。

非ペプチド性リンカーとしては、特に限定されるものではないが、例えばアルキルリンカー、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）リンカー、アミノヘキサノイルスペーサ等が挙げられる。また、非ペプチド性リンカーとして、ホモ二官能性基またはヘテロ二官能性基を備える架橋剤を用いてもよい。架橋剤が有する一般的な官能基としては、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド活性化エステル（ＮＨＳエステル）、マレイミド、アジドおよびヨードアセトアミド等が挙げられる。このなかでも、ＮＨＳエステルは、アミンと中性以上のｐＨで効率良く反応して結合することができる。また、マレイミドは、ＳＨ基と選択的に反応して結合することができる。例えば、マレイミドを含む架橋剤を使用する場合には、システイン残基をペプチドフラグメントのＮ末端またはＣ末端にリンカーとして付加する、若しくは、Ｎ末端またはＣ末端にシステイン残基を備えるペプチドフラグメントを準備することでペプチドフラグメントと架橋剤との結合を容易に実現できる。

ホモ二官能性基を有する好適な架橋剤としては、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ^３）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ－ＥＧＳ）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ－ＤＳＴ）等が挙げられる。特に、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ^３）を好ましく使用し得る。

また、ヘテロ二官能性基を有する好適な架橋剤としては、Ｎ－（６－マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スクシンイミジル４－［マレイミドフェニル］ブチレート（ＳＭＰＢ）、スクシンイミジル４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ－（γ－マレイミドブチロキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、ｍ－マレイミドプロピオニックアシド－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＰＳ）及びＮ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）等を好ましく用いることができる。特に、反応性官能基にＮＨＳエステルおよびマレイミドを備えたＥＭＣＳやＭＢＳを好ましく用いることができる。

外来物質は、真核細胞内に導入可能な分子サイズおよび化学的性質を有しているものであれば特に限定されず、例えば、有機化合物または無機化合物であり得る。有機物は、例えば、アミノ酸、ポリペプチド、核酸、色素、薬剤等を含む。外来物質は、１種を単独で含んでもよく、２種以上を含んでもよい。外来物質を２種以上含む場合には、ペプチドフラグメントのＮ末端側またはＣ末端側に２種以上の外来物質が結合していてもよい。また、ペプチドフラグメントのＮ末端側およびＣ末端側にそれぞれ１種または２種以上の外来物質が結合していてもよい。

外来物質がポリペプチドの場合、採用するポリペプチド（アミノ酸配列）は、特に限定されない。本明細書において、「ポリペプチド」とは、複数のアミノ酸がペプチド結合により結合した構造を有するポリマー（ダイマー、トリマー、オリゴマーを含む）をいう。ペプチド結合の数（即ち、アミノ酸残基数）によって限定されない。ポリペプチドとして、例えばアミノ酸残基数が２～１００程度のペプチド、アミノ酸残基数が１００～３００程度のポリペプチド、若しくはタンパク質（典型的には３００以上のアミノ酸残基から成る高分子化合物）のような、比較的アミノ酸残基数が多いものも外来物質として採用し得る。当該分野においては、ポリペプチドとタンパク質とは厳密に区分されるものではない。
ポリペプチドを構成するアミノ酸残基数の上限は特に限定されないが、合成（生合成、化学合成）の容易性の観点から、例えば、１０００以下、６００以下、５００以下、４００以下、または３００以下であることが好ましい。

ポリペプチドは、種々の細胞や組織（器官）の発生、分化、増殖、がん化、ホメオスタシス（恒常性）、代謝の調節、等の機能にかかわるポリペプチドの成熟型あるいは前駆体（プロ型、プレプロ型を包含する。）であり得る。また、ポリペプチドは機能が従来知られていないポリペプチドであってもよい。ここで開示される技術により、機能が知られていないポリペプチドの細胞内（生体組織内）における機能の解明を行うことができる。

