ES2434829T3 - Péptidos que contienen arginina C-terminal biológicamente activos - Google Patents
Péptidos que contienen arginina C-terminal biológicamente activos Download PDFInfo
- Publication number
- ES2434829T3 ES2434829T3 ES08829747T ES08829747T ES2434829T3 ES 2434829 T3 ES2434829 T3 ES 2434829T3 ES 08829747 T ES08829747 T ES 08829747T ES 08829747 T ES08829747 T ES 08829747T ES 2434829 T3 ES2434829 T3 ES 2434829T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- peptide
- peptides
- use according
- peptone
- arginine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 62
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 48
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 title claims abstract description 19
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 19
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 title claims abstract description 10
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 title description 8
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims abstract description 36
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims abstract description 36
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 23
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 12
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 claims abstract description 4
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 claims description 10
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 claims description 8
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 2
- OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 2,4-D Chemical compound OC(=O)COC1=CC=C(Cl)C=C1Cl OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 43
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 28
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 description 22
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 20
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 18
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 15
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 13
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 9
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 8
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 8
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 8
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 8
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- -1 Leu Chemical group 0.000 description 5
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 5
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 5
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 3
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 3
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 3
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 2
- 101100336480 Drosophila melanogaster Gem2 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 101100228790 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) yip11 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 2
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 238000001360 collision-induced dissociation Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 2
- 238000012434 mixed-mode chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000256173 Aedes albopictus Species 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 244000303258 Annona diversifolia Species 0.000 description 1
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 241000409811 Bombyx mori nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000255588 Tephritidae Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000000188 Vaccinium ovalifolium Species 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000012435 analytical chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940023913 cation exchange resins Drugs 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 239000010439 graphite Substances 0.000 description 1
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000004896 high resolution mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000001095 inductively coupled plasma mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 159000000014 iron salts Chemical class 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N pyrogallol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1O WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000012784 weak cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
- C07K5/06043—Leu-amino acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
- C07K5/06052—Val-amino acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/0606—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing heteroatoms not provided for by C07K5/06086 - C07K5/06139, e.g. Ser, Met, Cys, Thr
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/06078—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
- C07K5/06113—Asp- or Asn-amino acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/0806—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/0808—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/081—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing O or S as heteroatoms, e.g. Cys, Ser
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0819—Tripeptides with the first amino acid being acidic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/02—Cells for production
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Utilización de un péptido de fórmula en el que X1 y X2 pueden ser idénticos o diferentes y representan independientemente cualquier aminoácidodiferente de arginina; n es 0 ó 1; y R representa arginina, en el que dicho péptido muestra una actividad biológica de peptona para inducir el crecimiento celular y/o ladensidad celular y/o la viabilidad celular y/o la eficacia de producción de polipéptidos heterólogos en cultivos dehuéspedes recombinantes.
Description
Péptidos que contienen arginina C-terminal biológicamente activos
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La presente invención se refiere a la separación, identificación y caracterización de fragmentos de péptidos activos de peptonas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0002] Los hidrolizados de tejidos de animales y plantas se añaden a menudo a medios de cultivo para reforzar en las procariotas y eucariotas el número de células viables y el título de productos proteicos recombinantes. De este modo, se han utilizado ampliamente las peptonas de diversas fuentes en formulaciones de medios de cultivo celular para aumentar el crecimiento, la longevidad y la productividad del cultivo celular. Sin embargo, su presencia como aditivos del medio para la producción de proteínas terapéuticas presenta varios desafíos debido a su naturaleza no definida.
[0003] La utilización de componentes derivados de animales como aditivos del medio para la producción de proteínas terapéuticas por células de mamíferos pueden causar contaminaciones virales, por micoplasma y priones (Kallel et al., J. Biotechnol. 95:195-204 (2002)). El esfuerzo para evitar la utilización de componentes derivados de animales en medios de cultivo celular está apoyado por las autoridades reguladoras europeas y americanas (Castle y Roberston, Dev. Biol. Stand. 99:191-196 (1999)). En las últimas décadas se ha eliminado satisfactoriamente el suero de animal y la mayoría de los medios utilizados actualmente se certifican como libres de proteínas (Froud, Dev. Biol. Stand. 99:157-166 (1999)). Sin embargo, el cambio a medios libres de proteínas da lugar a menudo a una pérdida de crecimiento y productividad celular (Lee et al., J. Biotechnol. 69:85-93 (1999)).
[0004] Como resultado, los hidrolizados de proteínas (también conocidos como peptonas) se utilizan frecuentemente en medios de cultivo celular como aditivos de nutrientes porque algunos de ellos se pueden considerar como libres de proteínas 25 (Burteau et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. - Anim. 39 (7):291-296 (2003), US-A1-2004/0138428, EP-A20810283 y "BD Bionutrients Technical Manual" Tercera revisión revisada (2006) BD BIOSCENCE). Las peptonas para el cultivo celular se fabrican habitualmente mediante digestión enzimática de un conjunto de materiales de partida de base biológica: tejidos de animales, productos derivados de la leche, microorganismos o plantas.
[0005] El efecto general de las peptonas es un aumento del crecimiento celular y un incremento de la productividad, con la misma calidad de producto en comparación con el medio estándar (Jan et al., Cytotechnology 16:17-26 (1994); Heidemann et al., Cytotechnology 32:157-167 (2000); Sung et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 63:527-536 (2004)). Varios artículos han demostrado que las peptonas contienen materiales, tales como aminoácidos libres, oligopéptidos, sales de hierro, lípidos y elementos traza (Franck et al., Biotechnol. Prog. 16:688-692 (2000); Martone et al., Bioresour. Technol. 96:383-387 (2005)). Un estudio investigó las funciones potenciales de las peptonas y mostró que pueden tener un efecto nutricional (Heidemann et al., Cytotechnology 32:157-167 (2000). Además, Schlaeger, J. Immunol. Meth. 194:191-199 (1996), demostraron que un hidrolizado de proteínas particulares muestra propiedades contra la apoptosis.
[0006] A pesar de las numerosas investigaciones sobre los efectos de las peptonas en el cultivo celular, su mecanismo de acción aún es desconocido. Aunque las peptonas han demostrado ser beneficiosas en los procesos de cultivo celular, su uso también tiene muchas desventajas. En primer lugar, dado que algunas peptonas derivan de animales, se encuentran problemas similares que con el uso de suero. Además, las peptonas de otras fuentes también pueden ser una potencial fuente de agentes accidentales. En segundo lugar, la incertidumbre de los componentes “activos” en la peptona y su mecanismo de acción dificulta, si no imposibilita, tener una medición de la calidad en los lotes de peptonas utilizados en los procesos de fabricación de cultivos celulares. Finalmente, dado que los materiales de origen y los procesos en la fabricación de peptonas no están normalizados ni son generalmente intercambiables, las propias peptonas son por naturaleza una materia prima de origen único. Por lo tanto, existe la oportunidad de caracterizar mejor las peptonas a efectos de reducir o eliminar estas desventajas.
[0007] Por lo tanto, sería ventajoso entender la composición e identidad de los componentes activos en las peptonas a efectos de crear “medios definidos”, que comprendan componentes activos bien especificados en concentraciones reproducibles bien definidas. Además se espera que la identificación de componentes activo de peptonas conduzca a un mejor entendimiento de la fisiología de células huésped y líneas celulares recombinantes al abrir una ventana al control del crecimiento y la muerte celular y un mejor control de la expresión de proteínas recombinantes.
