KR101393397B1 - 세포내 분자 전송 펩티드를 이용한 피부 생리 활성 분자의 경피 전달시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포내 분자 전송 펩티드가 융합된 피부 생리 활성 분자를 포함하는 경피 전달용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 조성물은 분자량의 크기 및 물성으로 인해 피부 각질층의 투과가 용이하지 않은 피부 생리 활성 분자를 생체내 분자 전송능이 탁월한 펩티드를 융합한 것으로, in vitro 및 in vivo에서 우수한 피부 투과능을 나타내므로, 피부 세포 내로 다양한 잇점이 있는 화합물 등을 전달하는 데 효과적으로 이용될 수 있을 뿐 아니라, 다양한 형태로 제형화가 가능하여, 기능성 화장료의 원료로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

세포내 분자 전송 펩티드를 이용한 피부 생리 활성 분자의 경피 전달시스템{Transdermal delivery system of dermatological active ingredients using cellular transduction peptides}

본 발명은 세포내 분자 전송 펩티드가 결합된 피부 생리 활성 분자를 포함하는 경피 전달용 조성물, 상기 피부 생리 활성 분자를 이용한 경피 전달 시스템, 및 상기 피부 생리 활성 분자의 피부 세포내 전달 방법에 관한 것이다.

피부는 외부의 환경과 항상 접하고 있는 조직으로, 주된 기능은 체액 누출 및 감염 방지, 수분 소실을 막는 보호장벽으로서의 역할이다. 표피의 각질층은 피부에서도 가장 바깥쪽에 존재하면서 피부 밖으로의 수분과 전해질의 소실을 억제함으로써 피부의 건조를 막고, 피부의 정상적인 생화학적 대사를 할 수 있는 환경을 제공하여, 외부의 물리적 손상과 화학물질로부터의 인체를 보호하고, 세균, 곰팡이, 바이러스 등이 피부로 침범하는 것을 방지하는 중요한 역할을 한다(Bouwstra J. A, Honeywell-Nguyen P. L. Gooris G. S. and Ponec M. Prog Lipid Res. 42:1-36(2003)).

이러한 피부를 통한 흡수 경로는 각질층을 통한 흡수, 모낭과 피지선을 통한 흡수, 땀샘을 통한 흡수 등 3가지 경로가 있다(Prausnitz M. R. and Langer R. Nat Biotech. 26:1261-1268 (2008)). 피부를 통한 생리 활성 분자의 전달은 피부의 구조적, 물리적 특성상 여러 가지 제한을 받으며, 현재까지 알려진 바로는 각질층을 통한 흡수가 가장 중요한 흡수 경로로 알려져 있다. 특히, 피부 각질층은 피부의 주요 구성 세포인 각질형성세포(keratinocyte)가 자연사 되어 피부의 최외각층에 치밀한 구조를 이루고 있으며, 수분의 증발뿐만 아니라 외부 물질의 침투를 억제하며, 땀과 각종 지질 성분으로 인하여 pH 5 부근의 산성도를 보이고 있다. 이러한 각질층 장벽을 투과하기 위해서는 분자량이 1,000 이하로 작아야 하고, 친지질 특성을 보유하고 있어야 가능하다(Metha R. C. and Fitzpatrick R.E. Dermatol. Ther. 20:350-359 (2007)).

화장품 원료로 빈번하게 사용되는 분자량 1,000 이하의 저분자 합성 화합물이나 천연 화합물들은 쉽게 세포 내로 전달 될 수 있다고 알려져 있으나, 분자량 1,000 이상의 단백질, 펩티드 및 핵산과 같은 거대 분자들은 분자량의 크기 때문에 이중 지질막 구조로 되어 있는 세포막 안으로 투과하기 어렵다. 이들은 실제적으로 피부 장벽을 구성하는 각질층의 고유 특성으로 인하여 저분자량 물질들의 투과 효율이 극히 낮으며, 고분자량 물질들의 투과 효율은 더욱 낮은 것으로 알려져 있다. 이러한 저분자 및 거대 분자들이 세포의 원형질막을 통과하는 효율을 증폭시키기 위한 방법으로서, 최근 관심이 고조되고 있는 것이 피부를 통한 투여 방법(Transdermal drug delivery, TDD)이다(Prausnitz M. R. and Langer R. Nat Biotech. 26:1261-1268 (2008)). 그러나, 피부를 통한 투여 방법의 가장 큰 장벽은 각질층 내의 각질형성세포와 이들 사이의 각질세포간 지질이다. 대부분의 피부에서 생리학적으로 활성을 나타내는 분자(이하, 피부 생리 활성 분자)들은 피부 각질층의 저항성 때문에 경피 투과율이 낮아지게 된다.

이러한 피부 생리 활성 분자의 경피 투과율을 촉진시킬 수 있는 다양한 방법들이 연구되어 왔는데, 크게 물리적, 생화학적, 화학적 방법 등으로 나눌 수 있다. 물리적인 방법은 주로 전기(iontophoresis, electroporation), 초음파(sonophoresis), 열(thermal ablation)을 이용하는 방법이고, 생화학적인 방법은 전구체를 이용하여 유효성분이 피부 통과 중이나 통과 후에 활성화되어 작용을 나타낼 수 있는 성분의 형태로 변환되어 활성을 나타내게 하는 것이며, 화학적인 방법은 업계에서 가장 많이 활용되는 방법으로 다양한 종류의 기제, 계면활성제, 용매류 및 지방산류 등이 주로 생리 활성 분자를 담지하고 있는 복합체의 형태인 담체-매개 전달 시스템(carrier-mediated delivery systems)이 사용되고 있다(Prausnitz M. R. and Langer R. Nat Biotech. 26:1261-1268 (2008)). 이들 중에서 최근 펩티드계(peptide-base) 전달 시스템의 활용에 많은 관심이 집중되고 있다.

세포 투과성을 갖는 펩티드의 사용은 여러 장점을 갖는데, 이는 주로 상시 펩티드 서열에 이루어질 수 있는 다양한 변형에 기인한다. 이는 다른 세포 하부 도메인을 지정할 수 있으며, 다양한 형태의 화물 분자들(cargo molecules)을 운반할 수 있는 담체의 조작을 가능케 한다. 대표적인 세포막 투과성 펩티드를 예로 들면 다음과 같다.

맨 처음 발견된 전송 도메인은 1988년 Green 과 Loewenstein 그룹(Green 및 Loewenstein. Cell 55, 1179-1188(188))과 Frankel과 Pabo 그룹(Frankel 및 Pabo. Cell 55, 1189-1193(188))이 각각 별도로 후천성 면역 결핍증후군(acquired immune deficiency syndrome, AIDS)을 발생시키는 바이러스인 HIV-1의 전사관련 단백질 Tat가 세포막을 투과하고 바이러스 유전자를 교차-활성화(trans-activation)시키는 것을 발견하였다. 세포 투과성을 보이는 Tat 도메인은 Tat 단백질의 48번부터 57번째의 염기성 아미노산 서열(GRKKRRQRRR)로서, 이 서열이 세포막을 통과하는데 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌다(Vives et al., J. Biol. Chem. 272, 16010-16017 (1997); Futaki 등, J. Biol. Chem. 276, 5836-5840 (2001); Wadia, J.S. 및 S.F. Dowdy, Cum Opin. Biotechnolol. 13(1): 52-6 (2002); Wadia 등, Nature Medicine 10(3), 310-315(2004)).

둘째, 초파리의 안테나페디아 (antennapedia) 호메오도메인(homeodomain) 유래 16개의 아미노산으로 이루어진 페네트라틴(RQIKIYFQNRRMKWKK)을 들 수 있다 (Joliot et al., Proc Natl Acad Sci USA 88: 1864-1868 (1991); Derossi et al., J Biol Chem 269, 10444-10450 (1994); Joliot, A. 및 A. Prochiantz, Nat. Cell Biol. 6(3): 189-96 (2004)).

셋째, 생체막 전위 서열(membrane translocating sequence, MTS) 또는 신호 서열(signal sequences)에 기반한 펩티드로서, 이는 RNA에 의해 새로이 합성된 단백질을 생체 내의 적합한 세포 내 소기관들의 생체막으로 이동시켜주는 것을 돕는 수용체 단백질에 의해 인식되며, 핵 위치화 신호(nuclear localization signal, NLS)와 결합된 생체막 전위 서열은 몇 가지 종류의 세포에서 세포막을 통과하여 세포핵에 축적된다는 것이 알려졌다(J.S. Wadia, et al., Nat.Med. 10: 310?315 (2004); I. Nakase, et.al. Biochemistry 46: 492-501 (2007); H.L. Amand, et al., Biochim. Biophys. Acta (2011)). 이러한 펩티드들은 화물(cargo) 분자와 결합하여 세포에 근접하였을 경우에 내재 시그널(import signal)로 작용하고, 화물 분자의 세포 내로의 유입을 유도한다. 이에 따라, 세포막 투과성 펩티드를 본래 세포내에 존재하는 단백질과 연결하여 생물학적 연구 및 질병치료에 적용하려는 시도가 활발히 진행되고 있다 (F. Milletti, Drug Discovery Today 17: 850-860 (2012)). 세포막 투과성 펩티드가 Tat 이나 VP22와 같이 바이러스로부터 유도된 경우에서는 생체 내에서 면역반응을 유도할 가능성이 있어서, 인간에게서 발견되는 분비 단백질(secreted protein)에서 새로운 세포막 투과성 펩티드들을 주로 동정하는 상황이다 (Eguchi, A. and Dowdy, S.F. Trends Pharmacol. Sci. 30: 341-345 (2009);Mae, M. and Langel, U. Curr. Opin. Pharmacol. 6: 509- 514 (2006); Jarver, P. et al., Trends Pharmacol. Sci. 31: 528-535 (2010)). 또한 세포막 투과성을 높이기 위해서 아미노산 서열상의 결실(deletion) 및 변형(modification), 키메라 융합(chimeric fusion)등의 방법으로 새로운 세포막 투과성 펩티드를 개발하고 있다 (Taylor, B.N. et al., Cancer Res. 69: 537-546 (2009); Johansson, H.J. et al., Mol. Ther. 16: 115-123 (2007)).

현재 공지된 담체-매개 전달 시스템은 효율이 떨어지거나 자체의 독성으로 인해 그 활용도가 제한적이며, 전달 메커니즘은 논란의 소지가 많다. 담체의 세포내 물질 전송 기전에 대해 내포작용(endocytosis)인지의 여부에 대해서는 정확한 대답을 얻지 못했지만 다양한 메커니즘이 제안되었다. 수용체가 관여하지 않고 반전된 미셀(inverted micelle)을 형성하여 전이된다는 주장이 있으며, 또 다른 의견으로는 세포 표면의 프로테오글리칸(proteoglycan)이 전달에 중요한 역할을 한다는 의견과 세포막 투과성 펩티드와 정전기적 상호작용 외에 큰 역할을 하지 못한다는 의견도 제시되었다. 몇몇 연구는 TAT 단백질이 실제로 전이가 일어나는 것이 아니라, 세포 표면과 정전기적 상호작용을 강하게 일으켜 내포작용을 일으키고 엔도솜(endosome) 내부에 축적된다는 주장도 있으며, 엔도솜이 라이소좀(lysosome)과 융합되어 라이소좀내에 존재하는 단백질 가수분해 효소에 의해 펩티드가 쉽게 분해됨을 제시하고 있다. TAT과 같은 염기성 아미노산으로 구성된 물질 수송 담체를 이용하여 특정 유효성분을 세포 내로 전달하고자 할 경우 세포질 내의 표적으로 직접적으로 접근하기가 어렵고 원하는 활성을 보일 수 있는 수준으로 유효성분을 전달하기 위해서는 고농도의 처리가 요구되어 이를 응용할 시에 기대하는 효과를 얻을 수 없다는 문제점이 있다(J.S. Wadia, et al., Nat.Med. 10: 310-315 (2004); I. Nakase, et.al. Biochemistry 46: 492-501 (2007); H.L. Amand, et.al. Biochim. Biophys. Acta (2011), F. Milletti, Drug Discovery Today 17: 850-860 (2012)). 이와 같이, 외부 물질의 공지된 매개 전달 시스템의 경우 세포 내 유입 기전에 대해서는 논란의 여지가 많이 남아 있는 상태이다(F. Milletti, Drug Discovery Today 17: 850-860 (2012)). 또한, 이들 기존의 개발된 펩티드의 경우 현재까지 피부 각질층을 투과하여 피부 세포까지 전달이 가능함을 보여준 예가 없다.

최근 연구에 따르면 담체-매개 전달 시스템은 하나 이상의 메커니즘을 통해 전이가 일어나고 거대분자의 경우 에너지 의존적 대음세포작용(macropinocytosis)을 일으키고 세포막 투과성 펩티드 자체나 세포막 투과성 펩티드와 결합된 작은 분자들은 정전기적 인력이나 수소결합에 의해 에너지 비의존적 투과 메커니즘을 갖는다고 가정한다. 어떤 경우에라도 세포막 또는 세포막에 존재하는 프로테오글리칸과 세포막 투과성 펩티드의 직접적인 접촉이 세포 내 전달의 성공에 필수적이다. β-cyclodextrin 처리, cytochalasin D 처리, 혹은 dominant-negative dynamine (DynK44A) 발현 등의 실험으로 볼 때 lipid raft-mediated 대음세포작용이 주요한 기전임을 알 수 있다(Wadia JS, Stan RV, Dowdy SF. Nat Med. 2004 Mar;10(3):310-5.).