例えば、外来物質を導入する対象となる真核細胞が哺乳類細胞（ヒト又はその他哺乳動物）の幹細胞である場合、当該幹細胞の分化誘導に関与する種々の生理活性を有するポリペプチドの成熟型またはその前駆体の利用が好ましい。なお、「幹細胞」は、体性幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（Induced pluripotent stem cells：ｉＰＳ細胞）を包含する。また、外来物質を導入する対象となる真核細胞ががん細胞（腫瘍細胞）である場合、当該がん細胞（腫瘍細胞）のアポトーシス誘導に関与する種々のポリペプチドの利用が好ましい。あるいは、この場合においては、がん細胞（腫瘍細胞）が免疫監視機構の機能を抑制することを阻害し得るポリペプチドの利用が好ましい。さらに、導入の対象となる真核細胞が細菌感染細胞やウイルス感染細胞である場合、当該感染細胞のアポトーシス誘導に関与する種々のポリペプチドや、当該感染細胞において細菌もしくはウイルスが増殖することを抑制し得るポリペプチドや、当該感染細胞から細菌もしくはウイルスの感染が拡大することを抑制し得るポリペプチドの利用が好ましい。
なお、ペプチドフラグメントと同様、外来物質としてのポリペプチドは、その機能を保持する限りにおいて、１個または数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成される改変アミノ酸配列を含んでいてもよい。

外来物質がポリペプチドである場合には、例えば、該ポリペプチドを構成するアミノ酸配列と、ペプチドフラグメントを構成するアミノ酸配列とを含むようにペプチド鎖を設計し、該ペプチド鎖を生合成あるいは化学合成することによって、ポリペプチドをペプチドフラグメントに直接結合した構築物を作製することができる。

外来物質として採用される核酸の種類は、特に限定されるものではなく、例えば、いわゆる核酸医薬品を含み得る。本明細書において「核酸」とは、ヌクレオチドの重合体をいい、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＤＮＡとＲＮＡとの両方を含むＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド（ＤＮＡ－ＲＮＡキメラともいう。）を包含する。また、「核酸」は、塩基数によって限定されない。核酸は一本鎖（ヘアピン型一本鎖を含む）でもよく、二本鎖であってもよい。また、核酸を構成するヌクレオチドは、リン酸部、糖部、または塩基部に修飾基を含んでいてもよい。核酸医薬の種類は特に限定されず、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、ＣｐＧオリゴ等が挙げられる。

外来物質として採用される色素の種類は、特に限定されない。色素は、例えばＦＡＭやＦＩＴＣ等の種々の蛍光色素化合物を含み得る。構築物が色素を含むことで、構築物の導入が評価し易くなる。例えば、顕微鏡観察（例えば蛍光顕微鏡観察）、フローサイトメトリー、免疫化学的手法（例えばウエスタンブロットや免疫細胞染色等）等を使用して、真核細胞への導入効率を評価することができる。

外来物質として採用される薬剤の種類は、特に限定されない。薬剤は、例えば、５－フルオロウラシル（５ＦＵ）等の核酸系抗腫瘍剤を含む抗腫瘍剤やアジドチミジン（ＡＺＴ）等の抗ウイルス剤等の種々の有機化合物を含み得る。

構築物において、ペプチドフラグメントのＣ末端側に外来物質が結合している場合には、ペプチドフラグメントのＮ末端側のアミノ酸残基のα－アミノ基がアセチル化されていることが好ましい。詳細なメカニズムは不明だが、真核細胞中のタンパク質の多くはＮ末端側のアミノ酸のα－アミノ基はアセチル化修飾されるため、このような構成であれば、構築物の細胞内での安定性が向上し得る。