[0008] Por lo tanto, se han hecho esfuerzos para caracterizar composiciones de peptonas y para entender los mecanismos de sus efectos en los cultivos celulares.
[0009] La presente invención se basa en el fraccionamiento de una peptona derivada de animal, PP3, en componentes identificables y, mediante la aplicación de técnicas analíticas modernas que incluyen la espectrometría
de masas de alta resolución, el estudio de la naturaleza de estos compuestos. La presente invención se basa, por lo menos en parte, en el reconocimiento de que dipéptidos y tripéptidos que terminan en arginina juegan un papel en las actividades de inducción del crecimiento y el título de PP3.
DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN
[0010] La presente invención es tal como se establece en las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0011]
La figura 1 es la ilustración esquemática del fraccionamiento y análisis de PP3, tal como se describe en el ejemplo.
La figura 2 muestra los resultados de la cromatografía de fase inversa C18.
La figura 3 muestra los resultados de la cromatografía de la fracción que pasa por C18 (no unida). “Actividad específica relativa” se define como la actividad de un peso igual de la fracción dividida por la de PP3.
Las figuras 4A y 4B muestran que la actividad específica del material purificado por G-15 (fracciones F3-F7) se incrementó significativamente sobre la de PP3 con respecto a su capacidad de incrementar el título de proteína recombinante (figura 3A) y el recuento de células viables (VCC; figura 3B).
Figura 5. Análisis espectral de masas de la fracción de G-15. Panel superior: Rastreo MS de la fracción. Paneles inferiores: análisis ms/ms de m/z 403,2, 389,2 y 375,2, respectivamente.
Figura 6. Distribución de frecuencia de los péptidos en una biblioteca de tripéptidos in silico que terminan en R. Eje
X: masa de tripéptidos; Eje Y: frecuencia a cada masa.
Figuras 7A y B. Efectos de PP3 y péptidos XXR sobre el VCC y el título de producto. A. VCC medido en el bioensayo en respuesta a la adición de concentraciones crecientes de PP3 (línea negra) o péptidos XXR (línea roja).
B. Título de producto medido en el bioensayo en respuesta a la adición de concentraciones crecientes de PP3 (línea negra) o péptidos XXR (línea roja).
Figura 8. Secuencia de aminoácidos del componente 3 del polipéptido proteosa peptona (PP3) bovino (SEQ ID NO: 1).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
A. Definiciones
[0012] A menos que se defina lo contrario, los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que lo entendido habitualmente por un experto en la materia al que pertenece la invención. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2ª edición, J. Wiley & Sons (New York, NY 1994) proporciona a un experto en la material una guía general para muchos términos utilizados en la presente solicitud.
[0013] El término “peptona” se utiliza en el presente documento en el sentido más amplio e incluye derivados de proteínas solubles en agua obtenidas mediante la hidrólisis parcial de proteínas, y mezclas de los mismos, que incluyen, sin limitación, mezclas de hidrolizados derivados del tejido de mucosa de cerdo, ganado y otros animales, producidos mediante hidrólisis con enzimas proteolíticas, así como hidrolizados de varios tejidos de plantas. El término incluye específicamente, sin limitación, el componente 3 de peptona proteasa (PP3), también denominado lactoforina, que es una fosfoglicoproteína menor de 153 residuos (Sorensen y Sorensen, J. Dairy Res. 60:535-542 (1993)) hallada en la leche bovina (número de acceso en la base de datos SwissProt: P80195; No. de acceso de GenBank CAA58309), y proteínas homólogas caracterizadas por leche de otras especies, como el camello (Beg et al., FEBS Lett. 216:270-274 (1987), Ilama (Cantisani et al., J. Biochem. Biophys. Methods 21:227-236 (1990), oveja, y cabra (Sorensen et al., J. Dairy Sci. 80:3176-3181(1997) y Lister et al., J. Dairy Res. 81:2111-2115 (1998). Hasta ahora, no se ha hallado PP3 en leche humana. El PP3 está disponible de fuentes comerciales, tales como, por ejemplo, Difco Laboratories, Detroit, Michigan.
[0014] El término “péptido” se utiliza en el presente documento para referirse a un compuesto que contiene dos o más aminoácidos en que el grupo carboxilo de un ácido está unido al grupo amino del otro mediante un enlace amida o “peptídico”. La definición incluye específicamente péptidos formados de por lo menos dos residuos de aminoácidos y, en particular, dipéptidos y tripéptidos.
[0015] Por "proteína" se entiende una secuencia de aminoácidos para la que la longitud de cadena es suficiente para producir los niveles más elevados de estructura terciaria y/o cuaternaria. Habitualmente, la proteína del
presente documento tendrá un peso molecular de por lo menos 15-20 KD, preferiblemente por lo menos aproximadamente 20 kD. Entre los ejemplos de proteínas comprendidas en la definición del presente documento se incluyen todas las proteínas de mamífero, en particular, proteínas terapéuticas y de diagnóstico, tales como anticuerpos terapéuticos y de diagnóstico y, en general, proteínas que contienen uno o más enlaces disulfuro, que incluyen polipéptidos multicadenas que comprenden uno o más enlaces disulfuro intercadenas y/o intracadenas.
[0016] El término “aminoácido” o “residuo de aminoácido” se refiere habitualmente a un aminoácido que tiene su definición reconocida en la técnica, tal como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: alanina (Ala); arginina (Arg); asparagina (Asn); ácido aspártico (Asp): cisteína (Cys): glutamina (Gln); ácido glutámico (Glu); glicina (Gly); histidina (His); isoleucina (Ile): leucina (Leu); lisina (Lys); metionina (Met); fenilalanina (Phe); prolina (pyro); serina (Ser); treonina (Thr); triptófano (Trp); tirosina (Tyr); y valina (Val), aunque, según se desee, se pueden usar aminoácidos modificados, sintéticos o raros. De este modo, los aminoácidos modificados y no habituales listados en 37 CFR 1.822(b)(4) se incluyen en esta definición y se incorporan expresamente por referencia en el presente documento. Los aminoácidos se pueden subdividir en varios subgrupos. De este modo, los aminoácidos se pueden agrupar por tener una cadena lateral no polar (por ejemplo, Ala, Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Val); una cadena lateral cargada negativamente (por ejemplo, Asp, Glu); una cadena lateral cargada positivamente (por ejemplo, Arg, His, Lys); o una cadena lateral no cargada (por ejemplo, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, and Tyr). Los aminoácidos también se pueden agrupar en pequeños aminoácidos (Gly, Ala), aminoácidos nucleofílicos (Ser, His, Thr, Cys), aminoácidos hidrofóbicos (Val, Leu, Ile, Met, Pro), aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp, Asp, Glu), amidas (Asp, Glu), y aminoácidos básicos (Lys, Arg).
[0017] El término “actividad biológica” o “actividad biológica de peptona” en relación con los péptidos descritos en el presente documento se utiliza para referirse a cualquier actividad biológica conocida por ser mostrada por peptonas, que incluyen, sin limitación, la capacidad de inducir el crecimiento celular y/o la densidad celular y/o la viabilidad celular, y/o la eficacia de producción de un polipéptido heterólogo en cultivos de huéspedes recombinantes.
[0018] El término “cromatografía” se refiere al proceso por el cual un soluto de interés en una mezcla se separa de otros solutos en una mezcla como resultado de diferencias en las velocidades a las que los solutos individuales de la mezcla migran a través de un medio estacionario bajo la influencia de una fase móvil o en procesos de unión y elución.