이후, 2000년도에 들어서 세포 내 전달 효율이 향상되고, 구조 및 정전기적 특성이 다른 새로운 세포막 투과성 펩티드가 개발되었으며, 그 중 프로셀 제약이 개발한 ‘거대분자 세포 내 전송 기술(Macromolecule Intracelular Tranduction Technology: MITT)은 세포내 전송과정에는 HIV-TAT 세포 내 전송과정에 필요한 내포작용 및 에너지는 필요로 하지 않지만 세포막의 강직성(rigidity)과 완전성(integrity)이 중요 요소로 작용하기 때문에 세포막과의 직접적인 상호작용(direct interaction)이 중요하다고 제안되었다(WO2008/093982). MTD는 기존의 세포막 투과성 펩티드인 TAT에 비하여 화합물, 펩티드 및 단백질 중에서 선택할 수 있는 일명 화물(cargo material)의 전달효율이 높고, 세포간 전달(cell-to-cell delivery)의 장점을 가지고 있어 치료제 및 화장품 개발에 그 활용성이 높이 평가되고 있다.

이에, 본 발명자들은 상기의 거대분자 전송 도메인(MTD)의 아미노산 서열을 변형하여 보다 우수한 세포 투과능을 갖는 개량형 MTD 펩티드를 본 발명의 세포내 분자 전송 펩티드에 적용하고, 이러한 세포 내 분자 전송 펩티드가 피부 투과가 용이하지 않은 피부 생리 활성 분자에게 피부 각질층 내, 또는 피부 세포 내 전달 효능을 부여함을 증명함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 상기와 같이 분자량의 크기 또는 피부 각질층의 고유 특성으로 인해 피부를 통해 전달되기 어려운 피부 생리 활성 분자를 피부 세포 내로 효율적으로 도입하기 위해 고안된 것으로, 기존 MTD 펩티드에 비해 세포 투과능이 개선된 세포내 분자 전송 펩티드가 결합된 피부 생리 활성 분자를 포함하는 경피 전달용 조성물, 상기 펩티드가 결합된 피부 생리 활성 분자를 이용한 경피 전달시스템, 및 세포내 분자 전송 펩티드가 결합된 피부 생리 활성 분자를 피부 세포 또는 피부 각질층 내로 전달하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 세포내 분자 전송 펩티드가 결합된 피부 생리 활성 분자를 포함하는 경피 전달용 조성물로서, 상기 펩티드가 서열번호 15 내지 35로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 조성물은 화장용 조성물인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 펩티드는 서열번호 36 내지 56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열로부터 인코딩되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 서열번호 15의 아미노산 서열은 서열번호 36의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 서열번호 16의 아미노산 서열은 서열번호 37의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 서열번호 17의 아미노산 서열은 서열번호 38의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 서열번호 18의 아미노산 서열은 서열번호 39의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 서열번호 19의 아미노산 서열은 서열번호 40의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 서열번호 20의 아미노산 서열은 서열번호 41의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 서열번호 21의 아미노산 서열은 서열번호 42의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 서열번호 22의 아미노산 서열은 서열번호 43의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 서열번호 23의 아미노산 서열은 서열번호 44의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 서열번호 24의 아미노산 서열은 서열번호 45의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 서열번호 25의 아미노산 서열은 서열번호 46의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 서열번호 26의 아미노산 서열은 서열번호 47의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 서열번호 27의 아미노산 서열은 서열번호 48의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 서열번호 28의 아미노산 서열은 서열번호 49의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 서열번호 29의 아미노산 서열은 서열번호 50의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 서열번호 30의 아미노산 서열은 서열번호 51의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 서열번호 31의 아미노산 서열은 서열번호 52의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 서열번호 32의 아미노산 서열은 서열번호 53의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 서열번호 33의 아미노산 서열은 서열번호 54의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 서열번호 34의 아미노산 서열은 서열번호 55의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 서열번호 35의 아미노산 서열은 서열번호 56의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 피부 각질층을 투과하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 피부 생리 활성 분자는 상기 세포내 분자 전송 펩티드의 N-말단, C-말단 또는 양말단에 결합하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 피부 생리 활성 분자에 상기 세포내 분자 전송 펩티드의 아미노산이 역순으로 배열된 형태로 결합하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 결합은 펩티드 결합 또는 화학적 결합에 의해 이루어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 화학적 결합은 이황화 결합, 디아민 결합, 황화-아민 결합(sulfde-amine bonds), 카르복시-아민 결합(carboxyl-amine bonds), 에스테르 결합(ester bonds) 및 공유 결합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 비타민, 레티노이드 및 지방산으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 비타민은 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5, 비타민 B6, 비타민 B7, 비타민 B9, 비타민 B12, 비타민 C, 비타민 D1, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 D4, 비타민 D5, 비타민 E 및 비타민 K로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 레티노이드는 레티놀, 레티놀의 천열 및 합성 아날로그, 레티날, 트랜스, 9-시스, 및 13-시스 레티놀산 및 에트레티네이트로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 지방산은 라우린산, 스테아린산, 팔미틱산, 운데실렌산, 팔리톨레산, 올레산, 리놀산, 리놀렌산, 아라키돈산 및 에루신산으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 피부 생리 활성 분자는 주름 개선제, 미백제, 항산화제 및 보습제로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 주름 개선제는 피부 작용 성장인자 펩타이드 또는 단백질, 레티놀, 레티닐팔미테이트, 아데노신 및 폴리에톡실레이티드레틴아미드로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 미백제는 미백 펩타이드, 니아신아마이드, 닥나무 추출물, 알부틴, 에칠아스코밀에텔, 감초 추출물, 아스코빌글루코사이드, 및 마그네슘 아스코빌포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 피부 생리 활성 분자는 쿠마릭산(coumaric acid) 또는 아세틸펜타펩티드(Acetyl pentapeptide) 및 아세틸헥사펩티드(Acetyl Hexapeptide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 에멀젼, 크림, 에센스, 스킨, 리포솜, 마이크로캡슐, 복합 입자, 샴푸 및 린스로 이루어진 군으로부터 선택된 제형으로 제조되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 서열번호 15 내지 35로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 세포내 분자 전송 펩티드를 피부 생리 활성 분자와 결합시켜 전달하는 것을 특징으로 하는 피부 생리 활성 분자를 피부 세포 내로 전달하는 경피 전달시스템을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 펩티드는 서열번호 36 내지 56으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드로부터 인코딩되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 서열번호 15 내지 35로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 세포내 분자 전송 펩티드를 피부 생리 활성 분자와 결합시켜 전달하는 단계를 포함하는 상기 피부 생리 활성 분자를 피부 세포 내로 전달하는 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 서열번호 15 내지 35로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 세포내 분자 전송 펩티드를 피부 생리 활성 분자와 결합시켜 전달하는 단계를 포함하는 상기 피부 생리 활성 분자를 피부 각질층 내로 전달하는 방법을 제공한다.

본 발명의 경피 전달용 조성물은 분자량의 크기 및 물성으로 인해 피부 각질층의 투과가 용이하지 않은 피부 생리 활성 분자에 생체내 분자 전송능이 탁월한 펩티드를 결합시켜, 이를 통해 피부 생리 활성 분자를 피부 세포 또는 피부 각질층 내까지 전달할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 항산화제 효능, 혈관 신생 증대, 여드름 증상의 감소, 선분비의 감소, 노화 효과의 감소, 주름 감소, 멜라닌 생성 감소, 피부 염증 완화 또는 피부 건조함 개선과 같은 잇점이 있는 화합물 등을피부 조직 깊이 효과적으로 전달할 수 있을 뿐 아니라, 다양한 형태로 제형화할 수 있어, 기능성 화장료 원료로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1 내지 도 4는 본 발명의 세포내 분자 전송 펩티드의 2차 구조를 PEP FOLD server 프로그램을 이용하여 분석한 결과이다.
도 5는 본 발명의 세포내 분자 전송 펩티드의 피부 세포 투과능을 측정하기 위한 유세포측정 분석 결과이다.
도 6 내지 도 8은 본 발명의 세포내 분자 전송 펩티드의 피부세포 투과능을 측정하기 위하여 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다:
MR-form: A1-A2-MTD의 식에서, A1이 메티오닌이고, A2가 아르기닌인 형태의 개량형 MTD;
MH-form: A1-A2-MTD의 식에서, A1이 메티오닌이고, A2가 히스티딘인 형태의 개량형 MTD; 및
MK-form: A1-A2-MTD의 식에서, A1이 메티오닌이고, A2가 라이신인 형태의 개량형 MTD.
도 9는 EpiOral 인공 조직 모델에서 세포내 분자 전송 펩티드의 세포 조직 내 투과능을 공초점 현미경으로 시각화한 사진이다.
도 10은 EpiDerm 인공 피부 모델에서 세포내 분자 전송 펩티드의 각질층 및 피부 조직내 투과능을 공초점 현미경으로 시각화한 사진이다.
도 11은 세포내 분자 전송 펩티드의 생체 내(in vivo)에서 피부 투과능을 공초점 현미경으로 확인한 결과이다
도 12는 세포내 분자 전송 펩티드를 결합한 쿠마릭산 유도체의 티로시나제 활성 저해 효과를 확인한 결과이다.
도 13은 세포내 분자 전송 펩티드를 결합한 쿠마릭산 유도체의 세포 내 멜라닌 생성 저해 효과를 확인한 결과이다.
도 14는 세포내 분자 전송 펩티드와 아세틸펜타펩티드 결합 유도체의 인간 정상 피부 섬유아세포에서의 콜라게나제 활성 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 15는 세포내 분자 전송 펩티드와 아세틸헥사펩티드 결합 유도체의 피부세포 투과능을 측정하기 위한 유세포측정 분석 결과이다.
도 16은 세포내 분자 전송 펩티드와 아세틸헥사펩티드 결합 유도체의 피부세포 투과 위치를 공촛점 현미경으로 확인한 결과이다.

피부를 통한 활성물질의 전달은 피부의 구조적, 물리적 특성상 여러 가지 제한이 있다. 특히, 피부 각질층은 피부의 주요 구성 세포인 각질형성세포 (keratinocyte)가 자연사 되어 피부의 최외각층에 치밀한 구조를 이루고 있으며, 수분의 증발뿐만 아니라 외부 물질의 침투를 억제하며, 땀과 각종 지질 성분으로 인하여 pH 5 부근의 산성 영역에 있다. 이러한 각질층을 투과하기 위해서는 분자량이 1,000 이하로 작아야 하고, 친지질 특성을 보유하고 있어야 가능하다(Metha R. C. and Fitzpatrick R.E. Dermatol. Ther. 20:350-359 (2007)).

화장품 원료로 빈번하게 사용되는 저분자 합성 화합물이나 또는 천연화합물들은 쉽게 세포 내로 전달 될 수 있다고 알려져 있으며 단백질, 펩티드 및 핵산과 같은 거대분자들은 분자량의 크기 때문에 이중 지질막 구조로 되어 있는 세포막 안으로 투과하기 어렵다. 이들은 실제적으로 피부 장벽을 구성하는 각질층의 고유 특성으로 인하여 저분자량 물질들의 투과 효율이 극히 낮으며, 고분자량 물질들의 투과 효율은 더욱 낮은 것으로 알려져 있다. 이러한 저분자 및 거대분자들이 세포의 원형질막을 통과하는 효율을 증폭시키기 위한 방법으로서 ‘거대분자 세포 내 전송 기술(Macromolecule Intracellular Transduction Technologiy: MITT)’을 이용할 수 있다.

이에, 본 발명에서는 기존에 발명된(대한민국 공개특허 제10-2009-0103957호) 소수성 거대분자 전달 도메인(MTD)에 양전하를 띄는 1~2개의 친수성(극성) 아미노산을 소수성 도메인에 적용하여 음전하를 띄고 있는 세포막으로의 접근성을 높임으로써, 효율적으로 생물학적 활성 분자를 세포 내로 전달하는 개량형 MTD 펩티드를 개발하고, 이를 이용하여 피부 생리 활성 분자를 보다 효율적으로 피부 세포 안으로 전달할 수 있는 경피 전달용 조성물, 경피 전달시스템 및 피부 생리 활성 분자를 피부 세포 또는 피부 각질층 내로 전달하는 방법을 제공한다.

상기 개량형 MTD 펩티드는 하기 식 1로 기재되는 펩티드로서,

A1은 메티오닌(M, Met)이고;

A2는 아르기닌(R, Arg), 히스티딘(H, His) 및 라이신(K, Lys)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이며;

MTD는 서열번호 1 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 펩티드:

[식 1]

A1-A2-MTD이다.