また、構築物は、Ｃ末端側のアミノ酸残基がアミド化されていることが好ましい。アミノ酸残基（典型的にはペプチド鎖のＣ末端アミノ酸残基）のカルボキシル基をアミド化すると、かかる構築物の細胞質内または核内における構造安定性（例えばプロテアーゼ耐性）が向上し得る。また、カルボキシル基がアミド化されることで、構築物の親水性が向上するため、かかる構築物の水系溶媒への溶解性を向上させることができる。かかる水系溶媒としては、例えば、水、種々の緩衝液、生理食塩水（例えばＰＢＳ）、細胞培養液等が挙げられる。
例えば、ペプチドフラグメントのＮ末端側に外来物質が結合している構築物の場合、ペプチドフラグメントのＣ末端側のアミノ酸残基のカルボキシル基がアミド化されていることが好ましい。また、例えば外来物質がポリペプチドであり、かかるポリペプチドがペプチドフラグメントのＣ末端側に結合している場合は、当該ポリペプチドのＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基をアミド化することが好ましい。

ペプチドフラグメントまたは構築物のうちペプチド部分（外来物質としてのポリペプチド、ペプチドフラグメント、及びペプチド性リンカー）は、例えば、一般的な化学合成法に準じて容易に製造することができる。例えば、従来公知の固相合成法又は液相合成法のいずれを採用してもよい。アミノ基の保護基としてＢｏｃ（t-butyloxycarbonyl）或いはＦｍｏｃ（9-fluorenylmethoxycarbonyl）を適用した固相合成法が好適である。即ち、市販のペプチド合成機を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾（Ｎ末端アセチル化、Ｃ末端アミド化等）部分を有する上記ペプチド部分を合成することができる。なお、上記方法でペプチド鎖の一部のみを合成してもよく、例えば、ペプチドフラグメントのみ、または、ペプチドフラグメントとペプチド性リンカー部分とを含むペプチド鎖を合成してもよい。

或いは、遺伝子工学的手法に基づいてペプチドフラグメントまたは構築物のペプチド部分を生合成により作製してもよい。即ち、所望するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始コドンを含む。）のポリヌクレオチド（典型的にはＤＮＡ）を合成する。そして、合成したポリヌクレオチド（ＤＮＡ）と該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含する。）とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。
一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするペプチドを細胞内で生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からペプチド部分を単離し、必要に応じてリフォールディング、精製等を行うことによって、目的のペプチド部分を得ることができる。
なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本技術を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。

また、構築物のペプチド部分の製造には、例えば、宿主細胞内で効率よく大量に生産させるために融合タンパク質発現システムを利用することができる。例えば、目的のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を化学合成し、該合成遺伝子を適当な融合タンパク質発現用ベクター（例えばノバジェン社から提供されているｐＥＴシリーズおよびアマシャムバイオサイエンス社から提供されているｐＧＥＸシリーズのようなＧＳＴ(Glutathione S-transferase)融合タンパク質発現用ベクター）の好適なサイトに導入する。そして該ベクターにより宿主細胞（典型的には大腸菌）を形質転換する。得られた形質転換体を培養して目的の融合タンパク質を調製する。次いで、該タンパク質を抽出及び精製する。次いで、得られた精製融合タンパク質を所定の酵素（プロテアーゼ）で切断し、遊離した目的のペプチド断片（即ち設計した人工ポリペプチド）をアフィニティクロマトグラフィー等の方法によって回収する。このような従来公知の融合タンパク質発現システム（例えばアマシャムバイオサイエンス社により提供されるＧＳＴ／Ｈｉｓシステムを利用し得る。）を用いることによって、目的のポリペプチド（人工ポリペプチド）を製造することができる。
或いは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型ＤＮＡ（即ち、構築物のペプチド部分のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片）を構築し、ペプチド部分の合成に必要な種々の化合物（ＡＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸類等）を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のペプチド部分をインビトロで合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文(Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット（例えば、日本の（株）セルフリーサイエンスから入手可能）が市販されている。