[0019] El término “cromatografía de afinidad” y “cromatografía de afinidad de proteínas” se utilizan indistintamente en el presente documento y se refieren a una técnica de separación de proteínas en que una proteína de interés o anticuerpo de interés se une de manera reversible y específica a un ligando bioespecífico. Preferiblemente, el ligando bioespecífico se une covalentemente a un material cromatográfico en fase sólida y es accesible a la proteína de interés en solución ya que la solución entra en contacto con el material cromatográfico en fase sólida. La proteína de interés (por ejemplo, anticuerpo, enzima o proteína receptora) mantiene su afinidad de unión específica para el ligando bioespecífico (antígeno, sustrato, cofactor u hormona, por ejemplo) durante las etapas cromatográficas, mientras que otros solutos y/o proteínas en la mezcla no se unen de manera apreciable o específica al ligando. La unión de la proteína de interés al ligando inmovilizado permite que las proteínas contaminantes o impurezas de proteínas pasen a través del medio cromatográfico mientras que la proteína de interés permanece unida de manera específica al ligando inmovilizado en el material en fase sólida. A continuación, la proteína de interés unida de manera específica se extrae en forma activa del ligando inmovilizado con un pH bajo, pH elevado, concentración elevada de sal, ligando competidor, y similares, y se pasa a través de la columna cromatográfica con el tampón de elusión, libre de proteínas contaminantes o impurezas de proteínas que anteriormente se dejaron pasar a través de la columna. Se puede utilizar cualquier componente como ligando para purificar su respectiva proteína de unión específica, por ejemplo, anticuerpo.
[0020] Los términos “cromatografía sin afinidad” y “purificación sin afinidad” se refieren a un proceso de purificación en el que no se utiliza la cromatografía de afinidad. La cromatografía sin afinidad incluye técnicas cromatográficas que dependen de interacciones no específicas entre una molécula de interés (tal como una proteína, por ejemplo, anticuerpo) y una matriz de fase sólida.
[0021] Una “resina de intercambio catiónico” se refiere a una fase sólida que está cargada negativamente y que, de este modo, tiene cationes libres para el intercambio con cationes en una solución acuosa pasada sobre o a través de la fase sólida. Un ligando cargado negativamente unido a la fase sólida para formar la resina de intercambio catiónico puede ser, por ejemplo, un carboxilato o sulfonato. Las resinas de intercambio catiónico disponibles comercialmente incluyen carboximetilcelulosa, sulfopropilo (SP) inmovilizado en agarosa (por ejemplo, SP-SEPHAROSE FAST FLOW™ o SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE™, de Pharmacia) y sulfonilo inmovilizado en agarosa (por ejemplo, S-SEPHAROSE FAST FLOW™ de Pharmacia). Una "resina de intercambio iónico de modo mixto" se refiere a una fase sólida que está modificada covalentemente con grupos catiónicos, aniónicos e hidrofóbicos. Una resina de intercambio iónico de modo mixto disponible comercialmente es BAKERBOND ABX™
(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) que contiene grupos de intercambio catiónico débiles, una concentración baja de grupos de intercambio aniónico, y ligandos hidrofóbicos unidos a una matriz de soporte de fase sólida de gel de sílice.
[0022] El término "resina de intercambio aniónico" se utiliza en el presente documento para referirse a una fase sólida que está cargada positivamente, por ejemplo, que tiene uno o más ligandos cargados positivamente, tales como grupos amino cuaternarios, unidos a la misma. Las resinas de intercambio aniónico disponibles comercialmente incluyen DEAE celulosa, QAE SEPHADEX™ y FAST Q SEPHAROSE™ (Pharmacia).
B. Descripción detallada
Fraccionamiento y análisis de peptonas
[0023] La presente invención se basa en la identificación de fragmentos de peptonas activos utilizando una serie de técnicas cromatográficas y otras técnicas de separación.
[0024] El fraccionamiento de peptonas se puede realizar mediante técnicas conocidas en el sector, que incluyen una combinación de etapas cromatográficas. Un esquema típico para el fraccionamiento y análisis de la peptona PP3 se ilustra en la figura 1. La primera etapa en este esquema es HPLC de fase inversa (HPLC RP), que sirve separar componentes en base a su carácter hidrofóbico. Los compuestos se unen a columnas de HPLC de fase inversa en fase móvil altamente acuosa elevada y se eluyen de las columnas de HPLC RP con una fase móvil altamente orgánica. De este modo, los péptidos se pueden separar utilizando esta técnica mediante el desarrollo de gradientes lineales o no lineales de un disolvente orgánico apropiado.
[0025] A continuación, la fracción del flujo que pasa de HPLC de fase inversa se puede someter a etapas de separación cromatográficas adicionales, tales como la cromatografía por exclusión de tamaño, tal como se muestra en la figura 1. La cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) se refiere a la clasificación de moléculas de radios hidrodinámicos diferentes basados en el tiempo que estas moléculas están en una columna cromatogràfica. La separación tiene lugar como resultado del mayor o menor tiempo que están las moléculas en el volumen de la fase estacionaria que forma la columna. Las moléculas con un radio hidrodinámico grande se eluyen pronto durante la separación; las moléculas con radios más pequeños se eluyen más tarde. Las resinas SEC son conocidas en la técnica y están disponibles comercialmente de una serie de fabricantes. En los experimentos descritos en el ejemplo siguiente, se utilizó una columna de exclusión por tamaño SEPHADEX™ G15 (Amersham Biosciences), pero también son adecuadas otras columnas de exclusión por tamaño.
[0026] Si se desea, las peptonas se pueden subfraccionar mediante cromatografía de modo mixto. En esta técnica, la fase estacionaria contiene dos dominios de unión distintos en un único ligando cromatográfico. Los principios de separación acoplados habitualmente son el intercambio iónico y la cromatografía RP. La aplicación de la cromatografía de modo mixto normalmente es necesaria cuando la cromatografía de fase inversa (cromatografía RP) no consigue separar estructuralmente péptidos próximos. Actualmente, varios fabricantes ofrecen resinas de modo mixto comerciales que muestran diferentes especificidades, incluyendo la resina Hypercarb (Thermo Scientific), resina HLB Oasis® (Waters Corporation) y la resina SD-2 Dowex Optipore® (Dow Chemical Company). El sorbente Oasis es un copolímero de divinilbenceno y N-vinil pirrolidona. La composición equilibrada hidrofílicalipofílica permite una retención intensa por RP y una mejor humectación de los poros en relación con las resinas RP tradicionales. Por lo tanto, se pueden adsorber los compuestos polares y no polares. El tamaño promedio de las partículas de Oasis es de 30 µm. La composición de la resina Optipore es similar a la de la resina Oasis (divinilbenceno con aminas terciarias) que le da propiedades de RP y absorbente de intercambio aniónico débil. El tamaño promedio de partículas es de varios cientos de µm.
[0027] En cada etapa de purificación, en las fracciones obtenidas se puede analizar la actividad biológica y/o se puede someter a varios métodos clínicos a efectos de determinar su composición.
Ensayos de actividad del péptido
[0028] Las fracciones de peptona generadas se pueden analizar utilizando bioensayos conocidos, incluyendo un bioensayo basado en células descrito en el ejemplo. Los ensayos de la actividad biológica de péptidos derivados de peptonas se basan habitualmente en la medición de varios parámetros de cultivo en cultivos celulares que incluyen el péptido en cuestión en el medio de cultivo. Dichos parámetros incluyen, por ejemplo, densidad celular, recuento de células viables, productividad de un polipéptido heterólogo (por ejemplo, anticuerpo) producido, etc. Dichos ensayos se describen, por ejemplo, en Franek et al., Biotechnol. Prog. 16:688-692 (2000); Franek et al., Biotechnol. Prog. 18:155-158 (2002); Franek et al., Biotechnol. Prog. 19:169-174 (2003); Franek et al., Biotechnol. Prog. 21:9608 (2005).
