KR100787393B1

KR100787393B1 - 세포 도입성 ｆｋ506 결합 단백질의 융합 단백질

Info

Publication number: KR100787393B1
Application number: KR1020060026318A
Authority: KR
Inventors: 최수영; 박진서; 음원식; 김대원; 최진희; 김태윤; 권형주
Original assignee: 학교법인 한림대학교
Priority date: 2006-03-23
Filing date: 2006-03-23
Publication date: 2007-12-21
Anticipated expiration: 2026-03-23
Also published as: US7902346B2; KR20070096262A; US20080280830A1; WO2007108595A1

Abstract

본 발명은 FK506 결합 단백질과 단백질 수송도메인이 공유결합된 FK506 결합단백질 융합 단백질을 제조함으로써 피부 표면에 적용시킬 때 용이하게 진피 내로 또는 세포 내로 도입(penetration) 가능한 FK506 결합단백질 융합 단백질에 관한 것으로서, 좀더 자세히는 본 발명의 단백질 수송 도메인은 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성되어 있으며, 대조군과 비교할 때 원활히 세포 내로 농도 의존적, 시간 의존적으로 침투하며, 세포 내에서 48시간 이상 지속되었고 피부 세포사를 억제하는 효과를 나타내었다.

FK506, 융합 단백질, 세포 도입

Description

세포 도입성 ＦＫ506 결합 단백질의 융합 단백질{Cell-transducing fusion protein which comprising FK506 binding protein and protein transducing domain}

도 1은 pep-1-FK506 결합단백질 융합 단백질 발현 벡터의 개략도. pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질 발현 벡터는 벡터 pET-15b를 바탕으로 하여 구성되었다. 합성 pep-1 올리고머는 pET-15b의 NdeⅠ, XhoⅠ 제한부위에, 그리고 사람 FK506 결합단백질 cDNA는 pET-15b의 XhoⅠ, BamHⅠ 제한부위에 삽입되었다. 발현은 IPTG를 가하여 유도되었다.

도 2는 pep-1-FK506 결합단백질 융합 단백질의 발현과 정제에 관한 사진이다. 세포의 단백질 추출물과 정제된 융합 단백질이 12% SDS-PAGE(A 및 B)로 분석되었고 항-래빗 폴리히스티딘 항체로 웨스턴 블랏 분석되었다(C).

도 3은 pep-1-FK506 결합단백질 융합 단백질의 세포 도입을 나타내는 사진이다. (A) 0.5~5μM pep-1-FK506 결합단백질 융합 단백질이 배양 배지에 60분간 가해졌다. (B) 3μM의 PEP-1-FK506 결합단백질 융합 단백질이 배양 배지에 10~60분간 가해졌다.

도 4는 3μM pep-1-FK506결합단백질 융합단백질로 1~60시간 처리한 세포를 웨스턴 블랏으로 분석한 사진이다.

도 5는 세포 내 도입된 pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질이 LPS-유도된 COX-2 발현을 억제하는 것을 나타내는 사진이다. 피부세포를 10μM의 pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질, 대조군 FK506, 및 FK506가 없는 상태와 있는 상태 등의 조합으로 LPS에 노출시켰다.

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알러지(Allergy)는 대부분의 사람들에게는 아무런 반응을 나타내지 않다가 외부에서 침입한 이 물질에 대해 인체의 면역 기전이 보통보다 지나치게 이상 반응을 보이는 현상이다. 특히 현대인들에게 급증하고 있는 알러지 질환 중의 하나인 아토피 피부염(atopy dermatitis)은 심한 가려움증을 나타내는 재발성 만성 염증성 피부염으로서 주로 유아나 소아에서 시작되며, 성인기까지 지속되거나 성인이 되었을 때 발병되기도 한다. 아토피 피부염은 소양증(pruritus), 일괄적이고 특징적인 조직학적 패턴을 갖는 만성적 재발성 습진(eczema)등의 특징을 보이며, 만성기에는 태선화(lichenification), 표피 박리(excoriation)의 특징을 나타낸다. 아토피 환자 중의 일부는 알레르기성 비염, 천식, 호흡기 질환 등을 동반하기도 한다.