상기 펩티드는 생물학적 활성 분자의 세포 내로의 운반을 매개할 수 있는 펩티드로서, 대한민국 공개특허 제 10-2009-0103957호에 기재된 MTD 펩티드에 비해 우수한 세포 투과능을 나타내는 펩티드이며, 본 발명에서는 이를 "세포내 분자 전송 펩티드"라 명명하였다.

상기 펩티드는 서열번호 15 내지 35로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 펩티드는 대한민국 공개특허 제 10-2009-0103957호에서 개발된 193개의 거대분자 전달 도메인(MTD) 펩타이드 중에서, 정량화되어 상대 비교가 가능한 서열 중, 하기의 조건을 충족하는 서열인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다:

1) Proline의 위치가 서열의 중앙에 위치하고;

2) Signal P 프로그램을 이용한 세포 외 분비 유도 가능성 평가 결과 값이, 각 도메인에 대해 60% 이상으로 평가되며;

3) Protparam 프로그램(http://web.expasy.org/protparam/ 참조)을 이용하여 평가된 aliphatic index가 100 내지 300 사이의 값으로 평가되고;

4) Protscale (Average flexibility) 프로그램(http://web.expasy.org/protscale/ 참조)을 이용하여 평가된 flexibility가 0.36 이상으로 평가되며;

5) Protparam 프로그램을 이용하여 평가된 hydropathicity가 3.0 이하로 평가되고;

6) Protparam 프로그램을 이용하여 평가된 instability index가 30 내지 60사이의 값으로 평가되며;

7) Protscale (polarity) 프로그램을 이용한 polarity의 평가 결과가 0.1 이상으로 평가되는 서열.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 서열번호 8의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 서열번호 2의 아미노산 서열은 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 서열번호 3의 아미노산 서열은 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 서열번호 4의 아미노산 서열은 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 서열번호 5의 아미노산 서열은 서열번호 12의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 서열번호 6의 아미노산 서열은 서열번호 13의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 서열번호 7의 아미노산 서열은 서열번호 14의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 펩티드의 합성 및 피부 생리 활성 분자인 화물(cargo)을 함유하는 펩티드의 합성은 예를 들어 기기를 이용하거나 유전 공학 기법을 이용하여 수행할 수 있다.

상기의 세포내 분자 전송 펩티드를 이용하여 피부 세포 내로 항산화제 효능, 혈관 신생 증대, 여드름 증상의 감소, 선분비의 감소, 노화 효과의 감소, 주름 감소, 멜라닌 생성 감소, 피부 염증 완화 또는 피부 건조함 개선과 같은 잇점이 있는 화합물을 전달할 수 있다. 또한, 이들을 포함하는 조성물을 국소적으로 적용함으로써 피부에 유익한 효과를 제공할 수 있다. 상기 유익한 효과는 태양광에 의해 야기되는 손상을 감소시키거나 예방하는 것, 항산화제 활성을 제공하는 것, 피부에 미세 주름을 포함한 주름의 출현을 감소시키는 것, 선 분비를 감소시키는 것, 노화 효과를 감소시키는 것, 여드름을 치료하는 것, 모낭에서 혈관 신생을 유도하여 모발이 자라는 것, 피부 보습에 도움이 되는 것 및 멜라닌 생성을 억제하여 피부색을 환하게 하는 것을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 세포내 분자 전송 펩티드에 의해 피부 세포 내로 전달 가능한 유효성분은 화합물이거나 단백질 또는 그의 단편들로 이루어 질 수 있으며, 피부에 대한 추가적인 이점을 더 제공한다. 이들은 비독성, 비알레르기성 및 비자극성이므로 피부 조직과 친화적인 특징을 갖는다. 적절한 활성 분자(cargo)의 예로서 비타민 및 그의 유도체들, 레티노이드 및 지방산을 포함할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 의하면, 아스코르브산(비타민 C), 알파-토코페롤(비타민 E) 및 레티노이드(비타민 A)는 피부에 유익한 특성을 제공할 수 있다. 아스코르브산은 결합 조직의 합성을 자극하고, 특히 콜라겐 생성의 자극 및 조절에 관여한다. 그것은 지방 산화 및 자외선에 지속적으로 노출됨으로 인한 다른 유형의 세포 손상을 예방하거나 최소화하는 것을 돕는다 (Varani, J. et al., J. Invest. Dermatol. 114: 480-486 (2000), Offord, E. A. et al, Free, Radical Biol. & Med. 32:1293-1303, (2002)). 아스코르브산은 세포막의 멜라닌 형성 및 히스타민 분비를 억제하는 것을 도우며, 피부 내의 비타민 E 결핍을 보상하고, 피부의 탈색화 방지에 관여하고, 항-자유 라디칼(anti-free radical) 활성을 가진다. 알파-토코페롤은 세포막의 인지질 및 자유 라디칼의 해로운 효과를 방지하는 항산화제이다 (J.B Chazan 등. Free Radicals and Vitamin E. Cah. Nutr. Diet. 1987 22(l):66-76). 레티노이드는 피부 내 염증의 중개자를 차단하고, 프로콜라겐의 생성을 증가시킴으로써 타입 I 및 타입 III 콜라겐이 더 많이 생산되도록 한다.

구체적으로 본 발명의 cargo 화합물은 비타민 A, 비타민 Bl, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5, 비타민 B6, 비타민 B7, 비타민 B9, 비타민 B12, 비타민 C, 비타민 Dl, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 D4, 비타민 D5, 비타민 E, 및 비타민 K와 같은 비타민을 포함한다.

또한 본 발명의 또다른 cargo 화합물은 레티노이드이다. 레티노이드는 레티놀, 비타민 A(레티놀)의 천연 및 합성 아날로그, 비타민 A 알데히드(레티날), 모든 트랜스, 9-시스, 및 13-시스 레티놀산, 에트레티네이트(etretinate) 및 여러 선행문헌에 기재된 비타민 A 산(레티놀산) 뿐만 아니라 다양한 합성 레티토이드 및 레티노이드 활성을 갖는 화합물을 포함한다.

또한, 본 발명의 cargo 화합물은 지방산을 포함한다. 지방산은 포화 또는 불포화 지방성 꼬리를 갖는 모노카복시산이다. 국제 화장품용 성분 사전 및 핸드북(the International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, 7th Ed. (1997) volume 2, page 1567)에서 정의된 바와 같이(상기 개시물은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다), 지방산은 약 7 이상의 탄소 원자를 가진다. 예를 들어, 팔미트산은 가장 풍부한 천연 지방산으로서, 팜 오일 및 다른 지방에서 발견되는 포화 지방산이다. 팔미트산은 또한 피지선(sebaceous gland)에 의해 생성되는 피부의 주요 지방산 중에 하나이며, 보습제로서 피부 관리 및 화장품 제제에 사용된다. 그것은 오일 균형을 안정화시킴으로써 피부를 정상적이고, 건강한 상태로 유지할 수 있게 하며, 피부를 부드럽게 하고 항 케라틴화제처럼 반응한다. 팔미트산의 에스테르는 피부 및 모발에 비단결 같은 부드러움(silkiness)을 공급하는데 사용된다. 상기 팔미트산은 펜타펩티드를 피부 내로 투과시킬 수 있는 담체로서 작용하며, 윤활제로서 광범위하게 사용되고, 유화제, 계면활성제 및 제형 조직화제(formula texturizer)로 사용된다.

또한, 본 발명의 적절한 지방산은 라우린산, 스테아린산, 팔미틱산, 운데실렌산, 팔미톨레산, 올레산, 리놀산, 리놀레산, 아라키돈산 및 에루신산을 포함하나, 이에 한정하는 것은 아니다. 추가적인 적절한 지방산은 국제 화장품용 성분 사전 및 핸드북(the International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, 7th Ed. (1997) volume 2, page 1567)에 개시되어 있다.

상기 세포내 분자 전송 펩티드와 cargo 화합물, 즉 피부 생리 활성 분자는 공유 결합에 의해 결합되며, 에스테르, 아미드, 에테르 및 카르바미드 결합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 구체예는 쿠마릭산, 아세틸펜타펩티드 또는 아세틸헥사펩티드와 선별된 세포내 분자 전송 펩티드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화합물은 국소 적용하기 위해 의도된 많은 화장품용 또는 피부학적(dermatological) 조성물에 사용될 수 있다. 세포내 분자 전송 펩티드와 cargo 화합물은 피부 투과되어 모낭에서 혈관 신생을 자극할 수 있기 때문에, 이들 조성물은 모발 손실 방지 또는 모발 성장 개선을 위해 사용될 수 있다. 모발 성장에 영향을 미치는 화합물을 사용하는 경우, 두피, 눈썹 또는 속눈썹에 적용된다. 또한 피부에 적용되는 경우, 상기 세포내 분자 전송 펩티드와 cargo 화합물은 미세 라인 및 주름의 출현을 감소시키기 위해, 피부 탄력을 개선하기 위해, 부풀림(puffiness)을 감소시키기 위해, 피부 질감(texture)을 부드럽게 하기 위해, 피부에 비단결 같은 감촉을 제공하기 위해, 보습 효과를 제공하기 위해, 윤활성을 제공하기 위해, 멜라닌 생성 억제를 통한 환한 안색을 제공하기 위해, 노화 효과를 감소시키기 위해, 또는 다른 화장품용 잇점을 제공하기 위해 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는, “피부 생리 활성 분자”는 "화장품 용도로 또는 피부학적으로 허용 가능한(cosmetically or dermatologically acceptable) 분자"로 정의되며, 과도한 독성, 비양립성, 불안정성 등이 없이 생리학적인 조직에 접촉하여 사용되기 위한 적절한 조성물 또는 화합물을 포함한다.

본 발명의 조성물은 약리학적으로나 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제를 추가로 포함할 수 있다.

이러한 조성물에 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 비정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 상기 조성물은 약제화 하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

제형의 측면에서, 본 발명의 조성물은 용액, 에멀션(마이크로에멀션 포함), 현탁액, 크림, 로션, 겔, 분말, 또는 본 조성물이 적용될 수 있는 피부 및 기타 조직에 적용하기 위해 이용되는 기타 전형적인 고체 또는 액체 조성물을 포함할 수 있다. 그와 같은 조성물은 추가적인 항미생물제(antimicrobial), 보습제 및 수화제(hydration agent), 투과제(penetration agent), 보존제, 유화제, 천연 오일 또는 합성 오일, 용매, 계면활성제, 세정제(detergent), 겔화제(gelling agent), 연화제(emollient), 항산화제, 향료, 충진제, 증점제(thickener), 왁스, 냄새 흡수제, 염료(dyestuff), 착색제, 분말, 점도-조절제(viscosity-controlling agent) 및 물을 포함할 수 있고, 선택적으로, 마취제, 항-가려움 활성제(anti-itch active), 식물 추출물(botanical extract), 컨디셔닝제(conditioning agent), 흑화제 또는 미백제(darkening or lightening agent), 글리터(glitter), 습윤제(humectant), 운모, 미네랄, 폴리페놀, 실리콘 또는 그의 유도체, 일광 차단제(sunblock), 비타민, 및 약용식물(phytomedicinal)을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 장기간 동안 안정적이게 하기 위해, 전술된 성분들과 함께 제제화 되며, 이는 지속적인 또는 장기간의 사용이 의도되는 경우 유용할 수 있다.

본 발명의 일부 구체예에서, 상기 조성물은 피부 노화를 치료, 개선 또는 예방하기 위하여 사용된다. 노화에 의한 피부 손상은 미세하고 깊은 주름, 피부 라인, 틈(crevice), 혹(bump), 큰 구멍, 비늘(scaliness), 피부 탄력의 손실, 늘어짐(sagging), 피부 견고성 또는 팽팽함의 손실, 탈색, 노화 반점(age spot) 및 주근깨와 같은 과색화된(hyperpigmented) 부위, 각화증(keratosis), 비정상 분화, 과각화현상(hyperkeratinization), 탄력섬유증, 콜라겐 붕괴, 각질층, 진피, 표피, 피부의 관다발계, 피부에 특히 근접하는 하부 조직에서의 다른 조직학적 변화를 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 피부 노화는 연대기적 노화 또는 태양광에 지속적인 노출과 같은 외부 요인에 의한 노화가 있으나, 본 발명의 조성물은 상기 피부 노화 및 다른 유형의 피부 손상을 치료, 개선 또는 방지하는 방법이 개시된다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 세포내 분자 전송 펩티드의 세포 투과성을 정량적으로 결정하기 위하여, 세포내 분자 전송 펩티드에 FITC 형광물질을 연결한 복합체를 사용하여 피부세포에 일정 농도로 처리한 후, 유세포분석기(flow cytometry)를 이용하여 형광세기를 측정하였으며, 그 결과 세포내 분자 전송 펩티드가 공지된 PTD (protein transduction domain)에 비해 매우 효율적으로 FITC를 세포내로 전달하였음을 확인함으로써, 여러 서열의 세포내 분자 전송 펩티드의 피부 세포 내 침투 효과를 입증하였다.