Determinación de la composición de fracciones de peptonas
[0029] De este modo, las composiciones de peptonas y fracciones de peptonas se pueden analizar mediante espectrometría de masas (MS), RMN, ICPMS, análisis de aminoácidos y varias combinaciones de éstas y otras técnicas conocidas en el sector.
[0030] Los espectrómetros de masas consisten en una fuente de iones, un analizador de masas, un detector de
iones, una unidad de obtención de datos. En primer lugar, los péptidos se ionizan en la fuente de iones. A continuación, los péptidos ionizados se separan según su relación de masa-carga en el analizador de masas y se detectan los iones separados. La espectrometría de masas se ha utilizado ampliamente en el análisis de proteínas, especialmente desde la invención de los métodos de desorción-ionización láser asistida por matriz/tiempo de vuelo e ionización por electrospray (ESI). Existen varias versiones de analizadores de masas, incluyendo, por ejemplo, MALDI-TOF y triple o cuadrupolo-TOF, o analizador de masas de atrapamiento de iones acoplado a ESI. De este modo, por ejemplo, un espectrómetro de masas Q-Tof-2 utiliza una analizador de tiempo de vuelo ortogonal que permite la detección simultánea de iones a lo largo de todo el rango del espectro de masas. Para más detalles, véase, por ejemplo, Chemusevich et al., J. Mass Spectrom. 36:849-865 (2001).
[0031] Si se desea, las secuencias de aminoácidos de los fragmentos de péptidos y finalmente las proteínas de las que derivan se pueden determinar mediante técnicas conocidas en el sector, tales como ciertas variaciones de espectrometría de masas o degradación de Edman.
[0032] Aunque la presente invención se ilustra mediante fragmentos de péptidos identificados en los productos de degradación de una peptona particular, se espera que otras peptonas tendrán los componentes de péptidos con características estructurales y funcionales similares.
Bibliotecas combinatorias de péptidos
[0033] Las bibliotecas combinatorias de péptidos son conocidas en la técnica y se describen métodos para la generación y cribado de dichas bibliotecas en libros de texto estándar, tales como, por ejemplo, en Combinatorial Peptide Library Protocols (Methods in Molecular Biology), Shmuel Cabilly, ed., Humana Press Inc. 1998. También se describe una biblioteca de péptidos en Sloostra et al., Molecular Diversity, 1995, 1:87-96.
[0034] Las bibliotecas combinatorias de péptidos pueden estar en diferentes formatos. Por ejemplo, las denominadas bibliotecas de “un soporte un compuesto (“one bead one compound") contienen miles de soportes, cada uno con múltiples copias de compuestos de la biblioteca individuales (Lam et al., Nature, 354, 82-84 (1991)). La biblioteca se criba por una actividad deseada y se aísla cualquier soporte o soportes activos. El compuesto activo unido al soporte o soportes identificados se caracteriza a continuación mediante métodos convencionales, tales como, por ejemplo, mediante degradación de Edman. Alternativamente, se puede utilizar una estrategia reductora. En otro método, la metodología de fijación posicional de Houghten (Bioorg. Med. Chem. Lett., 14, 1947-1951 (2004)), se genera un grupo de bibliotecas relacionadas antes del cribado. Cada biblioteca contiene compuestos con un residuo específico fijado como un bloque de construcción único y residuos totalmente aleatorios. Las bibliotecas diferentes tienen un bloque de construcción diferente en la posición fijada. El cribado de este grupo de bibliotecas, para una actividad deseada, permite la identificación directa del bloque de construcción óptimo en el residuo fijado. Este proceso se puede llevar a cabo secuencialmente, optimizando un residuo cada vez, o alternativamente todos los grupos de bibliotecas se pueden cribar de manera simultánea para permitir la identificación del compuesto de biblioteca óptimo directamente a partir de una única ronda de cribado.
[0035] Utilizando los péptidos descritos específicamente en el presente documento, se pueden utilizar las bibliotecas combinatorias de péptidos para identificar péptidos adicionales con características químicas y/o biológicas mejoradas.
Síntesis de péptidos
[0036] Los péptidos identificados tal como se describe en el presente documento se pueden sintetizar mediante métodos convencionales de síntesis de péptidos, tales como, por ejemplo, métodos de síntesis en fase sólida, que se pueden realizar en una variedad de formas, tales como, por ejemplo, utilizando los grupos protectores Fmoc (9Hfluoren-9-il-metoxi-carbonilo) o Boc (tert-butoxicarbonilo) para proteger los extremos N-terminales de los monómeros de aminoácidos utilizados en la síntesis. Los sintetizadores automatizados están disponibles comercialmente para ambas técnicas, pero la síntesis de péptidos en fase sólida también se puede realizar manualmente. Para más detalles, véase, por ejemplo, Atherton, E., Sheppard, R.C. (1989). Solid Phase peptide synthesis: a practical approach. Oxford, England: IRL Press. ISBN 0199630674; and Steward, J.M., Young, J.D. (1984). Solid phase peptide synthesis, 2a edición, Rockford: Pierce Chemical Company, 91. ISBN 0935940030.
Usos de los dipéptidos y tripéptidos
[0037] Los dipéptidos y tripéptidos descritos en el presente documento se pueden utilizar como componentes de medio de crecimiento utilizado para la producción de polipéptidos recombinantes, incluyendo anticuerpos.
[0038] Los polipéptidos recombinantes, tales como anticuerpos, se pueden producir en un conjunto de organismos huésped eucariotas y procariotas.
[0039] Las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptido glicosilado, tal como anticuerpos, se pueden derivar de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e
insectos. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus y variantes y las correspondientes células huésped de insectos permisivos, tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Acdcs aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx mori. Están disponibles de forma pública una variedad de cepas virales para la transfección, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y se pueden utilizar dichos virus como el virus del presente documento particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. También se pueden utilizar como huéspedes cultivos celulares de plantas de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco.
[0040] Sin embargo, ha habido un mayor interés en células de vertebrados y la propagación de células de vertebrados en un cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento de rutina. Ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en un cultivo en suspensión, Graham et al, J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámstr chino/-DHFR (CHO, Urlaub ct al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL, 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442): células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Ilep G2).
[0041] Por ejemplo, se pueden producir polipéptidos recombinantes, tales como anticuerpos, en células dp12.CHO, la producción de las cuales a partir de células CHO-K1 DUX-B11 se describe en EP307247. A su vez las células CHO-K1 DUX-B11 se obtuvieron de células CHO-K1 (ATCC No. CCL61 CHO-K1), siguiendo los métodos descritos en Simonsen. C. C., y Levinson, A. D., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2495-2499 and Urlaub G., y Chasin, L.. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci USA 77: 4216-4220. Además, son conocidas y se pueden utilizar otras líneas celulares CHO-K1 (dhfr-).