아토피의 근본적인 원인은 밝혀지지 않았지만, 유전적 요인 및 서구화된 생활 환경과 공해, 각종 화학 약물의 사용의 증가로 인한 환경오염, 항생제 사용의 증가 등 환경적 요인이 원인으로 알려지고 있다. 최근 연구에서 밝혀진 바로는 T_H2 사이토카인(cytokine)인 인터루킨 4(interleukin 4; IL-4)의 과잉생산은 혈청 내의 IgE의 농도를 증가시키고, T_H1 사이토카인인 인터페론-γ(IFN-γ)가 비정상적으로 낮게 발현되면 T_H2 세포의 기능을 저해한다. 즉, 이 두 물질 사이의 균형이 중요한데 아토피 피부염에서는 이 균형이 깨져서 IgE가 과잉 생산되게 된다. 이러한 면역 적인 요인도 아토피의 원인으로 알려지고 있다.

FK506 결합 단백질(FK506 binding protein; 본 명세서, 발명의 상세한 설명, 도면, 청구범위에서 "FK506BP"와 혼용함)은 사이클로필린 A와 같이 이뮤노필린 패밀리 중 하나로, 펩티딜-프롤릴-아이소머라제(peptidyl-prolyl-isomerase) 활성을 가진 풍부한 세포질 수용체 단백질(cytosolic receptor protein)이다. FK506결합단백질는 세포막에서 면역억제제(immunosuppressive drug)인 FK506, 라파마이신(rapamycin)과 결합하여 복합체(complex)를 형성하고, 이 복합체는 T 세포 활성화를 위한 신호체계에 관여하여 사이토카인의 발현을 조절한다. 또한 FK506결합단백질는 Ca²⁺신호전달(signaling)에도 관여하는 것으로 보고되고 있다.

생체 내 고분자들 특히 피부질환에서 FK506결합단백질를 치료목적으로 이용하려는 관심이 매우 높아지고 있다. 현재 가장 주목을 받고 있는 것은 유전자 치료이다. 그러나 유전자 치료는 유전자의 운반방법이 용이하지 않고, 표적세포에서의 발현이 낮고, 세포에서 단백질이 발현되는 기간이 짧고, 표적세포에서 발현되는 단백질의 양을 인위적으로 조절하기가 매우 어려운 점 등 여러 가지 문제점을 가진다.

치료를 위한 약물이나 단백질을 세포 내로 이동시키는데 있어서 목표 단백질을 세포막을 거쳐 직접 전달하는 방법을 생각할 수 있다. 그러나 단백질은 크기나 여러 생화학적 성질 때문에 세포막을 통과하기가 매우 어렵다. 일반적으로 분자량 600달톤 이상의 물질은 세포막을 통과하기가 거의 불가능한 것으로 알려져 있다.

최근, 단백질의 운반 방법 중 하나로 서열번호 3의 서열을 갖는 pep-1 펩타이드(본 명세서, 발명의 상세한 설명, 도면, 특허청구범위에서 "pep-1" 또는 "pep"과 혼용함)를 이용하여 자연상태의 이형 단백질을 세포 내로 운반할 수 있음이 밝혀졌다. pep-1 펩타이드는 21개의 아미노산(KETWWETWWTEW SQP KKKRKV)으로 이루어졌고, 세 개의 도메인(소수성 도메인, 스페이서, 친수성 도메인)을 갖고 있다. 지금까지, pep-1 펩타이드를 이용한 연구에서는 pep-1 펩타이드와 외부 단백질을 동시에 세포에 투여하였을 경우 자연상태로 단백질을 세포 내로 운반할 수 있다는 것만 밝혀졌다. 또한, pep 펩타이드는 Tat 단백질에 비해 단백질 치료제로서의 여러 가지 장점 즉, 매우 효율적으로 단백질을 세포 내로 투과시키고, 생리학적인 완충액에서의 안정성, 혈청에 대한 민감성의 결여 등을 나타낸다. 그러나, pep 펩타이드는 외부 단백질 즉, 녹색형광단백질(Green fluorescent protein, GFP), 베타갈락토시데이즈(β-galactosidase, β-Gal) 등과 일정한 비율로 맞추어 투여해야만 세포 내에 효과적으로 단백질이 운반되는 것으로 확인되었다. 그러나, 치료 단백질을 비롯한 모든 단백질이 pep-1에 의해 세포 내로 운반 가능한지는 아직까지 명확히 밝혀지지 않았다.