본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 세포내 분자 전송 펩티드에 FITC 형광물질을 연결한 복합체를 사용하여 공초점 현미경(confocal microscope) 분석을 통하여 세포 투과성 및 세포내 전달(intracellular localization)을 시각적으로 확인할 수 있는 결과를 제시하였다. 그 결과, 유세포측정 결과와 동일하게 기존의 MTD 펩티드보다 개선된 세포내 분자 전송 펩티드에서 높은 피부 세포 투과성을 나타냄을 확인하였다. 또한 세포내 분자 전송 펩티드가 공지된 PTD (protein transduction domain) 중 세포내 전송 효율이 비교적 우수한 것으로 알려진 Tat에 비해 세포투과도가 높음을 확인할 수 있었다.

뿐만 아니라, 피부 생리 활성을 갖는 화물(cargo)을 보유한 펩티드를 이용하여 피부 투과를 통한 생리활성이 증대됨을 확인하여 미백 또는 주름 개선 효능을 갖는 화장품 원료로 사용될 수 있음을 입증하였다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 개량형 MTD 펩티드의 고안을 위한, 대상 MTD 펩티드의 선별

본 발명자들은 기존에 본 발명자들에 의해 개발된 기술인 대한민국 공개특허 제110-2009-0103957호)에서 개발된 193개의 MTD 펩타이드 중에서, 정량화되어 상대 비교가 가능한 서열 중 하기의 조건을 충족하는 서열에서 전송능 개량을 위한 대상 MTD 펩티드 서열을 선별하였다.

상기 선별을 위한 조건은 하기와 같다.

1) 거대분자 전달 도메인의 서열 중, proline의 위치가 서열의 중앙에 위치하는 서열을 선별한다.

2) 거대분자 전달 도메인의 서열 중, 세포 외 분비 유도 가능성이 높은 서열을 선별한다.

3) 거대분자 전달 도메인의 서열 중, 거대분자 전달 도메인의 물리화학적 특성을 결정하는 요소인 aliphatic index의 특정 수준을 만족하는 서열을 선별한다.

4) 거대분자 전달 도메인의 서열 중, 거대분자 전달 도메인의 물리화학적 특성을 결정하는 요소인 flexibility가 특정 수준을 만족하는 서열을 선별한다.

5) 거대분자 전달 도메인의 서열 중, 거대분자 전달 도메인의 물리화학적 특성을 결정하는 요소인 hydropathicity가 특정 수준을 만족하는 서열을 선별한다.

6) 거대분자 전달 도메인의 서열 중, 거대분자 전달 도메인의 물리화학적 특성을 결정하는 요소인 instability index가 특정 수준을 만족하는 서열을 선별한다.

7) 거대분자 전달 도메인의 서열 중, 거대분자 전달 도메인의 물리화학적 특성을 결정하는 요소인 polarity가 특정 수준을 만족하는 서열을 선별한다.

이를 구체적으로 설명하면 하기와 같다.

특정한 대표 서열을 선별하기 위하여, 상기 단계 1)에 기술된 바와 같이, 프롤린의 유무와 그 위치에 근거하여 대표 서열을 결정하였다. 거대 분자 전달 도메인의 서열을 구성하는 아미노산인 알라닌, 발린, 프롤린, 류신 및 아이소류신 중, 곁가지의 서열이 짧고 크기가 작은 프롤린은 아미노산 서열의 이차구조 형성의 자유도에 영향을 미치며 이는 거대분자 전달 도메인의 세포막 투과에 기여한다. ‘대한민국 공개번호 제10-2009-0103957호: 신규한 거대분자 전달 도메인 및 이의 동정 방법 및 용도’에 공지된 거대 분자 전달 도메인 (MTD) 중, 이를 구성하는 서열 상에 프롤린이 존재하며 그 프롤린의 위치가 거대분자 전달 도메인의 아미노산 서열의 중앙에 위치하여 아미노산 서열의 이차구조 형성의 자유도가 높을 것으로 분류되는 49개 거대분자 전달 도메인을 결정하였다.

이어서, 단계 1)에서 선별된 거대분자 전달 도메인 중에서 세포 외 분비 가능성이 높은 서열을 선별하였다. 일부 수용성 단백질은 수송을 매개하는 수용체와 상호작용 할 수 있는 신호를 갖고 있는데, 신호 매개 수송에서 단백질은 전달되는 타겟을 지정하는 하나 또는 그 이상의 신호서열을 가지고 있다. 따라서, 세포 외 분비 유도 서열과 유사성이 높으면 전송능을 향상시킬 수 있다는 가정 하에 Signal P 프로그램을 이용하여 세포 외 분비 유도 가능성을 평가하였다. 각 도메인에 대해 10 % 에서 90 % 사이의 가능성이 평가되는데, 단계 1)에서 결정된 거대분자 전달 도메인 중, 60 % 이상으로 평가된 서열을 개량형 대상 서열로 선별하였다.

이어서, 단계 2)에서 선별된 거대분자 전달 도메인 중에서 단계 3)에 기술된 바와 같이, 거대분자 전달 도메인의 물리화학적 특성을 결정하는 요소인 aliphatic index의 특정 수준을 만족하는 서열을 선별하였다. Aliphatic index는 아미노산의 곁가지의 탄소 체인에 의해 결정되는 전체 분자의 부피를 결정하는 물리적 특징으로 거대분자 전달 도메인이 세포막을 투과할 때 세포막의 구조를 변형하는 특징으로서 평가된다. Aliphatic index는 거대분자 전달 도메인의 아미노산 서열의 각각의 고유한 값과 전체 서열의 평균으로 결정되며, Protparam 프로그램(http://web.expasy.org/protparam/ 참조)을 이용하여 결정되었다. Protparam 프로그램은 아미노산으로 구성되는 단백질 내지 펩티드의 물리적 특성을 수치화하여 나타내는 유용한 도구로써 aliphatic index는 100에서 300 사이로 평가된 서열을 전송능 개량을 위한 대표 서열로 선별하였다.

이어서, 단계 3)에서 선별된 거대분자 전달 도메인 중에서 단계 4)에 기술된 바와 같이, 거대분자 전달 도메인의 물리화학적 특성을 결정하는 요소인 flexibility가 특정 수준을 만족하는 서열을 선별하였다. Flexibility는 거대분자 전달 도메인의 N 말단의 아미노산과 C 말단의 아미노산 사이의 상관 정도 및 자유도를 의미하는 물리화학적 특징으로 구조적으로 유연성을 부여하고, 세포막에 대한 친화력과 연관되어 있다. Flexibility는 아미노산 서열의 길이와 아미노산의 곁가지 서열의 구성에 따라 평가되며, Protscale (Average flexibility) 프로그램(http://web.expasy.org/protscale/ 참조)을 이용하여 평가되었다. Protscale 프로그램은 아미노산으로 구성되는 단백질 내지 펩티드의 물리적 특성을 수치화하여 나타내는 도구로 이용되었으며, 단계 3)에서 결정된 거대분자 전달 도메인 중, Protscale (Average flexibility) 프로그램을 이용한 flexibility의 평가 결과가 0.36 이상으로 평가된 서열을 전송능 개량을 위한 대표 서열로 선별하였다.

이어서, 단계 4)에서 선별된 거대분자 전달 도메인 중에서 단계 5)에 기술된 바와 같이, 거대분자 전달 도메인의 물리화학적 특성을 결정하는 요소인 hydropathicity가 특정 수준을 만족하는 서열을 선별하였다. Hydropathicity는 아미노산의 고유한 특징에 의해 결정되는 물리적 특징으로 물성을 결정하는 특징으로 여겨지며, 3.0 이상에서 심각한 엉김현상을 초래하는 것으로 알려져 있다. 또한, Hydropathicity는 거대분자 전달 도메인의 아미노산 서열의 각각의 고유한 값과 전체 서열의 평균으로 결정되며, Protparam 프로그램을 이용하여 평가하였다. 이에 1.3 에서 3.8 사이의 값으로 나타나는 hydropathicity 결과 중 단계 4)에서 선별한 거대분자 전달 도메인 내에서 hydropathicity가 3.0 이하로 평가된 서열을 개량을 위한 대표 서열로 결정하였다.

이어서, 단계 5)에서 선별된 거대분자 전달 도메인 중에서 단계 6)에 기술된 바와 같이, 거대분자 전달 도메인의 instability index가 특정 수준을 만족하는 서열을 결정하였다. Instability index는 아미노산 서열의 안정성을 의미하는 특성으로 서열 상의 아미노산의 배열 순서에 의해 결정되며 그 수치가 높을수록 불안정성을 갖는다. 이는 거대분자 전달 도메인의 물리화학적 특성을 결정하는 요소로 도메인의 세포내 안정성에 영향을 미치는 특징으로 여겨지며, Protparam 프로그램을 이용하여 평가하였다. 이에 분석결과 instability index 0 에서 130 사이의 값으로 나타나는 거대분자 전달 도메인중 단계 5)에서 결정된 거대분자 전달 도메인 내에서 instability index가 30 에서 60 사이에 위치한 서열을 개량을 위한 대표 서열로 선별하였다.

이어서 단계 6)에서 선별된 거대분자 전달 도메인 중에서 단계 7)에 기술된 바와 같이, 거대분자 전달 도메인의 물리화학적 특성을 결정하는 요소인 Polarity가 특정 수준을 만족하는 서열을 결정하였다. Polarity는 아미노산의 구성 성분 중 탄소 사슬의 길이 및 수산기의 유무로 판단되는 것으로 물에 대한 친화도를 나타내는 척도이다. 이는 hydropathicity와 함께 거대분자 전달 도메인의 물성을 결정하는 특징이며 세포막에 대한 친화도에도 영향을 미치는 것으로 생각된다. Polarity는 거대분자 전달 도메인의 아미노산 서열 각각의 고유한 값과 전체 서열의 평균으로 결정되며, Protscale (polarity) 프로그램을 이용하여 평가되었다. 이에 단계 6)에서 결정된 거대분자 전달 도메인 중, Protscale (polarity) 프로그램을 이용한 polarity의 평가 결과가 0.1 이상으로 평가된 서열을 개량을 위한 대표 서열로 선별하였다.

구체적으로, 대한민국 공개특허 제10-2009-0103957호에 기재된 거대 분자 전송 도메인 중 개량형 MTD 펩티드의 고안을 위한 대상 MTD인 JO-103(서열번호 3)는 하기 과정에 의해 결정되었다.

i) ‘대한민국 공개특허 10-2009-0103957: 신규한 거대분자 전달 도메인 및 이의 동정 방법 및 용도’에 공지된 거대 분자 전달 도메인 (MTD) 중, JO-103은 LALPVLLLA의 서열로 구성되어 있고;

ii) Singal P 프로그램을 이용한 세포 외 분비 가능성 평가에서 90 %의 가능성을 보이며;

iii) Protparam 프로그램을 이용한 aliphatic index 평가에서 271의 값을 나타내고;

iv) Protscale 프로그램을 이용한 flexibility 평가에서 0.38로 평가되며;

v) Protparam 프로그램을 이용한 hydrophobicity 결정에서 2.8로 결정되고;

vi) Protparam 프로그램을 이용한 instability index 결정에서 52로 결정되며;

vii) Protscale 프로그램을 이용한 polarity 평가에서 0.13으로 평가되므로,

따라서, 전송능 개선을 위한 대상 서열로 결정된 JO-103은 상기 7단계를 모두 만족하는 대상 도메인임을 알 수 있다.

동일한 방식을 통해, 개량형 MTD 펩티드의 고안을 위한 5개의 대상 MTD 펩티드가 선별되었으며, 구체적으로, 선별된 대상 MTD 펩티드는 MTD JO-18(서열번호 1), MTD JO-067(서열번호 2), MTD JO-103(서열번호 3), MTD JO-159(서열번호 4) 및 MTD JO-173(서열번호 5)이다.

이중 MTD JO-173번 펩티드에 대하여 프롤린의 위치를 변경하여 추가적인 유연성을 확보하고; 중간단계 펩티드인 MTD 173A 펩티드(서열번호 7)를 제작하였으며, 이렇게 제작된 MTD 173A 펩티드도 상기 7단계의 선별 조건을 모두 만족하므로, 개량형 MTD 펩티드의 고안을 위한 대상 MTD 서열에 포함하였다.

또한, 대상으로 선별된 MTD 중 JO-18번에 대하여 서열을 hydropathicity가 낮은 아미노산으로 치환하여 물성을 개선하고자 중간단계 펩티드 MTD 18m(서열번호 6)을 도출하였으며, 이 역시 상기 7단계의 선별 조건을 만족하고 있어, 개량형 MTD 펩티드의 고안을 위한 대상 MTD 서열에 포함하였다.