構築物のペプチド部分をコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドは、従来公知の方法によって容易に製造（合成）することができる。例えば、ペプチド部分を構成するアミノ酸残基に対応するコドンを選択することによって、かかるアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列が容易に決定され、提供される。そして、ひとたびヌクレオチド配列が決定されれば、ＤＮＡ合成機等を利用して、所望するヌクレオチド配列に対応するポリヌクレオチド（一本鎖）を容易に得ることができる。さらに得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、種々の酵素的合成手段（典型的にはＰＣＲ）を採用して目的の二本鎖ＤＮＡを得ることができる。また、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもよく、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）の形態であってもよい。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖で提供され得る。一本鎖で提供される場合は、コード鎖（センス鎖）であってもよく、それと相補的な配列の非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。こうして得られるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中で又は無細胞タンパク質合成システムにて、ペプチド生産のための組換え遺伝子（発現カセット）を構築するための材料として使用することができる。
なお、外来物質としての核酸についても、上述した製造方法と同様に準備することができる。

ここで開示される構築物は、外来物質の機能に基づく用途の組成物の有効成分として好適に使用し得る。なお、構築物は、外来物質の機能を失わない限りにおいて塩の形態であってもよい。例えば、常法に従って通常使用されている無機酸または有機酸を付加反応させることにより得られ得る酸付加塩を使用することができる。従って、本明細書および請求の範囲に記載の「構築物」は、かかる塩形態のものを包含し得る。

構築物は、使用形態に応じて医薬（薬学）上許容され得る種々の担体を含み得る組成物の有効成分として使用され得る。
上記担体としては、例えば、希釈剤、賦形剤等としてペプチド医薬において一般的に使用される担体が好ましい。かかる担体としては、外来物質導入用構築物の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶媒が挙げられる。また、かかる担体は、適当な濃度のアルコール（エタノール等）水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得、或いはリポソームであってもよい。また、医薬用組成物に含有させ得る副次的成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料等が挙げられる。

組成物の形態は、特に限定されない。例えば、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏などの形態が挙げられる。また、注射等に用いるため、使用直前に生理食塩水または適当な緩衝液（例えばＰＢＳ）等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
構築物（主成分）および種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の薬剤（組成物）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本技術を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修，Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。

本開示により、ここで開示される構築物を用いて、生体内（インビボ）、または、生体外（インビトロ）において真核細胞の外部から当該細胞の内部に目的とする外来物質を導入する方法が提供される。ここで、「真核細胞の内部」とは、細胞膜で囲まれた真核細胞の内側のことをいい、例えば、細胞質、サイトゾル、細胞内小器官（例えば、核、ミトコンドリア、小胞体、微小管、リソソーム、ゴルジ等）等を含む。ここで開示される方法では、例えば、構築物を真核細胞の少なくとも細胞質（さらには、細胞内小器官）に導入することができる。

ここで開示される方法では、おおまかにいって、以下の（１）～（２）の工程：
（１）ここで開示される構築物を用意する工程と、
（２）上記構築物を、目的とする真核細胞を含む試料中に供給する工程と
を包含する。また、ここで開示される方法では、さらに、上記（２）の工程の後、（３）の工程として、上記構築物が供給された試料をインキュベートして、該試料中の真核細胞の内部にかかる構築物を導入する工程を含み得る。

上記「真核細胞」は、インビボにおいては、例えば種々の組織、臓器、器官、血液、およびリンパ液等を包含する。上記「真核細胞」は、インビトロにおいては、例えば生体から摘出された種々の細胞塊、組織、臓器、器官、血液、およびリンパ液ならびに、セルライン等を包含する。真核細胞としては、例えば、哺乳類、鳥類、魚類、両生類、爬虫類、昆虫などの動物界由来の細胞、菌界由来の細胞、植物界由来の細胞等が挙げられるが、好ましくはヒトまたはヒト以外の哺乳動物の細胞（哺乳類細胞）であり得る。

