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ES2758451T3 - Péptido de penetración celular, conjugado que comprende el mismo y composición que comprende el conjugado - Google Patents

Péptido de penetración celular, conjugado que comprende el mismo y composición que comprende el conjugado Download PDF

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ES2758451T3
ES2758451T3 ES13838276T ES13838276T ES2758451T3 ES 2758451 T3 ES2758451 T3 ES 2758451T3 ES 13838276 T ES13838276 T ES 13838276T ES 13838276 T ES13838276 T ES 13838276T ES 2758451 T3 ES2758451 T3 ES 2758451T3
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Sang Jae Kim
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GemVax and Kael Co Ltd
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Abstract

Un conjugado de un péptido vehículo de penetración celular y un principio activo, en el que el péptido vehículo es un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 178, o un fragmento de cualquiera de las mismas, en el que el fragmento retiene la capacidad de penetración celular de una cualquiera de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 178.

Description

DESCRIPCIÓN
Péptido de penetración celular, conjugado que comprende el mismo y composición que comprende el conjugado
Campo de la invención
La presente invención se refiere a péptidos de penetración celular derivados de la enzima telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT), a conjugados de los péptidos de penetración celular, a principios activos y a composiciones que comprenden el conjugado.
Antecedentes
Aunque las sustancias de bajo peso molecular, ácidos nucleicos, proteínas, nanopartículas, etc., tienen grandes potenciales como sustancias terapéuticas a nivel molecular, sus usos son limitados debido a la incompetencia para penetrar en los tejidos y la membrana celular. El desarrollo de un sistema para suministrar tales sustancias a la célula ha sido el área activa de investigación en las últimas dos décadas. El transporte de las sustancias dentro de la célula ha sido un tema de conversación en un tratamiento de procedimiento molecular. Las sustancias de bajo peso molecular, los ácidos nucleicos o las nanopartículas se transportaron dentro de la célula por varios reactivos, electroporación o choque térmico. Sin embargo, fue difícil encontrar un procedimiento adecuado de suministro de proteínas dentro de la célula sin interrumpir la actividad y la integridad de las proteínas. En la década de 1980, en la investigación realizada sobre el estudio de la capacidad de penetración celular del VIH, se descubrió que la proteína VIH-TAT que consiste en 11 aminoácidos específicos juega un papel importante en un proceso de transporte dentro de la célula. Por lo tanto, en la década de 1990, los estudios sobre cómo encontrar el procedimiento correcto para transportar proteínas dentro de la célula han sido el área intensa de investigación. Por ejemplo, el documento WO 2008/093982 A1 describe péptidos de dominio de transducción de macromoléculas que transportan moléculas biológicamente activas al interior de una célula.
Se sabe que un telómero es una secuencia repetitiva de material genético encontrado en los extremos de cromosomas que evita que los cromosomas se dañen o se unan a otros cromosomas. La longitud del telómero se acorta en cada división celular y, después de un determinado número de divisiones celulares, la longitud del telómero se acorta extremadamente en la medida que la célula deja de dividirse y muere. Por otro lado, se sabe que el alargamiento de los telómeros amplía el lapso de vida de una célula. Por ejemplo, las células cancerosas excretan una enzima denominada telomerasa, que evita el acortamiento de los telómeros, dando como resultado de esta manera la proliferación de células cancerosas.
Se desvela en el presente documento un péptido novedoso.
Se desvela además en el presente documento el polinucleótido que codifica el péptido novedoso.
Se desvela además en el presente documento un péptido de penetración celular.
El objeto de la presente invención es proporcionar un péptido útil como un vehículo del principio activo en una célula.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un péptido útil como un vehículo del principio activo en una célula, especialmente administrar a la mitocondria localmente.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un péptido útil para la administración del principio activo a la mitocondria para la mejora, la profilaxis o el tratamiento de enfermedad o trastorno relacionado con la mitocondria.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un conjugado que se conjugan un principio activo y un péptido de penetración celular.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición que comprende un conjugado de un principio activo y un péptido de penetración celular.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica que comprende un conjugado de un principio activo y un péptido de penetración celular.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición cosmética funcional que comprende un conjugado de un principio activo y un péptido de penetración celular.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición de alimentación saludable que comprende un conjugado de un principio activo y un péptido de penetración celular.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un agente de contraste que comprende un conjugado de un principio activo y un péptido de penetración celular.
Sumario de la invención
En un aspecto, la presente invención se refiere a un conjugado de un péptido vehículo de penetración celular y un principio activo, en el que el péptido vehículo es un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 a s Eq ID NO: 178, o un fragmento de cualquiera de las mismas, en el que el fragmento retiene la capacidad de penetración celular de cualquier secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 178.
En una realización, el péptido vehículo consiste en a) al menos 3 aminoácidos; b) 30 o menos aminoácidos; o c) una secuencia de aminoácidos cualquiera de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 178.
En una realización, el principio activo es a) al menos uno seleccionado de una proteína, un ácido nucleico, un péptido, un lípido, un lípido de glicol, un mineral, un azúcar, una nanopartícula, un producto biológico, un agente de contraste, un fármaco y un compuesto químico; o b) una proteína o un péptido, opcionalmente una citocina, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una enzima terapéutica, un receptor soluble o un ligando.
En una realización, el péptido vehículo y el principio activo están conjugados a través de a) un enlace covalente, opcionalmente mediado por un enlazador; o b) un enlace no covalente.
En una realización, el principio activo es un agente de contraste.
En una realización, el agente de contraste se selecciona del grupo que consiste en un agente de contraste radioopaco, un agente de contraste paramagnético, un agente de contraste superparamagnético y un agente de contraste CT.
En una realización, el agente de contraste se basa en hierro, opcionalmente un carboxilato de ferroceno.
En un aspecto, la invención se refiere a un uso del conjugado, en el que el principio activo es un agente de contraste, para contrastar una célula, opcionalmente una célula madre.
En un aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende el conjugado, en el que la composición es una composición farmacéutica, una composición cosmética o una composición de alimentos saludables.
En un aspecto, la invención se refiere a la composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad.
En un aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para administrar un principio activo en una célula, que comprende administrar el conjugado o la composición a una célula in vitro.
En una realización, el procedimiento es para administrar el principio activo localmente en una mitocondria dentro de una célula.
En un aspecto, la invención se refiere al uso de un péptido de penetración de las células, en el que el péptido consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 178.
Aplicabilidad industrial
Los principios activos que son difíciles de transportar dentro de una célula pueden transportarse fácilmente dentro de una célula usando el péptido o el conjugado del péptido y los principios activos, desvelados en la presente invención. Esto significa que la efectividad de los principios activos puede aumentarse y por lo tanto la dosificación puede reducirse. Como resultado, los efectos secundarios debidos a la administración de fármacos pueden minimizarse y puede aumentarse la eficacia del tratamiento. Especialmente, como se administran los fármacos localmente en las mitocondrias, pueden mejorarse las enfermedades o los trastornos relacionados con las mitocondrias y puede aumentarse la eficacia de la profilaxis y el tratamiento de enfermedades. En un caso de cosméticos, con una pequeña cantidad de principios activos, puede crear un efecto excepcional. Al conjugar un péptido con una sustancia de contraste, puede usarse como sustancia de contraste para monitorizar un procedimiento de trasplante celular o células trasplantadas en un tratamiento celular. Especialmente, puede usarse eficazmente como sustancia de contraste para las células madre inyectadas dentro de un cuerpo.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 representa e ilustra que la captación celular de los números de células de una célula HeLa tratada después de que FITC se fusionó con el péptido pep1 de SEQ: 1 y se analizó por FACS. Las células de control se trataron solo con FITC.
La Figura 2 a la Figura 29 representan e ilustran que la captación celular de los números de células de una línea celular HeLa tratada después de que FITC se fusionó con el péptido de SEQ: 2 a SEQ: 178 y se analizó por FACS. Las células de control se trataron solo con FITC.
La Figura 30 a la Figura 51 representan e ilustran que la captación celular de los números de células de una célula Hur7 tratada después de que FITC se fusionó con el péptido de SEQ: 2 a SEQ: 178 y se analizó por FACS. Las células de control se trataron solo con FITC.
La Figura 52 a la Figura 69 representan e ilustran que la captación celular de los números de células de una línea celular humana de linfocitos T (Jurkat) tratada después de que FITC se fusionó con el péptido de SEQ: 2 a SEQ: 178 y se analizó FACS. Las células de control se trataron solo con FITC.
La Figura 70 representa e ilustra que el resultado de la toxicidad y la viabilidad celular de una célula HeLa tratada después de que FITC se fusionó con el péptido pep1 de SEQ: 1 y se analizó por citometría de flujo (Citometría de flujo). Las células de control se trataron solo con FITC.
La Figura 71 a la Figura 86 representan e ilustran que el resultado de la toxicidad y la viabilidad celular de una célula HeLa tratada después de que FITC se fusionó con el péptido de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 178 y se analizó por citometría de flujo (Citometría de flujo). Las células de control se trataron solo con FITC.
Descripción detallada de la invención
Las proteínas, los ácidos nucleicos, los péptidos o los virus, etc. tienen un gran potencial para usarse como sustancias terapéuticas. Sin embargo, sus usos son limitados porque no pueden penetrar en los tejidos y la membrana celular debido a los tamaños del nivel molecular. Aunque, el tamaño de las moléculas es pequeño, no pueden penetrar la bicapa lipídica debido a la estructura o características de las moléculas. Por lo tanto, mediante el uso de electroporación, choque térmico, etc., hubo intentos de transportar proteínas, ácidos nucleicos, péptidos o virus dentro de la célula; fue difícil transferirlos sin dañar la membrana celular ni mantener los estados activos de las moléculas anteriores. Se han realizado muchos estudios ya que la proteína TAT (el activador Trans-Activador de la Transcripción) derivada del VIH (virus de inmunodeficiencia humana) ha demostrado funcionar como péptido penetrador celular que puede transportar enormes sustancias activas dentro de la célula. Específicamente, se han realizado estudios sobre sustancias que pueden transportar moléculas enormes tales como proteínas, ácidos nucleicos, péptidos o virus dentro de la célula sin provocar ninguna toxicidad, a diferencia de la proteína TAT que provoca toxicidad dentro de la célula. Por lo tanto, la presente invención se completó ya que los presentes inventores han descubierto que los péptidos derivados de la telomerasa tienen una efectividad sobresaliente como péptido de penetración celular sin una toxicidad notable.
