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KR101841241B1 - 피부 질환에 대한 예방 또는 치료효과를 갖는 펩티드 융합체 및 이를 유효성분으로 하는 약학 조성물 - Google Patents

피부 질환에 대한 예방 또는 치료효과를 갖는 펩티드 융합체 및 이를 유효성분으로 하는 약학 조성물 Download PDF

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KR101841241B1
KR101841241B1 KR1020160116282A KR20160116282A KR101841241B1 KR 101841241 B1 KR101841241 B1 KR 101841241B1 KR 1020160116282 A KR1020160116282 A KR 1020160116282A KR 20160116282 A KR20160116282 A KR 20160116282A KR 101841241 B1 KR101841241 B1 KR 101841241B1
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한양대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 새로운 피부 투과성 펩티드 및 그를 이용한 생물학적 활성 물질이 결합된 융합제, 그를 포함하는 화장료 조성물 및 피부외용제용 약학 조성물을 제공하기 위한 것이다. 본 발명의 피부 투과성 펩티드는 종래 피부 투과성 펩티드에 비하여 면역 반응을 일으킬 가능성이 낮고, 현저히 개선된 피부 투과능을 나타내므로, 생물학적 활성 물질을 피부, 특히 각질층을 통해 효율적으로 전달시킬 수 있다.

Description

피부 질환에 대한 예방 또는 치료효과를 갖는 펩티드 융합체 및 이를 유효성분으로 하는 약학 조성물{fusion peptides associated with inflammatory skin disease and phamaceutical composition comprising the same}
본 발명은 경피 투여로도 효과적으로 피부 질환에 대한 우수한 예방 및 치료효과를 갖는 펩티드 융합체에 관한 것이다.
피부는 외부의 환경과 항상 접하고 있는 조직으로, 체액 누출 및 감염 방지, 수분 소실을 막는 보호장벽으로서 역할은 한다. 특히 표피의 각질층은 피부에서도 가장 바깥쪽에 존재하면서 피부 밖으로의 수분과 전해질의 소실을 억제함으로써 피부의 건조를 막고, 피부의 정상적인 생화학적 대사를 할 수 있는 환경을 제공하여, 외부의 물리적 손상과 화학물질로부터 인체를 보호하고, 세균, 곰팡이, 바이러스 등이 피부로 침범하는 것을 방지하는 중요한 역할을 한다(Bouwstra J. A, Honeywell-Nguyen P. L. Gooris G. S. and Ponec M. Prog Lipid Res. 42:1-36(2003)).
이러한 피부를 통한 흡수 경로는 각질층을 통한 흡수, 모낭과 피지선을 통한 흡수, 땀샘을 통한 흡수 등 3가지 경로가 있다(Prausnitz M. R. and Langer R. Nat Biotech. 26:1261-1268 (2008)). 피부를 통한 생리 활성 분자의 전달은 피부의 구조적, 물리적 특성상 여러 가지 제한을 받으며, 현재까지 알려진 바로는 각질층을 통한 흡수가 가장 중요한 흡수 경로로 알려져 있다. 특히, 피부 각질층은 피부의 주요 구성 세포인 각질형성세포(keratinocyte)가 자연사 되어 피부의 최외각층에 치밀한 구조를 이루고 있으며, 수분의 증발뿐만 아니라 외부물질의 침투를 억제하며, 땀과 각종 지질 성분으로 인하여 pH 5 부근의 산성도를 보이고 있다. 이러한 각질층 장벽을 투과하기 위해서는 분자량이 500 Da 이하로 작아야 하고, 친지질 특성을 보유하고 있어야 가능하다(Metha R. C. and Fitzpatrick R.E. Dermatol. Ther. 20:350-359 (2007)).
화장품 원료로 빈번하게 사용되는 분자량 500 Da 이하의 저분자 합성 화합물이나 천연 화합물들은 쉽게 세포 내로 전달 될 수 있다고 알려져 있으나, 피부 장벽을 구성하는 각질층의 고유 특성으로 인하여 저분자량 물질들의 투과 효율 역시 낮으며, 분자량 500 Da 이상의 단백질, 펩티드 및 핵산과 같은 거대 분자들은 분자량의 크기 때문에 이중 지질막 구조로 되어 있는 세포막 안으로 더욱더 투과하기 어렵다. 이러한 저분자 및 거대 분자들이 세포의 원형질막을 통과하는 효율을 증폭시키기 위한 방법으로서, 최근 관심이 고조되고 있는 것이 피부를 통한 투여 방법(Transdermal drug delivery, TDD)이다(Prausnitz M. R. and Langer R. Nat Biotech. 26:1261-1268 (2008)). 그러나, 피부를 통한 투여 방법의 가장 큰 장벽은 각질층 내의 각질형성세포와 이들 사이의 각질세포간 지질이다. 대부분의 피부에서 생리학적으로 활성을 나타내는 분자(이하, 피부 생리 활성 분자)들은 피부 각질층의 저항성 때문에 경피 투과율이 낮아지게 된다.
이러한 피부 생리 활성 분자의 경피 투과율을 촉진시킬 수 있는 다양한 방법들이 연구되어 왔는데, 최근 세포 투과성 펩티드를 이용한 전달 시스템에 많은 관심이 집중되고 있다. 세포 투과성을 갖는 펩티드의 사용은 여러 장점을 갖는데, 이는 주로 상시 펩티드 서열에 이루어질 수 있는 다양한 변형에 기인한다. 이는 다른 세포 하부 도메인을 지정할 수 있으며, 다양한 형태의 화물 분자들(cargo molecules)을 운반할 수 있는 담체의 조작을 가능케 한다.
대표적인 세포막 투과성 펩티드를 예로 들면 HIV-1(Human immunodeficiency virus-1)의 감염 기작 중 하나로 TAT라는 물질의 세포막을 투과하는 현상이 확인된 첫 번째 단백질로써, 이로부터 유래한 'YGRKKRRQRRR'에 해당하는 TAT 펩티드는 가장 많이 적용되고 활발한 연구가 진행되고 있다(Mann, D. A. et al., Embo J 10 : 1733-1739, 1991). TAT 펩티드를 이용하여 β-galactosidase, horseradish peroxidase, RNase A, domain of Pseudomonas exotoxin A (PE)등을 세포 내로 전달해서 그 기능과 세포 내의 localization에 대한 연구가 진행된 바 있고(Fawell, S. et al., PNAS 91 : 664-668, 1994), TAT 펩티드는 세포막에 존재하는 Heparan sulfate와의 상호작용 후 발생하는 Lipid Raft가 관여하는 엔도시토시스(Endocytosis)에 의한 것임을 밝혀졌다(Jehangir S. W. et al., Nature Med 10 : 310 - 315, 2004).
이 외에도, 초파리의 발생과정에 필수적인 전사인자인 Antennapedia homeoprotein으로부터 유래한 16개의 아미노산 서열로 구성된 Penetratin (Antp)이라는 세포 투과성 펩티드, HSV-1 (Herpes simplex virus type 1)이 발현하는 단백질인 VP22로부터 유래한 동명의 세포 투과성 펩티드 VP22, 인공적으로 합성해낸 27개의 아미노산 서열로 이루어진 Transportan, 세포 투과성 펩티드에서 가장 중요한 기능을 담당할 것이라고 예상되는 아르기닌을 인공적으로 반복시킨 폴리아르기닌 (Poly-Arginine) 등이 세포 투과성 펩티드로 잘 알려져 있다.
이러한 종래 세포 투과성 펩티드들은 HIV-1과 같은 바이러스 단백질로부터 유래한 서열이거나, 초파리와 같은 다른 종이 발현하는 단백질로부터 유래한 것들이거나, 종래 세포 투과성 펩티드를 구성하는 아미노산 서열 분석을 통해 특징적인 아미노산 서열을 선정, 인공적으로 합성해 낸 아미노산 서열이라는 점에서, 인체에 적용해서 사용할 때에 면역 반응 등의 부작용을 일으킬 소지가 있었다.
또한 이들은 비교적 긴 아미노산 사슬로 이루어져 있어서 원치 않는 면역반응을 일으킬 가능성이 더 크고, 전달하고자 하는 단백질의 구조 및 기능에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 세포 내로 전달하고자 하는 생물학적 활성 물질과 연결할 때에 효율이 저하되는 문제가 있었다.
본 발명의 발명자들은 소뇌를 발달시키고 신경의 이동에 관여하는 신경단백질의 하나인 인간 ASTN1(Astroractin 1) 단백질에서 유래한 펩티드 서열이 세포 투과성 펩티드인 TAT나 종래 공지된 피부 투과성 펩티드에 비하여 표피세포 또는 피부 조직의 투과 효율이 현저히 우수하다는 증명함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국공개특허 제10-2015-0056022호 한국공개특허 제10-2013-0070607호
본 발명은 종래 분자량의 크기 또는 피부 각질층의 고유 특성으로 인해 피부 표면에 직접적인 투여를 통해서는 달성하기 어렵던, 염증성 피부 질환의 예방 또는 치료 문제를 해결함과 동시에, 종래 펩티드에 비하여 면역 반응을 일으킬 가능성이 낮고, 현저히 개선된 피부 투과능을 나타내는 펩티드 융합체를 제공하기 위한 것이다.
또한 본 발명은 피부, 특히 각질층을 통해 효율적으로 피부 질환을 치료 또는 예방할 수 있는 화장료 조성물 또는 피부 염증성 질환의 치료 및 예방을 위한 피부외용제용 약학 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 서열번호 1 내지 12로 이루어진 아미노산 서열 중에서 선택되는 어느 하나의 피부 투과성 펩티드; 및 서열번호 20으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 rPTP 펩티드;가 결합된 융합체를 제공한다.
본 발명은 상기 융합체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명은 상기 융합체를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 융합체를 유효성분으로 포함하는 피부외용제용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 피부외용제용 약학 조성물을 개체의 피부에 도포하여, 인간을 제외한 동물의 피부 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 융합체는 표피 세포주, 진피 세포주 및 피부 조직 내로 효과적으로 전달되어, 피부 질환을 야기하는 각종 염증성 사이토카인 신호뿐만 아니라 T 세포 활성 및 증식을 동시에 억제할 수 있기 때문에, 염증성 피부 질환 또는 상태를 치료, 예방 또는 개선하는데 매우 우수한 효능을 발휘한다.
또한 본 발명의 펩티드 융합체는 안정성과 피부 투과도가 매우 우수하며, 이러한 특성으로 인해 의약, 의약외품 및 화장품에 매우 유리하게 적용될 수 있다.
도 1은 제조예 2의 AP와 이것이 연결된 EGFP (AP-EGFP)를 코딩하는 PCR 산물인 789 bp의 이중사슬 DNA 절편을 1% 아가로스 젤 전기영동을 통해 확인한 사진이다.
도 2는 제조예 3의 AP-EGFP DNA 절편을 삽입하기 위하여 AP-EGFP DNA 절편 (789 bp)과 pRSET-b 벡터 (2.9 Kb)를 NheI과 HindIII 제한효소를 이용해 각각 효소반응 한 뒤, 1% 아가로스 젤 전기영동을 통해 DNA의 양을 확인한 사진이다.
도 3은 제조예 3의 AP-EGFP를 코딩하는 DNA 절편이 삽입된 pRSET-b 벡터를 DH5α 대장균주에 형질 전환시킨 후 평판 LB 배지에서 배양해 선택한 콜로니를 액체 LB 배지에 접종하여 배양한 후 플라스미드 Mini preparation 과정을 통해 분리해 낸 DNA를 1% 아가로스 젤 전기영동 사진이다.
도 4는 제조예 3의 분리한 플라스미드 DNA가 AP-EGFP를 코딩하는 DNA 절편 (789 bp)과 pRSET-b 벡터 (2.9 Kb)로 구성되었음을 NheI과 HindIII 제한효소를 이용해 효소 반응 한 뒤 1% 아가로스 젤 전기영동을 통해 확인한 사진이다.
도 5는 제조예 3의 AP-EGFP가 삽입된 pRSET-b 벡터의 구조를 보여주는 모식도이다.
도 6은 제조예 4의 정제한 AP-EGFP 단백질과 음성 대조군에 해당하는 세포 투과 펩티드가 연결되어 있지 않은 EGFP 단백질, 양성대조군에 해당하는 기존에 가장 널리 알려진 세포 투과 펩티드인 TAT-EGFP 단백질을 12% SDS 젤 전기영동을 통해 확인한 사진이다.
도 7은 실험예 1에서 Jurkat 세포 내로 AP-EGFP 단백질이 농도 의존적, 시간 의존적으로 전달되었음을 유세포분석기(flow cytometry)를 이용한 세포 내 형광 강도 분석을 통해 나타낸 그래프이다.
도 8은 실험예 2에서 AP가 Jurkat 세포 내로 단백질을 전달하는 효율을 종래의 세포 투과 펩티드들을 양성 대조군으로 설정하여 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다.
도 9는 실험예 3에서 AP가 Jurkat 세포 내로 단백질을 전달하는 효율을 종래의 피부 투과 펩티드들을 양성 대조군으로 설정하여 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다.
도 10은 실험예 4에서 AP가 피부 표피 세포주인 HaCaT 세포 내로 단백질을 전달하는 효율을 종래의 세포 투과 펩티드들을 양성대조군으로 설정하여 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다.
도 11은 실험예 4에서 AP가 피부 진피 세포주인 NIH3T3 세포 내로 단백질을 전달하는 효율을 종래의 피부 투과성 펩티드들을 양성대조군으로 설정하여 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다.