실시예 2. 개량형 MTD 펩티드의 고안

상기 실시예 1에서 선별된 7개의 대상 MTD를 토대로, 1~2개의 친수성(극성) 아미노산을 첨가하여 소수성 도메인에 적용하여 세포막으로의 접근성을 높임으로써, 보다 효율적으로 생물학적 활성 분자를 세포내로 전달하는 새로운 개량형 MTD 펩티드를 제작하고자 하였으며, 이를 통해 하기의 식 1로 기재되는 펩티드를 고안하였다;

[식 1]

A1-A2-MTD:

A1은 메티오닌(M, Met)이고;

A2는 양전하를 띠는 아르기닌(R, Arg), 히스티딘(H, His) 및 라이신(K, Lys)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이며;

MTD는 상기 실시예 1에서 선별된 서열번호 1 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 7개의 아미노산 서열.

상기 식 1을 통해 고안된 개량형 MTD 펩티드의 서열은 서열번호 15 내지 35에 기재된 아미노산 서열과 같으며, 고안된 아미노산 서열을 토대로 펩티드를 합성하여 그 세포 투과능을 확인하였다.

실시예 3. 개량형 MTD 펩티드의 2차구조 분석

상기 실시예 2에서 고안된 개량형 MTD 펩티드의 서열에 대하여, PEP FOLD server 서비스 프로그램을 이용하여 2차 구조를 분석하였다.

그 결과, 도 1 내지 도 4에서 보는 바와 같이, 상기 실시예 2에서 고안된 개량형 MTD 펩티드에 EGFP 형광 단백질의 N-말단 서열을 결합한 서열은 대한민국 공개특허 제10-2009-0103957호(신규한 거대분자 전달 도메인 및 이의 동정 방법 및 용도)에 공지된 거대 분자 전달 도메인(MTD) 펩티드의 구조적 특징을 훼손시키지 않고, 세포막의 투과성을 높일 수 있는 α-helix 구조를 유지하고 있음을 확인하였다.

실시예 4. 세포내 분자 전송 펩티드 및 FITC 융합 형광체의 합성

상기 실시예 2에서 고안된 개량형 MTD 펩티드를 본 발명의 피부 생리 활성 분자에 융합되는 세포내 분자 전송 펩티드에 적용하였으며, 이들의 합성을 위해 일반적인 Fmoc SPPS(solid phase peptide synthesis) 방법을 이용하여 C-term부터 하나씩 커플링(coupling) 하였다.

구체적으로 먼저, 펩티드의 C-말단 첫 번째 아미노산이 레진(resin)에 부착된(attached) 것을 사용하였다. 사용가능한 레진은 NH₂-Lys(Dde)-2-chloro-Trityl 레진, NH₂-Met-2-chloro-Trityl 레진, 또는 NH₂-Ser(tBu)-2-chloro-Trityl 레진 중에서 필요에 따라 적절한 레진을 선정하여 펩티드 합성에 사용하였다.

둘째, 펩티드 합성에 사용하는 모든 아미노산 원료는 N-말단이 Fmoc으로 보호되고, 잔기는 모두 산에서 제거되는 Trt, Boc, t-Bu 등으로 보호된 것을 사용하였다 (Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Met-OH). 특수 아미노산의 경우에는 Fmoc-Lys(Ac)-OH, Fmoc-Lys(Dde)-OH를 사용하였다.

셋째, 20% piperidine in DMF를 이용하여 상온에서 5분간 2회 반응하여 Fmoc을 제거하였다.

넷째, DMF, MeOH, MC, DMF 순으로 세척하였다.

다섯째, 합성된 펩티드를 Resin에서 분리 및 잔기의 보호기 제거에는 TFA/EDT/Thioanisole/TIS/H2O=90/2.5/2.5/2.5/2.5을 사용한다 (TFA = trifluoroacetic acid, EDT = 1,2-ethanedithiol, TIS = triisopropylsilane). 마지막으로 HPLC로 정제 후, 질량분석기(mass spectrometer)로 분자량을 확인하고 동결건조하여 세포내 분자 전송 펩티드 합성품을 얻었다.

또한, 형광표시자(FITC)이 붙은 세포내 분자 전송 펩티드를 합성하기 위하여 세포내 분자 전송 펩티드는 상기의 합성방법으로 합성을 진행한 후에 마지막으로 라이신(K, Lysine)을 추가하여 펩티드 합성을 진행한 후 라이신의 프리 아민 잔기에 FITC를 결합시켰다. 합성된 세포내 분자 전송 펩티드-FITC 펩티드를 레진에서 분리하고 HPLC로 정제 후, 질량분석기(mass spectrometer)로 펩티드의 분자량을 확인하고 동결건조하여 세포 내 분자 전송 펩티드 형광체를 얻었다. 이후, 합성된 세포내 분자 전송 펩티드 형광체는 차광 상태에서 1 mM 농도가 되도록 DMSO로 녹인 후 1.5 mL 원심분리용 용기에 소량으로 분주하고 사용직전까지 냉동보관 하였다.

실시예 5. 피부 각질 형성세포에서 유세포 측정 ( Flow Cytometry )을 이용한 세포내 분자 전송 펩티드 형광체( MTD - FITC )의 in vitro 세포투과능 확인

세포 투과능을 검증하기 위해 3 μM 농도의 세포내 분자 전송 펩티드 형광체(MTD-FITC)를 피부각질형성세포 (Human Keratinocyte cell line, HaCaT cell, Order No. 300493, CLS cell line service, Germany)에 처리하고, 1시간 동안 배양하였다. 상기 HaCaT 세포를 10% 우태아 혈청(Fetal bovine serum: FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(10,000 units penicillin 및 10,000 μg/mL streptomycin, invitrogen)을 함유하는 DMED (Dubelcco’s modified eagle medium) 배지에서 유지하고, 5% CO₂의 습윤(humidified) 대기 하에서 37℃로 배양하였다. 배양이 종결된 후, 단백질이 처리된 HaCaT 세포의 세포막에 노출되어 있는 유리 MTD-FITC를 제거하기 위해 트립신을 처리하고, 냉장 보관한 PBS로 3번 세척하였다.

MTD-FITC 펩티드를 유세포 분석기 (FACS Calibur , Beckton-Dickinson, San Diego CA, USA)에 적용하였다. 각각의 시료에 대하여, 세포(1X10⁴)를 셀퀘스트 프로 세포측정 분석(CellQues Pro cytometric analysis) 소프트웨어를 이용하여 분석하였으며, 각각의 실험을 3회 이상 수행하였다. 본 발명에 적용되는 세포내 분자 전송 펩티드 각각의 세포투과성을 기존 MTD-FITC를 대조군으로 사용하여 세포투과 효율을 정량적으로 비교분석 하였다.

도 5는 유세포 측정(flow cytometry) 분석 결과를 나타낸 것으로, 세포에 처리된 각각의 세포내 분자 전송 펩티드의 세포 유입 효율은 셀퀘스트 프로 세포측정 분석(CellQues Pro cytometric analysis) 소프트웨어로 기하 평균(Geometric mean) 형광의 변화를 상대적으로 평가함으로써, 세포 유입 효율을 비교하였다.

그 결과, 세포내 분자 전송 펩티드(MTD-FITC)가 기존 MTD 펩티드의 우수한 세포 유입 효율을 나타내며, 또한 공지의 PTD 보다 최소 140%에서 최대 400%까지 높은 세포 유입 효율을 나타냄을 확인하였다.

실시예 6. 공초점현미경을 이용한 세포내 분자 전송 펩티드 형광체( MTD -FITC) 의 피부 세포 투과능 확인

세포내 분자 전송 펩티드와 기존에 세포 투과가 되는 것으로 알려진 PTD (Tat) 단백질을 피부유래 각질형성세포 (HaCaT cell, immortalized human keratinocyte, Cat No. 300493, CLS, Germany)에 3 μM 농도로 처리하고 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 공초점현미경 (confocal microscopy, Nikon, Germany)을 이용하여 가시적으로 관찰하였다. 실험 전일 HaCaT 세포를 글래스 커버슬립이 들어있는 12-웰 플레이트(12-well culture plate) 내에서 24시간 동안 배양하였다. HaCaT 세포는 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum: FBS), 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(10,000 units penicillin 및 10,000 μg/mL streptomycin, Invitrogen, USA)을 함유하는 DMEM 배지에서 유지하고, 5% CO₂의 습윤(humidified) 대기 하에서 37℃로 배양하였다. HaCaT 세포에 3 μM의 농도로 scrambled 펩티드, MTD-FITC 및 PTD-FITC 펩티드를 1시간 동안 처리하였다. 상기 처리 1시간 후, 관찰을 위하여 세포를 실온에서 4% 파라포름알데하이드 용액 (paraformaldehyde, PFA)로 20 분간 고정하였다.

내재화된(internalzed) FITC-펩티드의 직접적인 검출을 위하여 상기 세포를 PBS로 3회 세척하고 핵 형광 염색 용액인 5 mM 농도의 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)로 대조염색(counterstain)을 수행하였다. 10분 간의 DAPI 염색 후, 상기 세포를 PBS로 3회 세척하고 단백질의 형광표지를 보존하기 위해 20 ㎕의 중첩배지(mounting media)를 슬라이드 위에 점적하고 관찰하였다. 상기 세포내 분자 전송 펩티드가 처리된 세포는 FITC-펩티드의 세포 내 전달부위의 구별이 용이하도록 DAPI 염색을 통해 핵으로 전달 및 세포투과성 여부를 확인하였으며, 공초점 현미경은 노마스키 필터(normaski filter)를 이용하여 세포의 원형을 관찰하고, FITC 형광 및 DAPI 형광을 각각의 플루오로크롬(fluorochrome)에 맞는 필터로 관찰하였다. 도 6 내지 도 8에 나타난 바와 같이, 본 발명에 적용되는 세포내 분자 전송 펩티드 모두에서 세포막 바깥에 부착되어 있는 PTD (Tat)에 비해 분명하게 세포 내로 전송된 것을 확인하였으며, 개량된 세포 내 분자 전송 펩티드가 피부 세포에 대해 우수한 세포 투과능을 가지고 있음을 입증하였다.

실시예 7. 세포내 분자 전송 펩티드의 인공 피부 조직 투과능 확인

Ex vivo 조직 분포 능력의 분석을 위하여 EpiOral 피부모델 (MatTek, MA, USA)을 사용하여 FITC를 접합시킨 종래의 MTD (M18m, M173)와 세포내 분자 전송 펩티드 (M1018m, M1173A)를 선별하여 처리하고, 공초점현미경(confocal microscopy, Carl Zeisse , Germany)을 이용하여 가시적으로 관찰하였다. 실험전일 MatTek사에서 제공하는 실험 배지가 0.5 mL 들어있는 12-웰 플레이트(12-well plate)에 EpiOral 인공 조직 모델을 15시간 동안 5% CO₂의 습윤(humidified) 대기 하에서 37℃로 배양하였다. 다음날 새로운 배지로 교환하고, 50 μM 농도의 펩티드 40 ㎕를 EpiOral 인공 조직 위쪽에 처리하고 5시간 동안 5% CO₂의 습윤(humidified) 대기 하에서 37℃로 배양하였다. 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde, PFA)에 15시간 이상 넣어 EpiOral 인공 조직 모델을 고정한 후, 마이크롬 냉동박절기(Microm HM520 cryostat, Thermo)를 이용하여 동결절편(Cryosection)(6 μm)을 제조한 뒤, 이를 유리 슬라이드 위에 올려 제작하였다. 제작된 슬라이드는 10분 동안 PBS 완충용액으로 절편을 세척하고 0.5 mM DAPI 용액에 5분 간 노출하여 조직 내 세포핵을 염색하였다. 염색된 조직을 다시 10분 간 3번씩 PBS 완충용액으로 세척한 후, 중첩배지(mounting media)를 이용하여 슬라이드에 고정한 후에 공초점 현미경으로 관찰하였고 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타난 바와 같이, 음성대조군(vehicle)에서는 어떠한 유의미한 수준의 형광도 관찰되지 않았다. 하지만, 실험에 사용한 세포내 분자 전송 펩티드의 경우 시간이 경과함에 따라 EpiOral 인공 조직 모델 안쪽으로 투과가 일어나는 것을 확인하였다. 또한 실험에 사용한 종래의 MTD 펩티드(18m, 및 173) 보다 세포내 분자 전송 펩티드(1018m, 및 1173A)에서 심부 조직까지 보다 효과적으로 전달되는 것을 확인할 수 있었으며 형광의 밝기도 증가되는 것을 확인하였다. 이로서 개량된 세포 내 분자 전송 펩티드가 피부 조직에 대해서도 우수한 조직 투과능을 가지고 있음을 입증하였다.