Los péptidos se desvelan en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 178 mostrados en la Tabla 1 a la Tabla 5 a continuación. La SEQ ID NO: 179 es una secuencia de longitud completa de la proteína de la telomerasa humana. El péptido de SEQ ID NO: 1 deriva de la telomerasa, en el que el péptido comprende 16 aminoácidos. Los péptidos de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 77, en los que el péptido comprende SEQ ID NO: 1. Los péptidos de SEQ ID NO: 78 a SEQ ID NO: 178 son un fragmento de SEQ ID NO: 1. El "nombre" en la Tabla 1 a continuación se usó para la distinción de los péptidos. En una realización específica diferente de la presente invención, más de un péptido de los péptidos mencionados en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 6 puede comprender un "péptido sintético", un péptido sintetizado de áreas seleccionadas de la telomerasa. En la presente memoria descriptiva, el término "pep" en el presente documento se refiere a un péptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 o una cualquiera de las secuencias de aminoácidos entre la SEQ ID NO: 2 a la SEQ ID NO: 178 o, un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos por encima del 80 % de homología con las secuencias anteriormente mencionadas o un fragmento peptídico de los péptidos anteriormente mencionados.
[TABLA 1]
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(continuación)
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[TABLA 2]
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(continuación)
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[TABLA 3]
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(continuación)
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[TABLA 4]
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(continuación)
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[TABLA 5]
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(continuación)
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En una realización de la presente invención el polinucleótido codifica un péptido que consiste en una cualquiera de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 178. El polinucleótido anteriormente mencionado permite la producción de los péptidos en grandes cantidades. Por ejemplo, el cultivo de vectores que incluyen péptidos que codifican polinucleótidos permite la producción de péptidos en grandes cantidades.
Los péptidos desvelados en el presente documento pueden incluir un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos por encima del 80 %, por encima del 85 %, por encima del 90 %, por encima del 95 %, por encima del 96 %, por encima del 97 %, por encima del 98 % o por encima del 99 % de homología. Además, los péptidos desvelados pueden incluir un péptido que comprende una cualquiera de la secuencia de aminoácidos entre la SEQ ID NO: 2 a la SEQ ID NO: 178 o sus fragmentos y un péptido con más de 1 aminoácido transformado, más de 2 aminoácidos transformados, más de 3 aminoácidos transformados, más de 4 aminoácidos transformados, más de 5 aminoácidos transformados, más de 6 aminoácidos transformados o más de 7 aminoácidos transformados.
Los cambios en la secuencia de aminoácidos pertenecen a la modificación de las características físicas y químicas del péptido. Por ejemplo, la transformación de aminoácidos puede realizarse mejorando la estabilidad térmica del péptido, alterando la especificidad del sustrato y cambiando el pH óptimo.
El término "aminoácido" en el presente documento incluye no solamente los 22 aminoácidos convencionales que se integran de forma natural en el péptido sino también los isómeros D y los aminoácidos transformados. Por lo tanto, en una realización específica, un péptido en el presente documento incluye un péptido que tiene D-aminoácidos. Por otro lado, un péptido puede incluir aminoácidos no convencionales tales como los que se han modificado posttraduccionalmente. Los ejemplos de modificación post-traduccional incluyen fosforilación, glucosilación, acilación (incluyendo acetilación, miristoilación, palmitoilación), alquilación, carboxilación, hidroxilación, glicación, biotinilación, ubicuitinilación, transformación en propiedades químicas (por ejemplo, desimidación por retirada de p, desamidación) y transformación estructural (por ejemplo formación de puentes disulfuros). Además, se incluyen cambios de aminoácidos y los cambios de aminoácidos se producen debido a una reacción química durante el procedimiento de combinación con reticuladores para la formación de un conjugado peptídico.
Un péptido desvelado en el presente documento puede ser un péptido de tipo silvestre que se ha identificado y aislado de fuentes naturales. Por otro lado, cuando se compara con los fragmentos peptídicos de una cualquiera de entre la secuencia amino SEQ ID NO: 2 a la SEQ ID NO: 178, los péptidos desvelados en el presente documento pueden ser mutantes artificiales que comprenden uno o más aminoácidos sustituidos, eliminados y/o insertados. La alteración de aminoácidos en el polipéptido de tipo silvestre - no solo en mutantes artificiales - comprende la sustitución conservativa de aminoácidos que no influyen en el plegamiento y o la activación de proteínas. Los ejemplos de sustitución conservativa pertenecen al grupo que consiste en aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparaginas), aminoácidos hidrófobos (leucina, isoleucina, valina y metionina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina y treonina). Las sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran la actividad específica se conocen en la técnica de la presente invención. Las alteraciones más comunes producidas son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly y las alteraciones opuestas. Otro ejemplo de sustituciones conservativas se muestra en la siguiente Tabla 6.
[TABLA 6]
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La transformación sustancial de las propiedades biológicas de los péptidos se realiza seleccionando una sustitución significativamente diferente en las siguientes efectividades: (a) la efectividad en el mantenimiento de la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de sustitución, tales como láminas o estructuras helicoidales tridimensionales, (b) la efectividad en el mantenimiento de la carga eléctrica o la hidrofobicidad de la molécula en el área diana o (c) la efectividad en el mantenimiento de la mayor parte de la cadena lateral. Los restos naturales se dividen en grupos por las propiedades generales de la cadena lateral como las siguientes:
(1) hidrofobicidad: Norleucina, met, ala, val, leu, ile;
(2) hidrofilidad neutra: cys, ser, thr;
(3) acidez: asp, glu;
(4) basicidad: asn, gln, his, lys arg;
(5) resto que afecta la orientación de la cadena: gly, pro; y
(6) aromaticidad: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservativas pueden realizarse intercambiando un miembro de las clases anteriores por diferentes clases. Cualquier resto de cisteína que no esté relacionado con el mantenimiento de la estructura tridimensional adecuada del péptido puede sustituirse típicamente por serina, aumentando de esta manera la estabilidad oxidativa de la molécula y evitando la reticulación inapropiada. Por el contrario, puede lograrse una mejora de la estabilidad añadiendo enlace o enlaces cisteína al péptido.
Los tipos alterados de variantes de aminoácidos de los péptidos son aquellos que cambiaron el patrón de glucosilación de anticuerpos. El término "cambio" en el presente documento se refiere a la eliminación de al menos un resto de carbohidrato que se encuentra en un péptido y/o la adición de al menos un resto glucosilado que no existe dentro de un péptido.
La glucosilación en péptidos está típicamente conectada a N o conectada a O. La expresión "conectado a N" en el presente documento se refiere a que los restos de carbohidratos están unidos a la cadena lateral de los restos de asparagina. Como secuencias de tripéptidos, asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina (en las que la X es cualquier aminoácido excepto prolina) son la secuencia de reconocimiento para unir enzimáticamente el resto de carbohidrato a la cadena lateral de la asparagina. Por lo tanto, con la presencia de una de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido, se crean los posibles sitios de glucosilación. "Glucosilación conectada a O" significa unir uno de azúcar N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a aminoácidos de hidroxilo. Los aminoácidos de hidroxilo son más típicamente serina o treonina, pero pueden usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
La adición del sitio de glucosilación a un péptido se realiza convenientemente cambiando la secuencia de aminoácidos para que contenga la secuencia de tripéptidos mencionada anteriormente (para sitios de glucosilación enlazada a N). Estos cambios pueden realizarse mediante la adición de al menos un resto de serina o treonina a la primera secuencia de anticuerpos o mediante sustitución con esos restos (para sitios de glucosilación enlazados a O). En una realización de la presente invención, se proporciona un péptido de penetración celular que consiste en una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 a Se Q ID NO: 178.
Un péptido que consiste en una cualquiera de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 178 o un fragmento del péptido mencionado anteriormente es seguro y tiene una efectividad sobresaliente como péptido de penetración celular. Por lo tanto, el péptido puede conjugarse con un fármaco para transportar el fármaco dentro de la célula.
En una realización de la presente invención, se proporciona un conjugado de un péptido y un principio activo para transportarse, en el que el péptido consiste en una secuencia de aminoácidos cualquiera de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 178 o un fragmento del péptido mencionado anteriormente, en la que el fragmento retiene la capacidad de penetración celular de una cualquiera de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 178. En una realización de la presente invención, un principio activo puede ser al menos uno seleccionado de proteínas, ácidos nucleicos, péptidos, lípidos, glucolípidos, minerales, azúcares, sustancias de contraste, fármacos y compuestos químicos. En una realización de la presente invención, los principios activos pueden ser péptidos. En una realización de la presente invención, los principios activos pueden ser citocinas, un anticuerpo, fragmentos de anticuerpo, enzimas terapéuticas, receptores solubles o ligandos.
Un péptido de penetración celular desvelado en el presente documento significa un péptido que puede transportar carga desde in vitro y/o in vivo hacia el interior de la célula. Una "carga" desvelada en el presente documento comprende todas las sustancias que pueden transportarse dentro de la célula a través de conjugación con un péptido de penetración celular, por ejemplo, todas las sustancias que desean aumentar la efectividad de penetración celular, específicamente fármacos, cosméticos o principios activos de alimentos saludables, más específicamente sustancias que no pueden transportarse dentro de la célula por la vía general, más específicamente, azúcares, nanopartículas, formulación biológica, virus, sustancias de contraste u otros compuestos químicos que pueden tener proteínas, ácidos nucleicos, un péptido, minerales, glucosa como un ejemplo, pero no limitado a esos. Un "fármaco" desvelado en el presente documento es un concepto amplio que incluye una sustancia que se transportará para el alivio, la profilaxis, el tratamiento o el diagnóstico de enfermedades, heridas o un síntoma específico.
Un "péptido vehículo" desvelado en el presente documento es un péptido que puede transportar principios activos a un sitio diana a través de la conjugación con principios activos.
En una realización de la presente invención, la proteína o el péptido como carga comprenden uno o más de hormonas, análogo hormonal, enzima, inhibidores enzimáticos, proteínas (o péptidos) de transferencia de señal, anticuerpo y vacuna, pero no limitado a esos. En una realización de la presente invención, un ácido nucleico es una molécula que pueden ser moléculas de ADN o de ARN espontáneas o artificiales, ya sean monocatenarias o bicatenarias. La molécula de ácido nucleico puede ser una o más ácidos nucleicos del mismo tipo (por ejemplo, que tienen una misma secuencia de nucleótidos) o ácidos nucleicos de diferentes tipos. Las moléculas de ácido nucleico comprenden uno o más ADN, ADNc, ADN señuelo, ARN, ARNip, miARN ARNhp, ARNtp, ARNnop, ARNnp PNA, oligómero antisentido, plásmidos y otros ácidos nucleicos modificados, pero no limitado a esos. En una realización de la presente invención, el virus comprende el virus entero o el núcleo del virus que incluye los ácidos nucleicos del virus. En una realización de la presente invención, una sustancia química es una indicación amplia que comprende una sustancia natural o sintética que puede actuar como un fármaco.