도 12는 실험예 5에서 AP가 피부 표피 세포주인 HaCaT 세포 내로 단백질을 전달하는 효율을 종래의 피부 투과성 펩티드들을 양성 대조군으로 설정하여 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다.
도 13은 실험예 5에서 AP가 피부 진피 세포주인 NIH3T3 세포 내로 단백질을 전달하는 효율을 종래의 피부 투과성 펩티드들을 양성대조군으로 설정하여 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다.
도 14는 실험예 6에서 AP의 가장 많은 부분을 차지하고 있는 아미노산 서열인 아르기닌이 AP의 세포 내로 단백질을 전달하는 데에 미치는 영향을 아르기닌을 하나씩 없애는 대조군을 설정하여 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다.
도 15는 실험예 6에서 AP를 구성하는 아미노산 서열인 트립토판(X2), 시스테인, 라이신(X3 중 첫 번째 아미노산)이 AP의 세포 내로 단백질을 전달하는 데에 주는 영향을 확인하기 위하여 각각 알라닌으로 치환하여 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다.
도 16은 실험예 6에서 AP를 구성하는 아미노산 서열인 트립토판(X2), 시스테인, 라이신(X3 중 첫 번째 아미노산)이 AP의 세포 내로 단백질을 전달하는 데에 주는 영향을 확인하기 위하여 각각 아르기닌으로 치환하여 유세포분석기(flow cytometry)를 통해 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다.
도 17은 실험예 7에서 온도 및 배지 내 혈청 (serum)농도의 변화에 따른 AP의 세포 내 전달 효율의 변화를 종래의 세포 투과 펩티드들을 양성 대조군으로 이용하여 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다.
도 18은 실험예 8에서 Heparin과 MβCD (Methyl-beta-cyclodextrin)의 농도의 변화에 따른 AP-EGFP의 세포 내 전달 효율의 변화를 종래의 세포 투과 펩티드들을 양성 대조군으로 이용하여 비교 분석한 그래프이다.
도 19는 실험예 9에서 HeLa 세포 내부로 AP-EGFP가 전달되었음을 보여주는 형광 현미경 사진이다.
도 20은 실험예 10에서 AP가 피부 표피 세포주인 HaCaT 세포 내로 단백질을 전달하는 효율을 종래의 세포 투과 펩티드들을 양성대조군으로 설정하여 공초점 현미경을 통해 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 및 세포 내 위치 이미지이다.
도 21은 실험예 10에서 AP가 피부 진피 세포주인 NIH3T3 세포 내로 단백질을 전달하는 효율을 종래의 세포 투과 펩티드들을 양성대조군으로 설정하여 공초점 현미경을 통해 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 및 세포 내 위치 이미지이다.
도 22는 실험예 11에서 쥐의 각 장기 세포 내부로 AP-EGFP가 전달되었음을 보여주는 형광 현미경 사진이다.
도 23은 실험예 12에서 시간에 따른 AP-EGFP의 쥐의 피부조직으로 전달 효율 변화와 종래의 세포 투과 펩티드를 양성 대조군으로 이용하여 비교 분석한 형광 현미경 사진이다.
도 24는 실험예 13에서 쥐의 피부로의 AP-dTomato와 종래 피부 투과성 펩티드들과의 단백질의 전달 효율 비교 분석한 형광 현미경 사진이다.
도 25는 실험예 14에서 녹색 형광 단백질 적중 쥐의 피부에 AP-dTomato가 전달되었음을 확인하기 위한 공초점 현미경 사진이다.
도 26은 도 25의 확대 사진이다.
도 27은 제조예 4로부터 정제한 AP-EGFP 단백질과 제조예 7에서 정제한 AP-rPTP 단백질을 12% SDS 젤 전기영동을 통해 확인한 사진이다.
도 28은 실험예 16에서 AP-rPTP 단백질의 3차원 구조를 예측하여 나타낸 도면이다.
도 29는 실험예 17에서 AP-EGFP 단백질과 AP-rPTP 단백질의 phosphatase 활성을 확인하기 위한 그래프이다.
도 30은 실험예 18에서 AP-rPTP가 피부 표피 세포주인 HaCaT 세포 내로 단백질을 전달하는 효율을 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 분석한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다.
도 31은 실험예 19에서 AP-rPTP가 피부 표피 세포주인 HaCaT 세포 내로 시간에 따라 단백질을 전달하는 효율을 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다.
도 32는 실험예 20에서 AP-rPTP 단백질이 처리된 마우스 비장세포(splenocytes)에서 사이토카인(cytokines) 자극에 의한 영향을 측정하여 나타낸 이미지이다.
도 33a, b는 실험예 21에서 NA 또는 PBS 처리한 일차 마우스 CD4-T 세포들('NA' 및 'α-CD3αCD28+PBS')에서의 증식을 측정한 그래프이고, 도 33c는 실험예 21에서 일차 마우스 CD4-T 세포들에서 AP-rPTP 단백질을 처리하였을 때의 CD4 T 세포 증식을 조사하여 나타낸 그래프이다.
도 34는 실험예 22에서 AP-rPTP 및 AP-EGFP 단백질에 따른 마우스 비장세포에서의 사이토카인 발현양(IL-17(a), IL-13(b), IFN-γ(c) 및 IL2(d))을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 35는 실험예 23의 Oxazolone 유도 접촉성 피부염 동물모델 계획을 나타낸 도면이다.
도 36은 실험예 23에서 감작 6일 후 접촉성 피부염을 유도한 귀의 형태적 모습을 관찰한 결과 AP-rPTP 처리군의 쥐 귀의 염증이 저해된 것을 확인할 수 있는 사진이다.
도 37은 실험예 23에서 AP-rPTP를 처리한 쥐 그룹의 귀 두께가 대조군인 PBS 처리 쥐 그룹에 비해 감소한 것을 나타낸 그래프이다.
도 38은 실험예 23에서 AP-rPTP를 처리한 쥐 그룹의 귀 무게가 대조군인 PBS 처리 쥐 그룹에 비해 감소한 것을 타나낸 그래프이다.
도 39는 실험예 23에서 AP-rPTP를 처리한 쥐 그룹의 귀와 대조군인 PBS를 처리한 쥐 그룹의 귀를 H&E 염색법으로 염색하여 귀 두께의 차이를 광학현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 40은 실험예 24에서 Oxazolone 유도 접촉성 피부염 동물모델의 피부로부터 사이토카인(IL-1β, IL-6)의 mRNA 발현양을 측정하여 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 41은 실험예 24에서 Oxazolone 유도 접촉성 피부염 동물모델의 피부로부터 케모카인(CXCL2, CXCL5)의 mRNA 발현양을 측정하여 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 42는 실험예 25의 Ovalbumin(OVA) 유도된 만성(chronic) 피부염 동물모델 계획을 나타낸 도면이다.
도 43은 실험예 25에서 AP-rPTP를 처리한 쥐 그룹의 귀와 대조군인 PBS를 처리한 쥐 그룹의 귀를 H&E 염색법으로 염색하여 귀 두께의 차이를 광학현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 44는 상기 도 43의 H&E 염색 결과의 총 조직학적 수치를 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 45는 실험예 25에서의 동물모델의 피부 조직으로부터 IL-13 mRNA 발현량을 비교 분석한 결과 그래프이다.
도 46은 실험예 26의 이미퀴모드(imiquimod)로 유도된 건선(psoriasis-like) 피부염 동물모델 계획을 나타낸 도면이다.
도 47은 실험예 26에서 이미퀴모드(imiquimod)로 유도된 건선(psoriasis-like) 피부염 동물모델에 AP-rPTP와 AP-EGFP를 6일 동안 처리하는 동안의 귀 두께 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 48은 실험예 26에서 AP-rPTP 또는 AP-EGFP를 처리한 쥐 그룹의 귀와 음성대조군(Sham)의 귀를 H&E 염색법으로 염색하여 귀 두께의 차이를 광학현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 49는 실험예 26에서 AP-rPTP 또는 AP-EGFP를 처리한 쥐 그룹의 귀와 음성대조군(Sham)의 귀 조직 세포에서 측정된 사이토카인(IL-7A, IL-17F, IL-6) mRNA 발현량을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 50은 실험예 26에서 AP-rPTP 또는 AP-EGFP를 처리한 쥐 그룹의 귀와 음성대조군(Sham)의 귀 조직 세포에서 측정된 항균(antimicrobial) 펩티드(S100A8, S100A9) mRNA 발현량을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 51은 제조예 7로부터 발현 및 정제한 AP-rPTP 단백질을 12% SDS 젤 전기영동을 통해 확인한 사진이다.
도 52는 PTPN2 단백질(TC-PTP)로부터 설계된 재조합 펩티드(rPTP)와 피부 투과성 펩티드(AP)의 융합체의 구조를 나타낸 도면이다.
본 발명은 피부 투과성 펩티드와 PTPN2 단백질로부터 유래된 재조합 펩티드(rPTP)를 결합시켜, 경피 투여를 통해 피부 염증성 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 펩티드 융합체를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "펩티드 융합체 (fusion peptide)"는 하나 이상의 생리활성을 가진 저분자량의 펩티드인 rPTP 펩티드를 피부 투과성 펩티드 또는 하나 이상의 아미노산을 변이시킨 피부 투과성 펩티드 변이체의 N-말단 또는 C-말단에 결합시킨 새로운 분자 구성을 가진 펩티드 융합체를 의미한다.
상기 피부 투과성 펩티드는 (X1)n-X2-(시스테인)-(X3)m의 서열을 가지는 피부 투과성 펩티드일 수 있다.
상기 n은 3 내지 14 중의 어느 하나의 정수이고, 바람직하게는 3 내지 6 중의 어느 하나의 정수이며, 상기 m은 4 내지 14 중의 어느 하나의 정수이고, 바람직하게는 4 내지 7 중의 어느 하나의 정수이다.
상기 피부 투과성 펩티드는 바람직하게는 9 내지 14개, 더욱 바람직하게는 9 내지 12개, 가장 바람직하게는 9 내지 10개의 아미노산으로 이루어진다. 상기 하한치 미만에서는 세포 투과 효율이 급격히 감소하고, 상기 상한치를 초과할 경우에는 면역 반응을 일으킬 가능성이 높아진다.
상기 피부 투과성 펩티드에서 X1 및 X3은 각각 독립적으로 양전하 아미노산 중의 어느 하나로서, 아르기닌(Arg, R), 라이신(Lys, K) 또는 히스티딘(His, H)이며, 바람직하게는 아르기닌 또는 라이신이다. 상기 (X1)n은 X1에 해당하는 n개의 양전하 아미노산이 결합된 것으로, n개의 아미노산은 동일 아미노산이 n개 존재하는 것뿐만 아니라 각기 다른 양전하 아미노산이 n개 존재하는 것도 포함한다. 마찬가지로 상기 (X3)m은 각기 다른 양전하 아미노산이 m개 존재하는 것도 포함한다.
상기 피부 투과성 펩티드에서 X2는 무극성 또는 양전하 아미노산 중의 어느 하나로서, 알라닌(Ala, A), 글리신(Gly, G), 프롤린(Pro, P), 트립토판(Trp, W), 페닐알라닌(Phe, F), 로이신(Leu, L), 이소로이신(Ile, I), 메티오닌(Met, M), 발린(Val, V), 아르기닌(Arg, R), 라이신(Lys, K) 또는 히스티딘(His, H)이며, 바람직하게는 알라닌, 트립토판 또는 아르기닌이다.
상기 피부 투과성 펩티드는 더욱 바람직하게는 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 8 또는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진다.
상기 rPTP 펩티드는 생물학적 활성을 갖고 있는 펩티드인 PTPN2 단백질의 단편으로 이루어진 재조합 펩티드로, 피부를 통해 세포 내 또는 생체 내로 전달되어 생리적 현상과 관련된 활성 또는 치료 목적과 관련된 활성을 갖는 펩티드이다.
PTPN2 단백질은 T 세포 단백질 티로신 포르파타아제(phosphatase)로, TC-PTP라고도 불린다. 이는 JAK-STAT pathway와 관련된 사이토카인 수용체 신호(JAK1, JAK3, STAT1, STAT3, STAT5, STAT6)를 조절할 수 있는 효소로, Src 패밀리 티로신 키나아제(Lck, Fyn)과 같은 T 세포 수용체 신호 분자도 저해한다. PTNT2 단백질을 코딩하는 유전자는 도 52에 도시한 바와 같고, 이들 중에서도 촉매 도메인;과 AP 시퀀스와 결합하는 기질 결합 도메인;을 포함하는 각각의 결절 단편을 결합하여 rPTP 펩티드를 새롭게 설계하였다(도 52의 하단 펩티드). 이렇게 설계된 rPTP 펩티드는 피부에 국소적으로 적용되어 피부염 증상을 개선 또는 치료한다.
상술한 아미노산 서열이 아닌 PTPN2 단백질로부터 유래된 다른 아형은 피부 투과성 펩티드와 효율적으로 결합되기 어려워, 피부 투과 효율이 저하되거나 피부 염증성 질환에 대한 예방 및 치료 효과가 저하되는 문제가 발생할 수 있다.
게다가 본 발명과 같이 설계된 서열번호 20으로 이루어진 아미노산 서열의 rPTP 펩티드는 피부 염증성 질환(건선, 알러지, 만성 피부염 등)에 대해 동시에 우수한 치료 또는 예방 효과를 갖는다는 장점이 있다.