[0042] Las células huésped de mamífero utilizadas para producir péptidos, polipéptidos y proteínas se pueden cultivar en una variedad de medios. Los medios disponibles comercialmente, tales como F10 de Ham (Sigma), Medio Esencial Mínimo ((MEM), Sigma), RPM1-1640 (Sigma), y Medio de Eagle Modificado por Dulbecco ((DMEM, Sigma) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, se puede utilizar cualquiera de los medios descritos en Ham y Wallace (1979), Meth. in Enz. 58:44, Barnes y Sato (1980), Anal. Biochem. 102:255, patente de Estados Unidos No. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; o 4,560,655; WO 90/03430; WO 87/00195; patente de Estados Unidos No. Re. 30,985; o patente de Estados Unidos No. 5,122,469, como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios se puede complementar según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco Gentamycin™), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos presentes normalmente a concentraciones finales en el rango de micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. También se puede incluir cualquier otro complemento necesario a concentraciones apropiadas que serían conocidas por los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares, son aquellas utilizadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión y serán evidentes para el experto en la materia.
[0043] Los péptidos descritos en el presente documento se pueden utilizar, de forma individual o en varias combinaciones, como componentes de cualquier medio de cultivo disponible comercialmente producido habitualmente.
[0044] La utilización de los péptidos descritos en el presente documento no se limita al cultivo de células huésped de mamíferos, o, en general, células huésped eucariotas. Los péptidos descritos en el presente documento también son útiles en cultivos celulares de organismos huésped procariotas. Las células huésped procariotas de ejemplo incluyen, sin limitación, eubacterias, tales como organismos Gram-negativo o Gram-positivo, por ejemplo, Enterobacteriáceas, tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigeila, así como Bacilos, tales como B. subtilis y B. Licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrito en DD 266,710 publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas, tales como P. Aeruginosa y Streptomyces. Un huésped de clonación de E. Coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31,446), aunque otras cepas, tales como E. coli B, E. coli X 1776 (ATCC 31,537), y E coil W3110 (ATCC 27,325) son adecuadas.
[0045] Los detalles adicionales de la presente invención se proporcionan en el siguiente ejemplo.
Ejemplo
Identificación molecular de tripéptidos que contienen arginina C-terminal biológicamente activos utilizando una biblioteca combinatoria
Materiales y métodos
Bioensayo TubeSpin
[0046] Se diseñó el bioensayo TubeSpin para examinar los efectos de un aditivo del medio de cultivo celular en la proliferación y productividad celular (determinada mediante la densidad de células viables y concentración de anticuerpo producido, respectivamente) en un volumen de trabajo de 5 mililitros (ml) utilizando una densidad inicial de células viables de 1,5 x 10^6 células/ml.
[0047] Cada cultivo se preparó en un volumen de 7,15 ml de los que 5 ml se transfieren al tubo de ensayo. El tubo de ensayo es un tubo de centrifugación de 50 ml con un tapón especializado que contiene una membrana con un tamaño de poro de 0,2 micras para facilitar el flujo de gases. Los 2,15 ml que permanecían se utilizaron para medir la densidad de células viables (para confirmar que se había conseguido la densidad diana y que las células eran viables), osmolalidad y datos metabólicos (pH, glutamina, glutamato, lactato, amonio, sodio, potasio).
[0048] Dependiendo de la concentración y osmolalidad de partida del aditivo del medio deseado, se determinó una concentración diana para el aditivo. A partir de estos datos, se calculan el volumen del aditivo requerido, el volumen de cloruro de sodio requerido para conseguir la osmolalidad fisiológica en el cultivo final, y el volumen de agua necesaria para conseguir 7.15 ml. Utilizando estos valores, se ensambló una solución preparativa de aditivo de medio, cloruro de sodio y agua.
[0049] A continuación, a las células en Medio Esencial de Genentech Selectivo (GEM) se intercambió el medio a un medio de calidad de producción referido como GEM2. A continuación, las células en GEM2 se añadieron a cada tubo preparativo para conseguir las 1,5 x 10^6 células/ml indicadas en 7,15 ml. A continuación, se añadieron 5 ml a cada tubo de ensayo y se incubó a 37 grados centígrados durante 4,75 días.
[0050] Al final del periodo de incubación se midieron de nuevo la densidad, osmolalidad y perfil metabólico de células viables y se envió una muestra del cultivo de ensayo a un ensayo de cuantificación de anticuerpos separado para determinar su concentración.
Cromatografía preparativa de fase inversa C18
[0051] Se preparó una solución acuosa al 20% (p/v) de PP3 y se utilizó inmediatamente. Se empaquetó una columna de acero inoxidable de 5 x 5 con C18 preparativa de sílice Waters (tamaño de poro 125Å; tamaño de partícula 55-105 micras). La columna se preequilibró con 10 volúmenes de ácido trifluoroacético (TFA) al 0,02% (p/v) en agua (tampón A) y se trabajó a un caudal de 60 ml/min. Se cargaron en la columna 200 ml de la solución de PP3 anterior. La monitorización del disolvente de control y el efluente de la columna se consiguió utilizando un sistema de cromatografía Akta controlado por software Unicorn (GE Healthcare). Después de la carga, la columna se lavó con tampón A hasta que la absorbancia del efluente a 280 nm alcanzó la línea base. A continuación, la columna se lavó con acetonitrilo (ACN) al 85% (v/v) que contenía TFA al 0,02% para eluir el material unido. Las fracciones se analizaron por la actividad biológica utilizando el bioensayo.
Cromatografía preparativa Sephadex G15
[0052] El material que pasaba por la columna C18 se concentró mediante evaporación rotatoria y se fraccionó adicionalmente en una columna Sephadex G-15 (7 cm diámetro x 50 cm longitud.). La columna se equilibró con agua desionizada antes de la carga y se cargó todo el flujo que pasó por la columna C18. Se recogieron las fracciones y se analizó la actividad utilizando el bioensayo descrito anteriormente.
Cromatografía analítica Hypercarb
[0053] Se analizaron muestras de fracciones activas utilizando una columna Hypercarb (grafito) (tamaño de partícula de 5 micras; dimensiones de la columna: 0,1 mm x 50 mm). Los tampones utilizados fueron el tampón A: TFA acuosa al 0,02%; y el tampón B: ACN al 85% + TFA al 0,02%. Se cargaron varios volúmenes (0-10 microlitros) en la columna que se preequilibró con tampón A y se eluyó con un gradiente lineal que iba hasta el 50% de tampón B durante 25 minutos. La columna trabajó a un caudal de 0,1 ml/min. El control del disolvente se consiguió con un HPLC Agilent 1100 equipado con un detector de red de diodos y un espectrómetro de masas de un cuadrupolo MSD. El sistema completo estaba bajo el control del software Agilent Chemstation.
Espectrometría de masas
[0054] Se realizó una espectrometría de masas de alta resolución utilizando un espectrómetro de masas Q-TOF (Waters Corporation) o un espectrómetro de masas Orbitrap (Thermofinnigan). Los instrumentos operaron en modo de pulverización estática y se halló que la precisión de la masa era inferior a 5 ppm en ambos casos. Los espectros se utilizaron para obtener información precisa de la masa que se utilizó para correlacionarse con información de la
biblioteca de péptidos.
Bioinformática
[0055] Las bibliotecas in silico de dipéptidos y tripéptidos se construyeron con las precisiones de masa necesarias para correlacionarse con masas determinadas según se ha descrito anteriormente.
Síntesis de péptidos
[0056] Se creó una biblioteca de tripéptidos utilizando síntesis de péptidos de fase sólida Fmoc. La biblioteca se diseñó para contener todos los tripéptidos posibles que terminan en arginina (R), es decir, XXR.
Resultados
Fraccionamiento de PP3
[0057] El esquema para el fraccionamiento y análisis se muestran en el diagrama de la figura 1.