ここで開示される方法は、例えば、ここで開示される構築物を含む組成物を準備して
、真核細胞を含む試料中に供給する。インビボにおいて、かかる組成物は、その形態および目的に応じた方法や用量で使用することができる。例えば、液剤として、静脈内、筋肉内、皮下、皮内若しくは腹腔内への注射によって患者（即ち生体）の患部（例えば悪性腫瘍組織、ウイルス感染組織、炎症組織等）に所望する量だけ投与することができる。あるいは、錠剤等の固体形態のものや軟膏等のゲル状若しくは水性ジェリー状のものを、直接所定の組織（即ち、例えば腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、炎症細胞等を含む組織や器官等の患部）に投与することができる。あるいは、錠剤等の固体形態のものは経口投与することができる。経口投与の場合は、消化管内での消化酵素分解を抑止すべくカプセル化や保護（コーティング）材の適用が好ましい。

生体外（インビトロ）においては、培養している真核細胞に対し、構築物または組成物の適当量を、少なくとも１回、目的とする真核細胞の培養液に供給するとよい。１回当たりの供給量および供給回数は、培養する真核細胞の種類、細胞密度（培養開始時の細胞密度）、継代数、培養条件、培地の種類、等の条件によって異なり得るため特に限定されない。例えば、培養液中のペプチドフラグメント濃度が概ね０．０５μＭ以上１００μＭ以下の範囲内、例えば０．５μＭ以上５０μＭ以下の範囲内、また例えば１μＭ以上３０μＭ以下の範囲内となるように１回、２回またはそれ以上の複数回添加することが好ましい。また、構築物添加後のインキュベート時間についても、真核細胞の種類及び各種条件により異なり得るため特に限定されない。例えば、０．５時間以上、１時間以上、４時間以上、８時間以上、２０時間以上であり得る。なお、インキュベートの条件についても、真核細胞の種類により異なり得るため、特に限定されるものではないが、例えば、５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃下でインキュベートすることができる。
なお、インビトロにおける導入方法について、一例を後述の試験例において示している。

以上の通り、ここで開示される技術の具体的な態様として、以下の各項に記載のものが挙げられる。
項１：アミノ酸配列：ＲＲＲＲＳＮＲＲＧ（配列番号１）を含み、アミノ酸残基の合計が１０以下である、ペプチドフラグメント。
項２：アミノ酸配列：ＲＲＲＲＳＮＲＲＧ（配列番号１）から成る、項１に記載のペプチドフラグメント。
項３：ペプチドフラグメントと、記ペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した外来物質とを含む構築物であって、上記ペプチドフラグメントが、アミノ酸配列：ＲＲＲＲＳＮＲＲＧ（配列番号１）から成る、構築物。
項４：上記外来物質が、ポリペプチド、核酸、色素および薬剤から成る群より選択される少なくとも１種の有機化合物である、項３に記載の構築物。
項５：上記外来物質が、上記ペプチドフラグメントのＣ末端側に結合している、項３または４に記載の構築物。
項６：真核細胞の外部から該細胞の内部に目的とする外来物質をインビトロにおいて導入する方法であって、
（１）項３～５のいずれか一項に記載の構築物を用意する工程と、
（２）上記構築物を、目的とする真核細胞を含む試料中に供給する工程と
を含む方法。
項７：上記構築物を導入する対象の上記真核細胞が哺乳類細胞である、項６に記載の方法。

以下、ここで開示される技術に関するいくつかの試験例を説明するが、ここで開示される技術をかかる試験例に示すものに限定することを意図したものではない。

＜構築物の準備＞
例１～８において、それぞれ表１に示す構築物を準備した。表１に示すように、各例において、配列番号１～８のいずれかから成るペプチドフラグメント（合成ペプチド）と、該ペプチドフラグメントのＣ末端に結合した蛍光色素であるＦＡＭ（Ｃ_２１Ｈ_１２Ｏ_７：5(6)-Carboxyfluorescein、分子量３７６．３、励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）とから構成される構築物を準備した。なお、各例において、ペプチドフラグメントのＮ末端のアミノ酸残基のアミノ基はアセチル化されたものを準備した。また、各例の構築物をそれぞれジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、構築物の濃度が２ｍＭのサンプル溶液を調製した。また、蛍光色素のＦＡＭをＤＭＳＯで溶解した２ｍＭのＦＡＭ溶液を調製した。以下、説明のため、例Ｘで用いる構築物を構築物Ｘ、サンプル溶液をサンプル溶液Ｘと呼称する。