실시예 8. 세포내 분자 전송 펩티드의 인공 피부 조직 투과능 확인

Ex vivo 조직에서의 각질층 투과 능력의 분석을 위하여 EpiDerm 피부모델 (MatTek, MA, USA)을 사용하여 FITC를 접합시킨 세포내 분자 전송 펩티드 (M1067)와 Tat 펩티드를 선별하여 처리하고, 공초점현미경(confocal microscopy, Carl Zeiss , Germany)을 이용하여 가시적으로 관찰하였다. 실험전일 MatTek사에서 제공하는 실험 배지가 0.5 ml 들어있는 12-웰 플레이트(12-well plate)에 EpiDerm 피부모델을 15시간 동안 5% CO₂의 습윤(humidified) 대기 하에서 37℃로 배양하였다. 다음날 새로운 배지로 교환하고, 100 μM 농도의 펩티드 40 ㎕를 EpiDerm 피부 위쪽에 처리하고 24시간 동안 5% CO₂의 습윤(humidified) 대기 하에서 37℃로 배양하였다. 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde, PFA)에 15시간 이상 넣어 EpiDerm 피부모델을 고정한 후, 마이크롬 냉동박절기(Microm HM520 cryostat, Thermo)를 이용하여 동결절편(Cryosection)(6 μm)을 제조한 뒤, 이를 글래스 슬라이드 위에 올려 제작하였다. 제작된 슬라이드는 10분 동안 PBS 완충용액으로 절편을 세척하고 0.5 mM DAPI 용액에 5분 간 노출하여 조직 내 세포핵을 염색하였다. 염색된 조직은 다시 10분 간 3번씩 PBS 완충용액으로 세척을 한 후, 중첩배지(mounting media)를 이용하여 고정한 후에 공초점 현미경으로 관찰하였고 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타난 바와 같이, 음성대조군(vehicle)에서는 어떠한 유의미한 수준의 형광도 관찰되지 않았으며, Tat 펩티드의 경우는 최상층의 각질층에 처리된 Tat-FITC가 조직 내로 투과되지 못하고 머물러 있는 것으로 나타났지만, 세포 내 분자 전송 펩티드 (M1067)의 경우 시간이 경과함에 따라 최상층의 각질층을 투과하여 Epiderm 피부 모델 안쪽으로 현저히 투과가 일어나는 것을 확인하였다. 이로써 세포 내 분자 전송 펩티드 (M1067)는 피부 흡수에 있어 최대 장벽으로 알려진 각질층을 통과하고, 우수한 피부 조직 투과능을 보유하고 있음을 입증하였다.

실시예 9. 동물 모델을 이용한 세포 내 분자 전송 펩티드의 in vivo 피부 조직 투과능 확인

세포내 분자 전송 펩티드의 in vivo 피부 조직 투과능을 검증하기 위하여, 동물모델을 이용하여 실험하였다. 8주령의 암컷 ICR 마우스 (오리엔트바이오, 한국)를 대상으로 개체당 2.5 cm X 2.5 cm 크기의 멸균거즈에 형광표시자 (FITC)가 부착된 세포내 분자 전송 펩티드(M1067), Tat-FITC 및 FITC 단독을 각각 100 ㎍ 점적하여 마우스 등 부위에 Tegarderm (3M, USA)를 이용하여 고정시켰다. 1, 3, 6, 12 시간 경과 후, 마우스를 경추탈골의 방법으로 희생시키고, 약물이 도포된 부위의 피부를 적출하여, 4% paraformaldehyde에 24시간 이상 넣어 조직을 고정한 후, 6 ㎛ 두께로 냉동 절편을 얻어 슬라이드를 제작하였다. 제작된 슬라이드는 10분 동안 PBS 완충용액으로 절편을 세척하여 0.5 mM DAPI 용액에 5분 간 노출하여 조직 내 세포핵을 염색하였다. 염색된 조직을 다시 10분 간 3번씩 PBS 완충용액으로 세척을 한 후, 중첩배지 (mounting media)를 이용하여 고정한 후에 공초점 현미경으로 관찰하였으며, 이를 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타난 바와 같이, 음성대조군 (vehicle)에서는 형광신호가 전혀 검출되지 않았으며, FITC 단독 및 Tat-FITC 처리군에서는 피부 최상위층인 각질층에 형광신호가 특이적으로 관찰되는 것으로 보아 피부투과가 일어나지 않았음을 확인하였다. 그러나, 실험에 사용한 세포내 분자 전송 펩티드(M1067)의 경우, 도포 시간이 경과함에 따라 피부의 깊은 조직까지 투과가 일어나며, 투과된 세포내 분자 전송 펩티드(M1067)는 각질층을 통과하여 피부 조직 및 피부 모낭세포의 세포질에도 특이적으로 존재하는 것을 확인하였다.

실시예 10. 피부 생리 활성이 물질이 결합된 세포내 분자 전송 펩티드의 미백 효능 확인

10-1. 세포내 분자 전송 펩티드- 쿠마릭산의 합성

N-말단의 아미노산까지 커플링 된 상기 실시예 4에서 합성된 세포내 분자 전송 펩티드 M1067 및 M2067에 20% 피페리딘/N-메틸피롤리돈(Piperidine/N-methylpyrrolidone) 용액을 가하여 Fmoc기를 제거하고 N-메틸피롤리돈과 디클로로메탄(dichloromethane)으로 세척한 다음 상업적으로 판매되고 있는 쿠마릭산(coumaric acid, Sigma, USA)을 커플링시켰다. 커플링이 끝난 후 N-메틸피롤리돈과 디클로로메탄(dichlorometnane)으로 여러 번 세척한 다음 질소 가스로 건조시켰다. 여기에 트리플루오로아세트산 : 페놀 :치오아니솔 : 물 : 트리이소프로필실란 (trifluoroacetic acid: phenol: thioanisole: water: triisopropylsilane)의 90 : 2.5 : 2.5 : 2.5 : 2.5 (v/v) 용액으로 2 내지 3시간 반응시켜 펩타이드 보호기를 제거하고, 레진으로부터 펩타이드가 결합된 쿠마릭산을 분리시킨 다음, 디에틸에테르로 펩티드를 침전시켰다. 쿠마릭산의 C의 9번 탄소에 결합된 알코올기를 보호하고 있는 벤질기를 제거하기 위하여 10% Pd/C을 메탄올에 첨가하고, 수소 하에서 약 1시간 동안 실온에서 교반한 후, 셀라이트를 사용하여 Pd/C를 제거하고 얻은 여액을 감압 농축하였다. 이렇게 얻은 세포내 분자 전송 펩티드-쿠마릭산 유도체는 0.1% 트리플루오로아세트산이 포함된 아세토나이트릴를 구배로 하여 정제 역상 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼(purified reverse phase high performance liquid chromatography column, Zobax, C8 300Å, 21.1mm X 25cm)을 이용하여 정제함으로써 하기 식 2에서와 같이 서열번호 16번 또는 23번의 아미노산 서열을 갖는 M1067 또는 M2067 세포 내 분자 전송 펩티드에 쿠마릭산이 결합된 세포내 분자 전송 펩티드-쿠마릭산 유도체를 합성하였다.

[식 2]

(4-Hydroxycinnamoyl) Ala Ala Val Ala Pro Ala Ala Ala Arg Met

(4-Hydroxycinnamoyl) Ala Ala Val Ala Pro Ala Ala Ala His Met

10-2. 세포내 분자 전송 펩티드- 쿠마릭산의 티로시나제 저해 활성 확인

상기 실시예 10-1에서 합성된 화합물인 세포내 분자 전송 펩티드-쿠마릭산을 사용하여 티로시나제 활성 저해 효과를 측정하였다. 티로시나제는 버섯에서 분리 및 정제된 것으로 시그마사(Sigma, USA)에서 구입하여 사용하였다. 기질인 티로신은 0.05 M 인산칼륨 완충용액(pH6.8)에 녹여 0.3 mg/mL 용액으로 만들어 사용하였다. 화합물은 증류수에 100 mg/mL 농도로, 쿠마릭산은 에틸알코올에 100 mg/mL 농도로 용해시키고 다시 적당한 농도로 희석하여 사용하였다. 시료 티로신 용액과 완충용액을 각각 0.5 mL씩 시험관에 넣고 여기에 상기 화합물 용액을 0.5 mL을 가하여 37℃ 항온기에서 10분 간 방치한 후 2,000 U/mL 티로시나제 0.05 mL을 넣고 37℃에서 10분 간 반응시켰다. 이때 대조군은 각 화합물 대신 증류수 0.5 mL을 넣은 것이다. 반응액이 든 시험관을 항온기에서 꺼내 분광광도계 (spectrophotometer)로 파장 450 nm에서 흡광도를 측정하여 티로시나제 활성 저해율을 구하였다. 저해율을 하기 수학식 1에 따라 구하였으며, 그 결과는 도 12에 나타내였다.

상기 수학식 1에서,

A는 저해제가 첨가되지 않은 것의 450nm에서의 흡광도이며,

B는 저해제가 첨가된 것의 450nm에서의 흡광도이다.

그 결과 도 12에 나타낸 바와 같이, 기존에 티로시나제 저해 활성이 높은 것으로 알려진 쿠마릭산에 비해 본 발명의 세포내 분자 전송 펩티드와 결합한 화합물의 경우, 효소 저해 활성이 통계적으로 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다.

10-3. 세포내 분자 전송 펩티드- 쿠마릭산의 세포내 멜라닌 생성 저해 활성 확인

상기 실시예 10-1에서 합성된 화합물인 세포내 분자 전송 펩티드-쿠마릭산을 사용하여 세포 배양시 세포내의 멜라닌 생성양을 비교하였다. 마우스 유래 멜라노마 세포(murine melanoma, B16F1, 한국세포주은행 KCLB No.80007)를 10% FBS (fetal bovine serum)이 함유된 DMEM (Dubelcco's modified eagle medium) 배지로 6-well plate에 well당 1 X 10⁵개로 접종한 후 5% CO₂, 37℃ 하에서 세포가 well 바닥에 약 80% 이상 부착될 때까지 배양한다. 배양 후 배지를 제거하고 시료가 적당 농도 (1, 10, 100 ㎍/mL)로 희석된 배지로 교체한 후 5% CO₂, 37℃ 하에서 매일 배지를 교환하면서 3일 동안 배양한다. 3일 배양 다음날 배지를 제거한 세포를 PBS (phosphated buffer saline)으로 세척하고, 이것을 트립신으로 처리하여 세포를 회수한다. 회수된 세포는 10,000 rpm으로 10분간 원심분리한 다음 상등액을 제거하여 cell pellet을 얻고, 이 세포 pellet은 60℃에서 건조한 후 10% DMSO가 함유된 1M 수산화나트륨용액 200 uL를 넣어 60℃에서 충분히 녹여 세포내 멜라닌을 얻는다. 이 액을 가지고 microplate reader로 490 nm에서 흡광도를 측정하고 일부는 단백질 양을 특정하여 일정 단백질당 멜라닌양을 구한다. 공시험하여 보정한다.

그 결과 도 13에 나타낸 바와 같이, 기존에 세포내 멜라닌 생성 저해 효능이 있는 것으로 알려진 알부틴 (arbutin) 및 쿠마릭산 (coumaric acid)에 비해 본 발명의 세포내 분자 전송 펩티드와 결합한 화합물의 경우, 세포내 멜라닌 생성 저해 효능이 통계적으로 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다.

10-4. 세포내 분자 전송 펩티드- 쿠마릭산의 피부 안전성 평가

상기 실시예 10-1에서 합성된 화합물 세포내 분자 전송 펩티드-쿠마릭산과 세포내 분자 전송 펩티드(M1067)의 인체 피부를 이용한 일차자극 시험을 통하여 화장품 원료로서의 안전성을 확인하기 위하여 전문 임상 시험 기관인 (주)더마프로에 의뢰하여 수행하였다. 임상용 화장품 조성물은 하기에 기재된 바와 같이 준비하였다.

10-4-1.인체 피부 일차 자극 시험

임상 시험 선정 기준에 부합하고 제외기준에 해당되지 않는 피험자 30명 이상을 선정하였다. 피험자를 대상으로 등 부위에 시료물질을 도포한 후 48시간 후에 제거하였다. 제거 후 30분, 24시간 후에 시험부위를 관찰하였다. 피부 평가는 Frosch & Kligman 법(Frosch P.J and Kligman A.M. J Am Acad Dermatol, 1(1):35-41 (1979))과 The Cosmetic, Toiletry, and Frangrance Association (CTFA) guideline (The Cosmetic, Toiletry and Frangrance Association, Inc. Washington, D.C. 20005 (1981))을 반영한 표 1의 기준으로 평가하였고, 48시간 및 72시간의 평균 반응도를 비교하였으며, 각 조성물에 대한 평균 반응도를 기준으로 하여 그 결과를 판정하였다.

상기 표 2에 나타난 바와 같이 세포내 분자 전송 펩티드 및 세포내 분자 전송 펩티드-쿠마릭산은 인체 피부 일차 자극 측면에서 저자극 범주의 물질로 확인되었다. 이로써, 전문시험기관의 임상시험을 통해 세포내 분자 전송 펩티드가 피부 생리 활성 분자의 기능을 유지시키면서도, 인체에 대해서 안전하게 이용될 수 있음을 입증하였으며, 이는 화장용 조성물로서 이용가치가 현저히 우수함을 보여주고 있다.

10-4-2. 세포내 분자 전송 펩티드- 쿠마릭산 함유 화장료 조성물의 제조

세포내 분자 전송 펩티드-쿠마릭산 또는 세포내 분자 전송 펩티드를 함유한 에센스 조성물은 상기 표 3의 조성으로 아래와 같이 제형화하였다.