Un fenómeno en el que la expresión de ADN específica está controlada por ARN bicatenario (ARNbc) en un procedimiento de expresión de ADN se denomina interferencia de ARN; iARN. Desde que el fenómeno se descubrió por primera vez en C. elegans en 1998, se descubrió que el fenómeno es común en las plantas, moscas de la fruta y mamíferos (Fire y col., Nature, 391:806-811, 1998; Novina y Sharp, Nature, 430:161-164, 2004).
La interferencia de ARN está mediada por ARNbc que tiene 19-25 pb que entra en las células, tras lo que se combina con RISC (complejo silenciador inducido por ARN). La unión de la cadena antisentido de ARNbc a la secuencia complementaria de ARNm desencadena la degradación del ARNm diana por la enzima endonucleasa encontrada en el complejo RISC (Rana, T. M., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 8:23-36, 2007; Tomari, Y. y Zamore, P. D., Genes Dev., 19: 517-529, 2005). En otras palabras, el ARNip está implicado en la interferencia de ARN al suprimir la producción de proteínas específicas y por lo tanto al interferir con la expresión de ADN. El ARNip que consiste en 19-23 nucleótidos, forma un par de bases de acuerdo con el orden complementario de ARNm para el ARN mensajero específico (ARNm) para formar ARN bicatenario. Después de eso, el a Rn bicatenario se desintegra especialmente al mismo tiempo que se retira el ARN mensajero de las células. El ARNip se ha destacado como una sustancia para la terapia génica porque mostró un efecto sobresaliente en la supresión de la expresión de ADN específico en estudios recientes en animales. El ARNip con activación más alta y selección precisa de ADN, se ha estudiado durante los últimos 20 años y se espera que reemplace los oligonucleótidos antisentido que actualmente se usan como remedio. Por lo tanto, muchas compañías farmacéuticas están desarrollando un remedio basado en ARNip. En comparación con los oligonucleótidos antisentido existentes, se sabe que el ARNip inhibe la expresión génica con una cantidad 10 veces menor e inhibe solamente genes diana con una selectividad sobresaliente de genes. La técnica de ARNip, especialmente para el fin del tratamiento, tiene una gran ventaja ya que puede diseñarse fácilmente en comparación con otros fármacos y tiene características tales como alta selectividad diana e inhibición de la expresión génica específica. Además, dado que la supresión de la expresión génica por interferencia de ARN utiliza el mecanismo presente de forma natural in vivo, la toxicidad es baja. Sin embargo, el ARNip tiene la desventaja de que no puede transportarse fácilmente a una célula ya que no puede penetrar en la membrana celular ya que es aniónico y se descompone fácilmente en un corto período de tiempo debido a la baja estabilidad in vivo. Esta desventaja del ARNip puede resolverse conjugando con un péptido vehículo descrito en el presente documento.
En una realización de la presente invención, la efectividad de los principios activos, la carga, son células cancerosas, células inmunológicas o células fibroblastos. Específicamente, entre las células cancerosas comprenden una célula cancerosa cualquiera seleccionada del grupo que consiste en: células cancerosas hepáticas, células cancerosas de mama y células de leucemia, entre las células inmunológicas comprenden una célula inmunológica cualquiera seleccionada del grupo que consiste en: linfocitos T, células B y monocitos.
En una realización de la presente invención, los principios activos anteriores han de localizarse en el citoplasma y el péptido vehículo transporta los principios activos anteriores al citoplasma localmente.
En una realización de la presente invención, los principios activos anteriores han de localizarse en la mitocondria y el péptido vehículo transporta los principios activos anteriores a la mitocondria localmente.
En una realización de la presente invención, los fármacos transportados dentro de la célula por el péptido de penetración celular pueden comprender uno o más transportadores de fármacos como liposoma, micelas, nanopartículas, partículas magnéticas o puntos cuánticos.
La expresión "sustancia de contraste" desvelada en el presente documento es una indicación amplia que comprende todas las sustancias usadas para contrastar estructuras o fluidos dentro del cuerpo en formaciones de imágenes médicas. Una sustancia de contraste apropiada comprende agente de contraste radioopaco, un agente de contraste paramagnético, un agente de contraste superparamagnético, CT (tomografía computarizada) y otras sustancias de contraste, pero no limitado a esos. Por ejemplo, un agente de contraste radioopaco (para formación de imágenes de rayos X) comprenderá un compuesto de yodo inorgánico y un compuesto de yodo orgánico (por ejemplo, diatrizoato), metales radiopacos y sus sales (por ejemplo, plata, oro, platino, etc.) y otros compuestos radioopacos (por ejemplo, sales de calcio, sales de bario tales como sulfato de bario, tántalo y tántalo oxidado). Una sustancia de contraste paramagnético apropiada (para formación de imágenes de RM) comprende ácido gadolinio dietilen triaminopentaacético (Gd-DTPA) y sus derivados, otro gadolinio, manganeso, hierro, disprosio, cobre, europio, erbio, cromo, complejo de níquel y cobalto, por ejemplo, ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-N,N',N",N'"-tetraacético (DOTA), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-N,-N',N"-triacético (DO3A), ACIDO 1,4,7-triazaciclononano-N,N',N"-TRIACÉTICO (NOTA), ácido 1,4,8,10-tetraazaciclotetradecano-N,N',N",N"'-tetraacético (TETA), ácido hidroxibenciletilendiamina diacético (HBED). Una sustancia de contraste superparamagnética apropiada (para formación de imágenes de RM) comprende magnetita, óxido de hierro súper paramagnético (SPIO), óxido de hierro superparamagnético ultrapequeño (USPIO) y óxido de hierro monocristalino. Otras sustancias de contraste apropiadas son agentes de contraste CT yodados, no yodados, iónicos y no iónicos, una sustancia de contraste como etiqueta rotativa o agente eficaz para el diagnóstico.
Otros ejemplos de sustancias de contraste comprenden p-galactosidasa, Proteína Verde Fluorescente, Proteína Cian Fluorescente, luciferasa, pero no limitado a esos, y un gen marcador que codifica proteínas que pueden detectarse fácilmente cuando se expresan dentro de las células. Pueden usarse varios marcadores tales como radionúclidos, harina, enzima, enzima-sustrato, cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, ligandos (especialmente hapteno).
En un ejemplo de la presente invención, una sustancia de contraste es el ácido ferrocenocarboxílico de la fórmula química 2 a continuación. La estructura del ferroceno se muestra en la fórmula química 1.
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En un ejemplo de la presente invención, un conjugado de péptido de penetración celular y una sustancia de contraste es Ferrocenocarboxílico-pep (Ferrocenocarboxílico-pep) que se muestra en la fórmula química 3 a continuación.
Figure imgf000013_0002
En una realización de la presente invención, un péptido o composición puede fusionarse con uno o más marcadores detectables. Los marcadores pueden ser compuestos que pueden detectarse en respuestas químicas, físicas o enzimáticas, o compuestos que generan señales directa o indirectamente en las respuestas. El marcaje y la detección después de eso pueden realizarse de acuerdo con el procedimiento conocido en la técnica (por ejemplo, Sambrook, J. y Russel, D.W.(2001); y Lottspeich, F. y Zorbas H. (1998) Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg/Berlín, Alemania). Los marcadores comprenden marcador fluorescente, marcador enzimático, marcador cromogénico, marcador luminiscente, marcador de radiación, hapteno, biotina, complejo de metal, oro metal y coloidal, pero no limitado a esos. Todas las formas de estos marcadores son bien conocidas en este campo de trabajo, pueden obtenerse comercialmente de diversos proveedores.
En una realización de la presente invención, una carga puede combinarse directamente a través de diversos tipos de enlaces tales como enlaces covalentes o no covalentes. Una carga, por ejemplo, puede combinarse con el N-terminal o C-terminal del péptido. Por ejemplo, una carga puede estar unida al péptido mediante enlaces disulfuro o enlaces covalentes. Los enlaces covalentes son los enlaces que una carga puede unirse a la a-amina del glutamato N-terminal, o la amina de los restos de lisina C-terminales. Además, un péptido y una carga pueden combinarse mediante un enlace no covalente, que puede tener un péptido o una carga puede encapsular al otro en forma de cápsula.
En otra realización de la presente invención, un péptido puede combinarse con una carga a través de un enlazador. Por ejemplo, un péptido puede combinarse con una carga uniendo una carga a un conector después de introducir un conector tales como el conector Hynic (ácido 6-hidrazinopiridin-3-carboxílico), a la a-amina del glutamato N-terminal, o la amina de los restos de lisina C-terminales.
En otra realización de la presente invención, cuando una carga es ADN o ARN, el grupo SH (grupo tiol) se introduce en el péptido y el grupo maleimida se introduce en el ADN o ARN, después, el grupo SH del péptido y el grupo maleimida de ADN o ARN se combinan, creando así un enlace entre la carga y el péptido.
En otra realización de la presente invención, cuando una carga es un péptido o proteína, el ADN que expresa una carga se combina con el ADN que expresa un péptido vehículo, y al expresar esto, una carga y un péptido pueden combinarse como una forma de proteína de fusión. Los ejemplos específicos de combinación por una proteína de fusión son los siguientes: cuando se fabrica el cebador para la producción de proteína de fusión, un nucleótido que codifica un péptido vehículo se une en frente de un nucleótido que expresa una carga y el nucleótido obtenido se inserta en un vector tales como el vector pET usando una enzima de restricción y el nucleótido se expresa mediante transformación en una célula tales como BL-21 (DE3). En este momento, una proteína de fusión debe expresarse eficazmente al tratarla con un agente inductor de la expresión como IPTG (isopropiM-tio-S-D-galactopiranósido). Después, la proteína de fusión expresada se purifica mediante purificación con etiqueta His y se dializa con PBS y se añade a un kit para concentrarla mediante centrifugación en tal condición durante 5 a 20 minutos a 2.000 a 4.000 rpm.
En una realización de la presente invención, un péptido vehículo se combina con sustancias de tinción, sustancias fluorescentes, específicamente FITC (isotiocianato de fluoresceína) o GFP (proteína fluorescente verde). En una realización de la presente invención, FITC se combina con el grupo amino (NH3+) de lisina en el N-terminal o C-terminal de un péptido vehículo. En el caso de un péptido, en el que la lisina no existe en su extremo, el péptido puede combinarse con FITC a través de un conector que incluye lisina.