＜細胞膜透過性の評価＞
真核細胞としてＮＳＣ－３４細胞（mouse motor neuron-like hybrid cell line）を使用し、上記調製した構築物の細胞膜透過性を評価した。

（例１）
ＮＳＣ－３４細胞を培養培地である１０％ＦＢＳ（fetal bovine serum）含有ＤＭＥＭ（Dulbecco’s modified Eagle’s medium（富士フィルム和光純薬株式会社製、Cat No. 044-29765））で培養した。
培養プレートに接着したＮＳＣ－３４細胞をＰＢＳで洗浄後、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を添加し、３７℃中で３分間インキュベートを行った。該インキュベート後、上記１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを加え、トリプシンを不活性化させた後、１５０×ｇで５分間の遠心分離を行い細胞を沈殿させた。遠心分離によって生じた上清を取り除いた後、沈殿（細胞ペレット）に上記１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを加え、凡そ２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。該細胞懸濁液を市販の６穴（ウェル）プレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社製）のウェルに１ｍＬ加え、細胞を播種し（凡そ２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ウェル）、細胞がウェルの底面に接着するまで２～３時間インキュベートした。その後、上記調製した２ｍＭサンプル溶液１を上記１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで希釈し、サンプル濃度が２０μＭのサンプル溶液１を準備した。そして、該ウェルに上記２０μＭサンプル溶液１を１ｍＬ添加した（即ち、ウェル中の培養液の構築物１の濃度が１０μＭ、ＤＭＳＯ濃度が０．５％となるようにした）。細胞を５％ＣＯ_２条件下で、３７℃で２０時間インキュベートを行った。

２０時間のインキュベート後、ウェルから培養上清を取り除き、１ｍＬのＰＢＳでウェル中の細胞を２回洗浄した。次に、ウェルに１００μＬの０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を添加し、３７℃中で３分間インキュベートを行った。該インキュベート後、ウェルに９００μＬの上記１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを添加することでトリプシンを不活性化し、ウェル中の細胞懸濁液をチューブに移して細胞を回収した。その後、さらに共洗いしてウェル中に残った細胞を上記チューブへと回収した。このチューブを４℃、２１０×ｇの条件で５分間遠心分離を行った。遠心分離後、上清を取り除き、沈殿（細胞ペレット）を１ｍＬのＰＢＳで懸濁（洗浄）し、上記と同じ条件で遠心分離を行った。そして、上清を取り除き、構築物含有培地で培養した細胞（細胞ペレット）を得た。

上記得られた細胞（細胞ペレット）について、フローサイトメータを用いて細胞膜透過性の解析を行った。フローサイトメータとして、Ｏｎ－ＣｈｉｐＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ(On-Chip Biotechnologies Co., LTD.）製）を使用した。
かかる解析のために、上記得られた細胞ペレットを５０μＬのＯｎ－ｃｈｉｐＴｂｕｆｆｅｒで懸濁し、解析用の細胞懸濁液を用意した。

上記のフローサイトメータを用いて前方散乱（ｆｏｒｗａｒｄｓｃａｔｔｅｒ：ＦＳＣ）および側方散乱（ｓｉｄｅｓｃａｔｔｅｒ：ＳＳＣ）に基づくゲーティングを行い、解析対象とする細胞集団についてのゲートを設定し、かかるゲート内の細胞集団について、蛍光強度を測定した。なお、解析する該細胞集団の細胞数が凡そ１００００個となるように設定し、解析を行った。蛍光強度の測定には、ＦＡＭの蛍光波長を検出可能な上記フローサイトメータの蛍光検出器ＦＬ２（最適検出波長５４３ｎｍ付近）を使用した。かかる測定結果について、市販の解析ソフト「ＦｌｏｗＪｏ」（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）を用いて解析を行い、測定対象細胞集団の平均蛍光強度（ｍｅａｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙ：ＭＦＩ）を得た。