HPLC de fase inversa C18
[0058] El fraccionamiento inicial de PP3 se realizó utilizando HPLC de fase inversa. El cromatograma mostrado en la figura 2 es representativo del perfil de cromatografía de fase inversa de PP3. La mayoría de la masa (~70% del peso seco inicial) fluye a través de la columna al igual que la mayoría de la actividad biológica.
[0059] La fracción que pasa por la columna C18 se concentró y cargó en Sephadex G-15 para cromatografía por exclusión de tamaño, los resultados de los cuales se muestran en la figura 3.
[0060] Las fracciones de la columna G15 se analizaron por su bioactividad. La actividad específica del material purificado con G15 (fracciones F3-F7) se incrementó significativamente sobre la de PP3 con respecto a su capacidad de incrementar el título de proteína recombinante (figura 4A) y el recuento de células viables (VCC; figura 4B).
Espectrometría de masas en el flujo de la fracción de G15
[0061] Las fracciones activas se analizaron utilizando espectrometría de masas a efectos de obtener información sobre la naturaleza molecular de los componentes activos. La figura 5 muestra un espectro de masas representativo obtenido de una muestra del flujo de G15 obtenido tal como se ha descrito anteriormente. El espectro contiene numerosos picos con masas inferiores a 500 Da. Una característica destacable de los espectros fue el hecho de que contenían muchos picos que diferían en la masa en 14 unidades de pasa de una manera repetitiva. Además, se identificó un pico a 175,1 m/z (figura 5) como arginina por la masa exacta y el posterior análisis de composición elemental. Además, el análisis de las tres masas (403,2, 389,2 y 375,2 m/z; marcadas con un recuadro) del espectro mostrado en la figura 5 utilizando la disociación inducida por colisión (CID) reveló patrones de fragmentación similares en el intervalo de masas inferiores a 200 Da. Esto incluía la identificación de un residuo de arginina intacto a 175,1 m/z de cada una de las tres masas. Además, en base a las mediciones exactas de las masas, estas moléculas se identificaron como péptidos con las posibles siguientes identidades:
403,2 Da: EVR; DIR; DLR
389,2 Da: LTR; ITR
375,2 Da: SIR; SLR; TVR
[0062] El orden de los 2 primeros aminoácidos en las secuencias anteriores también se podría invertir. Existen varias posibilidades en cada masa debido al solapamiento en las combinaciones de aminoácidos individuales.
Creación de una biblioteca in silico de tripéptidos que contienen arginina
[0063] La estructura de repetición de 14 unidades de masa observada en los espectros de masa de fracciones de peptona y la presencia de arginina C-terminal en un grupo de estas moléculas sugería la presencia de una “biblioteca combinatoria” creada enzimáticamente de péptidos en PP3 que aparecen de los tejidos de animales. Para investigar más esta idea, se decidió crear una biblioteca in silico de tripéptidos que contienen arginina C-terminal. La biblioteca contiene 400 posibles péptidos y su composición y distribución de masas se representan en el gráfico mostrado en la figura 6. La distribución de hecho se parece a las diferencias de las 14 unidades de masa observadas en las fracciones de peptona con picos repetitivos a intervalos de 14 Da.
Construcción y análisis de una biblioteca combinatoria de péptidos XXR
[0064] A efectos de explorar adicionalmente la idea de que los péptidos que contienen arginina C-terminal podrían
ser responsables de parte de la actividad observada en las fracciones de PP3, se produjo una biblioteca combinatoria de estas moléculas utilizando síntesis de péptidos en fase sólida (Fmoc). La biblioteca que contenía péptidos liofilizados se disolvió en agua desionizada y el pH de la solución se ajustó a ~ 7,0 con NaOH. A continuación, se desaló la solución utilizando una columna G-15. Se recogió una fracción de la biblioteca, se concentró mediante evaporación rotatoria y se analizó mediante espectrometría de masas y mediante bioensayo. El análisis espectral de masas reveló la presencia de dipéptidos y tripéptidos. Se creyó que los dipéptidos hallados en la mezcla aparecieron de una cierta proporción de reacciones de síntesis de péptidos fallidas.
[0065] La espectrometría de masas reveló la presencia de numerosos picos, los cuales se compararon con la biblioteca in silico referida anteriormente. La tabla 1 indica las masas, identidades e intensidades relativas de los péptidos hallados en esta fracción. Las asignaciones se basan en las mediciones precisas de las masas con errores inferiores a 5 ppm. Esta lista representa una lista parcial de todos los péptidos presentes en esta fracción.
Bioensayo de la fracción XXR de G-1262.1515 0.000429 1.637755 255
[0066] Los péptidos XXR preparados tal como se indica anteriormente se analizaron por la actividad en el bioensayo y se observó que tenían efectos positivos significativos en el crecimiento celular y el título.
Resumen
[0067] Los resultados presentados en este ejemplo muestran que la PP3 contiene moléculas activas con masas moleculares inferiores a 500 Da. Algunas de estas moléculas se identificaron como tripéptidos que contienen arginina C-terminal. Una biblioteca combinatoria de estos péptidos mostró una actividad biológica en un bioensayo de 6 días. Se concluyó que los tripéptidos que contienen arginina C-terminal son responsables, por lo menos en parte, de las actividades de inducción del crecimiento y título de PP3.
TABLA 1
Identificaciones de péptidos de XXR
- Péptidos XXR identificados de la fracción bioactiva G15
- #
- Asignación m/z teórico Error (abs) Error (ppm) Intensidad
- relativa
1 DIR 403,2305 0,000408 1,011915 52 2 DLR 403,2305 0,000408 1,011915 52 3 EVR 403,2305 0,000408 1,011915 52 4 IR 288,2036 0,000365 1,266195 45 5 LR 288,2036 0,000365 1,266195 45 6 DPR 387,1992 0,000308 0,795164 38 7 PR 272,1723 0,000365 1,340232 38 8 DR 290,1464 0,000344 1,185539 19 9 TVR 375,2356 0,000293 0,781895 27 10 EIR 417,2462 0,000458 1,097935 27 11 ELR 417,2462 0,000458 1,097935 27 12 VR 274,1879 0,000415 1,513006 25 13 SR 262,1515 0,000429 1,637755 25 14 AR 246,1566 0,000415 1,6847 24 15 ER 304,1621 0,000294 0,966767 23 16 INR 402,2465 0,000392 0,975621 23 17 LNR 402,2465 0,000392 0,975621 23 18 QVR 402,2465 0,000392 0,975621 23 19 AVR 345,225 0,000229 0,662411 22 20 GIR 345,225 0,000229 0,662411 22 21 GLR 345,225 0,000229 0,662411 22 22 MR 306,16 0,000387 1,262895 ? 23 IVR 387,272 0,000379 0,97839 20 24 LVR 387,272 0,000379 0,97839 20 25 ITR 389,2512 0,000343 0,882384 19 26 LTR 389,2512 0,000343 0,882384 19 26 DTR 391,1941 0,000323 0,824468 17 28 ESR 391,1941 0,000323 0,824468 17 29 GGR 289,1624 0,000328 1,1356642 17 30 NR 289,1624 0,000328 1,135642 1 31 DVR 389,2149 0,000358 0,9197 17 32 IIR 401,2876 0,000429 1,069001 17 33 ILR 401,2876 0,000429 1,069001 17
34 LLR 401,2876 0,000429 1,069001 17 35 AIR 359,2407 0,000279 0,775956 16 36 ALR 359,2407 0,000279 0,775956 16 37 ADR 361,1836 0,000258 0,7138 16 38 EGR 361,1836 0,000258 0,7138 16 39 AGR 303,1781 0,000278 0,918467 16 40 QR 303,1781 0,000278 0,918467 15 41 GR 232,141 0,000465 2,001482 15 42 DQR 418,205 0,000422 1,008051 14 43 ENR 418,205 0,000422 1,008051 14 44 DMR 421,1869 0,00043 1,020357 13 45 EMR 435,2026 0,00048 1,102556 11 46 ASR 333,1886 0,000243 0,729836 11 47 GTR 333,1886 0,000243 0,729836 11 48 FPR 419,2407 -0,003021 -7,206469 11 49 IMR 419,2441 0,000351 0,836513 11 50 LMR 419,2441 0,000351 0,836513 11 51 IPR 385,2563 0,000329 0,853533 10 52 LPR 385,2563 0,000329 0,853533 10
Claims (8)
- REIVINDICACIONES1. Utilización de un péptido de fórmula5 (X1)nX2Ren el que X1 y X2 pueden ser idénticos o diferentes y representan independientemente cualquier aminoácido diferente de arginina; n es 0 ó 1; y10 R representa arginina, en el que dicho péptido muestra una actividad biológica de peptona para inducir el crecimiento celular y/o la densidad celular y/o la viabilidad celular y/o la eficacia de producción de polipéptidos heterólogos en cultivos de huéspedes recombinantes.15 2. Utilización, según la reivindicación 1, en la que dicho péptido se obtiene mediante el fraccionamiento de una peptona o se sintetiza químicamente.