따라서, 본 발명의 목적은 FK506결합단백질의 세포 침투성을 높인 융합 단백질을 제공하려는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 pep-1을 포함하여 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인, 라이신을 다수 포함하는 친수성 도메인 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서로 구성된 단백질 수송 도메인을 FK506결합단백질의 적어도 일측 말단과 공유결합시킴으로써 세포 침투성을 극대화하려는 것이다.

그리하여, 본 발명자들은 자연상태의 단백질을 세포 내로 운반하는 pep-1 펩타이드를 외부 단백질인 사람 FK506결합단백질에 융합시켰고, 융합 단백질을 대장균에서 과대발현시켰으며, 금속 킬레이팅 친화 크로마토그래피로 쉽고 편리하게 정제하였다. 정제된 융합 단백질이 효과적으로 생물학적인 활성을 지니고 세포 내로 운반되는 것을 배양된 피부 세포 및 조직실험을 통하여 확인하였다. 그리고, pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질이 피부 세포 내로 운반되며 피부 세포사를 효과적으로 보호함을 밝혀냈다. 본 발명은 pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질이 세포 내 운반과 단백질 치료제, 화장료로서의 응용 가능성을 제기하였다.

본 발명에서는 먼저, pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질을 과대발현시키고 쉽게 정제할 수 있는 pep-1-FK506결합단백질 발현벡터를 개발하였다. 이 발현벡터는 인간 FK506결합단백질 cDNA, pep 펩타이드 그리고 여섯 개의 히스티딘이 연속적으로 연결되어 있다. 이 발현벡터를 이용하여 pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질을 대장균에서 과대발현시켜 자연상태로 Ni²⁺-친화 크로마토그래피 컬럼을 이용하여 정제하였다. pep-1-FK506결합단백질의 과대발현은 상당히 높게 나타났으며, 이런 결과로 정제된 단백질의 양도 높게 나타났다. 웨스턴 블랏으로 배양된 피부 세포에 정제된 pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질이 농도 및 시간 의존적으로 세포에 운반되는 것을 확인하였다. 세포 내로 투과된 pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질은 세포 내에서 최소 48시간 지속적으로 유지되었으며 세포 내로 투과된 pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질은 LPS에 의한 COX-2 발현을 효과적으로 억제하는 것을 알 수 있었다.

이러한 결과는 pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질이 세포 내로 투과가 잘 일어나고, 세포 내에서 FK506결합단백질의 기능을 잘 나타내고 있음을 의미한다. 따라서 이러한 pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질은 피부 질환 치료 분야에 다양하게 응용될 가능성을 제시해 준다.

pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 주사형태 또는 도포제로 제형화할 수 있다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.

이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 비경구 방식 즉, 피하 투여, 근육 투여 또는 국소적용(topical application)할 수 있으며, 용량은 일일 투여량이 0.001㎍~10㎎/㎏의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

또한, 본 발명의 융합 단백질을 유효성분으로 하는 도포제는 통상적인 제조방법에 따라 어떤 형태로든 용이하게 제조할 수 있다. 일례로서 크림형 도포제를 제조함에 있어서는 일반적인 수중유형(O/W) 또는 유중수형(W/O)의 크림 베이스에 본 발명의 pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질을 함유시키고 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등을 필요에 따라 사용하는 한편, 물성개선을 목적으로 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 병용할 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명의 융합 단백질은 화장료로서 이용할 수 있는데, pH 조절제, 향료, 유화제, 방부제 등을 필요에 따라 부가하여 통상의 화장료 제조 방법으로 화장수, 젤, 수용성 파우더, 지용성 파우더, 수용성 리퀴드, 크림 또는 에센스 등으로 제형화될 수 있다.