상기 피부 투과성 펩티드와 rPTP 펩티드 결합은 펩티드 결합 또는 화학적 결합인 것을 특징으로 한다. 상기 화학적 결합은 이황화 결합, 디아민 결합, 황화-아민 결합(sulfde-amine bonds), 카르복시-아민 결합(carboxyl-amine bonds), 에스테르 결합(ester bonds) 및 공유 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 융합체는 서열번호 19로 이루어진 아미노산 서열일 수 있는데, 이는 고유의 생리활성 단백질보다 피부 염증성 질환에 대해 현저히 우수한 예방 및 치료 효과를 갖는다.
아울러 피부 투과성 펩티드를 다른 종래의 펩티드를 사용할 경우, 피부 염증성 질환에 대한 효과가 현저히 낮게 나타나는데, 이를 통해 피부 투과 효율(특히 경피 세포 침투 효율) 및 피부 염증성 질환에 대한 치료 또는 예방 효과의 상승이 피부 투과성 펩티드 또는 rPTP 펩티드 고유 성질에 의한 것이 아님을 알 수 있다.
상기한 바와 같이 본 발명에 따른 펩티드 융합체는 피부 투과성 효율이 우수할 뿐만 아니라, 경피 투여만으로도 우수한 치료 및 예방 효과를 나타낼 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 융합체는 피부 염증성 질환에 대한 예방 및 치료 효과를 갖는 약물로써 유용하게 사용될 수 있다.
상기 융합체는 활성화된 T 세포들에서 사이토카인 생산을 효과적으로 조절하였으며, 피부 염증성 질환(건선, 알러지 피부염, 만성 피부염)의 예방적 및 치료적 모델들 모두에서 저해 효과를 나타내었다.
상기 피부 투과성 펩티드와 rPTP 펩티드는 공유 결합에 의해 결합되며, 에스테르, 아미드, 에테르 및 카르바미드 결합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 피부 투과성 펩티드는 매우 작은 펩티드이므로 혹시 발생할 수 있는 활성 물질에 대한 생물학적 간섭을 최소화할 수 있다. 상기 피부 투과성 펩티드와 생물학적 활성 물질의 융합체는 피부를 통하여 생체 내 전달될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 융합체를 코팅하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터에 관한 것이다.
상기 재조합 발현벡터는 상기 피부 투과성 펩티드와 상기 rPTP 펩티드의 서열(서열번호 19) 및 상기 융합체의 정제를 용이하게 하는 태그(tag) 서열 예를 들어, 연속된 히스티딘 코돈, 말토우즈 바인딩 단백질 코돈 및 Myc 코돈 등을 포함할 수 있고, 융합체의 가용성(solubility)을 증가시키기 위한 융합파트너(partner) 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 상기 재조합 단백질의 전체적 구조와 기능의 안정 또는 각 유전자가 코딩하는 단백질의 유연성(flexibility)을 위하여 스페이서(spacer) 아미노산 또는 염기서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 스페이서의 예로는 AAY(P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK(R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-7315) 또는, 하나에서 다수의 리신(lysine) 잔기들(S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-5715)을 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 또한 상기 재조합 단백질의 불필요한 부분을 제거하기 위하여 효소에 의해 특이적으로 절단되는 서열, 발현 조절 서열 및 세포 내 전달을 확인하기 위한 마커(marker) 또는 리포터 유전자 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 재조합 발현벡터에 사용되는 발현 조절 서열은 목적 DNA 및/또는 RNA가 선택적으로 전달 또는 발현되는 세포, 조직, 장기에 특이적인 프로모터를 포함하는 조절 도메인(regulatory domain)으로 구성될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에서 피부 투과성 펩티드와 결합되는 rPTP 펩티드로 이루어진 융합체를 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물 또는 피부외용제용 약학 조성물에서, 조성물 총 중량에 대하여 상기 융합체를 0.0001 내지 50 중량%로 포함한다. 상기 조성물은 상기 융합체에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
상기 융합체는 피부 각질층을 투과하는 것을 특징으로 하는 것으로, 이를 포함하는 상기 화장료 조성물 도는 피부외용제용 약학 조성물은 경피성인 것이 가장 바람직하다. 예를 틀어 연고 또는 젤을 혀용하는 다른 제형으로 제조될 수 있다. 이러한 특별한 성질로 인해서, 피부 질환에 대한 경구 투여보다 질환 부위에 직접적인 투여가 가능하고, 부작용이 더 낮게 일어나므로, 특히 피부 질환의 치료에서 경피 투여를 통해 더 유리하게 예방 및 치료 효과를 가질 수 있다.
상기 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 융합체 이외에 추가적으로 약제학적이나 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제를 추가로 포함할 수 있다.이러한 조성물에 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 비정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 상기 조성물은 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 조성물의 제형은 용액, 에멀션(마이크로에멀션 포함), 현탁액, 크림, 로션, 겔, 분말, 또는 본 조성물이 적용될 수 있는 피부 및 기타 조직에 적용하기 위해 이용되는 기타 전형적인 고체 또는 액체 조성물을 포함할 수 있다. 그와 같은 조성물은 추가적인 항미생물제(antimicrobial), 보습제 및 수화제(hydration agent), 투과제(penetration agent), 보존제, 유화제, 천연 오일 또는 합성 오일, 용매, 계면활성제, 세정제(detergent), 겔화제(gelling agent), 연화제(emollient), 항산화제, 향료, 충진제, 증점제(thickener), 왁스, 냄새 흡수제, 염료(dyestuff), 착색제, 분말, 점도-조절제(viscosity-controlling agent) 및 물을 포함할 수 있고, 선택적으로, 마취제, 항-가려움 활성제(anti-itch active), 식물 추출물(botanical extract), 컨디셔닝제(conditioning agent), 흑화제 또는 미백제(darkening or lightening agent), 글리터(glitter), 습윤제(humectant), 운모, 미네랄, 폴리페놀, 실리콘 또는 그의 유도체, 일광 차단제(sunblock), 비타민, 및 약용식물(phytomedicinal)을 포함할 수 있다.
상기 조성물의 투여량은 대상의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 화합물의 경우 약 0.01 내지 100 ㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 0.5 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 일 회 내지 수 회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
상기 피부 염증성 질환은 염증성 피부염, 건선증, 상처, 아토피성 질환인 것이 가장 바람직하다.
본 발명은 상기 피부외용제용 약학 조성물을 개체의 피부에 도포하여, 인간을 제외한 동물의 피부 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
피부외용제용 약학 조성물은 피부를 통한 생체 또는 세포 내 주입이 가능하므로, 동물의 피부 특히 질환 부위에 이를 도포함으로써 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
<피부 투과성 펩티드(AP) 및 PTPN2 유래의 펩티드의 제조>
제조예 1: 펩티드 합성 및 분리정제
서열번호 1 내지 12, 15 및 17의 아미노산 서열을 가지는 피부 투과성 펩티드(AP)와 PTPN2 단백질로부터 설계된 서열번호 20의 아미노산 서열을 가지는 재조합 펩티드(rPTP)를 합성하였다.
상기 아미노산 서열에 합당한 센스(sense)와 안티센스(antisense) 올리고테옥시뉴클레오타이드(oligodeoxy nucleotide)를 각각 합성한 후 95℃에서 3분 방치하여 형성된 2차 또는 3차 구조를 제거하고(denaturation) 50℃ 그리고 72℃로 온도를 바꾸어 DNA 2중가닥을 만들었다. pRSET-b 벡터에 끼워 넣기 위하여 센스(sense)와 안티센스(antisense) 올리고데옥시뉴클레오타이드 이외의 제한효소 특이 서열을 5'과 3'에 넣었다. 이후 대장균(E. coli)에 넣어(형질변화(transformaiton)) 대량 증폭하였다. 이후 서열의 온전성을 확인하고 대장균에 넣어 발현 유도하였다.
서열번호 1 내지 12, 15 및 17 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 펩티드(이하, 'AP'라고도 함)를 PTPN2 단백질로부터 설계된 재조합 펩티드(이하 'rPTP'라고도 한다)(서열번호 20) 또는 녹색 형광 단백질(EGFP)과 융합하기 위하여 AP의 N-말단에 EGFP가 연결될 수 있도록 하는 프라이머를 제작하여 AP-rPTP 또는 AP-EGFP 유전자를 PCR 반응을 통해 생산하고 이를 벡터 (pRSET-b)에 삽입하여 대장균 균주에서 단백질을 발현, 정제한 후 세포 내에 전달효율을 확인하는 실험을 진행하였다.
<AP- EGFP 단백질 및 재조합 발현 벡터의 제조>
제조예 2: AP가 N-말단에 연결된 EGFP 을 코딩하는 이중사슬 DNA의 제조
녹색 형광 단백질(이하, 'EGFP'라고도 함)의 N-말단의 일부를 코딩하는 DNA 염기서열에 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 코딩하는 DNA 염기서열을 추가하여 포워드 프라이머를 제작하였다.
서열번호 13의 포워드 프라이머는 5′ 말단에 DNA 클로닝을 위한 NheI 제한효소 인식부위를 포함하고 있으며 AP와 EGFP의 염기서열 사이에는 BamHI 제한효소 인식부위를 포함하고 있다. 한편 AP-EGFP를 PCR반응으로 증폭시키기 위해 서열번호 14의 리버스 프라이머를 제작하였다. 상기 리버스 프라이머는 EGFP의 C-말단 일부를 코딩하는 DNA 염기서열을 포함하며 프라이머의 5′ 가장 말단 부분에는 DNA 클로닝을 위하여 HindIII 제한효소 인식 부위를 삽입하였다.
PCR 반응은 EGFP유전자가 포함된 pRSETb 벡터를 주형으로 하여 상기 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머들을 이용하였다. 95℃에서 3분 동안 초기 열 변성 반응을 한 뒤, 95℃에서 주형의 열 변성반응 20초, 50℃에서 프라이머와 주형이 결합하는 중합반응 20초, 72℃에서 연장반응으로 30초를 수행하는 것으로 1주기를 설정하여 30주기를 PCR 반응기 (Biorad)를 이용하여 수행하였다.
상기 반응으로부터 증폭된 AP-EGFP의 증폭산물은 1% 아가로스 젤 전기영동을 통해 789 bp의 DNA 절편이 증폭되었음을 확인하였다(도 1).
제조예 3: AP- EGFP 가 삽입된 pRSETb 벡터의 제조
AP-EGFP 단백질을 발현시키기 위하여 단백질 발현 벡터인 pRSETb에 상기 제조예 2에서 제조된 789 bp의 DNA 절편을 제한효소로 자른 후 연결효소(ligase)를 이용하여 벡터에 삽입하였다.
제조예 2에서 증폭된 DNA 절편을 NheI과 HindIII (NEB)를 이용하여 DNA의 5′/ 3′ 말단을 접착성 말단 (sticky end)이 되도록 효소 반응 시켰다. 한편, 같은 두 개의 제한효소를 이용하여 pRSETb를 효소 반응시켜 NheI , HindIII 삽입 부위를 갖는 선형의 pRSETb 벡터를 만들었다. 각각의 효소 반응 이후에는 PCR 정제 키트(코스모진텍)를 이용하여 분리하였다.
분리된 AP-EGFP 이중사슬 DNA 절편과 pRSET-b 벡터는 25℃에서 두 시간 동안 T4 Ligase (NEB)를 이용하여 연결되도록 효소 반응 시켰다. AP-EGFP 이중사슬 DNA 절편과 pRSET-b 벡터는 1% 아가로스 겔 전기영동을 통해 각각의 농도가 확인되었다(도 2).
이렇게 연결시킨 AP-EGFP가 삽입된 원형의 pRSETb 벡터를 DH5α 대장균 균주에 형질전환 시켜 항생제인 암피실린 50 μg/㎖이 포함된 LB 평판 배지에 배양하여 콜로니를 형성하는 형질전환 대장균을 선별하였다. 선별된 대장균 콜로니는 다시 암피실린 50 μg/㎖을 포함하는 액체 LB 배지에 접종하여 배양했으며 이후 플라스미드 Mini Preparation 키트(코스모진텍)를 이용하여 플라스미드 벡터를 분리하였다(도 3).
상기 과정을 통해 분리된 플라스미드 벡터가 AP-EGFP가 삽입된 pRSETb 벡터임을 확인하기 위하여 일차적으로 NheI과 HindIII 제한효소를 이용해 효소 반응 시킨 후, 1% 아가로스 젤 전기영동을 통해 확인하였다. 그 결과 789 bp에 해당하는 AP-EGFP DNA 절편이 2.9 kbp에 해당하는 pRSET-b 벡터에 삽입되어 있는 것을 확인하였다(도 4). 그리고 이것은 DNA 염기서열 분석(바이오닉스)을 통하여 최종적으로 확인할 수 있었다. 이렇게 제작된 AP-EGFP가 삽입된 pRSETb 벡터의 구조는 도 5에 나타내었다.
제조예 4: 대장균에서 AP- EGFP 단백질의 발현 및 정제
상기 제조예 3의 AP-EGFP가 삽입된 pRSETb 벡터를 대장균 BL21 (DE3)star pLysS 균주에 형질전환 시킨 후 항생제인 클로람페니콜 34 μg/㎖와 암피실린 50 μg/㎖가 포함된 LB 평판 배지에서 형성된 콜로니를 액체 LB 배지 50㎖에 접종하여 37℃에서 10시간 배양하여 이를 새로운 액체 LB 배지 500㎖에 접종하였다. 동일한 온도에서 대장균의 양이 분광광도계로 배양액을 측정하였을 때, O.D 값이 0.5가 될 때까지 배양한 후, IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)의 농도가 1mM이 되도록 첨가하여 온도는 20℃, 회전 속도는 150rpm로 맞춰진 진탕 배양기에서 14시간을 더 배양하였다. 이렇게 대장균주가 발현한 단백질은 AP-EGFP의 앞쪽에 pRSET-b 벡터에 코딩되어 있는 6X-His tag을 포함하고 있다. 이를 이용해 하기의 실험 방법으로 단백질을 정제하였다.