- 3. Utilización, según la reivindicación 2, en la que dicha peptona que se fracciona es una peptona PP3 (componente3 de la proteasa peptidona). 20
- 4. Utilización, según la reivindicación 1, en la que dicho péptido se selecciona entre los péptidos DIR, DLR, EVR, DPR, TVR, EIR, ELR, INR, LNR, QVR, AVR, GIR, GLR, IVR, LVR, ITR, LTR, DTR, ESR, GGR, DVR, IIR, ILR, LLR, AIR, ALR, ADR, EGR, AGR, DQR, ENR, DMR, EMR, ASR, GTR, IMR, FPR, LMR, IPR, LPR, IR, LR, PR, DR, VR, SR, AR, ER, MR, NR, QR, y GR.
-
- 5.
- Utilización, según la reivindicación 1, en la que dicho péptido es un tripéptido.
-
- 6.
- Utilización, según la reivindicación 5, en la que dicho tripéptido se selecciona entre los tripéptidos DIR, DLR, EVR,
DPR, TVR, EIR, ELR, INR, LNR, QVR, AVR, GIR, GLR, IVR, LVR, ITR, LTR, DTR, ESR, GGR, DVR, IIR, ILR, LLR, 30 AIR, ALR, ADR, EGR, AGR, DQR, ENR, DMR, EMR, ASR, GTR, IMR, FPR, LMR, IPR y LPR. - 7. Utilización, según la reivindicación 1, en la que dicho péptido es un dipéptido.
- 8. Utilización, según la reivindicación 7, en la que dicho dipéptido se selecciona entre los dipéptidos IR, LR, PR, DR, 35 VR, SR, AR, ER, MR, NR, QR, y GR.
- 9. Biblioteca combinatoria de péptidos que consiste en los péptidos de la fórmula40 (X1)nX2Ren los que X1 y X2 pueden ser idénticos o diferentes y representan independientemente cualquier aminoácido diferente de arginina; n es 0 ó 1; y45 R representa arginina, en los que por lo menos algunos de dichos péptidos muestran una actividad biológica de peptona para inducir el crecimiento celular y/o la densidad celular y/o la viabilidad celular y/o la eficacia de producción de polipéptidos heterólogos en cultivos de huéspedes recombinantes.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US96764407P | 2007-09-05 | 2007-09-05 | |
| US967644P | 2007-09-05 | ||
| PCT/US2008/075403 WO2009033024A1 (en) | 2007-09-05 | 2008-09-05 | Biologically active c-terminal arginine-containing peptides |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2434829T3 true ES2434829T3 (es) | 2013-12-17 |
Family
ID=40084302
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES08829747T Active ES2434829T3 (es) | 2007-09-05 | 2008-09-05 | Péptidos que contienen arginina C-terminal biológicamente activos |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US20090143248A1 (es) |
| EP (1) | EP2207790B1 (es) |
| JP (1) | JP5734653B2 (es) |
| CN (2) | CN101848925A (es) |
| CA (1) | CA2697519C (es) |
| CY (1) | CY1114618T1 (es) |
| DK (1) | DK2207790T3 (es) |
| ES (1) | ES2434829T3 (es) |
| HK (1) | HK1213916A1 (es) |
| HR (1) | HRP20131108T1 (es) |
| PL (1) | PL2207790T3 (es) |
| PT (1) | PT2207790E (es) |
| SG (2) | SG190602A1 (es) |
| SI (1) | SI2207790T1 (es) |
| WO (1) | WO2009033024A1 (es) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101848925A (zh) * | 2007-09-05 | 2010-09-29 | 健泰科生物技术公司 | 有生物学活性的、含c-端精氨酸的肽 |
| DE102010001983A1 (de) * | 2010-02-16 | 2011-08-18 | peptides&elephants GmbH, 14558 | Verfahren zur Erzeugung eines Peptidreinigungsmaterials auf Graphitbasis und Verfahren zur Peptidaufreinigung |
| CA2807895A1 (en) * | 2010-08-31 | 2012-03-08 | Friesland Brands B.V. | Culture medium for eukaryotic cells |
| ES2999332T3 (en) * | 2012-09-19 | 2025-02-25 | Gemvax & Kael Co Ltd | Cell penetrating peptide, conjugate comprising the same, and composition comprising conjugate |
| WO2017178193A1 (en) * | 2016-04-14 | 2017-10-19 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Method for the identification of random polynucleotide or polypeptide sequences with biological activity |
| CN109575106A (zh) * | 2019-01-07 | 2019-04-05 | 无限极（中国）有限公司 | 一种从大米多肽中制备抗氧化三肽的方法及应用 |
| WO2022137357A1 (ja) * | 2020-12-22 | 2022-06-30 | 株式会社マルハチ村松 | ペプチド、細胞増殖促進剤、タンパク質産生促進剤、培地、該ペプチドを用いた細胞増殖方法、及び、該ペプチドを用いたタンパク質産生方法 |
| CN116444610B (zh) * | 2022-11-30 | 2024-05-17 | 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 | 乳源活性肽dasaqfir及其制备方法与应用 |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| USRE30985E (en) | 1978-01-01 | 1982-06-29 | Serum-free cell culture media | |
| US4560655A (en) | 1982-12-16 | 1985-12-24 | Immunex Corporation | Serum-free cell culture medium and process for making same |
| US4657866A (en) | 1982-12-21 | 1987-04-14 | Sudhir Kumar | Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media |
| US4767704A (en) | 1983-10-07 | 1988-08-30 | Columbia University In The City Of New York | Protein-free culture medium |
| GB8516415D0 (en) | 1985-06-28 | 1985-07-31 | Celltech Ltd | Culture of animal cells |
| KR900007085B1 (ko) * | 1985-10-22 | 1990-09-28 | 플랜트 제네틱스, 인코포레이티드 | 체배형성을 증가시키는 방법 및 배지 |
| US4927762A (en) | 1986-04-01 | 1990-05-22 | Cell Enterprises, Inc. | Cell culture medium with antioxidant |
| IL87737A (en) | 1987-09-11 | 1993-08-18 | Genentech Inc | Method for culturing polypeptide factor dependent vertebrate recombinant cells |
| ATE135397T1 (de) | 1988-09-23 | 1996-03-15 | Cetus Oncology Corp | Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte |
| US5122469A (en) | 1990-10-03 | 1992-06-16 | Genentech, Inc. | Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins |
| EP0810283A3 (en) | 1996-05-31 | 1997-12-10 | Akzo Nobel N.V. | Live attenuated RTX-procucing bacteria of the family Pasteurellaceae |
| JPH1075774A (ja) * | 1996-05-31 | 1998-03-24 | Akzo Nobel Nv | パスツレラ科の弱毒化ｒｔｘ産生細菌 |
| US20020045266A1 (en) * | 2000-02-08 | 2002-04-18 | Hicham Fenniri | Method for determining the structure of an active member of a chemical library |
| US7041506B2 (en) * | 2001-11-19 | 2006-05-09 | Becton Dickinson And Company | Peptides promoting cell adherence, growth and secretion |