El péptido vehículo desvelado en el presente documento que es el péptido que consiste en una cualquiera de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 178 o un fragmento del péptido mencionado anteriormente, en el que el fragmento retiene la capacidad de penetración celular de una secuencia de aminoácidos cualquiera de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 178, puede combinarse con una carga en una fracción molar de 1:1, pero puede combinarse en una fracción molar distinta de 1:1. Por ejemplo, una fracción molar de CPP y una carga puede ser más de 2:1, específicamente, más de 2:1, más de 3:1, más de 4:1, más de 5:1, más de 6:1, más de 7:1, más de 8:1, más de 9:1 o más de 10:1. Esto significa que numerosas moléculas de péptidos vehículo pueden combinarse con una molécula de carga. Las numerosas moléculas de péptidos vehículo pueden combinarse en serie o en paralelo. "Combinado en serie" significa que un péptido vehículo y una molécula de carga han de combinarse en los aminoácidos terminales. "Combinado en paralelo" significa que han de combinarse en un sitio distinto de los aminoácidos terminales. Por otro lado, la fracción molar de un péptido vehículo y una carga puede ser más de 1:2. Esto significa que una molécula de péptido vehículo puede combinarse con numerosos números de una molécula de carga. Por ejemplo, una fracción molar de un péptido vehículo y una carga puede ser 1:2, específicamente, más de 1:2, más de 1:3, más de 1:4, más de 1:5, más de 1:6, más de 1:7, más de 1:8, más de 1:9 o más de 1:10.
Puede encontrar fácilmente una vía de movimiento del péptido combinado con isotiocianato de fluoresceína. Por lo tanto, un péptido vehículo en una realización de la presente invención se usará para obtener imágenes celulares o detectar una ruta de suministro de fármacos dentro de una célula.
En una realización de la presente divulgación, se proporciona un uso del péptido como un vehículo de administración de fármacos para transportar más de un principio activo, en el que el péptido comprende una cualquiera de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 a s Eq ID NO: 178 o el péptido es un fragmento del péptido mencionado anteriormente, o el péptido tiene más del 80 % de homología de secuencia de aminoácidos con el péptido mencionado anteriormente. El uso puede indicar un uso terapéutico o no terapéutico.
En una realización de la presente divulgación, se proporciona un procedimiento para administrar fármacos dentro de una célula de un sujeto que comprende una etapa de administrar una composición que comprende un fármaco; y el péptido; en el que el péptido comprende una cualquiera de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 178 o el péptido es un fragmento del péptido mencionado anteriormente, o el péptido tiene más del 80 % de homología de secuencia de aminoácidos con el péptido mencionado anteriormente.
En una realización de la presente divulgación, se proporciona un procedimiento para detectar una ruta de administración de fármacos que comprende una etapa de aplicar el péptido y una sustancia de contraste a un sujeto, en el que el péptido comprende una cualquiera de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 178 o el péptido es un fragmento del péptido mencionado anteriormente, o el péptido tiene más del 80 % de homología de secuencia de aminoácidos con el péptido mencionado anteriormente.
En una realización, la presente invención permite el conjugado de la invención para su uso en un procedimiento para detectar la ruta de administración del fármaco que comprende una etapa de aplicar el péptido y una sustancia de contraste a un sujeto.
En una realización, la presente invención permite, un kit para la administración de fármacos a una célula de un sujeto que contiene la composición e instrucciones, en el que la composición comprende un conjugado de un péptido y un fármaco para administración, en el que el péptido comprende una cualquiera de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 178 o el péptido es un fragmento del péptido mencionado anteriormente, en el que el fragmento retiene la capacidad de penetración celular de una cualquiera de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 178 y en el que las instrucciones incluyen al menos una dosis de administración, la ruta de administración, la frecuencia de administración y la indicación de la composición.
En una realización de la presente a la invención, la composición cosmética o alimenticia que comprende un conjugado de acuerdo con la invención. En otra realización de la presente invención, se proporciona una composición cosmética o alimenticia que comprende un conjugado de la invención.
En una realización de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica, cosmética o alimentaria con una capacidad sobresaliente para transportar principios activos dentro de una célula, que comprende un conjugado de la invención.
La mitocondria, como un orgánulo central en el metabolismo energético de una célula eucariota, es un primer orgánulo intracelular que se sabe que está relacionado con enfermedades humanas (Luft R, Ikkos D, Palmieri G, Ernster L, Afzelius B: A case of severe hypermetabolism of non thyroid origin with a defect in the maintenance of mitochondrial respiratory control: a correlated clinical, biochemical, and morphological study, J Clin Invest 41: 1776-804, 1962).
Dado que las mitocondrias juegan un papel importante en el control del metabolismo energético de las células y la apoptosis, actúan como una diana principal para diversos fármacos terapéuticos. Además, este orgánulo está implicado en el control de la concentración de calcio dentro de la célula, la cadena respiratoria mitocondrial actúa como un sistema de transporte de electrones que es importante en la producción de energía y provoca la producción de especies reactivas de oxígeno. Como resultado, la función mitocondrial anormal tiene una estrecha relación con enfermedades de adultos tales como la diabetes, cardiomiopatía, infertilidad, ceguera, enfermedades renales/hepáticas y accidente cerebrovascular (Modica-Napolitano KS, Singh KK: April mitochondria as targets for detection and treatment of cancer. Expert Rev Mol Med 11:1-19, 2002). Además, se está sugiriendo que las mutaciones genéticas mitocondriales estén implicadas en el estallido del envejecimiento, enfermedad neuronal degenerativa y cáncer, etc.
El sistema de administración dirigido a las mitocondrias puede proporcionarse de acuerdo con la realización de la presente invención que puede comprender uno cualquiera de los conjugados mencionados anteriormente, en el que el péptido vehículo se mueve localmente hacia las mitocondrias intracelulares y desempeña un papel de administración de los principios activos mencionados a las mitocondrias intracelulares locales, en donde el fragmento de la misma son los péptidos que mantienen el sistema de suministro dirigido a las mitocondrias, el péptido dirigido a mitocondrias mencionado anteriormente puede ser el péptido que consiste en una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 178.
Puede proporcionarse la composición de ajuste de la actividad mitocondrial, en la que la composición comprende un conjugado de un péptido de la invención y un péptido transportado para el suministro, en el que el péptido vehículo se mueve localmente hacia las mitocondrias intracelulares y desempeña un papel de administración de los principios activos mencionados a las mitocondrias intracelulares locales, en donde el fragmento de la misma son los péptidos que mantienen el sistema de suministro dirigido a las mitocondrias, el péptido dirigido a mitocondrias mencionado anteriormente puede ser la composición que tiene cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 178.
La composición de ajuste de la actividad mitocondrial de acuerdo con una realización de la presente invención, en la que la composición para el tratamiento de enfermedades o trastornos relacionados con las mitocondrias, la prevención, la inhibición del progreso o el alivio de los síntomas como una composición farmacéutica, en la que el principio activo se tratará para una enfermedad o trastorno relacionado con las mitocondrias, la prevención, la inhibición del progreso o el alivio de los síntomas.
Las "enfermedades relacionadas con las mitocondrias" desveladas en el presente documento comprenden enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, MELAS (Encefalomiopatía mitocondrial con acidemia láctica y episodios similares a accidentes cerebrovasculares); MERRF (mioclono, epilepsia y miopatía con fibras rojas irregulares; NARP/MILS (debilidad muscular neurogénica, ataxia, retinitis pigmentosa/síndrome de Leigh heredado de la madre); LHON (neuropatía óptica hereditaria de Lebers); KSS (Síndrome de Kearns-Sayre); PMPS (Síndrome de médula ósea-páncreas de Pearson); CPEO (oftalnoplegia externa progresiva crónica); Síndrome de Reye; Síndrome de Alper; Síndrome de deleción de ADNmt múltiple; síndrome de agotamiento de ADNmt; Deficiencia del complejo I; Deficiencia del complejo II (SDH); Deficiencia del complejo III; Deficiencia de citocromo c oxidasa (COX, complejo IV); Deficiencia de complejo V; Deficiencia de translocador de nucleótidos de adenina (ANT); Deficiencia de piruvato deshidrogenasa (p Dh ); Aciduria del ácido etilmalónico con acidemia de ácido láctico; Aciduria de ácido 3-metil glutacónico con acidemia de ácido láctico; epilepsia refractaria que representa una disminución durante la infección; Síndrome de Asperger que representa una disminución durante la infección; Autismo que representa una disminución durante la infección; trastorno por déficit de atención e hiperactividad (TDAH); Parálisis cerebral que representa una disminución durante la infección; Alexia que representa una disminución durante la infección; Trombocitopenia hereditaria materna; Leucemia; MNGIE (miopatía mitocondrial, neuropatía periférica y autonómica, disfunción gastrointestinal y epilepsia); Síndrome de MARIAHS (ataxia mitocondrial, infección recrudescente, afasia, hipouricemia/hipomielinización, convulsiones y aciduria de ácido dicarboxílico); Distonía ND6; Síndrome de vómitos cíclicos que representa una disminución durante la infección; Aciduria de ácido 3-hidroxiisobutírico que tiene acidemia de ácido láctico; Diabetes con acidemia de ácido láctico; Síndrome neural reactivo de uridina (URNS); Necrosis del estriado bilateral familiar (FBSN); Pérdida auditiva relacionada con aminoglucósidos; Miocardiopatía relajada; Linfoma de bazo; Síndrome de Wolframs; Síndrome de deleciones de ADN de mitocondrias múltiples; y Síndrome de acidosis tubular renal/diabetes/ataxia, pero no limitado a esos.
En otra realización de la presente invención, se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos mencionados anteriormente. Las moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, tienen secuencias de bases de GAA GCG CGC CCG GCG CTG ACC AGC CGC CTG CGC TTT ATT CCG AAA. Los ácidos nucleicos pueden introducirse en la célula hospedadora de acuerdo con un procedimiento conocido por los expertos en la materia. Por ejemplo, los procedimientos conocidos pueden ser el procedimiento de transformación por el procedimiento de fosfato de calcio, liposoma, electroporación, poniendo en contacto un virus y una célula o microinyección directamente en la célula, etc. La célula hospedadora es una célula eucariota superior, por ejemplo, células de mamífero, o células eucariotas inferiores, tales como una célula de levadura, o células procariotas, tales como una célula bacteriana. Las células hospedadoras procariotas apropiadas para la transformación pueden ser las especies que pertenecen a E. coli, Bacillus subtillis, Salmonella typhimurium, Pseudomonas, Streptomyces y especies de microbacterias, como ejemplos.