배양액을 원심분리로 모은 후 native condition의 용해용액(0.5M NaCl, 5mM imidazole, 20mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 재 부유시켰다. 대장균의 세포벽과 세포막을 깨뜨리기 위해 용해용액에 부유해 있는 상태로 10분간 놓아두었다. 그리고 초음파 세포 파쇄기인 VCX-130(Sonics & Materials)을 사용해 세포를 분쇄하고 원심 분리하여 상층액을 분리하였다. 분리된 상층액은 0.45㎛ 필터(Advantec)를 이용해 한번 거른 뒤 Ni-NTA agarose(Qiagen)와 상온에서 1시간 동안 결합하도록 하였다.
이후에는 히스티딘 칼럼(His-column, Biorad)을 이용해 Ni-NTA agarose와 결합된 단백질 산물만을 column에 결합할 수 있도록 하였다. 20mM의 imidazole 용액으로 세척한 뒤, 250mM의 imidazole 용액을 이용해 최종적으로 용출해냈다. 이렇게 용출된 단백질 산물은 PD-10 탈염 칼럼(Amersham Bioscience)에 적용하여 AP-EGFP를 최종적으로 순수 분리 정제하였다(도 6).
<AP- rPTP 단백질 및 재조합 발현벡터의 제조>
제조예 5: AP가 N-말단에 연결된 rPTP 을 코딩하는 이중사슬 DNA의 제조
rPTP로부터 유래된 서열번호 20의 N-말단의 일부를 코딩하는 DNA 염기서열에 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 피부 투과성 펩티드를 코딩하는 DNA 염기서열을 추가하여 포워드 프라이머를 제작하였다.
서열번호 21의 포워드 프라이머는 5′ 말단에 DNA 클로닝을 위한 NheI 제한효소 인식부위를 포함하고 있으며 AP와 rPTP의 염기서열 사이에는 BamHI, EcoRI 제한효소 인식부위를 포함하고 있다. 한편 AP-rPTP를 PCR반응으로 증폭시키기 위해 서열번호 22의 리버스 프라이머를 제작하였다. 상기 리버스 프라이머는 rPTP의 C-말단 일부를 코딩하는 DNA 염기서열을 포함하며 프라이머의 5′ 가장 말단 부분에는 DNA 클로닝을 위하여 XhoI 제한효소 인식 부위를 삽입하였다.
PCR 반응은 rPTP 유전자가 포함된 PET28a 벡터를 주형으로 하여 상기 서열번호 21 및 서열번호 22의 프라이머들을 이용하였다. 95℃에서 3분 동안 초기 열 변성 반응을 한 뒤, 95 ℃에서 주형의 열 변성반응 20초, 50℃에서 프라이머와 주형이 결합하는 중합반응 20초, 72 ℃에서 연장반응으로 30초를 수행하는 것으로 1주기를 설정하여 30주기를 PCR 반응기(Biorad)를 이용하여 수행하였다.
상기 반응으로부터 증폭된 AP-rPTP의 증폭산물은 1% 아가로스 젤 전기영동을 통해 945 bp의 DNA 절편이 증폭되었음을 확인하였다.
제조예 6: AP- rPTP 가 삽입된 PET28a 벡터의 제조
AP-rPTP 단백질을 발현시키기 위하여 단백질 발현 벡터인 PET28a에 상기 제조예 5에서 제조된 945 bp의 DNA 절편을 제한효소로 자른 후 연결효소(ligase)를 이용하여 벡터에 삽입하였다.
제조예 5에서 증폭된 DNA 절편을 NheI과 XhoI (NEB)를 이용하여 DNA의 5′/ 3′ 말단을 접착성 말단 (sticky end)이 되도록 효소 반응 시켰다. 한편, 같은 두 개의 제한효소를 이용하여 PET28a를 효소 반응시켜 NheI, XhoI 삽입 부위를 갖는 선형의 PET28a 벡터를 만들었다. 각각의 효소 반응 이후에는 PCR 정제 키트(코스모진텍)를 이용하여 분리하였다.
분리된 AP-rPTP 이중사슬 DNA 절편과 PET28a 벡터는 25℃에서 두 시간 동안 T4 Ligase (NEB)를 이용하여 연결되도록 효소 반응 시켰다. AP-rPTP 이중사슬 DNA 절편과 PET28a 벡터는 1% 아가로스 겔 전기영동을 통해 각각의 농도가 확인되었다.
이렇게 연결시킨 AP-rPTP가 삽입된 원형의 PET28a 벡터를 DH5α 대장균 균주에 형질전환 시켜 항생제인 카나마이신 50 μg/㎖이 포함된 LB 평판 배지에 배양하여 콜로니를 형성하는 형질전환 대장균을 선별하였다. 선별된 대장균 콜로니는 다시 카나마이신 50 μg/㎖을 포함하는 액체 LB 배지에 접종하여 배양했으며 이후 플라스미드 Mini Preparation 키트(코스모진텍)를 이용하여 플라스미드 벡터를 분리하였다(도 3).
상기 과정을 통해 분리된 플라스미드 벡터가 AP-rPTP가 삽입된 PET28a 벡터임을 확인하기 위하여 일차적으로 NheI과 XhoI 제한효소를 이용해 효소 반응 시킨 후, 1% 아가로스 젤 전기영동을 통해 확인하였다. 그 결과 945 bp에 해당하는 AP-rPTP DNA 절편이 2.9 kbp에 해당하는 PET28a 벡터에 삽입되어 있는 것을 확인하였다. 그리고 이것은 DNA 염기서열 분석(바이오닉스)을 통하여 최종적으로 확인할 수 있었다.
제조예 7: 대장균에서 AP- rPTP 단백질의 발현 및 정제
상기 제조예 6의 AP-rPTP가 삽입된 PET28a 벡터를 대장균 Rosetta 균주에 형질전환 시킨 후 항생제인 클로람페니콜 (34 ㎍/ml)과 카나마이신 (50 ㎍/ml)이 포함된 LB 평판 배지에서 형성된 콜로니를 액체 LB 배지 50에 접종하여 37에서 10시간 배양하여 이를 새로운 액체 LB 배지 500에 접종하였다. 동일한 온도에서 대장균의 양이 분광광도계로 배양액을 측정하였을 때, O.D 값이 0.5가 될 때까지 배양한 후, IPTG (Isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside)의 농도가 0.2mM이 되도록 첨가하여 온도는 20 ℃, 회전 속도는 150rpm로 맞춰진 진탕 배양기에서 14시간을 더 배양하였다. 이렇게 대장균이 발현한 단백질은 AP-rPTP의 앞쪽에 PET28a 벡터에 코딩되어 있는 6X-His tag을 포함하고 있다. 이를 이용해 하기의 실험 방법으로 단백질을 정제하였다.
배양액을 원심분리로 모은 후 native condition의 용해용액 (0.3M NaCl, 10mM imidazole, 50mM NaH2PO4, pH 8.0)으로 재 부유 시켰다. 대장균의 세포벽과 세포막을 깨뜨리기 위해 용해용액에 부유해 있는 상태로 10분간 놓아두었다. 그리고 초음파 세포 파쇄기인 VCX-130 (Sonics & Materials)을 사용해 세포를 분쇄하고 원심 분리하여 상층액을 분리하였다. 분리된 상층액은 0.45 ㎛필터 (Advantec)를 이용해 한번 거른 뒤 Ni-NTA agarose (Qiagen)와 상온에서 1시간 동안 결합하도록 하였다. 이후에는 히스티딘 칼럼(His-column, Biorad)을 이용해 Ni-NTA agarose와 결합된 단백질 산물만을 column에 결합할 수 있도록 하였다. 20mM의 imidazole 용액으로 세척한 뒤, 250mM의 imidazole 용액을 이용해 최종적으로 용출 (elution)해냈다. 이렇게 용출된 단백질 산물은 PD-10 탈염 칼럼 (Amersham Bioscience)에 적용하여 AP-EGFP를 최종적으로 순수 분리 정제하였다(도 51).
실험예 1: 암화 된 인간의 T 세포인 Jurkat 세포주 안으로 AP- EGFP 단백질의 전달 효율 비교
상기 제조예 4의 과정에서 정제된 AP-EGFP 단백질을 암화 된 인간 T 세포 세포주인 Jurkat 세포주 내로 전달하고 이의 효율을 확인하였다. Jurkat 세포를 RPMI 배지(HyClone)를 사용하여 배양하고, 350㎕의 RPMI 배지를 분주해 놓은 24-well 플레이트(SPL lifescience)의 각 well에 세포수가 1×106 만큼 들어있는 100㎕의 RPMI 배지를 첨가하는 방식으로 세포를 분주했다. 그리고 50㎕안에 D-PBS(Welgene)와 적정 농도가 되도록 맞춘 단백질을 섞어 총 부피가 500㎕가 되도록 단백질을 한 후에 명시한 바와 같이 다양한 조건에 맞게 단백질을 처리하였다. 이하 실험예에서 단백질의 처리 조건을 따로 명시하지 않은 경우, 배양액에 각각의 단백질을 5μM씩 처리하고 5% CO2 세포 배양기에서 37℃로 1시간 동안 배양하였다.
첫 번째로는 AP-EGFP 단백질의 농도가 각각 1μM과 5μM이 되도록 처리한 후 5% CO2 세포 배양기에서 37℃로 1시간 동안 배양하였다. 대조군으로는 AP가 연결되어 있지 않은 EGFP 단백질과 종래의 세포 투과성 펩티드 중 하나인 TAT-EGFP 단백질을 이용하였다. 1시간이 지난 후에는 세포를 모두 거두어 튜브에 옮겨 담고 원심분리를 이용해 상층액을 제거해 주었다. 또한 세포 표면에 묻어있거나, 배지가 남아 효율을 측정하는데 영향을 받지 않도록 D-PBS 1㎖를 이용해 세척하며 재 부유시키고 원심분리 하는 과정을 2회 반복했다. 2회의 세척 과정 후 얻어진 세포를 D-PBS 500㎕로 최종적으로 재 부유 시켜 유세포분석기(flow cytometry, FACS machine, BD science FACScantoII)를 이용해 세포 내 형광을 측정하는 방식으로 단백질의 세포 내 전달 효율을 측정하였다. 그 결과, 단백질의 처리 농도에 의존적으로 AP-EGFP가 Jurkat 세포주 안으로 전달되었음을 확인하였다.
이어서 AP-EGFP 단백질의 농도는 5μM로 유지하고 5% CO2 세포 배양기에서 37℃로 30분 ~ 4시간 동안 배양하였다. 해당 처리 시간이 지난 후에는 상기에 명시한 바와 같은 방법으로 세포를 세척한 후 유세포분석기로 세포 내 형광을 측정하였다. 그 결과 단백질의 처리 시간에 의존적으로 AP-EGFP가 Jurkat 세포주 안으로 전달되었음을 확인하였다(도 7).
실험예 2: Jurkat 세포주 안으로 종래 세포 투과성 펩티드들과의 단백질의 전달 효율 비교
또한 종래의 세포 투과성 펩티드들과 그 효율을 비교하기 위하여 실험예 1과 같은 농도, 같은 시간 동안 위와 같은 방법으로 Jurkat 세포주 안으로 각각의 단백질을 전달하는 실험을 진행하였다.
음성 대조군으로는 세포 투과성 펩티드가 연결되어 있지 않은 EGFP 단백질을 사용하고, 양성 대조군으로는 세포 투과성 펩티드에 EGFP (Enhanced Green Fluorescence Protein, 형광단백질)를 각각 결합한 TAT-EGFP, R9-EGFP, Hph-1 EGFP를 사용하여 비교해 보았다. 그 결과, 본 발명의 AP 서열이 TAT 보다 높은 효율로 단백질을 Jurkat 세포 안으로 전달하고 있음을 확인하였다(도 8).
실험예 3: Jurkat 세포주 안으로 종래 피부 투과성 펩티드들과의 단백질의 전달 효율 비교
또한 종래의 피부 투과성 펩티드들과 그 효율을 비교하기 위하여 실험예 1과 같은 농도, 같은 시간 동안 위와 같은 방법으로 Jurkat 세포주 안으로 각각의 단백질을 전달하는 실험을 진행하였다.
음성 대조군으로는 세포 투과성 펩티드가 연결되어 있지 않은 dTomato 형광단백질을 사용하고, 양성 대조군으로는 피부 투과성 펩티드에 dTomato 형광단백질을 결합시킨 TDP1-dTomato, TDP2-dTomato를 사용하여 비교해 보았다.
상기 TDP1-dTomato는, 한국공개특허 제10-2013-0135207호에 개시된 피부 투과성 펩티드(아미노산서열 'NGSLNTHLAPIL', 이하 '서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 펩티드' 또는 'TDP1'이라 함)이고, TDP1의 C-말단에 제한효소가 인식할 수 있는 링커(아미노산 서열 'GS')를 결합시키고, 상기 링커의 C-말단에 dTomato 형광단백질이 결합시킨 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 융합체이다.
상기 TDP2-dTomato는, 한국공개특허 제10-2013-0070607호에 개시된 피부 투과성 펩티드(아미노산 서열 'MRAAAPAVAA', 이하 '서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 펩티드' 또는 'TDP2'라 함)이고, TDP2의 C-말단에 제한효소가 인식할 수 있는 링커(아미노산 서열 'GS')를 결합시키고, 상기 링커의 C-말단에 dTomato 형광단백질이 결합시킨 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 융합체이다.