본 발명자들은 pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질을 마우스의 피부에 침투실험한 결과 진피층까지 원활하게 침투하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질을 약제 조성물 및/또는 도포제(본 명세서에서 "피부 외용제"와 동일한 의미로 사용함) 조성물의 주요성분으로 이용할 수 있음을 밝혔다.

본 발명은 FK506결합단백질를 세포 내 또는 피부 내부로 효율적으로 전달하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 FK506결합단백질 단백질 분자의 세포 내 전달은 FK506결합단백질에 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 4개 이상 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성된 수송 도메인이 공유결합된 세포투과성 수송도메인이 공유결합된 형태의 융합 단백질을 구성하여 수행된다. 본 발명의 상기 수송도메인의 일례로는 21개의 아미노산으로 구성되고, 서열번호 3과 같은 아미노산 서열로 이루어진 pep-1 펩타이드를 들 수 있다. 그러나, 본 발명의 단백질 수송 도메인이 서열번호 3의 pep-1 펩타이드로만 한정되는 것은 아니고, pep-1의 아미노산 서열 일부 치환이나 부가, 결여로 pep-1 펩타이드와 유사한 기능을 하는 펩타이드를 제조하는 것이 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자에게는 용이하므로, 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 4개 이상 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성된 단백질 수송 도메인과 이로부터 아미노산 일부 치환으로 동일·유사한 단백질 수송기능을 수행하는 단백질 수송 도메인을 이용한 융합 단백질도 본 발명의 범위에 속함은 자명하다고 할 것이다.

구체적으로, 본 발명은 pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질, 이 융합 단백질을 제조하기 위한 재조합 뉴클레오타이드와 벡터, 융합 단백질을 포함하는 치료, 예방 목적의 약학 조성물, 피부 외용제 조성물 등에 관한 것이다.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

"pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질"이란 단백질 수송 도메인과 FK506결합단백질를 포함하며, 수송 도메인과 화물 분자(cargo molecule, 즉 본 발명에서는 FK506결합단백질를 의미함)의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 본 명세서에서는 "pep-1-FK506결합단백질", "FK506결합단백질 융합 단백질" 또는 "pep-FK506결합단백질"와 혼용하였다.

또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.

또한, "표적 세포"란 수송 도메인에 의해 화물 분자가 전달되는 세포를 의미하는 것으로서 표적 세포는 체내 또는 체외의 세포를 말한다. 즉, 표적 세포는 체내 세포, 다시 말하여 살아있는 동물 또는 인간의 장기 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 표적 세포는 체외 세포, 즉 배양된 동물 세포, 인체 세포 또는 미생물을 포함하는 의미이다.

본 명세서의 "단백질 수송 도메인"은 펩타이드, 단백질과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 펩타이드나 단백질을 세포 내로 도입시킬 수 있는 것을 말하며, 예를 들면 pep-1 펩타이드(서열번호 3)를 말한다.

본 명세서의 "목표 단백질"은 pep-1 단백질 수송 도메인과 공유결합을 이루어 세포 내로 도입되어 활성을 나타내는 분자를 의미한다.

또한, 본 명세서에서는 단백질 또는 펩타이드를 세포 내로 "도입"시키는 것에 대하여 "형질도입", "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들과 혼용하였다.

본 발명은 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인, 라이신을 다수 포함하는 친수성 도메인 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서로 구성된 단백질 수송 도메인이 FK506결합단백질 단백질의 적어도 일측 말단에 공유결합된 세포 도입성(cell-transducing) FK506결합단백질 융합 단백질에 관한 것이다. 또한, silent change에 따라 서열 내에서 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)로 치환될 수 있다. 서열 내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다. 예컨대, 소수성 아미노산 분류는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양성 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성전하를 띤 산성 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 또한, 본 발명의 융합 단백질과 아미노산 서열간의 일정 범위의 상동성 예컨대 85-100% 범위 내의 동일 유사한 생물학적 활성을 갖는 절편 또는 이들의 유도체들도 본 발명의 권리범위에 포함된다.