El vector que incluye las moléculas de ácido nucleico mencionadas anteriormente es generalmente un vector de expresión recombinante y comprende, el origen de replicación que permite una transformación de la célula hospedadora y un marcador seleccionable (por ejemplo, dihidrofolato reductasa para el cultivo de células eucariotas o tolerancia a neomicina, tolerancia a tetraciclina o a ampicilina en E. coli o el gen TRP1 de S.cerevisiae) y el promotor para controlar la transcripción de secuencias de recubrimiento de proteínas. Los vectores de expresión disponibles son, por ejemplo, plásmidos bacterianos conocidos tales como SV40, derivados de pcDNA y plásmidos bacterianos conocidos tales como colE1, pCR1, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX (Smith, y col., Gene 67:31-40(1988)), plásmidos tales como pMB9 y su derivado RP4, ADN de fago que es lo mismo que numerosos derivados del fago I tales como NM989, ADN de fago tales como M13 y ADN de fago monocatenario de tipo filamento; plásmido de levadura, por ejemplo, ADN o vector de fago inducido a partir de una combinación de plásmido modificado para usar secuencias de supresión de expresión y ADN de fago. Los vectores de expresión de mamíferos comprenden el origen de replicación, un promotor apropiado y un potenciador. Además, pueden comprender sitios obligatorios de unión a ribosomas, sitios de poliadenilación, donador de empalme y parte del receptor, secuencias de terminación de la transcripción y secuencias no transcripcionales de entablado 5'. Los vectores de expresión de mamíferos pueden comprender un promotor inducible, por ejemplo, un vector que contiene el promotor de dihidrofolato reductasa, cualquier vector de expresión que contenga casete de expresión DHFR o vector de coamplificación DHFR/metotrexato tales como pED (Randal J, kaufman, 1991, Randal J. Kaufman, Current Protocols in Molycular Biology, 16, 12(1991)). O, el vector de co-amplificación de glutamina sintetasa/metionina sulfoximina, por ejemplo, pEE14 (Celltech), Virus Epstein-Barr (VEB) o un vector que dirige la expresión episómica bajo el control del antígeno nuclear (EBNA), por ejemplo, pueden usarse pREP4 (Invitrogen), pCEP4 (Invitrogen), pMEP4 (Invitrogen), pREP8 (Invitrogen), pREP9 (Invitrogen) y pEBVHis (Invitrogen). Los vectores de expresión de mamíferos seleccionables son Rc/CMV (Invitrogen) y pRc/RSV (Invitrogen), etc. Los vectores de expresión de mamíferos del virus vacuna que pueden usarse en la presente invención son pSC11, pMJ601, pTKgptF1S, etc.
El sistema de vector de expresión de levadura que se usará en la presente invención es el vector pYES2 sin fusión (Invitrogen), pYESHisA, B, C de fusión (Invitrogen), vector pRS, etc.
Los vectores mencionados anteriormente pueden introducirse en diversas células, tales como células de mamíferos que son especialmente las células derivadas de humanos, o bacterias, levaduras, hongos, insectos, nematodos y células vegetales. Los ejemplos de células apropiadas son células VERO, células HeLa, por ejemplo, N.° de ATCC CCL2, línea celular Ch O, por ejemplo, N.° de a Tc C CCL61, células COS, por ejemplo célula Co S-7 y célula N.° de ATCC CRL 1650, W138, BHK, HepG2, 3T3, por ejemplo, N.° de ATCC CRL6361, A549, PC12, célula K562, célula 293, célula Sf9, por ejemplo, N.° de ATCC CRL1711 y célula Cv1, tales como N.° de ATCC CCL70, etc.
Otras células apropiadas para su uso en la presente invención son cepas de células hospedadoras procariotas, por ejemplo, las cepas pertenecientes a E. coli (por ejemplo, cepa DH5-a), Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus.
En una realización, la composición puede contener 0,1 pg/mg a 1 mg/mg, específicamente 1 pg/mg a 0,5 mg/mg, más específicamente 10 pg/mg a 0,1 mg/mg del péptido. Cuando el péptido está contenido en el intervalo mencionado anteriormente, toda la seguridad y estabilidad de la composición puede satisfacerse y ser apropiada en términos de rentabilidad.
En una realización, la composición puede tener aplicación con todos los animales incluyendo humano, perro, pollo, cerdo, vaca, oveja, cobaya y mono.
En una realización, la composición farmacéutica puede administrarse a través de vía oral, rectal, transdérmica, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, en la médula ósea, por medios epidurales o subcutáneos.
Las formas de administración oral pueden ser, pero no se limitan a, comprimidos, píldoras, cápsulas blandas o duras, gránulos, polvos, solución o emulsión. Las formas de administración no oral pueden ser, pero no se limitan a, inyecciones, goteos, lociones, pomadas, geles, cremas, suspensiones, emulsiones, supositorio, parche o pulverizador.
En una realización, la composición farmacéutica, si es necesario, puede contener aditivos, tales como diluyentes, excipientes, lubricantes, aglutinantes, disgregantes, tampones, dispersantes, tensioactivos, agentes colorantes, aromáticos o edulcorantes. En una realización de la presente invención, la composición farmacéutica puede fabricarse por procedimientos convencionales de la industria en la técnica.
En una realización, el principio activo de la composición médica puede variar de acuerdo con la edad del paciente, el sexo, el peso, la patología y el estado, la vía de administración o el juicio del prescriptor. La dosificación basada en estos factores se determina dentro de los niveles de los expertos en la materia y la dosis diaria, por ejemplo, puede ser, pero no se limita a, 0,1 pg/kg/día a 1 g/kg/día, específicamente 1 pg/kg/día a 10 mg/kg/día, más específicamente 10 pg/kg/día a 1 mg/kg/día, más específicamente 50 pg/kg/día a 100 pg/kg/día. En una realización de la presente invención, la composición farmacéutica puede administrarse, pero no se limita a, 1 a 3 veces al día.
En una realización, la composición cosmética puede proporcionarse en todas las formas apropiadas para aplicaciones tópicas. Por ejemplo, las formas pueden proporcionarse como soluciones, emulsiones obtenidas por dispersión de fase oleaginosa en agua, emulsión obtenida por dispersión de agua en fase oleaginosa, suspensión, sólido, gel, polvo, pasta, espuma o aerosol. Estas formas pueden fabricarse por procedimientos convencionales de la industria en la técnica.
En una realización, la composición cosmética puede incluir, dentro de niveles que no dañarán el efecto principal, otros ingredientes que pueden aumentar deseablemente el efecto principal. En una realización de la presente invención, la composición cosmética puede incluir adicionalmente humectante, agentes emolientes, tensioactivos, absorbentes de UV, conservantes, fungicidas, antioxidantes, agente de ajuste de pH, pigmentos orgánicos o inorgánicos, aromáticos, agente refrigerante o antitranspirante. Los expertos en la materia pueden decidir la proporción de formulación de los ingredientes mencionados anteriormente dentro de niveles que no perjudiquen el fin y los efectos de la presente invención, y la proporción de formulación basada en el peso total de la composición cosmética puede ser del 0,01 al 5 % en peso, específicamente del 0,01 al 3 % en peso.
En una realización, la composición alimentaria no se limita a las formas, pero por ejemplo pueden ser gránulos, polvo, formas líquidas y sólidas. Cada forma puede formarse con ingredientes comúnmente usados en la industria elegidos apropiadamente por los expertos en la materia, además del principio activo, y puede aumentar el efecto con otros ingredientes.
La decisión de dosificación sobre el principio activo mencionado anteriormente está dentro del nivel de los expertos en la materia y la dosificación diaria por ejemplo puede ser de 1 pg/kg/día a 10 mg/kg/día, más específicamente 10 pg/kg/día a 1 mg/kg/día, más específicamente 50 pg/kg/día a 100 pg/kg/día, pero no se limita a estos números y puede variar de acuerdo con la edad, el estado de salud, complicaciones y otros diversos factores.
Los términos usados en el presente documento pretenden usarse para describir las realizaciones, no para limitar la presente invención. Los términos sin números delante no son para limitar la cantidad, sino para mostrar que puede haber más de una cosa del término usado. Las expresiones "que incluye", "que tiene" y "que comprende" se interpretarán abiertamente (es decir, "incluyendo pero no limitado a").
Se usa la mención del intervalo de números en lugar de indicar números separados dentro del intervalo, así que a menos que se indique explícitamente, cada número puede leerse como números separados integrados en el presente documento. Los valores finales de todos los intervalos se incluyen en el intervalo y pueden combinarse de forma independiente.
A menos que se indique lo contrario o se contradiga claramente en contexto, todos los procedimientos mencionados en el presente documento pueden realizarse en el orden apropiado. El uso de una realización cualquiera y todas las realizaciones o lenguaje ejemplar (por ejemplo, que usa "como ~"), a menos que esté incluido en las reivindicaciones, se usa para describir más claramente la presente invención, no para limitar el ámbito de la presente invención. Cualquier lenguaje en el presente documento fuera de las reivindicaciones no debe interpretarse como una necesidad de la presente invención. A menos que se defina de otra manera, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen un significado normalmente entendido por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención.
Las realizaciones preferidas de la presente invención son el mejor modo conocido por los inventores para realizar la presente invención. Puede resultar claro para los expertos en la materia después de leer las declaraciones antes de las variaciones en las realizaciones preferidas. Los presentes inventores esperan que aquellos expertos en la materia puedan usar las variaciones adecuadamente y que la presente invención se lleve a cabo de otras maneras distintas a las listadas en el presente documento. Por lo tanto, la presente invención, según lo permitido por la ley de patentes, incluye equivalentes y variaciones de los mismos, de los puntos clave de la invención establecidos en las reivindicaciones adjuntas. Además, todas las posibles variaciones dentro de cualquier combinación de los componentes anteriormente mencionados se incluyen en la presente invención, salvo que se indique explícitamente de otra manera o contradiga al contexto.
Ejemplo 1: Síntesis de péptido
Los péptidos de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 178 se sintetizaron de acuerdo con el procedimiento existente de síntesis de péptidos en fase sólida. En detalle, los péptidos se sintetizaron acoplando cada aminoácido del C-terminal a través de la síntesis de péptidos en fase sólida Fmoc, SPPS, usando ASP48S (Peptron, Inc., Daejeon ROK). Los péptidos con su primer aminoácido en el C-terminal uniéndose a la resina se usaron de la siguiente manera:
Resina NH2-Lys(Boc)-2-cloro-tritilo
Resina NH2-Ala-2-cloro-tritilo
Resina NH2-Arg(Pbf)-2-cloro-tritilo
Todos los materiales de aminoácidos para sintetizar el péptido estaban protegidos por Fmoc en el N-terminal y los restos de aminoácidos estaban protegidos por Trt, Boc, t-Bu (t-butiléster), Pbf (2,2,4,6,7-pentametil dihidro-benzofuran-5-sulfonilo) que pueden disolverse en ácido. Tales como:
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ahx-OH, ácido Trt-Mercaptoacético.
HBTU[2-(1H-Benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetametilaminio hexafluorofosfato]/HOBt [N-hidroxibenzotriazol]/NMM[4-metilmorfolina] se usaron como reactivos de acoplamiento. En el 20 % de DMF, se usó piperidina para retirar Fmoc. Para retirar la protección del resto o para separar el péptido sintetizado de la resina, se usó cóctel de escisión [TFA (ácido trifluoroacético)/TIS (triisopropilsilano)/EDT (etanoditiol)/H2O = 92,5/2,5/2,5/2,5].