AP에 EGFP를 결합시킨 융합체가 실험예 2에서 Jurkat 세포로 효율적으로 전달되는 것과 마찬가지로 AP에 dTomato를 결합시킨 융합체 역시 음성 대조군(dTomato 단독)에 비해 현저히 전달 효율을 향상시켰다. 또한 종래 피부 투과성 펩티드로 알려진 TDP1이나 TDP2는 분자량이 큰 형광단백질인 dTomato를 결합시켰을 때 AP-dTomato에 비해서 현저히 낮은 전달 효율을 가짐을 확인할 수 있었다(도 9).
실험예 4: 피부 세포 안으로 종래 세포 투과성 펩티드들과의 단백질의 전달 효율 비교
HaCaT 세포주는 인간 표피 세포주로서 경피 전달 실험 및 피부질환 논문에서 생체외 전달 효율 및 기작 확인을 위하여 사용되어 온 세포주이다[J Invest Dermatol. 2011 Jul;131(7):1477-85; Biochem Pharmacol. 2008 Mar 15;75(6):1348-57.]. 또한 NIH3T3 세포주는 쥐 진피 세포주로서 HaCaT과 마찬가지로 경피전달 및 피부질환의 메커니즘 확인을 위하여 생체외 실험에서 자주 사용되는 세포주이다[J Pharm Sci. 2013 Nov;102(11):4109-20; J Immunol. 2003 Jan 1;170(1):548-55.].
상기 HaCaT 세포주와 NIH3T3 세포주를 이용하여 본 발명의 AP가 피부 세포에 EGFP 형광단백질을 전단할 수 있는지 종래 세포 투과성 펩티드와 비교하여 도 10 및 도 11에 나타내었다.
실험예 2와 동일하게 음성 대조군으로는 세포 투과성 펩티드가 연결되어 있지 않은 EGFP 단백질을 사용하고, 양성 대조군으로는 세포 투과성 펩티드에 EGFP 를 각각 결합한 TAT-EGFP, R9-EGFP를 사용하여 비교해 보았다. 또한 추가로 AP 서열의 시스테인을 알라닌으로 치환한 AP C→A EGFP를 실험군으로 추가하였다.
본 발명의 AP가 면역세포(Jurkat 세포) 외에 HaCaT 세포주와 NIH3T3 세포주에서도 분자량이 큰 단백질을 TAT 또는 R9에 비해서 효율적으로 전달하고 있음을 확인하였고, 또한 이러한 AP의 전달 효율은 아미노산 서열 중에 포함된 시스테인을 알라닌으로 치환함으로써 현저히 감소되었다.
실험예 5: 피부 세포 안으로 종래 피부 투과성 펩티드들과의 단백질의 전달 효율 비교
실험예 3의 HaCaT 세포주와 NIH3T3 세포주를 이용하여 본 발명의 AP가 피부 세포에 dTomato 형광단백질을 전단할 수 있는지 종래 세포 투과성 펩티드와 비교하여 도 12 및 도 13에 나타내었다.
실험예 3과 동일하게 음성 대조군으로는 세포 투과성 펩티드가 연결되어 있지 않은 dTomato 형광단백질을 사용하고, 양성 대조군으로는 피부 투과성 펩티드에 dTomato 형광단백질을 결합시킨 TDP1-dTomato, TDP2-dTomato를 사용하여 비교해 보았다.
본 발명의 AP가 면역세포(Jurkat 세포) 외에 HaCaT 세포주와 NIH3T3 세포주에서도 분자량이 큰 단백질을 높은 효율로 전달하는 반면, 종래 TDP1과 TDP2 피부 투과성 펩티드는 분자량이 큰 단백질이 결합된 경우 투과 효율 증대 효과가 미미하였다.
실험예 6: AP 구성 아미노산의 치환, 제거, 추가에 따른 단백질의 전달 효율 비교
AP를 구성하는 각 아미노산의 역할에 대해 알아보기 위하여 다양한 변이체 들을 만들어 비교 분석해보았다.
(1) 말단 아미노산 제거에 따른 단백질 전달 효율 비교
먼저 AP의 양 끝을 구성하고 있는 아르기닌을 N-말단에서 하나(AP_D1, 서열번호 2), C-말단에서 하나(AP_D2, 서열번호 3), N, C-말단에서 각각 하나씩 제외(AP_D3, 서열번호 4)한 변이체를 만든 뒤, EGFP와 AP-EGFP, TAT-EGFP, R9-EGFP를 대조군으로 하여 비교해 보았다.
그 결과, 아르기닌이 하나라도 없는 경우, 즉 X1이 3 미만이거나, X2가 4 미만인 경우 기존의 AP 보다 효율이 크게 감소하는 것으로 보아 AP의 세포 내 단백질 전달의 역할에 있어 X1 및 X2의 아미노산 개수 하한치의 임계적 의의를 확인하였다(도 14).
(2) X2 , 시스테인, X3 아미노산의 치환에 따른 단백질 전달 효율 비교
트립토판(X2)과 시스테인, 라이신(X3 중 첫 번째 아미노산)의 역할에 대해 알아보기 위하여 각각의 아미노산을 알라닌 또는 아르기닌으로 치환한 변이체를 제작하여 비교해보았다. 알라닌은 전하를 띠지 않고 가장 간단하면서도 작은 구조이기 때문에 대조군으로 적합하다.
양전하를 띠고 있는 아르기닌으로의 치환체는 아르기닌이 9개 붙어있는 R9과의 효율을 비교하는 대조군으로 사용하였다. 결과적으로 알라닌 치환체와 아르기닌 치환체는 서로 유사한 패턴을 보였다. 트립토판은 다른 아미노산으로 바꾸어도 기존의 AP 서열과 큰 효율의 차이를 보이지 않는 것으로 보아 AP의 기능적 역할에 큰 기여를 하지는 않는 것으로 확인되었다. 아르기닌은 다른 아미노산으로 치환하게 되면 효율이 크게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 아르기닌의 양전하를 띠는 특성이 긍정적인 영향을 미친 것으로 판단된다. 시스테인을 다른 아미노산으로 치환한 경우 가장 급격한 효율의 감소를 보였는데, 이는 시스테인이 AP에 있어 매우 중요한 기능 및 역할을 하고 있음을 시사한다(도 15 및 도 16).
실험예 7: AP의 세포 투과 기작 확인
한편 AP가 기존에 가장 잘 알려진 세포 투과성 펩티드인 TAT처럼 세포내 섭취(endocytosis)과정으로 세포 내로 전달되는지 확인하기 위하여 온도에 의존한 세포 내 전달변화를 측정하였고, 배지 내의 혈청 (serum) 농도에 따라 다른 단백질의 영향을 받는지 여부를 확인해 보았다. 음성 대조군으로는 세포 투과성 펩티드가 연결되어 있지 않은 EGFP를, 양성 대조군으로는 TAT-EGFP를 사용하였다.
각각의 단백질을 상기와 같은 방법으로 5μM이 되도록 Jurkat 세포에 처리하여 각각 4℃, 25℃, 37℃ 온도에서 독립적으로 1시간. 그 결과, 기존의 TAT과 같이 온도에 영향을 받는 것을 확인할 수 있었다. 이것은 AP가 에너지에 의존하는 세포내 섭취(endocytosis)를 통해 전달되는 TAT과 비슷한 방식으로 전달된다는 것의 간접적인 증거가 되는 것으로써, AP가 기존에 알려진 방식과 비슷한 방식으로 단백질을 세포내로 전달하는 세포 투과성 펩티드임을 확인하였다. 뿐만 아니라 각각의 온도에서 모두 TAT보다 높은 전달효율을 보이는 것을 확인하였다(도 17의 위).
또한 RPMI 배지에 첨가한 혈청의 농도를 각각 0%, 10%로 달리 했을 때 5μM이 되도록 처리한 각 단백질의 전달 효율을 분석하였다. 세포에 단백질 처리 후 1시간 동안 37℃에서 배양하였으며, 음성 대조군은 세포 투과성 펩티드가 연결되지 않은 EGFP, 양성대조군은 TAT-EGFP를 이용하였다.
그 결과, 배지의 혈청 농도가 증가할수록 AP-EGFP 단백질이 세포막을 통과하여 세포 안으로 전달되는 효율이 낮아지는 것을 확인하였다. 이것 역시 다른 단백질들과의 경쟁이나 상호작용에 의해 세포 투과성 펩티드가 영향을 받는 것을 간접적으로 보여주는 결과로써 본 발명에서 개발된 AP가 갖는 세포 투과성 펩티드로써의 기능을 다시 확인해 주는 결과이다. 한편 각각의 혈청 농도에서 AP는 다른 양성 대조군에 비해 여전히 높은 전달 효율을 나타내고 있음을 확인하였다(도 17의 아래).
실험예 8: Heparin과 MβCD의 농도의 변화에 따른 AP- EGFP 의 세포 내 단백질 전달 효율
(1) Heparin 농도의 변화에 따른 AP- EGFP 의 세포 내 단백질 전달 효율
상기 실험예 4를 통해 AP-EGFP의 전달 효율의 기작을 확인하였던 것처럼 세포 투과성 펩티드가 세포 표면에 있는 헤파란 황산염 (heparan sulfate)과 결합하는 것을 방해할 수 있는 비슷한 구조의 heparin을 미리 처리하여 상호작용에 의해 직접적이거나 간접적인 영향을 받을 것이라는 예상을 하여 Heparin (Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa, Sigma)을 0 μm/ml, 10 μg/ml, 20 μg/ml, 50 μg/ml 4 가지 농도로 Jurkat 세포주에 30분 먼저 처리해주고 10μM의 AP-EGFP 단백질을 D-PBS로 최종 부피가 100㎕이 되도록 만들어 처리하였다. 양성 대조군으로는 TAT-EGFP를 사용하여 비교하였다. 그리고 1시간 동안 37℃의 5% CO2 세포 배양기에서 배양했다. 1시간이 지난 후에는 세포를 모두 거두어 튜브에 옮겨 담고 원심분리를 이용해 상층액을 제거해 주었다. 또한 세포 표면에 묻어있거나, 배지가 남아 효율을 측정하는데 영향을 받지 않도록 D-PBS 1㎖를 이용해 세척하며 재 부유시키고 원심분리 하는 과정을 2회 반복했다. 2회의 세척 과정 후 얻어진 세포를 D-PBS 500㎕로 최종적으로 재 부유 시켜 유세포분석기(flow cytometry, FACS machine, BD science FACS Canto )를 이용해 세포 내 형광을 측정하는 방식으로 단백질의 세포내 전달 효율을 측정하였다.
그 결과, Heparin 처리 농도가 높아짐에 따라 AP-EGFP의 세포 내 전달 효율이 현저하게 낮아지는 것을 확인하였다(도 18의 위).
(2) MβCD 농도의 변화에 따른 AP- EGFP 의 세포 내 단백질 전달 효율
또한 AP-EGFP가 세포 내로 전달되는 과정에서, 인지질 이중층 세포막을 구성하는 지질 뗏목 (lipid raft)과 연관된 엔도시토시스(endocytosis)에 영향을 받을 것이라고 예측하여, 세포막의 콜레스테롤 (cholesterol)을 제거하는 것으로 알려져 있는 MβCD(Methyl-beta-cyclodextrin)를 처리하여 지질로 인한 엔도시토시스 (endocytosis)를 미리 저해한 뒤, MβCD를 0 mM, 3 mM, 5 mM 세 가지 농도로 Jurkat 세포주에 얼음에서 20분 먼저 처리해주고, 10μM의 AP-EGFP 단백질을 한 시간 동안 처리하였다. 양성 대조군으로는 TAT-EGFP를 사용하여 비교하였다. 그 결과, MβCD 처리 농도가 높아짐에 따라 AP-EGFP의 세포 내 전달 효율이 확연하게 떨어지는 것을 확인하였다(도 18의 아래).
이것 역시 다른 단백질들과의 경쟁이나 상호작용에 의해 세포 투과성 펩티드가 영향을 받는 것을 직, 간접적으로 보여주는 결과로써 본 발명에서 개발된 AP가 갖는 세포 투과성 펩티드로써의 기능을 다시 확인해 주는 결과이다.
실험예 9: 암세포주인 HeLa 세포 안으로의 AP- EGFP 의 전달
AP가 단백질과 함께 실제로 세포 내로 전달되는 것인지, 세포 내 어느 위치에 존재하는지 직접 확인하기 위하여 자궁경부암 세포주인 HeLa 세포 안으로 AP-EGFP를 전달하여 공초점현미경을 이용해 분석하였다.