또한, 본 발명은 상기 세포 도입성 FK506결합단백질 융합 단백질이 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 단백질 수송도메인(protein transducing domain; "PTD")이 FK506결합단백질 단백질의 카복시 말단과 아미노 말단의 일측 또는 양측에 공유결합된 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 세포 도입성(cell-transducing) FK506결합단백질 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 세포 도입성 FK506결합단백질 융합 단백질을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 FK506결합단백질 cDNA에 단백질 수송도메인 펩타이드 코딩 DNA 서열이 결합되어 상기 세포도입성 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 6번을 비롯한 재조합 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 범위는 서열번호 6번의 재조합 폴리뉴클레오타이드뿐만 아니라 유전암호의 codon degeneracy에 의한 서열을 갖는 핵산분자들에도 미친다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 융합 단백질을 발현시키기 위하여 상기 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는, 세포 도입성 융합 단백질을 발현시키는 벡터에 관한 것이다.

아래에서는 본 발명의 구성을 구체적인 실시예를 들어 좀더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래의 실시예의 기재에 의하여 한정되는 것은 아니다.

<재료>

제한 효소와 T4 DNA 리가아제(ligase)는 Promega(USA)에서 구입하였고, Pfu 폴리머라아제는 stratagene(USA)에서 구입하였다. Tat 올리고뉴클레오타이드는 Gibco BRL custom primer(USA)에서 합성하였다. IPTG는 Duchefa(Netherland)에서 구입하였다. pET-15b와 BL21(DE3) 플라스미드는 Novagen(USA)에서 구입하였고, Ni-니트릴로-트리아세틱 애시드 세파로즈 슈퍼플로우는 Qiagen(Germany)에서 구입하였다. 사람 FK506 결합 단백질(FK506결합단백질) cDNA는 PCR 방법으로 사람 간 cDNA 라이브러리에서 분리하였다. 이외 모든 시약은 특급 제품을 이용하였다.

<실시예 1: pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질의 발현벡터 제조 및 형질변환>

기능을 가진 단백질을 세포 내로 침투시키는 기술을 개발하기 위하여 세포 내로 목표 단백질을 전달할 수 있는 융합 단백질 발현벡터를 제조하였고, pep-1 펩타이드가 단백질을 세포 내로 전달하는 능력을 용이하게 분석하기 위하여 사람 FK506결합단백질를 선택하였다.

먼저, pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질을 생산하기 위해 pep-1 펩타이드(KETWWE TWWTEW SQP KKKRKV)가 포함된 pET-pep 발현벡터를 제조하였다. pep-1 펩타이드에 해당하는 두 종류의 올리고뉴클레오타이드(윗 사슬, 5'-TATGAAAGAAACCTGGTGGGAAACCTGGTGGACCGAATGGTCT CAGCCGAAAAAAAAACGTAAAGTGC-3'; 아랫 사슬, 5'-TCGAGCACTT TACGTTTTTTTTTCGGCTGACACCATTCGGTCCACCAGGTTTCCC ACCAGGTTTCTTTCC-3')를 NdeⅠ-XhoⅠ 제한효소로 자른 pET-15b에 연결(ligation)하여 삽입하였다. 이어, 사람 FK506결합단백질의 cDNA의 서열을 기본으로 하여 두 종류의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 정방향 프라이머는 5’-CTCGAGATGGGAGTGC AGGTGGAAACCATC-3'로 XhoⅠ 제한 부위를 지니고 있으며 역방향 프라이머는 5’-GGATCCTCATTCCAGTTTTAGAAGCTCCAC-3'로 BamHⅠ 제한 부위를 갖고 있다.

중합효소 연쇄반응(PCR)은 온열 순환반응기(Perkin-Elmer, model 9600)에서 수행하였다. 반응 혼합액을 50㎕ 실리콘 튜브에 넣고 94℃에서 5분간 가열하였다. PCR 반응을 수행하였다. PCR 수행 후, 아가로즈 젤 전기영동으로 분리하여 반응물을 분리하고 이것을 TA 클로닝 벡터(Invitrogen, Sandiego, USA)에 연결(ligation)한 다음, 클로닝이 용이한 컴피턴트 세포(competent cell)에 형질변환시키고 형질변환된 박테리아로부터 플라스미드를 알칼리 용균법(alkaline lysis method)으로 분리하였다. 사람 FK506결합단백질 cDNA가 포함된 TA 벡터를 XhoⅠ과 BamHⅠ로 절단한 다음 pep 발현 벡터에 삽입하였다. pep-1-FK506결합단백질로 형질변환된 E. coli BL21(DE3)를 선택한 다음, 콜로니를 100ml LB 배지에 접종하고 IPTG(0.5mM)를 배지 내에 첨가하여 재조합된 pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질의 과대발현을 유도하였다. 과대발현된 pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질은 SDS-PAGE와 웨스턴 블랏 분석으로 확인하였다.