Los péptidos se sintetizaron usando el armazón de fase sólida añadiendo cada aminoácido con los procedimientos secuenciales como sigue; protección de aminoácidos, reacción de acoplamiento, lavado y desprotección. Después de cortar el péptido sintetizado de la resina, se purificó por HPLC y se verificó la síntesis por MS y después se secó por congelación.
El procedimiento de síntesis de péptidos específico se describe mediante lo siguiente con el ejemplo de Pep1 (EARPALLTSRLRFIPK).
1) Acoplamiento
El aminoácido (8 equivalentes) protegido con Resina NH2-Lys(Boc)-2-cloro-tritilo se fundió en el agente de acoplamiento HBTU (8 equiv.)/HOBt (8 equiv.)/NMM (16 equiv.) y tras la adición de DMF, la mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas, después se lavó secuencialmente con DMF, MeOH y DMF.
2) Desprotección de Fmoc
Después de la adición de piperidina al 20 % en DMF, la mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos 2 veces, después se lavó secuencialmente con DMF, MeOH y DMF.
3) Fabricar el marco básico del péptido repitiendo las reacciones 1 y 2 repetidamente.
4) Escisión: Añadir el Cóctel de Escisión al péptido completamente sintetizado y separar el péptido de la resina.
5) Añadir éter dietílico pre-enfriado a la mezcla y después centrifugar la mezcla de reacción para precipitar los péptidos.
6) Después de la purificación por Prep-HPLC, comprobar el peso molecular por CL/EM y liofilizar para obtener los péptidos en forma de polvo.
Ejemplo 2: Preparación de conjugado pep(CPP)-FITC
(1) Preparación del conjugado FITC-CPP
Un conjugado de los péptidos con SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 178 combinado con FITC se fabricó como sigue, por ejemplo, un conjugado de pep1 y FITC, en otras palabras, se fabricó FITC-enlazador-pep1 como sigue.
El marco básico del péptido, (Resina NH2-enlazador-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-cloro-Tritilo) que se obtuvo de acuerdo con los procedimientos de fabricación descritos en el Ejemplo 1, se hizo reaccionar con FITC. Específicamente, FITC (fluoresceína-5-isotiocianato) (8 equivalentes) y DIPEA (N, N-diisopropiletilamina) (16 equivalentes) se fundieron en DMF. Se añadió la solución de DMF y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas, después se lavó secuencialmente con DMF, MeOH y DMF. Como resultado, se obtuvo la resina FITC-enlazador-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-clorotritilo. El enlazador en el presente documento es ácido 6-aminohexanoico, Ahx. Se añadió TFA/TIS/H2O = 95/2,5/2,5 al péptido fabricado sobre la resina y el conjugado se separó de la resina. Se añadió un éter dietílico pre-enfriado a la mezcla obtenida y se usó centrifugación para precipitar los conjugados peptídicos. Después de la purificación por Prep-HPLC, la pureza se confirmó con la HPLC analítica y el peso molecular se determinó por CL/EM. El péptido sintetizado como se describió anteriormente se verificó como FITC-pep1 mediante la confirmación del peso molecular por CL/EM. Después los conjugados se liofilizaron.
(2) Preparación de un conjugado CPP-FITC
El marco básico del péptido, (Resina NH2-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Dde)-2-cloro-Tritilo) se generó de acuerdo con los procedimientos de fabricación descritos en el Ejemplo 2 1. (1). Para introducir selectivamente FITC al C-terminal del péptido, el N-terminal del péptido estaba protegido de Boc. Después, el di-ferc-dicarbonato de butilo (30 equivalentes) y DIPEA (30 equivalentes) se fundieron en DMF. La solución de DMF se añadió al péptido y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas y el péptido se lavó secuencialmente con DMF, MeOH y DMF. Como resultado, se obtuvo la resina Boc-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L R(Pbf)-F-I-P-K(Dde)-2-cloro-tritilo. Se usó hidrazina en 2 % de DMF para retirar Dde, que es el grupo protector del resto Lys C-terminal para añadir FITC al C-terminal de Lys. Después, FITC (8 equivalentes) y DIPEA (16 equivalentes) se fundieron en DMF que se añadió a la mezcla de reacción peptídica y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas, después se lavó secuencialmente con DMF, MeOH, DMF. Como resultado, se obtuvo la resina Boc-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(FITC)-2-cloro-tritilo. Se añadió TFA/TIS/H2O = 95/2,5/2,5 para separar el péptido de la resina. Se añadió éter dietílico preenfriado a la mezcla, y se usó centrifugación para precipitar los péptidos. Después de la purificación por Prep-HPLC, La pureza se confirmó con la HPLC analítica y el peso molecular se confirmó con CL/eM. Las sustancias obtenidas se verificaron como pep1-FITC mediante la confirmación del peso molecular por CL/EM. Después los conjugados se liofilizaron. También se prepararon los conjugados de SEQ ID NO:2 a SEQ ID NO: 178 de péptido-FITC de la misma manera que se describe anteriormente para pep1-FITC.
Ejemplo 3: Propiedad de penetración de un conjugado de Ferrocenocarboxílico-CCP
El aminoácido (8 equivalentes) protegido con Resina NH2-Lys(Boc)-2-cloro-triitilo y agente de acoplamiento HBTU(8 equivalentes)/HoBt(8 equivalentes)/NMM(16 equivalentes) se fundieron en DMF para el acoplamiento. La solución de DMF se añadió y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas, después se lavó con DMF, MeOH, DMF en ese orden. Después de eso, se añadió piperidina al 20 % en DMF para la desprotección de Fmoc y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 5 minutos, 2 veces, después se lavó con dMf, MeOH, DMF en ese orden. Repitiendo las reacciones anteriores, se fabricó el marco básico del péptido, Resina NH2-E(OtBu)-A-R(Pbf)-PA-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Dde)-2-cloro-tritilo. Se añadió hidrazina en 2 % de Dm F para retirar Dde que es el grupo protector de los restos de Lys C-term. Después de eso, Ácido ferrocenocarboxílico (Sigma Aldrich n.° de Cat.
46264, 16 equivalentes) y agente de acoplamiento HBTU(16 equivalentes)/HoBt(16 equivalentes)/NMM(32 equivalentes) se fundieron en DMF. La solución de DMF se añadió y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas, después se lavó con DMF, MeOH y DMF en ese orden. SE añadió TFA/TIS/H2O=95/2,5/2,5 a la resina de péptido anteriormente sintetizada para separar el péptido de la resina. Se añadió éter dietílico de enfriamiento a la mezcla obtenida y se usó centrifugación para precipitar los péptidos reunidos. El precipitado se purificó por HPLC y se confirmó con EM. Después, los péptidos se liofilizaron.
Ejemplo 4: Penetración celular experimental del conjugado pep(CPP)-FITC
(1) Penetración celular experimental de la línea celular HeLa
Cultivo celular
La línea celular de adenocarcinoma de cuello uterino de Homo sapiens como líneas celulares HeLa se adquirieron de ATCC (American Type Cell Culture). Las células se cultivaron en MEM suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Invitrogen, EE.UU.), sales de Earle, aminoácidos no esenciales, piruvato sódico y 100 pg/ml de penicilina y 10 unidades/ml de estreptomicina y se cultivaron a 37 °C, en una incubadora de CO2 al 5 %.
Análisis de citometría de flujo y microscopía confocal de penetración celular
La citometría de flujo y el análisis de microscopio confocal se realizaron para comparar el grado de captación celular de las células que se trataron con la SEQ ID NO: 2 con la SEQ ID NO: 178, pep (CPP) y control.
La línea celular se dividió en una placa de 6 pocillos y se cultivó en un medio que contenía suero bovino fetal al 10 % (Invitrogen, EE.UU.), 100 pg/ml de penicilina, 100 unidades/ml de estreptomicina a 37 °C, incubadora al 5 % de CO2 durante 12 horas. Después de lavar la línea celular con PBS, se indujeron ayunas en Medio Esencial Mínimo durante una hora. Se trataron 20 pM de cada péptido vehículo y se cultivaron a 37 °C durante una hora. Después de repetir la etapa de lavar las células con PBS tres veces, se trató con tripsina-EDTA durante 10 minutos a 37 °C para separar el péptido vehículo en el exterior de la célula. Las células se recogieron con PBS refrigerado y se realizó una centrifugación para repetir la etapa de lavar las células tres veces. Después de eso, las células se suspendieron en 0,5 ml de PBS que contenía 4 % de paraformaldehído y se analizó la fluorescencia de las células usando FACS Calibur (Becton Dickinson). Se comparó el aspecto de la captación celular del control y diversos péptidos combinados con FITC y se analizó por IFM (Intensidad de fluorescencia media).
Los resultados son como se muestran en las Figuras 2 a 29. La Figura 1 muestra los resultados para el pep 1 de SEQ ID NO: 1, sometida a la referencia. Los resultados de los análisis mostrados en las Figuras 2 a 29 se dan con detalle en la Tabla 7 a continuación.
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(2) Propiedad de penetración celular de la línea celular Huh7
Cultivo celular
La línea celular de carcinoma hepatocelular humano como líneas Huh7 se adquirió de ATCC (American Type Cell Culture) y se usó como células suspendidas. Las células se cultivaron en MEM suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Invitrogen, EE.UU.), sales de Earle, aminoácidos no esenciales, piruvato sódico y 100 pg/ml de penicilina y 10 unidades/ml de estreptomicina y se cultivaron a 37 °C, en una incubadora de CO2 al 5 %.
El análisis de detección de penetración celular usado por citometría de flujo
Para confirmar la penetración celular de los péptidos, las líneas celulares Huh7 se trataron con SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 178 y se analizaron por citometría de flujo. El procedimiento analizado también se confirmó de la misma manera que se describió anteriormente en el ejemplo (1) en líneas celulares Hela. Además, El resultado se mostró en la Figura 30 a la Figura 51.
(3) Penetración celular experimental en líneas celulares de linfocitos T humanos
Cultivo celular
La línea celular de leucemia de linfocitos T humanos como Jurkat se adquirió de ATCC (American Type Cell Culture) y se usó como células suspendidas. Las células se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Invitrogen, EE.UU.), Earle) aminoácidos no esenciales de Earle, piruvato sódico y 100 en ATCC (American Type unidades/ml de estreptomicina y se cultivaron a 37 °C, en una incubadora de CO2 al 5 %.
El análisis de detección de penetración celular usado por citometría de flujo
Para confirmar la penetración celular de los péptidos, las líneas celulares de leucemia de linfocitos T humanos se trataron con SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 178 y se analizaron por citometría de flujo. El procedimiento analizado también se confirmó de la misma manera que se describió anteriormente en el ejemplo (1) en líneas celulares Hela. Además, El resultado se mostró en la Figura 52 a la Figura 69.