12-well 플레이트 (SPL lifescience)의 각 well에 미리 현미경용 원형 커버글라스 (Marin field)를 깔아두고 HeLa 세포의 세포수를 1×105 으로 분주한 후, 18시간 동안 DMEM 배지 (HyClone)에서 배양하여 세포가 커버글라스에 부착될 수 있도록 하였다. 이후 배지를 모두 흡입 (suction)하여 버린 후 새로운 DMEM 450㎕를 넣어주고, 실시예 3을 통해 정제된 AP-EGFP 단백질을 농도가 5μM이 되도록 하여 D-PBS와 섞어 부피가 50㎕이 되게 해서 처리하였다. 그리고 1시간 동안 37℃의 5% CO2 세포 배양기에서 배양했다. 1시간의 처리시간이 지난 뒤에 세포외부의 단백질을 제거하기 위해 배지를 모두 흡입하여 버린 후 1㎖의 D-PBS로 세척하는 과정을 5회 반복했다. 그리고 포름알데히드 (formaldehyde 37% solution, formalin, SIGMA) 1㎖로 세포를 고정하였다. 고정 후에도 D-PBS 1㎖를 이용해 5회 세척하였다. 이후에는 세포를 확인하고 핵의 위치를 확인하기 위하여 1:4000으로 희석한 Hoechst (Hoechst AG)를 500㎕이용해 핵이 형광을 띄도록 염색했으며 10분의 반응시간 후에 D-PBS 1ml를 이용해 5회 세척하였다. 이렇게 준비된 커버 글라스는 Mounting medium (SIGMA)을 이용해 슬라이드 글라스위에 마운팅하여 형광현미경 DMi-8 (Fluorescence microscope, Leica) 으로 녹색 형광 단백질의 위치와 세포 안으로 전달되는 것을 확인하였다. 그 결과, AP가 결합된 녹색 형광 단백질은 세포막을 투과해 세포 내로 전달되어 들어가며, 세포내 위치는 세포질 (cytoplasm)에 머물러 있는 것을 확인하였다(도 19).
실험예 10: 피부 세포주인 HaCaT 및 NIH3T3 세포 안으로의 AP- EGFP 의 전달
AP가 단백질과 함께 실제로 피부 세포 내로 전달되는 것인지, 피부 세포 내 어느 위치에 존재하는지 직접 확인하기 위하여 피부 세포주인 HaCaT 및 NIH3T3 세포 안으로 AP-EGFP를 전달하여 공초점현미경을 이용해 실험예 9와 동일한 방법으로 분석하였다. 양성 대조군으로는 TAT-EGFP 및 R9-EGFP를 사용하여 비교하였다. 또한 추가로 AP 서열의 시스테인을 알라닌으로 치환한 AP C→A EGFP를 실험군으로 추가하였다.
그 결과, AP가 결합된 녹색 형광 단백질은 양성 대조군이나 C→A EGFP에 비하여 높은 효율로 세포막을 투과해 피부 세포 내로 전달되어 들어가며, 세포 내 핵 및 세포질에 머물러 있는 것을 확인하였다(도 20 및 도 21).
실험예 11 : 쥐의 각 장기 내부로의 AP- EGFP 의 전달
AP가 실제 체내 조건에서도 전달되는 것인지, 전달이 된다면 어느 장기까지 얼마나 전달이 될 수 있는지 직접 확인하기 위하여 C57BL/6 종의 6주 된 암컷 쥐에 5 mg의 AP-EGFP 단백질을 복강 주사하여 2시간 후 뇌, 심장, 신장, 간, 폐, 비장, 장 등의 장기를 얻어 4% 파라포름알데히드로 고정한 뒤, D-PBS로 2~3회 세척하여 O.C.T. compound를 이용해 얼린 블록을 제작하였다. 이후 크라이오스탯 (cryostat)을 이용하여 6μm의 두께로 절편을 만들어 슬라이드 샘플을 제작, 형광 현미경을 통하여 여러 장기 세포 내 AP-EGFP의 전달 여부를 확인하였다. 슬라이드 제작 후 Hoechst로 10분간 염색한 뒤 형광 단백질과 겹쳐서 비교하는 과정을 통하여 세포 내부로 들어갔는지의 여부를 확인하였다. 대조군으로는 세포 투과성 펩티드가 연결되지 않은 EGFP를 사용하였다. 그 결과 EGFP에 비교하여 AP가 연결된 녹색 형광 단백질은 뇌, 심장, 신장, 간, 폐, 비장, 장 등의 장기를 구성하는 세포 안으로 확연하게 잘 들어가는 것을 확인하였다(도 22).
실험예 12 : 쥐의 피부로의 시간에 따른 AP- EGFP 의 전달
본 발명의 AP가 피부조직으로도 전달되는 것인지, 전달이 된다면 어느 깊이까지 전달이 될 수 있는지 확인하기 위하여 C57BL/6 종의 7주된 암컷 쥐 털을 제거후, 테이프 접착 10회를 하여 각질층을 제거한 피부에 100 μg의 AP-EGFP를 종이패치를 이용하여 부착하였다. 각각 2, 4, 6 및 8 시간 후 피부조직을 얻어 4% 파라포름알데히드로 고정한 뒤, O.C.T 화합물을 이용해 얼린 블록을 제작하였다. 이후 크라이오스탯 (cryostat)을 이용하여 7 μm의 두께로 절편을 만들어 슬라이드 샘플을 제작, 형광 현미경을 통하여 피부조직 내 AP-EGFP의 전달 여부를 확인하였다. 슬라이드 제작 후 Hoechst로 15분간 염색한 뒤 형광 단백질과 겹쳐서 비교하는 과정을 통하여 세포 내부로 들어갔는지의 여부를 확인하였다. 종래의 세포 투과 펩티드가 결합된 TAT-EGFP를 양성대조군으로 사용하였다.
TAT-EGFP는 8 시간까지도 피부 조직 안으로 녹색 형광 단백질을 전달하지 못하였으나, AP가 연결된 녹색 형광 단백질(몌-EGFP)은 2 시간째부터 피부조직을 구성하는 세포 안으로 확연하게 잘 들어가는 것을 확인하였다(도 23).
실험예 13 : 쥐의 피부로의 AP- dTomato 와 종래 피부 투과성 펩티드들과의 단백질의 전달 효율 비교
본 발명의 AP가 분자량이 큰 dTomato 형광단백질과 결합된 경우에도 피부 조직으로 형광단백질을 전달하는지 종래 피부 투과성 펩티드들과 비교하여 실험하였다. 실험예 3과 동일하게 음성 대조군으로는 세포 투과성 펩티드가 연결되어 있지 않은 dTomato 형광단백질을 사용하고, 양성 대조군으로는 피부 투과성 펩티드에 dTomato 형광단백질을 결합시킨 TAT-dTomato, TDP1-dTomato, TDP2-dTomato를 사용하여 비교해 보았다. 실험예 12와 동일하게 실험하되 4 시간 째 피부조직을 얻어 실험에 이용하였다.
본 발명의 AP-dTomato 만이 피부조직 내로 dTomato 형광단백질을 전달하고 있음을 확인하였다(도 24).
실험예 14 : 녹색 형광 단백질 적중 쥐의 피부로의 AP- dTomato 의 전달
본 발명의 AP가 피부조직 내 피부세포로 전달되는 것인지 명확히 확인하기 위하여 모든 세포에서 녹색 형광 단백질(GFP)를 발현하는 GFP 유전자 적중 쥐 피부에 실험예 12와 동일한 방법으로 종이패치를 이용하여 AP-dTomato 형광 단백질을 부착하였다. 4시간 후 피부조직을 얻어 4% 파라포름알데히드로 고정한 뒤, O.C.T 화합물을 이용해 얼린 블록을 제작하였다. 이후 크라이오스탯 (cryostat)을 이용하여 20 μm의 두께로 절편을 만들어 슬라이드 샘플을 제작, 공초점 현미경을 통하여 피부조직 내 AP-EGFP의 전달 여부를 확인하였다.
슬라이드 제작 후 Hoechst로 15분간 염색한 뒤 형광 단백질과 겹쳐서 비교하는 과정을 통하여 세포 내부로 들어갔는지의 여부를 확인하여 도 25 및 도 26에 나타내었다. 대조군으로는 피부 투과 펩티드가 연결되지 않은 dTomato를 음성대조군으로 사용하였다.
그 결과 dTomato와 비교하여 AP가 연결된 붉은색 형광 단백질은 피부조직을 구성하는 세포 안으로 확연하게 잘 들어가는 것을 확인하였고(도 25), 고배율의 이미지를 통해서도 AP-dTomato 형광단백질이 GFP를 발현하는 녹색 세포 내에 잘 전달됨을 확인하였다(도 26).
실험예 15 : 대장균에서 AP- EGFP 단백질과 AP- rPTP 단백질의 발현 및 정제
제조예 4로부터 정제한 AP-EGFP 단백질과 제조예 7에서 정제한 AP-rPTP 단백질을 12% SDS 젤 전기영동을 통해 확인하였고, 이의 결과를 도 27에 나타내었다.
도 27에 나타난 바와 같이, 두 단백질 모두 대장균으로부터 제대로 발현되었으며, 잘 정제되었음을 확인할 수 있다.
실험예 16 : AP- rPTP 단백질의 3차원 구조
도 28은 제조예 7로부터 정제된 AP-rPTP 단백질의 3차원 구조를 예측하여 나타낸 도면이다. 이는 Sparks X(http://sparks-lab.org)에 의해 예측되었고, PyMOL을 사용하여 시각화하였다.
도 28에 나타난 바와 같이 AP-rPTP 단백질의 3차원 입체 구조는 원래 rPTP 단백질 구조를 거의 그대로 유지하고 있는 것으로 나타났으며, 구조의 급격한 변화는 관찰되지 않았다.
실험예 17 : AP- EGFP 단백질 및 AP- rPTP 단백질의 phosphatase 활성 측정
도 29는 제조예 4로부터 정제한 AP-EGFP 단백질과 제조예 7로부터 정제된 AP-rPTP 단백질의 phosphatase 활성을 측정하여 나타낸 것이다.
AP-EGFP 단백질 및 AP-rPTP 단백질에서 phosphatase 활성을 측정하기 위하여 AP-EGFP 단백질과 AP-rPTP 단백질에 발색체 기질을 첨가한 후, pNPP((para-nitrophenyl phosphate) phosphatase) 에세이(BioAssay 517 Systems, Hayward, CA, USA)를 사용하여 분석하였다.
이때 데이터는 단백질 농도에 따른 초기 비율(V0)의 플롯으로 나타내었다. 통계학적 분석은 one-way ANOVA에 의해서 수행되었다. *P<0.001.
도 29에 나타난 바와 같이, AP-rPTP 단백질의 phosphatase 활성은 1.5 nmol/min/㎍이였으나, AP-EGFP 단백질은 활성이 전혀 관찰되지 않았다.
실험예 18 : 피부 세포 안으로 AP- rPTP 단백질의 전달 효율 확인
HaCaT 세포주는 인간 표피 세포주로서 경피 전달 실험 및 피부질환 논문에서 생체외 전달 효율 및 기작 확인을 위하여 사용되어 온 세포주이다[J Invest Dermatol. 2011 Jul;131(7):1477-85; Biochem Pharmacol. 2008 Mar 15;75(6):1348-57.].
상기 HaCaT 세포주를 이용하여 본 발명의 AP-rPTP 단백질이 피부 세포에 전달할 수 있는지 도 30에 나타내었다. 이때, 상기 AP-rPTP 단백질을 항 His tag 항체로 염색하였고, 이의 신호는 Alexa Fluor-488-결합된 anti-mouse LgG 항체로 증폭하였으며, 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 세포 내 형광 강도를 측정하였다.
도 30은 제조예 7로부터 제조된 AP-rPTP 단백질이 피부 표피 세포주인 HaCaT 세포 내로 단백질을 전달하는 효율을 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 측정한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다. 도 30에서 우측 그래프의 x 축 MFI는 'mean fluorescence intensity'를 의미하는 것으로, 형광 강도를 나타낸다.
도 30에 나타난 바와 같이, 1 시간동안 1 또는 5 μM AP-rPTP 단백질을 처리하였을 때, 이들 모두 세포 내부 전달 효과는 매우 우수함을 확인하였다.
실험예 19 : 피부 세포 안으로 AP- rPTP 단백질의 시간에 따른 전달 효율 확인
HaCaT 세포주는 인간 표피 세포주로서 경피 전달 실험 및 피부질환 논문에서 생체외 전달 효율 및 기작 확인을 위하여 사용되어 온 세포주이다[J Invest Dermatol. 2011 Jul;131(7):1477-85; Biochem Pharmacol. 2008 Mar 15;75(6):1348-57.].
상기 HaCaT 세포주에 AP-rPTP 단백질을 다양한 시간(0.5 내지 12 시간)동안 처리한 후, 피부 세포에 전달할 수 있는 효율을 비교하여 도 31에 나타내었다.
이때, 상기 AP-rPTP 단백질을 항 His tag 항체로 염색하였고, 이의 신호는 Alexa Fluor-488-결합된 anti-mouse LgG 항체로 증폭하였으며, 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 세포 내 형광 강도를 측정하였다.
도 31은 제조예 7로부터 제조된 AP-rPTP 단백질이 피부 표피 세포주인 HaCaT 세포 내로 단백질을 전달하는 효율을 시간에 따라, 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 측정한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다. 도 31에서 우측 그래프의 x 축 MFI는 'mean fluorescence intensity'를 의미하는 것으로, 형광 강도를 나타낸다.
도 31에 나타낸 바와 같이, 2 시간 동안 처리하였을 때가 최대 형광 강도를 나타내는 것으로 확인되었고, 이후부터 급격하게 감소하다가 12 시간부터 안정적으로 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 본 발명의 AP-rPTP 단백질은 처리시간이 1 내지 8 시간이면 충분한 세포 내 전달 효율을 달성할 수 있으나, 1.5 배 이상의 세포 내 전달효율을 달성하기 위해서는 1.5 내지 3.5 시간동안 처리되는 것이 가장 바람직하다.