| AU2003286493A1 (en) | 2002-10-18 | 2004-05-04 | Abgenix, Inc. | System and method for cleaving antibodies |
| CN101848925A (zh) * | 2007-09-05 | 2010-09-29 | 健泰科生物技术公司 | 有生物学活性的、含c-端精氨酸的肽 |
| EP2490021A1 (en) * | 2011-02-18 | 2012-08-22 | Biotempt B.V. | Modulators of PRR and GPCR signalling |
-
2008
- 2008-09-05 CN CN200880114757A patent/CN101848925A/zh active Pending
- 2008-09-05 DK DK08829747.8T patent/DK2207790T3/da active
- 2008-09-05 CN CN201510249486.7A patent/CN104844690B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2008-09-05 SG SG2013032669A patent/SG190602A1/en unknown
- 2008-09-05 PT PT88297478T patent/PT2207790E/pt unknown
- 2008-09-05 US US12/231,917 patent/US20090143248A1/en not_active Abandoned
- 2008-09-05 JP JP2010524183A patent/JP5734653B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2008-09-05 ES ES08829747T patent/ES2434829T3/es active Active
- 2008-09-05 CA CA2697519A patent/CA2697519C/en active Active
- 2008-09-05 EP EP08829747.8A patent/EP2207790B1/en active Active
- 2008-09-05 SI SI200831066T patent/SI2207790T1/sl unknown
- 2008-09-05 SG SG10201803541TA patent/SG10201803541TA/en unknown
- 2008-09-05 PL PL08829747T patent/PL2207790T3/pl unknown
- 2008-09-05 WO PCT/US2008/075403 patent/WO2009033024A1/en active Application Filing
-
2011
- 2011-02-18 US US12/932,207 patent/US20110183413A1/en not_active Abandoned
-
2013
- 2013-11-05 CY CY20131100975T patent/CY1114618T1/el unknown
- 2013-11-20 HR HRP20131108AT patent/HRP20131108T1/hr unknown
-
2015
- 2015-12-24 US US14/757,925 patent/US20170088813A1/en not_active Abandoned
-
2016
- 2016-02-18 HK HK16101819.9A patent/HK1213916A1/zh not_active IP Right Cessation
-
2017
- 2017-07-20 US US15/655,279 patent/US20170321187A1/en not_active Abandoned
-
2020
- 2020-09-30 US US17/039,407 patent/US20210163880A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HRP20131108T1 (hr) | 2014-01-31 |
| CA2697519A1 (en) | 2009-03-12 |
| US20110183413A1 (en) | 2011-07-28 |
| DK2207790T3 (da) | 2013-10-28 |
| CA2697519C (en) | 2018-11-20 |
| CN104844690B (zh) | 2019-08-16 |
| PT2207790E (pt) | 2013-11-04 |
| JP2010538089A (ja) | 2010-12-09 |
| CY1114618T1 (el) | 2016-10-05 |
| US20090143248A1 (en) | 2009-06-04 |
| WO2009033024A1 (en) | 2009-03-12 |
| JP5734653B2 (ja) | 2015-06-17 |
| SI2207790T1 (sl) | 2013-11-29 |
| SG190602A1 (en) | 2013-06-28 |
| EP2207790B1 (en) | 2013-08-21 |
| US20210163880A1 (en) | 2021-06-03 |
| HK1213916A1 (zh) | 2016-07-15 |
| EP2207790A1 (en) | 2010-07-21 |
| CN104844690A (zh) | 2015-08-19 |
| SG10201803541TA (en) | 2018-06-28 |
| PL2207790T3 (pl) | 2014-01-31 |
| US20170321187A1 (en) | 2017-11-09 |
| US20170088813A1 (en) | 2017-03-30 |
| CN101848925A (zh) | 2010-09-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210163880A1 (en) | Biologically active c-terminal arginine-containing peptides | |
| Thingholm et al. | Analytical strategies for phosphoproteomics | |
| Formolo et al. | Determination of the NISTmAb primary structure | |
| Zhang et al. | Identification of isomerization and racemization of aspartate in the Asp–Asp motifs of a therapeutic protein | |
| EP2167974A1 (en) | Method for absolute quantification of polypeptides | |
| JP2013536683A (ja) | 真核細胞のための培養培地 | |
| Hoelz et al. | The discovery of labile methyl esters on proliferating cell nuclear antigen by MS/MS | |
| Sakaguchi et al. | A novel amino acid analysis method using derivatization of multiple functional groups followed by liquid chromatography/tandem mass spectrometry | |
| WO2021180063A1 (en) | Methods for detecting and quantifying biological modifications in antibodies | |
| KR20210120010A (ko) | 단백질 a 크로마토그래피 - 전기분무 이온화 질량 분광계 | |
| Krause et al. | Sequence diversity of the peptaibol antibiotic suzukacillin‐A from the mold Trichoderma viride | |
| Ruse et al. | Polyglutamylation: biology and analysis | |
| KR20240047469A (ko) | 숙주 세포 단백질 불순물을 식별하기 위한 프로브 및 방법 | |
| Mizuno et al. | A rapid and sensitive detection of D-Aspartic acid in Crystallin by chiral derivatized liquid chromatography mass spectrometry | |
| US20100012832A1 (en) | Method of separating phosphorylated peptide or phosphorylated protein | |
| Yu et al. | Synthesis and biological activity study of the retro-isomer of RhTx against TRPV1 | |
| Xi et al. | Expression, purification and characterization of active untagged recombinant human leukemia inhibitory factor from E. coli | |
| US20100212030A1 (en) | Use of n-terminal and c-terminal proteomics technology to enhance protein therapeutics and diagnostics | |
| Millán-Martín et al. | An automated high-throughput workflow for peptide mapping to monitor post-translational modifications (PTMs) of monoclonal antibodies authors | |
| Kasama et al. | A novel sequence analysis for one cyclic peptide immobilized on a single bead by MALDI-TOF-MS/MS focusing on discovery of medicinal medium sized molecules based on protein-protein interactions | |
| Schwartz et al. | Peptide mapping of a wheat gluten hydrolysate by reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) | |
| US20230176069A1 (en) | Mitigating concentration effects of antibody digestion for complete sequence coverage | |
| Sun et al. | Novel immunomodulatory peptides identified from Meretrix meretrix L. hydrolysates through in vitro cell experiments, in silico analysis, molecular docking, and dynamic simulation | |
| Licker et al. | Characterisation of human cerebrospinal fluid (CSF) after tandem mass tag (tmt0) labelling | |
| Kasama et al. | A high throughput sequence determination for one cyclic peptide immobilized on a single bead by MALDI-TOF-MS/MS focusing on discovery of interacting peptides and medicinal medium sized molecules |