（例２～８）
例２～８では、サンプル溶液１の代わりにサンプル溶液２～８のいずれかを用いた以外は例１と同様に実施した。

（例９）
例９では、サンプル溶液１の代わりにＦＡＭ溶液を使用した以外は例１と同様に実施した。なお、かかるＦＡＭ溶液の濃度はサンプル溶液１の濃度（即ち、ウェル中の培養液のＦＡＭ濃度が１０μＭ、ＤＭＳＯ濃度が０．５％）と同じになるように用いた。

例１～９で得られたＭＦＩの結果を表１および図１に示す。

上述したように、例８において用いた構築物に含まれるペプチドフラグメントは特許文献１～３等で開示されている細胞膜透過性ペプチドである。本試験では、このペプチドフラグメントの末端またはアミノ酸残基の間にＳＮ（セリン上記－アスパラギン残基）を付加または挿入を行い、細胞膜透過性の評価を行った。その結果、表１および図１に示すように、驚くべきことに、例５で用いたアミノ酸配列：ＲＲＲＲＳＮＲＲＧから成るペプチドフラグメントを含む構築物において、特に優れた細胞膜透過性を発揮することがわかった。

なお、詳細なデータは示していないが、本発明者の検討によって、ＲＲＲＲＳＮＲＲＧから成るアミノ酸配列から成るペプチドフラグメントと、外来物質としてポリペプチド、核酸、または薬剤を外来物質として含む構築物は、効率よく真核細胞の外部から当該細胞の内部に導入されることが確認された。

以上、ここで開示される技術の具体例を詳細に説明したが、これらは例示にすぎず、請求の範囲を限定するものではない。請求の範囲に記載の技術には、以上に例示した具体例を様々に変形、変更したものが含まれる。

本開示によれば、真核細胞（特に細胞壁を有しないヒトやそれ以外の哺乳動物に代表される種々の動物細胞）の外部から当該細胞の内部に、目的とする外来物質を導入可能なペプチドフラグメント及び該ペプチドフラグメントを有する構築物が提供される。かかる構築物を利用することにより、目的の細胞に目的の外来物質を効果的に導入させ、該外来物質が導入された細胞並びに器官等の生体組織を得ることができる。また、ここで開示されるペプチドフラグメント又は構築物をドラッグデリバリー技術に利用し、各種疾患に対する治療薬（例えば、眼科治療等の治療薬）が提供することができ得る。また、外用薬（例えば、点眼薬等）の有効成分又は添加物として、ここで開示されるペプチドフラグメント又は構築物を利用することができ得る。

Claims

アミノ酸配列：ＲＲＲＲＳＮＲＲＧ（配列番号１）から成る、ペプチドフラグメント。
ペプチドフラグメントと、
前記ペプチドフラグメントのＮ末端側又はＣ末端側に結合した物質と
を含む構築物であって、
前記ペプチドフラグメントが、アミノ酸配列：ＲＲＲＲＳＮＲＲＧ（配列番号１）から成り、
前記物質が、ポリペプチド、核酸、色素および薬剤から成る群より選択される少なくとも１種の有機化合物である、構築物。
前記物質が、前記ペプチドフラグメントのＣ末端側に結合している、請求項２に記載の構築物。
真核細胞の外部から該細胞の内部に目的とする物質をインビトロにおいて導入する方法であって、
（１）請求項２～３のいずれか一項に記載の構築物を用意する工程と、
（２）前記構築物を、目的とする真核細胞を含む試料中に供給する工程と
を含む方法。
前記構築物を導入する対象の前記真核細胞が哺乳類細胞である、請求項４に記載の方法。