실험예 20 : 비장세포 내에서, AP- rPTP 단백질의 신호전달 저해 효율 확인
본 실험예에서는 AP-rPTP 단백질이 사이토카인 신호를 저해하는지 여부를 확인하고자 한 것으로, 구체적으로 6-8 주령의 C57BL/6 마우스로부터 채추된 비장세포를 PBS, AP-rPTP 및 AP-EGFP로 각각 1 시간동안 37 ℃에서 배양한 후, 상기 비장세포를 다음의 사이토카인으로 활성화하였다. 재조합 마우스 IFN-γ(10 ng/㎖; BD), IL-4(20 ng/㎖; BD), IL-6(30 ng/㎖; BD). 상기 세포는 PBS와 RIPA 버퍼(Cell signaling, Becerly,, MA, USA)(1 mM NaF, 1 mM PMSF 및 Halt protease 및 phosphatase 저해제 칵테일)(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 포함함)로 30 분동안 얼음 중탕에서 세척하여 준다.
각 사이토카인 자극 단계별 STAT 단백질의 tyrosine phosphorylation을 면역블롯 방법을 통해 측정하여 나타내었다. 면역블롯(immunoblotting)은 PVDF 막(Bio-Rad)를 사용하였고, 일차 항체는 phospho-Stat1(Tyr701) 래빗 mAb, phopspho-Stat3(Tyr705) 래빗 mAb, phospho-Stat6(Tyr641) 래빗 mAb를 사용하였다. 이들은 세포 신호와 β-액틴 마우스 mAb(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)로부터 구입하였다.
도 32는 AP-rPTP 단백질이 처리된 마우스 비장세포(splenocytes)에서 사이토카인(cytokines) 자극에 미치는 영향을 나타낸다. 밴드의 좌측 상단에 표기된 IFN-γ, IL-6, IL-4는 각 밴드가 해당 사이토카인으로 자극된 것임을 나타내는 것이다.
여기서 NA란 면역세포가 활성화될 수 있는 자극을 주지 않은 것으로 음성 대조군에 해당하며, PBS는 면역세포가 활성화될 수 있도록 anti-CD3, anti-CD28 monoclonal antibody로 자극을 준 것으로, 이는 일종의 양성 대조군이고, 제시된 결과는 4회의 독립적인 실험 중 대표적인 것을 나타내었다 (n = 4).
도 32에 나타난 바와 같이, 1 시간동안 AP-rPTP 또는 AP-EGFP 단백질로 배양한 후, 이를 IFN-γ, IL-6, IL-4 순서대로 60분, 30분, 15 분으로 자극한 결과에 따른 STAT 단백질의 인산화 정도를 비교하여한 결과, AP-rPTP 단백질로 처리한 경우 STAT1, STAT3, STAT6의 인산화 반응(phosphorylation)이 상당히 감소한 것을 확인할 수 있었다.
결론적으로 본 발명에 따른 AP-rPTP 단백질은 면역세포에서 사이토카인 신호에 대해 음성 조절제(negatively regulates) 역할을 수행한다고 여길 수 있다.
실험예 21 : 비장세포 내에서, AP- rPTP 단백질의 CD4 T 세포의 증식 효율 확 인
본 발명에 따른 AP-rPTP 단백질이 T 세포 활성에서도 조절제 역할을 수행할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 하기 방법을 통해 분석하였다.
96 well plate에 0.1 ug의 anti-CD3, anti-CD28 antibody를 37 ℃, 0.5 % 이산화탄소 세포 배양기에서 5 시간 동안 코팅한다. 이후 분리해낸 쥐의 비장 세포를 각 well당 2.5 X 105 cell 씩 분주한다. 여기에 PBS 혹은, AP-rPTP 단백질을 처리한 뒤 3 일 동안 37 ℃, 0.5% 이산화탄소 세포 배양기에서 배양한다. 이후 세포를 CFSE(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 형광으로 4 ℃에서 20 분간 염색하였다. 이후 상술한 과정을 통해 제조된 세포로부터 CFSE 신호를 유세포분석기(FACS)를 통하여 비교 분석하였다.
도 33a, b는 NA 또는 PBS 처리한 일차 마우스 CD4-T 세포들('NA' 및 'α-CD3αCD28+PBS')에서의 증식을 측정한 그래프이고, 도 33c는 일차 마우스 CD4-T 세포들에서 AP-rPTP 단백질을 처리하였을 때의 CD4 T 세포 증식을 조사하여 나타낸 그래프이다.
여기서 NA란 T 세포가 활성화될 수 있는 자극을 주지 않은 것으로 음성 대조군에 해당하며, PBS는 T 세포가 활성화될 수 있도록 anti-CD3, anti-CD28 monoclonal antibody로 자극을 준 것으로, 이는 일종의 양성 대조군이다.
도 33에 나타난 바와 같이 활성화된 T 세포로부터 생성된 사이코카인과 CD4 T 세포 증식(proliferation)을 항-CD3과 CD28 항체로 자극(stimulation)에 따라 평가한 결과, AP-rPTP는 활성화된 T 세포 증식(proliferation)을 상당히 감소시키는 것으로 확인되었다.
실험예 22 : 비장세포 내에서, AP- rPTP 단백질과 AP- EGFP 단백질의 사이토카인 발현양 비교
96 well plate에 각각 2 ㎍/㎖(BD pharmingen)의 anti-CD3, anti-CD28 antibody를 37 ℃, 0.5 % 이산화탄소 세포 배양기에서 5 시간 동안 코팅한다. 이후 분리해낸 쥐의 비장 세포를 각 well당 2.5 X 105 cell 씩 분주한다. 여기에 AP-EGFP 혹은 AP-rPTP 단백질을 처리한 뒤 3 일 동안 37 ℃, 0.5% 이산화탄소 세포 배양기에서 배양한다. 이후 세포의 배양 상충액(supernatant)로부터 IFN-γ(BioLegend), IL-2(BioLegend), IL-13(Ebioscience) 및 IL-17(Ebioscience)을 ELISA 분석을 통해 측정하여 도 34에 나타내었다. 이때 상기 ELISA는 Biolegend사에서 시판하는 kit를 이용하였으며, 이의 표준 protocol대로 수행하였다.
도 34는 AP-rPTP 및 AP-EGFP 단백질에 따른 마우스 비장세포에서의 사이토카인 발현양(IL-17(a), IL-13(b), IFN-γ(c) 및 IL2(d))을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 모든 데이터는 최소 세 번의 실험을 수행한 것들의 평균 수치이며, 상기 수치들은 평균 ± s.e.m.을 나타내며, *는 p<0.05; **는 p<0.01; ***는 p<0.001을 나타내었고, 통계학적 분석은 one-way ANOVA에 의해 수행되었다.
도 34에 나타낸 바와 같이 농도 의존성에 따라(dose-dependent manner) IL-2, IFN-γ, IL-13, IL-17을 포함하는 다양한 사이토카인의 생성도 상당히 감소하고 있음을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 본 발명에 따른 AP-rPTP 단백질은, 염증(inflammatory) 사이토카인 신호뿐만 아니라 T 세포 활성 및 증식 모두를 조절하는 잠재적 면역 조절제(modulator) 역할을 수행할 수 있음을 확인하였다.
실험예 23 : Oxazolone 유도 접촉성 피부염 동물모델에서 AP- rPTP 단백질의 치료 효과 확인
암컷 7 주령의 C57BL/6 쥐의 털을 제모제를 이용하여 제거 후 다음날, 아세톤 : 올리브오일 (4:1) 용액에 섞어 만든 2% oxazolone을 쥐의 귀의 한쪽 면 당 10 ㎕씩 뿌려 감작시킨다. 감작 5일 후 1% oxazolone용액을 동일하게 뿌려 피부염을 유발한다. AP-rPTP 단백질은 감작과 유도 사이에 총 6회 종이패치를 이용하여 귀의 양쪽면에 부착 후 100 μg 씩 도포한다. 분석은 1% oxazolone 유도 다음날 진행한다(도 35).
그 결과 AP-rPTP를 도포한 쥐 그룹의 귀가 음성대조군인 PBS 처리 귀에 비해 염증이 저해된 것을 확인하였고(도 36), 마이크로미터 (mitutoyo)를 이용하여 귀 두께를 측정한 결과 AP-rPTP를 도포한 그룹의 귀 두께가 음성대조군과 비교하여 얇아졌으며(도 37), 귀 무게 또한 줄어든 것을 관찰하였다(도 38).
보다 구체적으로 확인하기 위하여 귀를 4% 포름알데하이드로 하루동안 고정한 뒤, 30% 수크로즈에 하루 동안 담가 탈수시킨 조직을 O.C.T 화합물을 이용하여 동결절편을 만들었다. 10 ㎛로 절편을 만든 후 H&E 염색기법으로 절편을 염색하여 광학 현미경으로 관찰하였다. 그 결과 음성대조군과 비교하여 귀 두께가 감소함을 확인하였다(도 39).
rPTP를 매개로 하여, 병리학적 조절 기능을 부여하기 위해서, AP 대신 종래의 세포 투과성 펩티드를 이용한, TAT-rPTP 융합체 또는 R9-rPTP 융합체로도 실험하였으나, 이들은 모두 Ap-rPTP와 같은 병리학적 조절기능을 발휘하지 못하는 것을 확인하였다. 즉 결과 상에 있어서 음성대조군과 비교하여 큰 변화가 관찰되지 않았으므로 별도로 이를 도시화하지 아니하였다.
실험예 24 : Oxazolone ( OXA ) 유도 접촉성 피부염 동물모델의 피부로부터 사이토카인과 케모카인의 mRNA 발현 비교
실험예 23으로부터 제조된 Oxazolone 유도 접촉성 피부염 동물모델의 피부로부터 사이토카인(IL-1β, IL-6)의 mRNA 발현양을 측정 및 정량화하여 도 40에 나타내었고, 케모카인(CXCL2, CXCL5)의 mRNA 발현양을 측정하여 정량화하여 도 41에 나타내었다.
흑색 그래프로 표기된 sham(모의 실험 대조군)과 비교하여 본 발명에 따른 AP-rPTP 단백질을 처리하였을 때(적색 그래프)가 가장 근접하게 사이토카인과 케모카인이 발현되었음을 확인하였다. 다만 AP-EGFP 단백질을 처리한 경우(초록 그래프) 사이토카인과 케모카인의 발현량이 본 발명의 AP-rPTP를 처리하였을 때 보다 현저히 증가하였을 알 수 있는데, 사이토카인은 최대 2배 이상 차이가 났고, 케모카인은 최대 3배 차이가 나는 것을 확인하였다.
다시 말해 AP-rPTP 단백질은 OXA로 유도된 급성 피부 염증을 앓고 있는 피부 조직에 대하여 염증 반응을 효과적으로 제어할 수 있음을 확인하였다.
실험예 25 : Ovalbumin (OVA) 유도된 만성(chronic) 피부염 동물모델에서 AP-rPTP 단백질의 예방 및 치료 효과 확인
암컷 7-8 주령의 BALB/c 암컷 쥐의 털을 제모제를 이용하여 제거 후 다음날, 100 ㎍ Ovalbumin(OVA)를 멸균 거즈를 이용하여 등쪽 조직에 도포하였다. 이러한 과정은 1 주간 총 3 차례에 걸쳐 진행되었고, 상기 단계 사이에는 2 주의 기일(term)을 두었다.
보다 구체적으로 예방 효과 확인을 위해서는 상기 총 3 차례의 단계마다 OVA와 함께 100 ㎍ AP-rPTP 단백질을 투여하였고, 치료 효과 확인을 위해서는 마지막 OVA 투여 단계에만 AP-rPTP 단백질을 함께 투여하였다(도 42).
보다 구체적으로 확인하기 위하여 귀를 4% 포름알데하이드로 하루동안 고정한 뒤, 30% 수크로즈에 하루 동안 담가 탈수시킨 조직을 O.C.T 화합물을 이용하여 동결절편을 만들었다. 6 ㎜로 절편을 만든 후 H&E 염색기법으로 절편을 염색하여 광학 현미경으로 관찰하였다. 그 결과 음성대조군(Sham)은 표피의 이상증식이 확인되었는데 반해, 본 발명에 따른 AP-rPTP를 처리한 경우(예방 또는 치료 모델에서) 등 두께 및 염증이 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 43).
도 44는 상기 도 43의 H&E 염색 결과의 총 조직학적 수치를 비교하여 나타낸 그래프로, 이에 따르면 마우스의 경피에 AP-rPTP 단백질을 처리함에 따라, 예방 모델과 치료 모델 둘 다에서 상당한 염증 조직이 감소되었음을 확인하였다.
도 45는 상기 예방 모델과 치료 모델의 피부 조직으로부터 IL-13 mRNA 발현량을 측정한 결과 그래프로, 이에 따르면 본 발명의 AP-rPTP 처리에 의해 IL-13 mRNA 발현이 현저히 감소하는 것을 알 수 있다.
상술한 결과를 종합하면 종이 패치를 통한 AP-rPTP의 경피 투여를 통해 급성 또는 만성 알러지 피부염의 염증을 상당히 감소시킬 수 있음을 알 수 있다. 즉 피부염에 대한 예방 및 치료 효과가 우수하다는 것을 확인하였다.
실험예 26 : 이미퀴모드(imiquimod)로 유도된 건선 (psoriasis-like) 피부염 동물모델에서 AP- rPTP 단백질의 예방 및 치료 효과 확인
본 발명에 따른 AP-rPTP 단백질은 염증성 사이토카인 신호와 T 세포 수용체 신호를 표적으로 하고 있으므로, 알러지 염증 반응뿐만 아니라, 다른 피부 질환에 대해서도 예방 또는 치료 효과를 나타낼 것이라 예상하여, 아래와 같은 실험을 통해 이를 증명하였다.