수상용해조에 1 ~ 6을 넣고 70℃까지 가온하면서 완전 용해시킨 뒤 유화조로 투입한다. 유상용해조에 7 ~ 11을 넣고 70℃까지 가온하면서 완전 용해시킨 후 유화조에 넣고 혼합한다. 내용물을 40℃까지 냉각한 뒤 원료 12, 13, 15을 유화조로 투입한 뒤 혼합한 후 내용물을 실온까지 냉각시켜 세포내 분자 전송 펩티드-쿠마릭산을 함유하는 피부 미백용 조성물을 제조하였다.

비교예 1 : 수상용해조에 1 ~ 6을 넣고 70℃까지 가온하면서 완전 용해시킨 뒤 유화조로 투입한다. 유상용해조에 7 ~ 11을 넣고 70℃까지 가온하면서 완전 용해시킨 후 유화조에 넣고 혼합한다. 내용물을 40℃까지 냉각한 뒤 원료 12 ~ 14을 유화조로 투입한 뒤 혼합한 후 내용물을 실온까지 냉각시켜 세포내 분자 전송 펩티드를 함유하는 조성물을 제조하였다.

비교예 2 : 수상용해조에 1 ~ 6을 넣고 70℃까지 가온하면서 완전 용해시킨 뒤 유화조로 투입한다. 유상용해조에 7 ~ 11과 16을 넣고 70℃까지 가온하면서 완전 용해시킨 후 유화조에 넣고 혼합한다. 내용물을 40℃까지 냉각한 뒤 원료 12, 13을 유화조로 투입한 뒤 혼합한 후 내용물을 실온까지 냉각시켜 쿠마릭산을 함유하는 조성물을 제조하였다.

실시예 11. 피부 생리 활성 물질이 결합된 세포내 분자 전송 펩티드의 주름개선 효능 확인

11-1. 세포내 분자 전송 펩티드- 아세틸펜타펩티드의 합성

N-말단의 아미노산까지 커플링 된 상기 실시예 4에서 합성된 서열번호 16번의 아미노산 서열을 갖는 M1067 펩티드에 화장품업계에서 상업적으로 사용되고 있는 아세틸펜타펩티드 (acetylated Lys Ther Ther Lys Ser)를 순차적으로 합성하고, 20% 피페리딘/N-메틸피롤리돈(Piperidine/N-methylpyrrolidone) 용액을 가하여 Fmoc기를 제거하고 N-메틸피롤리돈과 디클로로메탄(dichloromethane)으로 여러 번 세척한 다음 질소 가스로 건조시켰다. 여기에 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid) : 페놀(phenol) : 치오아니솔(thioanisole) : 물(water) : 트리이소프로필실란(triisopropylsilane)을 90 : 2.5 : 2.5 : 2.5 : 2.5 (v/v) 비율로 혼합한 용액으로 2 내지 3시간 반응시켜 펩티드 보호기를 제거하고, 레진으로부터 펩티드를 분리시킨 다음, 디에틸에테르로 펩티드를 침전시켰다. 이렇게 얻은 MTD 펩티드-아세틸펜타펩티드 유도체는 0.1% 트리플루오로아세트산이 포함된 아세토나이트릴를 구배로 하여 정제 역상 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼(purified reverse phase high performance liquid chromatography column, Zobax, C8 300Å, 21.1mm X 25cm)을 이용하여 정제함으로써 하기 식 3에서와 같이 서열번호 16번의 아미노산 서열을 갖는 M1067 세포내 분자 전송 펩티드에 아세틸펜타펩티드가 결합된 아세틸펜다펩티드 유도체를 합성하였다.

[식 3]

Met Arg Ala Ala Ala Pro Ala Val Ala Ala Lys* Ther Ther Lys Ser

* : acetylated lysine

11-2. 세포내 분자 전송 펩티드- 아세틸펜타펩티드의 세포 내 콜라게나제 활성 억제 효과 확인

상기 실시예 11-1에서 합성된 화합물인 세포내 분자 전송 펩티드-아세틸펜타펩티드를 사용하여 사람 정상피부 섬유아세포 내 콜라게나제 활성 저해 효과를 시험하였다. 세포 내 콜라게나제 활성 억제의 측정은 문헌(Bauer EA et al, J Invest Dermatol, 82(2):162-9, 1983)의 방법을 응용하여 측정하였으며, 시료를 첨가하지 않은 것을 100%로 하였다. 상세한 실험방법은 다음과 같다. 사람의 정상 피부 섬유아세포를 세포 배양용 6-웰 플레이트에 분주하고 일정 수의 세포를 접종한 후, 일정한 농도로 세포내 분자 전송 펩티드-아세틸펜타펩티드를 처리하고 24시간 배양한 후, 배양액 100 ㎕를 취하여 Matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) human biotrak ELISA system (GEHealthcare, USA)에 기재된 방법대로 배양액 내 콜라게나제의 양을 측정하였다. ELISA 방법은 2번 정량용 완충액 100 ㎕를 96웰 플레이트에 넣은 다음 1/10으로 희석한 배양액 및 표준액을 각각 100 ㎕을 넣고 상온에서 2시간 배양한다. 웰 플레이트에서 배양액을 제거한 다음 세척용 완충액 400 ㎕로 3회 세척 후 항체액 100 ㎕를 넣고 상온에서 2시간 반응시킨 다음 세척용 완충액 400 ㎕로 3회 세척한다. 이후, Peroxidase conjugate solution 100 ㎕을 넣고 상온에서 2시간 반응시킨 다음 인산염완충액 (PBS) 400 ㎕로 3회 세척하고, TMB substrate 100 ㎕를 넣고 상온에서 30분간 반응시킨다. 1M 황산 용액 100 ㎕를 넣고 450 nm에서 ELISA Reader로 측정하며, 표준액은 Huamn pro MMP-1에 정량용 완충액을 넣어 녹인 후, 각각 0, 3.13, 6.25, 12.5, 25, 50 ng/mL이 되도록 희석하여 사용한다. 저해율을 수학식 2에 따라 구하였으며, 그 결과는 도 14에 나타내었다.

상기 수학식 2에서,

A는 시료가 첨가되지 않은 것의 450 nm에서의 흡광도이며,

B는 시료가 첨가된 것의 450 nm에서의 흡광도이다.

그 결과 도 14에 나타낸 바와 같이, 세포내 분자 전송 펩티드-아세틸펜타펩티드를 처리한 군에서 농도 의존적으로 세포 내 콜라게나제의 활성억제를 유의하게 함을 확인하였다.

11-3. 세포내 분자 전송 펩티드- 아세틸펜타펩티드의 피부 안전성 확인

상기 실시예 11-1에서 합성된 화합물인 세포내 분자 전송 펩티드-아세틸펜타펩타이드의 인체 피부를 이용한 일차자극 시험을 통하여 화장품 원료로서의 안전성을 확인하기 위하여 전문 임상 시험 기관인 (주)더마프로에 의뢰하여 수행하였다. 임상용 화장품 조성물은 하기에 기재된 바와 같이 준비하였다.

11-3-1. 인체 피부 일차 자극 시험

임상 시험 선정 기준에 부합하고 제외기준에 해당되지 않는 18세 ~ 60세의 남성 또는 여성 피험자 30명 이상을 선정하였다. 피험자를 대상으로 등 부위에 시료물질을 도포한 후 48시간 후에 제거하였다. 제거 후 30분, 24시간 후에 시험부위를 관찰하였다. 피부 평가는 Frosch & Kligman 법(Frosch P.J and Kligman A.M. J Am Acad Dermatol, 1(1):35-41 (1979))과 The Cosmetic, Toiletry, and Frangrance Association (CTFA) guideline (The Cosmetic, Toiletry and Frangrance Association, Inc. Washington, D.C. 20005 (1981))을 반영한 표 4의 기준으로 평가하였고, 48시간 및 72시간의 평균 반응도를 비교하였으며, 각 조성물에 대한 평균 반응도를 기준으로 하여 그 결과를 판정하였다.

상기 표 5에 나타난 바와 같이 세포내 분자 전송 펩티드 및 세포내 분자 전송 펩티드-아세틸펜타펩타이드는 인체 피부 일차 자극 측면에서 저자극 범주의 물질로 나타났다. 이로써, 전문시험기관의 임상시험을 통해 세포내 분자 전송 펩티드가 피부 생리 활성 분자의 기능을 유지시키면서, 인체에 대해서 안전하게 이용될 수 있음을 입증하였으며, 이는 세포내 분자 전송 펩티드가 화장물 조성물로서 그 이용가치가 현저히 우수함을 나타내는 결과라 할 수 있을 것이다.

11-3-2. 세포내 분자 전송 펩티드- 아세틸펜타펩타이드 함유 화장료 조성물의 제조

세포내 분자 전송 펩티드-아세틸펜타펩타이드 또는 세포내 분자 전송 펩티드(M1067)를 함유한 에센스 조성물은 표 6의 조성으로 아래와 같이 제형화하였다.

수상용해조에 1 ~ 5을 넣고 70℃까지 가온하면서 완전 용해시킨 뒤 유화조로 투입한다. 유상용해조에 6 ~ 10을 넣고 70℃까지 가온하면서 완전 용해시킨 후 유화조에 넣고 혼합한다. 내용물을 40℃까지 냉각한 뒤 원료 11, 12, 14을 유화조로 투입한 뒤 혼합한 후 내용물을 실온까지 냉각시켜 세포내 분자 전송 펩티드-아세틸펜타펩타이드를 함유하는 피부 주름개선용 조성물을 제조하였다.

비교예 1 : 수상용해조에 1 ~ 5을 넣고 70℃까지 가온하면서 완전 용해시킨 뒤 유화조로 투입한다. 유상용해조에 6 ~ 10을 넣고 70℃까지 가온하면서 완전 용해시킨 후 유화조에 넣고 혼합한다. 내용물을 40℃까지 냉각한 뒤 원료 11 ~ 13을 유화조로 투입한 뒤 혼합한 후 내용물을 실온까지 냉각시켜 세포내 분자 전송 펩티드을 함유하는 조성물을 제조하였다.

비교예 2 : 수상용해조에 1 ~ 5을 넣고 70℃까지 가온하면서 완전 용해시킨 뒤 유화조로 투입한다. 유상용해조에 6 ~ 10을 넣고 70℃까지 가온하면서 완전 용해시킨 후 유화조에 넣고 혼합한다. 내용물을 40℃까지 냉각한 뒤 원료 11, 12, 15를 유화조로 투입한 뒤 혼합한 후 내용물을 실온까지 냉각시켜 아세틸펜타펩타이드를 함유하는 조성물을 제조하였다.

실시예 12. 세포내 분자 전송 펩티드와 피부 생리 활성 분자가 결합된 화장료 조성물의 경피 흡수 확인

본 발명에서 획득된 물질의 피부 조직 내 침투 (이를 통상적으로 경피흡수라 한다)를 확인하기 위하여 공시된 가이드라인에 따라 경피흡수 실험을 수행하였다(Test Guideline 428 : Skin absroption: in vitro Method, OECD, Paris, (2004), 생체외 피부흡수시험 가이드라인, 한국식품의약품안전청 (2010)). 경피 흡수 실험은 냉동 보관된 사체 피부 (cadaver skin, Cat No. SK11122, 한스바이오메드)를 32℃로 가온된 PBS에 해동하여 이를 이용하였다. 해동된 사체 피부는 수직형의 확산셀(Franz diffusion cell, Logan FDC-6, Logan instrument Corp. Somerset, NJ, USA)의 도너 (donor)과 리셉터 (receptor) 사이에 표피가 위로 (donor 방향으로) 향하게 하고 진피는 아래로 (receptor 방향으로) 장착하였다. 그런 다음 리셉터에 PBS 용액 (phosphate-buffered saline, pH 7.4, 32℃)을 채우고 사체 피부가 PBS 용액과 평형상태가 되도록 1시간 동안 방치하였다. 이후, 상기 실시예 4, 10-1 및 11-1에서 제조된 세포내 분자 전송 펩티드, 세포내 분자 전송 펩티드-쿠마릭산 및 세포내 분자 전송 펩티드-아세틸펜타펩타이드를 각각 1 mg을 1% DMSO가 함유된 PBS 용액 1mL에 충분히 녹여 표피에 도포하고(도포 면적 1.7 ㎤) 파라필름으로 도너를 봉쇄하여 시료가 증발되지 않도록 하였다. 24 시간 후 리셉터에서 0.2 mL의 시료를 채취하여 피부를 통해서 투과되어 나온 세포내 분자 전송 펩티드, 세포내 분자 전송 펩티드-쿠마릭산 및 세포내 분자 전송 펩티드-아세틸펜타펩타이드의 양을 질량분석기(mass spectrometer)로 분자량을 분석 및 정량하여 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

상기 표 7에서와 같이 세포내 분자 전송 펩티드 단독의 피부 투과율도 11.8%도 상대적으로 높은 것을 알 수 있었으며, 피부생리활성 물질을 결합한 세포내 분자 전송 펩티드의 경우, 자체적으로 피부 각질층 투과 효능이 있는 쿠마릭산의 피부 투과율에 비해 세포내 분자 전송 펩티드이 결합된 쿠마릭산이 투과율이 2배 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 피부 각질층 투과가 어려운 아세틸펜타펩타이드의 경우는 세포내 분자 전송 펩티드와의 결합 시 피부 투과율이 28배까지 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 이로써 인간 피부에 대한 경피흡수 실험에서도 세포내 분자 전송 펩티드와 피부 생리 활성 분자가 결합된 화장료 조성물의 투과능이 현저히 우수함을 다시한번 입증하였으며, 이로써 세포내 분자 전송 펩티드의 산업적 이용가치가 상당함을 확인할 수 있었다.