Los linfocitos (linfocito) derivados humanos se separaron de la sangre humana sana (50 m) y después se recogió la capa de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y los linfocitos se usaron por una solución de separación Biocoll (Biochrom AG, Berlín, Alemania).
(4) Análisis de viabilidad celular y toxicidad
La línea celular se dividió en una placa de 96 pocillos y se cultivaron en un medio que contenía suero bovino fetal al 10 % (Invitrogen, EE.UU.), 100 pg/ml de penicilina, 100 unidades/ml de estreptomicina a 37 °C, incubadora al 5 % de CO2 durante 12 horas. Después de lavar la línea celular con PBS, se indujeron ayunas en Medio Esencial Mínimo durante una hora. Se trataron 20 pM de cada péptido vehículo y se cultivaron a 37 °C durante una hora. Después de cultivar las células, se analizó la viabilidad celular y la toxicidad usada por el ensayo MTT. Los resultados se mostraron en la Figura 16 a la Figura 21.
<110> KAEL-GemVax Co., Ltd.
KIM, Sangjae
<120> Péptido de penetración celular y conjugado y composición que comprende el mismo
<130> OF13P178PCT
<150> KR10-2012-0104173
<151> 19-09-2012
<150> KR10-2012-0104144
<151> 19-09-2012
<150> KR10-2012-0109207
<151> 28-09-2012
<150> KR10-2012-0109216
<151> 28-09-2012
<150> KR10-2013-0017046
<151> 18-02-20138
<160> 186
<170> PatentIn versión 3.2
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys
1 5 10 15
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro
1 5 10 15
Lys
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Hls Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie
1 5 10 15
Pro Lys
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe
1 5 10 15
lie Pro Lys
<210> 5
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg
1 5 10 15
Phe lie Pro Lys
20
<210>6
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400>6
Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu
1 5 10 15
Arg Phe lie Pro Lys
20
<210>7
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg
1 5 10 15
Leu Arg Phe lie Pro Lys
20
<210>8
<211> 23
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser
1 5 10 15
Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys
20
<210>9
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Glu Ala Glu Val Arg Gln His Arg
Figure imgf000025_0001
1 5
Figure imgf000025_0002
Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys
20
<210> 10
<211> 25
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu
1 5 10 15
Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys
20 25
<210> 11
<211> 26
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu
1 5 10 15
Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys
20 25
<210> 12
<211> 27
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala
1 5 10 15
Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys
20 25
<210> 13
<211> 28
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Figure imgf000026_0001
<210> 14
<211> 29
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg
1 5 10 15
Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys
20 25
<210> 15
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala
1 5 10 15
Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys
20 25 30
<210> 16
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro
1 5 10 15
Lys Pro
<210> 17
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie
1 5 10 15
Pro Lys Pro
<210> 18
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie
1 5 10 15
Pro Lys Pro Asp
20
<210> 19
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro
1 5 10 15
Lys Pro Asp
<210> 20
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe
1 5 10 15
lie Pro Lys Pro
20
<210> 21
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe
1 5 10 15
lie Pro Lys Pro Asp
20
<210> 22
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe
1 5 10 15
lie Pro Lys Pro Asp Gly
20
<210> 23
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie
1 5 10 15
Pro Lys Pro Asp Gly
20
<210> 24
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro
1 5 10 15
Lys Pro Asp Gly
20
<210> 25
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg
1 5 10 15
Phe lie Pro Lys Pro
20
<210> 26
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg
1 5 10 15
Phe lie Pro Lys Pro Asp
20
<210> 27
<211> 23
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg
1 5 10 15
Phe lie Pro Lys Pro Asp Gly
20
<210> 28
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg
1 5 10 15
Phe lie Pro Lys Pro Asp Gly Leu
20
<210> 29
<211> 23
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe
1 5 10 15
lie Pro Lys Pro Asp Gly Leu
20
<210> 30
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie
1 5 10 15
Pro Lys Pro Asp Gly Leu
20
<210> 31
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro
1 5 10 15
Lys Pro Asp Gly Leu
20
<210> 32
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu
1 5 10 15
Arg Phe lie Pro Lys Pro
20
<210> 33
<211> 23
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu
1 5 10 15
Arg Phe lie Pro Lys Pro Asp
20
<210> 34
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu
1 5 10 15
Arg Phe lie Pro Lys Pro Asp Gly
20
<210> 35
<211> 25
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu
1 5 10 15
Arg Phe lie Pro Lys Pro Asp Gly Leu
20 25
<210> 36
<211> 26
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu
1 5 10 15
Arg Phe lie Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg
20 25
<210> 37
<211> 25
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg
1 5 10 15
Phe lie Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg
20 25
<210> 38
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe
1 5 10 15
lie Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg
20
<210> 39
<211> 23
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie
1 5 10 15
Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg
20
<210> 40
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro
1 5 10 15
Lys Pro Asp Gly Leu Arg
20
<210> 41
<211> 23
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg
1 5 10 15
Leu Arg Phe lie Pro Lys Pro
20
<210> 42
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg
1 5 10 15
Leu Arg Phe lie Pro Lys Pro Asp
20
<210> 43
<211> 25
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg
1 5 10 15
Leu Arg Phe lie Pro Lys Pro Asp Gly
20 25
<210> 44
<211> 26
<212> PRT
<213> Homo sapiens
< 400 > 44
Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg
1 5 10 15
Leu Arg Phe lie Pro Lys Pro Asp Gly Leu
20 25
<210> 45
<211> 27
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg
1 5 10 15
Leu Arg Phe lie Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg
20 25
<210> 46
<211> 28
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg
1 5 10 15
Leu Arg Phe lie Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro
20 25
<210> 47
<211> 27
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 47
Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu
1 5 10 15
Arg Phe lie Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro
20 25
<210> 48
<211> 26
<212> PRT
<213> Homo sapiens
< 400 > 48
Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg
1 5 10 15
Phe lie Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro 20 25
<210> 49
<211> 25
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49
Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe
1 5 10 15
lie Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro
20 25
<210> 50
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie
1 5 10 15
Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro
20
<210> 51
<211> 23
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro
1 5 10 15
Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro
20
<210> 52
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
< 400 > 52
Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser
1 5 10 15
Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys Pro
20
<210> 53
<211> 25
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 53
Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser
1 5 10 15
Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys Pro A$p
20 25
<210> 54
<211> 26
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 54
Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser
1 5 10 15
Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys Pro Asp Gly
20 25
<210> 55
<211> 27
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 55
Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser
1 5 10 15
Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys Pro Asp Gly Leu
20 25
<210> 56
<211> 28
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 56
Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser
1 5 10 15
Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg
20 25
<210> 57
<211> 29
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 57
Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser
1 5 10 15
Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro
20 25
<210> 58
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 58
Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser
1 5 10 15
Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro lie
20 25 30
<210> 59
<211> 29
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 59
Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg
1 5 10 15
Leu Arg Phe lie Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro lie
20 25
<210> 60
<211> 28
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 60
Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu
1 5 10 15
Arg Phe lie Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro lie
20 25
<210> 61
<211> 27
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 61
Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg
1 5 10 15
Phe lie Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro lie
20 25
<210> 62
<211> 26
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 62
Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe
1 5 10 15
lie Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro lie
20 25
<210> 63
<211> 25
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 63
His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie
1 5 10 15
Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro lie
20 25
<210> 64
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 64
Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro
1 5 10 15
Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro lie
20
<210> 65
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
< 400 > 65
Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys
1 5 10 15
Pro
<210> 66
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 66
Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys
1 5 10 15
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<210> 67
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 67
Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys
1 5 10 15
Pro Asp Gly
<210> 68
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 68
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1 5 10 15
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20
<210> 69
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 69
Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys
1 5 10 15
Pro Asp Gly Leu Arg Pro
20
<210> 70
<211> 23
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 70
Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys
1 5 10 15
Pro Asp Gly Leu Arg Pro lie
20
<210> 71
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 71
Pro Asp Gly Leu Arg Pro lie Val
20
<210> 72
<211> 25
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 72
Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys
1 5 10 15
Pro Asp Gly Leu Arg Pro lie Val Asn
20 25
<210> 73
<211> 26
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 73
Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys
1 5 10 15
Pro Asp Gly Leu Arg Pro lie Val Asn Met
20 25
<210> 74
<211> 27
<212> PRT
<213> Homo sapiens
< 400 > 74
Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys
1 5 10 15
Pro Asp Gly Leu Arg Pro lie Val Asn Met Asp
20 25
<210> 75
<211> 28
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 75
Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys
1 5 10 15
Pro Asp Gly Leu Arg Pro lie Val Asn Met Asp Tyr
20 25
<210> 76
<211> 29
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 76
Figure imgf000041_0001
<210> 77
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 77
Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys
1 5 10 15
Pro Asp Gly Leu Arg Pro lie Val Asn Met Asp Tyr Val Val
20 25 30
<210> 78
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 78
Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro
1 5 10 15 <210> 79
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 79
Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Fhe lie 1 5 10
<210> 80
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 80
Figure imgf000042_0001
<210> 81
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 81
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1 5 10
<210> 82
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 82
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1 5 10
<210> 83
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 83
Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg
1 5 10
<210> 84
<211>9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
< 400 > 84
Figure imgf000043_0001
<210> 85
<211>8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 85
Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr
1 5
<210> 86
<211>7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 86
Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu
1 5
<210> 87
<211>6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 87
Glu Ala Arg Pro Ala Leu
1 5
<210> 88
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 88
Glu Ala Arg Pro Ala
1 5
<210> 89
<211>4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
< 400 > 89
Glu Ala Arg Pro
1
<210> 90
<211>3
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 90
Glu Ala Arg
1
<210> 91
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 91
Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys
1 5 10 15
<210> 92
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 92
Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys 1 5 10
<210> 93
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 93
Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys
1 5 10
<210> 94
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 94
Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys
1 5 10
<210> 95
<211> 11
< 212 > P R T
< 213 > H o m o sap ie ns
<400> 95
Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys
1 5 10
<210> 96
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 96
Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys
1 5 10
<210> 97
<211>9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 97
Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys 1 5
<210> 98
<211>8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 98
Figure imgf000045_0001
<210> 99
<211>7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 99
Arg Leu Arg Phe lie Pro Lys
1 5
<210> 100
<211>6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
< 400 > 100
Figure imgf000046_0001
<210> 101
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 101
Arg Phe lie Pro Lys
1 5
<210> 102
<211>4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 102
Phe lie Pro Lys
1
<210> 103
<211>3
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 103
lie Pro Lys
1
<210> 104
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 104
Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro 1 5 10
<210> 105
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 105
Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie
1 5 10
< 210 > 106
< 211 > 10
< 212 > P R T
< 213 > H o m o sap ie ns
<400> 106
Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe
1 5 10
<210> 107
<211>8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 107
Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg
1 5
<210> 108
<211>6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 108
Figure imgf000047_0001
<210> 109
<211>4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 109
Leu Thr Ser Arg
1
<210> 110
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 110
Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie 1 5 10
<210> 111
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
< 400 > 111
Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe
1 5 10
<210> 112
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 112
Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg
1 5 10
<210> 113
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 113
Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu
1 5 10
<210> 114
<211>9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 114
Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg 1 5
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<211>8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 115
Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser
1 5
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<211>7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 116
Figure imgf000048_0001
< 210 > 117
< 211 > 6
< 212 > P R T
< 213 > H o m o sap ie ns
<400> 117
Figure imgf000049_0001
<210> 118
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 118
Ala Arg Pro Ala Leu
1 5
<210> 119
<211>4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 119
Ala Arg Pro Ala
1
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<211>3