수컷 7 주령의 C57BL/6 쥐의 털을 제모제를 이용하여 제거 후 다음날부터, 20 ㎎ Aldara cream(이미퀴모드(imiquimod) 5%)와 100 ㎍ AP-rPTP 또는 AP-EGFP를 함께 매일매일 1 시간동안 종이 패치를 사용하여 쥐의 귀에 부착하였다(도 46). 매일매일 귀의 두께(thickness)를 측정하여 도 47에 나타내었다. 7일 째에 병리학적(phathology) 분석을 수행하여 그 결과를 도 48 내지 50에 나타내었다.
도 47은 이미퀴모드(imiquimod)로 유도된 건선(psoriasis-like) 피부염 동물모델에 AP-rPTP와 AP-EGFP를 6일 동안 처리하는 동안의 귀 두께 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 47에 나타난 바와 같이 마이크로미터 (mitutoyo)를 이용하여 귀 두께를 측정한 결과, AP-rPTP를 도포한 쥐 그룹의 귀가 음성대조군인 Sham 처리 귀에 비해 귀 두께가 크게 두꺼워지지 않는 것을 확인하였고, AP-rPTP를 도포한 그룹의 귀 두께가 AP-EGFP를 처리한 그룹의 귀와 비교하여 얇아진 것을 확인할 수 있었다.
도 48은 AP-rPTP 또는 AP-EGFP를 처리한 쥐 그룹의 귀와 음성대조군(Sham)의 귀를 H&E 염색법으로 염색하여 귀 두께의 차이를 광학현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 48에 나타난 바와 같이, AP-rPTP로 처리한 경우, AP-EGFP로 처리하였을 때보다 염증 세포 침투와 표피 이상증식 현상이 현저히 감소되었음을 확인할 수 있다.
도 49는 AP-rPTP 또는 AP-EGFP를 처리한 쥐 그룹의 귀와 음성대조군(Sham)의 귀 조직 세포에서 측정된 사이토카인(IL-7A, IL-17F, IL-6) mRNA 발현량을 정량화하여 나타낸 그래프이고, 도 50은 AP-rPTP 또는 AP-EGFP를 처리한 쥐 그룹의 귀와 음성대조군(Sham)의 귀 조직 세포에서 측정된 항균(antimicrobial) 펩티드(S100A8, S100A9) mRNA 발현량을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 49 및 도 50에 나타난 바와 같이 귀 피부 조직에 대한 mRNA 발현 프로파일을 조사한 결과, AP-rPTP를 경피 투여하였을 때 IL-17A, IL-17F 및 IL-6 mRNA 발현이 급격히 감소하였음을 확인하였다.
또한 AP-rPTP 투여를 통해 호중성 백혈구에 대해 주화성을 가지고 있는 S100A8의 펩티드와 S100A9 펩티드도 뚜렷하게 감소하는 것을 확인할 수 있다. 종합하면 AP-rPTP는 경피 투여를 통해 건선 피부 질환에 대해서도 매우 효과적인 예방 및 치료효과를 갖고 있음을 알 수 있다.
<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> fusion peptides associated with inflammatory skin disease and phamaceutical composition comprising the same <130> HPC6915 <150> KR 10-2015-0128275 <151> 2015-09-10 <160> 22 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Skin penetrating peptide; AP <400> 1 Arg Arg Arg Trp Cys Lys Arg Arg Arg 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Skin penetrating peptide; AP <400> 2 Arg Arg Trp Cys Lys Arg Arg Arg 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Skin penetrating peptide; AP <400> 3 Arg Arg Arg Trp Cys Lys Arg Arg 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Skin penetrating peptide; AP <400> 4 Arg Arg Trp Cys Lys Arg Arg 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Skin penetrating peptide; AP <400> 5 Arg Arg Arg Ala Cys Lys Arg Arg Arg 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Skin penetrating peptide; AP <400> 6 Arg Arg Arg Trp Ala Lys Arg Arg Arg 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Skin penetrating peptide; AP <400> 7 Arg Arg Arg Trp Cys Ala Arg Arg Arg 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Skin penetrating peptide; AP <400> 8 Arg Arg Arg Arg Cys Lys Arg Arg Arg 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Skin penetrating peptide; AP <400> 9 Arg Arg Arg Trp Arg Lys Arg Arg Arg 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Skin penetrating peptide; AP <400> 10 Arg Arg Arg Trp Cys Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Skin penetrating peptide; AP <400> 11 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Skin penetrating peptide; AP <400> 12 Arg Arg Arg Arg Cys Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 13 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP forward primer <400> 13 ctagctagcc gccggcgctg gtgcaaacgc cgccggggat ccgtgagcaa gggcgaggag 60 ctgttcac 68 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP reverse primer <400> 14 caagctttta cttgtatagc tcgtc 25 <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> skin penetrating peptide; TDP1 <400> 15 Asn Gly Ser Leu Asn Thr His Leu Ala Pro Ile Leu 1 5 10 <210> 16 <211> 262 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TDP1-dTomato <400> 16 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Asn Gly 1 5 10 15 Ser Leu Asn Thr His Leu Ala Pro Ile Leu Gly Ser Met Val Ser Lys 20 25 30 Gly Glu Glu Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys Val Arg Met Glu 35 40 45 Gly Ser Met Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly 50 55 60 Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly 65 70 75 80 Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr 85 90 95 Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Lys 100 105 110 Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe 115 120 125 Glu Asp Gly Gly Leu Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp 130 135 140 Gly Thr Leu Ile Tyr Lys Val Lys Met Arg Gly Thr Asn Phe Pro Pro 145 150 155 160 Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Thr 165 170 175 Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Glu Ile His Gln 180 185 190 Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu Val Glu Phe Lys Thr 195 200 205 Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Tyr Tyr Tyr Val 210 215 220 Asp Thr Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val 225 230 235 240 Glu Gln Tyr Glu Arg Ser Glu Gly Arg His His Leu Phe Leu Tyr Gly 245 250 255 Met Asp Glu Leu Tyr Lys 260 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> skin penetrating peptide; TDP2 <400> 17 Met Arg Ala Ala Ala Pro Ala Val Ala Ala 1 5 10 <210> 18 <211> 260 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TDP2-dTomato <400> 18 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Arg 1 5 10 15 Ala Ala Ala Pro Ala Val Ala Ala Gly Ser Met Val Ser Lys Gly Glu 20 25 30 Glu Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys Val Arg Met Glu Gly Ser 35 40 45 Met Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro 50 55 60 Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro 65 70 75 80 Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser 85 90 95 Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Lys Lys Leu 100 105 110 Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp 115 120 125 Gly Gly Leu Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Thr 130 135 140 Leu Ile Tyr Lys Val Lys Met Arg Gly Thr Asn Phe Pro Pro Asp Gly 145 150 155 160 Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Thr Glu Arg 165 170 175 Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Glu Ile His Gln Ala Leu 180 185 190 Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu Val Glu Phe Lys Thr Ile Tyr 195 200 205 Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Tyr Tyr Tyr Val Asp Thr 210 215 220 Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln 225 230 235 240 Tyr Glu Arg Ser Glu Gly Arg His His Leu Phe Leu Tyr Gly Met Asp 245 250 255 Glu Leu Tyr Lys 260 <210> 19 <211> 313 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AP-PTPN2 <400> 19 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Ala Ser Arg Arg Arg Trp Cys Lys Arg Arg Arg 20 25 30 Glu Phe Ile Glu Arg Glu Phe Glu Glu Leu Asp Ala Gln Cys Arg Trp 35 40 45 Gln Pro Leu Tyr Leu Glu Ile Arg Asn Glu Ser His Asp Tyr Pro His 50 55 60 Arg Val Ala Lys Phe Pro Glu Asn Arg Asn Arg Asn Arg Tyr Arg Asp 65 70 75 80 Val Ser Pro Tyr Asp His Ser Arg Val Lys Leu Gln Ser Thr Glu Asn 85 90 95 Asp Tyr Ile Asn Ala Ser Leu Val Asp Ile Glu Glu Ala Gln Arg Ser 100 105 110 Tyr Ile Leu Thr Gln Gly Pro Leu Pro Asn Thr Cys Cys His Phe Trp 115 120 125 Leu Met Val Trp Gln Gln Lys Thr Lys Ala Val Val Met Leu Asn Arg 130 135 140 Thr Val Glu Lys Glu Ser Val Lys Cys Ala Gln Tyr Trp Pro Thr Asp 145 150 155 160 Asp Arg Glu Met Val Phe Lys Glu Thr Gly Phe Ser Val Lys Leu Leu 165 170 175 Ser Glu Asp Val Lys Ser Tyr Tyr Thr Val His Leu Leu Gln Leu Glu 180 185 190 Asn Ile Asn Thr Gly Glu Thr Arg Thr Ile Ser His Phe His Tyr Thr 195 200 205 Thr Trp Pro Asp Phe Gly Val Pro Glu Ser Pro Ala Ser Phe Leu Asn 210 215 220 Phe Leu Phe Lys Val Arg Glu Ser Gly Cys Leu Thr Pro Asp His Gly 225 230 235 240 Pro Ala Val Ile His Cys Ser Ala Gly Ile Gly Arg Ser Gly Thr Phe 245 250 255 Ser Leu Val Asp Thr Cys Leu Val Leu Met Glu Lys Gly Glu Asp Val 260 265 270 Asn Val Lys Gln Leu Leu Leu Asn Met Arg Lys Tyr Arg Met Gly Leu 275 280 285 Ile Gln Thr Pro Asp Gln Leu Arg Phe Ser Tyr Met Ala Ile Ile Glu 290 295 300 Gly Leu Glu His His His His His His 305 310 <210> 20 <211> 271 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rPTP peptide <400> 20 Ile Glu Arg Glu Phe Glu Glu Leu Asp Ala Gln Cys Arg Trp Gln Pro 1 5 10 15 Leu Tyr Leu Glu Ile Arg Asn Glu Ser His Asp Tyr Pro His Arg Val 20 25 30 Ala Lys Phe Pro Glu Asn Arg Asn Arg Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ser 35 40 45 Pro Tyr Asp His Ser Arg Val Lys Leu Gln Ser Thr Glu Asn Asp Tyr 50 55 60 Ile Asn Ala Ser Leu Val Asp Ile Glu Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Ile 65 70 75 80 Leu Thr Gln Gly Pro Leu Pro Asn Thr Cys Cys His Phe Trp Leu Met 85 90 95 Val Trp Gln Gln Lys Thr Lys Ala Val Val Met Leu Asn Arg Thr Val 100 105 110 Glu Lys Glu Ser Val Lys Cys Ala Gln Tyr Trp Pro Thr Asp Asp Arg 115 120 125 Glu Met Val Phe Lys Glu Thr Gly Phe Ser Val Lys Leu Leu Ser Glu 130 135 140 Asp Val Lys Ser Tyr Tyr Thr Val His Leu Leu Gln Leu Glu Asn Ile 145 150 155 160 Asn Thr Gly Glu Thr Arg Thr Ile Ser His Phe His Tyr Thr Thr Trp 165 170 175 Pro Asp Phe Gly Val Pro Glu Ser Pro Ala Ser Phe Leu Asn Phe Leu 180 185 190 Phe Lys Val Arg Glu Ser Gly Cys Leu Thr Pro Asp His Gly Pro Ala 195 200 205 Val Ile His Cys Ser Ala Gly Ile Gly Arg Ser Gly Thr Phe Ser Leu 210 215 220 Val Asp Thr Cys Leu Val Leu Met Glu Lys Gly Glu Asp Val Asn Val 225 230 235 240 Lys Gln Leu Leu Leu Asn Met Arg Lys Tyr Arg Met Gly Leu Ile Gln 245 250 255 Thr Pro Asp Gln Leu Arg Phe Ser Tyr Met Ala Ile Ile Glu Gly 260 265 270 <210> 21 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AP-rPTP forward primer <400> 21 ctagctagcc gccggcgctg gtgcaaacgc cgccggggat ccgaattcat cgagcgggag 60 ttc 63 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AP-rPTP reverse primer <400> 22 ccgctcgagt ccttctatta tgg 23

Claims (13)

  1. 서열번호 1 내지 12로 이루어진 아미노산 서열 중에서 선택되는 어느 하나의 피부 투과성 펩티드; 및
    서열번호 20으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 rPTP 펩티드;가 결합된 융합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 피부 투과성 펩티드와 rPTP 펩티드 결합은 펩티드 결합 또는 화학적 결합인 것을 특징으로 하는 융합체.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 화학적 결합은 이황화 결합, 디아민 결합, 황화-아민 결합(sulfde-amine bonds), 카르복시-아민 결합(carboxyl-amine bonds), 에스테르 결합(ester bonds) 및 공유 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 융합체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 피부 투과성 펩티드는 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 8 또는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 융합체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 융합체는 서열번호 19로 이루어진 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 융합체.
  6. 제1항에 따른 융합체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
  7. 청구항 제1항에 따른 융합체를 유효성분으로 하는 화장료 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 조성물은 에멀젼, 크림, 에센스, 스킨, 리포솜, 마이크로캡슐, 복합 입자, 샴푸 및 린스로 이루어진 군으로부터 선택된 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  9. 청구항 제1항에 따른 융합체를 유효성분으로 포함하는 피부 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 융합체는 피부 각질층을 투과하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  11. 삭제
  12. 제9항에 있어서,
    상기 피부 염증성 질환은 염증성 피부염, 건선증, 상처, 아토피성 질환인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  13. 청구항 제9항에 따른 피부외용제용 약학 조성물을 개체의 피부에 도포하여, 인간을 제외한 동물의 피부 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
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