<실시예 2: pep-1-FK506결합단백질 융합단백질의 발현 및 정제>

본 연구실에서 상기 실시예 2와 같이 제조한 인간 FK506결합단백질 cDNA가 pep-1-FK506결합단백질 형태로 포함되어 있는 E. coli BL21(DE3)세포를 암피실린이 포함된 LB 배지에 넣고 37℃에서 200rpm으로 교반하며 배양하였다. 배양액 내의 박테리아 농도가 O.D₆₀₀ = 0.5～1.0을 나타낼 때 IPTG를 배지 내에 첨가하여 최종농도가 0.5와 1mM 되게 한 다음 30℃에서 12시간을 더 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리하여 모은 뒤 5ml 결합완충액(5mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)를 넣고 초음파 분쇄기로 분쇄(sonication)하였다. 원심분리하여 상층액을 즉시 Ni²⁺-니트릴로 트리아세틱 애시드 세파로즈 슈퍼 플로우(Ni²⁺-nitrilotriacetic acid sepharose super flow) 컬럼에 부하하고 10배 부피의 결합 완충액과 6배 부피의 세척 완충액(60mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)으로 세척한 다음 용출 완충액(1M 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)로 융합 단백질을 용출하였다. 이어, 융합 단백질이 포함된 분획들을 모아 PD-10 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분획 중에 포함된 염분을 제거하였다.

정제된 단백질 농도는 우혈청 알부민을 표준물질로 사용하여 브래드포드(Bradford) 방법으로 측정하였다.

<실시예 3: 피부 세포배양 및 pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질의 세포내 투과>

피부 세포(Human primary fibroblast cell- 가톨릭대 의대 피부과로부터 입수)는 37℃에서 95% 공기와 5% CO₂를 공급해주며 20mM HEPES/NaOH(pH 7.4), 5mM NaHCO₃, 10% 우태혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 항생제(100㎍/ml 스트렙토마이신, 100U/ml 페니실린)가 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에서 배양하였다.

pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질의 세포 내 투과를 관찰하기 위하여, 피부 세포를 6-웰 플레이트에서 4~6시간 동안 키운 뒤 10% FBS가 포함된 신선한 DMEM 배양액으로 교체하고, pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질을 배양액 내에 처리하였다. 한 시간 뒤, 세포를 트립신-EDTA(Gibco BRL)로 처리하고 인산 완충액 생리식염수(phosphate buffered saline; PBS)로 충분히 세척하였다. 세포를 분쇄한 다음 세포 내로 투과된 rpS3의 양을 웨스턴 블랏 분석으로 측정하였다.

상기 피부 세포 외에 ATCC로부터 입수한 HaCaT 세포(Human Keratocyte cell)와 ATCC에서 입수한 B16 세포(Mouse Melanoma cell)로부터도 위와 같은 실험을 수행하여 pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질이 세포 내로 투과함을 확인하였다.