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 120
Ala Arg Pro
1
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<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 121
Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro
1 5 10
<210> 122
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
< 400 > 122
Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe
1 5 10
<210> 123
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 123
Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg
1 5 10
<210> 124
<211>8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 124
Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg
1 5
<210> 125
<211>7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 125
Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser
1 5
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<211>6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Arg Pro Ala Leu Leu Thr
1 5
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<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
< 400 > 127
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<211>4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 128
Figure imgf000051_0001
<210> 129
<211>3
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 129
Arg Pro Ala
1
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<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 130
Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro 1 5 10
<210> 131
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 131
Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie
1 5 10
<210> 132
<211>9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 132
Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg 1 5
<210> 133
<211>8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
< 400 > 133
Figure imgf000052_0001
<210> 134
<211>7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 134
Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg
1 5
<210> 135
<211>6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 135
Pro Ala Leu Leu Thr Ser
1 5
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<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 136
Pro Ala Leu Leu Thr
1 5
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<211>4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 137
Pro Ala Leu Leu
1
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<211>3
<212> PRT
<213> Homo sapiens
< 400 > 138
Pro Ala Leu
1
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<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 139
Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro
1 5 10
<210> 140
<211>9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 140
Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe 1 5
<210> 141
<211>7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 141
Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu
1 5
<210> 142
<211>6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 142
Ala Leu Leu Thr Ser Arg
1 5
<210> 143
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 143
Ala Leu Leu Thr Ser
1 5
<210> 144
<211>4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 144
Ala Leu Leu Thr
1
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<211>3
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 145
Ala Leu Leu
1
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<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 146
Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro
1 5 10
<210> 147
<211>9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 147
Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie 1 5
<210> 148
<211>7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 148
Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg
1 5
<210> 149
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
< 400 > 149
<210> 150
<211>4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 150
Leu Leu Thr Ser
1
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<211>3
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 151
Figure imgf000055_0001
<210> 152
<211>9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 152
Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro 1 5
<210> 153
<211>8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 153
Figure imgf000055_0002
<210> 154
<211>7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 154
Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe
1 5
<210> 155
<211>6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 155
Leu rhr Ser Arg Leu Arg
1 5
<210> 156
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 156
Figure imgf000056_0001
<210> 157
<211>3
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 157
Leu Thr Ser
1
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<211>8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 158
Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro
1 5
<210> 159
<211>7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 159
Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie
1 5
<210> 160
<211>6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
< 400 > 160
Thr Ser Arg Leu Arg Phe
1 5
<210> 161
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 161
Thr Ser Arg Leu Arg
1 5
<210> 162
<211>4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 162
Thr Ser Arg Leu
1
<210> 163
<211>3
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 163
Thr Ser Arg
1
<210> 164
<211>7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 164
Ser Arg Leu Arg Phe lie Pro
1 5
<210> 165
<211>6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
< 400 > 165
<210> 166
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 166
Ser Arg Leu Arg Phe
1 5
<210> 167
<211>4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 167
Ser Arg Leu Arg
1
<210> 168
<211>3
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 168
Ser Arg Leu
1
<210> 169
<211>6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 169
Figure imgf000058_0001
<210> 170
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 170
Arg Leu Arg Phe lie
1 5
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<211>4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
< 400 > 171
Arg Leu Arg Phe
1
<210> 172
<211>3
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 172
Arg Leu Arg
1
<210> 173
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 173
Leu Arg Phe lie Pro
1 5
<210> 174
<211>4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 174
Leu Arg Phe lie
1
<210> 175
<211>3
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 175
Leu Arg Phe
1
<210> 176
<211>4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 176
Arg Phe lie Pro
1
< 210 > 177
<211>3
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 177
Arg Phe lie
1
<210> 178
<211>3
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 178
Phe lie Pro
1
<210> 179
<211> 1132
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 179
Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser 1 5 10 15
His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly
20 25 30
Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg
35 40 45
Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro 50 55 60
Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu 65 70 75 80 Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val 85 90 95
Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro
100 105 110
Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr
115 120 125
Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val 130 135 140
Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val 145 150 155 160 Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr 165 170 175
Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly
180 185 190
Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg
195 200 205
Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg
210 215 220
Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg 225 230 235 240 Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp 245 250 255
Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val
260 265 270
Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala
275 280 285
Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His
290 295 300
Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro 305 310 315 320 Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly 325 330 335
Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro
340 345 350
Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr lie Phe Leu Gly Ser
355 360 365
Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His 385 390 395 400 Ala Gln Cys Pro Tyr Gly val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg 405 410 415
Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln
420 425 430
Gly Ser val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu
435 440 445
Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe
450 455 460
Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser •465 470 475 480 Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe H e Ser 435 490 495
Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met
500 505 510
Ser Val Arg Asp Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys
515 520 525
Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu lie Leu Ala Lys Phe 530 535 540
Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe 545 550 555 560 Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr 565 570 575
Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser H e Gly lie Arg Gln His
580 585 590
Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln
595 600 605
His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe lie 610 615 620
Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro lie Val Asn Met Asp Tyr Val Val 625 630 635 640 Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser 645 650 655
Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg
660 665 670
Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp lie His Arg
675 680 685
Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro 690 695 700
Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr lie 705 710 715 720 Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val lie Ala Ser lie lie Lys Pro Gln 725 730 735
Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His
740 745 750
Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp
755 760 765
Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser 770 775 780
Pro Leu Arg Asp Ala Val Val lie Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu 785 790 795 800 Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His 805 810 815
Ala Val Arg lie Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly lie Pro
820 825 830
Gln Gly Ser lie Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp
835 840 845
Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly lie Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu 850 855 860
Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala
865 870 875 880
Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys 885 890 895
Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu
900 905 910
Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe
915 920 925
Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser 930 935 940
Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser lie Arg Ala Ser Leu Thr Phe
945 950 955 960
Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly 965 970 975
Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln val Asn
980 985 990
Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn lie Tyr Lys lie Leu Leu Leu Gln
995 1000 1005
Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln Gln 1010 1015 1020
Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val H e Ser Asp Thr Ala
1025 1030 1035 1040
Ser Leu Cys Tyr Ser H e Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser Leu
1045 1050 1055
Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala Val Gln Trp
1060 1065 1070
Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg His Arg Val Thr
1075 1080 1085
Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr Ala Gln Thr Gln Leu Ser 1090 1095 1100
Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn
1105 1110 1115 1120
Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr lie Leu Asp
1125 1130
<210> 180
<211> 48
<212>ADN
<213> Homo sapiens
<400> 180
gaagcgcgcc cggcgctgct gaccagccgc ctgcgcttta ttccgaaa 48
< 210 > 181
<211> 21
<212>ARN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> ARNip sentido
<220>
<221> variación
<222> (20)..(21)
<223> n es desoxitimidina (dT)
<400> 181
cuuacgcuga guacuucgan n 21
<210> 182
<211> 21
<212> ARN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> ARNip antisentido
<220>
<221> variación
<222> (20)..(21)
<223> n es desoxitimidina (dT)
<400> 182
ucgaaguacu cagcguaagn n 21
<210> 183
<211>239
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Proteína fluorescente verde
<400> 183
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro lie Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe lie
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 ñrg Thr lie Phe Phe Lys ASp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg lie Glu Leu Lys Gly
115 120 125
H e Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn lie Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr lie Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly lie Lys Val Asn Phe Lys lie Arg His Asn lie Glu Asp Gly Ser 165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro lie Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly lie Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 184
<211> 720
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Proteína fluorescente verde
<400> 184
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcaco accggcaagc tgcccgtgco ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgcco gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccao aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgocgggatc actotcggca tggacgagct gtacaagtaa 720 <210> 185
<211> 21
<212>ARN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> siCont sentido
<220>
<221> variación
<222> (20)..(21)
<223> n es desoxitimidina (dT)
<400> 185
gcaccuauaa caacgguagn n 21
<210> 186
<211> 21
<212> ARN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> siCont antisentido
<220>
<221> variación
<222> (20)..(21)
<223> n es desoxitimidina (dT)
<400> 186
cuaccguugu uauaggugcn n 21

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado de un péptido vehículo de penetración celular y un principio activo,
en el que el péptido vehículo es un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 a s Eq ID NO: 178, o un fragmento de cualquiera de las mismas,
en el que el fragmento retiene la capacidad de penetración celular de una cualquiera de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 178.
2. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el péptido vehículo consiste en
a) al menos 3 aminoácidos;
b) 30 o menos aminoácidos; o
c) una cualquiera de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 178.
3. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el principio activo es
a) al menos uno seleccionado de una proteína, un ácido nucleico, un péptido, un lípido, un lípido de glicol, un mineral, un azúcar, una nanopartícula, un producto biológico, un agente de contraste, un fármaco y un compuesto químico; o
b) una proteína o un péptido, opcionalmente una citocina, un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo, una enzima terapéutica, un receptor soluble o un ligando.
4. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el péptido vehículo y el principio activo están conjugados a través de
a) un enlace covalente, opcionalmente mediado por un enlazador; o
b) un enlace no covalente.
5. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el principio activo es un agente de contraste.
6. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el agente de contraste se selecciona del grupo que consiste en un agente de contraste radiopaco, un agente de contraste paramagnético, un agente de contraste superparamagnético y un agente de contraste CT.
7. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el agente de contraste está basado en hierro, opcionalmente un carboxilato de ferroceno.
8. Uso del conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, para el contraste de una célula, opcionalmente una célula madre.
9. Una composición que comprende el conjugado de acuerdo con una cualquiera de la reivindicación 1 a la reivindicación 7, que es una composición farmacéutica, una composición cosmética o una composición de alimentos saludables.
10. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9, para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad.
11. Un procedimiento de administración de un principio activo en una célula, que comprende administrar el conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o la composición de la reivindicación 9 a una célula in vitro.
12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el procedimiento es para administrar el principio activo localmente en las mitocondrias dentro de una célula.
13. El uso de un péptido que consiste en una cualquiera de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2-178 como un péptido vehículo de penetración celular para transportar un fármaco al interior de una célula in vitro, en el que el péptido está conjugado con el fármaco.
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