실시예 13. 피부 생리 활성 물질이 결합된 세포내 분자 전송 펩티드의 피부세포 투과능 확인

13-1. 세포내 분자 전송 펩티드- 아세틸헥사펩티드 형광유도체의 합성

N-말단의 아미노산까지 커플링 된 상기 실시예 4에서 합성된 서열 번호 16번 아미노산 서열을 갖는 M1067, 서열 번호 23번 아미노산 서열을 갖는 M2067 및 서열 번호 28번 아미노산 서열을 갖는 M2173A의 세포내 분자 전송 펩티드에 화장품업계에서 상업적으로 사용되고 있는 아세틸헥사펩티드 (acetyl-Glu Glu Met Gln Arg Arg)를 순차적으로 합성을 진행한 후에 마지막으로 라이신(K, lysine)을 추가하여 펩티드합성을 진행한 다음 라이신의 프리 아민 잔기에 FITC를 결합시켰다. 합성된 펩티드-FITC는 20% 피페리딘/N-메틸피롤리돈(Piperidine/N-methylpyrrolidone) 용액을 가하여 Fmoc기를 제거하고 N-메틸피롤리돈과 디클로로메탄(dichloromethane)으로 여러 번 세척한 다음 질소 가스로 건조시켰다. 여기에 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid) : 페놀(phenol) : 치오아니솔(thioanisole) : 물(water) : 트리이소프로필실란(triisopropylsilane)을 90 : 2.5 : 2.5 : 2.5 : 2.5 (v/v) 비율로 혼합한 용액으로 2 내지 3시간 반응시켜 펩티드 보호기를 제거하고, 레진으로부터 펩티드를 분리시킨 다음, 디에틸에테르로 펩티드를 침전시켰다. 이렇게 얻은 세포내 분자 전송 펩티드-아세틸헥사펩티드 형광 유도체는 0.1% 트리플루오로아세트산이 포함된 아세토나이트릴를 구배로 하여 정제 역상 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼(purified reverse phase high performance liquid chromatography column, Zobax, C8 300Å, 21.1mm X 25cm)을 이용하여 정제함으로써 하기 식 4에서와 같이 서열번호 16번 또는 48번의 아미노산 서열을 갖는 세포내 분자 전송 펩티드에 아세틸헥사펩티드와 FITC가 결합된 세포내 분자 전송 펩티드-아세틸헥사펩티드 형광 유도체를 합성하였다. 이후, 합성된 펩티드-FITC는 차광 상태에서 1 mM 농도가 되도록 DMSO로 녹인 후, 1.5ml 원심분리용 용기에 소량으로 분주하고 사용직전까지 냉동보관 하였다.

[식 4]

Met Arg Ala Ala Ala Pro Ala Val Ala Ala Glu* Glu Met Gln Arg Arg

Met His Ala Ala Ala Pro Ala Val Ala Ala Glu* Glu Met Gln Arg Arg

Met His Pro Ala Val Ile Pro Ile Leu Ala Val Glu* Glu Met Gln Arg Arg

* : acetylated glutamic acid

13-2. 유세포 측정을 이용한 세포내 분자 전송 펩티드- 아세틸헥사펩티드의 in vitro 세포 투과능 확인

세포투과능을 검증하기 위해 3 μM 농도의 세포내 분자 전송 펩티드-아세틸헥사펩티드 형광체(MTD-AH-FTIC)를 피부각질형성세포 (Human Keratinocyte cell line, HaCaT cell, Order No. 300493, CLS cell line service, Germany)에 처리하고, 1시간 동안 배양하였다. 상기 HaCaT 세포를 10% 우태아 혈청(Fetal bovine serum: FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(10,000 units penicillin 및 10,000 μg/mL streptomycin, invitrogen)을 함유하는 DMED (Dubelcco’s modified eagle medium) 배지에서 유지하고, 5% CO₂의 습윤(humidified) 대기 하에서 37℃로 배양하였다. 배양이 종결된 후, 단백질이 처리된 HaCaT 세포의 세포막에 노출되어 있는 유리 MTD-AH-FITC를 제거하기 위해 트립신을 처리하고, 냉장 보관한 PBS로 3번 세척하였다.

준비된 MTD-AH-FITC 펩티드는 유세포 분석기 (FACS Calibur , Beckton-Dickinson, San Diego CA, USA)에 적용하였고, 각각의 시료에 대하여, 세포(1X10⁴)를 셀퀘스트 프로 세포측정 분석(CellQues Pro cytometric analysis) 소프트웨어로 분석하였으며 각각의 실험을 3회 이상 수행하였다. 본 발명에 적용되는 세포내 분자 전송 펩티드 각각의 세포투과성은 피부 생리활성 물질인 아세틸헥사펩티드 자체를 대조군으로 사용하여 세포투과성 효율을 정량적으로 비교분석 하였다.

그 결과를 도 15와 같이 셀퀘스트 프로 세포측정 분석(CellQues Pro cytometric analysis) 소프트웨어에서 각 실험군의 형광 변화를 기하 평균(Geometric mean)으로 비교하여 세포내 분자 전송 펩티드의 세포 유입 효율을 나타내었다. 그 결과, 세포내 분자 전송 펩티드가 결합된 아세틸헥사펩티드의 세포 유입 효율이 아세틸펙사펩티드 자체의 효율에 비하여, 200%에서 최대 400%까지 높은 세포 유입 효율을 나타냄을 확인하였다.

13-3. 공초점현미경을 이용한 세포내 분자 전송 펩티드- 아세틸헥사펩티드의 가시적 피부 세포 투과능 확인

내재화된(internalized) 세포내 분자 전송 펩티드-아세틸헥사펩티드 형광 유도체의 직접적인 검출을 위하여 피부유래 각질형성세포 (HaCaT cell, immortalized human keratinocyte, Cat No. 300493, CLS, Germany)에 3 μM 농도로 처리하고 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 공초점현미경 (confocal microscopy, Nikon, Germany)을 이용하여 가시적으로 관찰하였다. 실험 전일 HaCaT 세포를 글래스 커버슬립이 들어있는 12-웰 플레이트(12-well culture plate) 내에서 24시간 동안 배양하였다. HaCaT 세포는 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum: FBS), 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(10,000 units penicillin 및 10,000 μg/mL streptomycin, Invitrogen, USA)을 함유하는 DMEM 배지에서 유지하고, 5% CO²의 습윤(humidified) 대기 하에서 37℃로 배양하였다. HaCaT 세포에 5 μM의 농도로 scrambled 펩티드, MTD-FITC 및 PTD-FITC 펩티드를 1시간 동안 처리하였다. 이후, 관찰을 위하여 세포를 실온에서 4% 파라포름알데하이드 용액 (paraformaldehyde, PFA)로 20 분간 고정하고, PBS로 3회 세척 후 핵 형광 염색 용액인 5 mM 농도의 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)로 대조염색(counterstain)을 수행하였다. 10분 간의 DAPI 염색 후, 다시 PBS로 3회 세척하고, 단백질의 형광표지를 보존하기 위해 20 ㎕의 중첩배지(mounting media)를 슬라이드 위에 점적하고 관찰하였다. 상기 세포내 분자 전송 펩티드 유도체가 처리된 세포는 세포 내 전달부위의 구별이 용이하도록 DAPI 염색을 통해 핵으로의 전달 및 투과성 여부를 확인하였으며, 공초점 현미경은 노마스키 필터(normaski filter)를 이용하여 세포의 원형을 관찰하고, FITC 형광 및 DAPI 형광을 각각의 플루오로크롬(fluorochrome)에 맞는 필터로 관찰하였다. 그 결과, 도 16에 나타난 바와 같이, 피부 생리활성 물질인 아세틸헥사펩티드 자체를 사용한 대조군과 대비하여, 세포내 분자 전송 펩티드가 결합된 아세틸헥사펩티드가 전송펩티드에 의하여, 전송능력이 현저하게 향상되었음을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

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Claims (21)

1. 세포내 분자 전송 펩티드가 결합된 피부 생리 활성 분자를 포함하는 경피 전달용 조성물로서, 상기 펩티드가 서열번호 16 또는 23의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 화장용 조성물인 것을 특징으로 하는 경피 전달용 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 37 또는 44의 폴리뉴클레오티드 서열로부터 인코딩되는 것을 특징으로 하는 경피 전달용 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 각질층을 투과하는 것을 특징으로 하는 경피 전달용 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 상기 피부 생리 활성 분자는 상기 세포내 분자 전송 펩티드의 N-말단, C-말단 또는 양말단에 결합하는 것을 특징으로 하는 경피 전달용 조성물.
6. 제 1항에 있어서, 상기 피부 생리 활성 분자에 상기 세포내 분자 전송 펩티드의 아미노산이 역순으로 배열된 형태로 결합하는 것을 특징으로 하는 경피 전달용 조성물.
7. 제 1항에 있어서, 상기 결합은 펩티드 결합 또는 화학적 결합에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 경피 전달용 조성물.
8. 제 7항에 있어서, 상기 화학적 결합은 이황화 결합, 디아민 결합, 황화-아민 결합(sulfde-amine bonds), 카르복시-아민 결합(carboxyl-amine bonds), 에스테르 결합(ester bonds) 및 공유 결합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 경피 전달용 조성물.
9. 제 1항에 있어서, 상기 피부 생리 활성 분자는 비타민, 레티노이드 및 지방산으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 경피 전달용 조성물.
10. 제 9항에 있어서, 상기 비타민은 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5, 비타민 B6, 비타민 B7, 비타민 B9, 비타민 B12, 비타민 C, 비타민 D1, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 D4, 비타민 D5, 비타민 E 및 비타민 K로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 경피 전달용 조성물.
11. 제 9항에 있어서, 상기 레티노이드는 레티놀, 레티놀의 천연 및 합성 아날로그, 레티날, 트랜스, 9-시스, 및 13-시스 레티놀산 및 에트레티네이트로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 경피 전달용 조성물.
12. 제 9항에 있어서, 상기 지방산은 라우린산, 스테아린산, 팔미틱산, 운데실렌산, 팔리톨레산, 올레산, 리놀산, 리놀렌산, 아라키돈산 및 에루신산으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 경피 전달용 조성물.
13. 제 1항에 있어서, 상기 피부 생리 활성 분자는 주름 개선제, 미백제, 항산화제 및 보습제로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 경피 전달용 조성물.
14. 제 13항에 있어서, 상기 주름 개선제는 피부 작용 성장인자 펩타이드 또는 단백질, 레티놀, 레티닐팔미테이트, 아데노신 및 폴리에톡실레이티드레틴아미드로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 경피 전달용 조성물.
15. 제 13항에 있어서, 상기 미백제는 미백 펩타이드, 니아신아마이드, 닥나무 추출물, 알부틴, 에칠아스코밀에텔, 감초 추출물, 아스코빌글루코사이드, 및 마그네슘 아스코빌포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 경피 전달용 조성물.
16. 제 1항에 있어서, 상기 피부 생리 활성 분자는 쿠마릭산(coumaric acid), 아세틸펜타펩티드(Acetyl pentapeptide) 및 아세틸헥사펩티드(Acetyl Hexapeptide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 경피 전달용 조성물.
17. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 에멀젼, 크림, 에센스, 스킨, 리포솜, 마이크로캡슐, 복합 입자, 샴푸 및 린스로 이루어진 군으로부터 선택된 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 경피 전달용 조성물.
18. 피부 생리 활성 분자를 피부 세포 내로 전달하는 경피 전달시스템으로서, 상기 시스템은 서열번호 16 또는 23의 아미노산 서열로 이루어진 세포내 분자 전송 펩티드를 피부 생리 활성 분자와 결합시켜 전달하는 것을 특징으로 하는, 시스템.
19. 제 18항에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 37 또는 44의 폴리뉴클레오티드로부터 인코딩되는 것을 특징으로 하는 경피 전달시스템.
20. 시험관 내(In vitro)에서, 피부 생리 활성 분자를 피부 세포 내로 전달하는 방법으로서, 상기 방법은 서열번호 16 또는 23의 아미노산 서열로 이루어진 세포내 분자 전송 펩티드를 피부 생리 활성 분자와 결합시켜 전달하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
21. 시험관 내(In vitro)에서, 피부 생리 활성 분자를 피부 각질층 내로 전달하는 방법으로서, 상기 방법은 서열번호 16 또는 23의 아미노산 서열로 이루어진 세포내 분자 전송 펩티드를 피부 생리 활성 분자와 결합시켜 전달하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.

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