< 실시예 4: 웨스턴 블랏 분석>

pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질의 세포 내 투과를 확인하기 위하여 웨스턴 블랏 방법을 수행하였다. 먼저 단백질은 자연상태로 정제하였다. 준비된 피부 세포에 pep-1-FK506결합단백질(1~12μM)의 융합 단백질을 처리한 다음 한 시간 후, 세포들만 모아서 웨스턴 블랏을 수행하였다. 세포 분쇄액 내의 단백질을 12% SDS 폴리아크릴아미드 젤로 분리한 다음 젤에 있는 단백질을 니트로셀룰로스 멤브레인(nitrocellulose membrane; Amersham, UK)으로 전기이동시켰다. 단백질이 이동된 니트로셀룰로스 멤브레인을 5% 탈지분유(non-dry milk)가 들어 있는 PBS로 블로킹하였다. 이어 멤브레인은 래빗 항-히스티딘 폴리클론 항체(polyclonal antibody; Santacruze, USA, 1:1,000)로 한 시간 처리하였다. 세척 후, 호스래디쉬 퍼옥시다아제-결합된 마우스 항-래빗(mouse anti-rabbit) IgG 항체(1:10,000 희석)와 한 시간 반응시켰다. 최종적으로 ECL kit(ECL; Amersham)를 이용하여 사람 rpS3 단항체에 반응하는 단백질 띠를 확인하였다.

<실시예 5: 피부세포로 투과된 pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질의 안정성>

세포 내로 투과된 pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질의 세포 내 안정성을 측정하기 위하여, 피부 세포를 6-웰 플레이트에서 4~6시간 동안 키운 뒤 FBS가 포함되지 않은 1ml의 신선한 배양액으로 교체하고 pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질을 배양액 내에 처리하였다. 처리 한 시간 후 세포를 트립신-EDTA로 처리하고 PBS로 충분히 세척하였다. 이어 FBS가 포함된 배지를 넣고 계속 배양하면서, 시간별 (1~60시간)로 세포를 모아 세포 내의 남아 있는 융합 단백질의 양과 활성을 웨스턴 블랏과 활성도 분석으로 측정하였다.

< 실시예 6: 면역반응 억제 효과>

LPS로 유도한 면역억제 효과를 측정하기 위해 피부 세포를 6-웰 플레이트에서 키운 뒤 FBS가 포함되지 않은 1ml의 신선한 배양액으로 교체하고 재조합 pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질을 배양액 내에 처리한 후 LPS를 투여하였다. 투여 후 COX-2의 발현을 웨스턴 블랏으로 확인하였다.

위 실시예에 의하여 얻어진 결과는 아래와 같이 정리하였다.

1) pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질의 과대발현 및 정제

pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질을 과대 발현시키기 위해 사람 FK506결합단백질 cDNA, pep 펩타이드(KETWWETWWTEW SQP KKKRKV) 및 여섯 개의 히스티딘이 연속적으로 포함되어 있는 pep-1-FK506결합단백질 발현 벡터를 개발하였다(도 1).

IPTG로 융합단백질의 과대발현을 유도한 대장균 세포를 4℃에서 초음파 분쇄기로 파쇄한 다음 원심분리하여 상층액의 단백질을 12% SDS-PAGE로 분리하였다. 도 2는 pep-1-FK506결합단백질의 과대발현과 정제된 단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색한 단백질 띠(도 2A 및 2B)와 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다(도 2C). 도 2A의 레인 2는 0.5mM IPTG를 처리하여 과대발현된 융합단백질을 나타내고 있으며, 대조군과 비교하여 매우 높은 농도의 융합단백질이 과대발현되었음을 잘 보여주고 있다.

pep-1-FK506결합단백질 융합단백질은 N-말단에 여섯 개의 히스티딘을 포함하고 있기 때문에 고정 금속-킬레이트 친화 크로마토그래피(immobilized metal-chelate affinity chromatography) 단일 단계로 융합단백질을 자연상태로 순수하게 (순도 〉95%) 정제하였다(도 2B). 그림은 정제된 pep-1-FK506결합단백질 융합단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하여 확인한 결과이다.

과대발현 및 정제된 pep-1-FK506결합단백질 융합단백질을 웨스턴 블랏 분석으로 다시 한번 확인하였다. 도 2C에 나타낸 바와 같이 FK506결합단백질 또는 6x 히스티딘 항체에 반응하는 pep-1-FK506결합단백질 밴드는 도 2A의 단백질 띠와 동일한 위치에서 관찰되었다.

2) 피부 세포로 pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질의 투과

자연상태에서 정제한 pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질의 피부 세포 내 투과가 시간 및 농도에 따라 어떻게 변화되는지를 관찰하였다. 도 3에 나타낸 것처럼 자연상태의 pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질은 시간 및 농도 의존적으로 피부 세포 내로 투과되는 것을 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다. 도 3A는 0.5~5μM pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질을 60분 동안, 도 3B는 5μM pep-1-FK506결합단백질를 10~60분 동안 세포 배양액 내에 처리하였을 때의 결과이다. pep-1-FK506결합단백질의 세포 내 투과 정도를 농도별로 관찰했을 때, 농도 의존적으로 세포 내로 투과된 pep-1-FK506결합단백질의 양이 증가되는 것을 확인하였다. 또한, 시간별로 관찰하였을 경우 투여 10분 이내에 투과된 융합 단백질을 확인할 수 있었고, 처리 시간에 비례하여 세포 내로 투과된 pep-1-FK506결합단백질의 양이 증가됨을 확인하였다. 이러한 결과는 pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질이 시간 및 농도 의존적으로 세포 내 투과가 일어남을 나타내주는 것이다.

피부 세포 내로 투과된 pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질은 상당한 기간 동안 세포 내에서 안정성을 유지해야만 효과적으로 단백질 치료에 응용할 수 있다. 도 4에 나타낸 바와 같이 세포 내로 투과된 pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질은 시간에 따라 분해되어 단백질의 양이 점차 감소되었으나, 최소 48시간 동안 세포 내에서 존재함을 알 수 있었다. 따라서, 세포 내로 투과된 pep-1-FK506결합단백질는 최소 48시간은 안정성을 유지하고 있기 때문에 유용하게 단백질치료에 응용할 수 있으리라 사료된다.

3) pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질의 생물학적 기능

피부 세포 내로 투과된 융합 단백질은 그 고유한 활성을 유지해야만 이를 단백질 치료에 응용할 수 있다. 따라서, 세포 내로 투과된 융합 단백질이 어느 정도 생물학적인 활성을 지니는지는 매우 중요한 문제이다. 따라서 정제된 pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질의 생물학적 기능을 알아보기 위해 LPS에 의해 유발되는 COX-2 발현을 웨스턴 블랏을 이용하여 확인하였다(도 5). 정제한 pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질을 시간과 농도별로 LPS에 의한 세포사 및 COX-2 발현을 억제함을 확인하였다. 면역 억제제인 FK506과 함께 투여하였을 경우 더욱 효과적으로 작용하고 있음을 알 수 있었다.

본 발명은 사람 FK506 결합 단백질을 효과적인 방법으로 단백질 수준에서 세포 내로 직접 투과시키는 기술을 제공한다.

아토피 피부염의 피부 염증을 회복하는데 있어서 주된 역할을 담당하는 FK506결합단백질를 자연상태로 세포 내 투여함으로써 피부 질환을 치료하는 단백질 치료에 pep-1-FK506결합단백질 융합 단백질이 효과적으로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

본 발명을 바탕으로 pep-1-FK506결합단백질를 세포 내로 직접 전달하여 아토피 피부염으로부터 피부 세포 및 조직을 보호할 수 있기 때문에 질병 이외에도 기능성 화장품 산업 등 더욱 효과적으로 본 발명이 광범위하게 활용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 3의 pep-1 단백질 수송 도메인이 FK506 결합 단백질의 적어도 일측 말단에 공유결합된, 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 세포 도입성(cell-transducing) FK506 결합단백질 융합 단백질.
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제1항에 있어서, 상기 FK506 결합단백질의 카복시 말단과 아미노 말단의 일측 또는 양측에 서열번호 3의 pep-1 단백질 수송도메인이 공유결합된 것을 특징으로 하는 세포 도입성 FK506 결합단백질 융합 단백질.
제1항의 세포 도입성 FK506 결합단백질 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
제1항의 세포 도입성 FK506 결합단백질 융합 단백질을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 아토피 피부염, 습진, 알러지성 비염, 천식 또는 알러지 증세의 예방, 치료, 경감용 약제학적 조성물.
FK506 결합단백질 cDNA에 단백질 수송도메인 펩타이드 코딩 DNA 서열이 결합되어 상기 제1항의 세포 도입성 FK506 결합단백질 융합 단백질을 코딩하는, 서열번호 6의 재조합 폴리뉴클레오타이드.
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